Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка морфофункционального состояния дыхательных путей и кожи при действии низких температур и католита

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Оценка морфофункционального состояния дыхательных путей и кожи при действии низких температур и католита"

005009215

На провар рукописи

ЧАЙКА Владимир Викторович

ОЦЕНКА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ

ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ И КОЖИ ПРИ ДЕЙСТВИИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР И КАТОЛИТА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на сонскание ученой степени кандидата биологических наук

1 0и5 1Ь-2

Владивосток - 2012

005009215

Работа выполнена в лаборатории нанотоксикологии кафедры нефтегазового дела и нефтехимии Инженерной школы ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук

Паничев Александр Михайлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Евдокимов Владимир Васильевич ФГУП «ТИНРО-Центр»

Ведущая организация: государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дальневосточный государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Защита состоится «?У » (улЛ ¡»р{ Л 2012 г. на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России по адресу: 690091, г. Владивосток, ул. Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета по адресу: 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 26.

кандидат биологических наук, доцент Ковалева Ирина Викторовна

ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан [2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Г.В. Рева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Проблема адаптации организма к стрессовым факторам окружающей среды является одной из ключевых в современной медицине. Актуальной задачей в рамках данной проблемы остается исследование адаптации к климатическим факторам, и, особенно, к низким температурам. Обусловлено это тем, что большая часть России, включая Сибирь и Дальний Восток, являются регионами с суровыми климатогеографическими условиями, поэтому низкие температуры как фактор среды в экологии человека уже давно и всесторонне исследуется (Авцын А.П.,. 1972-1985; Казначеев В.П., 1973-1976, 1993; Луценко М.Т., 1978, 1982, 1991; Доровских В.А., Воронин Н.И„ 1997; Hochachka P.W., Somero G.N., 2002; Козырева T.B. и др., 2003; Mietchen D. et al., 2008; Шаповалов К.Г., 2009; Попова О.Н., Гудков А.Б., 2009; Хаснулин В.И., 2010; Ли О.Н. и др., 2011).

Длительное холодовое воздействие на организм в первую очередь влияет на дыхательные пути и кожные покровы (Бурлакова Е.Б. и др., 1975; Бородин Е.А., 1992; Казначеев В.П., 1993). Угнетение клеток организма при действии низких температур обусловлено снижением в них активности окислительно-восстановительных и повышением активности гидролитических ферментов, развитием тканевой гипоксии, снижением энергетических ресурсов (АТФ), нарушением регуляторных внутриклеточных механизмов (дефицит цАМФ и цГМФ) (Колосова Н.Г., 1981,2000 Шаповаленко Н.С. и др., 2011).

В последние годы все более широкое распространение в науке и технике находят электрохимически активированные растворы (ЭХА-растворы) (Голохваст К.С. и др., 2011). Их уже применяют в медицине, • ветеринарии, металлургии, нефтехимической, электронной, деревообрабатывающей и пищевой промышленностях, коммунальном и сельском хозяйстве, военном деле (Бахир В.М. и др., 1981-2001; Кирпичников. П.А. и др., 1986; Широносов В.Г. и др., 1997,2001,2002; Аракелян К.К., .

2004; Гомбоев Д.Д. и др., 2004-2011).

Для исследования влияния ЭХА-растворов на организм животных в норме и при действии холода был выбран католит - ЭХА-раствор на основе поваренной соли, обладающий широким спектром биологических свойств (Широносов В.Г. и др., 2001,2002; Гомбоев Д.Д., 2011).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение влияния католита в норме и при действии низких температур на гистофизиологическое состояние систем местного иммунитета легких и кожи, а также на биохимические показатели системы перекисного " окисления липидов и антиоксидантной системы.

Достижение поставленной цели предполагается посредством реше-_ ния следующих задач:

1. Выявить характер влияния католита на морфологические показатели системы местного иммунитета кожи и легких.

2. Оценить влияние католита на основные биохимические показатели процессов перекисного окисления липидов (малоновый диальде-гид, диеновые конъюгаты и гидроперекиси липидов) и антиоксидантной системы (витамин Е, церулоплазмин).

3. Сопоставить гистологические показатели местного иммунитета легких и кожи у экспериментальных животных при повреждающем действии низких температур и в сочетании с применением католита.

4. Сопоставить основные показатели состояния системы перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при воздействии на организм низких температур и при коррекции католитом.

Научная новизна исследования. В результате проделанной работы установлены гистофизиологические параметры состояния систем местного иммунитета легких и кожи при воздействии электрохимически активированного раствора хлорида натрия - католита, как отдельно, так и в сочетании с воздействием низкой температуры.

Полученные новые данные влияния католита в норме и при охлаждении на биохимические показатели позволяют расширить понимание - механизма действия электрохимически активированных растворов на живые организмы. Результаты работы указывают на возможность применения католита для профилактики морфофункциональных сдвигов, вызванных действием низких температур на кожу и легкие.

Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенное изучение гистофизиологических изменений в организме при действии низких температур как повреждающих факторов среды, в том числе на фоне коррекции католитом, дополняют фундаментальную картину функционального состояния организма и системы местного иммунитета, как в норме, так и при действии разнообразных внешних факторов.

Полученные данные, указывающие на положительное влияние ка-толита на систему местного иммунитета дыхательной системы и кожи. при охлаждении организма, могут быть использованы в дальнейших исследованиях при разработке технологий применения электрохимически активированных растворов в практических сферах здравоохранения и ветеринарии.

Внедренный нами в процессе исследования патент на полезную модель №76566 позволит ускорить и оптимизировать процессы исследования в гистологии, физиологии и биохимии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ингаляция католита оказывает корригирующее влияние на характер компенсаторно-приспособительных реакций в системах местного иммунитета кожных покровов и дыхательных путей при воздействии холода.

2. Биологическое действие католита при действии низких температур обусловлено повышением эффективности функционирования анти-оксидантной системы в организме.

Апробация диссертации. Результаты работ докладывались на 11-ом съезде врачей-пульмонологов Сибири и Дальнего Востока (2007, Благовещенск), на IX-ой Тихоокеан. науч.-практ. конф. студ. и молод, ученых с междун. участием «Актуальные проблемы эксперим., профи-лакт. и клинич. медицины» (2008, Владивосток), 1-ом Тихоокеан. симп.' с междун. участием «Живое и неживое. Вещественные и энергетические взаимодействия» (2008, Владивосток), на Х-ой Тихоокеан. науч.-практ.. конф. студ. и молод, ученых с мевдун. участием (2009, Владивосток), на VIII Однораловских морфолог, чтениях (2009, Смоленск), на V-om Междун. конгр. «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (2009, Санкт-Петербург), VII Морфолог, конф. «Должанов-ские чтения» (2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 4 статьи в журналах из списка ВАК РФ, а также получен 1 патент на полезную модель РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах компьютерного текста на русском языке. Содержит общую характеристику работы, обзор литературы, материалы и методы, ре-

зультаты исследования и их обсуждение, выводы. Список использованной литературы включает 385 источников, в том числе 126 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 20 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объектом нашего исследования послужили лабораторные животные - белые беспородные крысы. В работе использованы 80 самцов белых крыс возрастом не старше 2,5 месяцев и массой 100-150 г. В эксперименте животные охлаждались для вызова воспаления дыхательных путей и кожи (Непомнящих Г.И. и др., 1984; Нихельман М„ 2001). Для этого использовалась климатическая камера "ILKA" (Feutron), где при . соблюдении адекватных условий влажности и вентиляции, задавалась температура -15 С, равная температуре холодового наркоза и незначительно превышающая величину биологического нуля для крыс (Иши-

" мова JI.M. и др., 1980). Охлаждение проводилось в течение 15 сут по 3 ч в день.

Католит использовался с pH 10,0, окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) = - 800 мВ (определялось рН-метром и иономе-ром фирмы "Hanna", Германия). Католит вырабатывался в установке СТЭJI-1 ОН-120-01 (ЗАО НИЦ «ИКАР») и Изумруд ЗКФТО (НПП «Изумруд») путем электрохимической обработки 1% раствора хлорида натрия в питьевой воде (сертификат соответствия на установки типа СТЭЛ, выданный Госстандартом России в 1994 году, N00370039). Католит распылялся в закрытой камере размером 1 мх1 Mxl м в дозировке 10 мл на одну крысу с помощью ультразвукового портативного ингалятора УП-0,25 "АРСА" (ОАО «Саранский приборостроительный завод»).

Для эксперимента все животные были разделены на 4 группы по 20 особей:

1) «контроль» (К) - интактные животные, не подвергавшиеся воздействию экспериментальных факторов;

2) «холод» (X) - охлаждаемые животные;

3) «католит» (Кат) - животные, которым ингаляционно вводился католит;

4) «католит+холод» (Кат+х) - охлаждаемые животные, которым ингаляционно вводился католит.

Наркоз животных осуществляли внутримышечным введением 0,5 мл 5% раствора калипсола (Гедеон Рихтер А.О.) в соответствии с требованиями приказа МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организованных форм работы с использованием экспериментальных животных». После наступления наркотического эффекта приступали к взятию материала. После экспериментальных воздействий проводился бронхоальвеолярный смыв. Из клеточного содержимого смыва готовились мазки.

Забор материала осуществлялся следующим образом. Скальпелем рассекали кожные покровы и вскрывали грудную клетку вдоль грудины. Затем ножницами отделяли трахею от подлежащих тканей и отсекали ее от гортани. Через трахею шприцем промывали легкие 5 мл холодной питательной среды 199 (ФГУП ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН," Россия). Для получения мазков бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) . центрифугировали в течение 15 мин при 1500 об/мин, осторожно пи-, петкой забирали надосадочную жидкость, оставляя 0,3 мл в пробирке, остаток смешивали с 0,1 мл сыворотки крови исследуемого животного, после чего клеточную взвесь наносили на предметные стекла. Далее мазки фиксировали в парах формалина в течение 15 мин. Окраску производили азур-эозином по Романовскому-Гимза (ООО Реактив Плюс).

Для оценки функционального состояния клеток мазки анализировали и подвергали морфометрической обработке. Фотосъемка осуществлялась на микроскопе Axio Observer Al (Zeiss). Морфометрическое исследование осуществлялось с помощью программы Axio Vision (Zeiss).

Для сравнительного анализа препаратов идентифицировали клетки и производили качественное и количественное описание микроскопической картины каждой группы. Жизнеспособность клеток выявляли ви-. тальной окраской трипановым синим (ООО Реактив Плюс). Подсчет клеток осуществляли по стандартной методике в камере Горяева.

Альвеолярные макрофаги и лимфоциты выделены как бесспорно идентифицируемые и наиболее массово представленные клетки в лава-же. Для репрезентативности при исследовании клеток бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) измерено по 50 клеток каждого типа из каждой -группы (Автандилов Г.Г., 1990). Для систематизации в каждой группе ; подсчитано удельное абсолютное количество клеток, относительное содержание жизнеспособных клеток, относительное число макрофагов и-

лимфоцитов. У каждой выбранной клетки измерено 11 стандартных показателей (Реук В.Д., Пешков A.B., 1976).

Для гистологического исследования материал кожных покровов • фиксировали в 10% забуференном нейтральном растворе формалина, . заливка осуществлялась в парафин. Парафиновые срезы толщиной 57 мкм для обзорного гистологического исследования окрашивали гематоксилином Бемера и эозином, выявления волокон соединительной ткани - орсеином по Унны-Тенцера (ООО Реактив Плюс). Клетки Лангер-ганса идентифицировались с помощью иммуногистохимии. Для свето-оптического и морфометрического исследования применялись полутонкие срезы, окрашенные метиленовым синим (ООО Реактив Плюс).

Для вычисления процента целостности базальной мембраны брали общее количество изображений и рассчитывали долю каждого показателя в группе. Среди критериев были выделены следующие показатели: целая базальная мембрана; базальная мембрана среднеразрыхленная; базальная мембрана очень разрыхленная. Для выявления степени вакуолизации слоев эпидермиса брали общее количество изображений и рассчитывали долю каждого показателя в группе, причем вводили показатели В! - число вакуолей в клетке от 1 до 3 включительно, В2 - число вакуолей в клетке от 4 до 6 включительно, В3 - число вакуолей в клетке от 7 до 9 включительно.

Для оценки биохимического состояния организма определяли уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в сыворотке крови и ткани легких крыс. У забитых животных, вскрывали грудную и брюшную полость, легкие перфузировали 0,15 М раствором KCl, содержащим 5 мМ трис-HCl буфер, pH 7,4. Легкие измельчали ножницами, взвешивали и гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса в соотношении 1:5 в течение 1 мин. Гомогенат легких использовали для определения содержания в нем продуктов ПОЛ и компонентов антиокси-дантной системы (АОС). Липиды из крови и тканей экстрагировали по методу Блайя-Дайера (Кейтс М., 1972). Церулоплазмин в сыворотке крови определяли по методу, основанному на окислении р-фенилендиамина при участии церулоплазмина (Колб В.Г., Камышников B.C., 1976). Малоновый диальдегид (МДА) определяли в цельной крови, гомогенатах легких по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Бородин Е.А., Арчаков А.И., 1987). Определение диено-

вых конъюгатов осуществляли по методу И.Д. Стальной (1977). Количество гидроперекисей липидов определяли на основе их способности окислять ионы Fe2+ с последующей реакцией на Fe3+ с тиоцианатом аммония (Романова Л.А., Стальная И.Д., 1977). Содержание витамина Е. определяли в липидных экстрактах из плазмы крови и тканей по цветной реакции с дипиридилом и FeCl3 (Кисилевич Р.Ж., Скварко С.И., 1972) в модификации М.А. Штарберга (1996). Результаты обработаны в' программе «Statistica 6.0». Вычислена средняя арифметическая величина (М), ошибки средней величины (ш) и степени достоверности (р) различий между показателями с учетом доверительной вероятности по критерию Стьюдента-Фишера.

Результаты исследования и их обсуждение

1. Система местного иммунитета легких в норме и при охлаждении. Действию холода как повреждающего фактора на систему дыхательных путей млекопитающих посвящено много отечественных и зарубежных исследований (Деряпа Н.Р., 1977; Непомнящих Г.И., 1984; Авцын А.П. и др., 1985; Bennett A.F. et al., 2000). Известно, что дыхательные пути одними из первых реагируют на воздействие экстремальных факторов воздушной среды (Колосова Н.Г., 2000; Зиновьев C.B. и др., 2001; Skold C.M.et al., 1995). Нами были изучены альвеолярные макрофаги и лимфоциты - компоненты системы местного иммунитета дыхательных путей, которые, по данным некоторых авторов (Годар Ф. и др., 1981; Прокопенко A.B., 2000), являются в норме единственными _ клетками БАЛ.

В группе «К» количество жизнеспособных клеток составило 88,2±4,3%, в группе «X» - 61*3,7%, в группе «Кат» - 93,4±4,7%, в груп- ' пе «Кат+х» - 85±4,1 % (во всех группах р<0,05). ^

Количество клеток в 1 мл в группе «К» составило 1,5±0,1х10 , в группе «X» - 5,8±0,4х105, в группе «Кат» 1,55±0,1 х 105, в группе «Кат+х» - 2,1±0,15х Ю5 (во всех группах р<0,05).

В группе «X» наблюдалось почти 4-кратное увеличение количества клеток в 1 мл с 1,5±0,1х105 до 5,8±0,4х105 по сравнению контрольной группой.

Такой эффект при действии неблагоприятных факторов отмечают ряд авторов (Шульцев Г.П., Висин А.Н., 1992; Прокопенко A.B., 2000).

Скорее всего, это говорит о компенсации системы местного иммунитета дыхательных путей посредством пролиферации клеток, и холод в данном случае следует рассматривать как повреждающий фактор.

Макрофаги и лимфоциты в разных группах выявлялись в разных пропорциях. В группе «К» макрофаги составляли 60±3,4%, лимфоциты- 30±1,7%, в группе «X» 23±1,6 и 65±3,2 соответственно, в группе «Кат» - 69±3,3 и 23±1,4, в группе «Кат+х» - 58±2,7 и 31±1,5 (во всех группах р<0,05).

При действии холода клеточный состав менялся в сторону увеличения количества лимфоцитов (до 65%) и уменьшения количества макро. фагов (до 23%). По мнению Бойчук Н.В. с соавторами (1997), кроме классических защитных функций макрофаги также выделяют факторы, ингибирующие функцию Т-лимфоцитов. Поскольку в условиях нашего " эксперимента в группах «К» и «X» незавершенный фагоцитоз не наблюдался, то инвертирование количества макрофагов и лимфоцитов мы объясняем возрастанием пула лимфоцитов, а не гибелью макрофагов. Вообще в группе «X», по сравнению с группой «К», у макрофагов наблюдалось уменьшение площади ядра на 55%, уменьшение ядерно-цитоплазматического соотношения более чем в 5 раз. У лимфоцитов группы «X», по сравнению с группой «К», выявлено уменьшение площади лимфоцитов на 15% и увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения у лимфоцитов на 35%.

Полученные данные свидетельствуют о том, что холодовое воздействие вызывает явные функциональные изменения в системе местного иммунитета дыхательных путей. У макрофагов наблюдается уменьшение таких морфометрических показателей как округлость ядра, длины, длины ядра, площади, площади ядра. Всё это в совокупности с пятикратным уменьшением ядерно-цитоплазматического соотношения в сторону цитоплазмы говорит об угнетении синтетических ядерных процессов у макрофагов при холодовом воздействии, что отмечали и другие исследователи (Юданова Л.А., 1981; Маянский Д.Н., 1991; Прокопенко A.B., 2000). У лимфоцитов же при холодовом воздействии напротив отмечается некоторая стимуляция ядерных процессов, о чем - свидетельствует увеличение длины и площади ядра, а также сдвиг ядерно-цитоплазматического соотношения в сторону ядра более чем на треть. Эти изменения влекут за собой снижение функциональной актив-

ности всех клеток БАЛ, в частности клеточных механизмов местного иммунитета.

2. Система местного иммунитета дыхательных путей при воздействии ЭХА-раствора (католита) и сочетании с холодом. В настоящее время ЭХА-растворы активно исследуются как отечественными, так и зарубежными исследователями (Бахир В.М. и др., 19812003; Hanaoka К. et al., 2004; Kim Mi-Ja et al., 2007; Lee M.Y. et al., 2007; ■ Park J. et al., 2009). Тем не менее, данные по поводу воздействия на систему местного иммунитета дыхательных путей католита при холодовом воздействии в доступной отечественной и зарубежной литературе отсутствуют.

В наших экспериментах данные по количеству жизнеспособных клеток в группе «Кат» (93,4±4,7) достоверно не отличались от группы «К» (88,2±4,3). Это может свидетельствовать о том, что католит не является повреждающим фактором для клеток БАЛ. При световой микроскопии клетки в группе «Кат» визуально отличались от клеток группы

«К» незначительно.

Количество клеток в 1 мл в группе «Кат» и группе «К» достоверно не отличались (1,55±0,1*105 и 1,5±0,1*105 соответственно). Клеточный состав БАЛ в группе «Кат» (69±3,3% макрофагов и 23±1,4% лимфоцитов) достоверно не отличался от группы «К» (60±3,4% макрофагов и

30±1,7% лимфоцитов).

Данные по количеству жизнеспособных клеток в группе «Кат+х» также достоверно не отличались от данных в группе «К», но достоверно ^ отличались от группы «X». Эти факты могут свидетельствовать о том, что католит способствует холодовой адаптации клеток БАЛ.

Увеличение удельного числа клеток при действии холода, скорее всего, говорит о компенсации системы местного иммунитета дыхательных путей посредством пролиферации клеток. О некоторой компенсации повреждающего действия холода в группе животных «Кат+х» может свидетельствовать и уменьшение в 2,7 раза удельного количества клеток в БАЛ по сравнению с группой «X». Причем, если в группе «X» мы наблюдали инвертирование результатов относительного количества макрофагов и лимфоцитов по сравнению с контрольной группой, то в группе «Кат+х» было отмечено преобладание макрофагов. Морфологически макрофаги группы «Кат+х» мало чем отличались от макрофагов

контрольной группы. Этот факт также можно объяснить адаптирующим влиянием католита на функциональную способность макрофагов и лимфоцитов при повреждающем действии холода.

3. Кожа и система местного иммунитета кожи в норме и при охлаждении. При действии общего охлаждения на теплокровных животных, в том числе на крыс, в первую очередь страдают кожные покровы, поскольку именно кожа играет важную роль в защите организма от факторов внешней среды. После устранения локальной гипотермии в организме продолжается реакция на холодо-вую травму. В частности это проявляется в виде отека, нарушении .структуры и функции кожи (Клинцевич Г.Н., 1970, 1973). Показано, , что после отморожения эпителий утолщается, клетки всех слоев нек-ротизированы, ядра пикнотичны, цитоплазма вакуолизирована (Аки-"мов Г.А. и др., 1977).

В ходе нашего эксперимента при охлаждении общий план строения кожи лап и ушей сохранился, но обнаруживалось постепенное увеличение слоев эпидермиса. Аналогичные данные получены Мяделец О.Д. (1984), при этом выявлялись морфологические изменения кератиноци-тов, что заключалось в набухании и лизисе клеток, флокуляции ядерного хроматина в базальном, а иногда и в шиповатом слоях. Шиповатый, зернистый и роговой слои кожи лап и ушей утолщались.

При воздействии холода наблюдалось достоверное увеличение вакуолизации слоев эпидермиса кожи лап, причем в большей мере таким изменениям подвергался базальный слой, а шиповатый и зернистый в меньше степени (табл. 1).

При действии общего охлаждения наблюдалось уменьшение ядер клеток кератиноцитов, в частности в базальном и шиповатом слоях кожи лап и ушей. Это указывает на то, что при увеличении вакуолей в клетке нарушается структура и снижаются функции органоидов (Shackle-ford J.M., 1984; Weedon D., 1985). В конечном счете это нарушает функциональную активность кератиноцитов.

В постгипотермическом периоде снижалась численность и функциональная активность клеток Лангерганса в эпидермисе, что приводи--ло к утолщению эпидермиса. В нашем эксперименте в клетках Лангерганса в коже лап и ушей увеличивается размер ядрышка и повышалось содержание хроматина в ядре.

Таблица 1

Вакуолизация слоев эпидермиса кожи лапы при общем охлаждении у интактных и экспериментальных крыс

Слои

Базальный

Шиповатый

Зернистый

Показатели

В,

В,

В,

В,

В,

В,

В,

Примечания: * - р<0,05.

К,%

Х,%

56,3*

48,4*

34,1н

46,3*

27,4*

30,7*

В проведенных экспериментах выявлено, что в клетках Меркеля повышается содержание хроматина в ядре и гранул в цитоплазме. Количество хроматина в ядре у лимфоцита также возрастает. Анализируя экспериментальные данные по клеточному составу можно судить о достоверном снижении соотношения ядра и цитоплазмы у клеток Лангер-ганса и Меркеля, при этом у лимфоцитов уменьшается только ядро (табл. 2).

Акимов Г.А. с соавт. (1977) выявили, что при отморожении сосоч-ковый слой сглажен, придатки кожи некротизированы, базальная мембрана сильно разрыхлена. В ходе нашего эксперимента наблюдались не столь сильные изменения в коже, что, скорее всего, связано с менее глубокой степенью поражения. Сосочки эпидермиса кожи лап и ушей увеличивались, при этом становились тоньше и выше. Базальная мембрана под действием холода становилась более разрыхленной и фрагментиро-ванной, что было особенно заметно в коже ушей. Таким образом, при охлаждении базальная мембрана разрыхляется, что сказывается на уровне трофических процессов в эпидермисе и как результат ведет к нарушению скорости деления в клетках базального слоя. В сосочковом слое коллагеновые волокна становились более длинными, тонкими и хаотично расположенными. В сетчатом слое пучки коллагеновых волокон становились толстыми, хаотичными и длинными.

Таблица 2

Морфометрические данные клеток Лангерганса, Меркеля и лимфоцитов кожи лапы при общем охлазвдении

у интактных и экспериментальных крыс_

Показатели Ядро, мкм Клетка, мкм

К X Кат+х К X Кат+х

Клетка Лангерганса

Р 40,46±1,57 33,П±2,27* 32,75±1,43 53,83±1,37 40,44±1,7** 46,76±2,17

S 49,49±3,95 32,55±2,63** 35,26±3,73 132,1±5,41 93,63±4,62** 124,59±4,34**

1 11,6±1,44 8,25±0,5* 8,07±0,86 15,39±0,66 11,65±0,74* 13,04±0,73

h 5,9±0,5 4,81±0,4 4,62±0,32 14,08±0,54 6,71±0,64** 10,28±0,37*

Клетка Меркеля

Р 47,65±2,26 32,77±2,77** 36,59±1,46 60,17±1,33 41,53±1,4** 47,59±1,13

S 90,1 ±5,69 50,89±2,19** 63,66±3,44* 175,68±8,77 106,3±5,02** 155Д9±6,30**

1 17,23±0,45 10,5±0,б** 12,58±0,52 18,66Я),72 12,59±0,53** 15,12±0,71

h 8,69±0,45 5,85±0,56* 8,3±0,19* 17,86Я),48 7,08±0,39** 12,07±0,51*

Лимфощпы

Р 33,64±0,81 26,74±0,17* 23,77±0,89 41,16±2,38 30,92±1,07* 32,47±1,43

S 49,39±2,53 28,84±2,23** 29,77±0,83 100,06*3,72 76,59±3,73** 82,96i2,60

1 7,75±0,26 6,1 Ш, 34 6,3±0,23 9,24±0,72 8,04±0,72 8,12±0,45

h 6,55±0,26 4,51±0,3* 3,72±0,19 8,56±0,6 7,63±0,22 7,76±0,50

Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,001.

Р - периметр, S - площадь, h - ширина, 1 - длина.

Выявленные изменения означают, что при холодовом воздействии у коллагеновых волокон усиливается их хаотичность и разветвленность, в строении наблюдается удлинение, утолщение и образование крупных пучков. Все это говорит об активации фибробластов. При сравнении изменений в строении коллагеновых волокон отмечена тенденция их увеличения в коже лап, по сравнению с кожей ушей. Аналогичные результаты дают исследования изменений коллагеновых волокон под влиянием холода, выполненные некоторыми исследователями (Chris-tiano А.М. et al., 1994; Egan G.F. et al., 2005; Datrice N. et al., 2006).

Согласно нашим наблюдениям, происходит дальнейшее утолщение эластических волокон, возрастает хаотичность их строения с образованием крупных пучков в сетчатом слое. Как было показано ранее (Soter N.F. et al., 1983; Bienenstock J. et al, 1987), воздействие низкой темпера-

туры вызывает дегрануляцию тканевых базофилов и отек дермы. Мы выявили, что действие холода вызывало достоверное уменьшение размеров тучных клеток (табл. 3), и, кроме того, наблюдали повышение количества гранул, встречающихся по периферии клетки.

4. Кожа и система местного иммунитета кожи при воздействии католита, а также при введении католита в сочетании с холодом. В результате проведенных исследований мы можем отметить, что при ингаляции католита строение кожи и все измеренные клеточные показатели достоверно не отличаются от группы «К» (табл. 2). Это позволяет сделать вывод, что католит в исследованном режиме ингаляции не является токсичным по отношению к клеткам кожи, что подтверждается данными других авторов (Hanaoka К. et al., 2004; Lee M.Y. et al., 2006; Гомбоев Д.Д., 2007 в, г; 2008; Kim Mi-Ja et al., 2007; Ашхаб Д.С.[ 2008,2009; Ye J. et al., 2008).

В группе «Кат+х» толщина эпидермиса кожи лап в результате действия католита приближалась к таковым в контрольной группе, и в эпидермисе наблюдались явления митоза и уменьшение слоев клеток.

В нашем эксперименте динамика изменения толщины слоев эпидермиса в коже ушей позволяет выявить эффективность действия католита на фоне охлаждения. Также в коже ушей часто наблюдалась картина митоза в клетках базального слоя. Известно, что у животных при применении антиоксидантов увеличивается фагоцитарная активность макрофагов (Серебренникова С.Н., Семинский И.Ж., 2008). Сравнивая морфометрические данные клеток Лангерганса с показателями ядерно-цитоплазматического соотношения, можно отметить, что под действием холода отмечается уменьшение ядра и цитоплазмы.

В целом, при воздействии католита в коже ушей все морфометрические показатели приближаются к показателям близким для интактных животных. Полученные нами результаты не противоречат ранее опубликованным данным по цитофизиологии клеток Лангерганса (Schuler G., 1991; Hernando J.C.et al., 1994; Emilson A., Scheynius А., 1995; Romania S et al., 2006). В случае применения католита при охлаждении в коже лап в клетках Меркеля достоверно увеличивается ядро. Ядерно-цитоплазматическое соотношение не изменялось (табл. 2). В ядрах клеток Меркеля в коже ушей в группе «Кат+х» возникают глубокие инвагинации, появляются ядрышки по периферии ядра, хроматина и

мелких гранул. Ранее было показано, что использование антиокси-дантов при охлаждении увеличивает защитную способность кожи (Sharif Alia S. et al., 2008; Yamazaki F., 2010), в частности, это касается лимфоцитов.

При действии холода происходит уменьшение ядра лимфоцитов на фоне увеличения цитоплазмы клетки, т.е. ядерно-цитоплазмати-ческое соотношение изменяется в пользу цитоплазмы. По нашим данным, в лимфоцитах при действии католита на фоне охлаждения в коже выявляется мелкий хроматин по всему ядру, инвагинации ядра были минимальные, а морфометрические данные стремятся к контрольным показателям. В эксперименте в группе «Кат+х», по сравнению с группой «X», повышался процент сохранения целостности базальной мембраны в коже лапок и ушей. В сосочковом слое дермы коллагеновые волокна ориентированы как в вертикальном, так и в горизонтальном направлениях относительно эпидермиса. Расположение и количество коллагенновых волокон в коже лап и ушей в группе «Кат+х» соответствовали контрольной группе.

У тучных клеток в группе «Кат+х», где коррекция вызывала положительную динамику структуры и размера, мы наблюдали увеличение количества гранул в цитоплазме и размеров тучных клеток (табл. 3). Гранулы в тучных клетках кожи лап и ушей становились крупными и заполняли центр клетки.

Таблица 3

Морфометрические данные тучных клеток кожи лапы при общем охлаждении у интактных и экспериментальных крыс

Клетка, мкм

Показатели К X Кат+х

Периметр 35,61+1,54 27,65+1,08* 28,84+0,56

Площадь 57,29+2,08 36,85+1,83** 36,86+1,08

Длина 13,53+0,65 10,14+0,5 12,67+0,72*

Ширина 5,99+0,38 3,86+0,22* 4,36+0,16**

Примечание: * -р<0,05; **-р<0,001.

5. Анализ показателей перекисного окисления липидов и анти-оксидантной системы. При охлаждении, как известно, происходит усиление процессов ПОЛ, нарушение координации компонентов АОС

(Целуйко С.С., 2000; Mietchen М. et al., 2008). В свою очередь, усиление ПОЛ на тканевом уровне сопровождается накоплением липоперекисей и других продуктов окисления в клеточных мембранах, органоидах, в частности митохондриях, что приводит к увеличению скорости утилизации кислорода и разобщению окислительного фосфорилирования. Ускоренное потребление кислорода тканями также интенсифицирует образование продуктов ПОЛ, что сопряжено с определенными патофизиологическими последствиями. Энергетическая эффективность использования кислорода в организме на фоне активации перекисного окисления снижается в связи с тем, что часть кислорода затрачивается на прямое (неферментное) взаимодействие с субстратами малой энергетической значимости. Липоперекиси обладают высокой цитоплазмати-ческой токсичностью, необратимо денатурируют ферментные белки, легко вызывают полимеризацию ферментов, оказывают разрушительное действие на узловые ферменты гликолиза, трикарбонового цикла, а также на макроэрги (Прилуцкий В.И. и др., 1999; Кодинцев В.В., 2000; Колосова Н.Г., 2000).

В нашем исследовании, в биохимическом анализе плазмы крови, при сравнении групп «Кат» и «К» наблюдалось снижение количества МДА на 21,2%, увеличение количества витамина Е на 15%, что может свидетельствовать об антиоксидантной активности католита в норме на уровне организма и отсутствие прооксидантного эффекта. В ткани легких зафиксировано снижение уровня гидроперекисей на 20%.

Как мы видим, механизм действия католита на живую систему оказался очень похожим на действие уже описанных в литературе антиок-сидантов. Сильная восстановительная активность католита определяется способностью отдавать свободные электроны окисленным соединениям, в том числе свободным радикалам (Кирпичников П.А., 1986; Ба-хир В.М. и др., 1999). Это влечет за собой увеличение активности био-антиоксидантов, стабилизацию клеточных мембран, усиление неспецифического иммунитета и повышение резистентности организма к радиоактивному облучению и токсинам. Таким образом, главным интегрирующим фактором, определяющим направленность общеклеточной ; реакции в сторону биостимуляции или преобладания деструктивных процессов, являются фазовые золь-гель переходы коллоидных структур клетки (Загускин С.Л., 2004). Наличие таких эффектов предполагает ис-

пользование католита в качестве профилактического средства, повышающего иммунитет и устойчивость организма к некоторым неблагоприятным воздействиям.

Биохимические данные при сравнении групп «К», «Кат» и «Кат+х» , приводятся ниже (табл. 4 и 5).

Биохимические показатели ПОЛ

Таблица 4

Показатель/ группа Диеновые конъюгаты (нмоль/мл) МДА (нмоль/мл) Гидроперекиси (нмоль/мл) Витамин Е (мкг/мл) Церулопл аз- мин (мг/100мл)

1.К 51,82+5,15 4,92±0,45 20,18±1,21 27,16±1,69 21,44±1,27

2.Х 67,81±7,04 (Р1,2<0,1) 10,62±2,08 (Ри<0,05) 36Д6±2,78 (р1Д<0,001) 21,01+2,64 (Р1,2<0,1) 15,28+1,62 (Ри<0,05)*

3. Кат 50,26±3,07 (Р1,з>0,1) 3,88+0,27 (Р.,з<0,1) 21,80±2,73 (Р1,з>0Д) 31,39±3,41 (Р1,з>0,1) 20,75±3,01 (Р|,з>0,1)

4. Кат+х 42,24±4,18 (Р1,4>0Д Р2.4<0,02) 5,08±0,64 (Р1,4>0Д р2.4<0,05) 24,36±2,71 (Р1,4>0,1 Р2,4<0,02) 28,01±2,76 (Р!.4>0,1 Р2,4<0,05) 20,84±1,53 (Р1,4>0,1 Р2,4<0,05)

Таблица 5

Биохимические показатели ПОЛ в ткани легких

во всех экспериментальных группах

Показатель/ группа Диеновые конъюгаты (нмоль/г) МДА (нмоль/г) Гидроперекиси (нмоль/г) Витамин Е (мкг/г) Церулопл азмин (мг/100 г)

1.К 221,76±14,86 8,84±1,22 90,58±4,4 205,44±7,38 39,02+2,54

2.Х 294,12±21,67 (Р1.2<0,05) 12,71+1,00 (Р1,2<0,05) 124,36+9,78 (Ри<0,02) 177,31±7,01 (Р1,2<0,05) 28,36+3,07 (Р1,2<0,05)

3. Кат 207,21±22,37 (Р1,з>0,1) 9,06±0,74 (Р1.з>0,1) 72,31±6,58 (Ри<0,05) 203,78±9,56 (р.,з>0Д) 38,25±3,66 (Ри>0Д)

4. Кат+х 226,31±17,14 (Р1,4>0Д Р2.4<0,05) 8,81 ±0,90 (Р1,4>0,1 р2,4<0,02) 94,76±6,68 (Р1,4>0Д Р2,4<0.05) 206,65±8,71 (Р1.4>0Д р2,4<0,05) 38,81±2,89 (Р1,4>0Д Р2,4<0,05)

В биохимическом анализе крови группы «Кат+х» наблюдалось увеличение уровня церулоплазмина на 36% по сравнению с группой «X»,

снижение количества диеновых конъюгат на 18,5% по сравнению с группой «К» и на 38% по сравнению с группой «X», снижение количества МДА на 52% по сравнению с группой «X», увеличение уровня гидроперекисей на 20,7% по сравнению с группой «К» и уменьшение на 33% по сравнению с группой «X», увеличение на количества витамина Е 33,3% по сравнению с группой «X». В ткани легких наблюдалось такое же содержание церулоплазмина как и в группе «К» и его увеличение на 37% по сравнению с группой «X», уменьшение количества диеновых конъюгат на 23% по сравнению с группой «X», такое же количество МДА как и в контрольной группой и снижение на 31% по сравнению с группой «X», уменьшение уровня гидроперекисей на 24% по сравнению с группой «X», такое же количество витамина Е, что и в группе «К» и увеличение его на 16,5% по сравнению с группой «X».

При подведении итогов, становится очевидным, что католит обладает сильной восстановительной активностью, т.е. отдает свободные электроны окисленным соединениям, в том числе свободным радикалам (Бахир В.М. и др., 1999).

ВЫВОДЫ

1. Электрохимически активированный 1% раствор хлорида натрия (католит) в исследованной дозе (10 мл/м3) не оказывает негативных токсических эффектов на морфологические показатели системы иммунитета кожи и легких крыс.

2. Католит при нормальной температуре снижает концентрацию в крови конечного продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида, а в легких - содержание гидроперекисей.

3. Католит при воздействии низких температур повышает жизнеспособность клеток бронхоальвеолярного лаважа, снижает общее число клеток в 1 мл, нормализует популяционный состав клеток (соотношение альвеолярных макрофагов и лимфоцитов) и их морфометрические показатели.

4. Католит при воздействии низких температур снижает вакуолизацию кератиноцитов, повышает морфометрические показатели клеток кожи (клеток Лангерганса, Меркеля, лимфоцитов, тучных клеток), упорядочивает структуру и расположение эластических и коллагеновых волокон, уменьшает разрыхленность базальной мембраны.

5. Механизм защитного действия католита при воздействии низких температур обусловлен его антиоксидантными свойствами (уровни диеновых конъюгат, малонового диальдегида МДА, гидроперекисей, витамина Е и церулоплазмина не отличаются от контрольных показателей).

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Голохваст К.С., Штарберг М.А., Чайка В.В., Кодинцев В.В. Гис-тофизиологическое состояние системы местного иммунитета дыхательных путей при охлаждении и коррекции ЭХА-раствором / Тезисы докладов II съезда врачей-пульмонологов Сибири и Дальнего Востока, 2425 октября 2007 года, Благовещенск. С. 38-41.

2. Голохваст К.С., Чайка В.В., Старков А.Н., Штарберг М.А., Кодинцев В.В. Гистофизиологическое состояние системы местного иммунитета дыхательных путей при охлаждении и коррекции ЭХА-раствором // Бюллетень физиологии и патологии дыхания, 2007. №27. С. 15-17

3. Голохваст К.С., Паничев A.M., Борисов С.Ю., Чайка В.В. Изучение новых классов антиоксидантов // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН,

2008. №2 (60). С. 84-85.

4. Голохваст К.С., Паничев A.M., Борисов С.Ю., Чайка В.В., Кодинцев В.В. Изучение антиоксидантной активности цеолитов и эха-растворов // Первый тихоокеанский симпозиум с международным участием «Живое и неживое. Вещественные и энергетические взаимодействия», 23-24 октября 2008, Владивосток, 2008. С. 106-108

5. Патент РФ на полезную модель №76566. Голохваст К.С., Гуль-ков А.Н., Паничев A.M., Чайка В.В., Борисов С.Ю. «Установка для изучения внешних воздействий на животное» Опубликовано 27.09.2008. Бюл. №27.

6. Чайка В.В. Коррекция последствий холодовой травмы в коже ка-толитом // Материалы Х-ой Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, 21 апреля, 2009 г., Владивосток. С.17-18.

7. Чайка В.В. Некоторые биологические свойства католита при ' действии низких температур // Вестник НГУ. Серия биология и клиническая медицина, 2009. №.3. С. 30-33.

8. Чайка В.В. Действие католита на кожу при действии низких температур // Сборник научных трудов «Однораловские морфологические чтения». Выпуск 8. Воронеж, 2009. С. 299-303.

9. Голохваст К.С., Гульков А.Н., Чайка В.В., Паничев A.M. Электрохимически активированный раствор католит как антиоксидант при воздействии на организм низких температур // Материалы V Международного конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», 29.06-03.07.2009, Санкт-Петербург. С. 49.

10. Голохваст К.С., Рыжаков Д.С., Чайка В.В., Гульков А.Н. Перспективы использования электрохимической активации растворов // Вода: химия и экология, 2011. №2. С. 23-30.

11. Голохваст К.С. Чайка В.В. Альвеолярный макрофаг (краткий обзор) // Вестник новых медицинских технологий, 2011. №2. С. 23-26.

12. Голохваст К.С., Чайка В.В. Некоторые аспекты механизма влияния низких температур на человека и животных // Вестник новых медицинских технологий, 2011. С. 486-489.

Чайка Владимир Викторович

ОЦЕНКА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ И КОЖИ ПРИ ДЕЙСТВИИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР И КАТОЛИТА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 10.01.2012 Формат 60x90 1/16. Усл. п.л. 1,0. Уч. изд. л. 0,75. Тираж 100 экз. Заказ 16

Отпечатано на участке оперативной полиграфии типографии ООО «Рея» г. Владивосток, ул. Адм. Юмашева, 426