Пентилентетразоловый киндлинг у крыс: влияние на обучение, нейродегенерация и механизмы гибели нейронов в гиппокампе

Павлова, Татьяна Васильевна

Автореферат диссертации по теме "Пентилентетразоловый киндлинг у крыс: влияние на обучение, нейродегенерация и механизмы гибели нейронов в гиппокампе"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ

на правах рукописи УДК 577.352

Павлова Татьяна Васильевна ПЕНТИЛЕНТЕТРАЗОЛОВЫЙ КИНДЛИНГ У КРЫС: ВЛИЯНИЕ НА ОБУЧЕНИЕ, НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ ГИБЕЛИ НЕЙРОНОВ В

ГИППОКАМПЕ

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Лаборатории функциональной биохимии нервной системы (зав. лаб. - докт. биол. наук, профессор Н. В. Гуляева) Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (директор - докт. биол. наук, профессор П.М. Балабан)

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Н. В. Гуляева

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук А. С. Базян

Доктор биологических наук, профессор С. А. Чепурнов

Ведущая организация:

НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН Защита диссертации состоится 2006 года в

/у.

-"часов

на заседании Диссертационного совета'Д-003.10.01 при Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук по адресу: 117485, г. Москва, ул. Бутлерова, 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИВНД и НФ РАН.

Автореферат разослан У^саоАЯ 2005 года

Ученый секретарь специализированного совета . ___

Доктор биологических наук ^"^Х^Соштоянц

—уп 3

& Актуальность проблемы

Эпилепсия является одним из наиболее распространенных заболеваний нервной системы, а её лечение является актуальной медико-социальной задачей. Заболеваемость эпилепсией составляет 50-70/100000 человек, распространенность 5-10/1000 человек. Это заболевание сопровождается значительными социальными трудностями, моральными и физическими страданиями больного и членов его семьи. Эпилепсия является одним из приоритетов Всемирной Организации Здравоохранения, проводящей глобальную кампанию "Эпилепсия - из тени". Проявления эпилепсии разнообразны: от кратковременного нарушения сознания до тяжелых конвульсий. Она характеризуется повторными приступами, являющимися симптомами дисфункции мозга. Не менее одного припадка в течение жизни переносят 5 % населения, у 20-30 % больных эпилепсия является пожизненной. Многие больные эпилепсией испытывают серьезные социальные проблемы, которые часто обусловлены нарушением когнитивной функции при этом состоянии. Можно полагать, что нарушение функционирования мозга при эпилепсии обусловлено не только дисфункцией отдельных групп нейронов, но и их гибелью.

Несмотря на то, что эпилепсия не относится к собственно нейродегенеративным заболеваниям, нейродегенерация при многих ее формах считается доказанной (Duncan, 2002). Поэтому чрезвычайно актуальной задачей является исследование механизмов нейродегенерации при эпилепсии. Решение этой задачи необходимо для поиска путей предотвращения гибели нейронов и возможной коррекции дисфункции мозга у больных эпилепсией.

Одним из наиболее удобных экспериментальных приёмов для исследования

механизмов изменений, связанных с эпилепсией, является пентилентетразоловый

киндлинг (PTZK) (McNamara, 1985), поскольку при этом наблюдаются

нарушения, в определенной степени аналогичные таковым при эпилепсии

височной доли у человека. У экспериментальных животных развиваются

судороги, нарушается поведение, повреждаются нейроны. Однако

снов при P-TZK. немного. Pohle et РОС. НАЦИОНАЛЫ« i* БИБЛИОТЕКА. j С.Пстербур Г ФЭ

экспериментальных подтверждений гибели

;кл I

"J j

al. (1997) и Franke and Kittner (2001) показали, что PTZK может вызывать умеренную дегенерацию нейронов в гиппокампе. Механизм гибели нейронов при этом неясен. Однако при амигдалярном электрическом киндлинге удалось установить, что гибель некоторых нейронов в гиппокампе может происходить по апоптотическому пути (Zhang et al., 1997). В последние годы появляются данные о том, что в нейронах может происходить активация аберрантного клеточного цикла, приводящая в конечном итоге к нейродегенерации. Так, например, при эпилепсии височной доли у человека была обнаружена экспрессия нейронального циклина В1 в гиппокампе (Nagy and Esiri. 1998). Поскольку PTZK является общепринятой моделью этой формы эпилепсии, представлялось вероятным, что гибель нейронов при PTZK также происходит с вовлечением активации клеточного цикла.

Неоднократно предпринимались попытки установить количественную связь между силой клонико-тонических судорог, вызванных различными воздействиями, и гибелью нервных клеток в гиппокампе. В некоторых случаях, например, при использовании повторяющегося электрошока, такая связь была обнаружена (Зарубенко и соавт., 2004). В то же время при введении каината такой связи выявлено не было (Berger et al, 1989), несмотря на наличие корреляции между силой судорог и рядом показателей окислительного стресса и апоптоза в гиппокампе (Stepanichev et al., 2000). Важно отметить, что до сих пор многие исследователи считают эпилепсию с конвульсивными проявлениями значительно более эффективной в отношении повреждений в селективно чувствительных отделах мозга (в частности, амигдале и гиппокампе), чем эпилепсию без конвульсий, например типа абсанс (Wong, 2003).

Цель работы и основные задачи исследования

Основной целью работы было комплексное исследование влияния пентилентетразолового киндлинга на процессы обучения и памяти, развитие нейродегенерации, а также исследование механизмов гибели нейронов в гиппокампе. Кроме того, целью работы было выявление соотношения вызванной пентилентетразолом конвульсивной активности с одной стороны и процессами

возбуждения в гиппокампе и гибелью нейронов с другой стороны. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние пентилентетразолового киндлинга на способность к обучению условным реакциям пассивного и активного избегания у крыс.

2. Провести патоморфологическое исследование гиппокампа при пентилентетразоловом киндлинге.

3. Исследовать возможное участие окислительного стресса в гибели нейронов.

4. Исследовать возможное участие апоптоза в гибели нейронов.

5. Исследовать возможное участие аберрантного клеточного цикла в гибели нейронов.

6. Изучить соотношение между выраженностью конвульсий после пентилентетразолового киндлинга и степенью нейродегенеративных изменений.

7. Изучить соотношение между выраженностью конвульсий после пентилентетразолового киндлинга и эпилептической активностью мозга.

Научная новизна

В работе впервые проведено комплексное исследование влияния РТЖ на процессы обучения и памяти, развитие нейродегенерации, а также механизмов гибели нейронов в гиппокампе. Кроме того, впервые исследовано соотношение между степенью выраженности конвульсивной активности при РТ2К и паттернами электроэнцефолограммы в гиппокампе, а также гибелью нейронов.

Впервые выявлено, что РТгК сопровождается накоплением продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, и снижением уровня восстановленных тиолов в гиппокампе крыс.

Впервые продемонстрировано участие аберрантного клеточного цикла как возможного механизма гибели нейронов в гиппокампе крыс после РТ2К. Кроме того, показано отсутствие апоптотических ядер в гиппокампе крыс после Í>TZ¥L,

Впервые было проведено сравнительное исследование крыс Вистар,

разделенных на «чувствительных» и «толерантных» к конвульсиям, вызванным РТгК, и установлено, что гибель нейронов и окислительный стресс в гппокампе этих животных не зависят от выраженности конвульсий (нейродегенерацию и окислительный стресс наблюдали и у «толерантных» животных).

Впервые продемонстрирована судорожная активность на ЭЭГ у «толерантных» к конвульсиям крыс. На основе исследований механизма развития PTZK у этих животных предложена новая модель для исследования эпилепсии неконвульсивного типа.

Теоретическая ценность и практическая значимость

В работе систематически исследованы патологические процессы в гиппокампе при экспериментальном моделировании на крысах эпилепсии височной доли.

Выявлены ключевые молекулярные механизмы, сопровождающие нейродегенерацию в данной модели эпилепсии. Морфологически показаны зоны гиппокампа, наиболее чувствительные к повреждению при данной модели эпилепсии. Показано, что нейродегенеративные изменения в гиппокампе сопровождаются окислительным стрессом, при этом гибель нейронов не является апоптотической. Более того, нейродегенерация тесно связана с экспрессией циклина В1 - маркера С2 фазы клеточного цикла. Полученные нами свидетельства вовлечения белков клеточного цикла в гибель нейронов при эпилепсии позволили предположить новый механизм связанных с эпилепсией нейродегенеративных изменений в ЦНС. Выявлены основные механизмы гибели нейронов при РТ2К, которые позволяют предполагать общность путей гибели нейронов при нейродегенеративных заболеваниях и эпилепсии.

Показано, что и у «толерантных» к конвульсиям животных также происходят нейродегенерация и окислительный стресс в гиппокампе, и поэтому наиболее вероятной причиной этих изменений является именно судорожная активность в мозге животных. Чрезвычайно важен для понимания соотношения конвульсий и нейродегенерации тот факт, что гибель нейронов не зависит от выраженности конвульсий.

Понимание механизмов нейродегенерации при эпилепсии позволит более эффективно искать пути патогенетически обоснованного предотвращения гибели нейронов и возможной коррекции дисфункции мозга у больных. Популяцию крыс, подвергнутых PTZK, можно использовать и как модель конвульсивных судорог («чувствительные»), и как модель неконвульсивной эпилепсии («толерантные»). Использование такой модели может дать существенные преимущества в сравнительном изучении различных нарушений и их механизмов при конвульсивной и неконвульсивной эпилепсии.

Положения, выносимые на защиту

1. Пентилентетразоловый киндлинг сопровождается изменением способности к обучению условной реакции активного избегания, окислительным стрессом и нейродегенерацией в гиппокампе.

2. Гибель нейронов не зависит от выраженности конвульсий, не является апоптотической и сопровождается экспрессией циклина В1, маркера фазы G2 клеточного цикла.

3. Животные без выраженных конвульсий после пентилентетразолового киндлинга демонстрируют генерализованную эпилептическую активность в ЭЭГ, отличную по основным характеристикам от таковой у конвульсивных животных.

Апробация работы

Основные результаты работы были доложены (и опубликованы тезисы) на научных конференциях молодых ученых Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, 2002, 2003, 2004, 2005), Ш съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), I международном симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния» (Феодосия, 2002), международном симпозиуме «4th International Symposium on Experimental and Clinical Neurobiology» (Верхние Татры, Словакия, 2003), научной конференции «Опыт интеграции научных исследований НИИ-ВУЗ-Клиника» (Москва, 2002, 2004), XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления

физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004), 8-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Москва, 2004), XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), 20-м съезде Международного нейрохимического общества совместно с Европейским нейрохимическим обществом (Иннсбрук, Австрия, 2005), 35-м ежегодном съезде Общества Нейронаук США (Вашингтон, 2005) и апробированы на совместном семинаре Лаборатории функциональной биохимии нервной системы и Лаборатории нейрохимических механизмов условного рефлекса ИВНДиНФ РАН (Москва, 2005).

Объем и структура диссертации

Диссертация содержит следующие основные разделы: введение, обзор данных литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и библиографический указатель, включающий работы на русском (13) и иностранных языках (274). Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и содержит 2 схемы и 24 рисунка.

Методы исследования

В работе использовано 168 крыс-самцов линии Wistar, массой 250-350 г. Крыс содержали по пять особей в пластмассовых клетках в условии вивария при искусственном световом режиме (день 8:00-20:00) и свободном доступе к воде и пище.

Выработку киндлинга осуществляли путем внутрибрюшинного введения пентилентетразола (PTZ) в субконвульсивной дозе 40 мг/кг, 3 раза в неделю. Контрольным крысам вводили изотонический раствор NaCl (1 мл/кг) в том же режиме. После каждого введения поведение животных наблюдали в течение 20 мин и конвульсивные проявления судорожной активности оценивали по шкале Racine (1972): стадия 0 - отсутствие реакции; стадия 1 - замирание, лицевые автоматизмы, подергивание ушей и вибрисс; стадия 2 - конвульсивные волны, распространяющиеся вдоль оси туловища; стадия 3 - миоклонические судороги со вставанием; стадия 4 - клонические конвульсии с потерей позы; стадия 5 -

повторные сильные клонико-тонические или летальные судороги и для более детальной оценки поведенческих реакций были введены стадии: 0-1, 1-2, 2-3, 3-4 - модификация Franke and Kittner (2001).

Для оценки когнитивных способностей у животных использовали обучение условным реакциям пассивного (УРПИ) и активного избегания (УРАИ). УРПИ вырабатывали на основе однократного электрокожного подкрепления (Bures et al., 1983). УРАИ вырабатывали в челночной камере по стандартной методике (на основе сочетания безусловного (удар током) и условного (свет) раздражителя).

Для биохимических исследований крыс декапитировали в разные сроки после окончания PTZK. Подготовку ткани мозга к биохимическому анализу проводили по методу, описанному ранее (Gulyaeva et al., 1996). Для морфологических исследований мозг фиксировали методом интракардиальной перфузии, в качестве фиксатора использовали 4%-ый нейтральный параформальдегид или смесь формалин: уксусная кислота: этанол в соотношении 2:1:7 (Stepanichev et al., 2000).

Определение продуктов свободнорадикального окисления, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП) проводили по методу Ohkawa et al (1972). Содержание восстановленных белковых и небелковых тиолов (фракция небелковых тиолов в мозге - преимущественно глутатион (Ohkawa et al, 1979)) определяли спектрофотометрическим методом с использованием 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) (Sedlak and Lindsay, 1968). Концентрацию белка оценивали по методу Bradford (1976) с использованием красителя Кумасси голубого.

Патоморфологическое исследование проводили на парафиновых срезах, которые окрашивали в соответствии со стандартными методиками: для оценки морфологического состояния нейронов и подсчета их плотности применяли окраску по Нисслю крезилвиолетом; для оценки необратимости изменений в поврежденных нейронах использовали окраску ванадиево кислым фуксином; для выявления апоптотических ядер использовали процедуру TUNEL (мечение высвобождающихся при деградации ДНК З'-ОН концов); для выявления белков маркеров клеточного цикла использовали иммуногистохимические методы

окраски с применением специфических антител для каждого из белков (циклин D1, циклин В1, PCNA, cdk2, cdk4). Количественный анализ плотности нейронов проводили на срезах, окрашенных по Нисслю, в поле CAI гиппокампа на протяжении полоски в 450мкм (х400), в поле САЗ - в рамке 450x350 мкм (х400), в поле СА4 - полностью (х400), а в зубчатой фасции (ЗФ) - в трех случайно выбранных полях длиной ЗООмкм (х400), расположенных в верхней и нижней ветвях ЗФ, как описано ранее (Stepanichev et al., 2004).

Судорожную активность в мозге крыс после PTZK регистрировали электроэнцефалографически. Запись производили с электродов, вживленных в затылочную кору, гиппокамп и шейные мышцы (референтный - в лобную кость).

Статистическую обработку и анализ результатов проводили при помощи пакета программ "Statistica for Windows". Использовали адекватные поставленным задачам параметрические и непараметрические тесты. Данные представлены в виде M±SEM, если не указано иначе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Нарушение способности к обучению у животных после PTZK

Во многих исследованиях на модели PTZK было показано нарушение когнитивных функций у животных. В данной работе также выявлено изменение способности к обучению в тесте на выработку УРАИ у крыс после развития PTZK. Как видно из рис. 1, хроническое введение PTZ приводило к нарастанию судорожной активности, уже после 4-й инъекции средняя стадия судорог достоверно отличалась от таковой после 1-й инъекции PTZ.

1° 2 2

11 о

4 , Рис. 1. Развитие РТгК.

14-я инъекция сделана через 10 дней после 13-й для проверки сохранности судорожной готовности, п=12.

♦ t

* : ♦ т * • » . 1

i «

Отличия от средней стадии судорог после 1-й инъекции VTZ: * - р<0.05 (тест Вилкоксона).

01 23456789 10 11 12 1314

Число инъекций PTZ

Нарушений обучения животных УРПИ после P^ZK не происходило (рис. 2).

ш

I" в >.

И

о. №

0) ьг

>5 2 Е

х

Р

со

200

150

100

50

Контроль

ртгк

Рис. 2. Обучение УРПИ после РТЯК.

Контроль: п=12; РТгК: п=12.

Т(0)

Т(24)

При обучении УРАИ число избеганий в группе животных после РТ2К не отличалось от такового в контрольной группе (рис. ЗА). Однако выявлено, что внутри группы животных после РТ2К число избеганий находилось в обратной корреляционной зависимости от средней стадии судорог после 2-х последних инъекций РТ2 (11—0.61, р=0.035, тест Спирмана) (рис. ЗБ). Кроме того, как видно из рис. ЗВ, число межсигнальных реакций у крыс после PTZK было увеличено (к 3-й сессии достоверно - на 46 %) в сравнении с контрольными, что косвенно может свидетельствовать о более низкой эффективности обучения у этих крыс.

А

Контроль

30 25

2 20 л>

¡15

I 10

§ 5

1 сессия 2 сессия 3 сессия

Рис. 3. Влияние ТОК на обучение УРАИ.

А - Число избеганий; Б - Корреляция между средней стадией судорог после 2-х последних инъекций PTZ (ось абсцисс) и числом избеганий за 1 сессию обучения (ось ординат); В - Число межсигнальных реакций. Контроль: п=12; РТЖ: п=12 Отличия от группы контрольных животных: * - р<0.05 (тест Манна-Уитни).

Таким образом, PTZK изменял способность крыс к обучению УРАИ, причем характер изменений зависел от степени судорожной активности. Можно предположить, что такие изменения опосредованы, в частности, табелью нейронов в специфических областях мозга.

2. Гибель нейронов и окислительный стресс в гиппокампе животных после

PTZK.

Морфологическое исследование показало, что число неповрежденных нейронов (светлоокрашенные с прозрачными округлыми ядрами) снижалось во всех отделах гиппокампа крыс после PTZK: в СА1 на 11%, САЗ на 10%, СА4 на 13% и ЗФ на 8%, в сравнении с контрольными животными (рис. 4А). При этом в гиппокампе животных, подвергнутых PTZK повсеместно присутствовали нейроны с измененными морфологическими признаками (сжатые, уродливой формы нейроны с гиперхромно окрашенным ядром). Число таких нейронов было выше в CAI в 13 раз, СА4 в 9.5 раз и ЗФ в 3.5 раза, в сравнении с контролем (рис. 4Б).

250

200

I 150

100

50

о

5

Контроль PTZK

СА1 САЗ СА4 ЗФ

а

1S

а)

X X

3

X

X ф

&

ш о

■5 о

1

CAI САЗ СА4 (¿Ó

Рис. 4. Влияние PTZK на число неповрежденных и поврежденных нейронов в гиппокампе крыс.

А - число неповрежденных нейронов, Б - число поврежденных нейронов в полях CAI, САЗ, СА4 и ЗФ гиппокампа контрольных и животных после PTZK. Контроль п= 12; PTZK- п=12 Отличия от группы контрольных животных' * - р<0.05, ** - р< 0.01, + - р<0.1 (тест Манна-Уитни).

Одним из факторов, опосредующих повреждающие эффекты PTZK, является окислительный стресс (Rauca et al, 1999). Уровень ТБК-АП, а также содержание восстановленных белковых и небелковых тиолов в мозге являются надежными маркерами окислительного стресса. Как видно из рис 5, содержание ТБК-АП достоверно увеличивалось на 80%, а уровень белковых тиолов достоверно снижался на 23% в гиппокампе крыс после PTZK, что свидетельствует об интенсификации в нем окислительных процессов.

Таким образом, PTZK приводит к структурным изменениям в гиппокампе, которые сопровождаются окислительным стрессом.

Рис. 5. Влияние PTZK на показатели окислительного стресса в гиппокампе крыс.

А - содержание ТБК-АП, Б - уровень белковых тиолов (ЭН-групп). Контроль п=6; РТгК: п=7 Отличия от группы контрольных животных: * - р<0.05 (тест Манна-Уитни).

3. Механизм гибели нейронов в гиппокампе крыс после PTZK

Механизм гибели нейронов при PTZK до сих пор остается неясным. Морфологическое исследование гиппокампа, проведенное в настоящей работе, не выявило наличия некротических нейронов. Окраска TUNEL, выявляющая апоптотические ядра, также не позволила обнаружить нейроны, гибнующие по апоптотическому пути. В последнее время показано, что при некоторых нейропатолсгических состояниях, в терминально дифференцированных нейронах перед их гибелью может происходить активация клеточного цикла. Поскольку в результате PTZK происходит гибель нейронов в гиппокампе, мы предположили, что этот процесс может быть опосредован аберрантным клеточным циклом.

В нейронах, характеризуемых как поврежденные (рис. 6 А, Б), выявлено позитивное окрашивание для циклина В1 - маркера фазы G2 клеточного цикла

(рис. 6 В, Г). Экспрессии других маркеров клеточного цикла - Dl, PCNA, cdk2 и cdk4 не обнаружено. Наши результаты совпадают с данными, полученными Nagy and Esiri (1998) на образцах биопсии мозга пациентов с эпилепсией височной доли.

я ч л fv <* «■%

JF » % «й

■If 4 i .

Рис. 6. Повреждения нейронов и

экспрессия циклина В1 в гиппокампе крыс после PTZK.

Микрофотографии поля CAI гиппокампа контрольной крысы (А, В) и животного после PTZK (Ь, Г) Срезы окрашены ванадиево кислым фуксином (А, Б) и на циклин В1 (В, Г).

Поврежденные нейроны - сжатые, треугольной формы с гиперхромно окрашенным ядром (толстые стрелки); неповрежденные - светло-окрашенные, с прозрачным округлым ядром (тонкие стрелки). Позитивное окрашивание на циклин В1 в поврежденных нейронах (белые стрелки). Подобные изменения наблюдали и в других отделах гиппокампа. Линейка - 50 мкм.

4. Нейродегенерация и окислительный стресс в гиппокампе крыс, толерантных к PTZK.

В популяции существует значительная разница в индивидуальной чувствительности особей к проконвульсивным воздействиям. Так, по мере развития PTZK одни животные показывают выраженные клонико-тонические судороги («чувствительные» крысы - ЧК), максимальные же проявления судорожной активности у других выглядят как кратковременные замирания, сопровождающиеся лицевыми автоматизмами («толерантные» крысы - ТК). Обычно этих крыс исключают из эксперимента, однако, известно, что даже однократное введение PTZ в подпороговой дозе приводит к появлению спайк-волновых комплексов в электроэнцефалограмме (Marescaux et al., 1984). Задача этой части работы состояла в исследовании соотношения между выраженностью конвульсий после PTZK у ЧК и ТК и степенью нейродегенеративных изменений в гиппокампе.

Из рис. 7 видно, что хроническое введение РТг приводило к постепенному нарастанию конвульсивной активности у ЧК, проявлявшемуся в появлении миоклонизмов, их учащению, клонических судорогах передних конечностей, с подъемом на задние лапы. Начиная с 3-4-й инъекции PTZ, выделялись ТК, у которых не происходило заметного усиления конвульсивных проявлений, а средняя сила судорог у ТК оставалась близкой к первоначальному уровню (начиная с 4-й инъекции была достоверно ниже, чем у ЧК).

Рис. 7. Развитие РТгК у ЧК и ТК

Начиная с 4-й инъекции средняя стадия судорог у ТК достоверно ниже таковой у ЧК. ЧК: п=34; ТК: п=33. (* -р<0.05; тест Манна-Уитни).

1 2 3 4 5 в 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2122

Число инъекций РТг

Из данных, представленных на рис. 8А, Б, видно, что после завершения РТ2Ж в гиппокампе как ЧК, так и ТК обнаруживается нейродегенерация.

Рис. 8. Влияние PTZK на число неповрежденных и поврежденных нейронов в гиппокампе ЧК и ТК.

А - число нормальных нейронов, Б - число поврежденных нейронов в полях CAI, САЗ, СА4 и ЗФ гиппокампа контрольных животных, а также ЧК и ТК. Контроль: п=6; ЧК: п=7; ТК: п=6. Отличия от группы контрольных животных: * - р<0.05, р<0.1 (тест Манна-Уитни)

Как видно из рис. 9, уровень небелковых тиолов (глутатиона) после РТ2К был достоверно снижен как в гиппокампе ЧК (на 14%), так и у ТК (на 7%), что свидетельствует об окислительном стрессе в гиппокампе крыс обеих групп.

Таким образом, «толерантные» к развитию конвульсивных судорог при РТ2К крысы демонстрируют нейродегенеративные изменения в гиппокампе, сопровождающие окислительный стресс, сходные с таковыми у «чувствительных» крыс.

д 0,20

Рис. 9. Влияние РТ2Х на уровень восстановленного глутатиона в гиппокампе ЧК и ТК.

Отличия от группы контрольных животных: * - р<0.05, ** - р<0.01 (тест Манна-Уитни). Контроль: п=13; ЧК: п=4; ТК: п=8.

Контроль

5. Судорожная активность на электроэнцефалограмме у толерантных к ртгк крыс.

У чувствительных к РТ2К крыс хроническое введение подпороговой дозы РТ2 приводит к прогрессирующей интенсификации судорожной активности, включая как её электроэнцефалографическую, так и конвульсивную составляющие (Ко е1 а1, 1977). Как было упомянуто выше, среди животных, подвергнутых РТ7К, выделяется группа, не демонстрирующая выраженной конвульсивной составляющей (клонико-тонической стадии судорог) на протяжении всего периода киндлинга - «толерантные» крысы (ТК). Тем не менее, у ТК при отсутствии выраженной конвульсивной активности мы выявили нейродегенерацию и окислительный стресс в гиппокампе. Известно, что даже при однократном введении РТ7 в подпороговой дозе, не вызывающей конвульсий, наблюдают появление спайк-волновых комплексов в электроэнцефалограмме (АЬЬавоуа е! а1., 2004; Магеясаих е1 а!., 1984). В этой части работы мы исследовали

электроэнцефалографическую активность в мозге «чувствительных» и «толерантных» крыс после PTZK.

Введение подпороговой дозы PTZ (challenge), по окончании PTZK вызвало характерные изменения электрической активности в мозге ЧК и ТК. Сразу после инъекции PTZ, но до появления конвульсий у ЧК, в обеих группах наблюдали короткие (2-3 с) генерализованные судорожные разряды (CP) частотой 5-7 Гц (рис. 10). Однако CP у ЧК имели ярко выраженный первый пик, встречались в ЭЭГ чаще, чем у ТК, а амплитуда CP составляла 800-900 мкВ, тогда как у ТК -400-500 мкВ.

Кюпроль ff^i^Mri^M^

ТК

_|300 мкВ

1 с

Рис. 10. Паттерн ЭЭГ у ЧК и ТК после инъекции РТЖ в период отсутствия конвульсий.

Канал записи «Лобная кость-гиппокамп».

У ТК на протяжении всего периода записи ЭЭГ наблюдались короткие СР с частотой 7-8 Гц, которые сопровождались кратковременными замираниями, у ЧК по мере развития конвульсий наблюдали изменение паттерна ЭЭГ, характерное для каждой достигнутой стадии судорог (рис. 11). Клонические судороги сопровождались высокоамплитудными полиспайками частотой 2-4 Гц, которые перемежались изолированными спайк-волновыми разрядами (рис. 11В). Тоническая фаза судорог сопровождалась полиспайками высокой амплитуды и частоты, которые чередовались периодами сглаживания ЭЭГ (рис. ИГ).

Рис. 11. Паттерны ЭЭГ у ЧК после инъекции PTZ, в период конвульсий.

А - паттерн ЭЭГ у ЧК до последней инъекции PTZ (challenge), через 7 дней после завершения PTZK; Б - паттерн ЭЭГ при конвульсивных волнах, распространяющихся вдоль оси туловища; В - паттерн ЭЭГ при миоклонических судорогах со вставанием; Г - паттерн ЭЭГ при клонических конвульсиях с потерей позы. Канал записи «Лобная кость-гиппокамп».

Как видно из рис. 12А судорожная активность в ЭЭГ ТК появлялась в среднем на 45 с раньше, чем у ЧК. Число CP за весь период записи ЭЭГ у ТК было снижено на 60 % (рис. 12Б) в сравнении с ЧК.

Средняя длительность CP за весь период записи ЭЭГ у ЧК и ТК не различалась, однако суммарная длительность CP за первые 45 мин была достоверно меньше у ТК, в сравнении с ЧК (рис. 12 В, Г).

FBüW тЩ

15 30 45 60 75 90 я после PTZ инъекции, мин

Рис. 12. Сравнение основных свойств СР у ЧК и ТК.

А - латентный период СР; Б - число СР; В - Средняя длительность СР; Г - Суммарная длительность СР, ча каждые последующие 15 мин от момента инъекции PTZ ЧК: n=17; ТК: п=3 Различия между ЧК и ТК: * - р<0.05,р<0.1 (тест Манна-Уитни). Med [Q25-Q75].

Как видно из рис. 13, пик мощности частот у ТК был ярко выражен и приходился на 7.2 Гц, тогда как у ЧК такого пика нет. Такое распределение мощности частот в ЭЭГ (7-9 Гц) характерно для судорог типа абсанс, моделируемых однократным введением РТг в низких дозах (Чепурнов и соавт., 2005). Таким образом, при РТ2К выявлена эпилептическая активность в ЭЭГ, независимо от чувствительности животных к конвульсиям, однако характеристики этой активности различались у ЧК и ТК.

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Частота, Гц

Рис. 13. Распределение мощности частот у ЧК и ТК.

До недавнего времени считалось, что генерализованная неконвульсивная судорожная активность (абсанс-эпилепсия) не вызывает значительных структурных изменений в ЦНС, в отличие от конвульсивной эпилепсии. Однако появляется все больше фактов, свидетельствующих о том, что судороги типа абсанс обладают повреждающим действием, поскольку у пациентов с абсанс эпилепсией встречаются нарушения когнитивных функций (Pavone et al, 2001). Часто эпилепсия типа абсанс может переходить в конвульсивную эпилепсию с генерализованными тонико-клоническими судорогами (Bouma et al, 1996). Это позволяет предположить, что судорожной активности в мозге, без конвульсивной составляющей, достаточно для провоцирования структурно-функциональных изменений в ЦНС. Действительно, мы показали, что, несмотря на отсутствие конвульсивного поведения у ТК, у них выявлена судорожная активность в мозге, и именно она представляется наиболее вероятной причиной окислительного стресса, который, в свою очередь, приводит к гибели нейронов в гиппокампе у ТК. Конечно, при PTZK нельзя исключить участия эксайтотоксичности, вызванной введением PTZ, в гибели нейронов гиппокампа. Однако, гибель нейронов продолжается и через 10 недель после окончания PTZK (Franke and Kittner, 2001). Это может указывать на то, что причиной гибели нейронов в этой модели является не только, и не столько гипервозбуждение и непосредственное «эксайтотоксичноское» действие PTZ, а скорее иные, связанные с киндлингом механизмы (например, окислительный стресс и/или активация аберрантного клеточного цикла).

Заключение

Таким образом, при моделировании эпилепсии у крыс путем PTZK выявлено изменение поведения в тесте УРАИ, тем более выраженное, чем более выраженными были конвульсии. Изменение когнитивных способностей наблюдают как при эпилепсии у человека (особенно при судорожной активности с сильной «моторной» составляющей) (Halgren et al, 1991), так и при моделировании эпилепсии различными способами на животных (Beldhuis et al, 1992; Becker et al, 1995). Такие нарушения поведения после судорог могут свидетельствовать о структурно-функциональных перестройках, а возможно и гибели нейронов в ответственных за обучение отделах мозга (например, гиппокампе) человека и животных.

Нами выявлена гибель нейронов в гиппокампе крыс после PTZK, как одном из наиболее чувствительных к судорогам отделе. Считают, что при моделировании эпилептических судорог с использованием широкого спектра эпилептогенных факторов паттерн гибели нейронов в гиппокампе животных сходен с таковым при эпилепсии у человека (Mello et al, 1993, Sutula et al, 1988). Несмотря на различия специфических эффектов этих факторов на нейроны, все эти факторы обладают способностью вызывать судорожную активность. В связи с этим предполагают, что именно судорожная активность, а не прямое токсическое действие каждого из эпилептогенных факторов вызывает повреждения нейронов (рис. 14).

Общим молекулярным механизмом, участвующим в гибели нейронов при всех патологических состояниях, является окислительный стресс. В данном исследовании на модели PTZK выявлен окислительный стресс в гиппокампе, где и происходят основные нейродегенеративные изменения. При судорогах, вызванных PTZK, к окислительному стрессу могут привести как прямое токсическое действие PTZ и опосредующая его эксайтотоксичность, так и процессы, индуцируемые судорожной активностью (рис. 14). Однако известно, что, во-первых, период полураспада PTZ в мозге грызунов составляет 2.5-3.8 ч, а гибель нейронов наблюдают и через полгода после окончания PTZK (Franke and Kittner, 2001); во-вторых, как упоминалось выше, паттерн нейродегенеративных

изменений не зависит от типа факторов, вызывающих эпилептические судороги. Исходя из этих двух фактов, можно предположить, что окислительный стресс и последующая нейродегенерация, видимо, не являются следствиями прямого токсического эффекта PTZ, и скорее связаны с вызванной PTZK судорожной активностью в мозге.

Описано много молекулярных механизмов, вовлеченных в нейродегенерацию, но основные сценарии гибели клеток немногочисленны: некроз, апоптоз или, как недавно было показано, активация аберрантного клеточного цикла (Herrup et al., 2004). В данной работе на модели PTZK не выявлено апоптотической гибели нейронов. Однако экспрессия маркера G2 фазы клеточного цикла, циклина В1, в гиппокампе крыс после PTZK, позволяет предположить, что гибель нейронов в этой модели эпилепсии связана с активацией аберрантного клеточного цикла. Этот результат, полученный в настоящей работе, открывает новое направление в исследовании механизма нейродегенерации при эпилепсии.

Впервые показана гибель нейронов и окислительный стресс в гиппокампе животных, не демонстрирующих конвульсивную активность при PTZK. Ранее не были исследованы причины таких изменений, поскольку этих животных просто исключали из эксперимента, как не выработавших PTZK. Однако исследование ЭЭГ выявило эпилептическую активность в мозге таких неконвульсивных животных. Остается открытым вопрос о том, может ли судорожная активность в мозге, не выходящая на уровень моторной судорожной активности, вызывать гибель нейронов у неконвульсивных животных. Этот вопрос тем более важен, что неконвульсивные формы эпилепсии до сих пор считают менее «повреждающими» для мозга, чем конвульсивные формы (Wong, 2003). Исходя из имеющихся данных, конвульсивную активность сопровождают относительно более выраженные судорожные разряды (например, с более высокой амплитудой, частотой). Такие судорожные разряды с большей эффективностью вовлекают удаленные нейронные сети, которые могут запускать моторные судороги. Однако неясно, достаточно ли судорожной активности в мозге, наблюдаемой у «толерантных» крыс, для инициации механизмов гибели. Вопрос о том, какие

именно факторы инициируют гибель нейронов у «толерантных» и «чувствительных» крыс, а также являются ли эти механизмы общими для этих групп животных, требует дальнейших исследований.

Рис. 14. Факторы, приводящие к гибели нейронов при эпилепсии.

Наиболее вероятные пути повреждения для судорожной активности без конвульсивной составляющей - 1, с конвульсивной составляющей - 2. По-видимому, оба пути в той или иной степени имеют место при конвульсивной и неконвульсивной судорожной активности. Схема составлена по данным литературы и результатам собственных исследований.

Выводы

1. Пентилентетразоловый киндлинг вызывает изменение поведения у крыс в тесте условной реакции активного избегания, но не условной реакции пассивного избегания. При обучении условной реакции активного избегания наблюдается модификация поведения, в частности, увеличивается число межсигнальных реакций на 46%.

2. У крыс, подвергнутых пентилентетразоловому киндлингу, происходит накопление в гиппокампе продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (на 80%) и снижение содержания белковых тиолов на 23 %.

3. Пентилентетразоловый киндлинг вызывает нейродегенерацию в гиппокампе крыс. Плотность неповрежденных нейронов достоверно снижается в поле CAI на 11%, в поле СА4 на 13% и в зубчатой фасции на 8%. При этом число поврежденных нейронов достоверно увеличивается в поле CAI в 13 раз, в поле СА4 в 9.5 раз и зубчатой фасции в 3.5 раза.

4. После пентилентетразолового киндлинга в гибнущих нейронах гиппокампа не обнаружено маркеров апоптоза (TUNEL-позитивньтх ядер), однако выявлена экспрессия циклина В1, маркера G2 фазы клеточного цикла.

5. Предполагается, что опосредованная окислительным стрессом нейродегенерация при пентилентетразоловом киндлинге идет не по апоптотическому пути, но связана с активацией аберрантного клеточного цикла.

6. При разделении популяции на крыс с разной чувствительностью к пентилентетразоловому киндлингу по параметрам конвульсивной активности показано, что, у «толерантных» крыс происходят нейродегенерация и окислительный стресс в гиппокампе, а также проявляются генерализованные судорожные разряды в электроэнцефалограмме, как и у «чувствительных».

7. Электроэнцефалографические характеристики различаются у «чувствительных» и «толерантных» крыс. У «толерантных» число

судорожных разрядов после инъекции пентилентетразола на 60 % меньше, чем у «чувствительных», и судорожные разряды появляются раньше на 45 с. Суммарная длительность судорожных разрядов за первые 45 мин после инъекции пентилентетразола у «толерантных» крыс ниже на 68%, хотя «чувствительные» и «толерантные» крысы не различаются по средней длительности судорожных разрядов. Пик мощности частот у «толерантных» приходится на 7.2 Гц, тогда как у «чувствительных» пик не выражен ярко. Поскольку при пентилентетразоловом киндлинге выявлена нейродегенерация в гиппокампе и эпилептическая активность в электроэнцефалограмме, независимо от чувствительности животных к проявлению конвульсий, популяцию крыс, подвергнутых пентилентетразоловому киндлингу, можно использовать и как модель конвульсивных судорог («чувствительные»), и как модель неконвульсивной эпилепсии («толерантные»).

Список опубликованных статей по теме диссертации

1. Т.В. Павлова, А.А. Яковлев, A.M. Менджерицкий, М.Ю. Степаничев, Н.В. Гуляева. Пентилентетразоловый киндлинг вызывает окислительный стресс в мозге крыс // Нейрохимия. 2002. №2. с. 123-126.

2. Т.В. Павлова, А.А. Яковлев, A.M. Менджерицкий, М.Ю. Степаничев, Н.В. Гуляева. Пентилентетразоловый киндлинг вызывает активацию каспазы-3 в мозге крыс // Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова.

2003. Т. 53 №1. с. 110-113. (T.V. Pavlova, А.А. Yakovlev, M.Y. Stepanichev, A.M. Mendzheritskii, N.V. Gulyaeva. Pentylenetetrazol kindling induces activation of caspase-3 in the rat brain // Neurosci. Behav. Physiol. 2004. V. 34. № 1. P. 45-47.)

3. А.А. Яковлев, Д.И. Перегуд, Т.В. Павлова, Н.В. Гуляева. Эффекты острого введения пентилентетразола и пентилентетразолового киндлинга: окислительный стресс и активность NO-синтазы в мозге // Нейрохимия.

2004. Т. 21. №1. с. 58-67.

4. Т.В. Павлова, А.А. Яковлев, М.Ю. Степаничев, Н.В. Гуляева. Пентилентетразоловый киндлинг у крыс: связана ли нейродегенерация с проявлениями судорожной активности? //Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2005 Т. 91. №7. с. 764-775 (T.V. Pavlova, А.А. Iakovlev, M.Iu. Stepanichev, N.V. Guliaeva. Pentylenetetrazole kindling in rats: whether neurodegeneration is associated with manifestations of seizure activity? // Ross Fiziol Zh Im I M Sechenova. 2005. V. 91. № 7. P. 764-775.)

5. T.V. Pavlova, M.Yu. Stepanichev, N.V. Gulyaeva. Pentylenetetrazole kindling induces neuronal cyclin B1 expression in rat hippocampus // Neuroscience Letters. 2006. V. 34. № 1-2. P. 45-47.

Павлова Татьяна Васильевна

ПЕНТИЛЕНТЕТРАЗОЛОВЫЙ КИНДЛИНГ У КРЫС ВЛИЯНИЕ 11А ОБУЧЕНИЕ, НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ ГИБЕЛИ НЕЙРОНОВ В ГИППОКАМПЕ

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, Ленинский пр-т, д.37А Тираж 70 экз.

» 90

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Павлова, Татьяна Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Эпилепсия.

1.2 Склероз гиппокампа.

1.3 Моделирование судорожной активности и эпилепсии на животных

1.4 Феномен киндлинга.

1.5 Пентилентетразоловый киндлинг.

1.6 Структурно-функциональные перестройки в гиппокампе при моделировании эпилепсии на грызунах.

1.7 Гипотеза «эксайтотоксического повреждения» при судорожной активности.

1.8 Окислительный стресс при судорожной активности.

1.9 Пути гибели клетки в норме и патологии.

1.10 Пути гибели нейронов при судорожной активности.

1.11 Обоснование комплексного исследования модели пентилентетразолового киндлинга.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Работа с животными.

2.2 Моделирование пентилентетразолового киндлинга на крысах.

2.3 Исследование способности крыс к обучению.

2.3.1 Условная реакция пассивного избегания.

2.3.2 Условная реакция активного избегания.

2.4 Биохимические методы исследования.

2.4.1 Приготовление гомогенатов ткани мозга.

2.4.2 Определение содержания продуктов реагирующих с тиобарбитуровой кислотой

2.4.3 Определение содержания SH-групп.

2.4.4 Определение содержания белка.

2.5 Морфологические и иммуногистохимические методы исследования

2.5.1 Подготовка ткани мозга к патоморфологическому исследованию.

2.5.2 Подсчет нейронов в отделах гиппокампа.

2.5.3 Выявление фрагментированной ДНК в нейронах гиппокампа.

2.5.4 Исследование экспрессии циклинов в нейронах гиппокампа.

2.6 Электроэнцефалографическое исследование.

2.6.1 Подготовка животных к исследованию.

2.6.2 Регистрация электроэнцефалограммы.

2.7 Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Исследование способности к обучению у животных после пентилентетразолового киндлинга.

3.1.1 Развитие пентилентетразолового киндлинга.

3.1.2 Влияние пентилентетразолового киндлинга на условную реакцию активного и пассивного избегания у крыс.

3.2 Нейропатологические изменения в результате пентилентетразолового киндлинга и их возможные механизмы.

3.2.1 Нейродегенерация в гиппокампе животных в результате пентилентетразолового киндлинга.

3.2.2 Участие окислительного стресса в гибели нейронов.

3.2.3 Принимает ли участие апоптоз в нейродегенеративных изменениях в результате пентилентетразолового киндлинга?.

3.2.4 Активация клеточного цикла при гибели нейронов в результате пентилентетразолового киндлинга.

3.3 Взаимосвязь между конвульсивной активностью, судорожной активностью в мозге, а также нейродегенерацией в гиппокампе крыс после пентилентетразолового киндлинга.

3.3.1 Нейродегенерация и окислительный стресс в гиппокампе чувствительных и толерантных к пентилентетразоловому киндлингу животных.

3.3.2 Исследование электроэнцефалограммы чувствительных и толерантных к пентилентетразоловому киндлингу животных.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пентилентетразоловый киндлинг у крыс: влияние на обучение, нейродегенерация и механизмы гибели нейронов в гиппокампе"

Эпилепсия является одним из наиболее распространенных заболеваний нервной системы, а её лечение является актуальной медико-социальной задачей. Заболеваемость эпилепсией составляет 50-70/100000 человек, распространенность 5-10/1000 человек. Это заболевание сопровождается значительными социальными трудностями, моральными и физическими страданиями больного и членов его семьи. Эпилепсия является одним из приоритетов Всемирной Организации Здравоохранения, проводящей глобальную кампанию "Эпилепсия - из тени". Проявления эпилепсии разнообразны: от кратковременного нарушения сознания до тяжелых конвульсий. Она характеризуется повторными приступами, являющимися симптомами дисфункции мозга. Не менее одного припадка в течение жизни переносят 5 % населения, у 20-30 % больных эпилепсия является пожизненной. Многие больные эпилепсией испытывают серьезные социальные проблемы, которые часто обусловлены нарушением когнитивной функции при этом состоянии. Можно полагать, что нарушение функционирования мозга при эпилепсии обусловлено не только дисфункцией отдельных групп нейронов, но и их гибелью.

Несмотря на то, что эпилепсия не относится к собственно нейродегенеративным заболеваниям, нейродегенерация при многих ее формах считается доказанной (Duncan, 2002). Поэтому чрезвычайно актуальной задачей является исследование механизмов нейродегенерации при эпилепсии. Решение этой задачи необходимо для поиска путей предотвращения гибели нейронов и возможной коррекции дисфункции мозга у больных эпилепсией.

Одним из наиболее удобных экспериментальных приёмов для исследования механизмов изменений, связанных с эпилепсией, является пентилентетразоловый киндлинг (PTZK), поскольку при этом наблюдаются нарушения, в определенной степени аналогичные таковым при эпилепсии височной доли у человека (McNamara, 1985). У экспериментальных животных развиваются судороги, нарушается поведение, повреждаются нейроны. Однако экспериментальных подтверждений гибели нейронов при PTZK немного. Pohle et al. (1997) и Franlce and Kittner (2001) показали, что PTZK может вызывать умеренную дегенерацию нейронов в гиппокампе. Механизм гибели нейронов при этом неясен. Однако при амигдалярном электрическом киндлинге удалось установить, что гибель некоторых нейронов в гиппокампе может происходить по апоптотическому пути (Zhang et al., 1997). В последние годы появляются данные о том, что в нейронах может происходить активация аберрантного клеточного цикла, приводящая в конечном итоге к нейродегенерации. Так, например, при эпилепсии височной доли у человека была обнаружена экспрессия нейронального циклина В1 в гиппокампе (Nagy and Esiri, 1998). Поскольку PTZK является общепринятой моделью этой формы эпилепсии, представлялось вероятным, что гибель нейронов при PTZK также происходит с вовлечением активации клеточного цикла.

Неоднократно предпринимались попытки установить количественную связь между силой клонико-тонических судорог, вызванных различными воздействиями, и гибелью нервных клеток в гиппокампе. В некоторых случаях, например, при использовании повторяющегося электрошока, такая связь была обнаружена (Зарубенко и соавт., 2004). В то же время при введении каината такой связи выявлено не было (Berger et al, 1989), несмотря на наличие корреляции между силой судорог и рядом показателей окислительного стресса и апоптоза в гиппокампе (Stepanichev et al., 2000). Важно отметить, что до сих пор многие исследователи считают эпилепсию с конвульсивными проявлениями значительно более эффективной в отношении повреждений в селективно чувствительных отделах мозга (в частности, амигдале и гиппокампе), чем эпилепсию без конвульсий, например типа абсанс (Wong, 2003).

Цель работы и основные задачи исследования

Основной целью работы было комплексное исследование влияния пентилентетразолового киндлинга на процессы обучения и памяти, развитие нейродегенерации, а также исследование механизмов гибели нейронов в гиппокампе. Кроме того, целью работы было выявление соотношения вызванной пентилентетразолом конвульсивной активности с одной стороны и процессами возбуждения в гиппокампе и гибелью нейронов с другой стороны. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние пентилентетразолового киндлинга на способность к обучению условным реакциям пассивного и активного избегания у крыс.

2. Провести патоморфологическое исследование гиппокампа при пентилентетразоловом киндлинге.

3. Исследовать возможное участие окислительного стресса в гибели нейронов.

4. Исследовать возможное участие апоптоза в гибели нейронов.

5. Исследовать возможное участие аберрантного клеточного цикла в гибели нейронов.

6. Изучить соотношение между выраженностью конвульсий после пентилентетразолового киндлинга и степенью нейродегенеративных изменений.

7. Изучить соотношение между выраженностью конвульсий после пентилентетразолового киндлинга и эпилептической активностью мозга.

Научная новизна

В работе впервые проведено комплексное исследование влияния PTZK на процессы обучения и памяти, развитие нейродегенерации, а также механизмов гибели нейронов в гиппокампе. Кроме того, впервые исследовано соотношение между степенью выраженности конвульсивной активности при PTZK и паттернами электроэнцефолограммы в гиппокампе, а также гибелью нейронов.

Впервые выявлено, что PTZK сопровождается накоплением продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, и снижением уровня восстановленных тиолов в гиппокампе крыс.

Впервые продемонстрировано участие аберрантного клеточного цикла как возможного механизма гибели нейронов в гиппокампе крыс после PTZK. Кроме того, показано отсутствие апоптотических ядер в гиппокампе крыс после PTZK.

Впервые было проведено сравнительное исследование крыс Вистар, разделенных на «чувствительных» и «толерантных» к конвульсиям, вызванным PTZK, и установлено, что гибель нейронов и окислительный стресс в гппокампе этих животных не зависят от выраженности конвульсий (нейродегенерацию и окислительный стресс наблюдали и у «толерантных» животных).

Впервые продемонстрирована судорожная активность на ЭЭГ у «толерантных» к конвульсиям крыс. На основе исследований механизма развития PTZK у этих животных предложена новая модель для исследования эпилепсии неконвульсивного типа.

Теоретическая ценность и практическая значимость

В работе систематически исследованы патологические процессы в гиппокампе при экспериментальном моделировании на крысах эпилепсии височной доли.

Выявлены ключевые молекулярные механизмы, сопровождающие нейродегенерацию в данной модели эпилепсии. Морфологически показаны зоны гиппокампа, наиболее чувствительные к повреждению при данной модели эпилепсии. Показано, что нейродегенеративные изменения в гиппокампе сопровождаются окислительным стрессом, при этом гибель нейронов не является апоптотической. Более того, нейродегенерация тесно связана с экспрессией циклина В1 - маркера G2 фазы клеточного цикла. Полученные нами свидетельства вовлечения белков клеточного цикла в гибель нейронов при эпилепсии позволили предположить новый механизм связанных с эпилепсией нейродегенеративных изменений в ЦНС. Выявлены основные механизмы гибели нейронов при PTZK, которые позволяют предполагать общность путей гибели нейронов при нейродегенеративных заболеваниях и эпилепсии.

Показано, что и у «толерантных» к конвульсиям животных также происходят нейродегенерация и окислительный стресс в гиппокампе, и поэтому наиболее вероятной причиной этих изменений является именно судорожная активность в мозге животных. Чрезвычайно важен для понимания соотношения конвульсий и нейродегенерации тот факт, что гибель нейронов не зависит от выраженности конвульсий.

Понимание механизмов нейродегенерации при эпилепсии позволит более эффективно искать пути патогенетически обоснованного предотвращения гибели нейронов и возможной коррекции дисфункции мозга у больных. Популяцию крыс, подвергнутых PTZK, можно использовать и как модель конвульсивных судорог («чувствительные»), и как модель неконвульсивной эпилепсии («толерантные»). Использование такой модели может дать существенные преимущества в сравнительном изучении различных нарушений и их механизмов при конвульсивной и неконвульсивной эпилепсии.

Положения, выносимые на защиту

1. Пентилентетразоловый киндлинг сопровождается изменением способности к обучению условной реакции активного избегания, окислительным стрессом и нейродегенерацией в гиппокампе.

2. Гибель нейронов не зависит от выраженности конвульсий, не является апоптотической и сопровождается экспрессией циклина В1, маркера фазы G2 клеточного цикла.

3. Животные без выраженных конвульсий после пентилентетразолового киндлинга демонстрируют генерализованную эпилептическую активность в ЭЭГ, отличную по основным характеристикам от таковой у конвульсивных животных.

Апробация работы

Основные результаты работы были доложены (и опубликованы тезисы) на научных конференциях молодых ученых Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, 2002, 2003, 2004, 2005), III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), I международном симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния» (Феодосия, 2002), международном симпозиуме «4th International Symposium on Experimental and Clinical Neurobiology» (Верхние Татры, Словакия, 2003), научной конференции «Опыт интеграции научных исследований НИИ-ВУЗ-Клиника» (Москва, 2002, 2004), XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004), 8-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых

Биология - наука XXI века» (Москва, 2004), XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), 20-м съезде Международного нейрохимического общества совместно с Европейским нейрохимическим обществом (Иннсбрук, Австрия, 2005), 35-м ежегодном съезде Общества Нейронаук США (Вашингтон, 2005) и апробированы на совместном семинаре Лаборатории функциональной биохимии нервной системы и Лаборатории нейрохимических механизмов условного рефлекса ИВНДиНФ РАН (Москва, 2005).

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Павлова, Татьяна Васильевна

выводы

1. Пентилентетразоловый киндлинг вызывает изменение поведения у крыс в тесте условной реакции активного избегания, но не условной реакции пассивного избегания. При обучении условной реакции активного избегания наблюдается модификация поведения, в частности, увеличивается число межсигнальных реакций на 46%.

2. У крыс, подвергнутых пентилентетразоловому киндлингу, происходит накопление в гиппокампе продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (на 80%) и снижение содержания белковых тиолов на 23 %.

3. Пентилентетразоловый киндлинг вызывает нейродегенерацию в гиппокампе крыс. Плотность неповрежденных нейронов достоверно снижается в поле СА1 на 11%, в поле СА4 на 13% и в зубчатой фасции на 8%. При этом число поврежденных нейронов достоверно увеличивается в поле СА1 в 13 раз, в поле СА4 в 9.5 раз и зубчатой фасции в 3.5 раза.

4. После пентилентетразолового киндлинга в гибнущих нейронах гиппокампа не обнаружено маркеров апоптоза (TUNEL-позитивных ядер), однако выявлена экспрессия циклина В1, маркера G2 фазы клеточного цикла.

5. Предполагается, что опосредованная окислительным стрессом нейродегенерация при пентилентетразоловом киндлинге идет не по апоптотическому пути, но связана с активацией аберрантного клеточного цикла.

6. При разделении популяции на крыс с разной чувствительностью к пентилентетразоловому киндлингу по параметрам конвульсивной активности показано, что, у «толерантных» крыс происходят нейродегенерация и окислительный стресс в гиппокампе, а также проявляются генерализованные судорожные разряды в электроэнцефалограмме, как и у «чувствительных».

7. Электроэнцефалографические характеристики различаются у «чувствительных» и «толерантных» крыс. У «толерантных» число судорожных разрядов после инъекции пентилентетразола на 60 % меньше, чем у «чувствительных», и судорожные разряды появляются раньше на 45 с. Суммарная длительность судорожных разрядов за первые 45 мин после инъекции пентилентетразола у «толерантных» крыс ниже на 68%, хотя «чувствительные» и «толерантные» крысы не различаются по средней длительности судорожных разрядов. Пик мощности частот у «толерантных» приходится на 7.2 Гц, тогда как у «чувствительных» пик не выражен ярко.

8. Поскольку при пентилентетразоловом киндлинге выявлена нейродегенерация в гиппокампе и эпилептическая активность в электроэнцефалограмме, независимо от чувствительности животных к проявлению конвульсий, популяцию крыс, подвергнутых пентилентетразоловому киндлингу, можно использовать и как модель конвульсивных судорог («чувствительные»), и как модель неконвульсивной эпилепсии («толерантные»).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, при моделировании эпилепсии у крыс путем PTZK выявлено изменение поведения в тесте УРАИ, тем более выраженное, чем более выраженными были конвульсии. Изменение когнитивных способностей наблюдают как при эпилепсии у человека (особенно при судорожной активности с сильной «моторной» составляющей) (Halgren et al, 1991), так и при моделировании эпилепсии различными способами на животных (Beldhuis et al, 1992; Becker et al, 1995). Такие нарушения поведения после судорог могут свидетельствовать о структурно-функциональных перестройках, а возможно и гибели нейронов в ответственных за обучение отделах мозга (например, гиппокампе) человека и животных.

Нами выявлена гибель нейронов в гиппокампе крыс в результате PTZK, как одном из наиболее чувствительных к судорогам отделе. Считают, что при моделировании эпилептических судорог с использованием широкого спектра эпилептогенных факторов паттерн гибели нейронов в гиппокампе животных сходен с таковым при эпилепсии у человека (Mello et al, 1993, Sutula et al, 1988). Несмотря на различия специфических эффектов этих факторов на нейроны, все эти факторы обладают способностью вызывать судорожную активность. В связи с этим предполагают, что именно судорожная активность, а не прямое токсическое действие каждого из эпилептогенных факторов вызывает повреждения нейронов (рис. 28).

Общим молекулярным механизмом, участвующим в гибели нейронов при всех патологических состояниях, является окислительный стресс. В данном исследовании на модели PTZK выявлен окислительный стресс в гиппокампе, где и происходят основные нейродегенеративные изменения. При судорогах, вызванных PTZK, к окислительному стрессу могут привести как прямое токсическое действие PTZ и опосредующая его эксайтотоксичность, так и процессы, индуцируемые судорожной активностью (рис. 28). Однако известно, что, во-первых, период полураспада PTZ в мозге грызунов составляет 2.5-3.8 ч, а гибель нейронов наблюдают и через полгода после окончания PTZK (Franke and Kittner, 2001); во-вторых, как упоминалось выше, паттерн нейродегенеративных изменений не зависит от типа факторов, вызывающих эпилептические судороги. Исходя из этих двух фактов, можно предположить, что окислительный стресс и последующая нейродегенерация, видимо, не являются следствиями прямого токсического эффекта PTZ, и скорее связаны с вызванной PTZK судорожной активностью в мозге.

Описано много молекулярных механизмов, вовлеченных в нейродегенерацию, но основные сценарии гибели клеток немногочисленны: некроз, апоптоз или, как недавно было показано, активация аберрантного клеточного цикла (Herrup et al., 2004). В данной работе на модели PTZK не выявлено апоптотической гибели нейронов. Однако экспрессия маркера G2 фазы клеточного цикла, циклина В1, в гиппокампе крыс после PTZK, позволяет предположить, что гибель нейронов в этой модели эпилепсии связана с активацией аберрантного клеточного цикла. Этот результат, полученный в настоящей работе, открывает новое направление в исследовании механизма нейродегенерации при эпилепсии.

Впервые показана гибель нейронов и окислительный стресс в гиппокампе животных, не демонстрирующих конвульсивную активность при PTZK. Ранее не были исследованы причины таких изменений, поскольку этих животных просто исключали из эксперимента, как не выработавших PTZK. Однако исследование ЭЭГ выявило эпилептическую активность в мозге таких неконвульсивных животных. Остается открытым вопрос о том, может ли судорожная активность в мозге, не выходящая на уровень моторной судорожной активности, вызывать гибель нейронов у неконвульсивных животных. Этот вопрос тем более важен, что неконвульсивные формы эпилепсии до сих пор считают менее «повреждающими» для мозга, чем конвульсивные формы (Wong, 2003). Исходя из имеющихся данных, конвульсивную активность сопровождают относительно более выраженные судорожные разряды (например, с более высокой амплитудой, частотой). Такие судорожные разряды с большей эффективностью вовлекают удаленные нейронные сети, которые могут запускать моторные судороги. Однако неясно, достаточно ли судорожной активности в мозге, наблюдаемой у «толерантных» крыс, для инициации механизмов гибели. Вопрос о том, какие именно факторы инициируют гибель нейронов у «толерантных» и «чувствительных» крыс, а также являются ли эти механизмы общими для этих групп животных, требует дальнейших исследований.

Рис. 28. Факторы, приводящие к гибели нейронов при эпилепсии.

Наиболее вероятные пути повреждения для судорожной активности без конвульсивной составляющей — 1, с конвульсивной составляющей — 2. По-видимому, оба пути в той или иной степени имеют место при конвульсивной и неконвульсивной судорожной активности. Схема составлена по данным литературы (McEachern and Shaw, 1999; Pohle et al., 1997; Becker et al., 1999; Rauca et al., 1999, 2000; Franke and Kittner, 2001; Ben-Ari, 1981; Zhang et al., 1998; Gillardon et al, 1995; Nagy and Esiri, 1998) и результатам собственных исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлова, Татьяна Васильевна, Москва

1. Бурлакова Е.И., Чернявская Л.И., Архипова Г.В. Изменения в составе и физико-химических свойствах липидов головного мозга крыс как причина разной чувствительности ЦНС животных к раздражающим факторам. // Нейрохимия. 1989. - V. 8. № 2. - С. 249-258.

2. Виноградова О. С. Гиппокамп и память. М. Наука. - 1975.

3. Гуляева Н.В., Ерин А.Н. Роль свободнорадикальных процессов в развитии нейродегенеративных заболеваний. // Нейрохимия. 1995. - Т. 12. -№2.-С. 3-15.

4. Зарубенко И.И., Яковлев А.А., Степаничев М.Ю., Гуляева Н.В.

5. Электроконвульсивный шок вызывает гибель нейронов в гиппокампе мышей: корреляция нейродегенерации с судорожной активностью. // Рос. физиол. журн. 2004. - Т. 90. С. 272-281.

6. Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., Шергин С.М. Окислительный стресс.

7. Диагностика, терапия, профилактика. Изд-во СО РАМН, Новосибирск. - 1993. - С. 181.

8. Котляр Б.И. Нейробиологические основы обучения. М.: Наука. - 1989. -С. 240.

9. Крыжановский Г.Н., Никушкин Е.В., Тупеев И.Р. Anticonvulsive effect of superoxide dismutase // Бюл. эксп. биол. мед. 1987. - Т. 103. - №4. С. 396-398.

10. Лукьянова М.Д., Балмуханов B.C., Уголев А.Г. Кислородзависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние. М. Наука. — 1982.- С. 260.

11. Софронов Г.А, Пшенкина Н.Н., Иваницкий Ю.Ю., Панина Е.В.

12. Возможные пути влияния химических агентов и ионизирующих излучений на процессы апоптоза. // Програмированная клеточная гибель. Санкт-Петербург: Наука. - 1996. - С. 209-218

13. Тупеев И.Р., Бордюков М.М., Крыжановский Г.Н., Никушкин Е.В. State of the antioxidant system during induction in rats of primary generalized epileptic activity // Бюл. Эксп. Биол. Мед. 1987. - Т. 104. - С. 167169.

14. Чепурнов С.А., Чепурнова Н.Е., Редкозубова О.М., Саакян С.А. Status epilepticus новые механизмы и пути торможения (литий-пилокарпиновая модель) // Успехи физиологических наук. - 2005. -Т.36.-№1.-С. 68-84.

15. Яковлев А.А., Онуфриев М.В., Степаничев М.Ю. Браун К., Гуляева Н.В.

16. Активность каспазы-3 в отделах мозга грызунов разных видов // Нейрохимия. 2001. - Т. 18. - №1. - С.41-43.

17. Яковлев А.А., Семенова Т.П., Колаева С.Г., Онуфриев М.В., Михалев С.Л., Гуляева Н.В. Изменение активности каспазы-3 в отделах мозга сусликов citellus undulatus в течение гибернационного цикла// Нейрохимия. 2002. - Т. 19. -№1. - С.33-36.

18. Abbasova K.R., Berdiev R. К., Chepurnova N.E., Chepurnov S.A., Luijtelaar G.

19. Typical and atypical spike-wave discharges: effects ofpentylenetetrazole in WAG/Rij Rats // The WAG/Rij Model of Absence Epilepsy (Eds.: G. van Luijtelaar et al.). Printpartners Ipskamp Nijmegen. 2004. - P. 219-225.

20. Abrams R. Electroconvulsive Therapy. / In New York: Oxford University Press, 1988.

21. Andersen P., Greengard P., Hu G. Y. Injection of protein kinase С in rat hippocampal pyramidal cells in vitro induces plastic changes similar to long term potentiation.// J. Physiol. (Gr. Brit). -1987. -V. 390. P. 18.

22. Annegers J.F. Epidemiology and genetics of epilepsy. // Neurol Clin. 1994. -V. 12.-P. 15-29.

23. Arendt T, Holzer M, Gartner U. Neuronal expression of cycline dependent kinase inhibitors of the INK4 family in Alzheimer's disease. // J Neural Transm. 1998. - V.105 - P. 949-960.

24. Atack J.R., Cook S.M., Huston P.H., File S.E. Kindling induced by pentylenetetrazole in rats is not directly associated with changes in the expression of NMD A or benzodiazepine receptors. // Pharm Biochem Behavior. -2000. V. 65. - P. 743-750.

25. Atack J.R., Cook S.M., Hutson P.H., File S.E. Kindling induced by pentylenetetrazole in rats is not directly associated with changes in theexpression of NMDA of benzodiazepine receptors. // Pharmacol. Biochem. Behav. 2000. - V. 65. - P. 743-750.

26. Austin J.K., Dunn D.W. Progressive behavioral changes in children with epilepsy. // Prog Brain Res. 2002. - V. 135. - P. 419-427.

27. Babb T.L., Brown W.J., Pretorius J., Davenport C., Lieb J.P., Crandall P.H.

28. Temporal lobe volumetric cell densities in temporal lobe epilepsy. // Epilepsia 1984. V. 25. - P. 729-740.

29. Bal-Price A., Brown G.C. Nitric-oxide-induced necrosis and apoptosis in PC 12 cells mediated by mitochondria. // J Neurochem. 2000. - V. 75. - P. 1455-1464.

30. Becker A., Braun H., Schroder H., Grecksch G., Hollt V. Effects of enadoline on the development of pentylenetetrazol kindling, learning performance, and hippocampal morphology. // Brain Res. 1999. - V. 823 - N.l-2 -P. 191-197.

31. Becker A., Grecksch G., Brosz M. Antiepileptic drugs—their effects on kindled seizures and kindling-induced learning impairments. // Pharmacol Biochem Behav. 1995. - V. 52. - P. 453-459.

32. Becker A., Grecksch G., Brosz M. Naloxone ameliorates the learning deficit induced by pentylenetetrazol kindling in rats. // Eur J Neurosci. -1994.-V. 6.-P. 1512-1515.

33. Becker A., Grecksch G., Ruthrich H., Pohle W., Marx В., Matthies H. Kindling and its consequences on learning in Rats. // Behavioral Neural Biology. 1992. - V. 57. - P. 37-43.

34. Becker A., Grecksch G., Ruthrich H.L., Pohle W., Marx В., Matthies H.

35. Kindling and its consequences on learning in rats. // Behav Neural Biol. 1992. - V. 57. - P. 37-43.

36. Becker A., Tiedge A., Grecksch G.A. Diazepam-its effects on the development of pentylenetetrazol kindling, related learning impairments, and neuronal cell loss. // Pharmacol Res. 1997. - V. 35. - P. 27-32.

37. Beldhuis H.J.A., Everts H.G.J., Van Der Zee E.A., Luiten P.G.M., Bohus B.

38. Amygdala kindling - induced seizures selectively impair spatial memory: 1. Behavioral characteristics and effects on hippocampal neuronal protein kinase С isoforms. // Hippocampus. - 1992. - V.2. P. 397-410.

39. Beltran В., Mathur A., Duchen M.R., Erusalimsky J.D., Moncada S. The effect of nitric oxide on cell respiration: A key to understanding its role in cell survival or death. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2000. V. 19. P. 97.

40. Ben-Ari Y. Limbic seizures and brain damage produced by kainic acid: mechanisms and relevance to human temporal lobe epilepsy. // Neurosience. 1985. - V. 14. - P. 375-403

41. Ben-Ari Y., Gho M. Long-lasting modification of the synaptic properties of rat CA3 hippocampal neurones induced by kainic acid. // J. Physiol. -1988.-V. 404. P.365-384.

42. Ben-Ari Y., Tremblay E., Ottersen O.P., Meldrum B.S. The role of epilepticctivity in hippocampal and "remote" cerebral lesions induced by kainic acid. // Brain Res. 1980. V. 191. P. 79-97.

43. Bengzon J., Kokaia Z., Elmer E., Nanobashvili A., Kokaia M., Lindvall O.

44. Apoptosis and proliferation of dentate gyrus neurons after single and intermittent limbic seizures. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1997. V. 94.-P. 10432-10437.

45. Bengzon J., Mohapel P., Ekdahl C.T., Lindvall O. Neuronal apoptosis after brief and prolonged seizures. // Prog Brain Res. 2002. - V. 135. - P. 111119.

46. Benson D.F., Hermann B.P. Personality Disorders. / In: Epilepsy: a comprehensive textbook (Engel J, Jr., Pedley ТА, eds), Philadelphia, USA. Lippincott-Raven. 1997. P. 2065-2070.

47. Berg A.T., Testa F.M., Levy S.R., Shinnar S. The epidemiology of epilepsy.

48. Past, present, and future. // Neurol Clin. 1996. - V. 14. - P. 383-398.

49. Berger M.L., Lassmann H., Hornykiewicz O. Limbic seizures without brain damage after injection of low doses of cainic acid into the amygdale of freely moving rats. // Brain Res. 1989. - V. 489. - P. 261-272.

50. Bertram E.H. 3rd, Lothman E.W. Morphometric effects of intermittent kindled seizures and limbic status epilepticus in the dentate gyrus of the rat. // Brain Res. 1993. V. 603.-P. 25-31.

51. Bliss Т.V., Lomo Т. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. // J Physiol. 1973. - V. 232. - P. 331-356.

52. Bliss T.V., Collingridge G.L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. // Nature. 1993. - V. 361. - N. 6407.-P. 31-39.

53. Blume W.T. Clinical Description and Diagnosis. / In: Intractable Seizures Diagnosis, Treatment and Prevention (Burnham W.M., Carlen P.L., Hwang P.A., eds), New York, USA: Kluwer Academic/Plenum Publishers. 2002. - P. 9-18.

54. Blumer W.T. Psychiatric Aspects of Intractable Epilepsy. / In: Intractable Seizures Diagnosis, Treatment and Prevention (Burnham W.M., Carlen P.L., Hwang P.A., eds), New York, USA: Kluwer Academic/Plenum Publishers. 2002. - P. 133-147.

55. Bobrysheva I.V., Chernyavskaya L.I., Onufriev M.V., Grivennikov I.A., Gulyaeva N.V. Hydrogen peroxide dose-dependently inhibits caspese-3 in PC 12 cells. // Нейрохимия. 2000. - V. 7. - P. 93-98.

56. Bohdanecky Z., Necina J. Course of some pharmacological tests in functionally decorticated animals. // Physiol Bohemoslov. 1963. - V. 12. - P. 5561.

57. Bouma P.A., Westendorp R.G., van Dijk J.G., Peters A.C., Brouwer O.F. The outcome of absence epilepsy: a meta-analysis. // Neurology. 1996. -V. 47. - P. 802-808.

58. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. //

59. Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.

60. Braughler J.M., Hall E.D. Central nervous system trauma and stroke. I.

61. Biochemical considerations for oxyformation and lipid peroxidation. // Free Radical Biol. Med. 1989. - V. 6. - P. 289-301.

62. Briellmann R.S., Newton M.R., Wellard R.M., Jackson G.D. Hippocampal sclerosis following brief generalized seizures in adulthood. // Neurology.-200 l.-V. 57.-P. 315-317.

63. Bures J., Buresova O., Huston J.P. Techniques and Basic Experiments for the Study of Brain and Behavior. / Elsevier, Amsterdam, New York. -1983.

64. Burnham W.M. Antiseizure Drugs. / In: Principles of Medical Pharmacology (Kalant H, Roschlau WHE, eds), New York, USA: Oxford University Press. - 1998. - P. 250-261.

65. Burnham W.M. Intractable Epilepsy: The Invisible Disorder. / In: Developmental Disabilities in Ontario (Brown I., Percy M., eds), -Toronto: Front Page Publishing. 2002a.

66. Burnham W.M. Primary and "transfer" seizure development in the kindled rat. // Can J Neurol Sci. 1975. -V. 2. - P. 417-428.

67. Cadet J.L., Brannock C. Free radicals and the pathobiology of brain dopamine systems. // Neurochem Int. 1998.-V. 32. - P. 117-131.

68. Cain D.P. Bidirectional transfer of intracerebrally administered pentylenetetrazol and electrical kindling. // Pharmacol. Biochem. Behav. 1982. - V. 17.-P. 1111-1113.

69. Cain D.P. Effects of kindling or brain stimulation on pentylenetetrazol-induced convulsion susceptibility. // Epilepsia. 1980. V. 21. P. 243-249.

70. Cain D.P. Kindling and the Amygdala. / In: The Amygdala: Neurobiological Aspects of Emotion, Memory, and Metal Dysfunction (Gloor P., ed), -Toronto: Wiley-Liss, Inc. 1992. - P. 539-560.

71. Cain D.P. Transfer of pentylenetetrazol sensitization to amygdaloid kindling. Pharmacol.//Biochem. Behav. 1981. - V. 15.-P. 533-536.

72. Carlson N.R. Learning and Memory: Basic Mechanisms. / In: Physiology of Behaviour (Carlson NR, ed), Boston: Allyn and Bacon. - 1998. - P. 409-450.

73. Cavazos J.E., Golarai G., Sutula T.P. Mossy fiber synaptic reorganization induced by kindling: time course of development, progression, and permanence. // J Neurosci. 1991.-V. 11.-P. 2795-2803.

74. Cavazos J.E., Sutula T.P. Progressive neuronal loss induced by kindling: a possible mechanism for mossy fiber synaptic reorganization and hippocampal sclerosis. // Brain Res. 1990. - V. 527. - P. 1-6.

75. CCTILAE. Proposal for revised classification of epilepsies and epileptic syndromes. Commission on Classification and Terminology of the International League Against Epilepsy. // Epilepsia. 1989. - V. 30. -N.4.-P. 389-399.

76. CCTILAE. Proposal for revised clinical and electroencephalographic classification of epileptic seizures. From the Commission on

77. Classification and Terminology of the International League Against Epilepsy. // Epilepsia. 1981. - V. 22. -N. 4. - P. 489-501.

78. Chen J., Nagayama Т., Jin K., Stetler R.A., Zhu R.L., Graham S.H., Simon R.P.1.duction of caspase-3-like protease may mediate delayed neuronal death in the hippocampus after transient cerebral ischemia. // J. Neurosci. 1998. V. 18. P. 4914-4928.

79. Clark R.S., Kochanek P.M., Chen M., Watkins S.C., Marion D.W., Chen J., Hamilton R.L., Loeffert J.E., Graham S.H. Increases in Bcl-2 and cleavage of caspase-1 and caspase-3 in human brain after head injury. // FASEB J. 1999.-V. 13.-P. 813-821.

80. Cohen G. Catalase, glutathione peroxidase, superoxide dismutase, and cytochrome P-450. / Handbook of Neurochemistry. Plenum Press, New York. - 1983. - V. 4. - P. 325-330.

81. Cole A.J., Koh S., Zheng Y. Are seizures harmful: what can we learn from animal models? // Prog Brain Res. 2002. - V. 135. P. 13-23.

82. Corda M., Orlandi M., Lecca D., Giorgi O. Decrease in GABAergic function induced by pentylenetetrazol kindling in rats: antagonism by MK-801. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1992. - V. 262. - P. 792-798.

83. Covolan L., Smith R.L., Mello L.E. Ultrastructural identification of dentate granule cell death from pilocarpine-induced seizures. // Epilepsy Res. -2000.-V. 41.-P. 9-21.

84. Dam A.M. Epilepsy and neuron loss in the hippocampus. // Epilepsia. 1980. -V. 21. P. 617-629.

85. Dam A.M., Hertz M., Bolwig T.G. The number of hippocampal neurons in rats after electrically-induced generalized seizures. // Brain Res. 1980.1. V. 193.-P. 268-272.

86. Dam A.M. Quantitative neuropathology in epilepsy. //Acta Neurol Scand Suppl.- 1992.-V. 137.-P. 51-54.

87. Depaulis A., Snead O.C., Marescaux C., Vergnes M. Suppressive effects of intranigral injection of muscimol in three models of generalized non-convulsive epilepsy induced by chemical agents. // Brain Res. 1989.- V. 498. P. 64-72.

88. Dodel R.C., Du Y., Bales K.R., Ling Z., Carvey P.M., Paul S.M. Caspase-3-like proteases and 6-hydroxydopamine induced neuronal cell death. // Mol. Brain. Res. 1999. - V. 57. - P. 195-206.

89. Dodrill C.B. Progressive cognitive decline in adolescents and adults with epilepsy. // Prog Brain Res. 2002. - V. 135. - P. 399-407.

90. Duncan J.S. MRI studies. Do seizures damage the brain? // Prog Brain Res. -2002.-V. 35.-P. 253-261.

91. Ekonomou A.; Smith A.L., Angelatou F. Changes in AMPA receptor binding and subunit messenger RNA expression in hippocampus and cortex in the pentylenetetrazole-induced 'kindling' model of epilepsy. // Mol. Brain Res. 2001. V. 95. P. 27-35.

92. Enari M., Sakahira H., Yokoyama H., Okawa K., Iwamatsu A., Nagata S. A.

93. Caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. //Nature. 1998. - V. 391. - P. 43-50.

94. Engel J.J. Excitation and inhibition in epilepsy. // Can J Neurol Sci. 1996. - V. 23.-P. 167-174.

95. Engel J.J., Crandall P.H. Intensive neurodiagnostic monitoring with intracranialelectrodes. // Adv Neurol. 1987. - V. 46. P. 85-106.

96. Engel J.J., Starkman S. Overview of seizures. // Emerg Med Clin North Am. -1994.-V. 12.-P. 895-923.

97. Erdtmann-Vourliotis M, Riechert U, Mayer P, Grecksch G, Hollt V.

98. Pentylenetetrazol (PTZ)-induced c-fos expression in the hippocampus of kindled rats is suppressed by concomitant treatment with naloxone // Brain Res. 1998. V. - 792. - N2. - P. 299-308.

99. Evans M., Griffiths Т., Meldrum B. Early changes in the rat hippocampus following seizures induced by bicuculline or L-allylglycine: a light and electron microscope study. // Neuropathol Appl Neurobiol. -1983.-V. 9.-P. 39-52.

100. Evans M.C., Griffiths Т., Meldrum B.S. Kainic acid seizures and the reversibility of calcium loading in vulnerable neurons in the hippocampus. // Neuropathol Appl Neurobiol. 1984. - V. 10. - P. 285-302.

101. Fadeel В., Orrenius S., Zhivotovsky B. The most unkindest cut of all: on the multiple roles of mammalian caspases. // Leukemia. 2000. - V. 14. -P. 1514-1525.

102. Fisher R.S. Animal models of epilepsies. // Brain Res. Rev. 1989. - V. 14. - P. 245-252.

103. Franke H., Kittner H. Morphological alterations of neurons and astrocytes and changes in emotional behavior in pentylenetetrazol-kindled rats. // Pharmacol Biochem Behav. 2001. - V. 70. - P. 291-303.

104. Frantseva M.V., Velazquez J.L., Hwang P.A., Carlen P.L. Free radical production correlates with cell death in an in vitro model of epilepsy. // Eur J Neurosci. 2000b. - V. 12.-P. 1431-1439.

105. Fridovich I. Superoxide dismutases in biolodgy and medicine. Patholodgy of Oxygen. / Academic Press, New Yorkl. 1982. - P. 19.

106. Friedman H.R., Goldman-Rakic P.S. Activation of the hippocampus and dentate gyrus by working-memory: a 2-deoxyglucose study of behaving rhesus monkeys. // J Neurosci. 1988. - V. 8. - P. 4693-4706.

107. Fuerst D., Shah J., Shah A., Watson C. Hippocampal sclerosis is a progressive disorder: a longitudinal volumetric MRI study. // Ann Neurol. 2003. -V. 53.-P. 413-416.

108. Gavrieli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S.A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. // J. Cell Biol. 1992. - V. 119. - P. 493-501.

109. Genkova-Papazova M.G., Lazarova-Bakarova M.B. Pentylenetetrazole kindling impairs long-term memory in rats. // Eur Neuropsychopharmacol. -1995.-V. 5.-P. 53-56.

110. Genkova-Papazova, M.G., Petkova В., Shishkova, N., Lazarova-Bakarova M.

111. The GABA-B antagonist CGP 36742 prevent PTZ-kindling-provoked amnesia in rats. // Eur Neuropsychopharmacol. 2000. - V. 10. - P. 273-278.

112. Gerren R.A., Weinberger N.M. Long term potentiation in the magnocellular medial geniculate nucleus of the anesthetized cat. // Res. 1983. - V. 265.-P. 138-142.

113. Gilby K.L., Da Silva A.G., Mclntyre D.C. Differential GABA(A) subunit expression following status epilepticus in seizure-prone and seizure-resistant rats: a putative mechanism for refractory drug response. // Epilepsia. 2005. - V. 46. - P. 3-9.

114. Gillardon F., Wickert H., Zimmermann M. Up-regulation of bax and down-regulation of bcl-2 is associated with kainate-induced apoptosis in mouse brain. // Neurosci Lett. 1995. V. 192. - P. 85-88.

115. Giorgi O.; Orlandi M.; Lecca D., Corda M.G. MK-801 prevents chemical kindling induced by pentylenetetrazol in rats. // Eur. J. Pharmacol. -1991.-V. 193.-P. 363-365.

116. Goddard G.V. Development of epileptic seizures through brain stimulation at low intensity. // Nature. 1967. - V. 214. - N. 92. - P. 1020-1021.

117. Goddard G.V., Mclntyre D.C., Leech C.K. A permanent change in brain function resulting from daily electrical stimulation. // Exp Neurol. -1969. V. 25. - N. 3. - P. 295-330.

118. Gombos Z., Spiller A., Cottrell G.A., Racine R.J., Mclntyre B.W. Mossy fiber sprouting induced by repeated electroconvulsive shock seizures. // Brain Res. 1999. - V. 844. - P. 28-33.

119. Gonzalez Burgos G.R., Biali F.I., Nicola Siri L.C., Cardinali D.P. Effect ofgamma-aminobutyric acid on synaptic transmission and long-term potentiation in rat superior cervical ganglion. // Brain Res. L994.- V. 658. -N.l-2. - P. 1-7.

120. Grace G.M., Corcoran M.E., Skelton R.W. Kindling with stimulation of the dentate gyrus. I. Characterization of electrographic and behavioral events. // Brain Res. 1990. - V. 509. P. 249-256.

121. Grecksch G., Becker A., Rauca C. Effect of age on pentylenetetrazol-kindling and kindling-induced impairments of learning performance. // Pharmacol. Biochem. Behav. 1997. - V. 56. - P. 595-601.

122. Griffiths Т., Evans M.C., Meldrum B.S. Intracellular calcium accumulation in rat hippocampus during seizures induced by bicuculline or L-allylglycine. // Neuroscience. 1983. - P. 10. - P. 385-395.

123. Guberman A., Bruni J. Essentials of Clinical Epilepsy. Boston, USA Butterworht Heinemann. 1999.

124. Halgren E., Stapleton J., Domalski P., Swartz B.E., Delgado- Escueta A.V., Walsch G.O., Mandelkern M., Bland W., Ropach J. Memory dysfunctions in epilepsy patients as a dearrangement of normal physiology. //AdvNeurol. 1991.- V. 55.-P. 385-410.

125. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine. -Oxford. Clarendon Press. 1989. - P. 543.

126. Hamm R.J., Pike B.R., Temple M.D., O'Dell D.M., Lyeth B.G. The effect of postinjury kindled seizures on cognitive performance of traumatically brain-injured rats. // Exp Neurol. 1995. - V. 136. - P. 143-148.

127. Hampton M.B., Fadeel В., Orrenius S. Redox regulation of the caspases during apoptosis. // Ann N Y Acad Sci. 1998. - V. 854. - P. 328-335.

128. Hauser W.A., Annegers J.F., Kurland L.T. Prevalence of epilepsy in Rochester, Minnesota: 1940-1980.//Epilepsia. 1991. - V. 32.-P. 429-445.

129. Hauser W.A., Rich S.S., Annegers J.F., Anderson V.E. Seizure recurrence after a 1st unprovoked seizure: an extended follow-up. // Neurology. -1990.-V. 40.-P. 1163-1170.

130. Hebb D.O. The organization of behavior: A neuropsychological theory. N.Y: Wiley. - 1949.

131. Henshall D.C., Chen J., Simon R.P. Involvement of caspase-3-like protease in the mechanism of cell death following focally evoked limbic seizures. // J. Neurochem. 2000. - V. 74. - P. 1215-1223.

132. Herrup К., Neve R., Ackerman S.L., Copani A. Divide and die: cell cycle events as triggers of nerve cell death. // J. Neurosci. 2004. - V. 24. - P. 9232-9239.

133. Hildebrandt F. Pentamethylenetetrazol (Cardiazol). // Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 1926. - V. 116.-P. 100-109.

134. Houser C.R. Neuronal loss and synaptic reorganization in temporal lobe epilepsy. // Adv Neurol. 1999. - V. 79. P. 743-761.

135. Jokeit H, Ebner A (2002) Effects of chronic epilepsy on intellectual functions. Prog Brain Res 135: 455-463

136. Kandel E.R., Kupferman I., Iversen S. Learning and Memory. / In: Principles of Neural Science (Kandel ER, Schwartz JH, Jessell TM, eds), New York, USA: McGraw-Hill. - 2000.

137. Kanner A.M., Balabanov A. Depression and epilepsy: how closely related are they? // Neurology. 2002. - V. 58. P. 527-539.

138. Khurgel M., Racine R.J., Ivy G.O. Kindling causes changes in the composition of the astrocytic cytoskeleton. // Brain Res. 1992. - V. 592. P. 338342.

139. Kim J.H. Pathology of epilepsy. // Exp Mol Pathol. 2001. - V. 70. - P. 345367.

140. Klioueva I.A., van Luijtelaar E.L., Chepurnova N.E., Chepurnov S.A. PTZ-induced seizures in rats: effects of age and strain. //Physiol Behav. -2001.-V. 72.-P. 421-426.

141. Koroleva VI, Vinogradova LV, Bures J. Reduced incidence of cortical spreading depression in the course of pentylenetetrazol kindling in rats. // Brain Res.- 1993.-V. 608.-N. l.-P. 107-14.

142. Krinsky N.I. Mechanism of action of biological antioxidants. // Proc Soc Exp Biol Med. 1992. - V. 200. - P. 248-254.

143. Kroemer G., Dallaporta В., Resche-Rigon M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. // Annu Rev Physiol. 1998. V. 60. P. 619-642.

144. Kruman I., Bruce-Keller A.J., Bredesen D.E., Waeg G., Mattson M.P. Evidence that 4-hydroxynonenal mediates oxidative stress-induced neuronal apoptosis. // J. Neurosci.- 1997. V. 17. P. 5089-5100.

145. Kuan C.Y., Roth K.A., Flavell R.A., Rakic P. Mechanisms of programmed cell death in the developing brain. // Trends Neurosci. 2000. V. 23. P. 291-297.

146. Kudryashov I.E., Onufriev M.V., Kudryashova I.V., Gulyaeva N.V. Periods of postnatal maturation of hippocampus: synaptic modifications and neuronal disconnection // Dev. Brain Res. 2001. - V. 132. - P. 113120.

147. Madison D.V., Malenka R.C., Nicoll R.A. Mechanisms underlying long-term potentiation of synaptic transmission. // Annu Rev Neurosci. 1991. -V. 14.-P. 379-397.

148. Majno G., Joris I. Apoptosis, oncosis and necrosis. An overview of cell death. Amer. // J. Pathol. 1995. - V. 146. - P. 3-15.

149. Malenka R.C. Synaptic plasticity in the hippocampus: LTP and LTD. // Cell. -1994. V. 78. -N.4. - P. 535-538.

150. Manning J.P., Richards D.A., Bowery N.G. Pharmacology of absence epilepsy. // Trends Pharmacol Sci. 2003. - V. 24. - P. 542-549.

151. Marescaux C., Micheletti G., Vergnes M., Depaulis A., Rumbach L., Waiter J.M. A model of chronic spontaneous petit mal-like seizures in the rat: comparison with pentylenetetrazol-induced seizures // Epilepsia. -1984.-V. 35.-P. 326-331.

152. Marsh L., Rao V. Psychiatric complications in patients with epilepsy: a review. //Epilepsy Res. 2002. - V. 49. - P. 11-33.

153. Martin L.J. Neuronal cell death in nervous system development, disease, and injury. // Int J Mo I Med. 2001. - V. 7. - P. 455-478.

154. Mathern G.W., Kuhlman P.A., Mendoza D., Pretorius J.K. Human fascia dentata anatomy and hippocampal neuron densities differ depending on the epileptic syndrome and age at first seizure. // J Neuropathol Exp Neurol. 1997. - V. 56. - P. 199-212.

155. Mattson M.P. Apoptosis in neurodegenerative disorders. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2000.-V. l.-P. 120-129.

156. Mattson M.P., Duan W. "Apoptotic" biochemical cascades in synaptic compartments: roles in adaptive plasticity and neurodegenerative disorders. // J. Neurosci. Res. 1999. - V. 58. - P. 152-166.

157. Mattson M.P., Keller J.N., Begley J.G. Evidence for synaptic apoptosis. // Exp. Neurol. 1998. V. 153. P. 35-48.

158. McEachern J.C., Shaw C.A. An alternative to the orthodoxy: plasticity -pathology continuum model // Brain Res. Reviews. 1996. - V. 22. -P. 51-92.

159. McEachern J.C., Shaw C.A. The plasticity pathology continuum: defining a role for the LTP phenomenon // J. Neuros. Res. - 1999. - V. 58. - P. 42-61.

160. McNamara J.O. Analyses of the molecular basis of kindling development. // Psychiatry Clin Neurosci. 1995. - V. 49. - P. 175-178.

161. McNamara J.O., Bonhaus D.W., Shin C., Crain B.J., Gellman R.L., Giacchino J.L. The kindling model of epilepsy: a critical review. // CRC Crit. Rev. Clin. Neurobiol. 1985.-V. l.-P. 341-391.

162. McNamara J.O., Bonhaus D.W., Shin C., Crain B.J., Gellman R.L., Giacchino J.L. The kindling model of epilepsy: a critical review. // CRC Critical Rev. Clin. Neurobiol. 1985.-V. l.-P. 341-391.

163. Meldrum B.S. Do preclinical seizure models preselect certain adverse effects of antiepileptic drugs. // Epilepsy Res. 2002. - V. 50. P. 33-40.

164. Meldrum B.S. First Alfred Meyer Memorial Lecture. Epileptic brain damage: aconsequence and a cause of seizures. // Neuropathol Appl Neurobiol. 1997.-V. 23.-P. 185-201.

165. Meldrum B.S. Metabolic factors during prolonged seizures and their relation to nerve cell death. // Adv Neurol. 1983. - V. 34. P. 261-275.

166. Meldrum B.S., Brierley J.B. Prolonged epileptic seizures in primates. Ischemic cell change and its relation to ictal physiological events. // Arch Neurol. 1973. - V. 28. P. 10-17.

167. Meldrum B.S., Horton R.W. Physiology of status epilepticus in primates. // Arch Neurol. 1973. - V. 28. - P. 1-9.

168. Meldrum B.S., Vigouroux R.A., Rage P., Brierley J.B. Hippocampal lesions produced by prolonged seizures in paralyzed artificially ventilated baboons. //Experientia. 1973. - V. 29. - P. 561-563.

169. Mello L.E., Cavalheiro E.A., Tan A.M., Kupfer W.R., Pretorius J.K., Babb T.L., Finch D.M. Circuit mechanisms of seizures in the pilocarpine model of chronic epilepsy: cell loss and mossy fiber sprouting. // Epilepsia. -1993.-V. 34.-P. 985-995.

170. Miller S.P., Li L.M., Cendes F., Tasch E., Andermann F., Dubeau F., Arnold D.L. Medial temporal lobe neuronal damage in temporal and extratemporal lesional epilepsy. // Neurology. 2000. V. 54. P. 14651470.

171. Mitchell R.N., Cotran R.S. Cell Injury, Death and Adaptation. / In: Basic Pathology (Kumar V, Cotran RS, Robbins SL, eds), Toronto: W.B. Saunders Company. - 1997. - P. 3-24.

172. Moscovitch D.A., McAndrews M.P. Material-specific deficits in "remembering" in patients with unilateral temporal lobe epilepsy and excisions.

173. Neuropsychologia. 2002. - V. 40. P. 1335-1342.

174. Muradian K, Schachtschabel DO. The role of apoptosis in aging and age-related disease: update. Z Gerontol Geriatr 2001 Dec;34(6):441-6

175. Nadler J.V., Cuthbertson G.J. Kainic acid neurotoxicity toward hippocampal formation: dependence on specific excitatory pathways. // Brain Res.- 1980.-V. 195.-P. 47-56.

176. Nagata S. Apoptotic DNA fragmentation. // Exp. Cell Res. 2000. - V. 256. -P. 12-18.

177. Nagy Z., Esiri M.M. Neuronal cyclin expression in the hippocampus in temporal lobe epilepsy. // Exp. Neurol. 1998. - V. 150. - P. 240-247.

178. Nakagawa E., Aimi Y., Yasuhara O., Tooyama I., Shimada M., McGeer P.L., Kimura H. Enhancement of progenitor cell division in the dentate gyrus triggered by initial limbic seizures in rat models of epilepsy. // Epilepsia. 2000. - V. 41. - P. 10-11.

179. Namura S., Zhu J., Fink K., Endres M., Srinivasan A., Tomaselli K.J., Yuan J., Moskowitz M.A. Activation and cleavage of caspase-3 in apoptosis induced by experimental cerebral ischemia. // J. Neurosci. 1998. -V. 18.-P. 3659-3668.

180. Ney G.C., Lantos G., Barr W.B., Schaul N. Cerebellar atrophy in patients with long-term phenytoin exposure and epilepsy. // Arch Neurol. 1994. -V. 51.-P. 767-771.

181. Nilsson O.G., Shapiro M.L., Gage F.H., Olton D.S., Bjorklund A. Spatial learning and memory following fimbria-fornix transection and grafting of fetal septal neurons to the hippocampus. // Exp Brain Res.- 1987. V. 67.-P. 195-215.

182. Niquet J., Ben Ari Y., Represa A. Glial reaction after seizure induced hippocampal lesion: immunohistochemical characterization of proliferating glial cells. // J Neurocytol. 1994a. - V. 23. P. 641-656.

183. Niquet J., Jorquera I., Ben Ari Y., Represa A. Proliferative astrocytes may express fibronectin-like protein in the hippocampus of epileptic rats. // Neurosci Lett. 1994b. - V. 180. - P. 13-16.

184. Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. // Anal. Biochem. 1979. - V.95. - P. 351360.

185. Olney J.W., Fuller Т., de Gubareff T. Acute dendrotoxic changes in the hippocampus of kainate treated rats. // Brain Res. 1979. - V. 176. -P. 91-100.

186. Olsen R.W. The GABA postsynaptic membrane receptor-ionophore complex.

187. Site of action of convulsant and anticonvulsant drugs. // Mol. Cell. Biochem. 1981.-V. 39.-P. 261-279.

188. Olsen R.W., Wamsley J.K., Lee R.J., Lomax P.

189. Benzodiazepine/barbiturate/GABA receptor-chloride ionophore complex in a genetic model for generalized epilepsy. // Adv Neurol. -1986.-V. 44.-P. 365-378.

190. Oppenheim R.W., Flavell R.A., Vinsant S., Prevette D., Kuan C.Y., Rakic P.

191. Programmed cell death of developing mammalian neurons after genetic deletion of caspases. // Neurosci. 2001. - V. 21. - P. 47524760.

192. Osawa M., Uemura S., Kimura H., Sato M. Amygdala kindling develops without mossy fiber sprouting and hippocampal neuronal degenerationin rats. //Psychiatry Clin Neurosci. 2001. - V. 55. - P. 549-557.

193. Parent J.M., Lowenstein D.H. Seizure-induced neurogenesis: are more new neurons good for an adult brain? // Prog Brain Res. 2002. - V. 135. -P. 121-131.

194. Pasinelli P., Borchelt D.R., Houseweart M.K., Cleveland D.W., Brown R.H. Jr.

195. Caspase-1 is activated in neural cells and tissue with amyotrophic lateral sclerosis-associated mutations in copper-zinc superoxide dismutase. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. - V. 95. - P. 15763-15768.

196. Patrylo P.R., Schweitzer J.S., Dudek F.E. Abnormal responses to perforant path stimulation in the dentate gyms of slices from rats with kainate-induced epilepsy and mossy fiber reorganization. // Epilepsy Res. -1999. V. 36.-P. 31-42.

197. Pavone, P., Bianchini, R., Trifiletti, R.R., Incorpora, G., Pavone, A., Parano, E., Neuropsychological assessment in children with absence epilepsy. //Neurology. 2001. - V. 56. - P. 1047-1051.

198. Peele D.B., Gilbert M.E. Functional dissociation of acute and persistent cognitive deficits accompanying amygdala-kindled seizures. // Behav Brain Res. 1992. - V. 48. - N. 1. - P. 65-76.

199. Penfield W., Jasper H. Epilepsy and the Functional Anatomy of the Brain. Boston, USA: Little, Brown . 1954.

200. Pohle W., Becker A., Grecksch G., Juhre A., Willenberg A. Piracetam prevents pentylenetetrazol kindling-induced neuronal loss and learning deficits. // Seizure. 1997. - V. 6. - P. 467-474.

201. Pohle W., Rauca C. Hypoxia protects against the neurotoxicity ofkainic acid. //Brain. Res. 1994/ - V. 644. - P. 297-304.

202. Pollack M., Leeuwenburgh C. Apoptosis and aging: role of the mitochondria. //J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2001. -V. 56. - N 11. - P. B475-482.

203. Pollard H., Charriaut-Marlangue С , Cantagrel S , Represa A , Robain О , Moreau J , Ben Ari Y. Kainate-induced apoptotic cell death in hippocampal neurons. // Neuroscience. 1994. - V. 63. - P. 7-18.

204. Portera-Cailliau C., Price D.L., Martin L.J. Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum.//J Comp Neurol. 1997.-V. 378.-N.1.-P. 88-104.

205. Pretel S., Applegate C.D., Piekut D. Apoptotic and necrotic cell death following kindling induced seizures. // Acta Histochem. 1997. V. 99. P. 71-79.

206. Racine R., Rose P.A., Burnham W.M. Afterdischarge thresholds and kindling rates in dorsal and ventral hippocampus and dentate gyrus. // Can J Neurol Sci. 1977. - V. 4. - P. 273-278.

207. Racine R.J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalogr. // Clin. Neurophysiol. 1972. - V. 32. -P. 281-294.

208. Racine R.J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. I. Afterdischarge threshold. // Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 1972a. -V. 32.-P. 269-279.

209. Racine R.J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. // Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 1972b. - V. 32. -P. 281-294.

210. Racine R.J., Steingart M., Bureau Y., Mclntyre D.C. Differential sensitivity of genetically Fast vs. Slow kindling rats strains to GABAergic convulsive agents. //Neuropharmacology. 2003. - V. 45. N 7. P. 918-924.

211. Racine R.J., Steingart M., Mclntyre D.C. Development of kindling-prone and kindling-resistant rats: selective breeding and electrophysiological studies. //Epilepsy Research. 1999. - V. 35. - P. 183-195.

212. Ramanjaneyulu R., Ticku M.K. Interactions of pentamethylenetetrazole and tetrazole analogues with the picrotoxinin site of the benzodiazepine-GABA receptor-ionophore complex. // Eur J Pharmacol. 1984. - V. 98.-N. 3-4.-P. 337-45.

213. Randic M., Jiang M.C., Cerne R. Long-term potentiation and long-term depression of primary afferent neurotransmission in the rat spinal cord. //J Neurosci. 1993. - V. 13. N. 12. - P. 5228-5241.

214. Rauca C., Pohle W., Grunenberg K., Franze S. Hypothermia inhibits pentylenetetrazol kindling and prevents kindling-induced deficit in shuttle-box avoidance. // Pharmacol Biochem Behav. 2000. - V. 65. N l.-P. 23-30.

215. Rauca C., Pohle W., Grunenberg K., Franze S. Hypothermia inhibits pentylenetetrazol kindling and prevents kindling-induced deficit inshuttle-box avoidance.// Pharmacol. Biochem. Behav. 2000. - V. 65. -N 1. - P. 23-30.

216. Rauca C., Zerbe R., Jantze H. Formation of free hydroxyl radicals after pentylenetetrazol kindling-induced seizure and kindling. // Brain Res.- 1999.-V. 847.-P. 347-351.

217. Represa A., Ben Ari Y. Kindling is associated with the formation of novel mossy fibre synapses in the CA3 region. // Exp Brain Res. 1992. -V. 92.-P. 69-78.

218. Rocha L.; Ackermann R.F., Engel J. Jr. Chronic and single administration of pentylenetetrazol modifies benzodiazepine receptor-binding: an autoradiographic study. // Epilepsy Res. 1996. - V. 24. - P. 65-72.

219. Rothman S.M., Thurston J.H., Hauhart R.E. Delayed neurotoxicity of excitatory amino acids in vitro. //Neuroscience. 1987. - V. 22. - P. 471-480.

220. Roux P.P., Colicos M.A., Barker P.A., Kennedy Т.Е. p75 neurotrophin receptor expression is induced in apoptotic neurons after seizure. // J Neurosci.- 1999. V. 19. - P. 6887-6896.

221. Saint-Hilaire J.M. Counselling the Patient With Epilepsy. / In: Demystifying Epilepsy Management in Primary Care (Bruni J, ed), Montreal, Canada: Grosvenor House Inc. - 1995b. - P. 79-89.

222. Saint-Hilaire J.M. Defining Epilepsy. / In: Demystifying Epilepsy Management in Primary Care (Bruni J, ed), Montreal, Canada: Grosvenor House Inc. - 1995a.-P. 13-23.

223. Sakhi S., Sun N., Wing L.L., Mehta P., Schreiber S.S. Nuclear accumulation of p53 protein following kainic acid-induced seizures. // Neuroreport. -1996.-V. 7. P. 493-496.

224. Sander J.W. The epidemiology of epilepsy revisited. // Curr Opin Neurol. -2003.-V. 16.-P. 165-170.

225. Sankar R., Shin D.H., Liu H., Mazarati A., Pereira D.V., Wasterlain C.G.

226. Patterns of status epilepticus-induced neuronal injury during development and long-term consequences. // J Neurosci. 1998. - V. 18.-P. 8382-8393.

227. Sarkisian M.R., Holmes G.L., Carmant L., Liu Z., Yang Y., Stafstrom C.E.

228. Effects of hyperthermia and continuous hippocampal stimulation on the immature and adult brain. // Brain Dev. 1999. - V. 1. - P. 318325.

229. Scheepers M., Kerr M. Epilepsy and behaviour. // Curr Opin Neurol. 2003. -V. 16.-P. 183-187.

230. Scher M.S. Seizures in the newborn infant. Diagnosis, treatment, and outcome. //Clin Perinatol. 1997. - V. 24. - P. 735-772.

231. Schmidt J. New aspects in the pharmacology of kindling implications for mechanism of of action in kindling.// Pol. J. Pharmacol. Pharm. -1987.-V. 39.-P. 527-536.

232. Schroeder H., Becker A., Hoellt V. Sensitivity and density of glutamate receptor subtypes in the hippocampal formation are altered in pentylenetetrazole-kindled rats. // Exp Brain Res. 1998. V. 120. -N. 4. -P. 527-530.

233. Schroeder H., Becker, A., Lossner, B. Glutamate binding to brain membranes is increased in pentylenetetrazol-induced kindled rats. // J. Neurochem. -1993.-V. 60.-P. 1007-1011.

234. Schwob J.E., Fuller Т., Price J.L., Olney J.W. Widespread patterns of neuronaldamage following systemic or intracerebral injections of kainic acid: a histological study.//Neuroscience. 1980. - V. 5. P. 991-1014.

235. Scott B.W., Woj'towicz J.M., Burnham W.M Neurogenesis in the dentate gyrus of the rat following electroconvulsive shock seizures. // Exp Neural. -2000.-V. 165.-P. 231-236.

236. Sedlak J., Lindsay R.H. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman's reagent. // Anal. Biochem. -1968.-V.25.-P. 192-205.

237. Seidel W.T., Corcoran M.E. Relations between amygdaloid and anterior neocortical kindling. // Brain Res. 1986. V. 385. - P. 375-378.

238. Shimohama S., Tanino H., Fujimoto S. Changes in caspase expression in Alzheimer's disease: comparison with development and aging. // Biochem. Biophys. Res. Com. 1999. - V. 256. P. 381-384.

239. Shinnar S., Berg A.T., Moshe S.L., Petix M., Maytal J., Kang H., Goldensohn E.S., Hauser W.A. Risk of seizure recurrence following a first unprovoked seizure in childhood: a prospective study. // Pediatrics. -1990.-V. 85.-P. 1076-1085.

240. Shmidt K.F. Uber den Imin-Rest. // Ber.Dtsch Chem Ges. 1924. - V. 57. - P. 704-706.

241. Shorvon S.D. The epidemiology and treatment of chronic and refractory epilepsy. //Epilepsia. 1996. - V. 37. - N. 2. - P. S1-S3.

242. Sies H. Oxidative stress: Introdactory remarks. / Oxidative stress. Academic Press, London. - 1985. - P. 1-8.

243. Sies H., Cadenas E. Oxidative stress: damage to intact cells and organs. // Philos

244. Trans RSoc Lond В Biol Sci. 1985.-V. 311.-N. 1152.-P. 617631.

245. Simon H.U., Haj-Yehia A., Levi-Schaffer F. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction. // Apoptosis. 2000. - V. 5. - N 5. - P. 415-418.

246. Sirven J.l. Classifying seizures and epilepsy: a synopsis. // Semin Neural. 2002 - V. 22. P. 237-246.

247. Sloviter R.S. "Epileptic" brain damage in rats induced by sustained electrical stimulation of the perforant path. I. Acute electrophysiological and light microscopic studies. // Brain Res Bull. 1983. - V. 10. - P. 675697.

248. Sloviter R.S. Decreased hippocampal inhibition and a selective loss of interneurons in experimental epilepsy. // Science. 1987. - V. 235. -P. 73-76.

249. Sloviter R.S., Damiano B.P. Sustained electrical stimulation of the perforant path duplicates kainate-induced electrophysiological effects and hippocampal damage in rats. // Neurosci Lett. 1981. - V. 24. - P. 279-284.

250. Sloviter R.S., Dean E., Sollas A.L., Goodman J.HApoptosis and necrosis induced in different hippocampal neuron populations by repetitive perforant path stimulation in the rat. // J Comp Neurol. 1996. - V.366.-P. 516-533.

251. Snead O.C. 3rd. Pharmacological models of generalized absence seizures in rodents // J. Neural Transm. Suppl. 1992. - V. 35. - P. 7-19.

252. Snead O.C., Banerjee P.K., Burnham M., Hampson D. Modulation of absence seizures by the GABAA receptor: a critical role for metabotropic glutamate receptor 4 (mGluR4). // J. Neurosci. 2000. - V. 20. - P. 6218-6224.

253. Soderfeldt В., Kalimo H., Olsson Y., Siesjo B. Histopathological changes in the rat brain during bicuculline-induced status epilepticus. // Adv Neurol. 1983.-V. 34.-P. 169-175.

254. Spiller A.E., Racine R.J. The effect of kindling beyond the 'stage 5' criterion on paired-pulse depression and hilar cell counts in the dentate gyrus. // Brain Res. 1994. - V. 635. - P. 139-147.

255. Stefan H., Pauli E. Progressive cognitive decline in epilepsy: an indication of ongoing plasticity. // Prog Brain Res. 2002. - V. 135. P. 409-417.

256. Stefanis L., Park D.S., Yan C.Y., Farinelli S.E., Troy C.M., Shelanski M.L., Greene L.A. Induction of CPP32-like activity in PC 12 cells by withdrawal of trophic support. Dissociation from apoptosis. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 30663-30671.

257. Stepanichev M.Yu., Zdobnova I.M., Zarubenko I.I., Moiseeva Yu.V., Lazareva N.A., Onufriev M.V., Gulyaeva N.V. Amyloid-P (25-35) induced memory impairment correlates with cell loss in rat hippocampus. // Physiol. Behav. 2004. - V. 80. - P. 647-655.

258. Stone W.E. Convulsant actions of tetrazol derivatives. // Pharmacology. 1970. -V. 3.- P. 367-370.

259. Sutula Т., He X.X., Cavazos J., Scott G. Synaptic reorganization in the hippocampus induced by abnormal functional activity. // Science. — 1988. V. 239. - N. 4844. - P. 1147-1150.

260. Sutula T.P., Pitkanen A. More evidence for seizure-induced neuron loss: is hippocampal sclerosis both cause and effect of epilepsy? // Neurology. 2001. - V. 57.-P. 169-170.

261. Sutula TP, Hagen J, Pitkanen A. Do epileptic seizures damage the brain? // Curr Opin Neurol. 2003. - V.16. - N.2. - P. 189-195.

262. Toth Z., Yan XX., Haftoglou S., Ribak C.E., Baram T.Z. Seizure-induced neuronal injury: vulnerability to febrile seizures in an immature rat model. // J Neurosci. 1998. - V. 18. - P. 4285-4294.

263. Van der Vliet A., Bast A. Effect of oxidative stress on receptors and signal transmission. // Chem. Biol. Interactions. 1992. - V. 85. - P. 95-116.

264. Velez L., Selwa L.M. Seizure disorders in the elderly. // Am Fam Physician. -2003.-V. 67.-P. 325-332.

265. Victorov I.V., Prass K., Dirnagl U. Improved, selective, simple and contrast staining of acidophilic neurons with vanadium acid fuchsin. // Brain Res. Protocols. 2000. - V.5.- P. 135-139.

266. Villa P., Kaufmann S.H., Earnshaw W.C. Caspases and caspase inhibitors. // Trends Biochem. Sci. 1997. - V. 22. - P. 388-393.

267. Vincent C.I., Рае J.L., Hallows J.L. The cell cycle and human neurodegenerative disease. // Progr. Cell Cycle Res. 2003. - V. 5. - P. 31-41.

268. Viskontas I.V., McAndrews M.P., Moscovitch M. Remote episodic memory deficits in patients with unilateral temporal lobe epilepsy and excisions. // J Neurosci. 2000. - V. 20. - P. 5853-5857.

269. Westbrook G.L. Seizures and Epilepsy. / In: Principles of Neural Science (Kandel E.R., Schwartz J.H., Jessell T.M., eds), New York, USA: McGraw-Hill. - 2000.

270. White H.S. Animal models of epileptogenesis. // Neurology. 2002. - V. 59. -N. 5.-P. S7-S14.

271. Williams L.R. Oxidative stress, age-related neurodegeneration, and the potential for neurotrophic treatment. // Cerebrovasc Brain Metab Rev. 1995. -V.7.-N. 1.-P. 55-73.

272. Wong M., Wozniak D.F., Yamada K.A. An animal model of generalized nonconvulsive status epilepticus: immediate characteristics and long-term effects. // Exp. Neurol. 2003. - V. 183. - P. 87-99.

273. Yu B.P. Cellular defenses against damage from reactive oxigen species. // Physiol. Rev. 1994. - V. 74. - P. 139-162.

274. Yuan J., Yankner B.AApoptosis in the nervous system. // Nature. 2000. - V. 407. - P. 802-809.

275. Zhang L.X., Smith M.A., Li X.L., Weiss S.R., Post R.M. Apoptosis of hippocampal neurons after amygdala kindled seizures // Mol. Brain Res. 1998.-V. 55. - P. 198-208.

276. Zhang X., Cui S.S., Wallace A.E., Hannesson D.K., Schmued L.C., Saucier D.M., Honer W.G., Corcoran M.E. Relations between brain pathology апв temporal lobe epilepsy. // J Neurosci. 2002. - V. 22. P. 60526061.

277. Zhang X., Gelowitz D.L., Lai Chien-Tsai, Boulton A.A., Yu P.H. Gradation of Kainic Acid-induced Rat Limbic Seizures and Expression of Hippocampal Heat Shock Protein-70. // European Journal of Neurosience. 1997. - V. 9. - P. 760-769.

278. Zola-Morgan S., Squire L.R. Memory impairment in monkeys following lesions limited to the hippocampus. // Behav Neurosci. 1986. - V. 100. - P. 155-160.