Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка трансфекции гена VEGF121 в мультипотентные стромальные клетки человека невирусными методами

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Оценка трансфекции гена VEGF121 в мультипотентные стромальные клетки человека невирусными методами"

СМИРНИХИНА СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА

ОЦЕНКА ТРАНСФЕКЦИИ ГЕНА УЕСГ121 В МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА НЕВИРУСНЫМИ МЕТОДАМИ

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2011

1 4 ДПР 2011

4843727

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН

Научный руководитель:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Бочков Николай Павлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Румянцев Сергей Александрович

доктор медицинских наук, Писарев Владимир Митрофанович

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики Российской

академии наук

Защита состоится «16» мая 2011 года в «¡У » часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетичсскош научного центра РАМН по адресу. 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «; Ц » — 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук, профессор

Зипченко Р.А.

Актуальность проблемы

Клеточная терапия с использованием мультипотентных мезенхимиых стромальных клеток человека (МСК) считается одним из наиболее перспективных направлений медицины. МСК сейчас используют практически во всех областях медицины: от пластической хирургии до возмещения больших дефектов тканей и органов (Riordan N.H., 2009; Psaltis P.J., 2008; Yoshimura К., 2008; Schaffler Л., 2007; Пальцев М.А., 2009).

Использование МСК в регенеративной медицине неслучайно. Эти клетки есть у каждого человека, и их достаточно просто выделить и культивировать. МСК содержатся в костном мозге, жировой ткани, пуповишгой крови и почти во всех органах. При аллотрансплантации МСК относительно неиммуногенны и даже отмечено, что они могут незначительно подавлять иммунный ответ реципиента, что позволяет им длительно выживать после введения для оказания терапевтического эффекта (Le Blanc К., 2004).

Помимо всех выше перечисленных достоинств, МСК экспрессируют широкий спектр цитокинов и факторов роста, которые оказывают паракринные эффекты: осуществляют иммуномодуляцию и трофику (Sadan О., 2009), стимулируют гемопоэз in vitro (Pittenger M.F., 1999; Majumdar M.K., 1998; Парфенова E.B., 2000). Также есть данные, что МСК оказывают проангиогенный эффект, причем у МСК, выделенных из жировой ткани, он выше, чем у МСК из костного мозга (Kim Y., 2007). Кроме того, МСК усиливают неоангиогенез за счет дифференцировки в эндотелиальные клетки и выделения множества ангиогенных факторов, таких как VEGF, bFGF и ангиопоэтин-1 (Al-Khaldi А., 2003; Lee J.B., 2006; Kaigler D., 2003; Бокерия Л.А., 2006). Все вышеперечисленное позволяет применять МСК для лечения ишемических состояний нижних конечностей и сердца.

Кроме того, есть данные о том, что введение в очаг ишемии генно-инженерных конструкций с факторами ангиогенеза, также может приводить к усиленному росту сосудов, что с успехом используется в комплексной терапии ишемических состояний (Константинов Б.А., 2005; Бочков Н.П., 2006; Бочков Н.П., 2010).

С целью большей стимуляции роста новых сосудов целесообразно совместить оба метода, т.е. трансплантировать МСК, трансфицированные генами ангиогенеза, в частности VEGF. В литературе описаны положительные примеры такого подхода. Наиболее безопасными методами трансфекции являются невирусные методы -липофекция и электропорация, так как лишены многих побочных эффектов вирусных методов (инсерционный мутагенез, иммунологические осложнения). В отношении трансфекции МСК имеются противоречивые сведения об эффективности невирусных

методов и о степени повышения уровня экспрессии трансгена. С целью разработки оптимальных протоколов трансфекции необходимо проведение серии экспериментов с использованием плазмиды с геном УЕСГ.

Цель и задачи исследовании

Цель работы - оценка результативности трансфекции, динамики эчиминации плазмиды с геном УЕОР и экспрессии введенного гена в МСК человека двумя невирусными методами - липофекцией и электропорацией.

Задачи исследования:

1. Оценить результативность трансфекции и динамику элиминации плазмид в различных культурах МСК, трансфицированных липофекцией и электропорацией.

2. Охарактеризовать липофекцию и электропорацию по результативности и динамике элиминации плазмид из трансфицированных клеток.

3. Оценить уровни экспрессии гена ^/£GF в нетрансфицированных и трансфицированных обоими методами клетках.

4. Оценить уровень метилирования СМУ-промотора введенной генетической конструкции.

Научная новизна

В настоящем исследовании проведена трансфекция плазмвды с геном УЕйЕ. В работе показано, что результативность невирусных методов при трансфекции этой плазмиды в МСК не различается.

В работе выявлены культуральиые различия в результативности трансфекции, динамике элиминации плазмид из клеток и в уровнях экспрессии гена F£GF как б трансфицированных, так и в нетрансфицированных клетках.

Впервые исследовано метилирование при транзиектной трансфекции МСК. Показано, что метилирование не вносит существенный вклад в снижение уровня экспрессии гена вводимой плазмиды.

Учитывая малоэффективные попытки лечения ишемических состояний с помощью МСК и генной терапии с использованием генно-инженерных конструкций с факторами ангиогенеза, проведена попытка разработки оптимальных условий трансфекции и дальнейшей трансплантации трансфицированных культур в шпемизированные ткани, необходимой для лучшей реваскуляризации ткани при клеточной терапии. В ходе работы определены наиболее эффективные подходы в трансфекции МСК плазмидой с геном УЕОР.

Практическая значимость

Работа представляется базисной, направленной на оценку результативности невирусных методов трансфекции МСК. Результаты работы указывают на необходимость разработки подходов к уменьшению вариабельности результативности трансфекции МСК. Результаты работы необходимы для дальнейшего применения трансфицированных клеток в клеточной терапии, включая лечение ишемичсских состояний нижних конечностей.

Положения, выносимые на защиту

1. Между культурами МСК обнаружены индивидуальные различия в результативности трансфекции и динамике элиминации нлазмид из клеток.

2. Определена динамика элиминации илазмид после липофекции и электропорацин. Оба метода не отличаются друг от друга по результативности и динамике элиминации плазмид из трансфицированных клеток.

3. После трансфекции уровень экспрессии гена VEGF повышается в половине культур к 9-му дню.

4. Метилирование промотора плазмиды не оказывает существенного влияния на уровень экспрессии VEGF.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых при МГНЦ РАМН (Москва, 2009 г.), на конференции Stem Cells Europe (Эдинбург, 2009 г.), на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010 г.), лабораторных и межлабораторных семинарах. Апробация проведена на базе МГНЦ РАМН 16 февраля 2011 года.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации

Работа выполнена на базе Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН. Автор проводил дифференцировку МСК в адипогенном и остеогенном направлении, трансфекцию, выделение образцов ДНК и РНК, анализ с помощью ПЦР в реальном времени, подготовку образцов к секвенированию, все расчеты и статистическую обработку полученных результатов. Автор участвовал в оптимизации всех методов трансфекции МСК, подборе праймеров для ПЦР, иммунофенотипировании МСК. Автор сформулировала выводы и опубликовала статьи, отражающие основные результаты диссертационной работы.

Публикации

Работа отражена з 6-ти печатных работах - 4 статьи и 2 тезисов в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы в клиническую практику

Результаты диссертационной работы внедрены в практику в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН. Полученные результаты используются при разработке протоколов транзиентной трансфекции мультипотентных стромальных клеток человека с целью получения ткане-инженерных конструкций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, выводов, обсуждения и списка литературы (141 источник, в том числе 12 в отечественных изданиях). Работа изложена на 96 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами и 15 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культуры теток, Культуры МСК-1 и МСК-2 были выделены из жировой ткани доноров женского пола, полученной в ходе плановой хирургической операции. От доноров были получены информированные согласия на использование клеток в эксперименте. Кусочки жировой ткани трижды промывали раствором РВБ, добавляли равный объем коллагеназы I (0,3 £д/мл) и инкубировали 1 час при 37°С, периодически помешивая. После чего нейтрализовали фермент полной ростовой средой (15 мл) и центрифугировали 10 минут на 2 тыс. об/мин. Осадок ресуспендировали в ростовой среде и культивировали в чашках Петри или флаконах 25-см2 в полной ростовой среде: ОМЕМ/Р12 (ПанЭко, Россия), 10% ИЗ 5 (РегЫо НуСкте, США), гепарин 8 Ед/мл (ПанЭко, Россия), Ь-глутамин 2мМ (ПанЭко, Россия), РОР-Ь Юнг/мл (ПанЭко, Россия), пенициллин/стрептомицин (ПанЭко, Россия) - при температуре 37°С и содержании С02 5%. После выделения клеток культуральную среду меняли через сутки и далее каждые 3-4 дня. Культуры МСК-3 -МСК-7 были любезно предоставлены лабораторией генетики стволовых клеток МГНЦ РАМН (руководитель - ДВ. Гольдштейн). Источник тот же - жировая ткань. Культивирование проводили в тех же условиях, что описаны выше.

Иммунофенотинирование и дифференцировка этих культур клеток проводилась там же.

Дифференцировка клеток в aduno- и остеогенном направлениях. МСК культивировали в полной ростовой среде до конфлгоентности 60-70%, после чего в среду добавляли 100 мкМ индометацина, 1 мкМ дексаметазона, 0,5 мкМ 1-метил-З-изобутилксантина и 10 мкг/мл инсулина (факторы дифференцировки в адипогенном направлении) и культивировали 20 дней. Для остсогенной дифференцировки добавляли 50 мкМ L-аскорбгаювой кислоты фосфата, 10 мМ бета-глицерофосфата и 100 нМ дексаметазона и культивировали 17 дней. Среду меняли каждые 3-4 дня. После культивирования дифференцированные в адипогенном направлении клетки были фиксированы в метаноле и окрашены красителем Oil Red О (3 мг/мл Oil Red О в 60%-ном растворе изопропанола) в течение 15 минут. Дифференцированные в остеогенном направлении клетки были фиксированы в метаноле и окрашены красителем Alizarin Red (2% Alizarin Red в O.IMNH4OH; pH 5.4) в течение 15 минут.

Иммунофенотипирование клеток. Клетки дважды промывали раствором PBS, добавляли 0,2% раствор ЭДТА в PBS и инкубировали 10 минут, ЭДТА нейтрализовали равным объемом полной ростовой среды и центрифугировали 5 минут при 1000 rpm. Клеточный осадок ресуспендировали в PBS до конечной концентрации 10 млн./мл. На 1 млн. клеток добавляли 5 мкл флюоресцентно окрашенных антител (CD44, CD73, CD105, CD14, CD19), перемешивали на вортексе и инкубировали 30 минут на льду. Далее промывали раствором PBS и центрифугировали 5 минут при 2000 rpm, ресуспендировали в 500 мкл 1%-ного формальдегида и оценивали флюоресценцию на проточном цитометре Flowmax (Partee, Германия).

Трансфекция. Трансфекцию проводили плазмидой с геном VEGFI2I (pS450VEGF121), регулируемым CMV-промотором, любезно предоставленной профессором Б.С. Народицким (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи Минздравсоцразвития РФ). Условия трансфекции были оптимизированы с помощью плазмиды pEYFP-Cl (Clontech, США). Клетки (4-7-ой пассаж) в количестве 105 ресуспендировали в 100 мкл буфера для электропорации (Eppendorf, Германия) и проводили электропорацшо - 400В/мм, 55мкс с использованием электропоратора Multiporator (Eppendorf, Германия), после чего рассевали по лункам 6-ти луночных планшетов или во флаконы 25см2. Липофекцию с помощью Унифектина-56 (Unifect Group, Россия) проводили в культурах клеток конфлюентных до 60-70%. Соотношение Унифектина и плазмиды - 12 Ед.:б мкг на чашку Петри диаметром

lOcM или культуральный флахон 25см2. После обоих способов трансфекции среду меняли на следующий день, далее каждые 3-4 дня.

Выделение ДНК. На i-e, 3-й, 6-е и 9-е сутки после трансфекции клетки промывали дважды раствором PBS, добавляли раствор трипсин-ЭДТА (ПанЭко, Россия), инкубировали 10 минут при 37ÖC, добавляли равный объем полной ростовой среды и центрифугировали 5 минут при 1,5 тыс. об/мин. Осадок дважды промывали PBS и считали количество клеток в камере Горяева. Выделение ДНК проводили с помощью набора «ДНК-Сорб-АМ» (ИнтерЛабСервис, Россия) по рекомендованному производителем протоколу. Образцы растворяли в ТЕ-буфере и хранили при t -20°С.

Выделение РНК. Клетки снимали с флаконов и чашек Петри, как описано выше. К клеточной суспензии добавляли 2,5 мл тризола и 0,5 мл хлороформа, перемешивали на вортексе и центрифугировали 20 мин. при 4°С на 4000 об/мин. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку, добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ и также центрифугировали. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку, добавляли разный объем ледяного изопропанода и инкубировали при -20°С не менее часа. Далее центрифугировали 20 минут при 4°С на 12 тыс об/мин. Осадок растворяли в 0,3 мл GTB-буфера, переносили в новую пробирку, добавляли равный объем ледяного изопропанола и инкубировали не менее 30 минут при -20°С, после чего центрифугировали 20 минут (4°С, 12 тыс об/мин). К осадку добавляли 1 мл 75%-ного этанола и инкубировали при комнатной температуре 15 минут, центрифугировали 10 минут (4°С, 12 тыс об/мин). Осадок подсушивали на воздухе и растворяли в 100 мкл MillíQ. После этого проводили обработку DNase (Promega, Германия) по рекомендованному производителем протоколу.

Отрицательные коитроли трансфекции. Из нетрансфицированных образцов всех культур выделяли ДНК и РНК, как списано выше.

Синтез кДНК. Реакция обратной транскрипции проводилась с помощью фермента M-MuLV (СибЭнзим, Россия) по протоколу, рекомендованному производителем.

ПЦР в реальном времени. В реакционную смесь (25 мкл), содержащую 300 нМ праймеров, 200 мкМ дНТФ, 3 мкМ Mg2+, lxSYBR Green I (Invitrogene, США) и 0,04 Ед. Taq-полимеразы, вносили по 5 мкл ДНК. ПЦР в реальном времени проводили на приборе CFX96 (Bio-Rad, США). Условия реакции: 95°С - 3 мин, 45х(95°С - 5 сек, 60сС - 10 сек, 72°С - 20 сек). Использованные праймеры представлены в табл. 1.

Рестрикция Я/ndlII и ЕсоШ. Образцы ДНК и контрольные образцы по 300 нг, подлежащие исследованию метилирования, обрабатывали рестриктазами Hindill (фланкирующей CMV-промотор) или EcoRI при 37°С в течение 1 часа. После

рестрикции все образцы, кроме положительных контролем, очищали с помощью набора «ДНК-Сорб-АМ» (ИнтсрЛабСервис, Россия). Образцы растворяли в ТЕ-буфере.

Таблица 1. Праймсры, использованные для ПЦР в реальном времени

Ген Пранмер Последовательность (5'-3') Продукт (п.н.)

GAPDH F AAGGTCGGAGTCAACGGATTT 259

R CCAGCATCGCCCCACTTGA

VEGF F CCTTGCTGCTCTACCTCCAC 75

R GATGATTCTGCCCTCCTCCTT

Actin fi F CCTGGCACCCAGCACAAT 144

R GGGCCGGACTCGTCATAC

Положительный контроль метилирования. Разрезанную плазмиду обрабатывали метилазой A/.&îI в присутствии S-аденознлметионина (Сибэнзим, Россия) и инкубировали 3 часа при 37°С, далее добавляли такое же количество фермента и S-аденозилметионина и продолжали инкубацию в течение 3-х часов в тех же условиях. Выделяли ДНК с помощью набора «ДНК-Сорб-АМ» (ИнтсрЛабСервис, Россия). Образцы растворяли в ТЕ-буфере.

Бисульфитная конверсия. Бисульфитная конверсия ДНК проводилась наборами EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN) и EZ DNA Methylation Kit (Zyrao Research, США) no рекомендованным протоколам с изменениями: конверсия проводилась в амплификаторе Mastercycler personal (Eppendorf, Германия) в режиме периодической денатурации и инкубации (денатурация - 5 мин. при 95°С, инкубация - 25 мин. при 60°С, денатурация - 5 мин. при 95°С, инкубация - 1 час 25 мин. при 60°С, денатурация - 5 мин. при 95°С, инкубация - 2 часа 55 мин. при 60"С). Степень бисульфитной конверсии определялась программой QUMA (http://quma.cdb.riken.jp) на основе полноты конверсии свободных цитозиновых оснований.

ПЦР для секеенирования. Предсказание расположения CpG-островков в CMV-промоторе генетической конструкции и подбор праймеров производился с использованием программы McthPrimer, доступной по адресу в Интернете http://wvAv.urogene.org/mcthprimer/indexl.html. ПЦР проводили с праймерами на CMV-промотор. 5 мкл конвертированной ДНК (в разведении 10"') смешивали с 200 нМ каждого праймера (F - 5'-TGTTTTTTGTTTGTGTGTTGGА-3', R - 5'-АТАССААААСАААСТСССАТТА-3 ') в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 200 мкМ дНТФ и 0,04 Ед. Taq-полимеразы. Условия ПЦР: 2 мин - 95°С, 5х(10 сек - 95°С,

30 сек - 62°С, 30 сек - 72°С), 55х(10 сек - 95°С, 30 сек - 58°С, 30 сек - 72°С), 2 мин -72°С. Для контролей - 20 циклов.

Выделение образцов для последующего секвенирсвания. Образцы, подлежащие секвенированию, подвергали электрофорезу в 1,8%-ном агарозном геле (0,9 г агарозы (ПгнЭко, Россия) на 50 мл IxTBE, окрашенном бромидом этидия в концентрации 0,5 мкг/мл) в однократном растворе TBE. После электрофореза ампликон вырезали из геля и выделяли набором DNA Extraction Kit (Fermentas, ЕС) по рекомендованному производителем протоколу.

Секвенирование. Проводилось на 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Нуклеотидные последовательности анализировали с использованием программы Sequence Scanner v.1.0 (Applied Biosystems, США).

Подсчет кДНК и мРНК гена VEGF. Относительное количество VEGF в МСК рассчитывалось как отношение относительных концентраций VEGF и GAPDH, полученных в ходе ПЦР в реальном времени. Относительная концентрация по каждому гену рассчитывалась по формуле:

где

Е - эффективность праймеров. Этот показатель рассчитывался по формуле (% эффекгивности*0,01)+1, при 100%-ной эффективности реакции этот показатель равен 2;

Ст (MiN) - средний показатель C(t) для образца с минимальным средним C(t) для целевого гена;

CT(S3mp|e)- средний показатель C(t) для образца;

GOI - целевой ген.

За относительное количество гена VEGF в образце брали отношение RQvecf/RQgapdh Для каждой копии каждого образца. Всего на одну точку (т.е. образец ДНК, выделенный в определенный день после трансфекцйи) использовали 4 реплики.

Относительное количество мРНК VEGF в МСК рассчитывалось методом нормализованной экспрессии по генам GAPDH и Actin ßпо формуле:

Normad Expresskm,^^ --*Q»q»tct>t)-^

<R®ssm/3Íe¡Ref l) * RQsäsiple;P«2> * — * ^sample¡Ref/s)*'

где

RQ - относительное количество образца;

Ref - референсный ген в эксперименте;

GOI - целевой ген.

Расчеты производились с использованием программного обеспечения CFX96 (Bio-Rad, США).

Статистическая обработка. В исследовании использовали средние, доверительные интервалы и анализ корреляции, полученные с использованием программы Statistica 6.0 (StatSoft) и Microsoft Excel (Microsoft, США). Результаты считали достоверными, если р<0,05. В работе также использовали непараметрический метод оценки достоверности - метод Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Мультипотентность и фенотип МСК

Для доказательства «стволовости» МСК проводили дифференцировку и иммунофенотипирование клеток. При культивировании МСК в среде с факторами дифференцировки в адипо- и остеогенном направлении через 20 и 17 дней, соответственно, были получены дифференцированные клетки (рис. 1).

Рис. 1. Дифференцировка МСК. А - отрицательный контроль адипогенной дифференцировки; Б - дифференцировка в адипогенном направлении (окраска Oil Red О); В - отрицательный контроль остеогенной дифференцировки; Г - дифференцировка в остеогенном направлении (окраска Alizarin Red). Увеличение хЮО.

При окраске МСК антителами к поверхностным антигенам С044, С073, СО 105, СО 14, СО 19 выявлено, что клетки экспрессируют на своей поверхности антигены, присущие МСК (табл. 2).

Таблица 2. Иммунофенотипирование МСК_

Маркер Позитивные клетки, %

CD44+ 97

CD73+ 97

CD105+ 73

CD14- 0

CD19- 0

Таким образом, в наших исследованиях доказано, что клетки, выделенные из жировой ткани являются мультипотентными мезенхимными стромальными клетками, так как способны дифференцироваться в адипо- и остеогенном направлении и экспрессируют определенный, характерный для МСК, спектр поверхностных антигенов.

Результативность трансфекции

Эффективность трансфекции и функционирование плазмид с разными генами, по литературным данным, может отличаться (Не J., 2005; Zhang X.Y., 2004). Поэтому, после отработки протокола трансфекции на плазмиде с репортерным геном, далее работа была сосредоточена на плазмиде с геном VEGF.

Под результативностью трансфекции в исследовании понимали уровень содержания ДНК гена VEGF (т.е. плазмидной ДНК) в МСК по отношению к геномной ДНК через сутки после трансфекции. Термин эффективность трансфекции предполагает знание процента трансфицированных клеток, и в данном случае использовать его некорректно.

Эффективность трансфекции в этом исследовании можно предполагать лишь косвенно на основе трансфекции этих же клеток плазмидой с геном желтого флюоресцентного белка (eYFP). При трансфекции МСК плазмидой с этим геном эффективность обоих методов составила 5-10%. Эти протоколы применяли для трансфекции плазмиды с геном VEGF. Вероятно, эффективность трансфекции для плазмиды с VEGF была не выше 10%.

Относительное количество плазмидной ДНК измеряли в образце ДНК, выделенном из трансфицированной или нетрансфицированной культуры. Для оценки элиминации плазмиды и экспрессии гена VEGF использовали одни и те же праймеры,

подобранные на кДНК гена, которая являлась вставкой в плазмиду. В образце ДНК, выделенном из трансфицированных клеток, амплификация проходила только с плазмидной ДНК, поэтому данные по содержанию плазмидпой ДНК в образце, определенные таким образом, отражают действительное ее содержание.

Полученные данные по результативности трансфекции отражены на рис. 2. Как видно на гистограмме, культура МСК-4 не трансфицировалась ни одним из методов. Эта культура была одновременно трансфицировапа с МСК-3, поэтому экспериментальную ошибку можно исключить. На наш взгляд, неэффективность обоих методов трансфекции в отношении МСК-4 можно объяснить индивидуальными особенностями либо донора, либо культуры клеток после ее выделения. Данная культура была исключена из анализа содержания плазмид в трансфицированных клетках.

МСК-1 МСК-2 МСК-3 МСК-4 МСК-5 МСК-6 Культуры клеток

Ш липофекция а электропорация

Рис. 2. Содержание ДНК УЕ(1Р' в культура* МСК через сутки после трансфекции.

Результативность электропорации и липофекции невысокая, что может быть связано с низкой эффективностью обоих невирусных методов трансфекции или тем, что МСК являются трудно трансфицируемыми клетками. Возможно, дальнейшая оптимизация протоколов трансфекции поможет проводить более эффективное введение нлазмиды в МСК.

Межкультуральные различия при трансфекции плазмиды с геном УЕСГ При трансфекции МСК обоими методами выявлены культурагсьные различия в результативности трансфекции и динамике элиминации плазмид из клеток. Данные по относительному количеству плазмид в клетках разных культур в разные сроки после трансфекции представлевы на рис. 3, Важно отметить, что все культуры МСК трансфицировали по одинаковым протоколам. Часто культуры трансфицировали в параллели, поэтому объяснить различное «поведение» культур можно лишь индивидуальными особенностями.

13 6 9

Дни после траисфеиции

Рис. 3. Содержание ДНК ^ЕСЕ в граясфианроеанкых клетке* на разные сроки кослс трансфекции (обобщенные данные по обоим методам трансфеккяи). Данные представлены как средние с доверительным интервалом.

По результатам исследования все культуры МСК можно условно разделить на плохо, хорошо и умеренно трансфицируемые. На рис. 3 отчетливо видно, что культура МСК-2 относится к плохо трансфицируемым. МСК-5 можно отнести к хорошо трансфицируемым культурам. Получены достоверные отличия этой культуры в результативности трансфекции от культур МСК-1, МСК-2 и МСК-6. Культуры МСК-1, МСК-3 и МСК-6 можно условно отнести к умеренно трансфицируемым.

Из данных, отраженных на рис. 3, можно предположить о существовании быстро и медленно элиминирующих культур. Так, на 6-ой день после трансфекции отмечено более медленное снижение УЕОЕ в культуре МСК-3, по сравнению со всеми другими (р<0,05). К 9-му дню различия этой культуры сохраняются только в отношении МСК-

1 и МСК-2. Содержанке плазмид в клетках культуры МСК-5 также достоверно выше на 9-ый день, чем в культурах МСК-1 и МСК-2. Также обнаружены отличия между МСК-6 и МСК-2. Таким образом, культура МСК-3 показала себя как медленно элиминирующая плазмиду с геном VEGF121, а МСК-1 и МСК-2 - как быстро элиминирующие.

Культуры МСК отличаются друг от друга по результативности трансфекции и динамике элиминации плазмиды. Индивидуальные различия, на наш взгляд, не позволяют использовать один и тот же стандартный протокол трансфекции для всех культур. Возможно, дальнейшая оптимизация протоколов для каждой культуры клеток позволит получать большую результативность трансфекции.

Динамика элиминации плазмиды из МСК при липофекции и электропорации

С течением времени плазмида элиминируется из клеток в соответствии с предположением о существования быстро и медленно элиминирующих культур МСК. Однако даже на 9-ый день после липофекции плазмида обнаруживается вс всех культурах, в некоторых даже на сопоставимом уровне с Ьм днем.

При электропорации отмечены большие колебания в результативности трансфекции от 0,39 до 5,14 o.e. По этому показателю культура МСК-5 достоверно отличается от культур V1CK-2 и МСК-6. В динамике элиминации прослеживаются культуры быстро и медленно элиминирующие плазмиды, однако элиминация происходит более быстрыми темпами, чо сравнению с элиминацией при липофекции. К 9-му дню в двух культурах из пяти (МСК-2 и МСК-5) плазмида не обнаруживается.

Таким образом, несмотря на явные различия культур между собой, при трансфекции в каждой культуре практически не выявляется различий в результативности и элиминации плазмиды при трансфекции разными методами.

Все культуры по каждому виду трансфекции представляли собой однородные группы, что позволило нам их объединять. Обобщенные данные отражены на рис. 4. Количество дяазмвд в трансфицироваякых клетках досгеверно снижается к 3-му дню как при электропорации, так и при липофекции, далее содержание плазмид не различается.

Содержание плазмид в трансфицированных клетках во всс сроки достоверно (р<0,05) отличается от контрольных значений и не зависит от метода трансфекции. Как видно на гистограмме (рис. 4), по совокупным данным липофекция и электропорация не отличаются друг от друга ни в один из сроков после трансфекции, то есть результативность и динамика элиминации плазмид при использовании обоих методов сопоставима.

3,5

а

13 6 9

Дни после трансфекции

Рис. 4. Суммарные данные по всем культурам по содержанию плазмидной ДИК гена УЕСР после трансфекции. Данные представлены как средние с доверительным интервалом.

Динамика экспрессии гена K£'GF

Ген эвдотелиального фактора роста сосудов в норме присутствует в геноме человека и экспрессируется. Такая экспрессия является базовой или контрольной. Совокупные данные по экспрессии УЕСГ в культурах МСК представлены в табл. 3.

Как следует из табл. 3, достоверных отличий в уровне экспрессии целевого гена для МСК-1 и МСК-2 не выявлено. В отличие от МСК-1, в МСК-2 наблюдаются колебания уровней экспрессии гена УЕСР во всех трех группах, размахи колебаний намного превышают таковые в культуре МСК-1. Возможно, это объясняется индивидуальными различиями, так как культивирование проводилось одинаково для всех культур. При липофекции пик экспрессии приходится на 6-ой день, как и в контрольных образцах, для электропорации максимальный уровень отмечен на 3-ий день. Однако все различия, как и для культуры МСК-1, являются недостоверными.

В контрольных образцах МСК уровни экспрессии колеблются. Это можно объяснить тем, что в норме экспрессия УЕОР колеблется в зависимости от различных условий, например, культивирования.

Таблица 3. Относительное содержание мРНК УЕйР в культурах МСК на разных

сроках после трансфекции

Культура Метод Содержание мРНК ^/EGF в культуре МСК ± ДИ

День 1 День 3 День 6 День 9

МСК-1 липофекция 1,12 ±3,57 1,83 ± 2,37 1,76 ±0,63 1,87 ±0,94

электропорация 6,06 ± 8,74 5,20 ±5,35 4,69 ± 10,34 2,95 ± 16,16

контроль 2,77 ±3,3 1,19 ± 0,40 3,35 ± 3,35 4,41 ±3,18

МСК-2 липофекция 1,32 ±0,43 7,15 ± 17,70 11,89 ± 11,26 1,28 ±0,83

электропорация 3,33 ±3,41 15,94 ±27,17 5,20 ± 4,94 1,33 ±0,76

контроль 0,60 ±0,21 1,23 ±0,71 10,05 ± 22,29 2,32 ± 5,39

МСК-3 липофекция 6,24 ± 1,34* 1,48 ± 1,08 23,43 ± 7,50* 21,61 ±17,71

электропорация 8,35 ±3,21* 2,43 ± 3,54 8,48 ± 11,25 16,08 ±34,89*

контроль 2,38 ± 1,99 2,28 ± 0,75 4,67 ±2,31 6,73 ± 2,75

МСК-5 липофекция 0,57 ±0,10 1,09 ±0,66 0,73 ±0,38 3,02 ± 0,72*

электропорация 3,19 ± 1,17* 1,89 ± 1,48 0,47 ±0,18 4,20 ±2,53*

контроль 1,11 ±0,41 0,48 ± 0,20 0,51 ±0,07 0,88 ± 0,32

МСК-6 липофекция 0,81 ± 0,47 0,79 ± 0,24* 1,21 ±0,97 3,81 ±2,84*

электропорация 0,30 ±0,09 0,09 ±0,07 0,11 ±0,10 1,39 ±0,19*

контроль 0,57 ± 0,47 0,18 ±0,13 0,23 ± 0,22 0,65 ± 0,47

* р<0,05, отличие от контрольного уровня

В культуре МСК-3, как и в МСК-2, отмечаются большие колебания уровней экспрессии УЕОР, с преимущественным увеличением к 6-му и 9-му дням. При этом усиление экспрессии наблюдается как в трансфицированных, так и в нетрансфицированных клетках. Более того, базовый уровень экспрессии в контрольных образцах достоверно различен на 3-ий и 9-ый дни. Это еще раз подчеркивает тот факт, что экспрессия гена УЕвР в норме колеблется в результате действия каких-либо эндо- или экзогенных причин. На наш взгляд, одной из причин может являться смена культуральной среды. Так, выделение РНК на 6-ой и 9-ый дни проводилось на 3-ий день культивирования после смены среды, тогда как при выделение на 3-ий день после трансфекции осуществлялось на 2-ой день после смены среды. Возможно, культивирование в обедненной факторами среде приводит к усиленной экспрессии определенных генов, в частности, гена УЕОР. Для проверки этой гипотезы необходимо проведение дополнительных исследований.

Уровни экспрессии УЕОР в МСК-3 после липофекции на 1-ый и 6-ой дни достоверно отличаются от контрольных. Также отмечено различие в уровне

экспрессии после электропорации на 1-ый и 9-ый дни. Полученные данные говорят в пользу того, что, скорее всего, трансфицированная в МСК-3 плазмида увеличивает экспрессию гена VEGF, так как в тот же день контрольный уровень экспрессии ниже и объяснить усиление экспрессии какими-либо эндо- или экзогенными факторами нельзя, потому что они бы увеличили экспрессию и в контроле. Экспрессия VEGF в МСК-3 на 6-ой день после липофекции достоверно отличается от уровней экспрессии на 1-ый день после липофекции и электропорации.

В целом базовый уровень экспрессии в культуре МСК-5 ниже, чем в других, а колебания не такие выраженные. Вероятно, это обусловлено индивидуальными особенностями культуры. Экспрессия целевого гена на 1-ый день после электропорации и на 9-ый день после обоих методов трансфекции достоверно выше контрольных значений.

Для культуры МСК-6 получены достоверные различия в уровнях экспрессии VEGF от контрольных на 3-ий день после липофекции и на 9-ый день после электропорации и липофекции. Отмечено повышение экспрессии во всех трех группах к 9-му дню, для электропорации это повышение достоверное, относительно всех других дней.

При оценке корреляции между содержанием плазмид в клетках и уровнем экспрессии гена VEGF данных в пользу взаимосвязи этих параметров не получено. Корреляционный анализ проводили как с полученным уровнем экспрессии в трансфицированных клетках, так и с вычетом соответствующих контрольных значений экспрессии.

Полученное в работе небольшое повышение экспрессии VEGF и отсутствие корреляции «содержание плазмид - уровень экспрессии» может навести на мысль, что используемая в работе плазмида содержит какой-либо дефект, приводящий к отсутствию или снижению транскрипции с нее. Однако плазмида была проверена в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи Минздравсоцразвития РФ и показала высокую активность при трансфекции куриных эмбрионов (Авдеева C.B., 2005).

Так же, как в данных по результативности трансфекции и элиминации, при анализе экспрессии VEGF отмечены большие индивидуальные различия. Лучше всего они видны на примере контрольных нетрансфицированных образцов (табл. 4).

Как видно из таблицы, на 1-ый день после культивирования колебания в уровне экспрессии составляют от 0,57 до 2,77 o.e., однако достоверных отличий нет. На 3-ий день разбросы значений уменьшаются, но уровень экспрессии VEGF121 в культуре МСК-3 становится достоверно выше, чем в культурах МСК-5 и МСК-6. Эти же

различия можно наблюдать и в последующие дни. При этом уровни экспрессии на 6-ой и 9-ый дни в культурах МСК-1 и МСК-2 также повышаются, в отличие от культур МСК-5 и МСК-6, где экспрессия существенно не меняется. Вероятно, такое повышение экспрессии связано с индивидуальными особенностями культуры МСК-3. Похожие изменения для культуры МСК-3 обнаружены и в трансфицировашшх образцах.

Таблица 4. Относительное количество мРНК 1ЕСЕ в контрольных образцах культур МСК в разные дни культивирования_

Дни после трансфекции Относительное количество мРНК VEGF121 в культурах МСК, o.e.

МСК-1 МСК-2 МСК-3 МСК-5 МСК-6

1 2,77 ± 3,3 0,60 ±0,21 2,38 ± 1,99 1,11 ±0,41 0,57 ±0,47

3 1,19 ±0,40 1,23 ± 0,71 2,28 ± 0,75* 0,48 ±0,20 0,18 ±0,13

6 3,35 ±3,35 10,05 ± 22,29 4,67 ±2,31* 0,51 ±0,07 0,23 ± 0,22

9 4,41 ±3,18 2,32 ±5,39 6,73 ±2,75* 0,88 ±0,32 0,65 ±0,47

*р<0,05, отличие от МСК-5 и МСК-6

Полученные данные по уровню экспрессии VECF после трансфекции хорошо соотносятся с низкой результативностью обоих методов трансфекции для культур МСК. В клетки попадает мало плазмид, которые не могут привести к значимому увеличению экспрессии гена. С другой стороны, эффективность трансфекции тоже невысока, зкспрессирующах клеток мало, поэтому суммарно уровень экспрессии в культуре клеток поднимается незначительно.

При анализе повышения уровня экспрессии гена VEGF возникает вопрос: не является ли это повышением экспрессии собственною гена МСК в ответ на какое-либо воздействие? Основными причинами могут быть:

1. Окислительный стресс на внеклеточную ДНК (например, плазмидуУ Если этот факт имеет место, то экспрессия гена VEGF должна повышаться при трансфекции любой плазмиды, однако это не так. Из анализа литературы следует, что при трансфекции кератиноцитов плазмидой с EGFP экспрессия: VEGF не повышается, в отличие от трансфекции этих же клеток плазмидой с VEGF. Трансфекцию проводили с помощью липофекгамина (Rio М. D., 1999). С другой стороны, показано, что экспрессия эндогенного VEGF может повышаться при воздействии на TLR-рецептор 3 (Moon S. J., 2010). Данный тип рецепторов участвует в распознавании специфических компонентов микроорганизмов, приводя к сенсибилизации организма. В норме эти рецепторы реагируют только на патогены, такие как бактерии, грибы,

простейшие и вирусы. Поэтому маловероятно, что плазмида или реактивы для трансфекции активируют данные рецепторы.

2. Окислительный стресс как ответ на воздействие унифектина или электропорации. В ответ на такое влияние повышение экспрессии VEGF может происходить. Однако неясно, почему усиление происходит лишь на 9-ый день после трансфекции, а не сразу после воздействия на 1-ый день. Более того, культура МСК-4 была подвергнута обоим методам трансфекции, но неэффективно. Следовательно, в данной работе она может выступать неким контролем. Если бы экспрессия VEGF повышалась в ответ на действие самой процедуры трансфекции, то в этих «трансфицированных» клетках можно было наблюдать ее повышение. Однако усиление экспрессии отмечено только на 6-ой день после электропорации, а на 9-ый день экспрессия сопоставима с контрольным уровнем. Это может указывать на то, что экспрессия VEGF на 9-ый день повышается не из-за влияния самой трансфекции.

3. Повышение экспрессии в ответ на нахождение плазмиды в клетке. Эта причина маловероятна, так как трансфекция другими плазмидами, по данным литературы, не приводит к повышению экспрессии VEGF (Rio М. D., 1999).

4. Гипоксия. В норме гипоксия вызывает повышение экспрессии всех факторов, связанных с ангиогенезом, поэтому гипоксия может играть роль в повышении экспрессии VEGF. Все культуры клеток культивировали в условиях 20%-ного кислорода и 5%-ного углекислого газа. Культуры МСК-3 и МСК-4 культивировали в параллели, однако повышение экспрессии на 9-ый день отмечается лишь в МСК-3. Все трансфицированные клетки культивировали вместе с нетрансфицированными, но уровни экспрессии повысились лишь в трансфицированных клетках. Более того, гипоксией сложно объяснить повышение экспрессии лишь на 9-ый день, ведь клетки в таких же условиях культивировали на протяжении предыдущих 8-ми дней. Следовательно, гипоксия, скорее всего, не оказывает влияния на повышение уровня экспрессии VEGF в трансфицированных клетках на 9-ый день.

5. Усиление экспрессии VEGF под действием инсулина. Эту причину можно исключить, так как культивирование клеток проводили в среде без добавления инсулина.

6. Активация различных сигнальных путей под действие разных факторов. Например, активация пути NFkB при спонтанной остеогенной дифференцировке МСК. Или активация каскада реакций NFkB или ЕгЬВ под действием усиления экспрессии факторов роста клетками.

Основные причины, которые могли бы привести к повышению экспрессии

VEGF, в данной работе были исключены. Остались лишь маловероятные, выяснение которых требует проведения дополнительных исследований.

В работе удалось показать возможность повышения уровня экспрессии VF.GF в культуре МСК в 5-6 раз после трансфекции такими безопасными методами, как липофекция и электропорация. Достаточно ли такого повышения экспрессии для регистрируемого и значимого терапевтического эффекта необходимо выяснять в исследованиях in vivo. Согласно литературным данным при аденовирусной трансфекции VEGFI65 в МСК и последующей трансплантации в зону ишемии, для терапевтического эффекта необходимо 15-тикратное превышение экспрессии в трансфицированных клетках, по отношению к контрольным значениям (Gao F., 2007). По другим данным, трансфекция задотелиальных прогениторных клеток схожим вектором с VEGF165 приводит лишь к 2-хкратному повышению экспрессии, но даже этого уровня достаточно для усиления роста сосудов (Meng Q.Y., 2010). Таким образом, результаты нашего исследования свидетельствуют о возможности разработки клинических протоколов подготовки трансфицированных невирусными методами МСК, способных продуцировать повышенные количества ангиогенных факторов.

Анализ метилирования промотора плазмиды

Данные по элиминации плазмиды из МСК указывают на то, что даже на 9-ый день в клетках определяется плазмида, однако уровни эхспрессии гена VEGF не везде повышаются. Более того, данных за корреляцию содержания плазмид в клетках и уровня экспрессии не получено. Поэтому возникает вопрос, не оказывает ли влияние на уровень экспрессии метилирование CMV-промотора. Известно, что метилирование играют ключевую роль в инактивации чужеродной ДНК.

Было проведено исследование метилирования CpG-островка CMV-промотора используемой генетической конструкции. В этом исследовании оценивали только метилирование в пределах выбранного CpG-островка.

Вопреки ожиданиям, сформированным после изучения литературы, усиление метилирования обнаружено не было. На рис. 5 представлена нуклеотидная последовательность образца ДНК, выделенного на 6-ой день после липофекции. На участке ДНК протяженностью 35 п.н. расположено 6 CpG-динуклеотидов, ни один из которых не метилирован. Данный участок выбран как показательный в качестве демонстрации того, как выглядели все последовательности образцов ДНК, выделенных из трансфицированных клеток на разных сроках.

] 1 1 I I 1 1 ■ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I 1 1 I 1 111)1111 1(1 6 т е т т е т г т т в т е а т е т а т е о с л где а т а т а т е т ст : л м » т « а • V 1 1 Г . г

1 / ' / / / ' ШшШм 11 'МШ

Рис. 5. Нуклеотидная последовательность образца ДНК, выделенного на 6-ой день после липофекции. Стрелками указано положение СрО-динуклеотидов.

В этом исследовании мы обнаружили лишь незначительное частичное метилирование нескольких Срв-пар (см. табл. 5).

Таблица 5. Метилирование СрО-динуклеотидов СМУ-промотора после липофекции. С - цитозин, Т - тимин

№ СрС-нары 1-ый день 3-ий день 6-ой день Отрицательный контроль Положительный контроль

2 Т С Т т С

5 Т Т т т С

6 т Т т т с

7 т Т т т с

10 т Т т т с

16 т т с т с

17 т т т т с

Как следует из табл. 5, на 3-ий и 6-ой день после липофекции отмечено метилирование одного Срв-сайта (2-го и 16-го, соответственно). На наш взгляд, такой уровень метилирования не должен оказывать существенного влияния на экспрессию гена, который контролируется СМУ-промотором.

В нашей работе проведена также оценка метилирования 4-х Срв-пар (2-ой, 5-ой, 6-ой и 7-ой). в Срв-островке СМУ-промотора на 1-ый, 3-ий и 6-ой дни после электропорации. Степень бисульфитной конверсии для образцов от 1-го и 3-го дней составила 100%, для образца 6-го дня - 92,3%.

Данные по метилированию представлены в табл. 6.

Таблица 6. Метилирование СрО-динуклеотидов СМУ-промотора после злектропорации. С - цитозкн, Т - тимин

А» СрС-пары 1-ый день 3-ий день 6-ой день Отрицательный контроль Положительный контроль

2 С С С Т С

5 т Т Т Т С

6 т т т Т С

7 т т С т С

Как следует из табл. 6, СрО-динуклеотиды СМУ-промотора лишь незначительно подвержены метилированию. Обращает на себя внимание тот факт, что метилирование обнаружено в том же 2-ом СрО-сайте, что и после липофекции. Оба раза в положении этого динуклеотида различали 2 пика (тиминовый и цитозиковый), что говорит в пользу частичного метилирования. Выявленный уровень метилирования, скорее всего, не должен отразиться на функционировании генетической конструкции.

Таким образом, на разных культурах, трансфицированных разными методами, нами получены результаты, свидетельствующие о незначительном частичном метилировании отдельных СрО-динуклеотидов. На наш взгляд, этих данных достаточно, чтобы сделать вывод о том, что метилирование СМУ-промотора не играет существенной роли в низкой экспрессии гена УЕСР.

Подводя итог всем исследованиям, проведенным в рамках этой работы, можно заключить, что липофекция и электропорация малоэффективны при трансфекции МСК плазмидой с геном УЕСР. Эффективность этих методов не превышает 10%. В каждую клетку попадает небольшое количество плазмид, недостаточное для сильного повышения экспрессии гена УЕСР. Однако в работе отмечено повышение уровня экспрессии K£GF в трансфицированных культурах к 9-му дню после трансфекции, что свидетельствует функционировании введенной плазмиды. Полученное пятикратное повышение, по данным литературы, может быть достаточным для оказания терапевтического эффекта Таким образом, даже такие малоэффективные методы трансфекции, как липофекция и электропорация, могут составить конкуренцию высокоэффективным вирусным методам трансфекции МСК. Очевидная безопасность первых в сочетании с терапевтически достаточным повышением экспрессии целевых генов заставляет продолжать разработки более эффективных вариантов их применения. Например, для усиления экспрессии трансфицированых

конструкций перспективным представляется использование полимеров. Так, показано, что применение полимера Плуроник Р85 при трансфекции увеличивает экспрессию трансгена в миоцитах, макрофагах и некоторых других клетках (Gaymalov Z.Z., 2009) за счет увеличения попадания плазмид в клетки и их транспорта (Pitard В., 2002) и за счет усиления транскрипции (Sriadibhatla S., 2006). Исследований по трансфекции МСК с полимерами не так много, по уже можно говорить об их противоречивости. При трансфекции МСК человека использование поликатиогаюпз полимера полиэтиленимина (PEI) существенно усиливает экспрессию хоцдрогенных факторов (Park J.S., 2011). По другим же сведениям, PEI более эффективны в отношении клеток НЕК293, чем в МСК (Кудряшова Н.В., 2010). В любом случае, применение полимеров для трансфекции МСК - малоизученная область, требующая проведения многих разносторонних исследований.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены индивидуальные различия между культурами МСК в результативности трансфекции и динамике элиминации плазмид pS450VEGFI21 из клеток.

2. К 3-му дню количество плазмид, трансфицированных липофекцией и электропорацией, снижается (р<0,05), после чего с 3-го по 9-ый день не изменяется.

3. Липофекция и электропорация не отличаются друг от друга по результативности и динамике элиминации плазмид из трансфицированных клеток.

4. Уровни экспрессии VEGF в половине культур МСК, трансфицированных липофекцией или электропорацией, повышаются; максимальный (в 5-6 раз) эффект наблюдается к 9-му дню.

5. Уровень экспрессии VEGF не связан со степенью метилирования промоторной области трансфицированной плазмиды введенного гена.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Смирнихииа С. А., Лавров А. В. Методы оценки метилирования остатков цитозина в ДНК // Молекулярная биология. - 2009. - Т. 43, №3. - С. 387-391.

2. Смирнихииа С. А., Лавров А. В. Оценка метилирования трансфицированной в мезенхимные стволовые клетки человека плазмиды с геном VEGF121 // Медицинская генетика (тезисы докладов молодых ученых). - 2009. - Т. 8,№12.-С. 31.

3. Смнрнихина С. А., Лавров А. В. Эффективность электропорации и динамика элиминации плазмиды после трансфекции МСК человека // Медицинская

генетнка (материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков). -2010.-С. 167.

4. Лавров А. В., Смырнихина С. А. Гетерогенность ядер и пролифератизный потенциал МСК-подобных клеток в культуре стромально-васкулярной фракции жировой ткани // Цитология. - 2010. - Т. 52, № 8. - С. 616-620.

5. Смнрнихина С. А. Экспрессия генов, трансфицированных в мезенхимные стволовые клетки человека // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2010. - Т.5, № 4. - С. 16-23.

6. Смнрнихина С. А., Лавров А. В., Бочков Н. П. Динамика элиминации плазмид и экспрессии гена VEGF121, трансфицированного в МСК человека разными методами // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2011. - № 1. - С. 1721.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДИ - доверительный интервал ДНК—дезоксирибонуклеиновая кислота кДНК - комплементарная ДНК мРНК - матричная РНК

МСК - мультипотектные мезенхимные стромальные клетки

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

b-FGF - фактор роста фибробластсв ß (от англ. fibroblast growth factor) CMV - шггомегаловирус (здесь промотор плазмиды) (от англ. cytomegalovirus) DsRed - ген красного флюоресцентного белка, выделенного из-дискосомы (от англ. Discosoma sp. red fluorescent protein)

GAPDH - ген, кодирующий глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу (от англ. g!yceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)

GFP - ген зеленого флюоресцентного белка (от англ. green fluorescent protein) PEI - полиэтиленимин

VEGF121 - ген фактора роста эндотелия сосудов 121 (от англ. vascular endothelial growth factor)

YFP - ген желтого флюоресцентного белка (от англ. yellow fluorescent protein)

Подписано в печать:

28.03.2011

Заказ № 5237 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Смирнихина, Светлана Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цель и задачи исследования.

1.3. Научная новизна.

1.4. Теоретическая и практическая значимость.

1.5. Положения, выносимые на защиту.

1.6. Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации.

1.7. Апробация работы.

1.8. Публикации.

1.9. Структура и объем диссертации.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Трансфекция МСК.

2.2. Анализ функции трансфицированных генов.

2.3. Влияние трансфекции на состояние стволовых клеток морфология, пролиферация).

2.4. Механизмы регуляции экспрессии трансфицированных генов.

2.5. Способы регуляции экспрессии трансфицированных генов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оценка трансфекции гена VEGF121 в мультипотентные стромальные клетки человека невирусными методами"

1.1. Актуальность проблемы

Клеточная терапия с использованием мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека (МСК) считается одним из наиболее перспективных направлений медицины. МСК сейчас используют практически во всех областях медицины: от пластической хирургии до возмещения больших дефектов тканей и органов [Riordan N. H. et al, 2009; Psaltis P. J. et al, 2008; Yoshimura K. et al, 2008; Schaffler A., Buchler C., 2007; Пальцев M.A., 2009].

Использование МСК в регенеративной медицине неслучайно. Эти клетки есть у каждого человека, и их достаточно просто выделить и культивировать. МСК содержатся в костном мозге, жировой ткани, пуповинной крови и почти во всех органах. При аллотрансплантации МСК относительно неиммуногенны и даже отмечено, что они могут незначительно подавлять иммунный ответ реципиента, что позволяет им длительно выживать после введения для оказания терапевтического эффекта [Le Blanc К. et al, 2004].

Помимо всех выше перечисленных достоинств, МСК экспрессируют широкий спектр цитокинов и факторов роста, которые оказывают паракринные эффекты: осуществляют иммуномодуляцию и трофику [Sadan О., Melamed Е., Offen D., 2009], стимулируют гемопоэз in vitro [Pittenger M. F. et al, 1999; Majumdar M. K. et al, 1998; Парфенова E.B., Ткачук В. A., 2000]. Также есть данные, что МСК оказывают проангиогенный эффект, причем у МСК, выделенных из жировой ткани, он выше, чем у МСК из костного мозга [Kim Y. et al, 2007]. Кроме того, МСК усиливают неоангиогенез за счет дифференцировки в эндотелиальные клетки и выделения множества ангиогенных факторов, таких как VEGF, bFGF и ангиопоэтин-1 [Al-Khaldi A. et al, 2003; Lee J. В. et 7 а1, 2006; Kaigler Б. ег а1, 2003; Бокерия Л.А. с соавт., 2006]. Все вышеперечисленное позволяет применять МСК для лечения ишемических состояний нижних конечностей и сердца.

Кроме того, есть данные о том, что введение в очаг ишемии генно-инженерных конструкций с факторами ангиогенеза, такими, например, как УЕОЕ (эндотелиальный фактор роса сосудов), также может приводить к усиленному росту сосудов [Константинов Б.А. с соавт., 2005; Бочков Н.П. с соавт., 2006; Бочков Н.П., Воронов Д.А., 2010], что с успехом используется в комплексной терапии ишемических состояний.

С целью большей стимуляции роста новых сосудов целесообразно совместить оба метода, т.е. трансплантировать МСК, трансфицированные генами ангиогенеза, в частности УЕОЕ. В литературе описаны положительные примеры такого подхода. Наиболее безопасными методами трансфекции являются невирусные методы - липофекция и электропорация, так как лишены многих побочных эффектов вирусных методов (инсерционный мутагенез, иммунологические осложнения). В отношении трансфекции МСК имеются противоречивые сведения об эффективности невирусных методов и о степени повышения уровня экспрессии трансгена. С целью разработки оптимальных протоколов трансфекции необходимо проведение серии экспериментов с использованием плазмиды с геном УЕОЕ.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Смирнихина, Светлана Анатольевна

ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ

1. Выявлены индивидуальные различия между культурами МСК в результативности трансфекции и динамике элиминации плазмид р3450УгЕОП21 из клеток.

2. К 3-му дню количество плазмид, трансфицированных липофекцией и электропорацией, снижается (р<0,05), после чего с 3-го по 9-ый день не изменяется.

3. Липофекция и электропорация не отличаются друг от друга по результативности и динамике элиминации плазмид из трансфицированных клеток.

4. Уровни экспрессии УЕСЕ в половине культур МСК, трансфицированных липофекцией или электропорацией, повышаются; максимальный (в 5-6 раз) эффект наблюдается к 9-му дню.

5. Уровень экспрессии УЕСЕ не связан со степенью метилирования промоторной области трансфицированной плазмиды введенного гена.

2.6. Заключение

Как видно из анализа литературы, МСК сами по себе оказывают положительное действие на организм, однако этого действия бывает недостаточно для эффективного репаративного процесса. Поэтому было предложено использовать трансфекцию с целью усиления терапевтических эффектов (например, для лечения ишемической болезни нижних конечностей). Показано, что трансфицированные определенными факторами МСК оказывают больший эффект, чем нетрансфицированные. Однако трансфекция МСК не так широко используется, как трансфекция других клеток. Это связано, прежде всего, с трудностями культивирования и с тем, что МСК труднее трансфицировать. Поэтому еще не до конца изучены механизмы и поведение МСК после трансфекции. Разработка этого направления безусловно перспективна.

При транзиторной трансфекции со временем генетическая конструкция элиминируется из клетки, с этим, в основном, связывают отсутствие продукта трансгена. Однако на различных типах клеток доказано, что здесь также оказывают влияние эпигенетические процессы, происходящие в клетке по отношению к введенной конструкции. По МСК таких данных нет, это подчеркивает новизну темы.

Основными механизмами эпигенетической регуляции трансгена являются метилирование ДНК и деацетилирование гистонов. Эти процессы взаимосвязаны, поэтому доказав наличие одного из них, можно с большой вероятностью утверждать и о наличии другого. Существуют пути увеличения экспрессии введенного гена в результате эпигенетических процессов. Это применение деметилирующих агентов и блокаторов гистоновых деацетилаз, которые оказывают довольно сильное положительное действие, но очень токсичны для организма, а некоторые из них, к тому же, потенциально онкогенны.

Таким образом, анализ литературы показывает, что имеются

32 противоречивые сведения о результативности, динамике элиминации и экспрессии генетических конструкций, трансфицированных невирусными методами в МСК человека, метилирование трансфицированных плазмид в МСК не изучалось.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы исследования

Программы для компьютерного анализа

Расчеты относительного количества плазмид и мРНК VEGF121 производились с использованием программного обеспечения амплификатора CFX96 (Bio-Rad, США). Предсказание расположения CpG-островков в CMV-промоторе генетической конструкции и подбор праймеров производился с использованием программы MethPrimer, доступной по адресу в Интернете http://www.urogene.org/methprimer/indexl .html. Степень бисульфитной конверсии определялась программой QUMA (http://quma.cdb.riken.jp). Для анализа нуклеотидных последовательностей использовали программу Sequence Scanner v. 1.0 (Applied Biosystems, США). Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программ Statistica 6.0 (StatSoft) и Microsoft Excel (Microsoft, США).

Оборудование

В работе использовали центрифуги Eppendorf (Германия) и Jouan (Франция); инвертированный микроскоп Olympus (Япония); С02-инкубатор RS Biotech (New Brunswick Scientific, Великобритания); морозильники Liebherr (Германия) и Sanyo (Япония); автоматические пипетки и дозаторы Eppendorf (Германия), Ленпипет (Россия); электропоратор Eppendorf (Германия); термостаты BioSan (Латвия) и Binder (Германия); шейкеры Eppendorf (Германия) и BioSan (Латвия); аналитические весы Sartorius (Россия) и Ohaus (США); спектрофотометр Eppendorf (Германия); дистиллятор (Россия); источник постоянного тока Pharmacia (Швеция); электрофорезные камеры Хеликон (Россия); трансиллюминатор (Франция); секвенатор Applied Biosystems (США); рН

34 метр Mettler Toledo (Италия), амплификаторы Bio-Rad (США), Eppendorf (Германия), ДНК-технология (Россия), проточный цитометр Flowmax (Partee, Германия).

Ферментные препараты

В работе использовании следующие ферментные препараты: коллагеназа I (ПанЭко, Россия), DNase, Hinálll (Promega, Германия), М-MuLV, EcoBl, M.SssI (СибЭнзим, Россия), Taq-полимераза (Синтол и ДНК-Синтез, Россия) - в условиях, рекомендованных изготовителем.

Реактивы и расходные материалы

В работе использовали неорганические соли отечественного производства (Хеликон, ПанЭко; Россия) категорий «ОСЧ» и «ХЧ», а также фирмы «Sigma» (США). Все реактивы использовались без предварительной очистки. Олигонуклеотиды синтезированы биотехнологическими фирмами «ДНК-Синтез» и «Синтол» (Россия).

В работе использовали пластиковую посуду и расходные материалы европейских и американских производителей.

Культуры клеток

Культуры МСК-1 и МСК-2 были выделены из жировой ткани доноров женского пола, полученной в ходе плановой хирургической операции. От доноров были получены информированные согласия на использование клеток в эксперименте. Культуры МСК-3 - МСК-7 были любезно предоставлены лабораторией генетики стволовых клеток МГНЦ РАМН (руководитель - Д.В. Гольдштейн). Источник тот же - жировая ткань.

Прописи растворов, примененных в работе 1. PBS (1х)

1.7шМ дигидрофосфат калия (КН2РО4),

35

5.2mM гидроортофосфат натрия (Na2HP04), 150шМ хлорид натрия (NaCl)

2. GTB-буфер

4М гуанидин тиоционат, 25шМ цитрат натрия (рН 7.0), 0.5% N-лауроилсаркозин натрия, 0.1М Ь-меркаптоэтанол.

3. Тризол 1 мл GTB,

0,1 мл 2М ацетат натрия (рН 4.0), 1 мл водонасыщенного фенола.

4. ТВЕ(Юх) 0,89М Tris-base 0,89М борной кислоты 0,02М ЭДТА (рН 8.0)

3.2. Методы исследования

Культуры клеток

Культуры клеток выделяли из жировой ткани. Кусочки жировой ткани трижды промывали раствором PBS, добавляли равный объем коллагеназы I (0,3 Ед/мл) и инкубировали 1 час при 37°С, периодически помешивая. После чего нейтрализовали фермент полной ростовой средой (15 мл) и центрифугировали 10 минут на 2 тыс. об/мин. Осадок ресуспендировали в ростовой среде и культивировали в чашках Петри или флаконах 25-см в полной ростовой среде: DMEM7F12 (ПанЭко, Россия), 10% FBS (Perbio HyClone, США), гепарин 8 Ед/мл (ПанЭко, Россия), L-глутамин 2мМ (ПанЭко, Россия), FGF-b Юнг/мл (ПанЭко, Россия), пенициллин/стрептомицин (ПанЭко, Россия) — при температуре 37°С и содержании СО2 5%. После выделения клеток культуральную среду

36 меняли через сутки и далее каждые 3-4 дня.

Культуры МСК-3 - МСК-7 были любезно предоставлены лабораторией генетики стволовых клеток МГНЦ РАМН. Иммунофенотипирование и дифференцировка этих культур клеток проводилась там же.

Дифференцировка клеток в адипогенном направлении

МСК (9-ый пассаж) культивировали в полной ростовой среде до конфлюентности 60-70%, после чего в среду добавляли 100 мкМ индометацина, 1 мкМ дексаметазона, 0,5 мкМ 1-метил-З-изобутилксантина и 10 мкг/мл инсулина и культивировали 20 дней, среду меняли каждые 3-4 дня. После культивирования клетки были фиксированы в метаноле и окрашены красителем Oil Red О (3 мг/мл Oil Red О в 60%-ном растворе изопропанола) в течение 15 минут.

Дифференцировка МСК в остеогенном направлении

МСК (7-ой пассаж) культивировали в полной ростовой среде до конфлюентности 60-70%, после чего в среду добавляли 50 мкМ L-аскорбиновой кислоты фосфата, 10 мМ бета-глицерофосфата и 100 нМ дексаметазона и культивировали 17 дней, среду меняли каждые 3-4 дня. После культивирования клетки были фиксированы в метаноле и окрашены красителем Alizarin Red (2% Alizarin Red в 0.1M NH4OH; pH 5.4) в течение 15 минут.

Иммунофенотипирование клеток

Клетки дважды промывали раствором PBS, добавляли 0,2% раствор ЭДТА в PBS и инкубировали 10 минут, ЭДТА нейтрализовали равным объемом полной ростовой среды и центрифугировали 5 минут при 1000 rpm. Клеточный осадок ресуспендировали в PBS до конечной концентрации 10 млн./мл. На 1 млн. клеток добавляли 5 мкл

37 флюоресцентно окрашенных антител (CD44, CD73, CD 105, CD 14, CD 19), перемешивали на вортексе и инкубировали 30 минут на льду. Далее промывали раствором PBS и центрифугировали 5 минут при 2000 rpm, ресуспендировали в 500 мкл 1%-ного формальдегида и оценивали флюоресценцию на проточном цитометре (Flowmax, Partee, Германия).

Трансфекция

Трансфекцию проводили плазмидой с геном VEGF121 (pS450VEGF121), регулируемым CMV-промотором (рис. 2), любезно предоставленной профессором Б.С. Народицким (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи Минздравсоцразвития РФ). Условия трансфекции были оптимизированы с помощью плазмиды pEYFP-Cl (Clontech, США) (рис. 3).

Клетки (4-7-ой пассаж) в количестве 105 ресуспендировали в 100 мкл буфера для электропорации (Eppendorf, Германия) и проводили электропорацию - 400В/мм, 55мкс с использованием электропоратора Multiporator (Eppendorf, Германия), после чего рассевали по лункам 6-ти луночных планшетов или во флаконы 25см . Липофекцию с помощью Унифектина-56 (Unifect Group, Россия) проводили в культурах клеток конфлюентных до 60-70%. Соотношение Унифектина и плазмиды - 12 Ед.:6 мкг на чашку Петри диаметром 10см или культуральный флакон О

25см . После обоих способов трансфекции среду меняли на следующий день, далее каждые 3-4 дня.

Выделение ДНК

На 1-е, 3-й, 6-е и 9-е сутки после трансфекции клетки промывали дважды раствором PBS, добавляли раствор трипсин-ЭДТА (ПанЭко, Россия), инкубировали 10 минут при 37°С, добавляли равный объем полной ростовой среды и центрифугировали 5 минут при 1,5 тыс. об/мин. Осадок дважды промывали PBS и считали количество клеток в камере Горяева. Выделение ДНК проводили с помощью набора «ДНК-Сорб-АМ»

38

ИнтерЛабСервис, Россия) по рекомендованному производителем протоколу. Образцы растворяли в ТЕ-буфере и хранили при X -20°С. iVcol (7191) Pcmv

Т7

Ilindlll (17)

100 m.u. CELO s

JJmdlII (6469) ApálÁ (6247)

P(BLA)

ApalA (5750) дрг i

Щ/ \

Clal (50)

Ncol (145) VEGF121

Clal (521) pS415VEGF121

7475 bp

ApaLl (4504), A

ORI P(LAC) ficoRI (3834)

Sitial (3820) Лиа1(з818) Xmaí (3818) BamHl (3813) Я % ж 4

Aval {702) BGH pA

Clal (1318)

JJcoRl (2194) 88,8 m.u, CELO

Рис. 2. Плазмида pS450VEGF121. Ncol, Hind III, Clal, Aval, ЕсоШ, Smál, Xmal, BamHl, ApaLl — сайты рестрикции соответствующих ферментов; Pcmv - цитомегаловирусный промотор; Т7 — промотор Т7; VEGF121 - кДНК гена эндотелиального фактора роста сосудов; BGH -телячий гормон роста; 88,8 m.u. CELO и 100 m.u. CELO - фрагмент генома аденовируса CELO от 88,8 до 100 ед. карты; P(LAC) - последовательность лактозного промотора; P(BLA) — последовательность промотора (3-лактамазы; ORI - точка начала репликации; АРГ - ген устойчивости к ампициллину; bp - пар оснований.

ЕсоОт I

3854)

Nhe I (592) Ecoßtl HI (597) Аде I (601)

BSPG I (1323)

MOS

1330-1417)

AfiW (1638)

Рис. 3. Плазмида pEYFP-Cl. P CMV - цитомегаловирусный промотор; P SV40 - промотор SV40; P f 1 - промотор; EYFP - кДНК гена усиленного желтого флюоресцентного белка; ori - точка начала репликации; pUC - сайт начала плазмидной репликации; MCS — сайт множественного клонирования; Asel, Nhel, EcoAlWl, Agel, BsrGl, Aflll, Stul, EcoOl 091 - сайты рестрикции соответствующих ферментов; Kanr — ген устойчивости к канамицину; Neor - ген устойчивости к неомицину; HSV ТК - тимидинкиназа вируса простого герпеса; kb - тысячи пар оснований.

Выделение РНК

Клетки снимали с флаконов и чашек Петри, как описано выше. К клеточной суспензии добавляли 2,5 мл тризола и 0,5 мл хлороформа, перемешивали на вортексе и центрифугировали 20 мин. при 4°С на 4000 об/мин. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку, добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ и также центрифугировали. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку, добавляли равный объем ледяного

40 изопропанола и инкубировали при -20°С не менее часа. Далее центрифугировали 20 минут при 4°С на 12 тыс об/мин. Осадок растворяли в 0,3 мл GTB-буфера, переносили в новую пробирку, добавляли равный объем ледяного изопропанола и инкубировали не менее 30 минут при -20 С, после чего центрифугировали 20 минут (4°С, 12 тыс об/мин). К осадку добавляли 1 мл 75%-ного этанола и инкубировали при комнатной температуре 15 минут, центрифугировали 10 минут (4°С, 12 тыс об/мин). Осадок подсушивали на воздухе и растворяли в 100 мкл MilliQ. После этого проводили обработку DNase (Promega, Германия) по рекомендованному производителем протоколу.

Отрицательные контроли трансфекции

Из нетрансфицированных образцов всех культур выделяли ДНК и РНК, как описано выше.

Синтез кДНК

Реакция обратной транскрипции проводилась с помощью фермента M-MuLV (СибЭнзим, Россия) по протоколу, рекомендованному производителем.

ПЦР в реальном времени

В реакционную смесь (25 мкл), содержащую 300 нМ праймеров, 200 мкМ дНТФ, 3 мкМ Mg2+, lxSYBR Green I (Invitrogene, США) и 0,04 Ед. Taq-полимеразы, вносили по 5 мкл ДНК. ПЦР в реальном времени проводили на приборе CFX96 (Bio-Rad, США). Условия реакции: 95°С - 3 мин, 45х(95°С - 5 сек, 60°С - 10 сек, 72°С - 20 сек). Использованные праймеры представлены в табл. 1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Смирнихина, Светлана Анатольевна, Москва

1. Авдеева С. В. Создание рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих гены факторов роста кровеносных сосудов и изучение влияния этих вирусов на ангиогенез in vivo: Дис. . канд. биол. наук. Москва. 2005.-141 с.

2. Биология стволовых клеток и клеточные технологии в 2 т. Под ред. Пальцева М.А. М.: Медицина, 2009, 728 с.

3. Бочков Н. П. Клеточная терапия в свете доказательной медицины // Клиническая медицина. 2006. - Т. 3, № 10. - с. 4-10.

4. Бочков Н. П., Воронов Д. А. Генотерапия в лечении сердечнососудистых заболеваний: фундаментальные основы, терапевтический потенциал, современное состояние и перспективы // Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. — 2010. Т. 3, № 3. - с. 4-11.

5. Бочков Н. П., Никитина В. А., Рослова Т. А., Чаушев И. Н., Якушина И. И. Клеточная терапия наследственных болезней // Вестник РАМН. 2008. - №10. - с. 20-28.

6. Кочегура Т. Н., Ефименко А. Ю., Акопян Ж. А., Парфенова Е. Е. Клеточная терапия сердечной недостаточности: клинический опыт, проблемы и перспективы // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010. - Т. V, № 2. - с. 11-18.

7. Парфенова Е. В., Ткачук В. А. Перспективы генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний // Вопросы медицинской химии. 2000. Т. 46, №3.- с. 293-310.

8. Al-Khaldi A., Al-Sabti Н., Galipeau J., Lachapelle К. Therapeutic angiogenesis using autologous bone marrow stromal cells: improved blood flow in a chronic limb ischemia model // Ann Thorac Surg. 2003. - № 75. - p. 204209.

9. Bahadori M. New Advances in RNAs // Arch Iranian Med. 2008. -№ 11(4).-p. 435-443.

10. Baksh D., Yao R., Tuan R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow // Stem Cells. 2007. - № 25(6). - p. 1384-1392.

11. Balyasnikova I. V., Franco-Gou R., Mathis J. M., Lesniak M. S. Genetic modification of mesenchymal stem cells to express a single-chain antibody against EGFRvIII on the cell surface // J Tissue Eng Regen Med. -2009. Article online.

12. Bangari D. S., Mittal S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity // Curr Gene Ther. 2006. - № 6. - p. 215226.

13. Bestor T. H. Gene silencing as a threat to the success of gene therapy // J Clin Invest. 2000. - № 105. - p. 409-411.81

14. Bosch P., Pratt S. L., Stice S. L. Isolation, Characterization, Gene Modification, and Nuclear Reprogramming of Porcine Mesenchymal Stem Cells // Biology of Reproduction. 2006. - № 1 (vol. 74). - p. 46-57.

15. Bushman F., Lewinski M., Ciuffi A., Barr S., Leipzig J., Hannenhalli S., Hoffmann C. Genome-wide analysis of retroviral DNA integration // Nat Rev Microbiol. 2005. -№ 3. - p. 848-858.

16. Cao F., Xie X., Gollan T., Zhao L., Narsinh K., Lee R. J., Wu J. C. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells // Mol Imaging Biol.- 2010. -№ 12(1).-p. 15-24.

17. Chan J., O'Donoghue K., de la Fuente J., Roberts I. A., Kumar S., Morgan J. E., Fisk N. M. Human fetal mesenchymal stem cells as vehicles for gene delivery // Stem Cells. 2005. - № 23. - p. 93-102.

18. Chelobanov B. P., Laktionov P. P., Vlasov V. V. Proteins involved in binding and cellular uptake of nucleic acids // Biochemistry (Mosc). 2006. -№71 (6).-p. 583-596.

19. Cheng J. C., Matsen C. B., Gonzales F. A., Ye W., Greer S., Marquez V. E., Jones P. A., Selker E. U. Inhibition of DNA methylation and reactivation of silenced genes by zebularine // J. Natl. Cancer Inst. 2003. - № 95. - p. 399409.

20. Cheng L., Ziegelhoffer P. R., Yyang N-S. In vivo promoter activity and transgene expression in mammalian somatic tissues evaluated by usingparticle bombardment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. - c. 4455-4459.

21. Cheng T., Xu C. Y, Wang Y. B., Chen M., Wu T., Zhang J., Xia N. S. A rapid and efficient method to express target genes in mammalian cells by baculovirus // World J Gastroenterol. 2004. - № 10 (11). - p. 1612-1618.

22. Christiano R. Viral and non-viral vectors for cancer gene therapy // Anticancer Res. 1998. - № 18. - p. 3142-3246.

23. Cohen R. N., van der Aa M. A. E. M., Macaraeg N., Lee A. P., Szoka F. C. Jr. Quantification of Plasmid DNA Copies in the Nucleus after Lipoplex and Polyplex Transfection // J Control Release. 2009. - 135(2). - p. 166-174.

24. Cudkowicz G., Upton A. C., Smith L. H.5 Gosslee D. G., Hughes W. L. An Approach to the Characterization of Stem Cells in Mouse Bone Marrow // Ann N Y Acad Sci. 1964. - № 114. - p. 571-585.

25. Di Ianni M., Terenzi A., Perruccio K., Ciurnelli R., Lucheroni F., Benedetti R., Martelli M. F., Tabilio A. 5-Azacytidine prevents transgene methylation in vivo // Gene Therapy. 1999. - № 4(6). - p. 703-707.

26. Engler C., Kelliher C., Wahlin K. J., Speck C. L., Jun A. S. Comparison of non-viral methods to genetically modify and enrich populations of primary human corneal endothelial cells // Mol Vis. 2009. - № 15. - p. 629637.

27. Escher G., Hoang A., Georges S., Tchoua U., El-Osta A., Krozowski Z., Sviridov D. Demethylation using the epigenetic modifier, 5-azacytidine,increases the efficiency of transient transfection of macrophages // J. Lipid Res. 2005. - № 46. - p. 356-365.

28. Fazzari M. J., Greally J. M. Epigenomics: beyond CpG islands. // Nat. Rev.Genet. 2004. - № 5. - p. 446^55.

29. Finnin M. S., Donigian J. R., Cohen A., Richon V. M., Rifkind R. A., Marks P. A., Breslow R., Pavletich N. P. Structures of a histone deacetylase homologue bound to the TSA and SAHA inhibitors // Nature. 1999. - № 401. -p. 188-193.

30. Flotte T. R. Gene therapy: The first two decades and the current state-of-the-art // J Cell Physiol. 2007. - № 213. - p. 301-305.

31. Gaetano C., Catalano A., Palumbo R., Illi B., Orlando G., Ventoruzzo G., Serino F., Capogrossi M. C. Transcriptionally active drugs improve adenovirus vector performance in vitro and in vivo // Gene Therapy. — 2000. — №7.-p. 1624-1630.

32. Gaymalov Z. Z., Yang Z., Pisarev V. M., Alakhov V. Y., Kabanov A. V. The effect of the nonionic block copolymer pluronic P85 on gene expression in mouse muscle and antigen-presenting cells // Biomaterials. 2009. - 30(6). -p. 1232-45.

33. Gheisari Y., Soleimani M., Azadmanesh K., Zeinali S. Multipotent mesenchymal stromal cells: optimization and comparison of five cationic polymer-based gene delivery methods // Cytotherapy. 2008. - 10(8). - p. 81523.

34. Gottfried O. N., Dailey A. T. Mesenchymal Stem Cell And Gene Therapies For Spinal Fusion // Neurosurgery. 2008. - № 63. - p. 380-392.

35. Gwak, S. J., Kim, B. S. Poly(lactic-co-glycolic acid) nanosphere as a vehicle for gene delivery to human cord blood-derived mesenchymal stem cells: comparison with polyethylenimine // Biotechnol Lett. 2008. — № 30(7). — p. 1177-1182.

36. Haleem-Smith H., Derfoul A., Okafor C., Tuli R., Olsen D., Hall D. J., Tuan R. S. Optimization of high-efficiency transfection of adult human mesenchymal stem cells in vitro // Mol Biotechnol. 2005. - № 30. - p. 9-20.

37. Hamm A., Krott N., Breibach I., Blindt R., Bosserhoff A. K. Efficient transfection method for primary cells // Tissue Eng. 2002. - № 8. - p. 235245.

38. He J., Yang Q., Chang L. J. Dynamic DNA methylation and histone modifications contribute to lentiviral transgene silencing in murine embryonic carcinoma cells // J Virol. 2005. - № 79(21). - p. 13497-13508.85

39. Helledie T., Nurcombe V., Cool S. M. A simple and reliable electroporation method for human bone marrow mesenchymal stem cells // Stem Cells Dev. 2008. - № 17(4). - p. 837-848.

40. Hung S.-C., Lu C.-Y., Shyue S.-K., Liu H.-C., Hob L. L.-T. Lineage Differentiation-Associated Loss of Adenoviral Susceptibility and Coxsackie-Adenovirus Receptor Expression in Human Mesenchymal Stem Cells // Stem Cells.-2004.-№22.-p. 1321-1329.

41. Iversen N., Birkenes B., Torsdalen K., Djurovic S. Electroporation by nucleofector is the best nonviral transfection technique in human endothelial and smooth muscle cells // Genet Vaccines Ther. 2005. - № 3(1). - p. 2.

42. Jones P. A., Taylor S. M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation // Cell. 1980. - № 20. - p. 85-93.

43. Kaigier D., Krebsbach P. H, Polverini P. J, Mooney D. J. Role of vascular endothelial growth factor in bone marrow stromal cell modulation of endothelial cells //Tissue Eng. -2003. -№ 9(1). p. 95-103.

44. Kameda T., Smuga-Otto K., Thomson J. A. A severe de novo methylation of episomal vectors by human ES cells // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006. - № 349. - p. 1269-1277.

45. Kim J. H., Park S. N., Suh H. Generation of insulin-producing human mesenchymal stem cells using recombinant adeno-associated virus // Yonsei Med J. 2007. - № 48(1). - p. 109-119.

46. Kucerova L., Altanerova V., Matuskova M., Tyciakova S., Altaner C. Adipose Tissue-Derived Human Mesenchymal Stem Cells Mediated Prodrug Cancer Gene Therapy // Cancer Research. — 2007. № 67. — p. 6304-6313.

47. Lakshmipathy U., Pelacho B., Sudo K., Linehan J. L., Coucouvanis

48. E., Kaufman D. S., Verfaillie C. M. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells // Stem Cells. 2004. -№ 22. - p. 531-543.

49. Le Blanc K., Rasmusson I., Sundberg B., Gotherstrom C., Hassan M., Uzunel M., Ringden O. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells // Lancet. — 2004. — № 363. — p. 1439-1441.

50. Lee J. B., Bae Y. C., Sung S. M., Jung J. S. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells improve postnatal neovascularization in a mouse model of hindlimb ischemia // Cell Physiol Biochem. 2006. - № 17(5-6).-p. 279-290.

51. Lee K., Majumdar M. K., Buyaner D., Hendricks J. K., Pittenger M.

52. F., Mosca J. D. Human mesenchymal stem cells maintain trangene expression during expansion and differentiation // Mol Ther. 2001. - № 3. - p. 857-866.

53. Ma L., Wang G., Li L., Feng K., Bai L., Pei X. Expression of lipofect AMINE mediated human GM-CSF eukaryotic expressing vector in HFCL cells // Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2000. - № 21(12). p. 624-627.

54. Madonna R., Willerson J. T., Geng Y. J. Myocardin a enhances telomerase activities in adipose tissue mesenchymal cells and embryonic stem cells undergoing cardiovascular myogenic differentiation // Stem Cells. — 2008. -№26(1).-p. 202-211.

55. Majumdar M. K., Thiede M. A., Mosca J. D., Moorman M., Gerson S. L. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells // J. Cell. Physiol. 1998. -№176.-p. 57-66.

56. Makino S., Fukuda K., Miyoshi S., Konishi F., Kodama H., Pan J., Sano M., Takahashi T., Hori S., Abe H., Hata J., Umezawa A., Ogawa S. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro // J Clin Invest. 1999. -№ 103(5). - p. 697-705.

57. Marshall H. M., Ronen K., Berry C., Llano M., Sutherland H., Saenz D., Bickmore W., Poeschla E., Bushman F. D. Role of PSIPl/LEDGF/p75 in Lentiviral Infectivity and Integration Targeting // PLoS ONE. 2007. - № 2. -p. el340.

58. Mclnerney J. M., Nawrocki J. R., Lowrey C.H. Long-term silencing of retroviral vectors is resistant to reversal by trichostatin A and 5-azacytidine // Gene Ther. 2000. - № 7. - p. 653-663. '

59. Mei S. H., McCarter S. D., Deng Y., Parker C. H., Liles W. C., Stewart D. J. Prevention of LPS-induced acute lung injury in mice by mesenchymal stem cells overexpressing angiopoietin 1 // PLoS Med. 2007. -№4(9).-p. e269.

60. Meng Q.Y., Li X.Q., Yu X.B., Lei F. R., Jiang K., Li C. Y. Transplantation of VEGF165-gene-transfected endothelial progenitor cells in the treatment of chronic venous thrombosis in rats // Chin Med J (Engl). — 2010. — № 123 (4).-p. 471-477.

61. Modlich U., Baum C. Preventing and exploiting the oncogenic potential of integrating gene vectors // J Clin Invest. 2009. - № 119(4). - p. 755-758.

62. Mok P. L., Cheong S. K., Leong C. F., Othman A. In vitro expression of erythropoietin by transfected human mesenchymal stromal cells // Cytotherapy. 2008. - № 10(2). - p. 116-124.

63. Morozkin E. S., Laktionov P. P., Rykova E. Y., Vlassov V. V. Extracellular nucleic acids in cultures of long-term cultivated eukaryotic cells // Ann N Y Acad Sei. 2004. - № 1022. - p. 244-249.90

64. Naldini L., Blomer U., Gallay P., Ory D., Mulligan R., Gage F. H., Verma I. M., Trono D. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector // Science. 1996. - № 272(5259). - p. 263-267.

65. Nan X., Campoy F. J., Bird A. MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin // Cell. 1997. - № 88. - p. 471-481.

66. Palmer G. D., Steinert A., Pascher A., Gouze E., Gouze J. N., Betz O., Johnstone B., Evans C. H., Ghivizzani S, C. Gene-induced chondrogenesis of primary mesenchymal stem cells in vitro // Mol Ther. 2005. - № 12(2). — p. 219-228.

67. Parolin C., Sodroski J. A defective HIV-1 vector for gene transfer to human lymphocytes // J Mol Med. 1995. - № 73(6). - p. 279-288.

68. Partridge K. A., Oreffo R. O. Gene delivery in bone tissue engineering: progress and prospects using viral and nonviral strategies // Tissue Eng. 2004. - № 10. - p. 295-307.

69. Patkin E. L. Epigenetic mechanisms for primary differentiation in mammalian embryos // Int Rev Cytol. 2002. -№ 216. - p. 81-129.

70. Paulsen M., Ferguson-Smith A. C. DNA methylation in genomic imprinting, development, and disease. // J Pathol. 2001. - № 195. - p. 97-110.

71. Pitard B., Pollard H., Agbulut O., Lambert O., Vilquin J. T., Cherel91

72. Y., Abadie J., Samuel J. L., Rigaud J. L., Menoret S., Anegon I., Escande D. A nonionic amphiphile agent promotes gene delivery in vivo to skeletal and cardiac muscles // Hum Gene Ther. 2002. - № 13(14). - p. 1767-75.

73. Pittenger M. F., Mackay A. M., Beck S. C., Jaiswal R. K., Douglas R., Mosca J. D., Moorman M. A., Simonetti D. W., Craig S., Marshak D. R. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells // Science. -1999. -№284. -p. 143-147.

74. Praznovszky T., Kereso J., Tubak V., Cserpan I., Fatyol K., Hadlaczky G. De novo chromosome formation in rodent cells // Proc Natl Acad Sci USA. 1991. - № 88(24). - p. 11042-11046.

75. Psaltis P. J., Zannettino A. C. W., Worthley S. G., Gronthosb S. Concise Review: Mesenchymal Stromal Cells: Potential for Cardiovascular Repair // Stem Cells. 2008. - № 26. - p. 2201-2210.

76. Riew K. D., Wright N. M., Cheng S., Avioli L. V., Lou J. Induction of bone fonnation using a recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene in a rabbit spinal fusion model // Calcif Tissue Int. 1998. - № 63(4).-p. 357-360.

77. Rosenqvist N., Hard Af Segerstad C., Samuelsson C., Johansen J., Lundberg C. Activation of silenced transgene expression in neural precursor cell lines by inhibitors of histone deacetylation // J. Gene Med. 2002. - № 4. - p. 248-257.

78. Sadan 0., Melamed E., Offen D. Bone-marrow-derived mesenchymal stem cell therapy for neurodegenerative diseases // Expert Opin Biol Ther. -2009. № 9(12). - p. 1487-1497.

79. Schaffler A., Buchler C. Concise Review: Adipose Tissue-Derived Stromal Cells—Basic and Clinical Implications for Novel Cell-Based Therapies // Stem Cells. 2007. - № 25. - p. 818-827.

80. Sheyn D., Pelled G., Zilberman Y., Talasazan F., Frank J. M., Gazit D., Gazit Z. Nonvirally engineered porcine adipose tissue-derived stem cells: use in posterior spinal fusion // Stem Cells. 2008. - № 26(4). - p. 1056-1064.

81. Somia N., Verma I. M. Gene Therapy: Trials and Tribulations // Nature Reviews Genetics. 2000. -№ 1(2). - p. 91-99.

82. Spizizen J., Reilly B. E., Evans A. H. Microbial transformation and transfection // Annu Rev Microbiol. 1966. - № 20. - p. 371-400.

83. Sriadibhatla S., Yang Z., Gebhart C., Alakhov V. Y., Kabanov A. Transcriptional activation of gene expression by pluronic block copolymers in93stably and transiently transfected cells // Mol Ther. 2006. - 13(4). - p. 804-13.

84. Stender S., Murphy M., O'Brien T., Stengaard C., Ulrich-Vinther M., Soballe K., Barry F. Adeno-associated viral vector transduction of human mesenchymal stem cells // Eur Cell Mater. 2007. -№ 13. - p. 93-99.

85. Tate P., Skarnes W., Bird A. The methyl-CpG binding protein MeCP2 is essential for embryonic development in the mouse // Nat Genet. 1996. - № 12.-p. 205-208.

86. Tichy P., Rytir V., Kohoutova M. Genetic transformation and transfection of Bacillus subtilis spheroplasts // Folia Microbiol (Praha). — 1968. -№ 13(6).-p. 510-514.

87. Tu Q., Valverde P., Li S., Zhang J., Yang P., Chen J. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone // Tissue Eng. 2007. - № 13(10). - p. 24312440.

88. Uchida E., Mizuguchi H., Ishii-Watabe A., Hayakawa T. Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells // Biol Pharm Bull. 2002. - № 25. - p. 891-897.

89. Valero A., Post J. N., van Nieuwkasteele J. W., Ter Braak P. M., Kruijer W., van den Berg A. Gene transfer and protein dynamics in stem cells using single cell electroporation in a microfluidic device // Lab Chip. 2008. -№ 8(1).-p. 62-67.

90. Wu M. H., Liebowitz D. N., Smith S. L., Williams S. F., Dolan M.E. Efficient expression of foreign genes in human CD34(+) hematopoietic precursor cells using electroporation // Gene Ther. 2001. - № 8(5). - p. 384390.

91. Xu Y., Mirmalek-Sani S. H., Lin F., Zhang J., Oreffo R. O. Adipocyte differentiation induced using nonspecific siRNA controls in cultured human mesenchymal stem cells // RNA. 2007. - № 13(8). - p. 1179-1183.

92. Yang J. F., Zhou W. W., Tang T., Hu J. G., Yu J. F., Yang Y. F., Zhou X. M., Hu D. X. Transfection of human VEGF165 gene into bone marrow mesenchymal stem cells in rats // Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. — 2006. № 31(3). - p. 313-318.

93. Yoshimura K., Sato K., Aoi N., Kurita M., Hirohi T., Harii K. Cell-Assisted Lipotransfer for Cosmetic Breast Augmentation: Supportive Use of Adipose-Derived Stem/Stromal Cells // Aesth Plast Surg. 2008. - № 32. - p. 48-55.

94. Zeng B., Chen H.5 Zhu C., Ren X., Lin G., Cao F. Effects of combined mesenchymal stem cells and heme oxygenase-1 therapy on cardiac performance // Eur J Cardiothorac Surg. 2008. - № 34(4). p. 850-856.

95. Zhang X. Y., La Russa V. F., Bao L., Kolls J., Schwarzenberger P., Reiser J. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells // Mol Ther. 2002. - № 5. - p. 555-565.

96. Zhang X.-Y., La Russa V.F., Reiser J. Transduction of Bone-Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells by Using Lentivirus Vectors Pseudotyped with Modified RD114 Envelope Glycoproteins // Journal of Virology. 2004. -№ 3 (78). - p. 1219-1229.