Особенности взаимодействия новых гибридных антиоксидантов-ихфанов с эритроцитарной мембраной

Паршина, Евгения Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности взаимодействия новых гибридных антиоксидантов-ихфанов с эритроцитарной мембраной
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Особенности взаимодействия новых гибридных антиоксидантов-ихфанов с эритроцитарной мембраной"

на правах рукописи

Паршина Евгения Юрьевна

ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НОВЫХ ГИБРИДНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ - ИХФАНОВ С ЭРИТРОЦИТАРНОЙ МЕМБРАНОЙ.

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова и в Институте Биохимической Физики им. Н.М. Эмануэля РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, чл.-корр. РАН, профессор

А. Б. Рубин доктор биологических наук Л. Я. Гендель

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук О. М. Панасенко доктор биологических наук, профессор Ю. В. Архипенко

Ведущая организация:

Институт проблем химической физики РАН

Защита состоится «23 » 2006г., в (У.РР часов на заседании

Диссертационного совета Д 501.001.96 по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики, ауд. г *

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан « ргфаАРгш г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

ПОДПИСЬ РУКИ ЗАВЕРЯЮ

!« тюмяж м* МГУ

;елева

ЛОО Gf\ SG o7

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Важной задачей физико-химической биологии и фармакологии является поиск новых эффективных лекарственных препаратов. Одно из направлений поиска - создание препаратов комбинированного действия, то есть соединений, содержащих в своей структуре фрагменты, обладающие различными видами биологической активности. Таковыми являются синтезированные в ИБХФ РАН гибридные антиоксиданты - ихфаны (Никифоров и др., 2003). В их структуру включены два фрагмента, обеспечивающие антиоксидантную и антихолинэстеразную активности, кроме этого они имеют боковой алкильныЙ заместитель с различным содержанием углеродных атомов в алифатической цепи, обуславливающий гидрофобные свойства производных этого ряда. Химический дизайн ихфанов, по мнению ряда авторов, позволяет рассматривать их в качестве перспективных препаратов для лечения болезни Альцгеймера (Braginskaya et al., 1996; Molotchkina et al., 2002; Бурлакова и др., 2003).

Выявлены высокая антиоксидантная активность ихфанов и их ингибирующее действие на ацетилхолинэстеразу эритроцитов человека, а также различия в эффективности действия разных по гидрофобным свойствам производных (Braginskaya et al., 1998; Озерова, 2000; Molotchkina et al., 2002; Никифоров и др., 2003).

Важным этапом во взаимодействии экзогенного соединения с клетками является процесс его мембранного транспорта, в частности, интеркаляция в мембрану и распределение во внутримембранном пространстве (Stein, 1981; Гендель, Круглякова, 1986; Balaz, Lukacova, 2002). Несмотря на важность проблемы мембранный транспорт ксенобиотиков, в том числе органических катионов, все еще остается недостаточно изученным.

Не были исследованы особенности мембранного транспорта производных ряда ихфанов и их влияние непосредственно на структуру плазматической мембраны эритроцитов. В связи с этим в данной работе использовали методы сканирующей электронной микроскопии и спиновых зондов, позволяющие получать взаимодополняющую информацию о влиянии ксенобиотиков на морфологию эритроцитов и структуру эритроцитарной мембраны, а так же об особенностях распределения различных по гидрофобным свойствам соединений, в том числе и производных ряда ихфанов, во внутримембранном пространстве. Такая информация важна для понимания механизмов действия этих биологически активных веществ и разработки подходов к синтезу новых лекарственных препаратов.

Цель настоящей работы. Изучить физико-химические особенности взаимодействия новых гибридных антиоксидантов ряда ихфанов с мембранами эритроцитов для установления взаимосвязи химической структуры производных с их интеркалированием в мембрану и распределением во внутримембранном пространстве и выяснения влияния гидрофобных свойств ихфанов на их мембранотропное действие.

Основные задачи исследования:

-изучить методом сканирующей электронной микроскопии действие производных ряда ихфанов на морфологию эритроцитов. Оценить влияние различных по гидрофобности боковых заместителей в структуре ихфанов на кинетику индуцируемых ими морфологических трансформаций эритроцитов и специфику распределения производных во внутримембранном пространстве;

- изучить гемолитическую активность ихфанов и выявить концентрации, в которых изученные производные оказывают гемолитическое действие;

-изучить методом спиновых зондов влияние ихфанов на структуру плазматической мембраны эритроцитов и мембран липосом. Провести сравнительный анализ эффективности структурно-модифицирующего действия производных с различными по структуре и гидрофобным свойствам боковыми заместителями.

Научная новизна работы, В работе впервые изучено влияние новых гибридных антиоксидантов - представителей гомологического ряда ихфанов на структурные особенности мембраны эритроцитов. Установлено, что ихфаны индуцируют изменения морфологии эритроцитов, оказывая эхиноцитогенное и стоматоцитогенное действия. Обнаружены различия в кинетике и эффективности трансформирующего действия различных по гидрофобным свойствам производных, отражающие особенности процесса их мембранного транспорта во внутренний монослой эритроцитарной мембраны.

Показано, что ихфаны с объемным гидрофобным заместителем способны вызывать гемолиз эритроцитов. Выявлена зависимость гемолитической активности от концентрации производного и структуры его гидрофобного заместителя.

Установлено модифицирующее действие ихфанов на структуру мембран эритроцитов и липосом. Выявлено уменьшение микровязкости как поверхностных, так и более глубоких областей эритроцитарной мембраны под действием ихфанов, а также влияние химической структуры и гидрофобных свойств бокового заместителя на характер распределения производных ряда ихфанов в мембране. Обнаруженные структурные модификации мембраны липосом ихфанами указывают на возможное участие липидной компоненты в их мембранотропном действии на эритроцитарную мембрану.

Научно-практическое значение. Получены новые важные данные о мембранотропном действии ихфанов, дополняющие характеристику их биологической активности как потенциальных лекарственных препаратов. Обнаруженные эффекты ихфанов необходимо учитывать при их возможном практическом использовании.

Результаты работы расширяют представления о взаимодействии органических катионов с биологическими мембранами, в частности, с мембранами эритроцитов, а также о влиянии гидрофобного заместителя, введенного в структуру биологически активных соединений, на особенности их распределения во внутримембранном пространстве и их мембранотропные свойства.

Полученные данные вносят вклад в изучение механизмов действия гибридных соединений, в частности указывают на возможность неспецифического ингибирования мембраносвязанной ацетилхолинэстеразы эритроцитов ихфанами, обусловленного изменениями структуры мембраны.

Результаты работы могут быть использованы для выработки практических рекомендаций при выборе оптимального гидрофобного заместителя в молекуле ихфанов, а также для разработки подходов к направленному синтезу лекарственных соединений.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на 3-ей Молодежной конференции ИБХФ РАН - Вузы Биохимическая физика (Москва, 2003), 5 Meeting of European Fédération of ESR Groups (Portugal, 2003), конференции "Фундаментальные науки - медицине", (Москва, 2003), П1 Съезде Биофизиков России (Воронеж, 2004), конференции "Современные достижения магнитного резонанса" (Казань, 2004), European Association for Red Cell Research 15й1 Meeting (Murten, Switzerland, 2005).

Публикации по теме исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Список публикаций приведен в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, заключение, выводы, приложение и список цитируемой литературы ( /¿ü"работ). Работа изложена на /¿Û страницах и включает б_ таблицы и ¿¿_ рисунков.

Содержание работы.

Материалы и методы исследований.

Основными объектами исследований служили эритроциты из крови крысы и человека, а также липосомы на основе фосфатидилхолина.

Эритроциты получали из крови взрослых беспородных белых крыс и крови человека, выделенной методом венопунктуры. В качестве

антикоагулянта использовали гепарин. Эритроциты выделяли по методу (Isomaa, Hagerstrand, 1987) посредством 3-х кратного центрифугирования при +4°С в буфере А (145 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 4 мМ Na2HP04, 1 мМ NaH2P04, 1 мМ MgS04, 1 мМ СаС12,10 мМ глюкозы, рН=7.4).

Липосомы получали по методу (Racker, 1973) с модификациями путем озвучивания суспензии L-a-лецитина (Sigma, США), содержащего 17% фосфатидилхолина, в буфере В (50 мМ K-фосфатный буфер, 2 мМ MgS04, рН=7,5) на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т.

В работе использовали синтезированные в ИБХФ РАН д.х.н. Никифоровым Г.А. производные гомологического ряда ихфанов (Никифоров и др., 2003)

Для изучения морфологии эритроцитов применяли методику, предложенную в работе (Козинец, Симоварт, 1984) с модификациями. Эритроциты фиксировали в 1% растворе глютарового альдегида (SERVA, Германия) в буфере A (pH 7,4) в течение 3 часов или в 2.5% растворе глютарового альдегида (Sigma, США) в течение 1 часа с последующей отмывкой клеток. Для исследования методом СЭМ образцы напыляли слоем платины с палладием в вакуумном ионном распылителе ЕПСО ГО-3. В работе использовали сканирующий электронный микроскоп CAMSCAN (Великобритания) и световой микроскоп Carl Zeiss (Германия).

Способность ихфанов вызывать гемолиз эритроцитов изучали спектрофотометрическим методом с использованием спектрофотометра Specol 11 (Carl Zeiss, Германия).

Исследования методом ЭПР проводили с использованием спин-меченых производных стеариновой кислоты (5- и 16-доксилстеарат) (Sigma, США) (зонды I и П, соответственно) и спин-меченого производного у-карболина (зонд III) (синтезирован в ИХФ РАН (Розанцев, 1970; Панасенко и др., 1980)). Химические названия и структурные формулы, а так же спектры ЭПР в суспензиях эритроцитов и микросом использованных в работе нитроксильных радикалов приведены в табл. 1.

В качестве параметров, характеризующих структурное состояние мембраны, использовали 2А'ц и т для зондов I и II, соответственно. Величину 2А'ц (пропорциональную параметру псфядка S (Смит, Шриер-Мучилло, 1979)) определяли как расстояние (в Гс) между экстремумами спектра ЭПР в области низких и высоких полей (см. табл.2). Значения т оценивали с использованием формулы (Анциферова, Вассерман, 1977):

г = 6,65хД#+1

хЮ"10

сек,

где А-1 амплитуды, соответственно, низкополевой и

высокополевой компонент спектра ЭПР, - ширина (в Гс)

низкополевой компоненты спектра.

Для исследования влияния ихфанов на кинетику аскорбат-индуцированного восстановления радикальных центров спиновых зондов I и

г _Ао(0/ и ( \

III использовали параметр "о~ //г0(г =2мин)' где интенсивности

центральной компоненты спектра ЭПР нитроксильного радикала в зависимости от времени I после введения аскорбата в суспензию липосом.

Таблица 1. Использованные в работе спиновые зонды.

Номер зонда I II III

Структурная формула и химическое название ГЪ-о CHl—<CH2)ll-ic£--<CH2)3-СООН 5-доксил стеариновая кислота СИ, rt- CHJ-СН2—ci— (СНЯи-СООН 16-доксилстеариновая кислота | и С4Н9 2,2,4,4-тетраметил-9-бутил-1,2,3,4-тетрагидро-у-карболин-3-оксил

Схема определения параметров 4 2А', Р !/ / ю гс (\=г I 10 Го 1

В работе использовали ЭПР-спектрометры РЭ-1306 и РЭ-1307.

Инкубацию с исследованными соединениями во всех экспериментах и регистрацию спектров ЭПР проводили при температуре 18±2°С. Исследованные соединения и спиновые зонды использовали в виде растворов в этаноле, конечное содержание этанола в пробе не превышало 1,2 об. %.

Статистическую обработку результатов проводили на основе компьютерной программы 81айзйса 5.5 с использованием критерия Стьюдента и коэффициента корреляции Пирсона.

Результаты исследований и их обсуждение.

1. Влияние ихфанов на морфологию эритроцитов.

Известно, что ксенобиотики, в частности синтетические антиоксиданты, способны влиять на морфологию эритроцитов (Shcetz, Singer, 1976; Isomaa, Paatero, 1981; Гендель и др., 1996; Hagerstrand et al., 2000; Лунева и др., 2002, 2005). Согласно представлениям, развитым в работах Шитса и Сингера (Sheetz, Singer, 1974) изменения формы эритроцитов, индуцируемые интеркалирующими в мембрану химическими агентами отражают особенности распределения этих веществ во внутримембранном пространстве. В связи с этим целью настоящего раздела

работы было изучение методом сканирующей электронной микроскопии влияния различных по гидрофобным свойствам ихфанов на морфологию эритроцитов и выяснение особенностей их распределения во внутримембранном пространстве.

1.1. Оценка гидрофобности ихфанов с различными заместителями у четвертичного атома азота.

В табл.2 приведены использованные в работе производные группы ихфанов. В левой части структуры они содержат фрагмент представленный экранированным фенолом, обеспечивающий их антиоксидантные свойства, справа находится фрагмент - остаток холина, обуславливающий антихолинэстеразную активность соединений и там же расположен связанный с четвертичным атомом азота алкильный заместитель, содержащий в алифатической цепи 1, 8, 10, 12 или 16 атомов углерода. Наличие в структуре ихфанов четвертичного атома азота придает им положительный заряд и свойства органических катионов.

Таблица 2. Химические названия, структурные формулы и условные обозначения производных ряда ихфанов.

Структурная формула X Углеводородный радикал R Условное обозначение

НзС/^'у^НЗ OftCH2COOC4jCH2—R X ¿Нз J' -СН3 И(С-1)

Вг" -с8н17 И(С-8)

-С,оН21 И(С-Ю)

-С12Н25 ЩС-12)

-С16Н33 ЩС-16)

Для характеристики гидрофобных свойств ихфанов оценивали значения их коэффициентов распределения в системе окганол-вода (K<,w):

f _ Coctaaol ow - '8 ,

cwater

где Codanoi и cwater - концентрации исследуемого вещества в неполярной фазе (октаноле) и водной фазе в равновесном состоянии, соответственно. Этот параметр широко используется для оценки гидрофобности различных органических соединений (Hanch, Leo, 1995).

Теоретические значения К,,«, вычислены с использованием программы LogKow(KowWin) (Meylan, Howard, 1995), в основу которой положен метод суммирования гидрофобности фрагментов соединения.

На основе проведенных вычислений доя ихфанов выявлена линейная зависимость их гидрофобности от числа углеродных атомов в алифатической цепи заместителя (рис.1), т.е. чем длиннее углеводородная цепочка бокового

заместителя, тем больше его производного.

вклад в гидрофобность соответствующего

Рис 1 Зависимость вычисленных значений коэффициентов распределения ихфанов в системе октанол-вода от числа углеродных атомов в алифатической цепи гидрофобного заместителя

О 2 4 б в 10 12 14 IS количество атомов С

1.2 Кинетика изменений морфологии эритроцитов под влиянием ихфанов.

Основная масса эритроцитов млекопитающих в норме представлена дискоцитами и имеет гладкую поверхность и форму двояковогнутого диска. Под влиянием экзогенных соединений, интеркалирующих в мембрану (Sheetz, Singer, 1976), может происходить трансформация эритроцитов в форму эхиноцитов - клеток с множественными выростами, стоматоцитов -клеток, имеющих форму спущенного мяча, и сфероцитов - сферических клеток, являющихся предлитической стадией трансформации (названия форм приведены в соответствии с классификацией Бессиса (Bessis, 1974)). На рис 2 приведены полученные в работе электронные микрофотографии различных морфологических форм эритроцитов.

Рис 2 Электронные микрофотографии морфологических форм эритроцитов крысы (хЮОО)

Изучение влияния на морфологию эритроцитов представителя гомологического ряда ихфанов - И(С-10) показало, что это производное в концентрации 5 * 1 О*5 М и выше в результате 30 мин инкубации с суспензией эритроцитов вызывает концентрационно-зависимое увеличение содержания стоматоцитов. Для дальнейших исследований была выбрана концентрация

1x10-" М (6х106 молекул на эритроцит) при которой И(С-10) индуцирует изменения формы эритроцитов, не вызывая при этом разрушения клеток.

С целью выяснения характерных особенностей влияния ихфанов на форму эритроцитов исследовали кинетику изменения содержания различных морфологических форм эритроцитов (Р,%) при добавлении в среду инкубации соответствующих производных. Инкубация суспензии эритроцитов с ихфанами, в случае каждого из использованных соединений, приводила к развивающимся во времени изменениям содержания в суспензии клеток различной формы (рис.3). На начальных этапах инкубации имело место значительное уменьшение содержания дискоцитов (рис.За) и увеличение содержания эхиноцитов (рис.3б). В дальнейшем происходил обратный процесс: уменьшение числа эхиноцитов и возрастание содержания дискоцитов, а так же имело место появление и увеличение содержания стоматоцитов (рис.Зв). На рис.4 представлены микрофотографии эритроцитов при различных временах инкубации с И(С-10). Видно, что под влиянием И(С-10) часть клеток претерпевает описанные выше морфологические трансформации.

8 контроль

• И(С-1)

Д И(С-8)

V И(С-10)

о И(С-12)

е И(С-16)

контроль 0 20 40 во во 100 120 1, мин

контроль О 20 40 во во 100 120

контроль О 20 40 во ВО 100 120

I НИИ

Рис.3. Кинетические зависимости изменения содержания (Р,%) дискоцитов (а), эхиноцитов (б) и стоматоцитов (в) в суспензии эритроцитов под влиянием ихфанов с различными гидрофобными заместителями. Содержание эритроцитов в суспензии 1><107 кл/мкл. Контролем служила суспензия эритроцитов, инкубированная в присутствии 0,8 об.% этанола.

Как видно из данных, приведенных на рис.3 и 5, эффективность трансформирующего действия и характер кинетической зависимости трансформации существенно различны в случае мембранного транспорта производных с разной структурой и гидрофобностью бокового алифатического заместителя.

Наименее гидрофобное соединение И(С-1) оказывало лишь незначительный эхиноцитогенный эффект. Наиболее выраженное

увеличение содержания эхиноцитов на начальных стадиях инкубации и образование наибольшего количества стоматоцитов при увеличении времени инкубации вызывали производные, содержащие в углеводородной цепи бокового заместителя 8, 10, и 12 углеродных атомов. Из них максимальным модифицирующим эффектом обладало соединение И(С-8) (рис.За,в и 5).

контроль

С) л I

" о ^ <

.О о О О {

о о по

10 мин

2 мин

Рис.4. Микрофотографии суспензии эритроцитов крысы в контроле и через 2 , 10 и 90 мин после введения И(С-10) (^Ю^М) в суспензию эритроцитов; ><1000. Условия см. рис.3.

—О- эхиноциты, 2 мин - -А- стоматоциты, 30 мин |

И(С-12)

контроль

И(С-16)

Рис.5. Содержание (Р,%) в суспензии эритроцитов эхиноцитов после 2 мин и стоматоцитов после 30 мин инкубации с различными по гидрофобное™ ихфанами (I х10"4М). Условия см. рис.3.

Производное И(С-1б), с самым объемным и гидрофобным боковым заместителем, отличалось от других соединений ряда ихфанов как менее выраженным эхиноцитогенным эффектом, так и кинетикой морфологических

трансформаций: индуцируемые им увеличение и снижение содержания эхиноцитов происходили на более поздних этапах по сравнению с другими производными.

Для интерпретации полученных результатов использовали гипотезу сопряженного бислоя (Sheetz, Singer, 1974), широко применяемую в настоящее время для объяснения изменений морфологии эритроцитов при действии экзогенных соединений, в том числе катионных амфифилов (Isomaa et al., 1981,1987; Lim et al., 2002; Лунева и др., 2005). Согласно этой гипотезе мембрану эритроцита можно рассматривать как замкнутую пластинку, состоящую из двух скользящих относительно друг друга монослоев. Интеркаляция соединения в наружный или внутренний монослой мембраны приводит к увеличению его площади и образованию эхиноцитов или стоматоцитов, соответственно.

С учётом этих представлений развивающиеся во времени изменения морфологии при инкубации с ихфанами можно объяснить следующим образом. Начальной стадией мембранного транспорта является интеркаляция молекул ихфанов во внешний монослой, что приводит к трансформации части клеток в форму эхиноцитов. В дальнейшем под действием электростатических сил положительно заряженные молекулы, в случае каждого из ихфанов, проникают во внутренний монослой мембраны, несущий отрицательный заряд вследствие преимущественной локализации в нем фосфатидилсерина (Sheetz, Singer, 1974). При этом дисбаланс площадей сначала сглаживается и при достижении компенсаторного эффекта клетки приобретают дискоидную форму. В последующем, по мере накопления молекул ихфана во внутреннем монослое мембраны, к дисбалансу площадей приводит увеличение площади этого монослоя по отношению к внешнему монослою, что является причиной образования стоматоцитов. Следует отметить, что в процесс трансформации формы, в использованных в работе условиях эксперимента, вовлекается только часть клеток в суспензии эритроцитов. По-видимому, в мембраны этих клеток и происходит интеркаляция ихфанов. Процент клеток, переходящих в форму стоматоцитов относительно невелик по сравнению с трансформирующимися в эхиноциты. В связи с этим можно предположить, что в равновесных условиях распределение ихфанов в мембране значительной части клеток приводит к компенсаторному эффекту.

Выявленное в работе влияние гидрофобности ихфанов на кинетику их проникновения в мембрану и распределения во внутримембранном пространстве (рис.5) согласуется с известной немонотонной зависимостью мембранного транспорта, фармакокинетики и биологических эффектов лекарственных соединений от гидрофобности (Котык, Яначек, 1980; Hansch, Leo, 1995; Panchagnula, Thomas, 2000). В случае ихфанов такой характер зависимости может быть обусловлен как гидрофобными свойствами гомологов ихфанов, так и размерами их молекул. Полученные результаты позволяют предположить, что вещество И(С-1), характеризующееся наименьшим в данном ряду соединений, значением коэффициента распределения (Kow, рис.1) в меньшей степени способно интеркалировать в

мембрану по сравнению с более гидрофобными гомологами И(С-8), И(С-10) и И(С-12), которые, по-видимому, обладают оптимальными свойствами для проникновения во внутримембранное пространство. На примере наиболее гидрофобного и объемного соединения - И(С-16) видно, что способность интеркалировать в мембрану в ряду ихфанов снижается с дальнейшим ростом их гидрофобности.

Таким образом, полученные в работе данные позволяют заключить, что молекулы ихфанов обладают способностью интеркалировать в мембрану эритроцитов. Установлено, что при этом они проявляют развивающиеся во времени эхиноцитогенное и стоматоцитогенное действия. На скорость проникновения соединения в мембрану и его распределение во внутримембранном пространстве оказывают существенное влияние его гидрофобные свойства, которые, в свою очередь, определяются гидрофобностью бокового заместителя. Благодаря наличию положительного заряда ихфаны имеют тенденцию к распределению во внутреннем монослое мембраны, куда они поступают, проходя через внешний монослой. Это позволяет сделать вывод о том, что ихфаны могут осуществлять свое биологическое действие в обоих монослоях мембраны.

2. Гемолитическое действие производных ряда ихфанов.

Известно, что амфифильные соединения, в частности гидрофобные органические катионы, в высоких концентрациях способны вызывать разрушение эритроцитарной мембраны и гемолиз эритроцитов (котаа е1 а1., 1986; КЛевгсгупвка й а1., 2000; Ец^ага а а!., 2001). Оценка гемолитического действия органических катионов - ихфанов на эритроциты особенно важна в связи с изучением возможности их использования в качестве лекарственных препаратов, поскольку при попадании в кровяное русло эти соединения могут оказывать прямое влияние на целостность эритроцитарной мембраны.

На рис.6 представлены полученные в работе концентрационные зависимости гемолитической активности различных по гидрофобности ихфанов. Видно, что наименее гидрофобное соединение И(С-1) во всех исследованных концентрациях практически не вызывает гемолиза.

Более гидрофобные гомологи ихфанов индуцируют гемолиз при концентрациях выше 3*107 молекул на клетку, причем степень гемолиза увеличивается с ростом концентрации. Гидрофобные свойства гомологов ихфанов оказывают существенное влияние на концентрационную зависимость их гемолитической активности. Соединение И(С-8) при низких концентрациях обладает меньшей гемолитической способностью по сравнению с веществами И(С-10) и И(С-12). Это может быть обусловлено меньшими размерами молекулы И(С-8), что приводит к менее выраженному нарушению структуры мембраны. Соединение И(С-16) при концентрации 3*107 молекул на клетку вызывает наибольшее повреждение клеток, однако при увеличении концентрации до 4.8x108 молекул на клетку его гемолитическая активность падает по сравнению с другими гомологами. Это может быть обусловлено снижением солюбилизирующей способности

мембраны по отношению к данному соединению, имеюшему наиболее объемный в данном ряду соединений гидрофобный заместитель.

Рис.6. Гемолиз эритроцитов человека под влиянием ихфанов. Содержание в суспензии 25*105

эритроцитов кл/мкл.

* - р<0,05 контролю

по отношению

количество молекул вещества на эритроцит

Таким образом, в работе показано, что изученные производные ряда ихфанов, за исключением И(С-1) обладают кенцентрационно- зависимой гемолитической активностью. В связи с этим для исследования мембранотропного действия ихфанов в настоящей работе были использованы концентрации соединений, вызывающие не более 10-12% гемолиза. Способность ихфанов индуцировать гемолиз важно учитывать в исследованиях их биологической активности как потенциальных лекарственных препаратов.

Выявленные в работе влияние ихфанов на морфологию эритроцитов и гемолитическая активность этих соединений позволили предположить, что интеркаляция молекул ихфанов в эритроцитарную мембрану и их мембранный транспорт скажутся так же и на структурном состоянии внутримембранного пространства. С целью исследования структурно-модифицирующего действия ихфанов на эритроцитарную мембрану использовали метод спиновых зондов.

3. Влияние ихфанов на структуру мембраны эритроцитов и липосом.

В работах (Смит, Бутлер, 1979; Панасенко и др., 1981; Бурлакова, Хохлов, 1985; Гендель, Круглякова, 1986; Tsuchiya, Asada, 2002) показано, что интеркаляция в биомембрану гидрофобных и амфифильных соединений, в том числе синтетических антиоксидантов, может влиять на ее структурное состояние, в частности на микровязкость и упорядоченность липидов в составе бислоя.

3.1 Структурные изменения эритроцитарной мембраны, индуцируемые производными ряда ихфанов. С целью получения взаимодополняющей информации о структурном состоянии разных участков эритроцитаной мембраны были использованы спиновые зонды I и II (табл. 1),

радикальные фрагменты которых располагаются, соответственно, в поверхностных и более глубоких областях мембраны.

В табл. 1 представлены типичные спектры ЭПР спиновых зондов I и И, введенных в суспензию эритроцитов. Для характеристики влияния ихфанов на структуру бислоя использовали параметры 2А'ц и т. Уменьшение 2А'ц и т отражает увеличение жидкостности и уменьшение микровязкости областей распределения спиновых зондов во внутримембранном пространстве.

На примере И(С-10) была исследована концентрационная зависимость влияния ихфанов на структуру мембраны эритроцитов. Было установлено, что достоверное снижение микровязкости (р<0,05) проявляется при концентрации вещества ЗхЮ7 молекул на эритроцит (что соответствует концентрации ихфана 5*10"4М в экспериментальном образце). Все дальнейшие эксперименты с ихфанами проводили с использованием их в данной концентрации.

На рис.7 приведены кривые, отражающие относительные изменения величин 2А'ц зонда I и т зонда II в ходе инкубации эритроцитов с производными ряда ихфанов. Видно, что ихфаны в большинстве случаев вызывают уменьшение средних значений 2А'ц и т. Это указывает на индуцируемое этими веществами снижение микровязкости как поверхностных, так и более глубоких областей внутримембранного пространства.

Рис.7. Изменения параметров 2А'ц зонда I и т зонда П при инкубации суспензий эритроцитов в течение 30 мин с производными ряда ихфанов (5x10"4!*!). Концентрация спиновых зондов содержание эритроцитов в суспензии 1x10 кл/мкл.

[(контроль

Ат,% =(Т«шт -Тшетрои) * 100/ Ткстрот

* - р<0,05 по отношению к контролю.

Амплитуда выявленных изменений величин 2А'ц и т невелика, как и в случае действия других биологически активных веществ (Киту, МсСоппеИ, 1975; Гендель и др., 1997). Наиболее выраженное уменьшение указанных параметров вызывали соединения И(С-8) и И(С-10). Производное И(С-1) не оказывало заметного влияния на микровязкость поверхностных областей мембраны и снижало микровязкостъ ее глубинных структур. В отличие от этого соединения производное И(С-16), содержащее наиболее объемный боковой заместитель, модифицировало структуру мембраны в основном вблизи ее поверхности.

Полученные данные указывают на то, что разные по структуре бокового заместителя и по гидрофобным свойствам производные ряда

ихфанов в ходе мембранного транспорта модифицируют структуру различных областей внутримембранного пространства, являющихся, по-видимому, областями их локализации. Можно предположить, что наименее гидрофобное соединение И(С-1) расположено во внутренних областях мембраны, не оказывая влияния на структуру ее поверхностных областей. Вещества И(С-8), И(С-10) и И(С-12) располагаются ближе к поверхности мембраны, вызывая изменения микровязкости как поверхностных, так и более глубоких областей мембраны. Вещество И(С-16) локализуется в близких к поверхности областях мембраны, не вызывая изменения структуры более глубоких областей. Влияние структуры бокового заместителя и гидрофобности производного на его распределение в эритроцитарной мембране было показано ранее на примере гомологических рядов спин-меченых неэлектролитов в работах (Гендель, Круглякова, 1986; Лунева и др., 2005). В данной работе установлено, что введение различных по гидрофобным свойствам заместителей в основную структуру вещества -органического катиона так же оказывает существенное воздействие на их распределение в мембране.

Различия в эффективности модифицирующего действия производных ряда ихфанов могут быть отражением того, что солюбилизирующая способность эритроцитарной мембраны в отношении поступающего в нее вещества ограничена, в связи с чем более объемные гомологи интеркалируют в мембрану в меньших количествах и, соответственно, оказывают менее выраженное воздействие.

Таким образом с использованием метода спиновых зондов выявлены структурные изменения эритроцитарной мембраны, индуцированные встраиванием в мембрану и распределением во внутримембранном пространстве различных по гидрофобным свойствам производных ряда ихфанов. Показаны различия в распределении и эффективности модифицирующего действия производных. Определено, что в изученном ряду соединений наиболее эффективными модификаторами структуры эритроцитарной мембраны являются производные И(С-8) и И(С-10).

Для изучения влияния ихфанов непосредственно на структуру липидного бислоя и выяснения возможного участия липидного компонента в их мембранотропном действии было изучено взаимодействие ифанов с мембранами липосом.

3.2 Модифицирующее действие ихфанов на структуру мембран липосом. Искусственные бислойные мембраны, в частности мембраны липосом, широко используются для изучения мембранных эффектов различных биологически активных соединений (Ondrias, Balgavy, 1983; Müller, Herrmann, 2002).

Исследования модифицирующего действия ихфанов на мембрану липосом проводили с использованием подхода, основанного на изучении влияния биологически активных веществ на кинетику аскорбат-индуцированного восстановления радикальных центров спиновых зондов, встроенных в мембрану, в данном случае в мембрану липосом. О снижении

содержания радикальных центров судили по уменьшению амплитуды сигнала ЭПР. Изменение скорости восстановления радикальных центров спиновых зондов под влиянием биологически активных веществ, в том числе синтетических антиоксидантов, указывает на структурные перестройки в мембране, облегчающие или затрудняющие доступность радикалов для аскорбат-аниона (Смит, Бутлер, 1979; Панасенко и др., 1983).

Для исследования влияния ихфанов на структуру липосомальной мембраны использовали спиновые зонды I и П1. На рис.8 приведены кинетические кривые аскорбат-индуцированного восстановления радикальных центров зондов I и Ш, встроенных в мембрану липосом, инкубированных в отсутствии (контроль) и в присутствии производных ряда ихфанов.

а б

Рис.8. Влияние различных по гидрофобности ихфанов (б^Ю^^М) на кинетику восстановления аскорбатом зонда I (а) и зонда П1 (б), встроенных в мембрану липосом. Концентрация спиновых зондов 1х 10*41, концентрация фосфолипидов - 40 мг/мл, концентрация аскорбата натрия - 4><10"3М.

* - р<0,05 по отношению к контролю, ** - р<0,05 по отношению к контролю для соединений ЩС-1), И(С-8), ЩС-10) и ЩС-12).

Контрольные кривые отражают значительные различия в кинетике восстановления зондов I и III. Наличие периода медленного восстановления для зонда I в контроле (от 2 до 20 мин.) и меньшая скорость его восстановления по сравнению с зондом Ш свидетельствуют о его меньшей доступности для восстановления экзогенным аскорбатом по сравнению с зондом III. Это позволяет предположить, что он располагается в более глубоких областях мембраны. Из данных, представленных на рис.8а видно,

что ихфаны, содержащие в углеводородной цепи гидрофобного заместителя от 1 до 12 атомов углерода, ингибируют с разной степенью эффективности процесс аскорбат-индуцированного восстановления зонда I, а производное И(С-16), имеющее наиболее объемный боковой заместитель, не влияет на кинетику восстановления. Иная картина наблюдалась в экспериментах с зондом Ш (рис.8б). В этом случае соединение И(С-16) ускоряло процесс восстановления, тогда как производные И(С-1)-И(С-12) не оказывали на него существенного влияния.

Полученные данпые позволяют заключить, что вследствие стерических препятствий молекулы ЩС-16) располагаются неподалеку от поверхности мембраны и вблизи от локализации зонда П1, в то время как И(С-1)-И(С-12) распределяются в глубинные области мембраны липосом, модифицируя структуру липидного бислоя в области распределения зонда I и затрудняя проникновение аскорбат-аниона к радикальным центрам данного зонда.

Таким образом, на основе анализа кинетики аскорбат-индуцированного восстановления радикальных центров спиновых зондов установлено, что ихфаны способны модифицировать структуру липидного бислоя. При этом разные по гидрофобным свойствам производные этого ряда соединений модифицируют различные участки мембранной структуры, являющиеся областями их распределения во внутримембранном пространстве. Полученные данные указывают на возможное участие липидной компоненты в мембранотропном действии ихфанов на эритроцитарную мембрану.

Заключение

Изучены физико-химические особенности взаимодействия новых гибридных антиоксидантов - ихфанов с плазматичской мембраной эритроцитов. С использованием методов сканирующей микроскопии, спиновых зондов выявлена взаимосвязь химической структуры производных ряда ихфанов с их интеркалированием в мембрану и распределением во внутримембранном пространстве.

Показано, что процесс мембанного транспорта ихфанов сопровождается концентрационно-зависимыми морфологическими трансформациями эритроцитов в форму эхиноцитов и стоматоцитов. Полученные данные указывают на то, что большинство из изученных соединений распределяются как во внешнем, так и во внутреннем монослоях эритроцитарной мембраны, где могут осуществлять свое антиоксидантное действие. Установлено, что различные по гидрофобности боковые заместители в структуре ихфанов оказывают существенное влияние на кинетику индуцируемых соответствующими производными морфологических изменений эритроцитов и специфику распределения производных во внутримембранном пространстве.

Обнаружена способность производных ряда ихфанов, за исключением наименее гидрофобного соединения И(С-1), вызывать гемолиз эритроцитов, и определена концентрационная зависимость гемолитического действия.

Выявлено структурно-модифицирующее действие ихфанов на эритроцитарную мембрану. Установлено, что ихфаны способны

индуцировать уменьшение микровязкости как поверхностных, так и глубинных областей мембраны эритроцитов. При этом эффективность действия различна у производных с разными по гидрофобности боковыми заместителями. Эксперименты с использованием простых мембранных систем - липосом - показали, что ихфаны могут влиять непосредственно на структуру липидного бислоя. Ранее уже высказывалось предположение о том, что изменения структуры микроокружения мембраносвязанной ацетилхолинэстеразы могут приводить к нарушению ее функционирования и вносить вклад в антихолинэстеразное действие ихфанов (Озерова, 2000). Полученные в работе данные указывают на возможное участие липидной компоненты в мембранотропном действии ихфанов в том числе и в проявлении их антихолинэстеразной активности.

Сравнительный анализ активности изученных производных ряда ихфанов показал, что эффективность их мембранотропного действия существенно зависит от химической структуры и гидрофобных свойств боковогого заместителя.

Выявленные зависимости морфологических трансформаций эритроцитов, их гемолиза, а также структурных модификаций эритроцитарной мембраны от гидрофобности производных ряда ихфанов свидетельствуют о том, что с увеличением гидрофобности соединений указанные активности сначала возрастают, а затем снижаются. Такого же типа зависимости для антиокислительной и антихолинэстеразной активностей были получены в работах (Вгадиккауа е! а1., 1998; Озерова, 2000).

Результаты наших исследований указывают на то, что в реализации биологического (антиокислительного и антихолиэстеразного) действия ихфанов важную роль играет их способность интеркалировать в мембрану и распределяться во внутримембранном пространстве, которая в свою очередь зависит от гидрофобности соединения. Полученные данные могут быть полезны при разработав рекомендаций к синтезу биологически активных препаратов, активность которых можно варьировать, включая в структуру различные по гидрофобным свойствам заместители.

Выводы

1. Изучены особенности взаимодействия представителей гомологического ряда ихфанов с эритроцитарной мембраной методами сканирующей электронной микроскопии и спиновых зондов. На основании анализа электронных микрофотографий и спектров ЭПР установлена взаимосвязь между мембранотропным действием производных, содержащих различные по структуре алифатические заместители, и их гидрофобными свойствами.

2. Методом сканирующей электронной микроскопии исследовано влияние производных ряда ихфанов на морфологию эритроцитов. Установлено, что ихфаны способны индуцировать развивающиеся во времени переходы части клеток из нормальной дискоидной формы в форму

эхиноцитов и стоматоцитов, обусловленные процессом мембранного транспорта этих соединений.

Выявлены различия в кинетике морфологических изменений эритроцитов под влиянием разных по гидрофобным свойствам производных ряда ихфанов. Характер морфологических трансформаций указывает на то, что антиоксидантная активность этих веществ может быть реализована в обоих монослоях эритроцитарной мембраны.

3. Методом спектрофотометрии обнаружено, что ихфаны, за исключением производного И(С-1), обладают гемолитической активностью, проявляющейся при концентрациях выше 3*107 молекул на клетку. Показано, что гемолитическое действие производных ряда ихфанов зависит от их структуры и гидрофобности.

4. Методом спиновых зондов изучено влияние ихфанов на структуру мембран эритроцитов. Установлено, что ихфаны способны индуцировать уменьшение микровязкости различных по удаленности от поверхности эритроцитарной мембраны областей внутримембранного пространства. Показано, что различные по гидрофобным свойствам производные проявляют разное по эффективности структурно-модифицирующее действие.

5. На примере липосом методом спиновых зондов выявлено модифицирующее действие ихфанов непосредственно на структуру липидного бислоя. Установлено, что разные по гидрофобным свойствам производные модифицируют различные участки мембранной структуры, являющиеся областями их распределения во внутримембранном пространстве. Полученные данные указывают на возможность участия липидной компоненты в мембранотропном действии ихфанов на эритроцитарную и другие биомембраны.

А--

Список печатных работ по теме диссертации

1. Бурлакова Е.Б., Молочкина Е.М., Голощапов А.Н., Гендель Л.Я., Зорина О.М., Фаткулина Л.Д., Вологдина Е.Г., Паршина Е.Ю., Никифоров Г.А. Влияние "гибридных" антиоксидантов и Н202 на структуру мембран и холинэстеразную активность // Конференция "Фундаментальные науки -медицине", Москва, 10-11 декабря 2003г.: Тез. докл. - М., 2003, с.15-17.

2. Паршина Е.Ю., Гендель Л .Я. Мембранотропная активность новых гибридных антиоксидантов - ихфанов // III Съезд Биофизиков России, Воронеж, 2004.: Тез. докл., с.273-274.

3. Лунева О.Г., Паршина Е.Ю., Гендель Л Я. Изменения поверхностной архитектоники эритроцитов под влиянием синтетических антиоксидантов -производных 5-гидроксибензимидазола и ихфанов // 1П Съезд Биофизиков России, Воронеж, 2004.: Тез. докл., с.249-250.

4. Parshina E. Yu., Gendel L. Ya. Effect of new hybrid antioxidants -ICHFANs - on erythrocyte membrane structure // Конференция "Современные достижения магнитного резонанса", Казань, 2004 г.: Тез. докл.

5. Паршина Е.Ю., Гендель Л.Я., Рубин А.Б. Влияние новых гибридных антиоксидантов - ихфанов - на морфологию эритроцитов // Биофизика, 2004. №6, т.49, с. 1094-1098.

6. Паршина Е.Ю., Гендель Л.Я., Рубин А.Б. Влияние новых гибридных антиоксидантов - ихфанов - на кинетику аскорбат-индуцированного восстановления радикальных центров спиновых зондов в липосомах // Биофизика, 2005, №4, т.50, с.676-679.

7. Parshina E.Yu., Luneva O.G., and Gendel L.Ya. Effect of synthetic antioxidants, the derivatives of 5-hydroxybenzimidazole and screened phenol, on membrane of erythrocytes // European Association for Red Cell Research 15th Meeting, Murten, Switzerland, April 21-25,2005: Book of Abstracts, p. 86.

к исполнению 16/02/2006 Исполнено 17/02/2006

Заказ №86 Тираж-100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

36 0 7

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Паршина, Евгения Юрьевна

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Гибридные антиоксиданты ихфаны, перспективы их использования при болезни Альцгеймера.

2. Влияние антиоксидантов - экранированных фенолов на структуру биологических мембран.

3. Применение метода спиновых зондов для изучения мембранотропного действия и распределения во внутримембранном пространстве экзогенных соединений.

4. Форма эритроцитов и ее изменения под влиянием различных факторов.

4.1. Возможные механизмы морфологических трансформаций эритроцитов.

4.2. Влияние экзогенных соединений на форму эритроцитов.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Объекты исследований.

2. Выделение эритроцитарной массы.

3. Приготовление и анализ образцов при использовании методов сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и световой микроскопии (СМ).

4. Исследование гемолитической активности ихфанов.

5. Получение липосом.

6. Приготовление образцов для ЭПР спектроскопии и анализ спектров ЭПР.

7. Статистическая обработка результатов.

8. Использованные в работе химические соединения.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Влияние ихфанов на морфологию эритроцитов.

1.1. Оценка гидрофобности ихфанов с различными заместителями у четвертичного атома азота.

1.2. Кинетика изменений морфологии эритроцитов под влиянием ихфанов.

2. Гемолитическое действие производных ряда ихфанов

3. Влияние ихфанов на структуру мембраны эритроцитов и липосом

3.1. Структурные изменения эритроцитарной мембраны, индуцируемые производными ряда ихфанов.

3.2. Модифицирующее действие ихфанов на структуру мембран лпосом

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности взаимодействия новых гибридных антиоксидантов-ихфанов с эритроцитарной мембраной"

В настоящее время актуальной задачей физико-химической биологии и фармакологии является поиск новых эффективных лекарственных препаратов. Одно из направлений поиска - создание препаратов комбинированного действия, то есть соединений, содержащих в своей структуре фрагменты, обладающие различными видами биологической активности. К их числу относятся синтезированные в ИБХФ РАН гибридные антиоксиданты - ихфаны (Никифоров и др., 2003). В их структуру включены два фрагмента, обеспечивающие антиоксидантную и антихолинэстеразную активности; кроме этого они имеют боковой алкильный заместитель с различным содержанием углеродных атомов в алифатической цепи, обуславливающий гидрофобные свойства производных этого ряда. Химический дизайн ихфанов, по мнению ряда авторов, позволяет рассматривать их в качестве перспективных препаратов для лечения болезни Альцгеймера (Braginskaya et al., 1996; Molotchkina et al., 2002; Бурлакова и др., 2003).

Известно, что функциональная активность эритроцитов во многом определяется их формой и ее изменениями под влиянием биологически активных препаратов, при развитии патологических процессов в организме и действии других факторов (Sheetz, Singer, 1974; Bessis, 1974; Козинец, Симоварт, 1984; Isomaa et al., 1987; Лунева и др., 2002). Изучение взаимодействия биологически активных амфифильных соединений, к которым относятся ихфаны, с мембранами клеток крови, в частности с мембранами эритроцитов, имеет важное практическое значение, поскольку при введении в организм эти соединения могут непосредственно взаимодействовать с эритроцитарными мембранами.

Важным этапом во взаимодействии экзогенного соединения с клетками является процесс его мембранного транспорта, в частности, интеркаляция в мембрану и распределение во внутримембранном пространстве (Stein, 1981; Гендель, Круглякова, 1986; Balaz, Lukacova, 2002). Несмотря на актуальность проблемы мембранный транспорт ксенобиотиков, в том числе органических катионов, все еще остается недостаточно изученным.

До настоящего времени не были исследованы особенности мембранного транспорта производных ряда ихфанов и их влияние непосредственно на структуру плазматической мембраны эритроцитов. В связи с этим в данной работе использовали методы сканирующей электронной микроскопии и спиновых зондов, позволяющие получать взаимодополняющую информацию о влиянии ксенобиотиков на морфологию эритроцитов и структуру эритроцитарной мембраны, а также об особенностях распределения различных по гидрофобным свойствам соединений, в том числе и производных ряда ихфанов, во внутримембранном пространстве. Такая информация важна для понимания механизмов действия этих биологически активных веществ и разработки подходов к синтезу новых лекарственных препаратов.

В связи с этим целью работы является изучение физико-химических особенностей взаимодействия новых гибридных антиоксидантов - ихфанов с мембранами эритроцитов для установления взаимосвязей между химической структурой, гидрофобными свойствами и их способностью интеркалировать в мембрану и изменять ее внутреннюю структуру.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гибридные аитиоксиданты ихфаны, перспективы их использования при болезни Альцгеймера.

Исследованные в данной работе соединения - новые гибридные антиоксиданты ихфаны - относятся к антиоксидантам группы экранированных фенолов. В свою структуру эти гибридные соединения включают два фрагмента, обладающие различным биологическим действием. Наличие фрагмента, представленного экранированным фенолом, обеспечивает антиоксидантные свойства соединения, фрагмент, включающий четвертичный атом азота и сходный по структуре с молекулой ацетилхолина, придает соединению свойства ингибитора ацетилхолинэстеразы - фермента деградации ацетилхолина. Гидрофобный фрагмент обеспечивает проникновение соединений в мембрану клеток и через гематоэнцефалический барьер. Такое сочетание структурных особенностей ихфанов позволяет рассматривать их в качестве потенциальных лекарственных препаратов, направленных на терапию болезни Альцгеймера и других видов сенильных деменций (Вга§тзкауа е1 а1., 1998; МоЫсЫапа е1 а!., 2002; Молочкина, Озерова, 2003), при которых наблюдается развитие как недостаточности холинергической системы, так и свободнорадикальных повреждений (8е1кое, 2001).

Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее распространенной формой нейродегенеративных заболеваний, связанных со старением. Она сопровождается прогрессирующим нарушением памяти и когнитивной функции, на поздних стадиях болезни наблюдаются нарушения координации движения, по клинической картине напоминающие паркинсонизм. Причиной этих явлений в настоящее время считают разрушение большого числа подкорковых нейронов в головном мозге. Поражаются в основном М-холинэргические нейроны коры и гиппокампа, при этом наблюдается снижение уровня холинацетилтрансферазы - фермента, синтезирующего ацетилхолин, уменьшение числа пирамидальных нейронов, появление скоплений особого пептида - ß-амилоида - внутри нейронов и в области нервных окончаний. Снижение числа холинэргических нейронов приводит к нарушению функционирования мозга, в частности нарушению способности к запоминанию информации, а также к поражению других, связанных с холинэргической, медиаторных систем мозга. В основе патогенеза болезни Альцгеймера по современным представлением лежит образование нерастворимых агрегатов ß-амилоида. Этот пептид содержит порядка 40-42 аминокислотных остатков и является продуктом патологического расщепления более протяженного пептида - предшественника. При этом помимо образования собственно ß-амилоида, способного образовывать нерастворимые агрегаты и оказывать цитотоксический эффект, снижается также образование нормального продукта реакции - пептида, состоящего из 620 аминокислотных остатков и, по-видимому, участвующего в процессах консолидации памяти (Ашмарин и др., 1996).

Важным этапом патогенеза БА является воспалительный процесс, который возникает в микроглии в ответ на накопление агрегатов ß-амилоида. Это в свою очередь приводит к активации процессов перекисного окисления и радикальному повреждению белков, липидов и других макромолекул (Butterfleld et al., 2001). Процессы перекисного окисления в мембранах нервных клеток, а также другие патологические процессы ведут к нарушению структуры мембран, в частности к изменению их вязкости (Eckert et al., 2005; Chochina et al., 2001). Следствием этих процессов является дистрофия нейронов, нарушения синаптической передачи и гибель нервных клеток. (Selkoe, 2001; Gibson, Huang, 2002; Braginskaya et al., 2001; Grundman et al., 2002). Эти изменения ответственны за нарушение запоминания и невозможность воспроизведения ранее полученной информации, что характерно для ранних стадий заболевания (Selkoe, 2001).

Из вышесказанного следует, что лечение БА при помощи ингибиторов холинэстеразы (фермента деградации ацетилхолина) является симптоматическим и направлено на компенсацию снижения активности холинэргической системы мозга вследствие деградации холинэргических нейронов. В то же время именно этот подход, а также лечение агонистами М-холинорецепторов, являются наиболее распространенными в терапии БА (Ашмарин и др., 1996).

Важно отметить, что при БА изменения наблюдаются не только в мозге, но также и в плазме и клетках крови. Большое количество исследований, посвященных этому вопросу, связано с необходимостью разработки наименее инвазивных методов быстрой и точной диагностики развития патологического процесса. В литературе отмечено, что при БА наблюдаются многочисленные нарушения клеток крови. Показано, что агрегаты р-амилоида вызывают гибель эритроцитов вследствие активации процессов перекисного окисления (МаИБОп е1 а1., 1997), а также нарушение активности ацетилхлинэстеразы лимфоцитов, в то время как активность эритроцитарной холинэстеразы остается без изменений (уоп ВегпЬагсН, А1агсоп, 2005). Известно также, что содержание Р-амилоида АР-42 выше в плазме крови больных БА (Мауеих е1 а1., 2003). В то же время периферические изменения при БА, по-видимому, не могут вносить существенный вклад в основной патологический процесс, развивающийся в головном мезге. Даже если нарушение функционирования ферментов деградации ацетилхолина приведет к изменению его содержания в плазме крови, его концентрация в мозге не изменится, поскольку гематоэнцефалический барьер непроницаем для полярных молекул ацетилхолина. Есть данные о том, что при БА наблюдаются нарушения реологии крови (\Уеп е1 а1., 2000), незначительные изменения формы эритроцитов (Ооос1а11 е1 а1., 1994), а также ускоренное старение эритроцитов (ВоБгпап е1 а1., 1991). Представленные в литературе данные о вязкости эритроцитарной мембраны при БА малочисленны и противоречивы.

Тем не менее, хотя процессы, происходящие на периферии, не являются ключевыми в патогенезе БА, клетки крови являются подходящей моделью для исследования антихолинэстеразных и антиоксидантных препаратов, планируемых для использования в терапии БА. Такие исследования активности новых гибридных антиоксидантов - ихфанов были начаты и проводятся коллективом авторов в Институте Биохимической Физики им. Н.М. Эммануэля, а также другими авторами. Выявлены высокая антиокислительная и антирадикальная активность ихфанов, как в искусственных системах, так и по отношению к липидам гомогената мозга (Озерова, 2000; КгаБОШБка е1 а1., 2000; Никифоров и др., 2003; Сторожок и др., 2003; Перевозкина, 2003). Обнаружена высокая способность ихфанов к ингибированию ацетилхолинэстеразы как растворимой, так и связанной с мембранами клеток мозга и эритроцитов (Брагинская и др., 1992; Озерова, 2000). Объединение в одной молекуле фрагмента, представленного экранированным фенолом, и фрагмента, сходного по структуре с ацетилхолином, приводило к взаимному усилению антиоксидантных и антихолинэстеразных свойств (Озерова, 2000).

Ихфаны относят к новой группе антиоксидантов "поплавкового" типа (Никифоров и др., 2003). По мнению авторов, положительно заряженный четвертичный атом азота позволяет удерживать молекулу гибридного антиоксиданта на поверхности клеточной мембраны. Фиксация молекулы на определенной глубине во внутримембранном пространстве происходит за счет гидрофобного фрагмента (поплавковый эффект). Такая структура обеспечивает адресную доставку антиоксидантов при интенсификации процессов перекисного окисления липидов мембраны.

Однако мембранотропная активность ихфанов, их способность изменять структуру биологических мембран и распределяться во внутримемранном пространстве до настоящего времени не были изучены.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Паршина, Евгения Юрьевна

VI. выводы.

3. Методом спектрофотометрии обнаружено, что ихфаны, за исключением производного И(С-1), обладают гемолитической активностью, проявляющейся при концентрациях выше Зх107 молекул на клетку. Показано, что гемолитическое действие производных ряда ихфанов зависит от их структуры и гидрофобности.

В заключение приношу глубокую благодарность моему научному руководителю д.б.н. Л. Я. Генделю за исключительные внимание и терпение, проявленные ко мне в ходе работы над диссертацией; научному руководителю д.б.н., чл.-корр. РАН, профессору А.Б. Рубину за интерес к моей работе; к.б.н. К. Н. Тимофееву за помощь в работе и научные консультации; д.х.н. Г.А. Никифорову за предоставленные для работы химические соединения и научные консультации; а также сотрудникам кафедры биофизики Биологического факультета МГУ за поддержку.

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Выявлено структурно-модифицирующее действие ихфанов на эритроцитарную мембрану. Установлено, что ихфаны способны индуцировать уменьшение микровязкости как поверхностных, так и глубинных областей мембраны эритроцитов. При этом эффективность действия различна у производных с разными по гидрофобности боковыми заместителями. Эксперименты с использованием простых мембранных систем - липосом - показали, что ихфаны могут влиять непосредственно на структуру липидного бислоя. Ранее уже высказывалось предположение о том, что изменения структуры микроокружения мембраносвязанной ацетилхолинэстеразы могут приводить к нарушению ее функционирования и вносить вклад в антихолинэстеразное действие ихфанов (Озерова, 2000). Полученные в работе данные указывают на возможное участие липидной компоненты в мембранотропном действии ихфанов в том числе и в проявлении их антихолинэстеразной активности.

Выявленные зависимости морфологических трансформаций эритроцитов, их гемолиза, а также структурных модификаций эритроцитарной мембраны от гидрофобности производных ряда ихфанов свидетельствуют о том, что с увеличением гидрофобности соединений указанные активности сначала возрастают, а затем снижаются. Такого же типа зависимости для антиокислительной и антихолинэстеразной активностей были получены в работах (Вга£шзкауа е1 а1., 1998; Озерова, 2000).

Результаты наших исследований указывают на то, что в реализации биологического (антиокислительного и антихолиэстеразного) действия ихфанов важную роль играет их способность интеркалировать в мембрану и распределяться во внутримембранном пространстве, которая в свою очередь зависит от гидрофобности соединения. Полученные данные могут быть полезны при разработке рекомендаций к синтезу биологически активных препаратов, активность которых можно варьировать, включая в структуру различные по гидрофобным свойствам заместители.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Паршина, Евгения Юрьевна, Москва

1. Анциферова Л.И., Вассерман A.M., Иванова А.Н., Лившиц В.А., Наземец Н.С. Атлас спектров электронного парамагнитного резонанса спиновых меток и зондов. М.: Наука, 1977, 160 с.

2. Архипова Г.В., Бурлакова Е.Б., Федотова И.Б. Липиды нейрональных мембран в моделях памяти и обучения у крыс линии КМ, сверхчувствительных к звуковому раздражению. Сенсорные системы, 1992, 6(4), с. 66.

3. Архипова Г.В., Кузурман П. А., Бурлакова Е.Б. О механизме полиморфных превращений в фосфатидилхолиновых мембранах под действием антиоксиданта фенозана. 2002, VI Международная конференция "Биоантиоксидант", тезисы докладов, с.44-45.

4. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Стукалов П.В. Биохимические пути в исследовании механизмов психических и нервных болезней. В кн.: Нейрохимия. М.: Издательство Институтат Биомедицинской Химии РАМН, 1996, с.415-437.

5. Берлинер Л. Введение: о методе спиновых меток. В кн.: Метод спиновых меток. Теория и применение. М.: Мир, 1979, с.9-12.

6. Брагинская Ф.И., Зорина О.М., Молочкина Е.М., Никифоров Г.А., Бурлакова Е.Б. Синтетические биоантиоксиданты ингибиторы ацетилхолинэстеразной активности// Изв. АН СССР, сер. биол. 1992. №5. с.690-698.

7. Бурлакова Е.Б., Алесенко A.B., Молочкина Е.М., Пальмина Н.П., Храпова Н.Г. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте. М.: Наука, 1975, 211с.

8. Бурлакова Е.Б., Заец Т.А., Дубинская Н.И., Молочкина Е.М. Влияние антиоксидантов на изменение состава липидов лизосом печени крыс после термического ожога. Патологическая физиология и экспериментальная терапия, 1984, вып. 5, с.13-17.

9. Бурлакова Е.Б., Хохлов А.П. Изменение структуры и состава липидной фазы биомембран при действии синтетических антиоксидантов. Влияние на передачу информационного сигнала на клеточном уровне. Биологические мембраны, 1985, 2(6).

10. И. Гендель Л.Я., Гольдфельд М.Г., Кольтовер В.К. и др. Исследование конформациионных переходов в биомембранах методом слабосвязанного парамагнитного зонда. 1968, Биофизика, т.8, №6, с. 1114-1116.

11. Гендель Л.Я., Ким Л.В., Лунева О.Г., Федин В.А., Круглякова К.Е. Изменения поверхностной архитектоники эритроцитов под влиянием синтетического антиоксиданта фенозана-1. 1996, Известия РАН, сер.биологическая, №4, с.508-512.

12. Гендель Л.Я., Круглякова К.Е. Структурно-функциональные взаимодействия физиологически активных соединений с биомембранами. В кн.: Метод спиновых меток и зондов, М.: Наука, 1986, сЛ63-194.

13. Гендель Л.Я., Круглякова К.Е., Панасенко О.М. Селективное распределение спиновых зондов ряда бензо-у-карболина в эритроцитарной мембране. 1981а, Докл АН СССР, т.257, с. 1014-1019.

14. Гендель Л.Я., Лихачева Н.И., Богонатов Б.Н., Панасенко О.М., Круглякова К.Е. Изменения формы эритроцитов под влиянием пестицида пентахлорфенолята натрия (метод СЭМ) Докл. АН СССР 1984а т.277 с.493-496.

15. Гендель Л.Я., Панасенко О.М., Круглякова К.Е. Изучение влияния пестицидов на структуру эритроцитарной мембраны методом спинового зонда. В сб.: Магнитный резонанс в биологии и медицине: Тез. докл. Всесоюз. симпоз., Москва, 19816, с. 231-232.

16. Гендель Л.Я., Панасенко О.М., Сускина В.И. О солюбилизирующей способности биомембран в отношении разлияных по гидрофобным свойствам органических неэлектролитов (метод спинового зонда). 19846, Известия АН СССР, сер. биологическая, с.522-527

17. Гуреева Н.В., Сторожок Н.М., Крысин А.П., Храпова Н.Г., Бурлакова Е.Б. Взаимосвязь химического строения и активности радикалов антоксидантов фенольной природы. 2002, VI Международная конференция "Биоантиоксидант", тезисы докладов, с. 139-141.

18. Гриффит О., Джост П. Липидные спиновые метки в биологических мембранах. В кн.: Метод спиновых меток. Теория и применение. М.: Мир, 1979, с.489-569.

19. Дюбченко О.И., Просенко А.Е., Терах Е.И., Никулина В.В., Газина С.О. Исследование ингибирующего влияния аминоалкилфенолов на окисление липидных субстратов. 2003, Научный вестник Тюменской медицинской академии, №1, с.23-26.

20. Жданов Р.И., Комаров A.M. Модельные и биологические мембраны в методе спиновых меток и зондов. Итоги науки и техники. Биофизика мембран, т.6,1989.

21. Казенов A.M., Маслова М.Н. Структурно-биохимические свойства мембраны безъядерных эритроцитов. Физиологический журнал СССР 1987,73(12), с.1587 1598.

22. Козинец Г.И., Симоварт Ю.А. Поверхностная архитектоника клеток периферической крови в норме и при заболеваниях системы крови. Таллин, Вал. 1984 115с.

23. Котык А., Яначек К. Мембранный транспорт. М.: Мир, 1980, 341с.

24. Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда. М.: Наука, 1976, 210 с.

25. Лунева О.Г., Гендель Л.Я., Круглякова К.Е. Особенности связывания органических неэлектролитов эритроцитарной мембраной. 2002, Биофизика, т.47, №1, с.38-44

26. Лунева О.Г., Гендель Л.Я., Кузнецов Ю.В., Смирнов Л.Д. Особенности взаимодействия неэлектролитов производных 5-гидроксибензимидазола с эритроцитарной мембраной. 2005, Биофизика, т.50, №2, с. 310-315.

27. Лихтенштейн Г.И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии. М.: Наука, 1974,255 с.

28. Мальцева Е.Л., Бурлакова Е.Б. Различия в ответе мембранных клеток мозга и печени при действии in vitro антиоксиданта и жирной кислоты (по изменению активности циклаз и вязкости). Биологические мембраны, 1986, 3(8), с. 773-779.

29. Максина А.Г., Микаэлян Н.П., Князев Ю.А., Дайняк Б.А. Исследование с помощью спин-меченых жирных кислот структурных изменений вмембранах эритроцитов при сахарном диабете. 1992, Биофизика, т.37, №2, с.306-309.

30. Никифоров Г.А., Белостоцкая И.С., Вольева В.Б., Комиссарова Н.Л., Горбунов Д.Б. Биоантиоксиданты "поплавкового" типа на основе производных 2,6 дитретбутил-фенола. 2003, сб. "Биоантиоксиданты", Научный вестник мед акад. Тюмень, с.50-51.

31. Озерова И.Б. Новые антиоксиданты экранированные фенолы как модуляторы активности ацетилхолинэстеразы in vivo и in vitro. Автореферат кандидатской диссертации. М. 2000. с. 1-25.

32. Панасенко О.М., Гендель Л.Я., Круглякова К.Е., Эмануэль Н.М. Влияние хлор- и фосфорсодержащих пестицидов на кинетику аскорбат-индуцированного восстановления спиновых зондов в эритроцитарной мембране. 1983, Известия АН СССР, сер. биол., с.233-239.

33. Панасенко О.М., Гендель Л.Я., Сускина В.И., Изучение поведения новых нитроксильных радикалов производных бензо-у-карболина и у-карболина в суспензии эритроцитарных мембран. Изв. АН СССР, сер. биол., 1980, № 8, с. 854-864.

34. Панасенко О.М., Зорина О.М., Гендель Л.Я., Круглякова К.Е. Действие синтетических антиоксидантов гетероциклического ряда на структурно-функциональную организацию эритроцитарной мембраны. Доклады АН СССР, 259 (3), 1981а, с.727-731.

35. Перевозкина М.Г. Кинетика и механизм ингибирующего действия производных фенозана, салициловлй кислоты и их синергических смесей с а-токоферолом и фосфолипидами. Автореферат кандидатской диссертации. Тюмень, 2003. с. 1-28.

36. Розанцев Э.Г. Свободные иминоксильные радикалы. М.: Химия, 1970, 216с.

37. Смит Я., Бутлер К. Системы ориентированных липидов как модельные мембраны. В кн.: Метод спиновых меток. Теория и применение. М.: Мир, 1979, с.444-488.

38. Смит Я., Шриер-Мучилло Ш, Марч Д. Метод спиновых меток. В кн.: Свободные радикалы в биологии. М.:Мир.1979, стр. 178-229.

39. Сторожок Н.М., Перевозкина М.Г., Никифоров А.Г., Русина И.Ф. Особенности ингибирующего действия антиоксидантов группы ИБХФАНов. 2003, сб. "Биоантиоксиданты", Научный вестник мед акад. Тюмень, с.52-59.

40. Федотова И.Б., Семиохина А.Ф., Архипова Г.В., Бурлакова Е.Б. Возможности коррекции некоторых сложных периферических реакций крыс КМ с помощью антиоксиданта. Журнал высшей нервной деятельности, 1990, 40(2), с. 318-325.

41. Хохлов А.П., Ярыгин H.A., Юрченко Л.Н. Влияние синтетического антиоксиданта на процесс комплексообразования лигандов с мембрано-связанными и солюбелизированными опоидными рецепторами головного мозга крыс. Биологические мембраны, 1986, 3(3), с. 261-265.

42. Черницкий Е.А., Воробей A.B. Структура и функции эритроцитарных мембран. М.:Наука и техника, 1981, 216 с.

43. Aarts L., van der Нее R., Dekker I., de Jong J., Langemeijer H., Bast A. The widely used anesthetic agent propofol can replace alpha-tocopherol as an antioxidant. 1995, FEBS Lett., v.357, N1, p.83-85.

44. Baerlocher G.M., Beer J.H., Owen G.R., Meiselman H.J., Reinhart W.H. The anti-neoplastic drug 5-fluorouracil produces echinocytosis and affects blood rheology. Br. J. Haematol., 1997, 99(2), p. 426-432.

45. Balaz S., Lukacova V. Subcellular pharmacokinetics and its potential for library focusing. 2002, Journal of Molecular Graphics and Modelling, v.20, p.479^90.

46. Basse F., Stout J.G., Sims P.J., Wiedmer T. Isolation of erythrocyte membrane protein that mediates Ca2+-depdndent transbilayer movement of phospholipids. 1996, J. Biol. Chem., Jul 1996; 271: 17205 17210.

47. Bessis M. Corpuscles: Atlas of red blood cell shape. Berlin ect. 1974.

48. Bessis M. In: Red Cell Shape. Physiology. Phatology. Ultrastructure. (Bessis M., Weed R.I., Leblond P.F., ets.) Springer-Verlag, Heidelberg, 1973, p. 1-23.

49. Birnie C.R., Malamud D., Schnaare R. Antimicrobal evaluation of N-alkyl betaines and N-alkyl-N,N-dimethylamine oxides with variations in chain length. 2000, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.44, N9, p.2514-2517.

50. Bobrowska-Hagerstrand M., Karlj-Iglic V., Iglic A., Bialkowska K., Isomaa B., Hagerstrand H. Torocyte membrane endovesicles induced by octaethyleneglycol dodecylether in human erythrocytes. 1999, Biophys.J., v.77, p.3356-3362.

51. Bosman G.J., Bartholomeus I.G., de Man A.J., van Kalmthout P.J., de Grip W.J. Erythrocyte membrane characteristics indicate abnormal cellular aging in patients with Alzheimer's disease. 1991. Neurobiol Aging, v. 12, N 1, p. 1318.

52. Brites D., Silva R., Brito A., Effect of bilirubin on erythrocyte shape and haemolysis, under hypotonic, aggregating or non-aggregating conditions, and correlation with cell age. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1997, 57(4), p. 337-349.

53. Brunauer L.S., Moxness M.S., Huestis W.H. Hydrogen peroxide oxidation induces the transfer of phospholipids from membrane into the cytosol of human erythrocyte. 1994 Biochemistry, v.33, N15, p. 4527-4532.9

54. Butler K.W. Drug-biomolecule interaction: spin-probe study of effects of anesthetics on membrane lipids. 1975, Journal of Pharmacology Science,, v.64, p.479-501. v

55. Butterfield D.A., Drake J., Pocernich C., Castegna A. Evidence of oxidative damage in Alzheimer's disease brain: central role for amyloid beta-peptide. 2001, Trends Mol Med, v. 7, N 12, p. 548-554.

56. Cantor R.S. Breaking the Meyer-Overton rule: Predicted affects of varying stiffness and interfacial activity on the intrinsic potency of anesthetics. 2001, Biophysical Journal, v.80, p.2284-2297.

57. Chi M., Wu W.G., Sung K.L., Chien S. Biophisical correlates of lysophosphatidilcholine- and ethanol-mediated shape transformation and hemolysis of human erythrocytes. Membrane viscoelasticity amd NMR measurement. 1990, BBA, v. 1027, N2, p. 163-171.

58. Chochina S. V., Avdulov N. A., Igbavboa U., Cleary J. P., O'Hare E. O., Wood W. G. Amyloid ß-peptidei40 increases neuronal membrane fluidity: role of cholesterol and brain region. 2001, Journal of Lipid Research, v. 42, p.1292-1297.

59. Chong C.S., Colbow K. Light scattering and turbidity measurements on lipid vesicles. Biochim Biophys Acta. 1976, v. 436, N2, p.260-82.

60. Eckert G.P., Wood W.G., Muller W.E. Membrane disordering effects of beta-amyloid peptides. 2005, Subcell Biochem., N 38, p.319-337.

61. Elgsaeter A., Stokke B.T., Mikkelsen A., Branton D. The molecular basis of erythrocyte shape. 1986, Science, v.234, N 4781, p.1217-1223.

62. Ferrell J.E., Huestis W.H. Phosphoinositide metabolism and the morphology of Human Erythrocytes. 1984, J. Cell Biol., v.98, p.1992-1998.

63. Fisher T.M. Bending stiffness of lipid bilayer: IV. Interpretation of red cell shape change. 1993, Biophis.J., v.65, N2, p.687-692.

64. Fraceto L.F., Pinto L.M.A., Franzoni L., Spisni, A., Schreier S., de Paula E. Location of lidocaine in phospholipid bilayers: an EPR, fluorescence and NMR study. 2000, IV Biophysics Congress of the Southern Cone, abstract.

65. Fujiwara T., Hirashima N., Hasegawa S., Nakanishi M., Ohwada T. Spasce-filling effects in membrane disruption by cationic amphiphiles. 2001, Bioorg Med Chem., v.9, N4, p.1013-1024.

66. Garcia D.A., Quiroga S., Perillo M.A. Flunitrazepam partitioning into natural membranes increases surface curvature and alters cellular morphology. Chem. Biol. Interact, 2000, 129(3), p. 263-277.

67. Ge M., Freed J.H. Hydration, Structure, and Molecular Interactions in the Headgroup Region of Dioleoylphosphatidylcholine Bilayers: An Electron Spin Resonance Study 2003, Biophysical Journal v.85, p.4023-4040

68. Gedde M.M., Huestis W.H. Membrane potential and human erythrocyte shape. 1997 Biophis.J. v.72 N3, 1220-1233.

69. Gedde M.M., Yang E., Huestis W.H. Shape Response of Human Erythrocyte to Altered Cell pH. 1995, Blood, v.86, p.1595-1599

70. Gedde M.M., Yang E., Huestis W.H. Resolution of paradox of red cell shape changes in low and high pH. 1999, BBA, 1417, p.246-253.

71. Gibson G.E., Huang H.M. Oxidative processes in the brain and non-neuronal tissues as biomarkers of Alzheimer's disease. 2002, Front Biosci, v.l, N 7, p.1007-1015.

72. Gimsa J., Ried C. Do band 3 protein conformational changes mediate shape changes of human erythrocyte? 1995, Mol. Membr. Biol., 12(3) p.247-254.

73. Gimsa J. A possible molecular mechanism governing human erythrocyte shape 1998, Biophys.J., v.75, p.568-569.

74. Glaser R. The shape of blood cells as a function of membrane potencial and temperature. 1979 J. Membrane Biol. 51, 217-228 .

75. Glaser R. Does the transmembrane potencial or the intracellular pH control the shape of human erythrocyte? 1998 Biopys.J. v.75, 569-570

76. Goodall H.B., Reid A.H., Findlay D.J., Hind C., Kay J., Coghill G. Irregular distortion of the erythrocytes (acanthocytes, spur cells) in senile dementia. 1994. Dis Markers, v.12, N 1, p.23-41.

77. Gregory T.R. Nucleotypic effects without nuclei: genome size and erythrocyte size in mammals. 2000 Genome, v.43, N 5, p.895-901.

78. Grundman M, Grundman M, Delaney P. Antioxidant strategies for Alzheimer's disease. 2002. Proc Nutr Soc, v. 61, N 2, p. 191-202.

79. Hagerstrand H., Isomaa B. Vesiculation induced by amphiphiles in erythrocytes. 1989, BBA, v.982, p. 179-186.

80. Hagersrand H., Isomaa B. Amphiphile-induced antihaemolysis is not causally related to shape change and vesiculation. 1991, Chem.Biol.Interact., v. 79, N.3, p. 335-347.

81. Hagersrand H., Isomaa B. Lipid and protein composition of exovesicles released from human erythrocyte following treatment with amphiphiles. 1994, BBA, v.l 190, N2, p.409-415.

82. Hanch C., Fujita T. p-o-n Analisis. A method for correlation of biological activity and chemical structure. 1964, J. Am. Chem. Soc., v. 86, p. 1616-1626.

83. Hansch C., Leo A. Exploring QSAR: vol.1. Fundamentals and applications in chemistry and biology. 1995. 557c.

84. Hubell W.L., McConnell H.M. Spin label studies of the exitable membranes of nerve and muscle. 1968, Proc. Nat. Acad Sci. U.S.A., v.61, p. 12-19.

85. Isomaa B., Engblom A.C. Is calmodulin inhibition involved in shape transformation induced by amphiphiles in erythrocytes? 1988, BBA, v.940, N1, p. 121-126.

86. Isomaa B., Hagerstrand H., Paatero G., Engblom A.C. Permeability alteration and antihaemolysis induced by amphiphiles in human erythrocytes. 1986, BBA, v.860, N3,p.510-524.

87. Isomaa B., Hagerstrand H., Paatero G. Shape transformation induced by amphiphiles in erythrocytes. BBA, 899, 1987, p.93-103.

88. Isomaa B., Paatero G. Shape and volume changes in rat erythrocytes induced by surfaca-active alkiltrimethylammonium salts and sodium dodecyl sulphate. BBA, 647, 1981, p.211-222.

89. Janoff A., Pringle M., Miller K. Correlation of general anesthetic potency with solubility in membrane. 1981, BBA, v.649, p. 125-128.

90. Kitagawa S., Orinaka M., Hirata H. Depth-dependent change in membrane fluidity by phenolic compounds in bovine platelets and its relationship with their effects on aggregation and adenilate cyclase activity. 1993, BBA, v.1179, N3, p.277-282.

91. Kleszczynska H., Sarapuk J., Rozycka-Roszak B. Modification if mechanical properties of model membranes by some bifunctional surfactants. 2000, Cell.Mol.Biol.Lett., v.5, N1, p.67-74.

92. Koltover V.K., Goldfeld M.G., Gendel L.Ya., Rozantsev E.G. Conformational transition in biological membrane studied by the spin lable method. 1968, Biochem. and Biophys. Res. Communs., v.32, p.421-425.

93. Krasowska A., Rosiak D., Szkapiak K., Oswiecimska M., Witek S., Lucaszewicz M. The antioxidant activity of BHT and new phenolic compounds PYA and PPA measured by chemiluminescencs. 2001, Cell.Mol.Biol.Lett., v.6, p.71-81.

94. Kroes J., Ostwald R., Keith A.D. Erythrocyte membranes compression of lipid phases by increased cholestero content. BBA, 274(1), 1972, p.71-74.

95. Kurad D., Jeschke G., Marsh D. Lateral Ordering of Lipid Chains in Cholesterol-Containing Membranes: High-Field Spin-Label EPR. 2004, Biophysical Journal, v.86 p.264-271.

96. Kury P.G., McConnell H.M. Regulation of membrane flexibility in human erythrocytes. Biochemistry, 1975, 14(13), p.2798-2803.

97. Lagerberg J.W., Williams M., Moor A.C., Brand A., van der Zee J., Dubbelman T.M., van Steveninck J. The influence of merocyanine 540 and protoporphyrin on physicochemical properties of the erythrocyte memebrane. BBA, 1996, 1278(2). p. 247-253.

98. Li A., Seipelt H., Muller C., Shi Y., Artmann M. Effects of salicylic acid derivatives on red blood cell membrane. 1999, Pharmacol.Toxicol., v.85, N5, p.206-211.

99. Lim G.H.W., Wortis M., Mukhopedhuyay R. Stomatocyte-discocyte-echinocyte sequence of the human red blood cell: Evidence for the bilayer-couple hypothesis from membrane mechanism. 2002, PNAS, v.99, N26, p.16776-16769.

100. Liu G.T., Zhang T.M., Wang B.E., Wang Y.W. Protective action of seven natural phenolic compounds against peroxidative damage to biomembranes. 1992, Biochem Pharmacol.,v.43, N2, p. 147-152.

101. Maehara K., Membrane cholesterol and insulin receptor in erythrocytes. 1991, Fukuoka Igaku Zasshi, v.82, N11, p. 586-602.

102. Malheiros S.V., Brito M.A., Meirelles N.C. Membrane effects of trifluoperazine, dibucaine and praziquantele on human erythrocytes. Chem. Biol. Interact., 2000, 126(2), p. 79-95.

103. Mattson M.P., Begley J.G., Mark R.J., Furukawa K. Abeta25-35 induces rapid lysis of red blood cells: contrast with Abetal-42 and examination of underlying mechanisms. 1997. Brain Res, v.771, N 1, p. 147-153.

104. Mayeux R., Honig L.S., Tang M.X., Manly J., Stern Y., Schupf N., Mehta P.D. Plasma Abeta.40 and A[beta]42 and Alzheimer's disease: relation to age, mortality, and risk. 2003. Neurology, v. 61, N 9, p.1185-1190.

105. Meylan W.M., Howard P.H. Atom/fragment contribution method for estimating octanol-water partition coefficients. 1995, J.Pharm.Sci., v.84, p.83-92.

106. Mihailescu D., Constantinescu A., Dragutan I., Cuculescu M., Frangopol P.T. Procaine incorporation into human erythrocyte membrane a spin label study. 1993, Arch Int Physiol Biochim Biophys, v. 101, N2, p. 155-159.

107. Molotchkina E.M., Ozerova I.B., Burlakova E.B. "ICHFAN" new antioxidant drug for the treatment of Alzheimer's disease. Free Radical Biology and Medicine 2002.V.33. Issue 2S1. № 610. p.S229-S230.

108. Morimoto Y., Hosokawa M., Sayo H., Takeuchi Y. ESR study of membrane perturbation and the lysis of liposomes induced by chlorpromazine. 1994, Chem Pharm Bull (Tokyo), v.42, N1, p.123-129.

109. Muller P., Herrmann A. Rapid transbilayer movement of spin-labeled steroids in human erythrocytes and liposomes. 2002, Biophysical Journal, v.82, p.1428-1428.

110. Nagasawa T. Deformation of transforming red cells in various pH solution. Experientia 1981, 37(9), p.977-978.

111. Nohl H., Stolze K. The effects of xenobiotics on erythrocytes. 1998, Gen. Pharmacol., v. 31, N3, p.343-347.

112. Olivier J.L., Chachaty C., Wolf C., Daveloose D., Bereziat G. Biding of two spin-labelled derivatives of chlorpromazine to uman erythrocytes. 1989, Biochem J, v.264, N3, p.633-641.

113. Omoto H., Al-Shawi M.K. A novel electron paramagnetic resomamce approach to determine the mechanism of drug transport by P-glycoprotein. The Journal of Biological Chemistry, 2002, v.277, N 47, p.45688-45694.

114. Ondrias K., Balgavy P., Stole S., Horvath L.I. A spin label study of parturbation effect of tertiary amine anesthetics on brane lipid liposomes and synaptisomes. BBA, 1983, v.732, N 3, p.627-635.

115. Ondrias K., Biskupic S., Stasko A., Pogady J. A spin probe study of chlorpromazine and its derivatives on lipid-protein interactions in synaptosomal membranes. 1992, Gen Physiol Biophys, v.l 1, N4, p.345-357.

116. Panchagnula R., Thomas N.S. Biopharmaceutics and pharmacokinetics in drug research. 2000, International journal of Pharmaceutics, v.201, p.131-150.

117. Pezeshk A., Derick Dalhouse A. Vitamin E, membrane fluidity, and blood pressure in hypertensive and normotensive rats. Life Sci., 2000, 67(15), p. 1881-1889,

118. Podolak M. Interaction between membranes and ammonium salts with different alkyl chain length. 2002, Current Topics in Biophysics, v.26, N 2, p.211-216.

119. Przestalski S., Sarapuk J., Kleszynska H., Gabrielska J., Hladyszowski J., Trela Z., Kuczera J. Influence of amphiphilic compounds on membranes. 2000, Acta Biochimica Polonica, v.47, N.3, p.627-638.

120. Racker E. A new procedure for the reconstitution of biologicallyactive phospholipid vesicles. Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1973. -vol.55-p.224-230.

121. Rosenberg P.H., Jansson S.E., Gripenbarg J. Effect of halothane, thiopental and lidocaine on fluidity of synaptic plasma membranes and artificial phospholipid membranes. 1977, Anesthesiology, v.46, N5, p.322-326.

122. Rosenberg P.H., Alila A. Hydrophobic membrane interaction of etidocaine, bupivacaine and 2-chloroprocaine. A spin and fluorescent probe study. 1982, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, v.319, N2, p.95-100.

123. Rousselet A., Guthmann C., Natricon J., Bienvenue A. Study of the transverse diffusion of spin labeled phospholipids in biological membranes of human red blood cells. BBA, 426, 1976, p.357-371.

124. Scheidt H.A., Muller P., Herrmann A., Huster D. The Potential of Fluorescent and Spin-labeled Steroid Analogs to Mimic Natural Cholesterol 2003, The Journal of Biological Chemistry, v. 278, No. 46, p. 45563-45569.

125. Schrier S.L., Zachowski A., Devaux P.F. Mechanisms of amphipath -induced stomatocytosis in human erythrocytes. Blood, 1992, 79(3), p. 782786.

126. Sentjurc M., Strancar J., Koklic T. Membrane domain alteration under the action of biologically active substances: an EPR study. 2002, Current Topics in Biophysics, v.26, N1, p.65-73.

127. Seigneuret M., Zachowski A., HermannA., Devaux P.F. Asymmetric lipid fluidity in human erythrocyte membrane: new spin-label evidence. Biochemistry, 1984, 23, p.4271-4275.

128. Selkoe D.J. Alzheimer's disease: Genes, proteins and therapy. 2001, Physiological Reviews, v.81, N2, p.741-776.

129. Sheetz M., Singer S. Biologycal membranes as bilayer couple. A molecular mechanism of drug-erythrocyte interaction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974, v.71 p. 4457-4461.

130. Sheetz M.P., Singer S.J. On the mechsnism of ATP-induced shape change in human erythrocyte membranes. 1977, J. Cell Biol, v.73, p.638-646.

131. Sheetz M.P., Singer S.J. Equilibrium and kinetic effects of drugs on the shape of human erythrocytes. The J. of Cell Biol., 1976, 70, p.247-251.

132. Subczynski W.K., Wojas J., Pezeshk V., Pezeshk A. Effect of probucol on phase transition and fluidity of phosphatidylcholine membranes: a spin label study. 1994, J.Inorg.Biochem., v.55, N1, p.1-11.

133. Subczynski W.K., Wisniewska A. Physical properties of lipid bilayer membrane: relevance to membrane biological functions. 2000, Acta Biochimica Polonica, v.47, N3, p.613-625.

134. Sulpice J.C., Zachowski A., Devaux P.F., Giraud F. Requirement for phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Ca2+ induced phospholipids redistribution in thr human erythrocyte membrane. 1994, J.Biol.Chem. v. 269, N9, p.6347-6354.

135. Suwalsky M., Hernandez P., Villena F., Aguilar F., Sotomayor C.P. The anticancer drug adriamycin interacts with human erythrocyte membrane. 1999, Z.Naturforsch.(C), v.54, N3-4, p.271-277.

136. Suwalsky M., Hernandez P., Villena F., Sotomayor C.P. The anticancer drug cisplatin interacts with human erythrocyte membrane. 2000, J. Naturforsch (C), v.55, N5-6, p.461-466.

137. Tanaka Y., Inoue K., Nojima S. Interaction of dilauroyl-glycerophosphocholine with erythrocytes: pre-hemolytic events and hemolysis. Biochim Biophys Acta, 1980, v.600, N1, p. 126-139.

138. Taylor A.M., Watts A. Spin-label studies of lipid-protein interaction with reconstituted band 3? the human erythrocyte chlorid-bicarbonate exchanger. Biochem. Cell Biol., 1998, 76(5), p.815-822.

139. Tedesco I., Russo M., Russo P., Iacomino G., Russo G.L., Carraturo A., Faruolo C. Moio L., Palumbo R. Antioxidant effect of red wine polyphenols on red blood cells. J Nutr Biochem. 2000, 11(2), p. 114-119.

140. Truong H.T., Deleke D.L., Huestis W.H. Dithiothreitol stimulates the activity of the plasma membrane aminophospholipid translocator. BBA, 1993, 1150, p. 57-62.

141. Tsuchiya M., Asada A., Kasahara E., Sato E.F., Shindo M.,. Inoue M. Antioxidant protection of propofol and its recycling in erythrocyte membranes. 2002, Am.J.Respir.Crit.Care.Med. v. 165, p.54-60.

142. Udden M.M. Rat erythrocyte morphological changes after gavage dosing with 2-butoxyethanol: a comparison with the in vitro effects of butoxyacetic acid on rat and human erythrocytes. J. Appl. Toxicol., 2000, 20(5), p. 381-387.

143. Vogel A., Scheidt H.A., Huster D. The Distribution of Lipid Attached Spin Probes in Bilayers: Application to Membrane Protein Topology 2003, Biophysical Journal v.85, p. 1691-1701.

144. Wang R., Fu Y., Lai L. A New Atom-Additive Method for Calculating

145. Partition Coefficients. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1997, 37, 615-621.

146. Watala C., Gwozdzinski K. Effect of aspirin on conformation and dynamics of membrane proteins in platelets and erythrocytes. 1993, Biochem Pharmacol, v.45, N6, p. 1343-1349.

147. Wen Z., Xie J., Guan Z., Sun D., Yao W., Chen K., Yan Z.Y., Mu Q. A study of hemorheological behaviour for patients with Alzheimer's disease at the early stages. 2000. Clin Hemorheol Microcirc, v.22, N 4, p.261-266.

148. Wong P. Mechanism of control of erythrocyte shape: a possible relationship to band 3. 1994, J. Theor. Biol. 171 N2, p. 197-205

149. Wong P. A basis of echinocytosis and stomatocytosis in the disc-sphere transformation of erythrocyte. 1999, J. Theor. Biol. 196 N3, p.343-361.

150. Zhang D., Kiyatkin A., Bolin J.T., Low P.S. Cristallographic structure and functional interpretation of the cytoplasmic domain of erythrocyte membrane band 3. 2000, Blood, v.96,N9, p.2925-2933.

Информация о работе

Паршина, Евгения Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.02

Диссертация

Особенности взаимодействия новых гибридных антиоксидантов-ихфанов с эритроцитарной мембраной - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы