Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Патологические изменения у растений хмеля (Humulus lupulus L.), индуцированные вирусом скручивания листа

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Патологические изменения у растений хмеля (Humulus lupulus L.), индуцированные вирусом скручивания листа"

Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України

Мельничук Максим Дмитрович

УДК 578.864.3.083.3

Патологічні зміни у рослин хмелю (Нити І из Іириіпз І..), індуковані вірусом скручування листя

03.00.06 - вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1997

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії імунологічних та біотехпологічішх проблем в вірусології кафедри вірусології біологічного факультету Київського університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, академік УААН,

професор Бойко Анатолій Леонідович, Київський університет імені Тараса Шевченка, завідуючий кафедрою вірусології.

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук Коваленко Олексій

Григорович, Інститут мікробіології та вірусології НАН України, старший науковий співробітник

- кандидат біологічних наук Бондаренко Павло Євгенович, Інститут садівництва УААН, старший науковий співробітник, завідуючий лабораторії вірусології

Провідна установа - Інститут захисту рослин УААН, м.Київ.

Захист відбудеться 22 жовтня 1997 року о ІО00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.81.01 при Інституті мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (252143, Київ 143, вул. Заболотного, 154, Інститут мікробіології та вірусології НАН України, зал засідань).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці інституту мікробіології та вірусології НАН України.

Автореферат розісланий “ 22- ” 1997 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради ^ ----Пуріш Л.М.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми: У зв’язку з різким збільшенням числа даних про вірусну етіологію хвороб багатьох видів рослин, вивчення характеристики збудників цих хвороб, морфологічних особливостей вражених вірусами клітин та їх субклітинних структур у тих чи інших видів рослин, місць локалізації та механізмів розповсюдження вірусної інфекції в різні органи рослин, а також шляхів їх иерезараження є актуальним.

Свої дослідження у вказаному напрямку ми проводили на рослинах хмелю (Humuius lupulus L.), здорових та вражених вірусом, який е причиною захворювання, що приводить до скручування листя, звідки і походить назва цієї хвороби. Вірусну етіологію та певні характеристики цього вірусу ще у 70-х роках показали Московець С.М. та Бойко А.Л. Дослідження хвороб хмелю цієї та іншої вірусної етіології проводяться в лабораторіях таких вчених як Thresh J.M., 1977; Spaar D., Schmidt

H.E., 1980; Zielinska L.,1983; Munro D., 1987; Solarska E., 1995, Бойко А.Л., 1980-1997 та ін. В результаті було показано, що при ураженні вірусом скручування листя хмелю (ВСЛХ) різко знижується врожайність рослин, погіршується якість отриманої продукції, втрачається її конкурентноздатність на зовнішньому ринку тощо.

Залишаються недостатньо вивченими імунологічні характеристики цього вірусу, характер ураження вірусом субклітинних структур клітин листка, локалізація ВСЛХ в інших частинах рослини, шляхи його транспорту в рослині тощо. Вивчення цих проблем має важливе теоретичне і прикладне значення, в тому числі для розробки нових та модифікації існуючих способів діагостики вірусних захворювань хмелю та для отримання безвірусного посадкового матеріалу.

Мета і задачі дослідження. Основною метою даної роботи було дослідження морфологічних змін клітин і їх субклітинних структур листка та інших органів рослин хмелю (Humuius lupulus L.) при ураженні ВСЛХ, а також наукове обгрунтування способів безвірусного розмноження цієї культури.

Для досягнення поставленої мети були вирішені такі завдання:

- проведено виділення, очистку, а також електронно-мікроскопічну, серологічну та біологічну ідентифікацію ВСЛХ;

- досліджено патологічні зміни в клітинах листя та інших органах інфікованих ВСЛХ рослин за допомогою різних видів мікроскопії;

- вивчено характер ураження провідних систем інфікованих ВСЛХ рослин;

- підібрані умови для культивування та розмноження вільних від

ВСЛХ клітин хмелю в умовах in vilro.

Наукова новизна одержаних результаті!). Використовуючи методи світлової, електронної та скапуючої мікроскопії, ультратонких зрізів, вивчено та встановлено патологічні зміни у рослин хмелю (Humulus lupulus І..) індукованих вірусом скручування листя хмелю.

Вперше вивчена морфологія точкових некрозів в листках хмелю, які утворюються в місцях проникнення віруса в рослину.

Встановлені морфологічні особливості уражених ВСЛХ мембран клітин та всіх їх субклітинних структур, а також специфічна форма та місце локалізації вірусу у вигляді специфічних нитковидних скупчень в різних частинах органів та клітин рослини.

Показано, що ВСЛХ локалізується в судинах ксилеми і практично відсутній в ситовидішх трубках та клітинах-сугіутницях флоеми.

Здійснена модифікація штучних живильних середовищ Мурасіге та Скута для культивування та розмноження вільних від ВСЛХ клітин хмелю в умовах in vitro.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлені специфічні морфологічні зміни клітин та їх субклітинних структур цри враженні рослин хмелю ВСЛХ, а також своєрідні форми вірусних скупчень в клітинах, міжклітинних просторах та плазмодесмах рослин хмелю можуть бути використані для ідентифікації вражених ВСЛХ рослин.

Отримані дані стосовно місць локалізації вірусних скупчень в різних органах рослин хмелю свідчать про те, що вегетативний спосіб його розмноження не гарантує отримання безвірусного посадкового матеріалу. Останнє може бути досягнуто шляхом використання модифікованих нами живильних середовищ Мурасігс та Скуга для культивування та розмноження вільних від вірусу клітин хмелю в умовах in vitro.

Отримані результати використовуються в навчальному процесі при підготовці вірусологів та в подальших наукових дослідженнях кафедри вірусології Київського університету імені Тараса Шевченка.

Особистш'і внесок злобувача. Всі основні роботи по відбору та приготуванню проб для дослідження хмелю (Humulus lupulus L.), виділення та очистки ВСЛХ, а також для проведення методів світлової, скануючої та електронної мікроскопії, ультратонких зрізів тканин були виконані автором особисто на базі лабораторії імунологічних та біотехнологічних проблем в вірусології біологічного факультету Київського університету імені Тараса

Шевченка під керівництвом д.б.н., професора, академіка УААН А.Л. Бойка.

Окремі частини по виділенню і очистці ВСЛХ, його імунодіагностики, електронної мікроскопії виконані за допомогою співробітників кафедри вірусології молодшого наукового співробітника Смирнової С.О. та інженера Баришевського О.М.

Розділ по дослідженню ультраструктури різних частин інфікованих ВСЛХ органів та клітин хмелю використовуючи методи світлової, скануючої і просвітлюючої електронної мікроскопії та ультратонких зрізів проводили на базі Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України разом із провідним науковим співробітником Мартином Г.Г. та інженором Кузьміиою

0.В.

Роботи по біотехнологічному культивуванню рослин хмелю проводили на базі ВКЦ “Фітоцентр” (директор Кріпкий О.Є.) при консультативній допомозі лабораторії біотехнології Інституту хмелярства УААН (завідуючий лабораторією к.с-г.н. Юрківський Й.М.)

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені і обговорювались па: Другому Радіобіологічному з’їзді (м.Київ, 1993 p.); International Conference “ Fundamental and applied problems in phytovirology”, Ukraine, Crimea, (Yalta, 1994); засіданнях та наукових семінарах кафедри вірусології біологічного факультету Київського Університету імені Тараса Шевченка (1993-1997рр.); наукових семінарах департаментів фітопагалогії університетів штатів Анова та Луізіана (США, 1997р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 наукових праць.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини ( 8 розділів власних досліджень, висновкіз і списку використаних літературних джерел, який включає 200 найменувань. Робота викладена на 177 сторінках машинописного тексту і містить 44 малюнка та 6 таблиць.

Основні положення, то виносяться на захист

1. Патологічна дія ВСЛХ на рослини хмелю (Humulus lupulus L.) проявляється в дезінтеграції мембранних систем клітин та всіх її субклітинних структур, що обумовлює порушення їх функцій та загибель клітин, появу точкових некрозів на листках та їх скручування.

2. Морфологічні зміни в органах та клітинах рослин хмелю ири інфікуванні вірусом скручування листя хмелю, а також вірусні

скупчення в уражених рослинах мають специфічну будову і можуть бути використані при діагностиці цього виду вірусного захворювання.

3. Вірусна інфекція рослин хмелю охоплює не тільки листя, а й всі інші органи рослини, що використовуються у вегетативному розмноженні (особливо кореневище). Велика роль у розповсюдженні вірусу в рослині відводиться судинам ксилеми.

4. Підібрані умови культивування та розмноження на модифікованих штучних живильних середовищах в умовах in vitro вільних від вірусів клітин хмелю.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Оглял літератури. Викладені відомості про вірусні та віроїдні захворювання рослин хмелю, їх серологічні, фізико-хімічні та біологічні властивості. Приведені відомі дані про негативний вилив цих збудників та реакцію рослинного організму на втручання майже всіх основних вірусів та віроїдів із багатьох вірусологічних груп, що уражують хміль.

Експериментальна частина Матеріали і метоли. Рослинний матеріал хмелю для дослідів відбирали за ознаками вірусних специфічних симптомів та иатологій в господарствах Житомирської області України. Контрольними були здорові рослини, які спеціально культивувались в лабораторії культури клітин або з дослідних плантацій, що були перевірені на вірусоносійство імунологічними тестами. Об'єктами вірусологічних та фітопатологічних досліджень були листя, стебла, пагони, бруньки, кореневища та шишки хмелю.

Виділення вірусу скручування листя хмелю проводили за стандартними методиками для вірусів групи Carlavirus, описаними Adams & Barbara (1982), а також за деякими власними модифікаціями, використовуючи різні буферні розчини з різними показниками pH середовища.

Концентрацію вірусу проводили методом центрифугування у градієнті щільності сахарози, описашшм Brakke (1958).

Спектрофотометричні дослідження проводили на спектрофотометрі в діапазонах довжини хвилі 230 - 300 нм.

Зараження чутливих до вірусу індикаторних рослин проводили згідно з методом, описашшм Fridlund (1959) та Legg (1965).

Серологічні дослідження проводили постановками реакції подвійної імунодифузії в агарі за аналогією з методом, описашшм Shepard (1972), реакції преципітації в пробірках згідно Bancroft et al. (1960), та імуноферментного аналізу (ІФА) з деякими модифікаціями у порівнянні

методами, описаними Clark & Adams (1977), Thresh et al. (1977). Використовували ноліклоиальні антитіла до ВСЛХ п розведенні 1.64, отриману нами та стандартні сироватки до М-, S-, X - вірусі» картоплі, отримані з Чернігівського НДІ сільськогосподарської мікробіології та Московського державного університету ім. Ломоносова, антитіла до вірусу мозаїки яблуні (ВМЯ) отримані з Інституту хмелярства УАЛІІ.

Дослідження стосовно анатомії і ультраструктури здорових та інфікованих ВСЛХ рослин, процесів проникнення, транспорту та локалізації вірусу в росліші проводили за допомогою методів ультратонких зрізів за схемою: фіксація - обезводнення матеріалу -заливка в епоксидну смолу - приготування зрізів на ультрамікротомі LKB-3. Одержані препарати на предметних скельцях аналізували та фотографували за допомогою світлового мікроскопу NU-2. Субмікроскопічну організацію клітин досліджували в скануючому електронному мікроскопі JSM - 35С та трансмісійному електронному мікроскопі JEM-1200 ЕХ, використовуючії 2%-іі розчин фосфорновольфрамової кислоти (ФВК) рН=7,0 та 2?І-й розчин уранілацетату (УА) згідно з методом, шшеанним Уіклі (1975) та Бойко (1967,1975).

Методи культивування та розмноження на штучних живильних середовищах в умовах in vitro безвірусних рослин хмелю проводили на модифікованих власно середовищах, використовуючи молоді стебла, зимуючі бруньки та апікальну меристему рослин хмелю сорту Клон - 18. Як основу для приготування живильних середовищ використовували середовище Мурасігс та Скуга в нашій модифікації з певними добавками міоінозитолу, тіаміну, піридокенну, нікотинової кислоти та деяких фітогормонів.

Експериментальний цифровий матеріал був опрацьований за стандартними статистичними методами з використанням комп’ютерних програм Microsoft Exccl.

Результати та їх обговорення Зовнішня симптоматика рослин хмелю. уражених ВСЛХ. Скручування листя хмелю - одна з поширених вірусних хвороб на плантаціях хмелю в Україні. Ураження вірусом, що її викликає, призводить до значних змін в фізіології та розвитку рослини, пригнічення ростових процесів, значного зниження продуктивності рослин.

Що стосується ВСЛХ, то його здатність до інфікування певним чином пов’язана із біологією хмелю. Симптоми вірусного інфікування переважно проявлялись у мозаїчності, крапчатості та скручуванні лпстісової пластинки. На стадії розвитку листя вірус викликає різку зміну морфо-апатомічних ознак. При цьому змінюється форма і розміри

листкової пластинки, ішраженість та ступінь диференціації її окремих тканинних елементів. .

Виділення. ідентифікація та характеристика ВСЛХ. Для ідентифікації і дослідження основних морфологічних показників вірусних частинок, що викликають хворобу скручування листя хмелю, їх виділяли з листків інфікованих рослин із чітко вираженими ознаками хвороби. Із отриманих сунернатантів після виділення готували препарати для електронної мікроскопії.

Як свідчать одержані результати, досліджуваний вірус має наличковидну форму, довжина окремих частинок коливається в межах 630-640 нм. Діаметр вірусних частинок досить стабільний і складає біля 12 нм (рис.1).

Рис.1 Нативннй препарат віруса скручування листя хмелю

Слід зазначити, що крім вірусних частинок, виділених з листків хмелю, що мали виражену симптоматику захворювання, в дослідах використовували також вірусні частинки, отримані з рослин-індикаторів, штучно заражених вірусом хмелю. Характерно, що використані для дослідів різні види рослин-індикаторів проявляли не однакову реакцію при їх інфікуванні. Найбільш виражені симптоми вірусного захворювання спостерігали у молодих рослин огірків (Cucumis sativus) та лободи (Chenopodium album).

Для більш детальної характеристики виділених з листків хмелю вірусів були використані серологічні реакції преципітації та подвійної імунодифузії в агарі за Ухтерлоні. Також було досліджено характер антигенної спорідненості ВСЛХ з подібними за морфологією вірусами М-ВК та S-BK. При проведенні цих реакцій була використана одержана нами поліклональна сироватка до ВСЛХ та стандартні сироватки до М-ВК та S-BK. Доведено, що паличковидні віруси скручування листя хмелю та S- та М-вірус картоплі ід групи Carlavirus мають між собою певне серологічне споріднення (табл.1).

Використання імунних сироваток до М-ВК, S-BK, Х-ВК дозволило визначити серологічну спорідненість вірусів хмелю до вірусів картоплі

методом ІФА. Так, з сироваткою до М-ВК сік із листків хмелю різних сортів давав позитивні результати з титрами 1:100 (сорт Перспективний 50), 1:200 (сорт Поліський) та 1:400 (сорт Клон-18). Незначні титри спостерігались при використанні сироватки до Б-ВК, а саме 1:10 (сорт Клон-18 та Поліський).

Таблиця 1 - Серологічна спрідненість вірусу скручування листя хмелю до М - та Б - вірусів картоплі

Шляхи проникнення та транспорту ВСЛХ п рослинах хмелю. Оскільки симптоми вірусного захворювання найбільш чітко проявляються в зміні морфологічного і функціонального стану листків, було прослідковано шляхи транслокації вірусу в тканинах листкової пластинки. Працювали з листками, що формувались на відростаючих пагонах рослин, інфікованих в попередні вегетаційні сезони. Вірус в період зимового спокою таких рослин зберігався в кореневищах -підземній багаторічній частині.

Проведене анатомічне дослідження листків з різним ступенем вірусного ураження як на етані формування листкової пластинки, так і після завершення цього процесу (сформовані листки) показало, що використані в роботі методи препаративної підготовки матеріалу дозволяли досить чітко ідентифікувати уражені вірусом клітини.

Після проникнення вірусів в клітини їх базофільність значно підвищувалась і на анатомічних препаратах такі клітини фарбувались значно інтенсивніше у порівнянні з неушкодженими. Цитоплазма клітин набувала гранулярної структури і в центральній вакуолі З’являлися темні включення, зростала осміофільність хлоропластів, що свідчило про розпад системи фотосинтезуючих мембран і про утворення в таких органелах пластоглобул.

Аналізуючи поперечні зрізи листків, вдалося прослідкувати динаміку поширення вірусної інфекції в тканинах листкової пластинки. Як в молодих, так і в зрілих листках перші пошкоджені вірусом клітини виявляються в зоні дрібних жилок. Аналіз препаратів молодих і таких, що закінчили ріст, листків показав про дещо різний ступінь їх пошкодження ВСЛХ. Так, коли листкова пластинка складала половину площі її кінцевого розміру, кількість пошкоджених клітин становила в середньому біля 50%. При цьому біля 65% пошкоджених клітин припадало на палісадну паренхіму і лише 35% на губчату. У листків, що були інфіковані після закінчення росту, кількість пошкоджених клітин не перевищувала 35%, із яких 2/3 складали клітини палісадної паренхіми.

При використанні глутар-осмієвого фіксатора вірусні частинки, проявляли дещо більший контраст у порівнянні з наявними структурними компонентами клітини. На ультратонких зрізах вони виявлялись переважно у вигляді скупчень багаточислешшх лінійних структур без певної просторової орієнтації (рис.2).

Рис.2 Лінійні скупчення ВСЛХ на ультратонких зрізах

Для таких скупчень характерна значна морфологічна

варіабельність. Вірусні частинки об'єднані у нитковидні скупчення так, що один їх кінець залишається вільним, а другим вони контактують з іншими частинками.

При електронно-мікроскопічному дослідженні особливостей

патогенної дії ВСЛХ виявлено певну закономірність у появі вірусних

частинок в тканинах листкової пластинки. Переважно це елементи ксилеми, що перебувають в стадії диференціації (рис.З).

Наступними клітинами, де починав виявлятися вірус, були клітини ксилемної паренхіми, що безпосередньо контактували із вказаними судинами. На більш пізніх стадіях розвитку інфекційного процесу віруспі частинки починають З’являтися в клітинах мезофілу, особливо в його палісадній частині. В ситовидних трубках і клітинах-супутницях в цей період вірусні частинки відсутні і їх вдається спостерігати лише па етапі, коли листкова пластинка вже має значні пошкодження, викликані вірусною інфекцією.

Результати детального дослідження ультраструктури жилок дозволяють говориш про можливі шлях» переміщення вірусу із трахеїд в клітини оточуючої їх паренхіми. Вірусні частинки виявляються в них як до, так і після автолізу протопласту, і на завершальних етапах формування судин спостерігаються у вигляді скупчень, що розміщуються між виростами вторинної оболонки (рис.4).

Важливо зазначити, що в процесі диференціації трахеїд поряд з літичним руйнуванням протопласту, спостерігається частковий розпад первинної оболонки, переважно в місцях, де відсутня їх лігніфікація.

Рис.З Віруспі частинки в клітинах ксилеми

Рис.4 ВСЛХ між виростами вторинної оболонки

Згідно з результатами електронно-мікроскопічного дослідження із клітин ксилемної паренхіми вірус переважно поширюється у вище розташовані клітини палісади і верхньої епідерми. Більш швидке переміщення вірусу в сторону адаксиальної поверхні листка обумовлено тим, що листки хмелю мають лише один шар клітин палісадної паренхіми, які щільно зімкнуті між собою та з клітинами ксилемної паренхіми і епідерми. В протилежність цьому губчата паренхіма складається із кількох шарів клітин, що розміщені рихло, за рахунок чого площа контактів між ними значно зменьшується, що знижує швидкість проникнення вірусної інфекції.

Крім переміщення вірусів через пори, що утворились в процесі диференціації трахеїд, існують інші шляхи їх розповсюдження. Виходячи із стану ультраструктури інфікованих клітин і топографії в них вірусних частинок, очевидно можна говорити про переміщення вірусних частинок з інфікованої клітини у сусідні по плазмодесмах (рис.5).

В клітинах черешків і стебла переважають мультивезикулярні тіла. В зоні плазмодесм вони розміщуються по обидві сторони клітинної оболонки і припускається, що формування мультивезикулярних тіл певним чином пов’язане з наявністю вірусного інфікування у порівнянні з контролем.

Дослідження морфології верхньої та нижньої епідерми показало наявність в інфікованих вірусом листках хмелю багаточисленних точкових некрозів. Характерно, що вони формуються виключно на верхній стороні листка і розміщуються на поверхні листкової пластинки досить нерівномірно. На ультратонкому зрізі та при аналізі в скануючому електронному мікроскопі точковий некроз листка хмелю має вигляд воронкоподібного заглиблення діаметром від 160 мкм до 200 мкм (рис.6,7).

Рис.5 Плазмодесма клітини, ураженої ВСЛХ

Внаслідок патогенної дії вірусу, що проявляється у появі мертвих клітин і ділянок листкової пластинки та точкових некрозів, порушується цілісність епідермальної тканини листка і поступової втрати нею властивих їй захисних функцій. Кількість викликаних вірусом пошкоджень зростає у міру розвитку хвороби, що негативно впливає на фізіологічні функції листка, порушує його водний обмін і в результаті призводить до швидкого старіння і відмирання як окремих частин листкової пластинки, так і листка в цілому.

_________Дослідження ультраструктури клітин різних органів рослин

інфікованих вірусом скручування листя хмелю. Дослідження мікроскопічної та субмікорскопічної організації клітин різних органів та частин рослин проводили на матеріалі, зібраному у другій половині серпня, коли всі морфоструктури рослин були сформовані, та тих рослин, що культивували в умовах in vitro.

Проведене нами електронно-мікроскопічне дослідження взаємодії ВСЛХ з клітинами листків хмелю включало ряд етапів і розпочиналось з ідентифікації вірусних частинок в протопласті клітин.

Так, вірусні частинки виявлено в ядрах та основних структурних компонентах цитоплазми. Окремі клітини при цьому часто відрізняються за кількістю і локалізацією вірусних частинок. Це обумовлено тим, що розвиток інфекційного процесу має певну спрямованість і відповідну швидкість. Що ж стосується вірусних включень, то їх структура досить стабільна як в окремих клітинах, так і в наявних тканинних комплексах листка.

В ядрах вірусні частинки виділяються як у вигляді поодиноких, так і досить чисельних включень. Розміщуються вони переважно в гетерохроматинових ділянках каріоплазми і ядерцях (рис.8).

Рис.8 Вірусні частинки в ядрі інфікованої клітини

Хлоропласти, як і ядра, також містять вірусні включення у вигляді скупчень лінійних часток. їх кількість на зрізах хлоропластів може бути різною і залежить, очевидно, від стадії і глибини ураження клітини ВСЛХ. Вірусні включення розміщуються переважно в стромі органел як відособлено, так і в контакті з мембранами оболонки, мембранами ламел і гран та пластоглобулами (рис.9).

Наявність і кількість вірусних включень в стромі варіабельна. Хлоропласти в інфікованих клітинах здатні певний час підтримувати цілісність своєї субструктури, яка згодом пошкоджується переважно за рахунок руйнування мембран оболонки органел.

В матриксі мітохопдрій також виявлялися вірусні частинки у вигляді поодиноких паличковидпих структур. З часом їх число зростало, можливо, за рахунок репродукції (рис. 10).

В ранній період в субсгруктурі мітохондрій не спостерігалось суттєвих змін. Подальше збільшення кількості вірусних частинок призводило до того, що вони поступово заповнювали весь простір матрикса органели. Цей процес, зрештою, призводить до появи значних структурних змін в їх мембранній системі, що в кінцевому результаті проявляється у втраті мігохондріями властивих їм фізіологічних функцій.

Рис.9 ВСЛХ в

хлоропласті

інфікованої

клітини

Крім зазначених органел ВСЛХ виявляється також в порожнині вакуолей. Контрольні рослин хмелю мають електроннопрозорпй вакуолярний вміст, тобто в центральній вакуолі відсутні виражені осміофільні структурні компоненти. У вакуолях уражених ВСЛХ листків спостерігаються досить добре виражені скупчення вірусних частинок (рис. 11).

Рис. 11 ВСЛХ в вакуолях вражених клітин листка хмелю

Аналіз субмікроскопічної організації клітин лусок у рослин з вираженими симптомами вірусного ураження показало наявність вірусних частинок практично в усіх клітинних комплексах. За морфологією вірусні частинки лусок не відрізняються від таких листкової пластинки. їх клітинна локалізація аналогічна.

В ході дослідження нами було також показано, що незалежно від тканинної приналежності клітин у більшості із них поряд з вірусними частинками спостерігаються мультивезикулярні тіла (рис. 12).

РисЛ2 Мультивезикулярні тіла в інфікованих ВСЛХ клітинах

Аналіз наявності мультивсзикулярішх тіл б клітинах контрольних і уражених ВСЛХ лусок показав, що вони можуть бути характерною ознакою уражених вірусом рослин.

Нами проаналізовано також стан субмікроскопічної організації клітин п ділянці провідних тяжів черешків шишок, листків і стебла. На відміну від клітин листкової пластинки і лусок, де вірусні частинки досить чисельні і представлені у вигляді скупчень лінійних структур, в клітинах стебла ці структури нам виявити не вдалось. Досить детальне дослідження клітин в ділянці камбіального кільця показало стан ультраструктури ксилемиих та флоемішх судинних елементів і суміжних з ними клітин паренхіми. Як нами відмічено, характерною особливістю ультрастуктури досліджуваних клітин стебла є те, що більшість із них містять мультивезикулярні тіла та вільно розміщені у вакуолях багаточислені везикули.

Подібні результати були отримані і при дослідженні ультраструктури клітин черешка листків та шишок. Як і в досліджуваних клітинах стебла, так і в клітинах ділянки провідних тяжів черешків нам не вдалось виявити аналогічні листковій пластинці віріони.

Таким чином, як свідчать результати дослідження ультраструктури клітин листкової пластинки, лусок, черешків і стебла інфікованих ВСЛХ рослин хмелю, існує певна специфічність розвитку вірусної інфекції в окремих органах пагона. Відсутність вірусних частинок в клітинах стсбла і черешків можливо пов’язана із тим, що для більшості клітин характерна обмежена кількість цитоплазми і, відповідно, низька метаболічна активність, що не сприяє репродукції вірусів. Крім того, більшість клітин у вказаних органах виконують механічні функції і характеризуються досить масивними клітинними оболонками, що створює відповідний бар'єр для міжклітинного переміщення вірусних частинок. Не виключено також, що вірус в клітинах зазначених органів перебуває в латентній формі, змінюючи нри цьому свої морфологічні

ознаки. Одержані нами дані можуть свідчити, що мультивсзикулярні тіла певним чином пов’язані з розвитком вірусного захворювання рослин хмелю та його репродукції. Останні здатні відокремлюватись від плазмалеми, залишаючись в гіалоплазмі, або переміщуватись в порожнину центральної вакуолі. Після виходу п цептральну вакуолю мембрана, що оточує везнкулярне тіло, як правило, руйнується, звільняючи дрібні везикули. Ці везикули можуть також руйнуватися внаслідок розпаду їх мембран. На стадії руйнування в таких везикулах починають виявлятися вірусні частинки. Починаючи з цього періоду кількість вірусних частинок збільшується, внаслідок чого утворюються досить великі їх скупчення.

Біотехнологічний пронес отримання рослин хмелю на безвірусній основі. В результаті проведених досліджень з культивування та розмноження рослин хмелю сорту Клон - 18 в умовах лабораторії культури клітин з використанням молодих стебел, зимуючих бруньок, апікальної мернстеми рослин, перевірених на вірусоносійство за допомогою ІФА та електронної мікроскопії, нами було встановлено, що можна одержати близько 51% стерильних рослин, які під час культивування не заражаються агентами бактеріальної, грибної та іншої природи. Досліджено, що 40% одержаних рослин дають нормальний ріст та розвиток.

Експериментально нами було підібрано умови та концентрації деяких фітогормоттів для регенерації апікальних меристем, утворення пагонів та регенерації корінців хмелю в умовах in vitro.

Після проведення досліджень з культивування рослин хмелю, було доведено, що оздоровлення в загальному процесі становить 76 - 82 % рослин, а на наступному етані розмноження хмелю від рослин-донорів вихід безвірусного садівного матеріалу в одному циклі оздоровлення збільшувався від вірусів груп Carlavirus, Ilarvirus до 94 - 96%.

ВИСНОВКИ

1. Здійснено виділення, очистка, а також серологічна і біологічна ідентифікація віруса скручування листя хмелю (ВСЛХ) паличковидної форми, розмірами 630 - 640 х 12 нм. Показана його серологічна спорідненість до М- та S- вірусів картоплі із групи Carlavirus.

2. Встановлено, що патогенна дія ВСЛХ проявляється в дезінтеграції мембранних систем клітин та майже всіх їх субклітинних структур, яка обумовлює порушення їх функцій та загибель, появу точкових некрозів та скручування листя.

3. Вивчено морфологічні зміни в будові інфікованих ВСЛХ .

клітин, а також форму вірусних скупчень в клітинах, . проводящих судинах та міжклітинних просторах, які мають ,, ..

своєрідну специфіку, що може бути використано при діагностиці цього вірусного захворювання хмелю.

4. BCJIX уражає не тільки його листя, а також інші його органи (корінь, пагони, шишки).

5. Виявлені значні вірусні скупчення в судинах ксилеми, на відміну від судин флоеми досліджуваних рослин.

6. Шляхом модифікації живильних середовищ Мурасіге та Скуга показана можливість культивування та розмноження клітин хмелю в умовах in vitro на безвірусній основі.

Список опублікованих прань.

1. Мельничук М.Д. Патологические изменения клеток листьев хмеля под влиянием вирусной инфекции// Доп. НАН України,- 1996.- №8. - С. 145 - 148.

2. Мелышчук М.Д., Бойко А.Л., Мартын Г.И., Смирнова С.А. Цитологические изменения у растений хмеля при вирусной инфекции//Микробиол. жури.- 1996. - Т. 58, №4. - С. 74 - 79.

3. Мельничук М.Д., Крінкий О.Є., Бойко А.Л., Юрківський Й.М., Кормільцев Б.Ф. Біотехнологічний процес одержання рослин хмелю на безвірусній основі//Доп. НАН України. -1996. -.N»9. - С. 139 - 141.

4. Мельничук М.Д., Мартын Г.И., Бойко А.Л. Изучение формирования точечных некрозов на растениях хмеля (Humulus lupulus L.), инфицированых вирусом скручивания листьев хмеля //Дои. НАН України. - 1997, -№5. - С. 166 -169.

5. Бойко А.Л., Молчанец О.В., Ильченко О.И., Мельничук М.Д., Загородний Ю.Д. Состояние растительного оргаиизма при вирусной инфекции и нарушении факторов внешней среды // Тезисы Радиобиологического съезда, г. Київ, 20 - 25 сентября 1993г. - К., 1993,- 4.1, - С. 125 - 126.

6. Dulevich Zh.A., Smirnova S.A., Melnichuk M.D. Characteristic of hop virus isolated from biocenosis of Ukraine// International Conference “ Fundamental and applied problems in phytovirology”. Abstr., Ukraine, Crimea, Yalta. 22-26 May, 1994. P.35.

Мельничук М.Д. Патологічні зміни рослин хмелю (Humulus

lupulus L.). індуковані вірусом скручування листя хмелю. -

Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата

біологічних наук по спеціальності 03.00.06 - вірусологія.

Київський університет імені Тараса Шевченка, Київ, 1997.

Захищається робота, з викладеними результатами вивчення патологічних змін при вірусній інфекції на рослинах хмелю (Humulus lupulus L.), а саме патологічних змін клітин та їх субклітинних структур різних органів рослинного організму. Описані пронеси дезінтеграції мембранних систем клітин, накопичення вірусних часток в судинах ксилеми, органної та клітинної локалізації вірусу скручування листя хмелю (ВСЛХ), якого відносять до групи Cariavirus. '

Вперше показано накопичення вірусних часток ВСЛХ в різноманітних органах та майже всіх органоїдів рослин в формі специфічних нитковидних включень. Вивчені морфологічні особливості точкових некрозів на листках хмелю.

Розроблений метод культивування та розмноження

безвірусних рослин хмелю сорту Клон - 18 в умовах in vitro на модифікованих штучних середовищах Мурасіге та Скуга.

Ключові слова: вірус скручування листя хмелю, Cariavirus, вірусна фітопатологія, вірусна патоморфологія, судинний транспорт, точковий некроз, розмноження хмелю in vitro.

Мелымчук М.Л. Патологические изменения растений хмеля (Hamulus lupulus L.). индуцированные вирусом скручивания листьев. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата

биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология. Киевский университет имени Тараса Шевченко, Киев, 1997.

Защищается работа, содержащая результаты изучения

патологических изменений при вирусной инфекции скручивания листьев на растениях хмеля Humulus lupulus L-, в частности, патологических изменений клеток и нх субклеточных структур различных органов растительного организма. Описаны процессы дезинтеграции мембранных систем клеток, накопления вирусных частиц в сосудах ксилемы, органной и клеточной локализации вируса скручивания листьев хмеля (ВСЛХ), которого относят к группе Cariavirus.

Впервые показано скопление вирусных частиц ВСЛХ в различных органах и почти во всех органоидах растения в форме специфических нитевидных включений. Исследованы морфологические особенности точечных некрозов на листьях

хмеля.

Разработан метод культивирования и размножения безпирусных растений хмеля сорта Клон-18 в условиях in vitro на

модифицированых искусственных питательных средах Мурасиге и Скуга.

Ключевые слова: вирус скручивания листьев хмеля, Carlavirus, вирусная фитопатология, вирусная патоморфология, сосудистый транспорт, точечный некроз, размножение хмеля in vitro.

Maksvm D. Melnvchuk.____________Pathological changcs of hops

(Humulus lupulus L.) infected of the Hop Leaves Binding Virus. Present thesis presented for Ph.D. degree in biology, speciality

03.00.06 - virology. Kiev National University by Taras Shevchenko, Department of virology, 1997.

Subject of defending is the thesis to present results of the specific virus morphological changes cells of the hops infected bv hop leaves binding virus (HLBV).

It was described cells membrane system disintegration, xylem transport and localisation of the HLBV from Carlavirus group.

For the first time it was shown HLBV localisation in any plant organs like hops cones, and any cells organells in specific line shape inclusions.

For the first time it was investigated hops leaves point necrosis forming in dynamics by light, scaning and. electron microscopy.

It was created techniques of cultivating and reproduction hop healthy plants Clon-18 line in vitro on modificalcd Murashige and Scoog culture mediums.

Key words: hop leaves binding virus, Carlavirus, virus

phytopathology, virus pathomorphology, vessels transport, point necrosis, in vitro multiply.

Підписано до друку 18.09.1997 Формат 60x84/16 Ум. друк. арк. 0,7 Зам. 98 Тираж 100 прим