Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПЕНОГАШЕНИЕ КАК МЕТОД УПРАВЛЕНИЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИМ ПРОЦЕССОМ БИОСИНТЕЗА ОКСИТЕТРАЦИКЛИНА

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ПЕНОГАШЕНИЕ КАК МЕТОД УПРАВЛЕНИЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИМ ПРОЦЕССОМ БИОСИНТЕЗА ОКСИТЕТРАЦИКЛИНА"

\ I

мшспяр^'ш щсшн'о и срг^шго 01щ11альисг0 "гр.ти^у а^р

московски« ордшл .трудового красного аш.шни ташогичнскил инсгшт пидаой прсшшн»&нооти

УНП

На правах рукописи Для служебного пользования энэ.№ , О^

ковалёв ЬЬШ'ОР №Ш1АШ*1Ч УДК

663,1.046.74 : 6I5.V79.93I ШйЮГАШЕНЛЕ КАК ¡ЖГСк УДРАИШШ ТЕЛКШ'Й'-ШйЫ ПРОЦЕССОВ БИОСИНТЕЗА ОКагГШ'РАЩБШШ

05.18.10. - Технология витаминных, ферментных и

белковых препаратов 03.00.07. - ¡Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата -технических наук

Москва - 1982 год.

Работа выполнена на кафедре "Технология адкробиологических производств" Московского ордена Трудового Красного Знамени технологического института пищевой промышленности! во Всесоюзном научно - исследовательском институте антибиотиков и на Курганской комбинате "Синтез" Министерства медицинской проижпенности.

Научные/руководители:

Доктор биологических наук Грачёва U.M. Кандидат технических наук Былинкина Е.С.

Официальные оппоненты:

Доктор технических наук Старков A.B. Кандидат технических наук Бирюков В.В.

Ведущее предприятие:

Ленинградский Всесоюзный научно - исследовательский и технологический институт антибиотиков и ферментов.

на заседании специализированного Совета К 063.51.04 при Московском ордена Трудового Красного Знамени технологическом институте пищевой промышленности /125060, Москва, Волоколамское шоссе, II/.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ШШП.

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью просим направлять по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д.П.

Автореферат разослан и ... 1982 года.

Ученый секретарь специализированного Совета,

кандидат технических наук Агапова Е.В.

Защита состоится

часов

РГАУ-МСЛА имени К. А. Тимирязева ЦНБ имени Н И. Жслезно-а Фонд научный

Актуальность темы. Решениями ХХУ*]

но в 1981-1985 годы увеличение выпуска продуктов микробного синтеза, в том числе антибиотиков - препаратов, получивших широкое применение не только в медицине, но и в других отраслях народного хозяйства. К числу препаратов, выпуск которых должен существенно возрасти, относится.и антибиотик окситетрациклин.

В процессе биосинтеза окситетрациклина имеет место исключительно сильное пенообразоваше, в результате чего нарушается нормальное течение биосинтеза, и снижаются качественные и количественные показатели процесса. Применение значительных количеств пеногасителей, в основном пищевых жиров, с одной стороны не всегда обеспечивает эффективное пеногашение, о другой стороны удорожает препарат и приводит к необходимости расхода дефицитных пищевых продуктов, В связи с этим изыскание путей сокращения расхода жира и одновременно интенсификации процесса биосинтеза яб-ляется актуальной задачей, включенной в отраслевой план развития науки и техники Министерства медицинской промышленности СССР на 1579-1981 года /раздел 01/ и отвечающей требованиям майского 1982 года Пленума ЦК КПСС, рассмотревшего и одобрившего Продовольственную программу.

Цель работы. Целью данной работы являлась разработка более экономичного технологического процесса биосинтеза окситетрациклина за счет:

- использования более эффективных и менее дефицитных яировых и синтетических пенсгасителей,

- установления связи между их пеногасительной эффективность», воздействием на скорость процессов массопередачи по кислороду и влиянием на морфогенез культуры, ультгаструктуру клетки,

- разработка метода применения химических пеногасителей, обеспечивающего возможность управления скоростью процессов ыассооб-

мена.

Научная новизна работы. Изучена пеногасительная эффективность и влияние на биосинтез окситетрадиклина ряда жировых и синтетических пеиогасителей, ранее не применявшихся для этой цели. Впервые для технологического процесса биосинтеза окситетрадиклина проведено изучение влияния жировых и синтетических пеиогасителей на скорость процессов маесопередачи по кислороду и изменение технологических параметров: интенсивности дыхания культуры, концентраций растворенных кислорода и диоксида углерода, газосодержания культуральной жидкости. Впервые изучено влияние химических пеиогасителей на морфогенез и ультраструктуру КЛеТОК культуры STREPTOKYCES mt.rasus. Разработан способ подачи пеиогасителей - Kaie метод управления процессом биосинтеза окситетрациклина по условиям маесопередачи.

Практ; гееская ценность* Практическим результатом проведеншсс исследований явилась разработка, и внедрение способов пеногаше-ния с использованием пальмового масла и синтетических пеиогасителей контрамин 210 и 210 В на Курганском комбинате "Синтез" в производствах окситетрациклина, эритромицина, феноксикетилпени-циллина. Экономический аспект от использования в данных технологических процессах пальмового масла составил в 19в1 году 382 тыс.рублей.

Апробация работы. Основные результаты работы бшщ доложены на: I/. III Всесоюзной конференции "Теория и практика управляемого культивирования микроорганизмов",г.Киев,1981 год, 2/. Всесоюзном совещании "Новые источники сырья для производства антибиотиков",г.Москва,ВШШ,1&&1 год, 3/. IX конференции молодых ученых института микробиологии им. А.Кирхенштейна АН Латв.ССР, г.Рига.,1981 год, 4/.Научной конференции молодых ученых ВНЩА г. Москва,1981 год, 5/.Научных конференциях МТИПП I979-1981 годы.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 3 статьи

- 4 -

и 3 тезисов докладов на научных конференциях.

Структура и объём работа« Диссертационная рс-бота состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 207 источников, приложения. Работа изложена на 133 страницах, включая 15 рисунков и Г8 таблиц.

Краткое соде шали е работы.

I. Обзор литература.

Анализ данных литературы по вопроса« пенооброзования, способам пеногашения, влияния жиров и синтетических пеногасителеЯ на условия ыассопередачи и процессы биосинтеза позволяет ответить:

1. Использование концентрированных сред и высокоактивных штаммов продуцентов антибиотиков приводит к интенсивному пено-обраэованию.

2. Факторы, влияющие на пенообразованиа и устойчивость пены, весьма многочисленны и находятся в сложной взаимосвязи друг с другом, поэтому предсказать характер и интенсивность пенообразования по ходу ферментации не представляется возможным и в капдом конкретной случае требуется проведение экспериментальных работ.

3» Описаны разнообразные способы пеногашения: химические, физические, механические и смешанные. Единого универсального метода не существует, и каждый процесс требует разработки специфических средств борьби с ценообразованием. В производстве антибиотиков в основном применяются химические пеногасители.

4. Влияние добавления тех или иных пенсгасителей на течение биосинтеза может быть совершенно различно, в связи с чем выбор пеногасителя и его эффективной, не токсичной дозы требует применительно к каждоцу продуценту специальной проработки.

5. Влияние пеногасителеЯ на процессы массопередачи хотя и ис-

следовалось, но полученные при этом данные весьма противоречива.

6. В зависимости от класса пеногасителя,доэы и времени его внесения он может оказывать различное влияние на морфогенез культуры.

7. В процессе биосинтеза окситетрациклина ранее использовали кашалотовый жир. В настоящее время применяют животные и рыбьи гири, а также синтетические пеногасители адеканоль и пропинол Б-400.

2. [Материалы и методы»

эксперименты по изучению влияния пеногасителей на биосинтез окситетрациклина проводили в лабораторных, полупроизводственных и производственных условиях в ферментаторах вместимостью 0,1 мэ, 4 ы3, 63 м3. Биосинтез окситетрациклина в лабораторных условиях осуществляли в качалочньсх колбах вместимостью 750 шг с 50 мл питательной среды, установленных на подвесной качалке с 220-240 об/мин. Данные об использованных жировых и синтетических пенога-сителях приведены в таблицах I и 2.

Модельные эксперименты по изучении влияния пеногасителей на гаэосодероание культуральной жидкости и изменение скорости процессов маесопередачи проводили в лабораторных стеклянных ферментаторах фирмы 4 Не« Бгипз«1к " /США/ и фирмы " сь«оар " /Швейцария/, оснащённых системами для автоматического контроля и записи рН, растворённого кислорода, контроля температуры и пенообра-зования. Для возможности определения объёма и газосодержания культуральной жидкости ферментаторы предварительно градуировали, с точностью ± 0,1 л с помощью мерной шкалы, укреплённой на нар/жней стенке аппарата.

Концентрацию диоксида углерода в отработанном воздухе определяли с помощью газоанализатора марки " игаа - 2Т" /ФРГ/.

Водные эцульеми пальмового масла готовили с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 /СССР/, турбинной мешалки "Зенит" *

тип V -3 /ГДР/ и с использованием эмульгирующей установки конструкции ВНИйА.

Наблюдение за морфогенезом культуры проводили с использованием светового микроскопа МБП-15 при увеличении 1350 и электронного микроскопа ЛЛ.1 -100 В фирш " авоь " /Япония/.

динамическую вязкость среда измеряли на вискозиметре * - 2" /ГДР/.

Объектом исследования служили высокоактивные штаммы - продуцента окситетрациклина ЗЪгерЮтусез г1тоеио ЛС-Т-464 и 1-43.

В состав ферментационной среды входила кукурузная цука, кукурузный экстракт и минеральные соли /А.С.К5 722240 СССР 1930 г./ Исходное рН среды 6,2-6,4. для засева применяли /объёмных/ по севного материала, биосинтез вели при температуре 27+1 °С. Длительность ферментации составляла 168-192 ч.

В процессе биосинтеза проводилось определение концентрации

антибиотика, общей концентрации углеводов, аммонийного азота,

растворенных кислорода Сд и диоксида углерода Сэд , пенэобразу-

2 2

мерялась динамическая вязкость^«, рН, интенсивность дыхания культуры (1, Коэффициент массопередачи по кислорода Кьа определяли балансовым методом. Для каждого варианта проводилось не менее трех опытов по 3-5 повторкостей. Экспериментально получанные результаты обрабатывались статистически с использованием критерия Стьюдента, Ошибка опытов не превышала 3-5

Таблица I*

Данные об основных жировых пеногасителях

Е Р Наименование жира, п.п. квалификация

ГОСТ сорт Цена по

2 поясу руб/хг оптовая,розничная

I. Жиры животные:

1. Пищевые

2. Технические

II. Растительные масла

3. Подсолнечное

4. Соевое

5. Пальмовое

ОСТ 49-125-78 ГОСГ 1045-73 I сорт

ГОСТ 1129-73 ГОСТ 7625-76 Импортное

рафин. рафин. рафкнир. не раф.

0-68

0-72 0-68

2-00

1-70 1-30

Таблица 2.

Данные об основных синтетических пеногасителях

К! К?

Наименование пеногасителя Производитель

ТУ Содер. Цена ж ГУб/кг

I. Органические полиэфиры

II.

1.Пропинол Б-400 СССР 6-14-300-77 100 2-00

2.Адеканоль 1,5-109 Япония 100 1-50

З.Структол 11 -673 ФРГ 100 -

4. Антихабзин вир 100 -

5. Верин А-1.А-2 НРБ 100

Сложные эфиры жирных кислот

6. Контрамин 210, 210 В Югославия - 100 2-00

. Полиорганосилоксаны

7. ПМС-154 А СССР 6-02-584-70 100 9-00

8. АС-60 СССР 6-02-937-74 60 7-80

9. 135-104 СССР 6-02-1040-76 30 2-20

10. ЗАС-471 США 100

II. (1-10335 ГБоу» согп1п£" Бельгия 100 "Ц

12. Р 525 "Ро* согп1пе" Бельгия - -

- 8 -

3. Результаты исследований и их обсуждение. Изучение влияния добавления жиров на биосинтез окситетсащтклина.

Для возможности выбора эффективного пеногасктеля, а также времени внесения его в среду, нами в первую очереда была изучена взаимосвязь между интенсивностью пенообразования, изменением вязкости культуралькой жидкости, её газосодептсанпем, концентрацией растворённых кислорода и диоксида углерода в процессе биосинтеза окситетрациклина в аппаратах вместимостью 0,1 м3 с использованием в исходной среде 0,65ji животного кира, Пеногашеште осуществляли периодической подачей через восемь часов животного жира в количестве 0,2si, а после 100 часов роста культуры подавали в промежутке мевду подачами жира, а также при сильном вспенивании, пропинол Б-400 по 0,025ji.

Одновременно фиксировали интенсивность дыхания продуцента и концентрацию растворенного кислорода с целью определения периодов наибольшей потребности микроорганизма в кислороде и обеспечения в дальнейшем в этот период соответствующих условий маесообщена.

На рисунке I представлены данные по одному из проведенных экспериментов. Как можно видеть в период с 60 до 144 часов ферментации имеет место увеличение вязкости куль ту ральноЯ жидкости, повышение в ней газосодержания и концентрации растворенного диоксида углерода и соответственно наиболее интенсивное пенообра- ■ зование. Интенсивность дыхания культуры к GC-7G часам заметно снижается и падает концентрация растворённого кислорода. Очевидно, начиная с 60 часов необходимо снижение вязкости, интенсивности ценообразования и соответственно газосодеряания для повыиения скоростей процессов массопередачи.

В первую очередь была изучена пеногасителькая эффективность различных аиров и их влияние на биосинтез, подученные данные

- У -

Рис.1. Динамика изменения пекообразующей способности, вязкости, газосодержания, растворённых кислорода и диоксида углерода в кудътуралъноЯ жидкости, интенсивности дыхания культуры при биосинтезе окситетрациклина в ферментаторе вместимостью 0,1 мэ.

приведены в таблице 3. АСир вносили в исходную среду в количестве Й4 и 24 на 48 часов культивирования. В качестве контроля были приняты данные, полученные с использованием кашалотового жира.. Как можно видеть из представленных результатов, помимо животного технического жира I сорта положительный эффект был получен при использовании костных жиров» свиного жира, подсолнечного /партия 1Р 2/ и пальмового масел. Но в промышленных условиях желательно применять не пищевые жиры:животный технический и пальмовое масло.

Проверка влияния на биосинтез качества применяемых жиров и зависимость качества от условий и сроков хранения, как видно из данных таблицы 4, показала несомненные преимущества использования

пальмового масла. Учитывая, кроме того» отсутствие ограничений в его поставках и тот фактор, что оно не является пищевым продуктом,4 дальнейшая работа проводилась с его применение«.

Использование пальмового масла, как и других твердых шфов, связано с определенными техническими трудностями /транспортировка по трубопроводам, калирание на стенках аппарата, образование трудноусваеваемых ьккроорганиз^ом комочков и др./.

В связи с отим было изучено влияние на биосинтез окситетра-циклина водных эмульсий пальтвого масла с различными э^льга-торами. Применение пальмового шсла в взде 4СЙ эмульсии дает превышение показателей процесса биосинтеза в среднем на 10-15^ по сравнению с применением его в товарном виде. Наилучше результаты были получены с эмульсией приготовленной с двумя эцулъгаторами: хозяйственным мылом и Т-2. Эта эцульсия апрюби-роаана в подупроизводственных условиях и рекомендована к применению в промышленных аппаратах. В настоящее время, учитывая отсутствие эмульгирующей установки большой производительности, совместно с сотрудниками Курганского комбината "Синтез" отработан метод применения пальмового масла в смеси с кздкиют жирами при биосинтезе окситетрациклина, эритромицина.

С целью выяснения возможности сокрадения расхода жира была изучена динамика потребления пальмового масла /40?£ эмульсия/ а показано, что наиболызая скорость потребления наблюдается до 48 часов ферментации и в период 96-120 часов, что коррелирует с максимальным дыханием. Полученные делнке свидетельствуют о возможности снижения расхода жира после 96-120 часов ферментации и замены его, как пеногасителя, на синтетический.

Одновременно с изучение« возможности и разработкой способа применения пальмового масла нами была проверена возможность использования в процессе биосинтеза окситетрацинлина и других ви-

Таблица 3.

Сравнительные результаты использования различных жиров при биосинтезе окситетрациклина в колбах, штамм ЛС-Т-464.

Р I» ! КИР п.п.! Р партии

!

1

Показатели качества!? сред- !

—¡nmi в jí¡

кислот,пеоекис. теше число число ратура ! мгКОН/г л иода пяавл. *

°С !

:к конт-{ролю

Активн.

1С «Ж* 8

ток контролю

I. Кашалотовый жир /контр./<3,1 0,13 " i 100 100

2. Животный техн.1 сорта 2,3 0,10 31 100 100

3. Подсолнечное масло 1,3 0,60 - 410 90

4. Подсолнечное масло №2 0,4 0,20 - 200 107

5. Костный жир В-1! 0,4 0,10 30 100 115

6. Костный жир №2 0,6 1,50 30 100 100

7. Свиной жир 0,4 0,10 29 220 100

8. Рыбий жир 3,3 0,70 - 240 100

9. Пальмовое масло 2,4 0,15 33 НО 100

10. Соевое масло 1.6 0,12 - 400 87

II. Хлопковое масло №1 0,2 0,10 - 200 100

12. Хлопковое масло №12 0,3 0,40 - 400 92

Таблица 4.

Влияние условий хранения жиров на их качество и показатели процесса биосинтеза окситетрациклина.

1 *

К! J9

п.п

1.

1.1

1.2

2.

2.1

2.2

И Р

Показатели качества

! Актив-

• температура хранения!кислотное i пеоекнсное i те«-! ность

оп число число перат к.ж. в I ^ Ha7 КОН/г! % иода !плав. 5* к кон_______________________________________________С____ТК>52___

Пальмовое масло /исход./ 2,4 0,15 33 100

Пальмовое масло / + 6 / 3,4 0,30 33 100

Пальмовое масло / + 22 / 5,0 0,50 33 96 Кир животный технический ■ *

I сорта /исходный/ 2,3 0,20 31 100

ЗКир животный технический

I сорта / + 6 / 4,3 0,70 31 95

Жир животный технический

I сорта / + 22 / 6,5 1,20 31 77

Срок хранения образцов б месяцев.

дов жирового сырья: ланолин, шерстный кир, микробный жир, жирные кислоты шерстного жира, кирше кислоты тал лов ого масла, саломас. Применение вышеперечисленного сырья в качестве компонента питательных сред привело к снижению показателей биосинтеза, что свидетельствует о необходимости проведения комплекса исследований по отработке способов применения этих экировцх источников, Исключение составил саломас, очевидно он может служить одним из вариантов использования этих видов ииров.

Изучение влияния синтетических пеногасителей на биосинтез о'кситетращтклт'гна.

Была проведена серия экспериментов по определению эффективности действия синтетических пеногасителей, результаты которой представлена в таблице 5.

Таблица 5.

Эффективная доза /Сэ/ и показатель эффективности / / / синтетических пеногасителей по отношению к культуралькой жидкости окситетращпслина.

(¡5 К? ! Наименование I 5^^ен?)гвность

п.п.! пеногасителей ! С&, г / х 10 чсм

I. Органические полиэфиры

I. Пропинол Б-400 0,03-0,05 200

2. Адеканолы, 6-109 0,01-0,03 500

3. Структол .1-673 0,02-0,04 250

4. Антихабзин 0,03-0,05 200

5. Верин А-1,А-2 0,03-0,06 100

Сложные зс[лры жирных кислот

6. Контрашн 210,210 В 0,03-0,05 200

Поли органосилоксаны

7. ШС-154 А 1,00 5

8.. АС-60 0,03-0,05 200

9. 139-104 0,03-0,05 200

10. 5А&-471 0,03-0,05 200

II. й-10335 "Ос* сога1пЕ " 0,03-0,05 100

12. Р 525 "Вокг еогг;1пс ■ " 0,02-0,04 125

Как можно видеть наиболее эффективными оказались большинство органических полиэфиров, контрамины, а из силиконовых - пенога-сители фирмы "Dow coming XAG-47I и отечественные АС-60 и 139-104.

Следующим этапом исследований явилось изучение влияния наиболее эффективных синтетических пеногасителей на биосинтез окси-тетрациклина. Эти данные представлены в таблице 6.

Таблица 6.

Влияние синтетических пеногасителей на биосинтез окситетрациклина в колбах штаммом JIC-T-464.

№ Р Наименование Количество Активность

п.п. пеногаснтеля % К*Х» f №

I. Адеканоль LG-I09 /контроль/ 0,1 100

2. Пропинол Б-400 0,3 ео

3. Структол J-673 0,1 96

4. Антихабзин 0,2 но

5. Верин A-I 0,3 90

6. Верин А-2 0,3 92

7. Контрамин 210 0,3 105

8. Контрамин 210 В 0,3 108

9. ШС-154 А 0,2 80

10. АС-60 0,4 НО

II. ' 139-104 0,4 НО

12. SAG-47I 0,5 100

13. Q-I0335 0,5 105

14. » S25 0,5 102

Во все варианты в исходную среду дали 4?б жира животного техн,1 сорта, синтетические пеногасители внесли на 48 часов ферментации.

Как видно из данных таблицы б показатели процесса не снизались при добавлении антихабзина, контраминов. Силиконовые пеногасители АС-60, 139-104 также показали хорошие результаты, что дало основание проверить их влияние на процесс ферментации при введении их в среду с уменьшенным содержанием жира. И в отом случае

показатели процесса биосинтеза окситетрациклика были выше контроля, как это видно из данных таблицы 7.

Таблица 7.

Влияние синтетических пеногас:гтелей на биосинтез окситетра-циклина в колбах штаммом Л-СТ-464 при содержании в средс различных концентраций животного жира.

КЗ в? Наименование Концентрация Количество Активность п.п. лелогасителя жира в среде, сиптетнч. к.ж., ^

^ пеног. ,54

,1. Адеканоль /контроль/ 4 0,02 100

2. Адеканоль 0 0,02 65

3. Антихабзин 0 0,2 83

4. Антихабзин 2 0,2 95

5. Антихабзин 4 0,2 110

6. Контрамин 210 0 0,5 62

7. Контрамин 210 2 0,5 ' 98

8. Контрамин 210 4 0,5 105

9. Контрамин 210 В 0 0,5 84

10. Контрамин 210 В 2 0,5 100

XI. Контрамин 210 Б 4 0,05 103

12. АС-60 0 0,4 89

13. АС-60 2 0,4 100

14. АС-60 4 0,4 НО

15. 139-104 0 0,4 90

16. 139-104 2 0,4 102

17. 139-104 4 0,4 НО

Примечание: жир кроме вар.2,3,6,9,12,15 и синтетические пеногасители вар. б -Г? давали 50& в среду, 5054 на 48 часов. Антихабзин и адеканоль давали на 48 «асов ферментации.

Здесь же представлены данные, подученные при применении югославского леногасителя контрашн карок 210 и 210 В, показаэ-пие несомненную перспективность и необходимость более широкой проверки. Учитывал также их низкую стоимость и отсутствие в настоящее время возможности поставки в нужных количествах силиконовых пеногасителей АС-60, 139-104 был.?, прсиздсгл. г^уобация конт-

- 15 -

раминов в промышленных аппаратах вместимостью 63 м3 цеха № 2 Курганского комбината "Синтез". Показатели процесса с применением коктраминов марок 210 и 210 В были на уровне контроля, что позволило рекомендовать нам данные пеногасители к внедрению в производство и осуществить процесс внедрения.

Из данных таблицы 6 видно, что наиболее широко применяющийся в промышленности протшнол Б-400 даёт значительное снижение показателей биосинтеза. Это привело к продолжению исследования по подбору условий применения и времени внесения пропинола Б-400 в процесс ферментации, а также изучению причин его токсичности. Ранее / Иванкова соавт. 1980 / били подобраны условия применения пропинола Е-400 - внесение его после 100 часов роста кулыуры, и подача его на фоне определённого количества жира в среде или в смеси с жиром 1;3. Причины токсичности пропинола Б-400 выявлены нз были. Одной из причин снижешш показателей.^ процесса биосинтеза при применении пропинола Б-400, на наш взгляд, могло быть ухудшение условий массообмена, что и явилось предметом дальнейших исследований*

Влияние химических пеногасителей на скорость процессов массообмена при биосинтезе окситетрздиклита. В таблице ь приведены данные одной из серии опытов по изучению изменения газосодержания, концентрации растворённого кислорода, общей карбонатной концентрации в культуральной жидкости и интенсивности дыхания кулыуры при добавлении различных пеногасителей в количествах 0,01^ и О,ВС в модельных экспериментах. В первую очередь следует отметить, что с точки зрения разрушения пены } снижения газосодержания / наиболее эффективными показали себя пропинод Б-400, адекаполь, контрамин 210, однако добавление пропинола Б-400 и адеканоля заметно снижало интенсивность дыхания культуры и уровень растворённого кислоро-

Таблица 8

Нзмзиениэ хоицгнтр.зцлл рзсвзореиного кислорода,даоксзда углерода,газ0с0дзр:^и;ш,:н!тзис1аир0ти дыхаала культура при добаллелил пслогзсктеле;: ь процесс6 блослитзэа онз^техрацшдана. *

! Время

Пеисгэ слкш ! áepiie ц.

I ч

Í i

Ипогшш £-400

Адекантль

Яоктраюш 210 3

iiup ишотаай

АС-60

43 72 96 120

43 пг S6 120

43 ?2 96 120

43 ?2 23 120

43 72 96 120

Исходная культуральная!

! зидзость ( к.-л.) __

! Г í Спп I Сп ! <Х

Яультурашш едкость сразу послз иаесеипя пеногасателя _ъ •гсллч^сп'в О, OR л п. _' _

!

i

"СО, !цл/130,

Op1 * !

■К • Ч i

Г Я-

1Л

m.

■ Vu'4

\hV,r

" i ■■ i^p^ty^1''.'-'? i " :i.i*4 j í.'¡2 i ' : »4

O, OI ! О, I ! 0,0Ï lí O,til! 0,1 ¡O, OI! Ö, I ! 0,0lÍ3,I! O, OIJ О, I! O, Olí 0,1

! да

ю is 45 45

10

15 45 45

ID 15 45 45 12 13 5-3 50

12 13 50 50

2,0 35

^ 0 3,0

2,0 ¿1,5 3 0 ü,0

2,0

3 5 3,0 9,0 2,0

Й 'lo

2,0

4 0 8,0 10

П 14 20 30

О 14

20 ¿0

О 14 20 30

в0

13 23 О 12 IB 28

420 £40 300 250

420 »0 ¿00 260

420 340 S ПО 260

£20 23 л

440 3Í0 320 280

5 5 5 5

5 5 5 5

5 5 5 5 10 15 15 15 5 5 5 5

5 5 5

О

0,5 1,0 1,0

О 0,5 10 5 I¡0

5 О 5 0,5 5 1,0 5 i;o 10 0,5 10 1,0 15 2,0 15 2, "» 5 О 5 0,5

5 1,0 5 1,0

0 0 0 320 330 2 2,0 0 0 20

0 0 0 2î0 2оО £ 3 5 14 Vf 50 30

0 2 0 2*0 240 п SO 13 20 30 SO

0 12 10 230 220 8 13 20 30 40

0 0 0 S3') £30 2 2,0 0 0 40 GO

0 0 0 SIO 2г'Л г ¡3 3 5 14 14 30 50

0 2 i) 270 260 7 3 0 13 20 £0 40

0 12 10 240 230 в 9,0 13 20 20 30

0 0 0 320 3?0 2 ц 0 0 £0 50

0 0 0 £10 220 о V 14 14 £0 50

0 ö 2 230 270 7 3,0 14 I j 20 30

0 15 12 24 0 2¿0 3 1,0 -4 13 20 30

0,5 0 л0 430 420 2,0 0 р 10 20

■3,5 10 6,0 SSO £40 3 3,5 2 6 10 20

10 12 Iл 320 £20 С 17 о 6 8 0 0

IÎO 22 2,0 230 230 3 9,0 б 3 0' 0

0 0 0 420 410 2 2,0 0 0 20 so

0 3 4,0 £40 ££0 з, 5 4,0 4 3 20 £0

0,5 S з'о 13 210 210 7 75 10 10 10 10

0,5 13 270 270 9 0.5 10 10 10 10

i

о! i

да. С увеличение« дозы добавляемого пеногасителя интенсивность дыхания снижалась сильнее. Обрастет на себя внимание тот факт / рис,2а /, что интенсивность дыхания в последующие два часа после добавления пропинола Б-400 практически не восстанавливалась, несмотря на некоторое увеличение газосодереания культу-ральной жидкости и концентрации растворённого в ней кислорода.

Из приведенных данных также ввдно, что хотя пропинол Б-400 и адеканоль пеногасители одного класса и обладают практически одинаковой эффективностью, воздействие их на дыхание культуры было различным: пропинол Б-400 оказывал более сильное отрицательное влияние.

Иная картина наблюдалась при добавлении жира / рис.26 /, а также АС-60, характеризующихся меньшей пеногасителыюй эффективностью. Хотя первоначально газосодержание снижалось так же как и при добавлении других пеногасителей, но быстрее достигало первоначального значения, уровень растворённого кислорода падал незначительно и также быстро восстанавливался, причём тем быстрее, чем меньшее количество пеногасителя добавлялось. Интенсивность дыхания микроорганизма или не изменялась, или

изменялась незначительно.

Контрамин 210 по своему действию на эти же параметры занимал промежуточное положение между полиэфирами и полно рганоси-локеанами.

Коэффициент массопередачи кислорода Кса уменьшался на 35?£ при добавлении 0,1£ пропинола Б-400, на 25Д при добавлении 0,01^ и Ьи. при добавлении 0,1*, на бр4 при добавлении 0,0В< жира животного технического I сорта, / Рисунок 3 /.

Поскольку было выявлено, что применение больших доз пеногасителей значительно уменьшают Киа / 12-35/5 /, снижает интенсивность дыхания культуры, был проведён ряд экспериментов по пери-

одической подаче пеногасителей небольшими дозами. Дозн были подобраны таким образом, чтобы газосодержание уменьшалось, а интенсивность дыхания культуры практически не изменялась. / рис.4 /. Пеногасители АС-60 и контрамин 210 начинали дозировать с 48 часов ферментации, а пропинол Б-400 после 95 часов.

Учитывая, что вышеописанный цикл экспериментов был проведён с культуральной жвдкостью в модельных условиях процесса, для подтверждения полученной качественной зависимости изменения технологических параметров от добавления различных пеногасителей последующие опыты проводили непосредственно в процессе биосинтеза окситетрациклина в ферментаторе вместимостью 4 м3, ¿обазление пропинола Б-400 в количестве 0,01& и 0,1?« также вызыеоло снижение концентрации растворённого кислорода и интенсивности дыхания, только абсолютные значения этих изменений были несколько меньше, чем в модельных экспериментах. Восстановление указанных показателей происходило за 1,5-2 часа при добавлении и за 40-50 мицут при добавлении 0,01?» пеногасителя. Однако интенсивность дыхания в большинстве случаев за этот период времени не восстанавливалась до первоначального значения, особенно при добавлении пропинола Б-400 на ранних стадиях биосинтеза / 24-72 часа /, Следует подчеркнуть, что применение пропинола Б-400 в указанный период зачетно снижало так же показатели процесса биосинтеза. Концентрация диоксида углерода, растворённого в кулыуральной жидкости, уменьшалось на 50-60?», но не падала до низших значений. Отбор проб культуральной жидкости до подачи и после подачи 0,13» пеногасителя и измерение в них газосодертания показали, что оно снижалось не так сильно, как в модельных экспериментах, а лишь до величины 10-15^, что, очевидно, связано с различием в условиях аэрации и перемешивания в аппарате вместимостью 7 Л! и 4 ыэ. Вероятно поэтому коэффициент гассопередачи

°со2 Г

ШГ . $

Ш

й.г

.10 ■ 50 50

40 > 40

■6 ■ 30 • 30-

4 -20 -20'

.2 .10 .1ГП

0 0 0

Уэ

с0 а

2

£ щорл МЛ'Ч л

ОД *

/I

300—__I

— >—»— I

I

1-р—--——Г ^2

ОД %

—^ я

I

___а

<—*.—*— г

У

Г

/г

/

96

97

93

96 . 97 93 55

Рвс.2. Изменение общей карбонатной концентрации, газосодержяния, шшентрагщи растворённого

кислооода в культу га льнсй жидкости и интенсивности л"таная культури пса добавлении 0,1 % прошшола Б-400 / а / и жира животного технического Т сорта / б /. •

KLa / ч-1/

Юа / ч-Ч б '

.90

.(J0 0.0BÍ_

.70 .00

.üO

.40

.30 -rh-

Бремя цементации, ч

Рисунок 3.. Изменение коеффицыента массопередачи lÍLa при добавлении 0,ГЛ и 0,01л пропинола Б-4С0 /а/ и жира животного технического /б/.

£ со ,

Sí %и2 мкл/мл-ч

9<i 99 100

Бремя ферментации ,ч Рисунок Изменение показателей процесса при добавлении мелхи& доз / 0,0014 / пропинола Б-400,

в данных условиях снижался всего на 15~25# при добавлении 0,Bí пропинола В-400.

Как уже отмечалось, пропинол Б-400 и адеканоль по-разному влияют на процесс биосинтеза окситетрациклина и,в частности;ка дыхание кулыуры. С целью выяснения причин этого явления следу-гарм этапом исследований явилось изучение влияния различных пе-ногасителе ¿i на цитоморфологию клетки.

ЦИТОМОТУ^ОЛОГИЧеСКИе ИЭИеНеНИЯ КУЛЬТУРЫ Streptопусеn Tifiprtip

в тфису тс те ии различных пеног^сителей.

Процесс биосинтеза окситетрациклина проводили в колбах с добавлением на различные часы роста кулыуры пеногасителей: жира животного технического I сорта, пропинола Б-400, адеканоля, АС-60.

Исследования с помогаю светового и электронного микроскопов показали, что добавление жира животного технического X сорта не сказывается на строении клеток, но недостаток жира в среде сказывается на характере развития ^лыуры и может привести к деградации клеточных покровов.

Силиконовый пеногаситель АС-60 практически не влиял на развитие культуры, как на среде с жиром, так и без жира и не нарушал клеточных покровов.

Пропинол Б-400, добавленный без жира, оказывал токсическое влияние на вегетативные клетки культуры в течение первых 48 часов развития, резко изменял морфогенез и нуклеоцитоз гиф второй генерации, ответственных в основном за биосинтез антибиотика. Возникали инволюционные Форш клеток, В клетках наблюдались нарушения клеточной стенки и, главным образом, цитоплазматич еской мембраны, что должно приводить к снижению активности ряда ферментативных реакций, связанных с целостностью мембраны, в частности, дыхания клеток.

Добавление пропинола Б-400 на фоне жира в этот яе период

развития культуры приводит к меньшим негативны;* изменениям в развитии и строении клеток. Видимо, жир предохраняет клетки от действия пропинола Б-400.

Шло подтверждено, что добавление пропинола Б-400 на более поздних стадиях роста / после 48 часов / оказывает меныниЯ инги-бирующий эАрект, чем добавление его при посеве.

Добавление адеканоля на фоне жира не приводило л изменениям в развитии и строении клеток. :

Более продуктивный штамм 1-43 оказался чувствительнее к действию пропинола Б-400.

Таким образом, хотя прошнол Б-400 и адеканоль пеногасители одного класса, воздействие их на чульзуру различно. Прошшол Б-400 разрушает клеточные покровы, что и является основной причиной его токсичности.

Проведённый комплекс исследований позволил разработать способ пеногашения с применением пальмового масла й синтетического пеногасителя контрамин марок 210 и 210 В и осуществить его внедрение в промышленных условиях для технологических процессов производства окситетрациклина, эритромицина, фенокскметилпеницил-лина.

Изучение причин снижения в ряде случаев конечных показателей процесса биосинтеза при использовании синтетических пеногасите-лей показали, что основными причинами являются ухудшение условий массопередачи и воздействие на улъ траструк туру клетки.

Для сведения к ка:нимуму эффекта отрицательного влияния пено-гасителей как на процессы массопередачи, так и на клеточные покровы был предложен метод подачи химических пеногасителей мелкими дозами.

Проведённые исследования и апробация полученных результатов позволили разработать и рекомендовать для использования в практике комплексную програмцу,учитывающую взаимосвязь процессов пено-

образования, пеногашения и процесса биосинтеза антибиотиков* 4. Выводы,

X. Изучена пеногасительная эффективность и влияние на процесс биосинтеза окситетрациклина ряда синтетических пеногасите-лей из класса органических полиэфиров, сложных эфиров жирных кислот, полиорганосилоксанов и отобраны наиболее эффективные нонтрамин 210, 210 В, антихабзин, АС-60, 139-104,

2. Впервые применительно к технологическому процессу биосинтеза окситетрациклина разработан метод пеногашения с использованием пальмового масла вместо дефицитных пищевых жиров /животных, рыбьих/ и синтетического пеногасителя контрамина из класса сложных эфиров жирных кислот.

3. Изучено влияние добавления химических пеногасителей на скорость процессов массопередачи по кислороду и изменение ряда технологических параметров /концентраций растворённых кислорода и диоксида углерода, гаэосодержание культуральной жидкости, интенсивности дыхания культури/.

4. На основании данных об изменении условий ыассообмена разработан способ подачи пеногасителей, позволяющий управлять ско-росью процессов массопередачи, для поддержания заданных технологических параметров,

5. Впервые применительно к продуценту окситетрациклина изучено влияние добавления ПАВ на цитоморфологические изменения культуры и выявлены прнчины токсичности органического полиэфира пропинол Б-400,

6. Разработана программа проведения исследований для нахождения оптимального способа пеногашения,* учитывающая одновременно особенности культивирования микрооргатзма и взаимосвязь процессов пенооброзования и массопередачи,

7. Проведены промышленные испытания и внедрены метода пено-

- гашения с использованием пальмового масла и синтетического пе-ногасителя контрамина в производствах окситетрациклина, эритромицина, феноксиметилленициллина. Экономический эффект от использования в данных технологических процессах пальмового масла составил в 1961 году на Курганском комбинате "Синтез* 382 тыс* .

руб.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Иванкова Т.Д. .Ковалёв В.Н. «Лебедева Н.Л. ,Макаревич В.Г,, Кибальник А.И, Сравнительная оценка синтетических пеногасителей в процессах биосинтеза антибиотиков.Химико-фармацевтический

вднаям,158г,Р 2,с.206-211.

2. Ковалёв В.Н.,Иванкова Т.А» »Еылинкина Е.С, Влияние химических пеногасителей на скорость массообмена в процессе биосинтеза океитетрациклика.-"Антибиотшеи",1982,4,с,23-29.

3. Дмитриева C.B.,Заславская П.Л..Ковалёв В.Н,»Иванкова Т.А., Листэинова С.Н. Цитоморфологические изменения культурц 5ТЛБРТ0 —

myces himosus " продуцента окситетрациклина в присутствии различных пеногасителей.-"Антибиотики",1982,№ 7,с.22-26.

4. Ковалёв В.Н. Влияние добавок химических пеногасителей на скорость массообменных процессов.-Тезисы докл.молодых учёных на конф."Микроорганизмы - продуценты биологичоски-активных веществ", 1981,Рига,"Зинатне",с.64-66.

5. Ковалёв В.Н. Химические пекогасители как фактор регулирования процессом ферментации,-Тезиса докл.III Всесоюзной конф. "Теория и практика управляемого культивирования микроорганизмов" ,1981,Киев,"Наукова думка"»часть 2,с.179-1В0.

6. Еартошевич Ю.Э.,Иванкова Т.А. .Ковалёв В.Н. ,!^ина О.Д., Дурье Л.М. Использование пальмового масла при биосинтезе некоторых антибиотиков.-Тезисы докладов Всесоюзного совещания "Новые источники сырья для производства антибиотиков" ,1981,Москва,ВНИИА»

ДСП ПоДП..к_п»ч._16^С1-19в2_г._д[-|-_Зак.280*1 _Тир.100

Типография Госплана СССР