Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка токсичности буровых шламов и эколого-функциональные особенности выделенных из них микроорганизмов

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Оценка токсичности буровых шламов и эколого-функциональные особенности выделенных из них микроорганизмов"

На правах рукописи

Беляков Андрей Юрьевич

ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ БУРОВЫХ ШЛАМОВ И ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

03.02.08 - экология (биологические науки) 03.02.03 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов -2014

005558046

005558046

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» на кафедре биохимии и биофизики

Научный руководитель: Плешакова Екатерина Владимировна

доктор биологических наук, доцент

Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования

«Саратовский государственный

университет имени Н.Г. Чернышевского»,

профессор кафедры биохимии и биофизики

Официальные оппоненты: Рогачева Светлана Михайловна

доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А.»,

заведующая кафедрой природной и техносферной безопасности»

Попов Юрий Алексеевич

доктор биологических наук, профессор Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»»,

заведующий отделом образовательных программ и подготовки специалистов

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биологии Уфимского научного центра Российской академии наук, г.Уфа

Защита состоится «28» ноября 2014 г. в 13:00 часов на заседании диссертационного совета Д.212.243.13 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83, V уч. корпус. E-mail: biosovet@sgu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке имени В.А. Артисевич и на сайте http://www.sgu.ru/research/dissertation-council/d-212-243-13 ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени НГ. Чернышевского»

Автореферат разослан «/cJ» 20/\'г.

Ученый секретарь диссертационного совета

С.А. Невский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Бурение любой нефтяной и газовой скважины сопровождается применением буровых растворов, состоящих из химических реагентов и материалов различной степени экологической опасности (Герасимова, 2008; Исламов, 2011; Veil, 2013).

В настоящее время в процессе нефтедобычи при бурении, и особенно при заканчивании скважин, широкое распространение получили буровые растворы на углеводородной основе (РУО), в частности, инвертно-эмульсионные растворы (ИЭР) (Соловьев, 2003), в состав которых входит углеводородная дисперсионная среда и водная дисперсионная фаза. Это связано с их уникальными физико-химическими свойствами, высокой эффективностью и рядом преимуществ перед буровыми растворами на водной основе (Сушкова, 2005; Янг, Рамсес, 2006). Более широкому применению РУО препятствуют экологические проблемы, связанные с образованием в ходе бурения высокотоксичных буровых шламов (БШ), пропитанных компонентами, входящими в состав РУО, среди которых основными токсикантами являются углеводороды и поверхностно-активные вещества (ПАВ) (Балаба, 2004; Curtis, 2013). РУО в основном используют на морских проектах, поэтому существуют данные о токсическом действии этих растворов на водные организмы (Рыбина, 2004; Benka-Coker, Olumagin, 1995). Однако в последние годы доля применения РУО при строительстве скважин на суше сильно растет. В этом случае негативное влияние буровые растворы оказывают уже на почву, нарушая ее состав, свойства и плодородие. В то же время, проблема токсического действия РУО и их компонентов на почву недостаточно изучена.

Существующие технологии обезвреживания буровых отходов являются дорогостоящими, энерго- и трудозатратными, не всегда способствуют образованию экологически безопасных соединений (Абалаков и др., 2003; Морозов и др., 2004; Любин и др., 2009; Jerry, 2008). В связи с этим, актуальным является возможность использования микроорганизмов-деструкторов, способных расти и проявлять активную биохимическую деятельность в условиях комплексного загрязнения, в среде с высоким содержанием углеводородов, ПАВ и полимерных добавок, способных к биодеструкции этих веществ. Считается, что данный способ обезвреживания буровых отходов обеспечивает наиболее полное, экологически безопасное и экономически обоснованное восстановление загрязненных буровыми отходами биоценозов (Ягафарова и др., 1998).

В то же время, использование биотехнологического метода для детоксикации БШ ограничивается многокомпонентным составом пропитывающих их буровых растворов (Соловьев, 2003) в связи с известным синергическим действием ряда ксенобиотиков (Терехова, 2010; Тазетдинова и др., 2013), наличием в шламах тяжелых металлов (ТМ), являющихся опасными экотоксикантами, а также экстремальными экологическими условиями для микроорганизмов-деструкторов, которые характерны для такого комплексного загрязнения. Прежде всего, это повышенная щелочность шламов (pH более 8), связанная с присутствием в их составе извести и каустической соды (Рязанов, 2005), и повышенная минерализация (до 15%), обусловленная как использованием солей в составе буровых растворов, так и разбуриванием соленых отложений (Булатов и др., 1999).

В связи с вышесказанным, актуален поиск- новых штаммов бактерий для утилизации отходов бурения, устойчивых к условиям комплексного токсического воздействия компонентов БШ и, в тоже время, способных обеспечить значительную степень детоксикации реагентов, входящих в состав РУО.

Цель_диссертационной работы - охарактеризовать степень токсического

действия на почву буровых растворов на углеводородной основе и их компонентов, оценить деструктивный и адаптационный потенциал микроорганизмов, выделенных из буровых шламов.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Исследовать влияние на почвенную биоту инвертно-эмульсионных буровых растворов, дисперсионных сред и основных компонентов, входящих в их состав, с помощью различных приемов биотестирования.

2. Изучить состав микробиологических сообществ буровых шламов. Идентифицировать выделенные из них бактерии и оценить их способность к деградации нефтяных углеводородов.

3. Исследовать эколого-функциональные свойства у выделенных микроорганизмов, оценивая их поверхностно-активные свойства, алкало- и гапотолерантность, устойчивость к действию тяжелых металлов.

4. У отобранных микроорганизмов, наиболее перспективных для утилизации буровых шламов, определить экологическую безопасность, конкурентную способность, сравнить степень деструкции нефти модельными ассоциациями бактерий и составляющими их штаммами в нормальных и экстремальных условиях.

Научная новизна. С помощью комплексного биотестирования впервые показано высокое токсическое воздействие на почву инвертно-эмульсионных буровых растворов и их компонентов, обусловленное комбинированным эффектом. Выявлены реагенты с максимальным (нефть, дизельное топливо, ПАВ, хлориды) и минимальным токсическим действием (минеральное масло, известь, барит).

Установлено доминирование углеводородокисляющей микрофлоры в буровых шламах. Из микробных сообществ, существующих в экстремачьных условиях буровых шламов, выделено и изучено 7 новых штаммов бактерий, идентифицированные как: Halomonas sp. ОБР 1, Bacillus firmus ОБР 1.1, В. firmus ОБР 3.1, Solibacillus silvestris ОБР 3.2, В. circulons ОБР 3.3, В. circulons НШ и Erwinia rhapontici ОБР 4.1 с уникальным сочетанием эколого-функционапьных свойств. Для них характерны: широкий субстратный спектр в отношении нефтяных углеводородов разной степени токсичности, высокая эмульгирующая (экзогенная и эндогенная) и деструктивная активность по отношению к нефти, полирезистентность к тяжелым металлам, алкало- и гапотолерантность. Среди исследованных культур обнаружены штаммы, способные к росту в экстремальных условиях: В. firmus ОБР 1.1 (рН 7-9), В. circulons НШ (рН 7-10; 15% NaCl), S. silvestris ОБР 3.2 (15% NaCl; высокие концентрации Cu2+ (189 мг/л) и СсР (61 м г/л)).

Впервые продемонстрировано, что бактерии В. circulons НШ и S. silvestris ОБР 3.2 эффективно деградируют нефтяные углеводороды не только самостоятельно, но и в ассоциации с нефтеокисляющим микроорганизмом Dietzia maris АМЗ.

Эффективность деструкции нефти ассоциацией: В. circulans НШ + D. maris АМЗ выше, чем монокультурой.

Теоретическая и практическая значимость работы. Апробированный в работе комплекс биотест-организмов, состоящий из высших растений, микроорганизмов и почвенных беспозвоночных, может быть использован для экотоксикологической оценки почв, загрязненных буровыми отходами. Результаты биотестирования позволяют рекомендовать использование минерального масла в качестве углеводородной основы инвертно-эмульсионных буровых растворов как наименее токсичной дисперсионной среды.

Полученные оригинальные данные о микробиологическом составе буровых шламов можно применять при разработке биоремедиационных технологий, используя буровые шламы в качестве источника выделения и селекции микроорганизмов-деструкторов основных компонентов буровых отходов.

Создана коллекция штаммов-деструкторов углеводородов: Halomonas sp. ОБР 1, B.firmus ОБР 1.1, B.firmus ОБР 3.1, S. silvestris ОБР 3.2, В. circulans ОБР 3.3, В. circulans НШ. Высокая конкурентоспособность, углеводородокисляющая активность и широкий адаптационный потенциал свидетельствует о возможности использования данных бактерий, а также модельной ассоциации: В. circulans Hill + D. maris АМЗ в технологиях микробной утилизации буровых шламов.

Апробация работы. Основные результаты и положения работы докладывались на научных конференциях: Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ-2012» (Москва, 2012); VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012); XIII Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых специалистов «Геологи XXI века» (Саратов, 2012); Международной конференции «Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред» (Москва, 2013); V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2013); 10 Международном молодежном экологическом форуме стран Балтийского региона «Экобалтика» (Санкт-Петербург, 2013); Всероссийской научно-практической конференции «Геологические науки - 2014» (Саратов, 2014).

Личный вклад автора. Экспериментальные данные, на основе которых сформулированы положения и выводы, представленные к защите, получены лично автором. Соискатель принимал непосредственное участие в постановке задач исследования, подготовке и проведении экспериментальных работ, обработке и обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из которых 4 в печатных изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 170 страницах машинописного текста; содержит 12 таблиц и 23 рисунка; состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 299 источников, в том числе 87 зарубежных авторов, и приложения на 3-х страницах.

Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии и биофизики СГУ. Идентификация бактерий по последовательности гена 16S рРНК выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии (г. Москва).

Благодарности. Выражаю искреннюю благодарность научному руководителю -профессору кафедры биохимии и биофизики СГУ д.б.н., доценту Плешаковой Е.В., всем сотрудникам кафедры биохимии и биофизики СГУ, а также сотруднику ИБФРМ РАН к.б.н. Чернышевой МП. за помощь в проведении газовой хроматографии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Высокий уровень токсического действия на почву буровых растворов на углеводородной основе обусловлен токсичностью их дисперсионных сред (нефть, дизельное топливо) и компонентов дисперсионной фазы (ПАВ и хлориды), а также комбинированным действием реагентов, входящих в их состав.

2. В микробных сообществах буровых шламов преобладают углеводородокисляющие бактерии. Выделенные из буровых шламов микроорганизмы идентифицированы как: Bacillus circulons НШ; В. firmus ОБР 1.1; B.flrmus ОБР 3.1; Solibacillus silvestris 3.2, В. circulons ОБР 3.3, Halomonas sp. ОБР 1 и Erwinia rhapontici ОБР 4.1.

3. Для бактерий, выделенных из буровых шламов, характерны оригинальные эколого-функционапьные свойства: широкий субстратный спектр в отношении нефтяных углеводородов разной степени токсичности, высокая экзогенная и эндогенная эмульгирующая активность по отношению к нефти, полирезистентность к тяжелым металлам, алкало- и галотолерантность.

4. В экстремальных экологических условиях бактерии В. circulons НШ и S. silvestris ОБР 3.2 могут эффективно осуществлять деградацию нефтяных углеводородов не только самостоятельно, но и в комбинации с нефтеокисляющим микроорганизмом D. maris АМЗ. Эффективность деструкции нефти ассоциацией: В. circulons НШ + D. maris АМЗ выше, чем монокультурой.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БУРОВЫХ ШЛАМОВ И СПОСОБЫ ИХ ДЕТОКСИКАЦИИ (обзор литературы)

В главе приводится обзор литературы, посвященный проблеме опасности для окружающей среды БШ, образующихся в ходе бурения нефтяных и газовых скважин. Рассмотрен их состав и токсичность отдельных компонентов, основные способы детоксикации БШ. Особое внимание уделено биологическим методам утилизации, выделены их преимущества и перспективы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы выделяли из образцов БШ, отобранных в процессе строительства нефтяных скважин Восточной Сибири, особенностью которых являлась холодная геология продуктивных пластов, аномально низкие пластовые давления и высокое содержание NaCî. Образцы характеризовались повышенным значением рН (рН 9) и высокой степенью минерализации (15%). В работе также использовали нефтеокисляющий микроорганизм Dietzia maris АМЗ из коллекции почвенных свободноживущих и ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН (г. Саратов).

При анализе микробных сообществ БШ использовали технику прямого высева и метод накопительного культивирования (Нетрусов и др., 2005), где в качестве селективного агента в среду добавляли модельные РУО: на основе минерального масла (БР 1) и на основе дизельного топлива (ДТ) (БР 2). Количество углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) оценивали на минеральной среде М9 с нефтью (Теппер и др., 1993); бактерий, гидролизующих крахмал, - на крахмало-аммиачной среде (Меремкулова и др., 2010); целлюлозоразрушающих микроорганизмов - на среде Гетчинсона (Зенова и др., 2002). Для учета численности бактерий-деструкторов неионогенных ПАВ (НПАВ) использовали метод К.А. Кука (1978), анионоактивных ПАВ (АПАВ) - метод К. Ohwada (Ротмистров и др., 1977).

Идентификацию изолированных из БШ бактерий проводили по результатам сравнительного анализа морфолого-культуральных и физиолого-биохимических признаков в соответствии с критериями, предложенными в руководстве «Определитель бактерий Берджи» (1997), а также согласно принципам молекулярного типирования по последовательности гена 16S рРНК во ВНИИСБ (г. Москва). Визуализацию клеток осуществляли методом сканирующей электронной микроскопии на просвечивающем электронном микроскопе MIRA//LMU (TESCAN, Чехия) с приставкой ТЕМ.

Влияние pH (от 7 до И) и NaCl (от 3,5 до 15%) на рост бактерий оценивали в МПБ, используя буферные растворы, согласно (Справочник биохимика..., 1991). Устойчивость бактерий к действию ТМ определяли визуально по росту культур на МПА с добавлением диапазона концентраций солей TM: CuCb, Pb(NOj):, CdCl;, ZnS04, NiSO^ и FeS04. Для оценки уровня индивидуальной метаплоустойчивости бактерий рассчитывали минимальную ингибируюшую концентрацию (МИК) ионов каждого металла (Lambert, Pearson, 2000). Определение содержания ТМ в БШ проводили методом атомной абсорбции на спектрофотометре Квант-2АТ.

Экологическую совместимость бактерий изучали методом лунок и перекрестных посевов (Нетрусов и др., 2005). Гемолитическую активность микроорганизмов оценивали на кровяном агаре, лецитиназную - на желточно-солевом агаре (Методы общей бактериологии..., 1984). Определение антибиотикочувствительности бактерий проводили диско-диффузионным методом (Методические указания..., 2004). Вирулентность микроорганизмов изучали методом внутрибрюшинного заражения клинически здоровых беспородных самок белых крыс, оценивая количество летальных случаев в опытных группах (Лабинская и др., 2005).

Способность микроорганизмов использовать для роста РУО и его дисперсионные среды (нефтепродукты) определяли с помощью чашечного метода Мак-Кланга (Теппер и др., 1993); индивидуальные углеводороды - с помощью метода лунок (Егоров, 1983). Эмульгирующую активность микроорганизмов определяли методом Д. Купера с некоторыми модификациями (Cooper, Goldenberg, 1987). Для оценки показателя гидрофобности (ПГ) бактериальных клеток применяли метод Е.В. Серебряковой с соавт. (2002). Деструктивную активность бактерий определяли после 10 сут. культивирования в жидкой минеральной среде М9 с нефтью (0,4 и 1%), ДТ или минеральным маслом (0,4%) в качестве единственного источника углерода и энергии при различных значениях pH и содержании NaCl в

среде гравиметрическим методом (РД 52.18.647-2003; Методические указания..., 2003) и методом газовой хроматографии (Суржко и др., 1995; Другов, Родин, 2007). " В экспериментах по оценке влияния буровых растворов на почву (чернозем южный, суглинистый, отобранный в Саратовской области) использовали три модельных ИЭР с объемным соотношением углеводородная фаза/водная фаза (75:25). Дисперсионными средами являлись: минеральное масло И-20 (ИЭР 1) товарная нефть (ИЭР 2) и ДТ «Л» (ИЭР 3). Остальные реагенты, входящие в состав ИЭР, г/л: органобентонит- 4,6; сульфонол НП-3 - 22,8; BaS04 - 645; Са(ОН), - 22,8; СаС12 - 51,8. В почву вносили ИЭР и дисперсионные среды в концентрации 40 и 25 г/кг, соответственно, или компоненты дисперсионной фазы: BaS04 - 25,8; Са(ОН)2 -0,9; СаС12 - 2,1; сульфонол - 0,9 г/кг. Токсичность почвы определяли через 1 и 30 сут. после загрязнения с помощью дождевых компостных червей «Старатель» анализируя их поведенческие реакции, выживаемость (Международный стандарт 1998) через 2 и 7 сут. экспозиции (кратковременное и субхроническое действие) в фитотесте на трехсуточных проростках редиса сорта «Заря», оценивая всхожесть семян в %; среднюю длину побега и корня в мм (Остроумов 1990) по дегидрогеназной активности D. maris АМЗ (Плешакова, 2010). Для проведения сравнительного анализа степени токсичности почвы использовали методику расчета индекса токсичности оцениваемого фактора (ИТФ) по P.P. Кабирову и др. (1997)

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы Microsoft Excel 2010. Достоверность различий полученных результатов оценивали с использованием коэффициента Стьюдента (Р>0,95).

ГЛАВА 3. ОЦЕНКА ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НА ПОЧВУ ИНВЕРТНО-ЭМУЛЬСИОННЫХ БУРОВЫХ РАСТВОРОВ, ДИСПЕРСИОННЫХ СРЕД И ОСНОВНЫХ КОМПОНЕНТОВ, ВХОДЯЩИХ В ИХ СОСТАВ

Для исследования мы выбрали наиболее опасные составляющие БШ это ИЭР и их компоненты. Результаты биотестирования на дождевых червях «Старатель» проведенного сразу после внесения загрязнителей в почву, показали, что в почве с' минеральным маслом выживаемость дождевых червей через 2 сут. экспозиции составила 100%, свидетельствуя об отсутствии острой токсичности почвы В варианте с ИЭР 1, основой которого было минеральное масло, выживаемость червей «Старатель» составила 25%, с ДТ, нефтью и ИЭР с соответствующими дисперсионными средами от 0 до 10% (рисунок 1а), что указывало на острое токсическое воздействие данных реагентов. Такое ингибирующее действие наблюдалось и через 7 сут. инкубирования дождевых червей в почве Среди исследованных компонентов дисперсионной фазы буровых растворов максимальное снижение выживаемости тест-организмов наблюдалось при загрязнении почвы сульфонолом, которая составила 70% (рисунок 16). Через 7 сут. экспозиции выживаемость червей в почве с реагентами снизилась на 10-40%, доказывая усиление токсического эффекта исследованных веществ при более длительном воздействии.

Краткосрочное биотестирование (2 сут. экспозиции), осуществленное через 30 сут. после внесения поллютантов в почву, показало 100%-ную выживаемость тест-организмов в вариантах с минеральным маслом и ИЭР на его основе (рисунок 1 а) В остальных образцах с ИЭР и их дисперсионными средами показатели выживаемости

не изменились по сравнению с тестированием, выполненным сразу после загрязнения почвы. В почве, загрязненной компонентами ИЭР выживаемость дождевых червей через 2 и 7 сут. экспозиции с известью и баритом составила 100%, сульфонолом - 80%, СаСЬ - была ниже, чем при первоначальном внесении (рисунок 16). В образце с СаСЬ отмечено отсутствие у червей инстинкта переработки почвы, они обезвоживались, а затем погибали.

Рисунок 1 - Результаты вермитестирования почвы через 1 сут. после внесения загрязнителей (К.Х1 - 2 сут. экспозиции;» - 7 сут. экспозиции) и 30 сут. после внесения загрязнителей (ЕЙ 2 сут. экспозиции^В- 7 сут. экспозиции): а - ИЭР и их дисперсионных сред; 5-отдельных реагентов, входящих в состав ИЭР

Результаты фитотестирования показали, что всхожесть семян редиса после внесения в почву загрязнителей снизилась во всех вариантах, за исключением варианта с минеральным маслом. Всхожесть семян под влиянием ИЭР с нефтью в качестве дисперсионной среды, составляла всего 16% от контроля. В почве с сульфонолом через 1 сут. всхожесть была на 32% ниже, чем в контрольной почве, через 30 сут. разница с контролем составила 12%. В вариантах с остальными компонентами ИЭР через 30 сут. всхожесть семян редиса была ниже, чем в контрольном образце на 22-48%. Все исследованные дисперсионные среды и ИЭР после добавления их в почву в равной степени угнетали рост корней у проростков редиса: на 50-76%. Минимальное ингибирование корней наблюдалась в почве с ИЭР на основе минерального масла, максимальное - в почве с нефтью. Через 30 сут. в образцах почвы с ДТ и соответствующим ИЭР угнетение корней у проростков усилилось. Средняя длина корня заметно снизилась при внесении в почву отдельных компонентов ИЭР, этот показатель составлял 50 и 57% от контроля в почве с сульфонолом и СаС12. Показатели средней длины побега у проростков редиса в почве с ИЭР были в 2-3,6 раза ниже, чем в контрольной почве через 1 сут. после загрязнения. Максимальное ингибирование развития побегов отмечено в вариантах с ИЭР на основе нефти и минерального масла. Через 30 сут. ингибирующее воздействие на надземную часть проростков снизилось. Развитие побега в почве с отдельными компонентами ИЭР не угнеталось через 1 сут. эксперимента, через 30 сут. отмечено увеличение токсического эффекта в 1,5-3,8 раза.

В ходе оценки токсичности почвы, загрязненной ИЭР и их дисперсионными средами, по суммарной дегидрогеназной активности D. maris АМЗ показано, что дисперсионные среды, внесенные в почву, не влияли на активность дегидрогеназ

тест-микроорганизма, а ИЭР снижали данный показатель на 18-30% по сравнению с чистой почвой (рисунок 2а). Наибольшее снижение наблюдалось в почве с ИЭР на основе ДТ, что соответствует известным данным о токсичности ДТ (Sikkema et al.. 1995; Cunningham. Philp, 2000). Через 30 сут. активность дегидрогеназ D. maris АМЗ, снизилась во всех вариантах, особенно в почве с нефтью и ИЭР на ее основе: на 51 и 63% по сравнению с чистой почвой. Через 1 сут. после загрязнения почвы сульфонолом активность дегидрогеназ D. maris АМЗ снизилась на 42% по сравнению с чистой почвой (рисунок 26); через 30 сут. - в 2,6 раза, свидетельствуя об усилении токсичности. Все остальные реагенты, внесенные в почву, наоборот, оказывали стимулирующее действие на суммарную активность дегидрогеназ тест-организма через 1 сут. после загрязнения. Через 30 сут. данный показатель в вариантах с известью и баритом был сопоставим со значением в чистой почве, в образце с СаСЬ активность дегидрогеназ снизилась на 32%.

□через 1 суп после загрязнения я через 30 сут после загрязнения

" б Рисунок 2 - Оценка токсичности почвы по дегидрогеназной активности D. maris АМЗ: а- с ИЭР и дисперсионными средами; б- с отдельными реагентами, входящими в состав ИЭР

Сравнение результатов, полученных с помощью трех приемов биотестирования, позволил рассчитать ИТФ. Были установлены сходные тенденции (таблица 1). Из исследованных дисперсионных сред минеральное масло оказалось наименее токсичным, загрязненная им почва не была токсичной для дождевых червей и оказывала слабое токсическое воздействие на ферменты бактерий. Исключением явилось значительное ингибирование корней проростков редиса в почве с минеральным маслом, что, скорее всего, связано с нарушением под влиянием этого загрязнителя агрофизических свойств почвы. Все исследованные буровые растворы, внесенные в почву, по всем показателям биотестов обладали высокой токсичностью, которая незначительно уменьшалась через 30 сут. ИЭР на основе нефти и ДТ были более токсичны по отношению к тест-организмам по сравнению с ИЭР на основе минерального масла. Полученные данные позволяют рекомендовать использование минерального масла как наименее токсичной дисперсионной среды ИЭР. Из компонентов дисперсионной фазы наименьшим токсическим действием при внесении их в почву обладали известь и барит. В первом случае, предположительно, из-за низкой концентрации извести, во втором, из-за достаточно низкой химической активности барита. Выраженный токсический эффект наблюдался при добавлении в почву СаСЬ и сульфонола.

Таблица 1 - Индексы токсичности проб почвы с различными загрязнителями, рассчитанные по результатам биотестов

Варианты почвы с загрязнителями Экспозиция почвы после внесения загрязнителей, сут, ИТФ по показателям тест-организмов

растений Raphanus sativus бактерий Dietzia maris АМЗ дождевых компостных червей «Старатель»

всхожесть средняя длина корня средняя длина побега активность дегидрогеназ выживаемость

через 2 сут. через 7 сут.

ИЭР 1 1 0,85(4) 0,50(3) 0,27(2) 0,79(4) 0,2(2) 0,0(1)

30 0,84(4) 0,55(3) 0,30(2) 0,58(3) 1,0(5) 0,0(1)

Минеральное масло 1 0,98(5) 0,33(2) 0,73(4) 0,97(5) 1,0(5) 0,83(4)

30 0,91(5) 0,37(2) 0,93(4) 0,76(4) 1Д5) 1,0(5)

ИЭР 2 1 0,15(2) 0,28(2) 0,32(2) 0,84(4) 0,0(1) 0,0(1)

30 0,49(3) 0,40(2) 0,34(2) 0,34(2) 0,0(1) 0,0(1)

нефть 1 0,63(3) 0,23(2) 0,30(2) 0,98(5) 0,0(1) 0,0(1)

30 0,68(3) 0,40(2) 0,38(2) 0,45(2) 0,0(1) 0,0(1)

ИЭРЗ 1 0,52(3) 0,32(2) 0,48(2) 0,72(4) 0Д1) 0,0(1)

30 0,80(4) 0,10(2) 0,09(2) 0,52(3) 0,0(1) 0,0(1)

Дизельное топливо 1 0,78(4) 0,33(2) 0,84(4) 0,90(4) 0,10(2) 0,0(1)

30 0,75(4) 0,41(2) 0,33(2) 0,76(4) 0,10(2) 0,0(1)

сульфонол 1 0,68(3) 0,50(3) 0,97(5) 0,60(3) 0,70(3) 0,60(3)

30 0,87(3) 0,54(3) 0,42(2) 0,39(2) 0,80(4) 0,80(4)

СаС12 1 0,84(4) 0,57(3) 0,82(4) 1,09(5) 0,90(4) 0,80(4)

30 0,48(2) 0,37(2) 0,21(2) 0,64(3) 0,70(3) 0,40(2)

Са(ОН)2 1 0,84(4) 0,85(4) 0,98(5) 1,35(6) 1,0(5) 0,80(4)

30 0,61(3) 0,56(3) 0,48(2) 1,01(5) 1,0(5) 1,0(5)

ВаБ04 1 0,85(4) 0,81(4) 0,97(5) 1,41(6) 1Д5) 0,9(4)

30 0,76(4) 0,60(3) 0,64(3) 0,97(5) 1,0(5) 1,0(5)

Примечания: В скобках приведены значения степени токсичности почвы, соответствующие шкале токсичности: 6 - стимуляция: ИТФ >1,1:5-

норма: ИТФ=0,91-1,10; 4 - низкая токсичность: ИТФ=0,71-0,90; 3 - средняя токсичность: ИТФ=0,5-0,7; 2 - высокая токсичность: ИТФ<0,5; 1 -сверхвысокая: ИТФ=0.

Как показало комплексное биотестирование, токсичность всех исследованных ИЭР была значительно выше, чем токсичность отдельных компонентов, входящих в их состав. Тремя способами биотестирования было доказано негативное влияние на почву исследованных ИЭР и их компонентов, а именно: нефтяных углеводородов, ПАВ и хлоридов, что требует разработки современных технологий обезвреживания БШ, а также технологий ремедиации почвы при загрязнении ее отходами бурения.

ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ ИЗ БУРОВЫХ ШЛАМОВ ИХ ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОЦЕНКА ДЕСТРУКТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА

Для выявления микроорганизмов-деструкторов химических реагентов, входящих в состав буровых растворов, мы изучили микробные сообщества двух образцов БШ с высоким значением рН (рН 9) и степенью минерализации (15% ЫаС1). При прямом высеве бактерий общая численность гетеротрофных микроорганизмов в образцах БШ 1 и БШ 2 составила 1,0x10' и 8,9х 10' кл/г (таблица 2).

Таблица 2 - Содержание микроорганизмов различных физиологических групп буровых шламах_

Образцы • Методы выделения микроорганизмов Численность бактерий, кл/г(мл)

БШ ] I. Прямой высев гетеротрофных УОМ гидролизующих крахмал

1,0x10^0,30 <50±0,44 <50±0,00

2. Накопительное культивирование (+БР 1) 2,8« Ю5±0,58 4,4 х 104±0,22 <50±0,00

3. Накопительное культивирование(+БР 2) 2,0* 104±0,22 1,1хЮ"±0,44 4,3х Ю2±0,42

БШ 2 1. Прямой высев 8,9х Ю3±0,38 6,1хЮ3±0,34 8,8х 102±0,46

2. Накопительное культивирование(+БР 1) 1,4х 105±0,38 4,3* Ю4±0,45 6,9х 103±0,58

3. Накопительное культивирование(+БР 2) ] 1,8х 10'±0,40 !,6х104±0,28 4,2х 103±0,52

Примечание: «<50» означает, что при высеве бактерий из разведения 1:5 микроорганизм соответствующих групп не обнаруживались.

В шламе БШ 2 содержалось: УОМ - бДхЮ5 кл/г и 8,8*102 кл/г микроорганизмов, гидролизующих крахмал. При этом не обнаруживались микроорганизмы-деструкторы синтанола АЦСЭ-12, сульфонола НП-3 и карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ). Микробное сообщество БШ 1 не отличалось разнообразием, т.к. здесь не выявлялись в заметном количестве УОМ, деструкторы синтанола, сульфонола, КМЦ и крахмала. При выделении бактерий методом накопительного культивирования было показано, что добавление в среду селективных источников питания увеличило количество бактерий ряда вышеперечисленных групп по сравнению с прямым высевом микроорганизмов. В шламе БШ 1 общее содержание гетеротрофных бактерий возросло в 20 раз при культивировании его с буровым раствором на основе ДТ (БР 2) и значительно выше -на два порядка - с раствором на основе минерального масла (БР 1). Культивирование данного БШ с модельным раствором на основе ДТ способствовало увеличению

численности микроорганизмов, гидролизующих крахмал, при этом, добавление РУО на основе минерального масла не влияло на количество данной группы бактерий.

В образце БШ 2 общая численность гетеротрофных микроорганизмов, достигала значений 105 кл/мл при культивировании шлама с растворами БР 1 и БР 2; численность У ОМ - 104 кл/мл, примерно в 10 раз увеличилось количество бактерий, гидролизующих крахмал. Оба РУО, использованных нами в качестве селективных агентов, в равной степени способствовали развитию разных групп микроорганизмов, содержащихся в шламе БШ 2, в отличие от образца БШ 1, где буровой раствор на основе минерального масла в большей степени стимулировал рост гетеротрофных бактерий и УОМ. Добавки в среду культивирования РУО не стимулировали развитие бактерий-деструкторов НПАВ, АГ1АВ и КМЦ в обоих образцах БШ, что может быть связано с достаточно низкой концентрацией этих реагентов в составе растворов или их токсичностью.

Из буровых шламов БШ 1 и БШ 2 изолировано 7 чистых микробных культур, которые по совокупности изученных культурально-морфологических, физиолого-биохимических признаков и результатов молекулярного типирования были идентифицированы нами, как: В. агси1ат НШ; В. /¡гтт ОБР 1.1 \B.firmus ОБР 3.1; 5. ■«'«'га ОБР 3.2, В. сггснЬт ОБР 3.3, На1отопа$ ер. ОБР 1 и Е. гИаропПЫ ОБР 4.1.

Рисунок 3 - Изображения клеток выделенных культур в возрасте 24 ч, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии

При изучении деструктивного потенциала выделенных

микроорганизмов было показано, что большинство штаммов обладали способностью к росту на минеральной агаризованной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии: буровой раствор на основе минерального масла, сырую нефть, вазелиновое масло, ДТ. На среде с н-алканами (гексан, гептан, октан, декан, гексадекан) и ароматическими углеводородами (бензол, толуол, ксилол, кумол, нитробензол) микроорганизмы росли с различной интенсивностью. Несколько культур {В. fírmus ОБР 1.1, В. firmus ОБР 3.1, В. circulans ОБР 3.3 и В. circuíans НШ) активно использовали для роста все тестируемые нами нефтепродукты и индивидуальные углеводороды.

Было показано, что степень деструкции нефти (0,4%) бактериями составила 2840% за 10 сут. культивирования в жидкой минеральной среде М9 (рисунок 4). Максимальная деструктивная активность по отношению к нефти наблюдалась у бактерий В. firmus ОБР 3.1 и В. circulans НШ (38%), а также у Halomonas sp. ОБР 1 -

Bacillus circulans НШ Bacillusfirmus ОБР 1.1

Solibacillus silvestris ОБР 3.2 Halomonas sp. ОБР 1

40%. Деструктивная активность бактерий в отношении ДТ и минерального масла была меньше, предположительно, из-за ограниченной биодоступности этих нефтепродуктов для бактерий (Cunningham, Philp, 2000; Zanaroli et al., 2010). По отношению к ДТ деструктивную активность проявили В. circulans ОБР 3.3 и В. circulans HLLI, которая составила 35,5 и 25%. Степень деградации минерального масла B.firmus ОБР 3.1 и В. circulans НШ составила 39 и 35%.

.lililí

контроль ОБР 3.3 ОБР 3.1 ОБРЭ.2 ОБР 1 ОБР 1.1 НШ штаммы

Рисунок 4 - Деструктивная активность бактерий по отношению к нефти через 10 сут. культивирования в жидкой среде (гравиметрический метод)

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что БШ представляют собой источник специализированных микроорганизмов, способных к разложению различных ксенобиотиков. При этом в микробных сообществах Kill доминируют УОМ. Широкий субстратный спектр в отношении нефтяных углеводородов, а также дисперсионных сред РУО, обнаруженный у выделенных бактерий, свидетельствует о перспективности использования таких микроорганизмов в технологиях микробной утилизации БШ.

ГЛАВА 5. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БУРОВЫХ ШЛАМОВ

При разработке и применении биотехнологического метода обезвреживания отходов бурения следует учитывать многокомпонентный состав БШ, наличие в шламе ТМ - опасных экотоксикантов, а также высокое значение pH и высокую степень минерализации буровых отходов. В связи с этим, мы исследовали изолированные из БШ микроорганизмы не только на способность к деструкции компонентов БШ, но также на устойчивость к экстремальным условиям такого комплексного загрязнения.

Был изучен ПГ клеточной поверхности микроорганизмов при культивировании их на МПА и в жидкой минеральной среде с глицерином в качестве единственного источника углерода и энергии, учитывая, что данный показатель может изменяться при росте бактерий на углеводородных субстратах (Коломынцева и др., 2005; Волченко, 2006). ПГ клеточной поверхности у бактерий, относящихся к роду Bacillus, при культивировании их на МПА составлял от 23,7 до 36,8%, при выращивании их в среде с глицерином ПГ был значительно выше - 57,3-65,5% (таблица 3). ПГ у штамма S. silvestris ОБР 3.2 составил 18,7 и 66,2% при культивировании на МПА и в среде с глицерином. Низкие значения ПГ наблюдались у культур Haiomonas sp. ОБР 1 и Е. rhapontici ОБР 4.1.

Было показано, что все исследованные бактерии проявили высокую эмульгирующую активность по отношению к нефти (таблица 3). Эндогенная

активность через 24 ч составила у разных культур 55-97%, максимальная активность обнаруживалась у В. /¡гтия ОБР 3.1, через 48 ч эмульгирующая активность составляла 56-90%. Экзогенная эмульгирующая активность через 24 ч составила 4887%, через 48 ч - 40-85%.

Таблица 3 - Поверхностно-активные свойства бактерий, выделенных из буровых шламов

Бактерии Показатель гидрофобности, % Эмульгирующая активность по отношению к нефти, %

при росте на МПА при росте в М9 с глицерином эндогенная активность экзогенная активность

Е24 Е4Я В24 Е4К

Halomonas sp. ОБР 1 <1,0 <1,0 87±2,0 80±3,1 87±3,0 85±2,1

B.firmus ОБР 1.1 36,8±0,5 64,5±0,1 95±1,2 90±1,9 50±1,2 45±2,9

B.firmus ОБР 3.1 23,7±0,7 _57,3±0,3 97±2,1 85±3,2 48±2,8 40±2,2

5. silvestris ОБР 3.2 18,7±0,7 66,2±0,3 90±2,8 80±3,2 65±3,5 55±2,2

В. circulons ОБР 3.3 33,3±0,1 65,5±0,3 70±2,1 70±2,9 62±2,1 50±3,9

Е. rhaponlici ОБР 4.1 <1,0 14,7±0,2 55±3,0 56±2,8 60±3,3 45±2,0

В. circulons НШ 34,5±0,2 61,3±0,3 70±2,3 65±1,1 62±1,4 62±2,1

D. maris АМЗ - контроль 84,2±0,1 85,5±0,1 42±2,8 40±0,7 45±3,5 40±1,7

Микробный штамм Halomonas sp. ОБР 1 отличался высокими показателями как экзогенной, так и эндогенной эмульгирующей активности по отношению к нефти. Эмульгирующая активность контрольного микроорганизма D. maris АМЗ была значительно ниже показателей эмульгирующей активности бактерий, выделенных из БШ. По отношению к ДТ все изученные культуры обнаружили сходную эндогенную и экзогенную эмульгирующую активность, порядка 40% через 24 и 48 ч, что было сравнимо с соответствующими показателями для D. maris АМЗ.

Проявленная бактериями высокая эмульгирующая активность в отношении нефтепродуктов, а также ПГ клеток бактерий, значительно увеличивающиеся при культивировании бактерий на гидрофобном источнике углерода, свидетельствуют о возможном синтезе ими биоПАВ. Уровень эмульгирующей активности супернатанта Halomonas sp. ОБР 1, В. circulons ОБР 3.3 и В. circulons НШ был близок к уровню эмульгирующей активности жидкой культуры, позволяет предположить, что данное свойство этих бактерий обеспечивается и внеклеточными биоПАВ.

Одним из определяющих условий использования микробиологического способа для детоксикации БШ является резистентность микроорганизмов-деструкторов к высоким концентрациям ТМ. Содержание ТМ в шламах, из которых были изолированы бактерии, было в пределах ПДК в почве и выше.

Обнаружено, что все исследованные микроорганизмы хорошо росли на среде с Ni2+ (8-38 мг/л), Fe2+ (7-37 мг/л) и РЬ2+ (25-375 мг/л), что свидетельствует о наличии перекрестной устойчивости бактерий к данным ТМ. При оценке уровня индивидуальной метаплоустойчивости бактерий была определена МИК ионов каждого металла (таблица 4). Высокая концентрация Zrr ' в среде (178 мг/л) ингибировала рост бактерий: Halomonas sp. ОБР 1 и В. circulons НШ, при этом низкие и средние концентрации Zn2+ не угнетали рост этих микроорганизмов. Остальные бактерии хорошо росли при всех концентрациях Zn2+ в среде. S. silvestris ОБР 3.2 отличался от других микроорганизмов отчетливым ростом на среде с повышенным

содержанием Си2+ (142 и 189 мг/л) и С(12+ (43 и 61 мг/л). Рост всех остальных бактерий при содержании в среде Си2+ в количестве 94 и 142 мг/л ингибировался. Низкие концентрации Cd2+ в среде (12 и 24 мг/л) не влияли на рост изученных бактерий, а более высокие (43 и 61 мг/л) подавляли их рост, за исключением & silvestris ОБР 3.2, В. с1гси1ат 3.1 и В. ЫгсиЬпя НШ, которые были устойчивы к действию данного металла в различных дозах. Обнаруженная у исследованных бактерий полирезистентность к ТМ является их отличительным признаком, благодаря которому эти микроорганизмы смогут проявлять деструктивную активность в отношении нефтяных углеводородов в условиях повышенных концентраций комплекса ТМ, содержащихся в БШ.

Таблица 4 - Уровень металлоустойчивости бактерий

Штаммы МИК ионов металлов, мг/л

Си2+ РЬ2+ Cd2+ Zn2+ Ni2+ Fe2*

Halomonas sp. ОБР 1 142 >375 43 178 >38 >37

B.firmus ОБР 1.1 94 >375 43 >178 >38 >37

B.firmus ОБР 3.1 94 >375 >61 >178 >38 >37

S. silvestris ОБР 3.2 236 >375 >61 >178 >38 >37

В. circulons ОБР 3.3 94 >375 43 >178 >38 >37

В. circulons НШ 142 >375 >61 178 >38 >37

D. maris АМЗ 94 >375 43 178 >38 >37

У всех исследованных бактерий был обнаружен заметный рост в МПБ при рН 8 (таблица 5). Микробный штамм В. circulons НШ хорошо рос при рН 9 и 10, при рН 11 рост штамма был слабым. Штамм B.firmus ОБР 1.1 отличался значительным ростом при рН 9, при рН 10 и 11 его рост был слабым. Другие бактерии не обнаруживали способность к росту при значениях рН выше 8.

Таблица 5 - Оценка роста бактерий в МПБ при различных значениях рН и содержании NaCl

Микроорганизмы Рост бактерий

РН содержание NaCl, % по объему

7 8 9 10 ll 3,5 6,5 10 12 15

Halomonas sp. ОБР 1 +++ + - - - ++ ++ ++ +- _

В. firmus ОБР 1.1 ++ ++ ++ +- +- ++ ++ + +- +-

В. firmus ОЪР ЗА ++ ++ - - - ++ ++ _ _ _

S. silvestris ОБР 3.2 ++ + - - - ++ ++ ++ -н-

В. circulons ОБР 3.3 + + - - ++ ++ +- _ _

В. circulons НШ +++ +++ ++ "bi- +- +++ +++ +++ +++ +++

г ------" " " " * ' ч, ■ " — ш.иилвшип UVOAU л па лис, 1 >' — J..MC i МЫ И ОСаДОК

на дне; «++» - рост с помутнением среды и осадком на дне; «+++» - рост с помутнением среды, обильным осадком на дне и пленкой на поверхности.

Таким образом, микроорганизмы В. firmus ОБР 1.1 ni?, circulons НШ устойчивы к повышенной щелочности среды. Данные микроорганизмы не являются строгими алкалофилами, т.к. при рН 7 наблюдался значительный прирост биомассы: у B.firmus ОБР 1.1 и В. circulons НШ в 2,5 раза. При значениях рН среды от 8 до 10 прироста биомассы у В. circulons НШ не обнаруживалось, однако концентрация бактериальных клеток сохранялась на повышенном уровне, только при рН 11 наблюдался лизис

клеток, у В. Jirmus ОБР 1.1 продолжался рост при рН 9, дальнейшее повышение рН негативно отражалось на жизнеспособности бактерии.

Установлено, что все исследованные микроорганизмы хорошо росли в МПБ с 3,5 и 6,5%-ным содержанием NaCl (таблица 5). При 10%-ной концентрации NaCl наблюдался заметный рост у 4-х микробных штаммов. S. silvestris ОБР 3.2 и В. circulons НШ характеризовались интенсивным ростом в питательной среде с 12 и 15%-ной концентрацией NaCl.

Таким образом, показано, что все выделенные нами из БШ бактерии обладают оригинальными эколого-функциональными свойствами, они характеризуются высокой эмульгирующей и деструктивной активностью по отношению к нефтепродуктам, полирезистентны к действию ТМ. а также адаптированы к условиям повышенной минерализации и щелочности среды.

Учитывая возможность использования выделенных нами бактерий для утилизации БШ, были проведены исследования, показавшие, что микроорганизмы В. circulons НШ, B.firmus ОБР 1.1, Д. Jirnms ОБР 3.1, 5. silvestris 3.2, В. circulons ОБР 3.3 и Halomonas sp. ОБР 1 не обладали лецитиназной и гемолитической активностью, что косвенно свидетельствовало об отсутствие патогенности у бактерий (Лабинская и др., 2005). Наблюдение за клиническим состоянием подопытных беспородных белых крыс показало, что все протестированные шесть культур не оказывали летального действия на животных. Обнаружено, что бактерии проявили высокую и среднюю степень чувствительности к антибиотикам разных групп (ампициллину, бензилпенициллину, стрептомицину, мономицину, эритромицину и тетрациклину).

С целью создания эффективных ассоциаций бактерий-деструкторов компонентов БШ была изучена конкурентная способность бактерий по отношению друг к другу и к нефтеокисляющему штамму D. maris АМЗ. Результаты свидетельствовали об отсутствии антагонистических взаимоотношений между бактериями. Одним из подходов к повышению эффективности биопрепаратов-нефтедеструкторов является переход от монокультур к полибактериальным препаратам (Карасева и др., 2012; Wenderoth et al., 2003). Поэтому мы сравнили степень деструкции нефти (1%) монокультурами в обычных (рН 7; 0,5% NaCl) и экстремальных условиях (рН 9; 15% NaCl) с эффективностью деструкции нефти смешанными культурами. Степень деструкции нефти В. circulons НШ и S. silvestris ОБР 3.2 в экстремальных условиях составила 47 и 33%, соответственно (таблица 6), что сравнимо с деструктивной активностью, проявленной данными бактериями в обычных условиях (46 и 32%).

Все штаммы деградировали лигроиновую (C]2-Cm), керосиновую (Ci2-C,8) и газойлевую (С|9-С28) фракцию нефти (рисунок 5). S. silvestris ОБР 3.2 в равной степени осуществлял деструкцию всех оцениваемых фракций нефти (21-39%). В. circulons НШ в наибольшей степени проявлял деструктивную активность по отношению к газойлевой фракции, разрушая углеводороды на 60%, особенно, углеводороды С24-С28, деструкция лигроиновой и керосиновой фракции происходила на 48 и 45%. Деструктивная активность D. maris АМЗ в отношении керосиновой и лигроиновой фракции составила 41 и 49% соответственно. Газойлевая фракция данным микроорганизмом разрушалась меньше, чем В. circulons НШ.

Таблица 6 - Деструкция нефти бактериями и модельными ассоциациями через 10

сут. культивирования в жидкой среде (по данным газовой хроматографии)

Варианты Значение pH Содержание NaCI, % Степень деструкции общих углеводородов, %

В. cireu!ans НШ 7,0 0,5 46±3,2

S. silvestris ОБР 3.2 7,0 0,5 32±4,0

D. maris АМЗ 7,0 0,5 40±3,7

S. silvestris ОБР 3.2 7,0 15 33±1,9

D. maris АМЗ 7,0 15 6±0,9

К silvestris ОБР 3.2 + О. maris АМЗ 7,0 15 41±2,8

¡О. maris АМЗ 9,0 15 39±1,3

IS. circulans НШ 9,0 15 47±3,9

В. circulans НШ + D. maris АМЗ 9,0 15 59±4,1

"о

Рисунок 5 - Деградация нефти бактериями в жидкой среде в течение 10 сут. в обычных условиях (рН 7,0; 0,5% ЫаС1) (газовая хроматография)

Рисунок 6 - Газовая хроматография экстрактов нефти: а - контроль без добавления бактерий, б - В. circulons H LU, в — D. maris АМЗ, г - ассоциация В. circulons H 111 + D. maris АМЗ (рН 9; 15% NaCÎ)

Максимальная степень деструкции нефти в условиях повышенной солености и щелочности среды наблюдалась у ассоциации бактерий: В. circulons Hlil + D. maris АМЗ (рисунок 6). Через 10 сут. культивирования общее содержание углеводородов снизилось на 59% по сравнению с контролем (таблица 6). Деструктивная активность ассоциации была на 20 и 12% выше, чем активность индивидуальных штаммов D. maris АМЗ и В. circulons НШ, выращенных в аналогичных условиях. При этом деградации подвергались в большей степени углеводороды лигроиновой (C12-Ci4) и керосиновой фракций (C15-Cig), а также частично газойлевой фракции группы С21-С2Ъ. Итак, полученные данные показали, что в экстремальных экологических условиях бактерии В. circulons НШ и S. silvestris ОБР 3.2 могут эффективно осуществлять деградацию нефтяных углеводородов не только самостоятельно, но и в комбинации с нефтеокисляющим штаммом D. maris АМЗ.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено высокое токсическое воздействие на почвенную биоту инвертно-эмульсионных буровых растворов, обусловленное сочетанием их компонентов. Установлено, что максимальным токсическим действием обладают дисперсионные среды (нефть, дизельное топливо) и реагенты дисперсионной фазы (сульфонол, хлорид кальция), минимальным - известь, барит, минеральное масло и буровой раствор на его основе.

2. Среди гетеротрофных микроорганизмов, содержащихся в буровых шламах в количестве от 1 до 9><103 кл/г, преобладают бактерии, окисляющие углеводороды и гидролизующие крахмал, численность которых можно увеличить методом накопительного культивирования. Выделено семь микробных штаммов с широким субстратным спектром в отношении нефтяных углеводородов и нефтепродуктов, идентифицированные как: Bacillus circulons НШ; В. firmus ОБР 1.1; В. firmus ОБР 3.1; Solibacillus silvestris 3.2, В. circulons ОБР 3.3, Halomonas sp. ОБР 1 и Envinia rhapontici ОБР 4.1.

3. У бактерий обнаружена высокая эндогенная (Е24=55-97%; Е48=56-90%) и экзогенная (Е24=40-87%; Е48=40-85%) эмульгирующая активность по отношению к нефти. Halomonas sp. ОБР 1 деградирует нефть на 40%; В. circulons НШ - нефть, дизельное топливо и минеральное масло на 38, 25 и 35%; В. firmus ОБР 3.1 - нефть и минеральное масло - на 38 и 39%; В. circulons ОБР 3.3 - дизельное топливо - на 36%. Показатель гидрофобности клеточной поверхности у В. firmus ОБР 1.1 и 3.1, В. circulons ОБР 3.3 и НШ, S. silvestris ОБР 3.2 при культивировании их на МПА составляет 19-37%, в минеральной среде с глицерином - 51-66%.

4. Для шести бактерий показана полирезистентность к действию: Cu2+. Pb2+, Cd2+. ZnjT, Ni:+ и Fe2+, для четырех штаммов - галотолерантность, двух -алкалотолерантность. Микроорганизмы способны расти в экстремальных условиях: В. firmus ОБР 1.1 (рН 7-9), В. circulons НШ (рН 7-10; 15% NaCl), S. silvestris ОБР 3.2 (15% NaCl; высокие концентрации Cu2+ (189 мг/л) и Cd2+ (61 мг/л)). Все бактерии обладают конкурентной способностью и экологической безопасностью.

5. В условиях повышенной солености (15%) и щелочности среды (рН 9) максимальная степень деструкции нефти обнаружена у модельной ассоциации: В. circulons НШ + D. maris АМЗ - 59% за 10 сут. культивирования, что на 20 и 12% выше активности индивидуальных штаммов D. maris АМЗ и В. circulons НШ в аналогичных условиях. Под действием ассоциации в большей степени разрушаются углеводороды лигроиновой, керосиновой и частично газойлевой фракции.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ * - публикации в печатных изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ

1. Беляков, А.Ю. Комплексное биотестирование почвы, загрязненной буровым раствором на углеводородной основе / А.Ю. Беляков // «ЛОМОНОСОВ-2012»: Мат. междунар. молодежного научного форума. - М.: МАКС Пресс, 2012. - С. 217-218.

2. Беляков, А.Ю. Деструктивный потенциал микроорганизмов, выделенных из буровых шламов / А.Ю. Беляков, В.А. Амангалиева, Е.В. Плешакова // «Стратегия

взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой»: Мат. VI Всерос. конф. молодых ученых. - Саратов: Научная книга, 2012. - С. 57.

3. Беляков, А.Ю. Оценка токсического воздействия на почву инвертно-эмульсионных буровых растворов и дисперсионных сред, входящих в их состав / А.Ю. Беляков, Е.В. Плешакова // «Геологи XXI века»: Мат. XIII Всерос. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых специалистов. - Саратов: Изд-во СГУ, 2012. - С. 69-70.

4.»Беляков, А.Ю. Определение токсического воздействия на почву бурового раствора на углеводородной основе с помощью различных приемов биотестирования / А.Ю. Беляков, Д.С. Головко, Е.В. Плешакова // Известия СГУ. Серия Химия. Биология Экология. - 2012. - Т. 12. - Вып. 3. - С. 106-113.

5.*Беляков, А.Ю. Скрининг микроорганизмов-деструкторов компонентов буровых растворов / А. Ю. Беляков, Е.В. Плешакова // Известия СГУ. Серия Химия Биология Экология. -2013. - Т. 13. - Вып. 4. - С. 37-43.

6. Плешакова, Е.В. Использование различных приемов биотестирования для оценки токсического действия на почву инвертно-эмульсионных буровых растворов и их дисперсионных сред / Е.В. Плешакова, А.Ю. Беляков // «Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред»: Тез. докл. междунар. конф. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2013. - С. 167.

7. Deev, D.V. Adaptable properties of bacteria isolated from drill cuttings / D.V. Deev, A.Yu. Belyakov, Ye.V. Pleshakova // Сб. трудов 10 междунар. молодежного экологического форума стран балтийского региона «Экобалтика 2013». - СПб.: Изд-во Почитехн vh-та, 2013. -С. 24-28.

8. Плешакова, Е.В. Эколого-функциональные особенности бактерий, выделенных из буровых шламов / Е.В. Плешакова, А.Ю. Беляков, В.А. Амангалиева // «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины»: Мат. V Междунар. науч. практ. конф. - Ростов-на-Дону: Изд-во Южного федерального ун-та, - С. 404-405.

9.*Плешакова, Е.В. Использование различных приемов биотестирования для оценки токсического действия на почву инвертно-эмульсионных буровых растворов и их дисперсионных сред / Е.В. Плешакова, А.Ю. Беляков// Вестник МГУ Почвоведение -2014. -№1,- Р. 38-43.

10.*Беляков, А.Ю. Эколого-функциональные особенности бактерий, выделенных из буровых шламов / А.Ю. Беляков, Е.В. Плешакова, В.А. Амангалиева // Известия

Самарского научного центра РАН. Проблемы прикладной экологии -2014 -Т 16 №

1.-С. 294-298. '

Подписано в печать 23.09.2014. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать RISO. Объем 1,0 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 163.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство № 3117 410600, Саратов, ул. Московская, д. 152, офис 19, тел. 26-18-19, 51 -16-28