Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ответные реакции клетки на действие закаливающей температуры

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Ответные реакции клетки на действие закаливающей температуры"

российская академия наук

КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КНЦ РАН

0 Д На правах руштса

удк 581.1: 581.522.4

ЛАРСКАЯ Ирина Алексеевна

ОТВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ КЛЕТКИ НА ДЕЙСТВИЕ ЗАКАЛИВАЮЩЕЙ ТЕМПЕРАТУРЫ

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ 1996

Работа выполнена в институте биологии Казанского научного центра РАН

Научный руководитель -

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник А. И. Заботин

Официальные оппоненты - Заслуженный деятель науки

Республики Татарстан, доктор биологических наук, профессор Л. П.Хохлова

- кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г. Г. Кузьмина

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследователь -

ский институт растениеводства им. Н.И.Вавилова (Санкт-Петербург)

Защита состоится "3)£" июня 1995 года вД^З^часов на заседании Специализированного совета К 002.16. 01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биологии КНЦ РАН по адресу: 420503, Казань, а/я 30.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского института биологии КНЦ РАН.

Автореферат разослан " 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, . »

кандидат биологических наук ^ 7 с Н. Л. Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Реализация потенциальной продуктивности растений опосредована их устойчивостью к внешним факторам СУдо-венко, 1979; Климов с соавт. , 1990), одним из которых является температура. Формирование низкотемпературной устойчивости - многоступенчатый, интегральный процесс, заключавшийся в перестройке метаболизма и структуры клеток. В эту перестройку вовлечены все ее компартменты СХохлова, 1985; Джанумов, 1985; Эаботин с соавт. 1995). В настоящее время имеются экспериментальные данные, показывающие, что приспособление растений к низким температурам определяется дифференциальной экспрессией генов С Guy, 1990; Kuzne-tsov et.al., 1996), то есть идет при участии белоксинтезирующей системы (Trunova, 1987). Несмотря на очевидные успехи, достигнутые в изучении адаптации растений к низким температурам, механизм запуска и реализации адаптивной программы до конца не понятен. В то же время, известно, что у растений, как и у животных, приспособительные реакции на действие факторов внешней среды, например, силы тяжести, света, гормонов или патогенов могут быть опосредованы системой вторичных посредников Синозитолфосфат, ди-ацилглицерол, Са+^, цАМФ ) через посттрансляционную модификацию белков, например, активацию протеинкиназ и реакцию фосфорилиро-вания.

В качестве мишеней действия протеинкиназ при адаптации могут выступать различные ферментные системы, выполняющие жизненно необходимые функции - -в клетке. Например, Н+-АТФаза плазмалеммы, значение которой для формирования устойчивости определяется значимостью функций, определяемых ее работой Срост, транспорт веществ, водно-солевой обмен и др.). Поэтому весьма актуальным является изучение адаптивных изменений в активности данного фермента и возможных путей его регуляции. .

Функционирование Н -АТФазы плазмалеммы (Опритов с соавт., 1990), АТФ-синтетазы хлоропластов ССкулачев, 1987), как и многих других мембраносвязанных ферментов, опосредовано состоянием ближайшего окружения. Как известно, в процессе адаптации происходят значительные изменения липидного матрикса клеточных мембран СМа-нуильская, 1987; Yoshida, Uernura, 1988). Поэтому в качестве другого регуляторного механизма, определяющего активность различных мембранных ферментов в процессе низкотемпературного закаливания

могут выступать белок-липидные взаимодействия, роль которых достаточно подробно изучена при функционировании тилакоидных мембран (Заботин с соавт., 1975).

Развитие исследований физиолого-биохимических механизмов адаптации растений несомненно связано с изучением различных способов регуляции и координации активностей ключевых ферментов клетки и роли последних в соответствующей альтерации мембран клетки и их органелл, завершающих перестройку обмена.

Цель и задачи работы. Целью работы было выявить вовлеченность некоторых компартментов клетки Сплазмалемма, хлоропласты) в протекание начальной фазы закаливания и оценить участие разли чных регуляторных механизмов Ссистема вторичных посредников, бе-лок-липидные взаимодействия) в процессе формирования морозоустойчивости.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) исследовать с помощью ингибиторного анализа участие вторичных мессенджеров СцАМФ, Са+^,инозитолфосфаты, диацилглицерол) в процессе акклимации к холоду;

2) изучить динамику эндогенного содержания цАМФ на первой фазе закаливания низкими положительными температурами;

3) установить характер изменения активности Н+-АТФазы плаз-малеммы на действие закаливающей температуры;

4) изучить влияние закаливания низкой положительной температурой на перераспределение световой энергии между пигмент-бел-ково-липидными комплексами СПБЛК) и на устойчивость сопрягающей мембраны к детергентам;

Научная новизна. Впервые были проведены комплексные исследования по оценке участия вторичных посредников в процессе адаптации растений к низким температурам. Впервые продемонстрированс появление пика в эндогенном содержании цАМФ в течение первых часов действия закаливающей температуры. Установлено, что подобно« двухфазное изменение содержания цАМФ характерно для озимого сорта и не наблюдается у яровой пшеницы.

С использованием блокаторов Са+^ каналов различного тип; впервые оценен вклад различных источников Са+^-депонирующих ком партментов в формирование морозостойкости проростков озимо: пшеницы. Показано вовлечение АБК в развитие термоадаптивных ре акций на посттрансяяционной стадии.

Впервые установлено, что рН-зависимость Н+-АТФазы плазма-леммы связана с возможным существованием на плазмалемме двух различных способов переноса калия, отличающихся по оптимуму рН.

Практическая значимость работы. Полученная информация может представлять интерес для исследователей, занимающихся проблемами адаптации растений к низким температурам, и вносит вклад в понимание физиолого-биохимических механизмов, лежащих в основе закаливания растений с участием различных способов регуляции (вторичные мессенджеры, белок-липидные взаимодействия). Выявленное положительное влияние ряда химических эффекторов на уровень морозостойкости может служить основой для разработки способов повышения морозоустойчивости.

Целесообразно также использовать теоретические обобщения при чтении спецкурсов по физиологии устойчивости растений.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на конференциях молодых ученых Казанского института биологии КФАН СССР СКазань, 1983, 1988), на отчетных научных конференциях Казанского института биологии С1985-1995), на региональной конференции по криобиологии и холодо- и морозоустойчивости растений (Чернигов, 1988), на 2 Всесоюзном съезде ВОФР (Минск, 1990), на 7 Братиславском симпозиуме по олигосахаридам (Словакия, 1994), на 2 Республиканской конференции по экологии (Казань, 1995), на 7 Симпозиуме по клеточной стенке (Испания, 1995), на Симпозиуме по молекулярной и клеточной биологии (США, 1996).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 11 опубликованных работах, 2 работы находятся в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов. Работа изложена на й25"стр. машинописного текста, содержитрисунок,6 таблицы. Список цитированной литературы включает <?53~ наименований, в том числе на иностранном языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

В работе использовали проростки озимой пшеницы (ТгШсиш ае51луит I.) сорта Казанская-84. Растения выращивались на водопроводной воде при температуре +25°С, освещенности 10 Клк при 12-

часовом фотопериоде. Закаливание проводили при +2+4иС при том же световом режиме в течении 1 дня (для исследования динамики содержания цАМФ и ростовой кинетики) или в течении 7 суток (для изучения действия ингибиторов и эффекторов на процесс формирования устойчивости). Ингибиторы биосинтеза белка, гормоны, антагонисты кальмодулина, блокаторы кальциевых каналов и другие эффекторы системы вторичных посредников вносились в среду выравдвания за сутки до закаливания.

Методы. Получение инвертированных везикул плазматических мембран проводили по методике Hodges (Hodges et.al. , 1984) с использованием жидкой двухфазной полимерной системы (Альбертсон, 1974), содержащей ПЭГ 4000 (6,3*/.) и декстран Т-500 (6,3%).

Хлоропласта извлекали по методу, описанному Гавриленко с соавторами С1975). В работе использовали хлоропласты, замороженные при температуре жидкого азота в присутствии 30% глицерина, что позволило проводить целые серии экспериментов на идентичных образцах.

Об изменении холодоустойчивости судили по выходу электролитов согласно методике описанной Uemura, Steponkus (1989). Для этого образцы каждого варианта промораживали в течении часа при различных температурах с интервалом в 2°С, затем инкубировали 1 час в бидистиллированной воде. Измерение электропроводности водных вытяжек проводили на кондуктометре 0К-102-1. За нулевой уровень принимали значение электропроводности образцов, не подвергавшихся промораживании. Полный выход электролитов измеряли после автоклавирования образцов.

Длина проростков измерялась с временным интервалом в 2 часа, количество растений каждого варианта было не менее 50 штук.

Количество белка определяли по модифицированной методике Лоури (Peterson, 1977), приспособленной для измерения концентрации белка в присутствии полимеров.

АТФ-гидролаэную активность определяли по приросту неорганического фосфата за 15 минут при 30°С по модифицированной методике (Hodges,Leonard, 1974). АТФазная активность выражалась i

Ф /мг белка-час. н

Экстракцию фракций, содержащих цАМФ, проводили из корне! проростков по методу, описанному Никулиной (1978). Для этого фиксированные азотом пробы растирали в ступке с пестиком не допус-

кая оттаивания. Затем добавляли 10% раствор трихлоруксусной кислоты. Экстракция нуклеотидов происходила во время размораживания в течении 20 минут. Полученный экстракт центрифугировали 15 мин. при 15000 otí/мин. ТХУ удаляли 3-кратным встряхиванием надосадоч-ной жидкости с 10-кратным объемом холодного эфира. Содержание цАМФ в экстракте определяли с использованием стандартных наборов фирм "Amersham" (США) или "Алга" (Россия).

Для снятия низкотемпературных спектров флуоресценции использовали суспензию хлоропластов с концентрацией хлорофилла 0,45 мг/мл. Спектры флуоресценции (77К) снимали на флуориметре Perkin -Elmer MPF-44B (США). Использовали длину волны возбуждения 470 нм, ширина цепи - 4 нм. Сканирование проводили в диапазоне 650800 нм со скоростью 60 нм/с. Спектры автоматически записывались в ЭВМ, где подвергались математической обработке. С использованием метода наименьших квадратов экспериментальный спектр представлялся в виде суммы трех гауссовых кривых. После разложения спектра на составляющие, вычислялись отношения при 696 и 740 нм к флуоресценции при 685 нм (F695/F685; F740/F685).

Все опыты повторялись не менее 4-6 раз. В таблицах, диаграммах и на рисунках представлены результаты характерных опытов. Используемые в работе реактивы были преимущественно фирм "Serva" и "Sigma".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Рост и низкотемпературная устойчивость

Нами была исследована скорость роста растений как в условиях нормальных физиологических (контроль), так и закаливающих (опыт) температур. В первые часы закаливания (рис.1) с момента переноса растений в условия пониженной температуры наблюдается полная остановка роста. Этот период длится 6-8 часов, после которого опытные растения возобновляют рост, но уже со скоростью на порядок ниже, чем скорость контрольных растений. Выявленное торможение роста коррелирует с лаг-периодом формирования морозоустойчивости (табл.1). Существование такого периода в процессе формирования устойчивости обусловлено, по-видимому, необходимостью переключения клеточного метаболизма на адаптацию (Титов с соавт, 1990), включением новой генетической программы. Это высказывание поддерживается работами, где показано быстрое накопле-

ИМ. 16

Рис.1. Динамика роста проростков озимой пшеницы при 25°С и 2°С.

-+- 25'С -©- 2* С

час,

ние стрессовых белков в течении первых суток воздействия закаливающей температуры СВойников, Корытов, 1991), а также работами, в которых выявлена временная зависимость в действии ингибиторов синтеза белка на закаливание (Титов с соавт., 1984).

Таким образом, приостановка роста в условиях закаливающих

Таблица 1.

Динамика формирования низкотемпературной устойчивости

Время экспозиции (в час.)

Незакаленные

ЛТ,

50

Закаленные

0 г

4 6 8 24

- 5,3

- 5,2

- 5,2

- 5,3

- 5,3

- 5,3

- 5,3

- 5,8

- 7,0

- 9,5

* ЛТдд - температура гибели в процессе промораживания 50% проростков

температур на начальных этапах адаптации, по-видимому, действительно связана с образованием "пула адаптации" Спо терминологии Войникова), который может включать в себя не только появление стрессовых белков, но и, как нам кажется, изменение в содержании

регуляторных молекул.

2. Исследование динамики содержания циклических нуклеотидов в процессе первой фазы закаливания.

Мы исследовали динамику эндогенного содержания цАМФ в корнях проростков на начальных этапах закаливания. Из рисунка 2 видно, что при стационарном росте в условиях нормальной температуры +25°С (контроль), содержание цАМФ в корнях практически не меняется. При помещении проростков в климатическую камеру при +2°С (опыт) количество цАМФ резко нарастает к 5-10 часу от начала закаливания, после чего резко падает. При этом его концентрация

.часы

Рис.2 Динамика содержания цАМФ в корнях проростков пшеницы 0мская-17: 1 1 - опыт (+2°С) Казанская-84: 2 - контроль (+25°С)

3 - опыт (+2°С)

4 - опыт (+-2°С) + циклогексимид (10 мг/л)

5 - опыт С+2°С) + актиномицин Д (5 мг/л)

может превышать исходный уровень более чем в 10 раз.

Сравнительный анализ содержания цАМФ в яровой (сорт Омская 17) и озимой (сорт Казанская 84) пшеницах показал, что кратковременное повышение уровня цАМФ характерно лишь для озимой пшеницы (рис.2).

Чтобы оценить взаимосвязь термоиндуцированного возникновения пика цАМФ с синтезом белка de novo, наблюдаемого при адаптации (Mohapatra et.al., 1987; Antikainen, Pihakaski, 1994), мы использовали ингибиторы биосинтеза белка (циклогексимид) и РНК (актиномицин Д), которые, как известно (Зверева, Трунова, 1985; Титов, Шерудило, 1990), ингибируют процесс формирования морозоустойчивости. Из рисунка 2 видно, что циклогексимид в значительной степени снимает образование этого пика, а актиномицин Д полностью подавляет его, и эндогенное содержание цАМФ в растениях,

+25'С *2'С

■»FOR

♦IBMX

♦W-7

+W-7 * IBMX

0 50 100 ISO 200 250

%

ESS +25*С Ш*2'с

Рис.3. Влияние активатора аденилатциклазы Сфорсколина), ингибитора фосфодиэстеразы СЗ-изобутил-1-метилксантина) и антагониста кальмодулина (W-7) на морозоустойчивость проростков озимой пшеницы при закаливании: FOR - форсколин (100 мкМ), IBMX - З-изобутил-1-метилксантин (100 мкМ), W-7 (100 мкМ).

Примечание: Здесь и на рисунках 4-6 за 100% принята величина ЛТзд (~5,5°С) незакаленных растений.

обработанных ингибитором до начала закаливания не превышает уровень цАМФ в незакаленных растениях.

Как известно, уровень цАМФ в клетке определяется работой двух ферментных систем - аденилатциклазы и фосфодиэстеразы. Поэтому, мы ожидали, что если "всплеск" цАМФ действительно вовлечен в процесс акклиматизации, то эффекторы, влияющие на образование и распад этого циклонуклеотида, могут влиять на морозоустойчивость. Действительно С рис.3), внесение в среду выращивания активатора аденилатциклазы - форсколина значительно повышает устойчивость растений. Аналогичный эффект вызывало добавление ингибитора фосфодиэстеразы - З-изобутил-1-метилксантина (ИБМККрис.3).

Таким образом, исходя из полученных данных можно предположить, что цАМФ вовлечен в формирование низкотемпературной адаптации и повышение его уровня предшествует С по данным литературы) другим термоиндуцированным изменениям метаболизма.

3. Влияние эффекторов системы вторичных посредников на формирование устойчивости.

На клетках животных было показано, что влияние ИБМК на различные ферменты может быть опосредовано кальмодулином (ОазагаИ^у, ГапЬига, 1988). Поэтому, совместное действие ИБМК и антагониста кальмодулина - N-7 на процесс формирования морозостойкости может служить еще одним дополнительным доказательством вовлеченности кальмодулина в опосредование действия этого ингибитора. Данные, представленные на рисунке 3 подтверждают наше предположение. Повышение устойчивости, вызваное ингибированием фосфодиэстеразной активности можно снизить, если одновременно с ИБМК вносить ингибитор синтеза белка - циклогексимид Срис.З). То есть "всплеск" цАМФ, как нам кажется, эффективен лишь при запуске белоксинтези-рующей системы.

Действие циклогексимида и ряда других ингибиторов синтеза белка достаточно подробно изучено в ряде работ СЗверева, Трунова, 1985; Титов с соавт., 1984), показывающих прямую зависимость формирования устойчивости от функциональной активности транскри-пционно-трансляционной системы. Тем не менее, негативный эффект этого антибиотика, как это видно из рисунка 4,можно снять одновременным внесением АБК. Поскольку эффект циклогексимида однозначно определен, как ингибирование синтеза белка, то'действие АБК,

по-видимому, реализуется в посттрансляционный период Опыты по совместному воздействию этого гормона и хлорпромазина на устойчивость проростков озимой пшеницы согласуются с этой точкой зрения. Несмотря на то, что хлорпромазин обладает более широким спектром действия, он часто используется как антагонист кальмо-дулина (КоЬеНБ, На1д1ег, 1990). Как видно из рисунка 4 обработка растений хлорпромазином значительно подавляет их морозоустойчивость. АБК, внесенная вместе с ингибитором, практически не влияет на индуцированное хлорпромазином снижение устойчивости (рис.4). Это, как нам кажется, является подтверждением высказанного предположения об участии АБК в посттрансляционной стадии.

♦25'С «2'С ♦СР2 ♦АВА «СР2 «АВА ♦СН «СН «АВЛ *1л *1а «АВА

1 ! 1 •

^жтчттшжт^ лтт\жжж\кжтт\\жжч ■ш &11 1

тж\жт\ж\^жжжжжж!

! ! 1

50

100

150

200

350

I «25 С

♦2 С

Рис.4. Действие различных ингибиторов и активаторов на формирование низкотемпературной устойчивости: ср2 - хлорпромазин (0,25 мЮ, СН - циклогексимид (10мг/л), ава -абсцизовая кислота (3 мг/л), Ьа - 1а2(Ж)3)3 (1мМ)

Еще одним мощным рычагом, управляющим перестройкой и переключениями внутриклеточного метаболизма, является Са+^ (РооуагаЬ е!.а1., 1987; Хохлова с соавт., 1993). Низкое содержание свободного кальция в цитоплазме сменяется его быстрым, но временным

повышением и служит непосредственным сигналом к активации определенных метаболических путей (Knight et.al., 1991).

В ряде работ (Schroeder et.al., 1991; Wardet.al. , 1995) обсуждаются данные о возможной сопряженности АБК с Са+^ во многих клеточных ответах. Авторы считают, что АБК индуцирует повышение содержания в цитозоле через открытие связанных с плазмати-

ческой мембраной Са+^ каналов. Мы исследовали совместное действие блокатора Са+^ каналов La+^ и АБК на морозоустойчивость. Как видно из рисунка 4, La+^ снижает, а АБК повышает уровень устойчивости при закаливании. При одновременном внесении в среду выращивания и гормона и блокатора кальциевых каналов, устойчивость проростков оставалась на том уровне, который был вызван обработкой одним La+^. Таким образом, La+^ снимал вызванное абсцизовой кислотой повышение устойчивости. Следовательно, и в случае формирования низкотемпературной устойчивости АБК тоже может действовать через регуляцию концентрации в цитоплазме клеток.

Уровень цитоплазматического Са+^в клетке может быть обусловлен не только его поступлением извне, но и высвобождением из

250

200

♦25'С +2* С dlltiaiem carbahol La a°"'P°t □ ^C Ш *2'C

Рис.5. Действие блокаторов Са+^каналов: дилтиазема (200мкМ), Ьа+3С1мМ), карбахола С200 мкМ) и ингибитора липидза-висимой протеинкиназы: гозипола СЮОмкМ) на морозоустойчивость.

внутриклеточного "депо". Чтобы оценить возможную роль различных источников Са+^ (внутри- и внеклеточного матрикса) в холодовой адаптации, мы использовали эффекторы разного типа действия - дил-тиазем, La+3, нифедипин, которые блокируют поступление Са+^ извне и карбахол, который изменяет содержание Са+^ косвенно, как показано на клетках животных, влияя на метаболизм инозитолфосфа-тов (Plevin, Michael, 1988), Как видно из рисунка 5, блокирование поступления Са+2 в клетку при действии и дилтиазема, вызы-

вает ингибирование устойчивости к морозу, а карбахол повышает уровень устойчивости, как мы полагаем, через высвобождение Са+^ из внутриклеточного депо. Следовательно, можно говорить о решающем значении повышения содержания Са+^ в цитозоле независимо от его происхождения.

Эффект карбахола также показывает возможное вовлечение в процесс трансдукции низкотемпературного сигнала фосфоинозитоль-ного пути. Это косвенно подтверждается в наших экспериментах с использованием ингибитора фосфолипидзависимой протеинкиназы -гозипола, который, как видно из рисунка 5, снижает устойчивость проростков озимой пшеницы.

200

160

100

60

cm 2б "с

ЕЗ 2'с

о

Рис.6. Совместное действие нифедипина и циклогексимида на морозоустойчивость проростков озимой пшеницы: NIF - нифедипин (0,5 мЮ, СИ - циклогексимид С 10мг/л).

1 л

ZZZ71

-----«CZ7V

. А

У "Л

у_vi

♦2*С »26"С «СН -NIF «СН »NIF

Несколько неожиданным явилось действие другого блокатора каналов, относящегося к классу дигидропиридинов - нифедипи-на Этот эффектор значительно повышал морозоустойчивость (рис.6). Возможно, такое действие нифедипина связано с ингибированием им фосфодиэстеразной активности (Coukell, Cameron, 1987). Если это справедливо, то этот неспецифический ответ нифедипина косвенно подтверждается нашими экспериментами по совместной обработке растений в процессе закаливания этим блокатором Са+^ каналов и ингибитором биосинтеза белка циклогексимидом. Из рисунка 6 видно, что повышение устойчивости, вызванное нифедипином снижалось при одновременной добавке циклогексимида. Ранее мы показали, что ци-клогексимид снимает образование пика цАМФ. Поэтому, если повышение морозоустойчивости при действии нифедипина обусловлено, как мы полагаем, ингибированием активности ФДЭ, то циклогексимид может участвовать в регуляции обратного процесса. Все это, в своп очередь, косвенно подтверждает предположение об участии цАМФ в процессе адаптации растений к холоду.

Таким образом, исходя из полученных данных, можно утверждать, что реализация низкотемпературной устойчивости опосредована через систему вторичных посредников. Вовлечение системы вторичных посредников предполагает, как минимум, следующую цепочку событий: активация протеинкиназ, фосфорилирование и, как следствие, изменение активностей ферментов, необходимых для реализации адаптивной программы.

Поэтому, следующим этапом нашей работы было исследование изменения активности в процессе акклимации одного из ключевых ферментов клетки - Н+-АТФаэы плазмалеммы, обеспечивающего жизненно важные функции Срост, транспорт веществ и др.), роль которых значительно возрастает в ctdi • вых условиях.

3. Влияние низкотемпературного закаливания на Н+-АТФазную активность препаратов плазматической мембраны корней озимой пшеницы.

Для исследования изменения активности фермента использовались инвертированные частицы плазмалеммы, содержащие Н+-АТФазу. Полученные препараты обладали высокой АТФазной активностью, ко-рая была нечувствительна к молибдату аммония, азиду натрия и нитрату натрия, ингибиторам неспецифических фосфатаз, митохондриа-

льных и тонопластных АТФаз, соответственно С рис.7). Зато, значительно подавлялась неспецифическим ингибитором протонных АТФаз -дициклокарбодиимидом и специфическим ингибитором Н+- АТФазы пла-змалеммы - ортованадатом натрия С рис.7). Таким образом, в работе использовались относительно чистые препараты плазмалеммы.

Т--1--1--1--1--г

2 3 3 4 5 6

Рис. 7. Действие ингибиторов на Н^-АТФазную активность: 1 - без ингибиторов; 2-100 мкМ На3\Ю4; 3 - 100 мкМ ДЦКД; 4 - 1 мМ Иа^; 5 - 100 мкМ молибдат аммония; 6 - 50 мМ МаЖ)д. Примечание: за 100% принята Н+-АТФазная активность без добавок

Как известно, одной из основных характеристик фермента является ярко выраженная зависимость от рН среды. При сравнении АТФазной активности препаратов, выделенных из контрольных и закаленных растений, обнаружено, что С рис.8):

1) у контрольных образцов эта зависимость изменяется по одновершинной кривой с максимумом при рН 6,5;

2) при внесении в среду инкубации 50 мМ КС1 наблюдалось смещение в кислую сторону оптимума рН АТФазной активности препаратов из незакаленных растений;

3) у образцов, выделенных из ..растений прошедших закалку оптимум рН приходится на 6,0 и при добавлении ионов К+ в среду сдвига

оптимума не наблюдается.

Для объяснения данного эффекта калия можно предположить, что в плазмалемме растений работают два пути переноса К4" с разным оптимумом рН (6,0 и 6,5). Поэтому, изменение рН-зависимости активности фермента в контрольных образцах при внесении ионов калия означает преимущественный вклад в перенос К+ пути, характеризующегося соответствующим значением рН (6,0). При зака'лива-нии, когда ионный баланс в клетке нарушается и наблюдается выход ионов калия из клетки (Опритов с соавт., 1995), уже работает этот путь переноса с оптимумом рН 6,0. Поэтому, дополнительное внесение ионов калия не влияет на оптимум АТФазной активности.

100 п

Рис.8. Изменение АТФазной активности плазмалеммы корней озимой пшеницы в зависимости от рН среды

Как известно, имеется многоуровневая регуляция активности этого фермента (РаХшдгеш, 1990). Это выражается в регуляции фермента как на уровне генной экспрессии (дифференциальная экспрессия изоформ), так и посттрансляционной модификации (фосфорилиро-вание, ограниченный протеолизис) и изменении активности фермента с помощью окружения (например, липидов) и др. Некоторые из этих способов регуляции являются универсальными для различных клеточ-

ных компартментов. Ранее мы продемонстрировали возможное участие системы вторичных посредников и, следовательно, реакции фосфори-лирования, в процессе адаптации.

Следующей задачей нашей работы было изучение влияния липид-ного окружения на белковую фазу мембран. При выборе объекта исследования мы руководствовались изученностью изменений липидного матрикса сопрягающей мембраны и установленной в нашей лаборатории зависимостью взаимодействия ПБЛК хлоропластов от состояния липидной фазы СМалах, 1993).

5. Исследование состояния хлорофилла в процессе низкотемпературной адаптации Процесс закаливания, как показали результаты опытов ряда авторов (Дроздов с соавт., 1984), приводят к снижению в тканях листа основных форм пигментов, что связано с подавлением их биосинтеза, усилением процессов деградации. Поэтому, динамика содержания хлорофилла в листьях проростков озимой пшеницы была использована нами в качестве отправной характеристики процесса протекания низкотемпературного закаливания. Изучение динамики изме-

I СЫ а. +26С

2 3 4

Ш СЫ а. *2'С ЕЗ СЬ1 Ь, *26 с

5 сутки ! сы ь, *тс

Рис.9. Динамика содержания хлорофилла в процессе закаливания низкими положительными температурами.

гения количества зеленых пигментов при действии закаливающей те-лературы показало С рис.9), что после некоторого увеличения содержания хлорофилла "а" и "б" в первые дни закаливания, количество этих пигментов снижалось к концу первой фазы. Поскольку весь хлорофилл в хлоропластах связан со специфическими белками мембран, образуя пигмент-белковые комплексы, имеющие характерные по-

4000

3000 - -

о «

л " 2000

^ а:

О Е-

О О Ж

1000 ■ -

§

я

ш

С?

о

о

о

£

<в> О

А я

н Е-1

о О

о

к

«

о

к

<х>

ЕН

4000

3000 ■ -

2000 - -

Ш00

о тоо 2оа зоо

Рис.10. Низкотемпературные спектры флуоресценции хлоропластов, выделенных из контрольных С +25°С) и опытных С +2°С)

растений СХ0= 650 нм , Х-

300"

800 нм).

лосы поглощения и излучения, то по анализу спектров можно оценить состояние хлорофилла при изменяющихся условиях. На рисунке 10 представлены спектры низкотемпературной флуоресценции препаратов хлоропластов из контрольных и закаленных растений. Из рисунка видно, что у опытных растений наблюдается повышение уровня флуоресценции Г685 и Г696, причем интенсивность флуоресценции больше при 696 нм. Ранее нами было показано увеличение интенсивности флуоресценции Г696 при агрегации светособирающего комплекса СССЮ С рис. И). Поэтому, отношение Г696/Г685 может использо-

Рис.И, Спектры флуоресценции изолированного ССК в зависимости от соотношения Мд+^/тритон Х-100: 1 - 0,6'/. тритон Х-100 + 0 мМ МдС12; 2 - 0,6% тритон Х-100 + 7 мМ МдС12; 3 - 0,6% тритон Х-100 + 20 мМ МдС12

ваться для определения состояния антенных форм хлорофилла в пиг-мент-белково-липидных комплексах (ПБЛЮ. Увеличение данного отношения при закаливании может говорить об агрегированности ПБЛК Стабл.2). Это подтверждается экспериментами с МдС12. Как видно из данных таблицы 2, добавление Мд*'' к хлоропластам из контрольных растений приводит к повышению этого отношения, тогда как в хлоропластах из закаленных растений внесение ионов не влияет на

120

0

640 660 680 700 720 740

него. В то же самое время, отношение Г740/Г685 значительно изменяется у хлоропластов из закаленных растений (табл.2). Приведенные данные позволяет говорить, что низкотемпературная закалка влияет на состояние и взаимодействие ПБЛК ССК и понижает взаимодействие антенных форм с длинноволновой системой.

Таблица 2.

Зависимость перераспределения энергии между фотосистемами при добавления МдС12 в хлоропластах из закаленных и незакаленных растений.

* концентрация МдС12 - 10 мМ

Одной из возможных причин изменения свойств и взаимодействия ПБЛК хлоропластов при низкотемпературной адаптации могут быть значительные изменения липидного состава сопрягающих мембран (Мануильская, 1987). Мы уже отмечали зависимость механизма перераспределения энергии от состояния липидов (Малах, 1993). Если выявленные изменения спектральных характеристик у хлоропластов закаленных растений зависят и от липидного состава, то подтверждением этих соображений могут служить наши опыты по влиянию

Таблица 3.

Влияние закаливания на индуцированную тритоном Х-100 дезагрегацию ПБЛК.

Вариант Г696/Г685

- МдС12 + МдС12

Г740/Г685 - МдС12 + МдС12;

Контроль 1,45 1,79 Опыт 1,51 1,55

4,64 4,77 3,66 2,91

Вариант

Концентрация тритона Х-100'(%), обладающая полумаксимальным эффектом

Контроль Опыт

Г696/Т685 0,5 1,0

Г740/Г685 0,25 0,25

закаливания на эффективность дезагрегации ПБЛК под действием тритона Х-100. Солюбилизирующая способность неионных детергентов определяется, главным образом,составом гидрофобной части мембраны и ПБЛК, то есть составом липидов. Изменения этого состава должны изменять эффективную дезагрегирующую концентрацию детергента. Как видно из данных таблицы 3, закалка приводит к повышению концентрации тритона Х-100, вызывающей полумаксимальный эффект дезагрегации ПБЛК ССК, что можно интерпретировать как "понижение" гидрофобности их липидной фазы, по-видимому, вследствие увеличения доли ненасыщенности ее жирнокислотного состава.

Полученные результаты подтверждают данные о влиянии липидной фазы на перераспределение энергии между фотосистемами СМа-лах, 1993) и показывают модифицирующее влияние закаливающей температуры на ПБЛК.

ВЫВОДЫ

1. Впервые выявлено двухфазное изменение эндогенного содержания цАМФ в первые сутки холодовой акклимации. Появление пика цАМФ наблюдается через 5-10 часов после начала закаливания и является характерным только для озимой пшеницы.

2. Обнаружено изменение активности Н+-АТФазы плазмалеммы закаленных растений, характеризующееся повышением ее активности, сдвигом оптимума рН в кислую сторону и изменением чувствительности к калию.

3. Показано, что временная остановка роста проростков в первые часы действия закаливающей температуры совпадает с лаг-периодом формирования устойчивости.

4. Выявлено, что процесс формирования устойчивости определяется концентрацией цитоплазматического независимо от его происхождения (вне- и внутриклеточные источники).

5. С использованием антагонистов кальмодулина, эффекторов системы образования и гидролиза цАМФ, ингибитора липидзависимой протеинкиназы продемонстрировано участие различных групп вторичных посредников в процессе формирования низкотемпературной устойчивости.

6. Показано возможное участие АБК в формировании морозостойкости на стадии посттрансляционной модификации.

7. С использованием отношений интенсивности низкотемпературной флуоресценции ¡Т740/Г685 и Г696/Г685) охарактеризованы

изменения взаимодействий между основными ПБЯК под влиянием закаливающей температуры. Обнаружено, что их состояние определяется состоянием липидной фазы.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Ларская И. А. Характер изменения активности Н+-АТФазы плазмалеммы корней озимой пшеницы под влиянием закаливающих температур // Тез.докл. 8-й конференции молодых ученых-биологов "Экологические вопросы рационального природоиспользования". Рига 1989, С.107.

2. Ларская И. А. , Заботин А. И. Изучение изменения Н+-АТФаз-ной активности плазмалеммы корней на первой фазе закаливания проростков озимой пшеницы // Сб. "Н+-АТФазы и реактивность растительной клетки". Казань, 1989, С. 30.

3. Ларская И. А., Заботин А.И. Изучение динамики содержания циклических нуклеотидов при низкотемпературном закаливании // Тез.докл. III съезда БОФР. С-Петербург. 1993, Т.6, С.650.

4. Заботин А. И. , Басалова И. В. , Заботина 0. А. , Ларская И. А. Лозовая В.В. Изменения в клеточной стенке проростков озимой пшеницы в ходе низкотемпературной адаптации // там же, С.563.

5. Zabotina 0.А., Gurjanov 0.Р., Ayupova D.А., Larskaja I.A Beldman G. , Lozovaya V.V. Separation of oligosaccharins occurred naturally in plant tissues // Abstracts of 7-th Bratislava symposium on oligosaccharides. Smolenice, Slovakia. 1994. P.95.

6. Zabotm A. I., Barisheva T. S. , Zabotina 0. A. , Larskaja I. A., Pivovarov M.S. , Beldman G., Lozovaya V.V. Alterations in cell walls at low temperature acclimation // Abstracts of 7-th Bratislava symposium on oligosaccharides. Smolenice, Slovakia. 1994. P. 94.

7. Заботин А. И. , Барышева Т. С. , Заботина 0. А. , Ларская И. А. Лозовая В В. Клеточная стенка растений и формирование гипотер-мического синдрома // Докл.АН РАН. 1995. Т.343. N. 4. С. 672.

8. Заботин А. И., Барышева Т.С., Заботина 0.А., Ларская И. А. Лозовая В В. Изменения в клеточных стенках озимой пшеницы в процессе формирования низкотемпературной устойчивости // Тез.докл. II Республиканской конференции "Актуальные экологические проблемы республики Татарстан". Казань. 1995. С. 67.

9. Ларская И.А., Заботин А.И. Исследование альтерации плазматической мембраны клеток озимой пшеницы в течении холодовой акклимации // там же. С.74.

10. Zabotin A.I., Barisheva T.S., Zabotina 0.А., Larskaja I. A., Lozovaya V.V. Peculiarities of cell wall reconstruction during the low temperature acclimation of wheat seedlings // Abstracts of 7-th Cell Wall Meeting. Santiago de Compostela, Spam 1995. P. 177.

11. Zabotina 0.A., Ayupova D.A., Larskaya I.A., Zabotin A.I. , Lozovaya V. V., Beldman G., Voragen A. Oligosaccharides appeared during first hours of low temperature acclimation increase wheat seedling capability of adaptation // Abstracts of Keystone Symposia. Tamaron, Colorado, USA, 1996. P. 32.

12. Ларская И.А., Замалеева Г. А. Участие вторичных посредников в формировании морозоустойчивости проростков озимой пшеницы // Тез.докл. II Республиканской конференции молодых ученых, Казань. 1996. (в печати).

13. Ларская И.А., Белогуб А.В. Влияние низких положительных температур на фотосинтетический аппарат проростков озимой пшеницы // Тез.докл. II Республиканской конференции молодых ученых, Казань. 1996. Св печати).