Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Оздоровление от вирусных болезней как система сохранения мирового генофонда картофеля

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Оздоровление от вирусных болезней как система сохранения мирового генофонда картофеля"

На правах рукописи

ТРУСКИН08 Эрнст Валентинович

ОЗДОРОВЛЕНИЕ ОТ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ КАК СИСТЕМА СОХРАНЕНИЯ МИРОВОГО ГЕНОФОНДА КАРТОФЕЛЯ

Специальность: 06.01.1' - Защита растении

06.01.0.5 - Селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени доктора биологических наук

I

САНКТ-П РТЕРБУРГ, ПУШКИ11 1997 г.

Работа ньша'шеиь во 'Всероссийском (Всесоюзном) научно-исследовательском институте растениеводсгеа им. Н.И.Вавилова в период 1972 - 1995 гг.

Официальные оппоненты: ' •'/

доктор Отологических наук, профессор Ю.И.Вл^соп доктор биологических наук Л.Е.Горбатенко

доктор сельскохозяйственных наук Г.П.Атрошенко

; .г '.' ■ • "; •• ;; •'•¡'Я Д.-, 1- I.: ■'.!'. -• .. . ', ■' ■ • ■ 4 ' /л -л- «'/' *

Ведущее учрежден!?"- Санкт-Петербургский государственный ' аграрный университет-'< ,

Защита диссертации состоится " О " ___

1997 г. в 10 час. на

заседании диссертационного совета Д-020.01.01 по Всероссийском научно-исследовательской инсп,|уте зашитм растении 1'АСХН ир адресу: 189620, Санкт-Петербург Пушкин, ш. Нодбсльскрго, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно исследовательского института зашиты растений.

Лвгорсфер.тг раик^^н " 1997 I.

Учс.п.'И се^уим.'.;■>, с^галищиюго сог-.с кан,; и'^'екк*. м.'Лг

1 А.1!..се ^ ■ ;

Ввиду сильной яораженнссти мировой коллекции картофеля вирусными и иными болезнями давно стоял вопрос о необходимости эффективной ее защиты от всевозможных патогенов, среди которых вирусы имеют первенствующее значение, способствуя быстрому вырождению и гибели коллекционных образцов. Прежние попытки противодействовать этому к; всегда приносили должные результаты. Только с появлением в арсенале мер борьбы" с вирусами метода культуры мерпстемпой ткани стало возможным радикально оздоравливать многие вегетативно размножаемые культуры, включая картофель. Начиная с 1972 г., этот метод впервые освоен нами £ ВИРе н применен к коллекционным образцам картофеля в интродукциошю-карантшшом питомнике Павловской опытной станции ВИР, л затем в Пушкинских лабораториях ВИР на основной коллекции.

При этом выяснилось, чю одна культура ткани, примененная к отдельный образцам, не всегда дает желаемые результаты. Необходима единая скоординированная система оздоровительных мер борьбы с вирусным вырождением коллекции картофеля з целом, с учетом ее видового и сортового разнооС азйя, различных способов воспроизведения образно», наличия в них разных па.огенон, особенно вирусов. Целыо данной работы 'и явилась разработка и создание такой системы, при которой были бы задействованы все способы борьбы с вирусной инфекцией, включая культуру ткани и другие методы терапии.

.Драцшщсс&це-магцш-рзбодц !, выявить характер и степень поражения вирусными болезнями зарубежного картофеля в ннтродукционно-карантинном питомнике.

2. Разработать систему оздоровления коллекционного материала в услиьиях ка, антика.

3. Выявить новые заболевания картофеля вирусного и иного происхождения, в том числе имеющие карантинное значение.

4.Применить метод культуры ■ г капп для оздоровления коллекционных образной картофеля.

5. Исследован. некоторые методические вопросы, связанные с культурой мернстемиоп ткани :

а/ регенеративные w>3MO>.in)cni ботанически и юнечпчеек»! различных >-бр.'.зпов > о мекппн картофеля ь ку.'илуре in \ilro

б/ способность данных образце» к освобо;^!«.!» » эта* уСЛ01,:!ЯХ ОТ Шфуспон ИнфеКЦИИ

6. Изучить и разработать мето/и повышения аффектлнтоетм сго.др<шку нии картофеля п культуре ткан» с использованием, тгулю- » хемотерппип.

7. Создать оздоровленную коллекцию картофеля ;ц, У)1го с у«том разработки методов ее получения, поддержания и храксим-л.

8. Разработать единую систему оздоровления колл*кш-п» картофеля на еенопе ее ботанического к генетического разнообразия, а также многообразия пора^аюип« ее- патогенов, связав с общей системой кзученнл и поддержан г.;;, маро?ок? генофонда, картофеля..

9. Очертись нереиектнви.! сохранения и. исиольооианкя коллекции мирового генофонда картофеля в- будущем.

10. Дать ¡еетодв'иехке и практические рек&мс младая- \м- озцороилению коллекции картофеля и использования ее а. куготур* унго и ¡п у'уо.

Ш^шаяииои'дшь

1. На коллекционно;.-, материале ь услоаии.>. интродукцнонно-кярантиичого питомника изучена степень н характер поражения зарубежного кертофзля вирусными и иными болезнями. Разработана сисп-ма о-ц:?рог.дення его ьа основе разделении образцов на тр»! группы: здоровую, бол .ную и ю скрытой иифекикей.

2. Там же описаны и идентифицирован!» новые заболевания картофеля. Среди них специфическое оранжерейное ф/нкпнопалиное заболевание неинфзкшкнпша природы, которому дали название функционал!ный некроз или новообразование жилок /ФНЖ/. Впервые был обнаружен на нескольких образцах картофеля, а также уллюкуса из Южной Америки андийский латентный вирус картофеля /АЛЕЮ, имеющий карантинное значение.

. 3. Впервые на мирезой коллекции картофеля ВИР применен ¡,еюд культуры мерпстемной ткани с целью оздоровления ее от вир} :. ¡х болезней. Тем самым была открыто новое бнотехнологическ..*-напрааленис исследований прггч ешпельно к коллекционному 1енофонду Бегетатовно размножаемых культур.

4. Б результате этого создана пс-рзая •• 1ШРе V; одна из первых я стртас оздороаленнь;,-. коллекций ккртофелз ш уИго. Сооашепа и нзда!1а п ¡987 г. (чшпша.к-ная методик» я» огч'^роглошгкч

co.wpxaiimo n храиеи:нэ ксяяскциончмх пЗразиоз картофедя в условиях in »'¡tro.

5. й новом .".сдскте ¡пучены üojií-jíkiioctii терма- ü хемотсрапни а cuML-raüüH с K).ivrypo¡i ткали /совместно с Е.В. Рсгои.ной/.

В час гностн нснытапы непосредственное npoípcra u;s, пзэпнровзишх меристем, а также новы? химические препараты, включая рибавприн и стероидные глкхозняи. •

6. Применен ыиболег объективней критерий оценки ^ффектишюстн оздоровления методами культура ткани, гермо- и хенотгрг»пп:| по конечному репультату: ыаходу óeaanpycirux растеииЬ-ре^нграмтсш i"1 исходного '.¡:сла ¡полпредам ¡ь.к мер-.-етем, íii;|¡:¡¡t>!iu-.Myj.'¡ суммпримы итогом регенерации ii гпцд'.пиашш рирусои •• к\\"л:уре

TLaUll.

7. Предложена wierí.-a;; Ciien^a оздоровления м";ч>:.о^ ¡лi» и,>ртофел;, ¡к-чкнап с «птредукшш'.ьго-караитцннсго шпоин:«- и =, си.-п!» f дхш.иейшнч ее изучеппгм li nu; .ерзание«.: .one л лаборатирпых уелоьия.ч.

lipa «шссть

H prjyNW'e многолетней цодромпс^ьксм pai'ovi* с ;-!¡.jv;i>o,'¡ коллекцией картофеля ПИР меюдамн культуры ткани, термо- и хечотерашш, а также оскопил oiO'ipou оеьобохдено от wipyenoíf иифскшш около ООО обрачцо«. Cpea.t «чч пенни«. еелскьискаы ; copia, гибриды и клоны отечественной u зарубежной еелекшш. Пераи-шо? семеиоэодаяо сорта ДетскосельсккЛ уже на протяжении более 20„лег осуществляется на основе напученных » 1972 г. безвирусных мернклонсв. В культуре in vitro размножен р-щ ценных еелекппошолх сортов и итридоп, ненальзопанн:для дальнейшего пронзг.олстна озлороцлелл'.ло еемен'чпо картофеля.

Л.пр.аба1ша_рлбйииьпу.С>.'шкц1ип1 Осноыше материалы исследовании доложены млн предстанлены па ряде Всесою ных Или Международных съездах, конференциях или координационных семннарах-еорсшанна*. Сре,;н ннч Гнч-союлюс сочетание "Современные mcto.ti i получения ôeiriipycHom Kap..p|vw /Москг.л, 1У75/; XIV Международный гетчичесьин конгресс /Мое* вн. |Ч?3/; 111,IV,V и VI конференции >:о кумуре и ю шроынтмх кле1»к н IMIVIÍ paeleiiHli /ЛГ-чли,:. 1 '>70; Кнн.инем. t'X'.1: 1 1i>!!.k;ii,w<¡;.. > . J'iSît.

Алма-Лта,1993/, VIII Всесоюзное совещание по иммунитету с.-х.. культур к вирусным болезням /Вильнюс, 1984/; Школа-семинар по семеноводству картофеля на оздоровленной основе' /Петропавловск-Камчатский, L3"//; Международное рабочее совещание стран СЭВ /Варшава, 1988/; Конференция по рефляции поста и развита.--, картофеля fi 1осква, 1988/; III съезд Всероссийского общества физиолог-» растенкл /С.-Петербург, 1993/; Всероссийский съезд по защите растений /С.-Петербург, 1995/,' Совещание по экологически безопасным методам борьбы с вирусными н нематодными болезнями растений /С.-Петербург, 19!/// и др.

По материалам диссертации опубликовано 32 научных работ-1.

Объем.л оцзуыурд-раЗом

Диссертация состоит из введения, 8 глав, из которых 2 в основном обзорного,общетеоретического,а б - экспериментального содержания, включая обсуждение результатов, заключение, общие выводы и научно-практические рекомендации. Работа завершается списком цитированной литературы из 301 источника отечественной и иностранной библиографии, а так^;е приложением рабочих таблиц.

Материалы диссертации изложены на 299 страницах машинописного текста, включают 3S таблиц, а также 17 рисунков и фотографии.

Вовлеченный в оздороьитсльную работу коллекции.шып материал предстазлял сабой фактически все ботаническое и селекционно-генетическос разнообразие мировой . коллекции картофеля BMP, включая селекциошше сорта, гибриды и клоны, днгаплоиды, культурные виды S.luberosum и S.andigenum, примитивные н дикие виды.

В процессе оздоровления использовался ряд специальных методов диагностики вирусов картофеля, культуры изолированных тканей, органов и растений in vitro, термо- и хемотераппн, отбора, оценки и систематизации оздоравливаемого коллекционного материала. На интродукшюпно-карантинном материале вирусные и иные би.ечн отмечали как визуально, так и серологически, используя антт-сывориткк к ХВК', SBK, МВК, YBK, изготовленные во ВНИИ защиты растений /ВИЗР/ и НИИ картофельного хоийства /НИИКХ/. Серологический анализ проводили '.капельным методом микроагглютинаини /Камераз, Щербакова, 1958/. С начала получения мсристемнмх растений в

г

результате освоения метода культуры апикальных меристем в 1972 г, для диагностики вирусов стали использовать электронную микроскопию /ЭМ/ а с 1986 г. чммуноферментнын анализ /ИФА или ELISA-тест/. Электронную микроскопию /микроскоп Jem-100/ проводили в основном методом погружения ц налыления металла, «ноша негативного кои-грастпгювания /Бокс, 1976/. Иммуноферментный анализ проводили в модификации "двойной езндш.ч", используя диггностикумы к вирусам картофеля, производимые в Бнстехнологическом центре НПО по картофелеводству в Коренево по прилагаемой к ним инструкции и изданным там методическим рекомендациям /Безвирусиое семеноводство картофеля, 1990/. Оценку проводили как визуально, так н фотометрически. Для идентификации андийски* вирусов АЛВК и АВКК использовали также диагностикумы К JA /ELISA-kits/, полученные из Международное центра по исследованию картофеля в Перу /С1Р/.

В отдельных случаях применяли индикаторный анализ. В качестве тест-пастенин использовали виды: Gor.iphrena globosa, Chenopodium amaranticolor, Ch. guinoa. Nicotian» tabacuni, N.glutinosa, S jlamim demissum, шбрнд A-6 и др. /Бокс, 1976/.

Раздел оздоровительной работы, связанный с культурой тканн, начинается с изоляции апикальных меристем - стеблевых точек роста с 1-2 листовыми "ачатками или примордияма размером обычно от 150 до 350 мкм. Работа по вычленению апексов проводятся в условиях стерильного ламинар-бокса под бинокулярным микроскопом МБС-2 при 1б-?2-кратном увеличении.' Для фиксации их размеров используется окуляр-микрометр. Основным матери'чом, из которого вычленяются меристемы, служат заранее заготовленные и простерилизоаашгые в перекиси водорода /3°Ч 5-7 мин./, сулеме или диациде /0,1%, 3-5 мин/ почки клубчевых росткоа, обычно темновых, этиолированных, с последующей промывкой в стерильной воде. Изолированные с помощью препаровальных инструментов апексы сразу же переносят в пробирки с питательной средой. В качестве таковой служила В основном среда Мураенге-Скуга /Murashige, Scoog, 1962/ с некоторой модификацией по ростогим веществам и сахарозе. Специальная клубиеобразуюшая среда, в частности; имела повышенную концентрацию сахарозы /4-8Ht, кинетнн-0,5 мг/л, ИУК - 1 мг/л и не со держала ГК /шббе релин/.

Питательная среда автоклавировапась 15-20 ним. при 1 й1м. В. опытах по хемотерапии некоторые ингибиторы иирусов, й Чнстности,

интерферон, РНК-за, рнбавирин /сираэол/ вносили в среду после автоклавированик, используя специальные бактериальные фильтры.

В опытах по термотерапии использовал,; в основном предварительное прогревание клубней /32-37°С, в течение месяца/, а также воздействие повышеннгчи температурами непосредсгвенно в культуре in vitro. В последнем случае прогревали к а*' сами растения, так и непосредственно меристемные нзоллты с постепенным выводом на Температурный режим от 30 до 37"С в течение 2-3 недель Л1руски1:ов, Рогозина, 1991/.

Основное культивирование меристемных культур проводили на специальной свеТоустаноике с горизонтальным освещением люминесцентными лампами /ДБ-80/ с 'освещенностью 4000-6000 лк при 16-часовом фотопериоде и температуре 20-25°С/в автоматическом режиме/. Для получения пробирочных микроклубгей культуру переносили в условия укороченного фи.опериода 10-12 часов и относительно более низкой температуры: 17- 18°С на свету, 10-12 С в темноте. Полученные клубни хранились в холодильнике при 2-5"С. Подробно методика оздоровления, поддержания и хранении коллекционных образцов картофеля в условиях in vitro изложена в составленных нами методических указанмх ЛГрускгчов, 19S7/.

Полученные в опытах результаты обрабатывали методами математической статистики: достоверность различий при сравнении выборочных показателей качественных признаков по критерию Фишера -метод ф /Плохинскнй, 1970/. Оценка некоторых статистических показателей проводилась с использованием компьютерных программ Anbank, Diana-3, Corr.

. 1. Оздоровление от вирусных болезней интродуцнруемого картофеля в карантине

До недавнего времени вирусы, инфицирующие к-ртофель, не относили к возбудителям карантинных заболеваний. Тем не менее вирусологический контроль осуществляли в ннтродукцпонно-карантннпом питомнике /ИКП/ Павловской опытной станции ВИР задолго до включения ряда новых так называемых андийских вирусов в официальный перечень карантинных объектов.

При разработке и создании системы оздоровления необходимо было иметь четкое представление прежде всего о круге характеое патогенов, поражающих пнтродуцирусмый картофель в карантине, и, пределе всего, вирусов, как осговных факторов быстрого вырождения и утраты коллекционных образцов. .Многолетние данные о зараженности вирусам!! интродуцированных зарубежных образцов картофеля в 1-ый год карантинного испытания /¡971-1902 г.г./ дакл определенное представление о том, каков был за это время ввозимый в страну материал в отношении вирусных болезнен /Табл.1./, В разные годы зараженность картофеля вирусами была подвержена заметным колебаниям от 11% в 1985 г. до 78% в 1081 г. Колебания по отдельным шшСолее известным, распространенным и относительно неплохо диагностируемым мозаичным вирусам были примерно на близко сопоставимом уровне: ХВК: 4-62БВК: 3-61%, МВК; 2-56%. Заметно в меньшей степеш отмечен УВК, как по симптомной характеристике: потосчатая мозаика- 2 -13%, так и но серологическим данным - 2-15%, Постоянно, хотя п в разной степени проявления птме"алн за эти годы симптомы ВСЛК: 1-26% /скручивание листьев/.

Поскольку картофель, проходивший в эти годы через карантин, имел чрезвычайно разнообразнее ботаническое, географическое и фнлсяенетпческое происхождение, особый интерес в отношении вирусов ' был связан с обр.1 ¡нами,полу'ченными из Южной Америки -исконной родчмы дикого и культурист картофеля. По зараженности вирусами южпо-амерпканского картофеля, в основном собранною экспедициями ВИР, видно, что он в сильной степени поражен вирусной инфекцией, как в явной, так и скрытой форме /Табл.2/.

В наибольшей степени ><то касается ХВК и ХВК, заметно меньше определялся МВК, б лее типичный для Европы, чем для Южной Америки. И: стран континента наиболее пораженными вирусами оказались образцы из Аргентины и Перу /75 и 68% образцов, соотгетсгвенно/ и примерно наполовину - материал из Боливии, Колумбии, Эквадора. Для сравнения материал из Центральной Америки /Мексика/ был также заражен вирусами на 59% при том же преобладании БВК и ХВК чад МВК. Сравнительно мало в южно-американском материале " отмечалось симптомов крапчатой, полосчатой мозаикн, скручивания листьев 1\-ЪсА1, зато явно повышенное количество образ! ов в некоторые годы было с признаками всякого рода гннментиых аномалий

Таблица 1.

Зараженность вирусам» лнтродуцнрованных зарубежных образцов картофеля а 1-й год карантина

Год В се га испытано сбразцо» Вирусных образцов т Визуально /%/ Серологически /%/

Симптомы мозаики схручи-кание листьев . X S м Y

1971 550 49 3- 2. 30 31 То 2

t972 652 47 14 6 28 33 28 6

1973 110 77 . 12 25 62 36 40 15

1974 352 63 19 3 30 51 И 9

1975 1225 59 7 1. 42 33 10 2

1976 952 63 3 4 ' 15 36 20 2

1977 58 48 25" 7 24 21 9 10

1978 121 66 22 26 16 15 9 13

1979 139 60- 24 8 35 37 37 7

1980 227 41 6 3 27 27 7 2

1981 120 78 26 12 33 61 49 4

1982 154 75 24 12 44 26 56 10

198Э 45 60 29 2 15 42 47 15

1984 105 27 13 3 8 15 21 7

1985 196 и 12 ' 5 6 6 7 6

1986 102 45 16 10 13 18 9 6

1987 218 • 57 21 7 13 18 22 15

1988 • 31 61 17 22 28 37 27 3

1989 302 31 16 9 7 13 8 2

1990 280 44 29 8 4 23 7 3

1991 142 58 50 . 18 11 13 9 0

1992 56 32 15 21 7 3 2 2

типа желтух /интенсивное посинение, фиолетовость, пурпурность листье*/, ««то »ызыиало подозрение на микоплазмонодобную их природу.

0 »оследине годы на аборигенных видах и сортах карто(|>еля в Южкоьс А»юрике выявлен ряд новых, так называемых андийских, до

Таблица 2.

Зара женность вирусами образцов картофеля, интродуиированного нз Южной и Центральной Америки

Страна Всего испытано образцов Число образцов с вирусами /%/

Всего В том числе с вирусами

X S М

Аргентина 211 75 27 62 7

Боливия 163 53 39 34 14

Колумбия 947 49 15 31 20

Перу 16S0 68 35 31 11

Эквадор 330 44 24 27 j !4

Мексика 16 50 37 50 1 25

недавнего времени не описанных вирусов, в основной нз группы мозаик.

Учитывая, что на других континентах, в частности в Европе, они н» были идентифицированы, ЕОЗР /Европейская организация защиты растений/ сочла необходимым включить их в список карантинных объектов /ЕРРО Bulletin, 19&4/. К числу неевропейских карантинных вирусов относятся: андийский латентный вирус картофеля /АЛИКУ, андийский в л рус крапчатостн картофеля /АВКК/, Т-вирус картофеля /ТВК/, вирус кольцевой пятнистости табака, ашшйскнй штамм калико картофеля /ВКП'Г-Ка/ и др. К ним примыкают также новые агрессивные .штаммы уже давно известных, повсеместно распространенных вирусов картофеля, таких как ХВК, YBK, SB К, MB К и ;!р. Длительная интродукция южноамериканского картофеля в Европу обусловливала почти неизбежный занос туда всех этих вирусов и штаммов. То, что они недостаточно себя здесь проявили, возможно связано с особенностями их биологии, не слишком оптимальными для их. распространения в новых физико-географических н экологических условиях, а также еще недостаточно разработанной системой тестирования новых вирусов. Не исключено и относительно недавнее возникновение этих вирусов и штаммов в процессе сопряженной эволюции паразита и хозяина на исторической родине картофеля.

Ввиду современных требований к карантинному испытанию зарубежных образцов картофеля, особенно завезенных с его родины, в 1988-1991 г.г. была впервые предпринята попытка идентифицировать некоторые новые андийские вирусы на южноамериканском материале в ■иптродукционно-карантинном питомнике Павловской опытной ста цин ВИР, гае часть образцов была испытана на два андийских вируса: чилийский латентный виру картофеля /А Л В К/ к андийский вирус крапчатое™ картофеля /АВКК/. Для этого были использованы специальные днагностикумы для иммунно-фсрментно;о анализа /ИФА/, гшбезно предоставленные нам по предварительной просьбе известным ботанпком-соланологом из Международного центра по исследованию картофеля в Перу Карлосом Очоа. а также полученные из Бчотехцентра НИИКХ в Коренево. В результате испытания 93 образцов АЛВК был зафиксирован в двух образцах обоими диагностикумами. Один из этих образцов относится к высокогорному клубненосному виду рода Ullucus tuberosus Lozano из Эквадора, а другой к картофелю из Боливии. Повторная проверка подтвердила полученные результаты.

Установление андийского латентного вируса картофеля в уллюкусе является едва ли не первым свидетельством такого рода. В 1990г. АЛВК был выявлен методом ИФД еще у двух образцов уллюкуса /из пяти тестированных/, на этот раз нз Колумбии. В 1991 г. АЛВК отметили в 12 образцах картофеля из Боливии из 106 тестированных. Все они по карантинным соображениям изъяты из дальнейшей коллекционной работы. За все эти годы ни разу не был выявлен другой карантинный андийский вирус - АВКК.

Наряду с безусловно инфекционными вирусными или микоплазмо-подобными заболеваниями на протяжении многих лет работы в карантинной оранжерее наблюдалась еще одна до того не описанная болезнь картофеля, которую первоначально условно назвали "белый Y" по сходным признакам некрошзации листовых жилок, несколько похожим на подобные же симптомы, вызываемые вирусом Y картофеля /YBK/. Однако некрозы эти не типа "стрика", т.е. но полосчато-штрпховатые,' а сплошные и не коричг вые и черные, а в виде сухого беловато-серого налета. Появляясь в самом начале патогенеза, саш часто меняются, образуя вздутия типа иролпферирующей каллусной ткани. Конечным результатом таких новообразований может стать множественная дырявость листовых пластинок, сильная

их деформация и скручивание. Такая к .".рта на поражения' может затрагивать как отдельные побеги, так и растение в целом.

Данному заболеванию подвергаются не все, а определенные образны, но как правило, все принадлежащие к ним растения при клубневом их воспроизведении. Описанные симптомы проявляются обычно не сразу, а в некоторый критический момент -.'С[стации и к концу ее нередко сглаживаются, т.е. имеют вполне обратимый характер. При этом они воспроизводятся только при вымащивании образцов в оранжерее. Г. полевых условиях те и;е образцы на 2-й год карантинного испытания подобных симптомов не Имеют, тогда как а оранжерее обычно воспроизводят. 1/то дает основание считать данную болезнь специфично оранжерейной.

За многие годы наблюдении /1977-15^2 г.г./ болезнь проявлялась регулярно, в разной степени поражал образци. В наибольшей степени она проявила себя в 19Э2 г. /до 23% пораженных образцом/. Поражаются ею. в основном, культурные сорта З.шЬегозиш. Попытки выявить инфекционную природу данного заболевания, предпринятые нами, а также фитопатологамн других лаборатории, не позволили подтвердить се. Особое снимание уделялось вирусологическому исследованию больных растений. В частности неоднократно применялся индикаторный метод. .Искусственное заражение табакоь, юматов и других тест-растений путем механической инокуляции сокол), и также прививок не дали каких-либо положительных результатов. "Электронная микроскопия тпкже не выявила возбудителя. Это дает определенное основание считать данное заболевание функциональным, связанным с аномальной физиологией и с непривычными экологическими условиями выращивания картофеля а оранжереях с их повышенной температурой и влажностью воздуха в летнее время. Отсюда предлагается и новое условное название зтой оранжерейной болезни клргофеля - функциональный некроз пли новообразование жилок /ФНЖ/. Целесообразно было бы дать его описание в новых определителях и справочниках по болезням картофеля.

В основу оздоровительной работы со значительной степенью пораженным вирусными и иными болезнями клоповым материалом, полученным в виде клубней /в основном сорта/, был положен негативный отбор, т.е. массовая выбраковка больных растений в сочетании с индивидуальным клоповым отбором здоровых и лучших. Эгот метод пршолен для большинства образцов, |де есть из чего

отбирать, т.е. наряду с больными имеются здоровые растения. В условиях 2-летнего карантинного испытания результаты такого отбора в 1-й год могут быть видны уже на следующий. Если при его отсутствии зараженность вирусами клопового материала на 2-й год ■ обычно возрастает, то при целенаправленном оздоровительном отборе она должна заметно снижаться. Это наглядно можно видеть на рис. 1, где прослежена динамика поражения интродуцнрованного карто феля в 1-й и 2-й год карантинного испытания за ряд лет /1976-1992 г.г/. Если до 1931 г. этот процесс носил более или менее спонтанный характер и общая тенденция была больше в сторону увеличения зараженности, иногда вестма резкого /более 25% в 1977-1978 г.г./, то начиная с этого года, когда начали проводить целенаправленный оздоровительный отбор, картина поражения материала на 2-й год испытания с тала заметно меняться в стороьу оздороатення. Новая тенденция заметна в течение 2 лет /1981-1983 г.г./, затем опять сглаживается при остановке работы в 1983-1986 гг., а далее вновь дает устойчивое с ;нженне вирусного поражения, показывая явный оздоровительный эффект, с некоторым разрывом в 1989-1991 г.г. Объективно это связано не только с исходной зараженностью материала и с конкретными условиями того или иного года, влияющими на характер и степень переноса инфекции, но также с интенсивностью и тщательностью оздоровительного отбора, который не был одинаковым все эти юды. Тем не менее показана принципиальная и практическая возможность ' оздоровления, коллекционных образцов картофеля с помощью отбора в условиях карантина.

В процессе оздоровления всю совокупность образцов, проходящих карантинное испытание, можно разделить на грн основные группы: 1. Визуально и серологически здоровую, свободную от вирусов 2. Внешне здоровую, но со скрытой вирусной инфекцией /по данным серологии/ и 3. Визуально больную, что серологически ие всегда подтверждается. Последнее может быть связано как с несовершенством серодиагностики, так .ч с тем, что серологически определяют лишь несколько вирус«» картофеля, тогда как на самом деле их гораздо больше. Некоторые симптомы поражения могут быть с вирусами вообще не связаны. Так в одно время выделялась группа образцов с признаками вышеописанной оранжерейной болезни /ФНЖ/, однако учитывая ее неннфекционный, по всей вероятности функциональный характер, в дальнейшем эти образцы распределяли среди других групп, в

Динамика поражения вирусами ннтролуциропанного из-за рубежи картофеля в 1-ый и 2-ой год карантинного испытания

'Ч- поражения Интродукциокно-карантинкый

питомник Павловской

испытания

зависимости от данных серологии и побочных внешних проявлений, сопутствующих этому заболеванию.

Что касается больных образцов, то отбор игран здесь весьма ' существенную роль. За счет него можно было довольно заметно пополнить здоровую группу. Выбраковывая от 1 до 17% больных растений, удалое». " разные годы оздоровить и перевести в соответствующую группу от 5 до 28% образцов /табл.3/. В результате группа здоровых образцов составляла от 32 до 69%. В то же время группа явно больных образцов колебалась от 22 до 65%, а со скрытой вирусной инфекцией от 0 до 25%. Группировка образцов ; . ааличи.о или отсутствию вирусной инфекции, а также признаков болеши позволяет, с одной стороны, отделить здоровые образцы от больных, безвнрусные от инфицированных, поедотвратив дальнейшее их заражение в условиях карантина, с другой - определить дальнейшую их судьбу в процессе карантинного испытания и последующей передачи в основную коллекцию. Если здоровая 1руппа образцов после 2 лет испытания сразу же передается в коллекцию для соответствующего изучения, поддержания и хранения, то больлая из карантина в принципе выходить не должна. Ее необходимо оздоравливать тут же или ликвидировать, подобно образцам с карантинными объектами.

Таблица 3.

Группировка образцов картофеля в процессе его вирусологического

обследования и оздоровления в 1-й год карантинного испытания

Количес-во образцов Переве-

Всего в группах /%/ Выбрако- дено в

год Со Внешне вано здоровую

образцов Внешне скрытой и серо- больных группу

больная инфек- логиче- растений образцов

цией ски здо- /%/ /%/

ровая

1981 120 33 25 " 42 17 20

1982 154 22 15 63 13 28

1987 218 28 3 69 14 26

1988 ЗГ 49 3' 48 3 10

1989 302 30 12 58 5 8

1990 280 ' 35 15 50 2 5

1991 142 65 3 32 11 6

1992 56 32 0 68 1 5

Б J 972 г. в ннтродукционнс-карантшшом питомнике /ИКП/ Павловской опыт, станции ВИР была начата работа по оздоровлению картофеля от вирусных болезней методом культуры мерь темной ткани. В. качестве пробного объекта бил вччт сорт Детскосельский, с которым на протяжении ряда лет уже »елось первичное семеноводство на так называемой безвирусной основе /Зыкин, 1976/. Путем систематического клопового отбора удалось освободить данный сорт т основных мозаичных вирусов за исключением SBK, 100% носителем которого он являася. Нашей задачей ЯВИЛСК t> освобождение сорта от S3K разработанными уже тогда методами культуры мернстеммой ткани, термотерапии, а также прививок стеблевых апексов на живые растения-кормилицы /Mellor, Stace-Sinitli, 1967; Дунин, Нгуен-Тун, Харченко, 1971/. От подвергнутых термотерапии [¡астений /36-39°С в течение 1-2 месаиев/ изолировали аг.ексы размером 0,2-0,6 мм, часть из которых прививали на растения томатов, часть сажали на питательные среды Мураенге-Скуга н Уанта в пробирки. Из 470 сделанных прививок прижилось тольхо 4, из них лишь в одном привое не был обнаружен SBK. Из 500 ме;"исгемиых апексов, посаженных на питательные среды в пробирки, получено было 20 растенпй-регенерантов, нз которых лишь в одном был устапомен SBK /Трускинов, 1975/. Дальнейший выбор методики оздоровления не составлял проблемы. Явно более высокая эффективность чисто культурального метода перед прививочным не вызывала сомнения.

В последующие 1973-1977 г.г. в ИКП было пропущено через культуру меристем около 300 образцов, поступивших в карантин из-за рубежа, включая селекционные сорта, клоны, а также виды. В результате 90 образцов /более 30%/ были определенно оздоровлены d процессе освобождения от вирусов. При этом число освобожденных от вирусов меристемиых растений было еще выше, достигая почта 80% Сравнительно невысокий процент оздоровления образцов в целом был связан ; основном с тем, что не у всех из них были получены полноценные меристемные растения I примерно у 50% образцов/. Это во мноюм зависело от состояния исходною материала, степени его пораженности и от различной способности регенерировать о условиях изолированной культуры ткани ботанически и диетически разных

образцов картофеля /Трускинов, 1978/. Так или иначе оздоровление образцов картофеля в ИКП с применением ряда методов, включая культуру ткани, стало не только возможным, но и совершенно необходимым этапом на пути дальнейшего поддержания, изучения и использования в коллекционной и селекционной работе.

С 1978 г. работа по оздоровлению коллекции картофеля от вирусных болезней методом культуры апикальных меристем осуществлялась в Пушкинских лабораториях ВИР, сначала при отде клубнеплодов, а с 1992 г. в лаборатории биотехнологии. Всею за это время было взято в работу 1085 коллекционных образцов. Из них удалось освободить от вирусов 712 /66% от числа взятых образцов/. С учетом того, что не от всех образцов удалось получить меристемные растения, процентный показатель оздоровленных образцов от числа давших растения б мл несколько выше - 11% .

Оценивая общие итоги оздоровительной работы, проделанной за эти годы, важно учесть все показатели, характеризующие се. При оценке результатов работы учитывались 'как регенерационные показатели /приживаемость меристем, выход растеннй-регенерантов/, так и собственно оздоровительный эффект, т. е. процент полученных беззирусных растений. Оценка конечного результата оздоровления неоднозначна и зависит от того, выводится ли данный процент от числа всех полученных растений /47%/, от числа прнжив'чихся меристем /12%/ или от числа всех меристемных изолятов /7%/. Последний показатель будет определять не столько оздоровительный эффект как' таковой, сколько конечный итог или- эффективность оздоровительной работы /Табл. • 4./. Приведенные данные характеризуют картину оздоровления коллекционных образцов в целом. Вместе с тем особый интерес представляет реакция отдельных образцов на условия культуры ткани клк средства их оздоровления. Некоторые из них брались в работу неоднократно в разные годы исследования, в связи с чем ¡.мелась возможность сравнения результатов по регенерации и освобождению от вирусов как между повторностями образцов, так и между ними самими. В .результате выявилось, что отдельные образцы существенно выделяются по некоторым показателям. В частности, лучшую приживаемость меристем показали сорта Amaryl, Cobra, Miranda, Tajga, дигаплоиды Ewerest, Sebago, образцы S. tuberosum ssp. cbiloer.sc /К-6056 /, S. phureja /К-15877/, S.rybinii /К-12703/. Наибольший выход

Таблица 4.

Оздоровление коллекционных образцов картофеля методом культуры апикальных меристем

Пушкинские лаб. ВИР, 1978-1995 г.г.

Год Число образцов Число изолированных меристем Число прижившихся меристем Число полученных мсристемных растений Число р ггений, не показавших вирусы

~ абс. % абс. * 7с ** % 1 абс- % * % ** %

1978 52 1222 649 53 185 28 15 105 57 15 9

1979 61 834 71 92 16 11 56 61 9 7

1980 36 769 400 52 ]40 35 18 70 50 17 9

1981 36 671 552 82 175 32 26 32 18 6 5

1982 70 1386 936 67 263 28 19 153 54 15 10

1983 32 1350 717 53 159 22 12 97 61 13 7

: 1984 43 1690 900 53 224 25 13 133 59 15 9

; 1985 | 74 2139 1355 63 321 24 15 216 67 16 10

1986 | 68 | 2367 . 1367 58 281 21 12 121 43 9 5

Продолжение таблицы 4.

1 1987 \ 83 1 2298 1346 59 381 28 17 253 66 19 11

| 1988 152 ' 3065 1553 51 380 24 12 175 46 И 6

| 19Б9 92 224: 912 41 280 31 12 109 39 12 5

) 1990 58 1384 669 43 158 24 11 77 49 11 6

! 1992 13 472 99 21 26 26 5 11 42. 11 2

| 1993 83 2139 490 23 181 37 8 44 24 9 2

: 1994 ! 64 »369 395 29 208 53 15 52 25 13 4

; ¡995 68 1676 960 57 271 28 16 95 35 10 6

! 1978: 1995 1085 27076 13891 52±4 3725 23± 2 14±1 1759 47±4 12±1 7+1

Доиерктельные пределы 48-56 2^-30 13-15 43-51 11-13 6-8

Лимн'м 21-82 16-53 5-26 18-67 6-19 2-11

Коэффициенты вариации 31 29 36 .. 32 25 43

% от числа прижившихся меристем; **- % от числа изолированных меристем;

■ - с'( от числа полученных растений.

растений-регенератов отмечен у сорта Carine, дигаплоида Ewerest, примитивных видов S. phureja и S.rybinii. По рсгенерациониьш показателям приживаемости меристем и выхода меристемных растений данные виды и дпптлоид существенно выделяются из приведенной совокупности обр;._щов как наи1олее результативные. С другой стороны явную ретенерацнонную недостаточность проявили с^рт Cayuga и дигаплонд Sebago, что отражено в отсутствии у них растенин-регеперантов, а следовательно и ■ оздороик.елыюго эффекта. Для дигаплоида S:-bago это особенно показательно, учитывая высокую приживаемость меристем данного образна. Что касается собственно оздоровительного эффекта, iO наиболее н существенно высоким он был у сорточ Adretta, Auca, Rector, ScuteHa, если оценивать его от числа полученных растений-регенерантсв. Г1 > конечному критерию эффективности оздоровления от числа исходных меристемных нзолятов наивысшие показатели у сортов Atica и Cocine /21 и 23% соответственно/. Однако у них отмечены весьма высокие колебания по повторностям. Наиболее стабильные результаты по повторным опытлм получены у сортов Хибинский ранний. Adretta, Cayuga, Cobra, Prevalent, Russe' Burbank, дигаплопдов Ewerest u Sebago.

Для выявления определенной генетической обусловленности р .-генерационного ч оздоровительного процесса в культуре ткани представляло интерес сопоставить также данные по ряду сортов и их диганлоидоя . Они не дают четкой картины о влиянии уровня плоидности генетически родственных образцов на степень и характер регенерации, а также результаты оздоровления. В црлом все зависит от конкретных генотипов н особенностей вирусной инфекции. Вместе с тем в отдельных случаях можно проследить явное превышение тех пли иных показателей. В одних это будут сорта, в других - их днгаплоиды. Если взять за критерий оценки конечный показатель /процент оздоровленных растении от числа меристемных нзолятов/, то_ несколько лучшие результаты наблюдаются у дигаплопдов: Amsel, Apollo, Atziinba, Chippewa, Délos, Elia, Majestic, Saco. Явное преимущество сорта нат дигаплоидом заметно лишь у Katalidin. У остальных образцов существенных различий не выявлено. Если иметь в виду только регенерацию, i о можно отме-. >пь сорт Sebago, давший 50% расгенин-ретенерантон при отсутствии таковых у дшаплопдов сч рта.

Учитывая большое ботаническое и селекппоипоченегшкткое рашпобраше коллекционных обра шпц картофеля. нтяты.х в работу по

оздоровлению от вирусных болезней методом культуры ткани, немалый интерес представляет оценка ее результатов в зависимости от происхождения той или иной группы оадоравливаемого материала. Полученные результаты в значительной степени нивелируют, усредняют имеющиеся различия по отдельным образцам. Гак, сорта, их дигаплоиды, чилийские формы S. tuberosum, S.andigenum, примитивные виды практически не различимы по приживаемости меристем /50-56%/, выходу рвстений-регенерантов /24-37% от числа прижившихся и 14-18% от числа изолированных меристем/, а главное по конечному критерию оценкл-проценту безвирусных растений от исходного числа меристемных изолятов /5-8%/. Статистически вполне существенное различие отмечено лишь у диких видов по оздоровлению как таковому: 76% безвирусных растений от общсг - числа полученных и 13% от числа изолятов /Табл.5/. У них же отмечена наиболее высокая приживаемость меристем - 59%, несколько меньшая у S.andigenum - 56%. У этих двух ботанических групп коллекции картофеля Наблюдался и .наибольший размах изменчивости по регенерации и оздоровлению /наибольшие значения стандартных ошибок и соответственно размаха доверительных пределов/. Это возможно связано с наибольшей генетической гетерогенностью диких видов и сильны»! полиморфизмом S.andigenum.

повышенными, так и с пониженными температурами, как с предварительной термообработкой прорастающих клубней, так и с синхронной термотерапией непосредственно апикальных меристем.

Результаты предварительного прогревания клубней /32-37"С/ показали эффективность ее дал»ко не во всех случаях. Статистически наиболее достоверно это проявилось лишь у 2 из 23 образцов: сорта ЕЬа и чилпйского образца вдиЬегозит 7К-7529/.У данных образцов это было связано не только с отсутствием оздоровленных растении в мсристемном контроле, но и с явно и статистически более худшими рсгеьсрацнонными показателями в нем. Тогда как в другн;. образцах регенерационные показатели в вариантах С термотерапией были или на уровне или хуже, чем в контроле, что отразилось и на конечных результатах оздоровления. Тем не .менее при сравнении суммарных результатов предварительной термотерапии клубИсй п сочетании с культурой ткани и одной культуры

В них включены были варианты как с

Таблица 5.

Резуль пи оздоровления коллекционных образцов картог]тели разного

ботанического и селекционио-гснстнчсского происхождения____•_

Ботанические н | Чн ю .'.екнионйо-генетнческне | группы ! образцов 1 1 ! Число изолированных меристем Приживз емость меристем % Полненных растений РйстенвйГ>гз ьицусос

от числа прижившихся меристем % от числа мсри- СТСМНЬ'Х изолгтов % от числа ПОЛучеи- НЫХ % от числа меря-стемных ИЗОЛЯТОВ %

С^лекинокныс-сорга и гибриды 653 17477 54±10 31+7 16+3 47+10 8+2

Лшаплоилы 116 3107 52+Н 32±10 14+5 47+15 7±3

5.шЬего1ИП1 -,>р.с1н1оепзе 156 3827 50±6 £7±10 18+5 36+15 6+3

$.апс1п'епип1 44 404 56±20 24±15 14±7 ¿и±21 7+5

Примитивные вилы 52 1087 53±12 3319 15±4 34±13 " 5±3

Ликнс ВИДЬ! ! 23 1 498 59±20 26+15 17±7 76+21 13±5

НСРе.05

28 | 16 7 23 | 6

меристем статистически вполне достоверно прослеживается повышение эффекта и конечной эффек-чвности оздоровления при прогревании исходного материала на фоне определенного снижения приживаемости меристем и почти одинакового выхода растеннй-регечерантов в обоих вариантах опытов.

Что касается опы,jn по влиянию пониженной температуры во время проращивания клубнеГ /2-5°С/ на дальнейшее с доровление образцов в культуре ткани, то они в целом не дали желаемого результата. Только я 2 из 11 "испытанных образцов имел место некоторый оздоровительный аффект: сорта Bola и Фитофтороустойчивый при статистически достовёрном снижении приживаемости меристем. Сравнение суммарных данных холодной термотерапии, и мернстемного контроля подтверждают общую тенденцн: ухудшения регенерацнонных показателей в данном варианте термотерапии при отсутствии каких-либо существенных различий в результатах оздоровления.

Наибольший интерес представляли данные опытов по влиянию синхронной термотерапии в сочетании с культурой изолированных меристем на регенерацию растений и элиминацию вирусов. Здесь почти у всех образцов прослеживался явный оздоровительный эффект при общем снижении выхода растений-регенерантов. Однако в результате статистически достоверно по сравнению с контролем был поднят уровень освобождения от вирусов у одного из 8 образцов: сорт Frain. Это был единственный образец, у которого не снизился, а даже поднялся и регенерационный показатель. У остальных образцов оздоровительный эффект, если и поднимался, то только от числа полученных растений, а не от исходных изолятов. Это отражено и в суммарных данных по влиянию термотерапии в этой серии опытов: достоверное снижение регенерации, повышение оздоровительного эффекта и отсутствие существенной разницы в конечных результатах эффективности метода при расчете на исходное число меристемных изолятов /Табл. 6.1.

Пр* оценке сравнительной эффективности всех испытанных методов термотерапии в сочетании с культурой апикальных меристем наиболее существенная разница с контролем отмечена при предварительном профевании клубней. Сумм;,гшые данные по всем опытам с Термотерапией Подтверждают статистически достоверно лишь снижение по регенерации и повышение оздоровительною эффекта ирн сравнении процентных показателей числа бечвнрусных растений от общею чиела полученных /Табч. 7./.

Таблица б.

Влияние синхронной термотерапии /30-37°С/в Сочетании с культурой изолированных меристем на регенерацию растений и элиминацию вирусов , •

вари- Число Получено

Образец ант изоли- растений Из них бет вирусов

опыта рован-

ных ме- абс. % абс. % к*

ристем

ВПР-1 К 26 б 23 2 33 8

и T 20 2 10 1 50 5

Мурман- ' А

ский К 29 5 17 4 80 . 14

рант. "i т 40 2 5 2 100 5

Fnnn к 49 6 12 2 33 .,• А г

т 35 10 28 10 100' 28*

? tubero- s -

sum ssp. к 52 17 33 3 .18

chilocitsc

/К-7509/ т 48 5 10* 3 т б

S.crtilo- к 15 7 42 4 57 . 16

bum

/К-10472/ т 19 5 26 3 60 12

S.phurejü к 24 12 50 3 25 ■12

/К.-7928/

т 24 1 4' 1 : jo 4

S.phureja

/К-15788/ к 54 17 31 5 25. • 9

it т 38 3 8' 3 .100* 8

S.steno-

tominn 1С 15 6 40 2 33 13

/К-15824/ т •20 1 5* ,1 'юо 5

к 264. 76 29 25 33 ~9

У

т ■ 244 29 12* ' 24 83* 10

v ni чнс.-и полученных растений

Ol ЧИС.ЛП НЮЛЯЮН '

- г::пистчсски лостоперные различия по сравнению с контролем с

.".i'nilMJHOC'f/.JO 0,95

Таблица 7.

Сравнительная эффективность оздормнения коллекционных образцов »нртофеля методом культуры меристем /КМ/ в отдел ь л ости, в сочетании с предварительной термотерапией клубней /ТК-т-тепло и ТК-х-х^лод/ и

Методика Число Число Число меристемпых растений

изолиро- Получено Оздоровлено

оздоровления образ-цоа ванных меристем абс. %* абс. %** %*

КМ КМ + ТК-т 23 561 452 94 '/J 17 16 36 47 3S 64* 6 10*

км КМ + ТК-х 11 258 223 62 32 2-1 14* 14 9 23 28 5 4

км км + тм 8 264 244 76 29 29 12* 25 24 33 83* 9 10

1км /суммарный чонтроль/ 42 108: 232 21 73 32 7

ХУкм + т/ /суммарный опыт/ 919 134 15* 80 60* 9

* - % от числа изолятов;

** - % от числа полученных растений

* " статистически достоверные различия но сравнению с контролем /КМ/ с вероятностью 0,95

..шдсршмюинн

ышекшшшлш__образцов___картафсш_ох__виругл! *__й<жеии1й _быча

апикальных меристем, При этом исходили из toi j, .что хемотераннн может оказаться более приемлемым средством иншГнгюриот воздействия lia вирусы и оптимальною сочетания ею с культурой in vid о. Особый интерес в данном случае представляет изучение хемтерапемичесмни

воздействия различных антивирусных химических добавок путем включения их в питательные среды. Б наших опытах по хемотерапии были испытаны 4 типа веществ, включая рибавирин, ннтерфероны, нуклеазы и стероидные гликоэиды. Сравнивая их эффективность между соГ й и с контролем /культура меристем без антивирусных добавок/, видно, что наилучшие результаты были получены с рибавирином и стероидными гликозидами, в частности с никотианозидом, сомелонгозидом, томатозпдом и фитоником /Табл. 8.,'. Вместе с тем наиболее фитотоксичное действие оказывал рибавирин, что проявилось в снижении выхода растсний-регенерантов в 3 раза, тогда хак остальные вещества в цепом не оказывали столь существенного влияния на их образование. В отношении регенерации и оздоровления наиболее оптимально проявили себя уже названные стеро: дные гликоэиды. Именно они дали достоверное общее превышение конечной эффективности над контролем г 2 раза /а для фитоника более, чем в 3 раза/. Что касается рибавирнна, то данный показатель достоверно не отличался от контроля, хотя выход безвирусных растений от общего числа полученных превосходил контрольную цифру почти в 5 раз /89 % растений по сравнению с 18%/. Это еще раз подчеркивает значение регенерации в определении конечного результата оздоровления: процентного пыхода безвирусных растений от исходного числа меристемных пзолятов.

Как уже отмечалось, рибавирин, обладая явным антивирусным действием, оказывает также подавляющий эффект на регенерацию вплоть до леталькэго исхода. В связи с этим важно выбрать наиболее подходящую концентрацию вещества при добавлении его в питательную среду, сведя фитотоксичный эффект " минимуму, антивир) лый к оптимуму. Испытание рада концентраций рибавирина ог 10 до 50 мг/л показало, что чаиболее оптимальная и достоверно отличимая в отношении оздоровительного эффекта была концентрация рибавирнна 10 мг/л. /Табл. 9/. Остальные дозы препарата, существенно подавляя выход растений-регенерантов сводили к неотличимому от контроля конечному результату. Данные проведенного испытания вполне согласуются с более-рапними исследованиями, в частпсгн с диссертационной работой Е.В.Рогозиной, где концентрация рибайирина 0,001% была наиболее эффективной как в отношении оздоровлеш.л, так и регенерации /Рогозина, 1991/. Вместе с тем следует отметить, что на конечный результат применения рибавирнна с оздоровительной целью определенное влияние оказывали также оздорапливаемыс образцы и вирусная инфекция.

Tu блица 8.

Сравнительная эффективность оздоровления коллекционных образцов

Число мернстемпых растений

Мв' зд Число Число изолиро- Получено Из них без вирусов

образ- ванных мери- % %

цов стем абс. о ^ абс. от чи^ла n -nfl от числя меристем

КМ 254 s¡s 35 42 48 16

КМ + интерферон 404 126 31 69 55 17

КМ 13 537 187 35 73 39 14

КМ+ РНК-аза 975 318 33 147 46 15

КМ 52 17 33 3 18 й

КМ+ рибивирин 161 18 11' 16 89'

КМ 194 80 41 9 11 6

КМ+ стероидные гликспнды: 1200 454 38 144 32' 12

Капсикозид 94 26 28' 8 31* 8

МеЛ1нгозид 105 30 29' 7 23 7

Никотианозид 199 77 39 22 ■ 29' 11'

Нурпуреазид 99 29 29« 4 14 4

Соланозид 101 46 45 6 13 6

Сомелонгозид 197 63 32 25 40' IV

Томатозид 205 87 42 29 33' 14'

Фитоник 200 96 48 43 45* ■ 21'

ЕКМ /суммарный контроль/ ЕКМ + хемотерания /суммарный опыт/ Т» 1037 2740 372 916 36 33 127 380 34 4\~* Ti "IT

Примечание:'- статистически достоверные различия пи сран вероятностью 0.95

гнию

с

котролсм /КМ/с

Таблица 9.

Влияние разных концентраций рибавнрина на регенерацию п оздоровление коллекционных образцов картофеля in vitro

Концентрация рн'^а-вирина, мг/л Число изолированных меристем Получено раскний-регенерантов

Всего Из них без вирусов

абс. % абс. %* %**

0 766 175 23 42 2--' 5

10 252 71 ■ 28 34 48* 13*

20 147 21 14* 8 38 5

40 134 13 10* 6 46 4

5G [ 282 34 12* 9 ¿6 3

10-50 1 815 149 17* 58 41 7

* - % от числа полученных растений; ** - % от числа нзолятов;

* • статистическ'- достоверное различие с контролем /отсутствие в

среде рибавириНа/ с вероятностью 0,95.

Из 26 образцов отмечен оздоровительный эффект лишь у 13 /50%/, при этом достоверно и по конечному показателю у 2 сортов ; Gitte и Tunica. В некоторых с.учаях это имело место и при концентрациях рибавирииа выШ" 10 мг/л.

Оценивая общую и конечную эффективность хемотерапин по срапнеииго с одной культурой меристем без Применения ингибиторов вирусов /на оенпье суммарных цифр/, можно отметить относительно невысокий, статистически не отличимый ее рост /12% и 14% соответственно/. Статистически достоверное оздоровительное ее деиаппе но сравнению С контролем отмечалось лишь у 4 из 8 испытанных етсроидиых гликозидов /0,ОО^/а растворы/ и у рибавирйиа /а концентрации 10 мг/л/. Практически никакого преимущества перед контролем не проявилось в итоге в вариантах -с применением интерферона и l'HK-дзы /ни по регенерации, ни но освобождению от ипри'ои/.

Применение термо- и хемотерапии для повышения эффективности оздоровления в к^пьтуре ткани показало, что эти методы в ряде случаев, но не всегда, могут способствовать данной цели. При этом успех того или иного метода связан не 'oj.-ko с подавлением нщ./спой инфекции, но и в значительной мере с регенера'чюнными возможностями зараженного ею образца.

Осаобож.чение от иппусов я культуре ткани записи г. как известно. не только от генотипа растения-хозяина и слеп, фпческих свойств па~к>гс-ча. химических особенностей культуральиой среды и физических в частности тсмпсратурньг условий культивирования эксплантатов, но ч от исходных размеров последних,' играющих важную роль как п эл .минации вшу :оп. так i в регенерации бсзвирусных растений. Почти во всех литературных источниках прослеживается мысль и экспериментальное обоснование, что термо- и хсмотер: шя способствуют увеличению безвирусной зсны изолированной мсристемной ткани, а отсюда и возможности вычленять более крупные тканевые изоляты - апексы и почки. При этом почти a priori считаетег что чем крупнее изоляты,тсм они имеют больший шанс регенерировать в растения, хотя и с менпшен вероятностью освободиться от вирусов. Изучению этой противоречивой связи между размерами изолятов и особенностями их регенерации, а также элиминации вирусов в культуре ткани было уд-лено внимание почти все i оды исследования.

Выявилось то, что размеры меристемных изолятов в большей мере влияют на репаративную регенерацию, чем на репродуктивную. Это выражено в том, что их увеличение сказывалось главным образом на приживаемости меристем и мало или почти не затрагивало- выход оастеннй-регенерантов. /Табл. 10./ Более сложная зависимость выявляется при сравнении данных по элиминации вирусов. Существенным совпадением при этом служит то, что конечная эффективнос-ь оздоровления /выход безвнрусных растений от числа изолятов' была наивысшей при размерах ' изолятов 0,25 0,30 мм. Эта закономерность сохраняется ' в ' опытах по термотерапии, где наилучший результат получен также при размерах меристем 0,20-0,30 мм. В этих же опы ах показан i, что оздоровительный эффект имеет место здесь и при размерах меристем 0,30-0,40 мм. Что касаегся опытов по хемотерапии, то в них прослеженные зависимости, от размеров меристем не были столь 0 же однозначны при использовании разных •ингибиторов вирусов. Наиболее примечателен тог факт, что при

общем снижении числа безвирусных растений при размерах меристем более 0,3 мм исключение составлял вариант с сомелонгозидом, где процент освобождения от вирусов даже несколько вырос. Это, очевидно подтверждает особое ингнбиторное действие данного стероидного гликозида на вирусы, а также дополнительно свидетельствует о том, что при хемотерапни, как и при термотерапии, возможно увеличение зоны апикальных меристем, свободной от вирусной инфекции.

Таблица 10.

Выход н освобождение растений-регенерантои от йирусов с помощью культуры апикальных меристем в зависимости от их исходных

размеров

Размеры мернс-миых нзолятов Число меристемных нзолятов Число полученных расте"ий-регенерантов /7с/

Всего Прижилось Всего В том числе без вирусов

шт. шт. % шт. 7о шт. 7с* %**

0,Ю-0,15 2049 938 46 246 26 177 72 9

0,15-0,20 2450 1437 59* 377 26 235 62' 10

0,20-0,25 3323 2409 63* 685 28 59 52' 9

0,25-0,30 2246 1524 68" 456 30 280 61* . 12*

>0,30 1606 1078 67* 310 29 178 57* • 11*

* -7с от всех растений

** - 7с ог числа всех нзолятов

- Различия с исходным размером изолятов статистически достоверны с вероятностью 0,95

Коллекционные образцы картофеля, оздоровленные от вирусных болезней методом культуры апикальных меристем, нуждаются с одной стороны в клоповом размножении для дальнейшего их использования в селекции, семеноводстве, исследовательских работах, с другой - в надежном, долговременном сохранении их в свободном от вирусов и прочих патогенов состоянии.

Наиболее доступный н надежный способ такого поддержания состоит в использовании стерильной пробирочной культуры меристемных растений на искусственной питатель.,ий среде /Morel, 1975/. Поскольку |.ри обычном культивировании пробирочных растений /нскусстр'чшее освещение порядка 4000-6000 люкс, температура 20-27°С, 16 час. фотопернод/ необходимо довольно частое, ежемесячное их черенкование с последующим переносом черенков на свежую питательную среду, важна затормолиь процесс роста с тем, чтобы удлинить сро ' беспересадочного хранения растений в пробирках. Этому может способствоаи-ь: применение для черенкования более обедненных или минимизированных питательных сред; добавление в питательную среду ингибиторов ростл /ретардантов/ и ненользезпнне при культивнроы'чнн пониженных температур.

Однако решающим фактором продления срока хранения образцов явилось »'лубнеобразо-ание у растений в условиях in viiro, кото; ое обеспечиваю им дополнительный естественный и достаточно долгий период покоя. Возможность клубнеобразоьання в культуре изолированных тканей и органов картофеля известно достаточно давно /Barker, 1953; Бутенко, 1964/. О многообразных физиологических аспектах этого явления имеемся обширная литература /Мелик-Саркисов, <!'щеева, 1989/. В -наших опытах основное внимание уделялось температурным, фотопериодическим факторам клубнеобразования, а также влиянию на нею некоторых компонентов питательной среды /Трускинов, Оглузднн, 19S2; Трускинов, 1987/.

Известно, что многие виды картофеля прч естественном росте лучше образуют клубни в условиях укороченного дня, некоторые из них совсем не способны к клубнеобразованню на длинном дне /Разумов, 1931/. ß наш ix опытах, в условиях in vitro, укороченный фитоиернод оказывал также решающее воздействие на клубнео'бразованне у коллекционны", образцов, представленных ргзлнчными сортами и видами картофеля. Ме-ее всего образовалось клубней , на 16-часовом фотопериоде,' тогда как укорочение его и постоянная темнота вызывали заметное увеличение образцов с клубнями. Определенную роль здесь играло также понижение температурного режима, и ил и испытаны, в частности, условия холодильных камер с температурой от + 2 до +7°С. При этом более благоприятным было сочетание данной температуры с постоянной темнотой. Укоре-енное освещение в холодильной камере /10 н 4 часа/ действовало хуже как на сами растения /прогрессирующий

хлороз/, так и на образование ими хлубней вплот** до их отсутствия лри 10-часовом свете /Табя.11/,

Наблюдение за клубнеобразованием in vitro . у некоторых коллекционных образцов картофеля на разных фотопериодах показало, что на длинном 16-часовом д"е оно возможно линь у селекционных сортов, и то в незначительной степени. Туберизация происходила в основном ча коротком дне и в те'-ноте, Практически исключена она была на длинном дне у чилийских форм S. tuberosum и образцов друых видов.

Наряду с такими важным t факторами среды как свет и температура не менее важную роль для клубнеабразовання in vitro i грает питательная среда, особенно ее гормональный состав и насыщение углеводами, в '.астиости концентрация в ней сахарозы. Исходной 2% концентрации сахарозы в стандартной среде Мураснге-Скуга часто недостатсчо для клубнеобразовання in vitro на длинном, а .шогда на коротком дне. Приходится увеличивать ее до 3% я более. Однако при высоких концентрациях сахарозы происходит подавление роста и развития растений, которые сразу начинают образовывать клубни, иногаа физиологически неполноценные. Такое аномальное ускорение развития не способствует niai лой задаче продления всех фаз вегетации и соответственно общего- беспересадочного срока хранения образцов

Таблица 11.

Кдубнеобразоваиие у коллекционных образце j картофеля icr vitro np.i разных условиях культнвироглния

. Условия культивирования Всего образцо» Образцов с клубнями

число %%

Свет -16 час., 20-27°С 90 12 13

Спст-12час.,20"С 45 32 ' • 71

Свет -Ю час., 16-22"С 68 49 72

4-7'"С 13 0 0

Cbci -4 час., 4-51С 22 12 55

Темнота - 24 час.. 2-5"С 51 36 71

картофеля in vitro. Форсируя быстрое образование мнкроклубнен in vitro тем самым сокращаем этот спок «а несколько месяцев. Поэтому увеличение концентрации сахарозы в среде надо ¡.роводнть умеренно и дифференцированно, в зависимости от природной способности разных видов, сортов п гиютипов к туберизации.

В наших опытах по использование двух контрастных концентрации сахарозы /\.г,1 и Г/Д/ при разных фоюпернодах /10 час и 10 час/ на двух сортах: Весна и Пригожий было подтверждено сильное влияние высокой концентрации углевода на клубнеобразование в условиях длинного дня. Однако на коротком дне это влияние нивелировалось и даже достоверно снижалось по сравнению с низкой концентрацией сахарозы у сорта Весна /Табл. 12./.

Существенное значение имеет здесь н сортовая реакция на создаваемые условия. Так ирл достаточно одноышных условиях культивирования с последовательным сокращением фотопериода с 16 час до 10 час двукратное увеличение концентрации сахарозы с '¿. до 4с/с оказывало явное положительное влияние на клубнеобразоианне in viuo у сорта Детскосельскпй. В отношении же сортов Заравшаи и Сеснндж подобного действия ire проявилось и при 4% сахарозы у первою клубнеобразование было статистически достоверно ниже, чем у второго на 2% сахарозе /Табл. 13./.

Определенное значение при клубнеобразовашш in vi'ro придается ярусному происхождению эксплантнруемых черенков. Имеются данные, что верхушечные части растений хуже илн совсем не образуют клубни, по сравнению с черенками среднего и, особенно, нижнего яруса /Морозова, Мелик-Саркисов, 1978; Волкова, Колхут, 1990 /. По нашему опыту работы с культурой in vitro картофеля, гае в основном использовал i верхушки пробирочных оастеннй, клубни обычно образовывались, по крайней мере у сортов. Специальные опыты, поставленные с целью выявить существенные различия по спосооности к клубнеобразованню у сортов Весна и Пригожий в зависимости от яру^ности черенков, фактически таковых не выявили..В определенных вариантах освещения и концентрации сахарозы некоторое преимущество дажг было у »ерхиих черенков. Это'проявлялось на фоне длинною дня, в то время как ца коротком дне эти различия полностью исчезали сорт Весна/ илн были tie слишком существенны /сорт Прнгожън/. Следует также отметить, что в культуре in .vitro наблюдалось в основном два типа клубнеобраюгания: столонное и пазушное. Прослеживалась определенная связь

Таблица 12.

Клубнеобразоваиие in vitro в зависимости от фотопернода и концентрации сахарозы в питательной среде_

Фотопериод Концентрация Число растений

/час/ сахарозы в среде Всего В том числе с клубнями

% пбс. %

СсртЛшы

16 1 7 . 1 • 14

к 8 29 10 34

10 1 31 31 100*

it 8 47 41 87*

пнгожпй

16 1 10 2 20*

и 8 21 18 86*

10 1 39 38 97

8 60 52 ' 87

* - Стат. стически достоверно отличается в пределах

одного сорта и фотопернода с вероятностью 0,95

Таблица 13.

Клубнеобразоваиче in vitro в зависимости от сорта и концентрации __сахарозы в среде_

Сорт Концентрация сахарозы, % Число растений

Всего абс. %*

Детс кос ел ьс к и й 2 69 13 19

4 63 52 S3

Севинлж 2 265 208 75

Заравшлн 4 90 54 60

* - 7с показатели клубнеобразовання статистически достоверно

отличаются друг от друт с вероятностью 0,95

между данными типами микроклубнек и условиями их формирования. Клубни на столонах /нередко воздушные/ обычно образовывались на свету у физиологически более молодых /верхних/ ч-^енков, тогда как пазушное клубнеобразованне чаше идет в темноте у черенков с mix. чей части растений при слабо развитой ила отсутствии корневой системы i; наличии в питательной среде более иысогих доз сахарозы. Кроме то;-о оно наблюдалось при присутствии в среде препарата Тур, Оценивал результаты наших опытов в сопоставлении с другими данными такой, рода исследований, нельзя не принт и к заключению, что клубнеобразог'шие in vitro в принципе cwíjüho с теми же закономерностями, что и in vivo и определяется как условиями культивирования растений, ,ак и их гене.ином, сн«о»ой, сортовой, клонозой специфичностью образца. Этот вывод вытекает практически из всех работ, включая пашу с ботанически н генетически чрезвычайно разнородна..! коллекционным материалом.

Сравнивая разработанный нами метод но'аер:-:иння и хранения оздоровленных коллекционных образцов картофеля в культуре in vitro /Трускинсв, 1987/ с аналогичными методиками других исследователей у нас и за рубежом, можно сделать вывод, что они расходятся в некоторых деталях, но почти все сходятся в основных подходах: как ь.ожни более долгого продления беспересадочного их содержания в условиях, этому способствующих, с сохранением физиологически жизнеспособного и генетически стабильного состояния. Несмотря на определенные достижения в этом направлении, сроки такого хранения в культу]» in vifro обычно не превышают 2 лет. Для значительного числа образцов пересадку их на свежую питательную среду приходится так или плаче проводить как минимум один раз в год пли полтора, а для тех, что плохо образуют клубни и того чаще.

Способ ¡.оддержания и хранения коллекции картофеля in viuo ценен lie столько сам иосебе, сколь в общей систем«. оздоровления, изучения и использования мирового генофонда вегетативно размножае мых культур. Без данного метода не обходится теперь ни один из значительных , растительных генбанков мира. В ВИРе с начала 80-х годов создана одна, из первых в стране коллекций Картофеля in vitro на основе оздоро-ленных нами методом культуры ткани образцов, а таске собранного в результате интродукции и обмена материала. В настоящее время эта коллекция насчитывает более 200 образцов. Более 709с образцов составляют

селекционные сорта, из которых примерно четверть отечественных, остальные зарубежные. Кроме сортов в коллекцию in vitro включены селекционные гибриды и клоны, лига плоили, а также культурные, аримнтнвчыс » дикие виды /Табл.14./. Поддержание и хранение коллекции картофеля в культуре in vitro неразрывно связано с работой по оздоровлению в целом, включая культуру апикальных меристем, вирусологическое тестирование меристемных растений, их клошшнсе размножение, и является лишь завершающим ее этапом /Рис.37. Caii же культуралышй раздел /блок/ оздоровительной работы является существенной астыо более общей системы оздоровления мировой коллекции картофеля, применительно^! в основном к клоповым /клубневым/ ее образцам, воспроизводимым вегетативно /селекционные сорта, гибриды и клоны, а также виды, плохо или соасем не дающие семян/. Сама система оздоровления коллекции плодится а "еразрывной связи с ннтродукционно-карантинной работой, а также с изучением, поддержанием и хранением, мирового генофонда картофеля в целом /Рис. 4/.

В результате вышеизложенного можчо д?ть такое определение понятия оздоровления применительно к мировому генофонду картофеля коллекции ВИР: оздоровление - система мер бопьбы с ингЬекннонлым!

Оолеаиз.мш_вреашелашь.

шюмал и_я ми картофеля, нейтрализацию с тем, чтобы сох физиологически стабильном С0£1.ОШ>Ш,

При работе с исходным коллекционным материалом оздоровление является необходимым условием сохранения и использования итрового генофонда картофеля, ибо только здоровые растения и стабильные генотипы могут дать достоверные результаты при ботаническом изучении и селекционной оценке по всем биологическим и хозяйственно-ценным признакам зого или иного образца.

3S

Таблица 14.

Коллекция оздороьленньгх образцов картос]>сдя in vitro

Селекци- Селекци- S. tubero-

Всего онных онных Днгапло- sum asp. S.andice- Прими- Диких

Год сортов гибридов 1ЦЮВ cliilocnse num тивных ' видов

образцов И КЛОПОВ видов

абс. абс. абс абс. абс. абс. абс.

% % % 9t % % %

Ш 31 35 61 12 25 17

1986 349 46 9 10 17 5 7 5

1 180 20 40 60 20 25 14

1987 369 49 8 11 16 5 7 4

ш 32 45 56 13 26 16

1988 382 51 8 12 15 j 7 4

Ж 40 41 56 13 21 Я

1989 483. 61 8 8 12 3 5 з

305 22 26 2.2 10 15 10

1990 417 73 7 6 с . 2 4 2

1995 222 : 163 . < 17 2 1! 1 К) 11

73 8 4 5 0,5 4,5 5

Рис.З ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ПОДДЕР ЖАНИЯ ОЗДОРОВЛЕННЫХ КОЛЛЕКЦИОННЫХ ОБРАЗЦОВ КАРТОФЕЛЯ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

Изоляция

апикальных

меристем

3

В а

f4

(N

о U

А

Биологическое Ррофчликтччсск'ое

/семенами, виды/ /изоляция, агротехнические биологические и химические меры защиты/

лаоораторпое

_Селек"|П!',мос Тер:; м7?> гмчсгспс

/клоно.зые отборы/ /клоны/

КА'ДЫУГУ Тср>!о- Хемо-тканн «—---»терапия

ПО/1ДЕРЖЛПИЕ ИХРАНЕНИЕ

/сорта, вн;пл/ /виды/ /сорта, клон;.'./

Рнс.4 ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ РАБОТЫ С КОЛЛЕКЦИЕЙ КАРТОФЕЛЯ

ВЫВОДЫ:

1 Обследование более 6000 зарубежных образцов картофеля в течение ряда лет в карантине /1971-1992 гг./ выявило существенные колебания по зараженности интродукционного материала вирусами /от 11 до 78%/ и разные годы. Наибольшее заражение /свыше 60%/ отмечено ХВК и SBK, несколько меньшее • МВК, и наименьшее -Y В К /до ¡5% образцов/. В некоторые годы имела место заметная пораженность другими вирусоподобными и микоплазмоподобными болезнями. Р частности, описана специфическая оранжерейная болезнь не инфекционной-вирусной, а функциональной эколого-физнологичсской природы. Дано условное название этой болезни -функциональный некроз или новообразование жилок /ФНЖ/.

2.В условиях ннтродукционио-карантинного питомника на нескольких южно-американских образцах картофеля и уллюкус;. впервые обнаружен андийский латентный вирус картофеля /АЛВК/, 'имеющий карантинное значение.

3. В результате обследования и систематизации материала по зараженности вирусами все пнтродуцировайные образцы картофеля можно разделить на три группы: визуально и серологически ..оровую, со скрытой инфекцией и визуально больную /независимо

от результатов серодиагностики/. В разные годы группа здоровых образцов составляла от32 до 69%, со ci ытой инфекцией - от 0 до 25%, явно больных - от 22 до 65%.

В процессе группировки образцов проводилаз выбракс ка больных растений /от 1 до 17%/ и клоповый отбор здоровых, Таким путем оздоровлено от 5 ,,о 28% образцов, переведенных в здоровую группу. Доказана возможность оздоровительного отбора в течение 2 лег карантинного испытания клубневых /клоновых/ образцов.

4. Впервые па коллекционном материале ВИР с 1972 г. начата работа по оздоровлению картофеля от вирусных болезней методом культуры меристемной ткани. Более чем за 20 лет работы было оздоровлено этим методом около 800 коллекционных образцов,' включая селекционные сорта, гибриды, клоны, а также культурные, примитивные и дикче виды- картофеля. Испытанные в культуре ткани образцы показали различную способность к регенерации и освобождению от вирусов. Наилучшую регенерацнонную способность показали сорта Amaryl, Cobra, Corine, Miraada, Tajga, дпгаплоид Ewcrest, образцы S.tuberosum 3sp. cliiloense /К-6056/, S. phureja /К-15877/, S.rybinii /К-12703/. Не образовали растешгй-регенерантов cop r Cayuga и днгаплоид Sebago. Наибольший оздоровительный эффект отмечен у сортов Adretta, Atica, Corine, 'Rector, Scutella.

У различных ботанических и селекционно-генетических групп коллекции картофеля в целом различия по регенерации и оздоровлению нивелировались, за. исключением диких видов, у которых отмечен существенно более высокий оздоровительный эффект.

5. Б среднем за годы ра5оты/1978-1995 гг./ прижилось в культуре ткани более ЗОУо меристеыных толятои, не менее четверти из них регенерировало а растения, из которых около половины освободилось от вирусоз. От исходного числа изоллтон эю составляло примерно 7%, что характеризует конечную оффсктиг'юсть оздоровления, являясь суммарным итогом регенерации растений и элиминации вирусов в культуре ткани.

6. Повышение эффектылости оздоро?чення достигается за счет совершенствования техники и условии культуры ткани. : также

. термо- и хемотсрапии, как вспомогательных методов.

При использовании методов термо- и хемотерашш в сочетании с культурой ткани достоверное превышение над контролем по выходу безвнрусных растении достигнуто при предварительном' прогревании клубней и применении некоторых стероидных

. гликозидок /никотианозид, сомелонгознд. томатозид, фитоник/ в качестве антивирусных добавок к питательной среде. Такой же эффект показал рибавирин в концентрации 10 мг/л.

7. Установлено, что увеличение размеров изолированных меристем от 0,1 до 0,3 мм влияло на приживаемость меристем, но не на ьыход растении-регенсрантов. Оптимальными для регенерации растений и элиминации вирусов были размеры мериегем 0,25 - 0,30 мм.

8. Образцы картофеля, оздоровленные методом культуры меристемной ткани, наряду с изучением и поддержанием i полевой коллекции in Vivo необходимо сохранять в культуре in vitro. В настоящее время таким способом хранится более 200 коллекционных образцов. Разработка методика их оздоровления, поддержана* и хранения в культуре in vitro/издана в 1987 г./.

Основным фактором продления беспересадочного храпения образцов в этих условиях является клубнеобразование in vitro при укороченном. фотопериоде и специализиррваннги питат ельно.! среде. При образовании микроклубней образцы хранятся в холодильнике при 2-5°С до 2 лет и более.

ПРАКТИЧЕСКИЕ И МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В результате проведенной многолет'нсй работы по оздоровлению коллекционных образцов картофеля ВИР с использованием ка, антинных, биотехнологнческих и других методов борьбы с вирусной инфекцией рекомендуется:

1. Оздоровление коллекции картофеля следует начинать с ннтродукционно-карантинног" питомника, обследуя на патогены и, в первую очередь на вирусы, все зарубежные образцы картофеля, выделяя из них здоровые, больные н со скрытой инфекцией. Больные образцы в koj лекцию не передаются, а подлежат лечению или выбраковке в карантине.

2. Интродуцируемый материал in vitro необходимо в течение года выдержать в ннтродукционно-караитшшом питомнике, отчеренковав а пробирках и высадив часть его в закрытый грунт /оранжс"ея/ для апробации и получения клубней. Отчеренкованный материал передается затем на длительное*, храпение in vitro, а получеппые клубни - для дальнейшего поддержания и изучения образцов in vivo в оснопной коллекции.

3. Коллекцию образцов картофеля in vitro следует создавать, оздоравливая их методом культуры меристемной ткани /■ с привлечением термо- и хемо-^рапии/ и путем интродукции пробирочного материала. Оздораслнаать и вводить в культуру in vitro надо прежде всего отечественные co¡. ra и селекционные клоны, а из видов наиболее представительные и ценные ботанические формы, особенно те из них, что плохо или совсем не образуют семгт.

Интродуцировать пробирочные образцы и Пополнять коллекцию in vitro необходимо в основном за счет перспективных или редких зарубежных сортов и селекционных клонов, представляющих интерес для науки и практики.

4. Коллекционные образцы in vitro лучше всего хранить и передавать в виде микроклубне-";, гарантирующих длительность и надежность сохранения.

5. Оценивать эффективность оздоровления при использовании культуры

ткани, а также термо- и хемотерапии как подсобных к ней методов наиболее объективно "iо выходу безвирусных растений-регенерантоп от исходного числа изолированных ;:еристем, выраженному в процен'пх.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ по теме диссертации

1. Труо^ноп .'?.В. Распространение вируса М в коллекции картофеля //Со. трудов аспирантов и молоды.:; нг.учпых сотрудники» ВИР. 1970. В.,::; 16. С.-Ш-439.

2.' 1 $л ">.13. Поражение сеянцев картофеля мозаичными внрусцлм М и 8 //Бюллетень ВИР. ¡972. Выи.21. С.86-89.

3. Труски.чрв Э.В. Освобождение х;1ртоф;л-! юрта Дстекосельскни от ен;пс.: л //Картофель и осой«:. 1*>75. N-'10. С.23-34.

4-5. Труск •«;•» г>№. 0,'ч.1т оздорозленпл от ьнрусоа ктлекциоиных образце-!. к'.фтчч/слк :1510м кч.чму^л мер.1~1 ¿мной тх:иш //Сои/.о:-.'.'.!!!!>,мегодгI плчучлтл бея:и'\усно; о к>"т>феля. М. 1975. С.¡7-1 У. 3.картофеля от болеэкей к семе>к юдса-.е.

М. Р'77. Иын. ЗУ. С.^0-83.

С). Трус.чпнсв Э.В. Оэл-роиление гарт и.] с.. <«г шрушы.ч 1*ч>ле.!иеи методом культур;/. мепкяемныг» тканей //С..-;, и:;. "¡.П.

№2. С.250-255. '

7. Трускшю» Э.К. Культура ткани ка-.; срс.'.•;*:о с .\:р\ен;.тмн

болезнями интродуцироминого каг/гофел.:* /.V ьа. ЬН:\ IV С.58-61.

С. Винокурова З.И., Трускшюв '-)Л>. Пиюдьзоьа'ию культуры апикальных мерисгем для полччешц: бе^мф;. л-ых растений // И..;\ч::! ю труды ЛСХИ. 1*976. Т.29^.С.66-70.

9 Трушшов Э.Б. Нскоюрыс итоги оздоровления когг.и.ционныч образцов картофеля от вирусных болезнен методом культуры меристемнои ткани //Тр. по приклад. бот. ген. 11 селекции. 19 Т.02. Вып. 1. С. 144- 551.

10. Трускипоз Э.В., Полякова В.Л. Пораженное!ь лнтродуцироиамныч образцов картофеля вирусами ь условиях карантина //Вирусные болезни с.-:. р-нин и меры борьбы с ними М. 1978. С.112-114.

11. Трускимов Э.В. Рспнерациоипая способность некоторых ьидоп и сортов картофеля г. условиях культуры тканей //Тсзисы докладов 14 Международного генет. конгресса М. 197о. 4.1. С.608.

11. Трускпноа Э.В. Использование культуры тканей у оздоровлен!.и, размножении и хранении коллекционных образцов картофеля //Тезисы докладов 3 Всесоызн. конф. "Культура клеток растении". Абонян. С.143-144.

13. Трускииов Э.В., Цилосани Г.М. К вопросу элиминации ьируа-» и культуре калдусной ткани картофеля //Пюлл. 131П . 1979. Вып. 89. С.ьи-68.

о

14. Тр\скинов Э.В. Клубиеобразоьанне » культуре Iканеи ырюфели как фактор его размножения и дшиельном хранения //Г>к\ч НИР. Вып. 105. С.77-79.

.•¡У.Сурикон Трлгсикочг Э.З.. Цилосм-цт Г.М. Некоторые

»титжпичл'кне закономерности получении из «иллуса свободных от вирусов рсгекеганг.ов картофеля //Физиология с-нпн. 19SI. Т.23. fi-З.С.057-654. ' "

ir- Трускннов Э.В., Оглуздпн Н.С. Поддержание коллекционных образцов ^артофеля в культуре in vitro //Тр. по прнкл. бот. ген. и сггскцин. I<«2. Т.73. Выи.2. Cn?>-lcJ.

17. Трускиион 0.3. Храпение оздоровленной коллекции картофеля /«Тезисы докладов 4 Всесогозн. конф. ''Культура клеток растений и биоте.хнолошя". Кишинев. 1983. C.207.-20S.

18. Трускиноз Э.В., Смоленская С.Э. Регсисрацнонная способность картофеля разного уровня плоидности в культуре ткани //Билл. ВНР. 1984. Впп. 1-15. С.44-47,

;9. Трускинсг. Э.В., Смоленская С.Э. Перспективы использования культуры калдусп'ч1! ткани картофеля для оздоровления его от вирусных боясисй /«Тезисы докладов 3 Всесоюзного совещания: "Теория и практика использоиаиил иммунитета с.-х. гугьтур к ¡•.ирусным болезням". Вильнюс. 1984. С.87-33.

П. Будни К.З.. Трускиноз Э.В. Выявление вирусных Селезней картофеля // За1цита растений. 19S5.N4 !. С.3-1-35.

21. Трускннов Э.В. О путях борьбы с вирусными болезнчми //Современные проблемы семенснодстеа картофеля на беззнруспой ос. «не. Владивосток. 1985. С.144-151.

22. Трускннов Э.В. Поддержание и хранение коллекционных образцов картофеля з условиях in vitro /Мгтодитески * указания/. Л. 1987. 40С.

Трускиноа Э.В.., Полякова Б.А., Карантинные меры защиты от шф\сов картофеля //Тр: по-приклад, бет. ген: и селекции. 1987. Т.115.

V.7.'V-86.

2-!. '1;',;у.спИН0в 0>В.. L'oro-iuia Е.В.. Влияние некоторых знрусных n:u нбигоров на-регенерацию кар.офеял в культуре ткани //Тез. доклад, международ. кенф.. "Биология культивируемых клеток и биотехнологии". Новосибирск. 198S. 4.2. С.340-341. 25. Трускннов Э.В. Регенерация коллекционных образцов картофеля а культуре ткани //Биология культиаируемых клеток и биотехнология. Новосибирск. 1988, 4.2. С. 341-342.

2(>. Трускннов Э.В,, Алексеева /¡.И. Регенерация коллекционных образцов картофеля в культуре ткани //Регуляция роста и развития картофеля. М. Пчд. "Наукз". 1«>.;П. С.пЗ-105.

27. Трускиноз Э.В., Рогозина Е.В. Использование термотерапии в eo'teiMHM.: с кучыурей ткана при осзобо:"Ленин картофеля от

«np'.n.oii Ш.-1 ек:»!« //к:олл ПИР. 1991. Впп. П4. С.44-51.

'■-. 1 р'-'с: j.W. i. дппттнгн, лрзнепп in vitro M:ipo?o.'i ::о~лг:'ш:и

1 . мофом //Тез -".олт " i:ic:.;a Г.'.""-.'. ос;ц. р-ппн

29. Грускинов Э.В. Проблемы хранения клоповой коллекции картофеля //Тез. докладов 2 Международ. /6 Национальной/ конф. Биология культивируемых клеток р-ннй и биотехнология". Алма-Ата. 1993. С.258.

30. Трускинов Э.В. Костерсва H.A. Оздоровление коллекционных образцов картофеля и карантине- //Тел. докладов Всероссийского съезда защиты р-:л1й. С.-Петербург. 1995. С.20-27.

31. Трускиноь Э.В. Рогозина Е.В. Оздоровление клоповой коллекции картофеля в культуре ткани. Физиология растенгй. 1997. Т.43. №3. С.432-439.

32. Kozyreva O.G..Kissel N.J., Romanova N.P., Truskinov E.Y. et al. In vitro collections of disease free potatoes and a small fruit: origination and long time storage //Abstr. 8 Intern, congr. plant tissue and cell culture. Firenze. 1994. P.74.