Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности внутренних цепей питания зеленоядных мышевидных грызунов

ВАК РФ 03.00.08, Зоология

Автореферат диссертации по теме "Особенности внутренних цепей питания зеленоядных мышевидных грызунов"

Российская Академия наук Институт проблем экологии и эволюции имени А. Н. Северцова

На правах рукописи

Варшавский Александр Андреевич

Особенности внутренних цепей питания зеленоядных мышевидных грызунов

Специальность 03.00.08 - Зоология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в лаборатории экологии и функциональной морфологии высших позвоночных Института проблем экологии и эволюции РАН

Научный руководитель Научный консультант

доктор биологических наук Е. И. Наумова профессор, доктор биологических наук М. М. Умаров

Официальные оппоненты

профессор, доктор биологических наук

кандидат биологических наук А. В. Чабовский

Ведущая организация Санкт-Петербургский Государственный

Унивсрситст

Защита диссертации состоится 2 марта 2004 г. в 14 часов иа заседании Диссертационного совета Д 002.213.01 по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук при Институте проблем экологии и эволюции им. А. Н. Северцова РАН по адресу: Москва, 119071, Ленинский проспект, д. 33.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОБН РАН

Автореферат разослан февраля 2004 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук Л. Т. Капралова

2004^

20307

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Известно, что не только крупные растительноядные млекопитающие, но и некоторые мышевидные грызуны, например полёвки, способны к высокоэффективному усвоению вегетативных частей растений, характеризующихся низкой питательной ценностью. В мировой научной литературе уделено достаточно много внимания морфоэкологическим адаптациям крупных млекопитающих-фитофагов к потреблению кормов низкой питательной ценности, а также стратегии их пищеварения. Механизмы же обеспечения организма зеленоядных грызунов питательными веществами во внутренних (симбионтных) цепях питания изучены недостаточно.

Предполагается, что у растительноядных млекопитающих, в том числе грызунов, специализированных к питанию дефицитными по содержанию белка зелеными и подземными частями растений, важную роль в питании и пищеварении играет диазотрофно-целлюлолитический комплекс микроорганизмов. Однако до сих пор закономерности функционирования этого важнейшего звена внутренних цепей питания у млекопитающих практически не исследованы.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа была выполнена с целью изучения особенностей функционирования диазотрофно-целлюлолитического комплекса у травоядных мышевидных грызунов, испытывающих более острый недостаток диетарного азота по сравнению с семеноядными видами. Для этого были поставлены следующие задачи:

1) Провести анализ морфофункциональных адаптации пищеварительной системы исследуемых видов мышевидных грызунов к потребляемым

2) Определить диапазоны и пики активности основных ферментов комплекса у разных видов зеленоядных мышевидных грызунов.

3) Выяснить основные факторы, влияющие на эндоглюканазную активность в пищеварительном тракте.

кормам.

4) Исследовать влияние различных кормов (как субстратов для роста и развития микрофлоры) на активность целлюлолитических и азотфикси-рующих эндосимбионтов.

5) Разработать методику определения целлобиогидролазной активности (ЦА) эндосимбионтов пищеварительного тракта в условиях, приближенных к нативным.

6) Дать функциональную оценку особенностей внутренних цепей питания у зеленоядных грызунов и их роли в стратегии питания и пищеварения.

Научная новизна. Впервые выяснены некоторые закономерности функционирования симбиоценозов на примере достаточно больших выборок диких млекопитающих с использованием биохимических методов. Разработана методика измерения целлобиогидролазной активности в пробах содержимого пищеварительного тракта мелких млекопитающих. Показана корреляция ферментативной активности симбионтов с некоторыми структурными особенностями пищеварительного тракта, лактацией самок и составом корма (в эксперименте). Проанализированы особенности стратегии питания и пищеварения у представителей трех семейств мышевидных грызунов, использующих в пищу травянистые корма.

Практическая значимость. Полученные данные могут быть использованы для выделения наиболее активных микробных ассоциаций диазотрофно-целлюлолитического комплекса в целях дальнейшего использования в биотехнологии кормопроизводства и переработки целлюлозосодержащих отходов.

Апробация работы. По материалам работы были сделаны доклады на школе-семинаре «Проблемы эволюционной и экологической морфологии» (Москва, 2001), на Международном совещании «Териофауна России и сопредельных территорий» (Москва, 2003) и на объединенном коллоквиуме Лаборатории экологии и функциональной морфологии высших позвоночных и Группы популя-ционной экологии ИПЭЭ РАН (Москва, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 2 тезисов, ещё 2 статьи находятся в печати.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, 3 частей, разбитых на главы, и выводов. Текст диссертации изложен на ¿/¿^страницах, содержит.__2!_таблиц и_^/^рисунков. Список литературы содержит работ на русском и других языках.

Выполнение этой диссертационной работы было бы невозможно без помощи ряда людей, которых автор искренне хотел бы поблагодарить.

За отличное руководство, помощь в обработке материалов и организацию достойных условий работы - Е. И. Наумову. Других сотрудников Лаборатории экологии и функциональной морфологии высших позвоночных - Г. К. Жарову, Т. Ю. Чистову, Н. Г. Нестерову, И. Г. Мещерского и аспиранта О. О. Буткевича — за ценные советы, помощь в работе и моральную поддержку. Сотрудников кафедры Биологии Почв факультета Почвоведения МГУ М. М. Умарова, Н. В. Костину и аспирантку Т. А. Ульянову за измерения нитрогеназной активности, помощь в сборе материала и конструктивное обсуждение работы. Своего отца А. А. Варшавского и Ю. Г. Пузаченко за помощь в статистической обработке и оценке результатов. А. Ю. Пузаченко и сотрудников Центрально-Чернозёмного биосферного заповедника за помощь в добыче материалов по обыкновенному слепышу. Сотрудников научно-экспериментальной базы «Черноголовка» ИПЭЭ РАН за помощь при сборе материала, а особенно - И. А. Тихонова, оказавшего неоценимую помощь и при отлове полёвок, и при определении видов-двошгаков и вообще при организации работы. Сотрудников Научно-учебного отдела биохимических проблем экологии Института биохимии РАН за помощь в работе, а особенно М. Л. Рабиновича за совместную разработку методики определения ЦА и ценные советы по биохимии, а также Е. А. Звереву за предоставленные материалы. В. М. Малыгина за ценную информацию по видам-двойникам и моральную поддержку. Свою невесту, родных и друзей, всех, кто морально, материально и информационно поддерживал меня при оформлении данной работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение

Во введении рассматриваются основные этапы изучения пищеварительной. системы млекопитающих, обосновывается актуальность темы диссертации и практическое значение исследования диазотрофно-целлюлолитического комплекса. Даётся расшифровка понятия «внутренние цепи питания» - механизмы симбиотической трансформации трудно- или полностью неусвояемого корма в; легкоусвояемый в ЖКТ хозяина.

Часть 1. Особенности морфологии пищеварительной системы и симбионтного пищеварепия у растительноядных грызунов

Особенности кормовой базы и физиологии питания. Бурное развитие в палеоцене цветковых растений и последовавшая затем интенсивная экспансия травянистой растительности привели к возникновению растительноядных млекопитающих, а в дальнейшем — к их широкой адаптивной радиации. Высокое содержанием структурных углеводов (целлюлоза, гемицеллюлозы, лигнин) в растительной пище, ферментов для расщепления которых сами млекопитающие не вырабатывают, привело к необходимости формирования у них комплексов эколого-морфологических и функциональных адаптации.

У специализированных фитофагов, в отличие от генерализованных, обычная схема пищевой цепи, в которой за потреблением пищи сразу следует усвоение, удлиняется, благодаря введению ряда промежуточных звеньев, связанных с симбионтным преобразованием субстрата (Наумова, 1988). Произошёл перенос функций пищеварения на микрофлору пищеварительного тракта.

Эволюционное формирование эндосимбиоза в разных группах млекопитающих происходило двумя базовыми путями - образованием специальных камер для функционирования симбионтов в желудке, либо кишечнике. В соответствии с топографией этих камер, растительноядных млекопитающих в современных исследованиях разделяют на две группы — с преджелудочной и кишечной ферментацией (Наумова, 1999).

Существуют различные точки зрения на оптимальные стратегии кормления и пищеварения млекопитающих-фитофагов. В работе Хьюма (Hume, 1989) предлагается теория, учитывающая особенности условий питания представителей кишечных и преджелудочных ферментаторов. Согласно этому представлению, ни тот, ни другой тип ферментации не имеет абсолютных преимуществ в равных экологических условиях. Кишечный тип ферментации соотносится с «количественной» стратегией кормления и наиболее выгоден в условиях практически неограниченного доступа к пище (например, в степных ландшафтах). В случае же ограниченного количества пищевых ресурсов более выгодным является максимальное усвоение субстрата, реализуемое в преджелудочиом типе.

Весьма существенным представляется подразделение растительноядных млекопитающих на крупных и мелких. Примерная граница проводится на уровне массы тела 10 кг. Важность этого критерия вытекает из правила Клай-бера: удельные энергетические потребности организма уменьшаются с увеличением массы тела. В силу содержания высокого процента труднопереваримых компонентов, растительные корма значительно уступают животным по энергетической ценности, поэтому снижение энергетических потребностей в эволюции фитофагов представляется необходимым процессом. Следуя этим постулатам, большинство специалистов связывает увеличение толерантности млекопитающих к грубым растительным кормам с увеличением массы тела, отказывая мелким животным, в частности грызунам, в возможности специализации на питании бедными кормами.

Однако среди грызунов существуют такие высокоспециализированные к зеленоядности виды, как различные полёвки (Microtinae), большая песчанка (Rhombomys opimus), некоторые хомяки (Neotominae), крысы (Nesokia) и другие, не говоря уже о более крупных грызунах, таких как бобр (Castor). Среди зайцеобразных, также специализирующихся на богатых целлюлозой кормах, есть и весьма мелкие виды - пищухи (Ochotona) (Наумова, 1999). В то же время, для некоторых видов грызунов были получены экспериментальные данные, свидетельствующие об их способности эффективно усваивать клетчатку (Keys, Van

Soest, 1970; Hammond, Wunder, 1991; Justice, Smith, 1992; Абатуров, Хашаева,

1995).

В связи именно с мелкими размерами грызуны имеют наибольшую возможность избирательного выбора корма. Это обстоятельство может обеспечить мелким зверькам существенные преимущества уже на стадии сбора пищи.

Теоретически, уровень потребления пищи у грызунов должен быть больше в расчёте на массу тела, поскольку ёмкость пищеварительного тракта относительно энергетических потребностей у них меньше, чем у крупных млекопитающих. В этом случае неизбежно увеличивается скорость прохождения пищи по ЖКТ, что, в свою очередь, снижает время симбионтной ферментации, снижая её эффективность. Казалось бы, эти доводы говорят против возможности успешного усвоения грызунами волокнистой, богатой целлюлозой, пищи. Однако не стоит забывать, что в условиях более интенсивного метаболизма всасывание усваиваемых олигомеров также происходит быстрее, смещая равновесие реакций, в т.ч. ферментативных, и, таким образом, ускоряя их. Длительность нахождения химуса в слепой кишке - основном ферментёре мелких грызунов -значительно больше, чем в среднем в ЖКТ (Жарова и др., 1996, 2002), а цеко-трофия (Наумова, 1981) способствует как наиболее полному извлечению углеводов, так и перевариванию микробной массы.

Морфология пищеварительной системы мелких зеленоядных грызунов и её связь с симбионтной ферментацией.

Обобщая множество публикаций о морфологии желудка у грызунов, Наумова (1999) приводит следующие классификации желудка этих млекопитающих:

а) По количеству камер - однокамерный (унилокулярный), двухкамерный (билокулярный) и многокамерный (плюрилокулярный).

б) По характеру эпителиальной выстилки - железистый, полужелезистый и дискожелезистый.

Если желудок различных видов грызунов характеризуется весьма широким спектром функций, то слепая кишка, безусловно, является основным локусом

ферментации именно клетчатки. В силу её расположения в каудальной части пищеварительного тракта субстрат попадает туда, пройдя своеобразное «обогащение» целлюлозой. Кислый секрет желудка способствует разрушению кутикулы и набуханию волокон целлюлозы, делая их более доступными для ферментативной атаки. Протеазы, амилазы, липазы и различные другие ферменты, как эндогенные, так и секретируемые микрофлорой преджелудка, обеспечивают деструкцию многих компонентов пищи до легкоусвояемых олигомеров. Последние ассимилируются в тонком кишечнике. Таким образом, в слепую кишку поступает в основном целлюлозная фракция достаточно высокой степени очистки.

Ободочная кишка у грызунов может достигать необычно большой длины и высокой степени морфологической дифференциации (Наумова, 1988). По макроструктуре слизистой она представляет собой фильтр, способный замедлять движение химуса и производить его дифференцировку. Изучение скорости продвижения пищи по различным отделам кишечника у крысы и лемминга с помощью индикатора позволило предположить, что ободочная спираль служит сепаратором бактерий от содержимого кишечника (Sperber et al., 1983). При этом бактериальный «концентрат» может возвращаться по узкому каналу в слепую кишку, либо поедаться. Также в ободочной кишке предполагается сепарация пищевой массы - крупные непереваренные волокна могут задерживаться и возвращаться на доработку в слепую кишку (Наумова, 1988).

Симбионтное пищеварение. Бактерии колонизируют ЖКТ млекопитающего вскоре после его рождения. Кишечная микрофлора включает как факультативно поселяющихся микроорганизмов, так и облигатных симбионтов, которые развиваются в достаточно стабильные популяции и являются видоспецифич-ными (Stevens, Hume, 1998). Ферменты многих микроорганизмов способны перерабатывать субстрат, неусвояемый или труднопереваримый для хозяина, как, например, целлюлозу.

Целлюлозные системы включают ферменты, способные расщеплять 0-1,4-глюкозидные связи в полимерных формах целлюлозы, а также ферменты иной

специфичности или некаталитические белки, способные действовать на поверхности целлюлозы, т.е., содержащие целлюлозосвязывающий домен.

Представители рода Clostridium, целлюлазные системы которых изучены наиболее хорошо, были обнаружены и в ЖКТ млекопитающих (Бигон и др., 1989; Wang et al., 1996), и в пищеварительном тракте термитов (Орлова, 1972). Мы предполагаем, что ведущую роль во внутренних цепях питания грызунов играют именно анаэробные или микроаэрофильные микроорганизмы.

В середине 70-х годов в рубце жвачных были открыты анаэробные фико-мицетные грибы (Orpin, 1976; Orpin, Letcher, 1979), выработавшие в результате конвергентной эволюции ферментные системы, сходные с таковыми у анаэробных бактерий. Не исключено присутствие этих грибов и в пищеварительном тракте грызунов, специализирующихся на питании кормами с высоким содержанием целлюлозы. Организм-хозяин снабжается продуктами микробного гидролиза растительного субстрата при попадании клеток симбионтов в железистый желудок из преджелудка или - путём цекотрофии - из кишечника.

Не имея возможности фиксировать атмосферный азот, эукариоты образуют для этого азотфиксирующие сообщества с диазотрофными бактериями. Лаптев (1995) продемонстрировал явление симбионтной азотфиксации у жвачных. Согласно этой работе, азотфиксирующие микроорганизмы не относились к об-лигатной микрофлоре рубца, а попадали туда с кормом. Среди грызунов диазо-трофные бактерии впервые были выделены из пищеварительного тракта красной полёвки Clethrionomys rutilus (Наумова и др., 2000).

Часть 2. Материал и методика

Объектами изучения были выбраны представители трёх семейств мышевидных грызунов, характеризующиеся одной общей чертой - питанием преимущественно вегетативными частями растений.

1) Серые полёвки видов Microtus arvalis и М. rossiaemeridionalis. Характеризуются двухкамерным дискожелезистым желудком.

2) Песчанки видов Psammomys obesus и Meriones crassus. Характеризуются однокамерным полужелезистым желудком.

3) Обыкновенный слепыш Spdlax microphtalmus. Желудок, как и у серых полёвок, двухкамерный дискожелезистый.

Серые полёвки были выбраны как характерные представители высокоспециализированных травоядных грызунов. Из двух исследованных видов у восточноевропейской полёвки кормовой диапазон - несколько шире (Башенина, 1994). Песчанки, обладающие однокамерным полужелезистым желудком, служат хорошим ориентиром для сравнения. P. obesus способна продолжительное время питаться исключительно галофитом Anabasis, содержащим ~ 44% целлюлозы, М. crassus характеризуется смешанным зеленоядно-семеноядным типом питания. И, наконец, слепыши являются эволюционно наиболее древней группой растительноядных грызунов. Их кормовой рацион состоит в основном из зелёных частей растений, корневищ и корнеплодов (Варшавский, Пузаченко, Наумова, 2003). Кроме того, размеры тела слепышей значительно превышают размеры полёвок и песчанок, и в связи с этим слепыши также интересны для сравнительного анализа. Акцент в исследовании сделан на полёвок, по которым удалось получить массовый материал, а полученные данные по малым выборкам песчанок и слепышей рассматриваются как сравнительные.

Отлов полёвок для изучения эндоглюканазной активности (ЭА) и факторов, на неё влияющих, проводился на научно-экспериментальной базе «Черноголовка» ИПЭЭ РАН в июне-августе 2001 года. Зверьков отлавливали линиями плашек, которые выставлялись на 3-4 суток в двух биотопах: огородные участки и придорожная межа (разнотравье, кустарник). Всего было отловлено 18 восточноевропейских и 31 обыкновенная полёвка. При вскрытии определялись следующие параметры: пол, масса тела, линейные размеры, генеративное состояние, масса пищеварительного тракта и отдельно масса преджелудка и слепой кишки. Отбирались пробы содержимого преджелудка и слепой кишки (с участками стенки) для дальнейшего исследования ЭА.

Для изучения ЗА и нитрогеназной активности (НГА) слепышей в конце мая - начале июня 2002 г. в Центрально-Черноземном биосферном заповеднике (Курская обл., Россия) были отобраны пробы содержимого преджелудка и слепой кишки у 6 особей обыкновенного слепыша.

Песчанки (по 2 экземпляра каждого вида) были отловлены в ноябре 2002 в пустыне Негев севернее Митцпе-Рамоиа (Израиль), пробы химуса для определения ЭА и НГА отбирались также в Израиле, измерения проводили в Москве.

Для эксперимента по выяснению влияния корма на ферментативную активность симбионтов полёвки (21 взрослая особь вида М, го$$1аетеп<Иопа11$, отловленные в Воскресенском районе Московской области) содержались в лаборатории научно-экспериментальной базы «Черноголовка» в августе-сентябре 2002 года в условиях, приближенных к естественным (температура, освещение). Низкий уровень стресса в этих условиях доказывается успешным размножением зверьков.

В течение 12 суток контрольная группа полёвок (10 особей) получала семена овса и подсолнечника в качестве белкового корма, а опытная группа (11 особей) - свежесобранные листья одуванчика в качестве корма, бедного белком, но с большим содержанием глюканов. Обе группы получали также питьевую воду и морковь. Морковь давали как стартовый источник азота, необходимый для азотфиксации, контрольная группа получала ее во избежание возможных артефактов при измерениях. По окончании опыта у всех полёвок были отобраны пробы химуса для исследования ферментативной активности. Пробы отбирали только из слепой кишки, т.к. в преджелудке часто наблюдалось недостаточное количество химуса для измерения НГА.

Виды-двойники были идентифицированы при помощи электрофореза ге-моглобинов (Доброхотов, Малыгин, 1982). ЭА измеряли вискозиметрическим методом, НГА - хроматографическим, по ацетиленредуктазной активности. Результаты измерений анализировали с помощью пакета «^аШюа 6.0». Для анализа зависимости ЭА от пола, вида, лактации и беременности (ранговых величин) использовался критерий Краскела-Уоллиса (ранговый эквивалент од-

нофакторного дисперсионного анализа). Этот же критерий применялся и для анализа зависимости активности ферментов ЖКТ от рациона. Для анализа зависимости ЭА от длины тела (как показателя, коррелирующего с возрастом), массы тела, ЖКТ и отдельно преджелудка и слепой кишки (непрерывных величин) использовались корреляции Спирмена (Я) и гамма.

Методика вискозиметрического измерения эндоглюканазной активности. Использовался стандартный метод (Синицын и др., 1990) с некоторыми изменениями. Пробы химуса из ЖКТ объектов инкубировали в 80% глицерине в течение месяца при 1° = + 4-6°С. При измерении ЭА использовался 0.15М фосфатный буфер рН 6.8-7.0 и, в качестве субстрата, раствор №-КМЦ средней вязкости (1СК).

Методика измерения нитрогеназной активности по восстановлению ацетилена. Использовался стандартный метод (Методы.., 1991) с некоторыми изменениями. Пробы химуса (или стенок ЖКТ) помещали в герметично закрытые пенициллиновые флаконы и продували аргоном. Затем во флакон вводили 1 мл ацетилена и инкубировали 1 час при 37°С, после чего отбирали 1 мл газовой фазы и измеряли количество содержащегося в ней этилена. Этилен определяли на газовом хроматографе "СЬгош-41" с пламенно-ионизационным детектором; длина колонки 2 м, наполнитель 8рЬего8П, газ-носитель Аг под давлением 2 атм.

Методика флуориметрического измерения пеллюлазной активности. Принцип метода состоит в том, что МУФ (4-метилумбеллиферат) обладает способностью к- флуоресценции, а. МУФ-Ц (4-метилумбеллиферил-Р-О-целлобиозид), в котором остаток целлобиозы присоединён к молекуле МУФ такой же связью, как и в молекуле целлюлозы, не обладает этой способностью. При добавлении в раствор, содержащий МУФ-Ц, целлобиогидролазы, она отщепляет целлобиозид в том же молярном соотношении, что и при гидролизе целлюлозы, и высвобождает МУФ,флуоресценцию которого можно зарегистрировать, и, сравнив с флуоресценцией раствора МУФ известной концентрации, выяснить количество вещества (у) МУФ, образующегося в ходе реакции.

Активность фермента рассчитывается как отношение v продукта реакции к её времени.

Изначально этот метод (Синицын и др., 1990) применялся в лаборатории углеводов НУОБПЭ ИНБИ РАН для измерения активности целлобиогидролаз, выделенных из чистых культур и очищенных. Однако, хорошо известно, что поведение биологических систем in vivo и in vitro сильно различается. В полной мере это относится и к ферментам, тем более, что до сих пор неизвестно, сколько и какие именно целлобиогидролазы синтезируются симбионтами ЖКТ грызунов. Нашей целью являлось изучение ферментативной активности в условиях, максимально приближенных к нативным. Поэтому в качестве источника целлобиогидролаз в эксперименте использовались пробы химуса, зафиксированные в глицерине.

Однако при перемешивании раствор получался мутным, в результате чего флуоресценция могла гаситься. Это компенсировали тем, что в калибровочный раствор МУФ вносили химус в той же концентрации, что и в опытных пробирках. Другая проблема состояла в том, что частицы химуса неравномерно оседали на дно пробирок, что могло значительно искажать результаты. Именно это заставило нас поставить специальный опыт для проверки вышеизложенных предположений.

Из средней части слепой кишки домашнего кролика Oryctolagus cimiculus были отобраны пробы содержимого. Часть отобранного химуса растворили в 80% глицерине, часть - в фосфатном буфере и часть заморозили при -18°С. Кролик в качестве объекта был выбран как достаточно крупное животное, объём содержимого слепой кишки которого позволял отобрать все 15 проб (по 3 повторности на опыт и по 2 на контроль гашения флуоресценции) из одного локуса. Все пробы были выдержаны в течение 21 суток при температуре +4°С, замороженные — при -18°С, после чего проводились измерения ЦА. Размороженный химус и супернатанты из глицеринового и буферного экстрактов растворяли в фосфатном буфере так, чтоб конечная концентрация химуса в

реакционных пробирках составляла 0.005 г/мл. Результаты измерений приведены в таблице № 1.

Таблица №1. Значения ЦА симбионтов слепой кишки домашнего кролика в разли

ных условиях опыта.

; ЛрОбЫ ЦА, мкмоль/мин на грамм химуса

Разброс маченяй Среянее

Экстр» кт в 80% глицерине 0.055-0.067 0.062

Экстракт в фосфатной буфере 0.055-0.067 0.062

Замороженный химус 0.048-0.075 0.059

Как видно из таблицы, в пробах замороженного химуса отмечается больший разброс и несколько меньшая ЦА, что вызвано взвесью частиц химуса в реакционных пробирках. Из этого был сделан вывод, что данные, полученные при измерении ЦА в присутствии химуса, нельзя рассматривать, как абсолютные, но допустимо использовать при сравнении групп. Для дальнейших экспериментов было решено использовать экстракцию в глицерине, т. к., при идентичных с чистым буфером значениях активности, это позволяет использовать одни и те же пробы для измерения ЭА и ЦА, а также обеспечивает лучшую консервацию образцов (взвесь содержимого ЖКТ в нейтральном буфере представляет собой хорошую питательную среду для различных микроорганизмов).

Часть 3. Исследование диазотрофно-целлюлолитического комплекса мышевидных грызунов

Эндоглюканазная активность в ЖКТ серых полёвок. Измерения показали, что диапазон колебаний значений ЭА микрофлоры ЖКТ у обоих видов полёвок достаточно широк - от 3.0 до 130.2 мкмоль/мин на 1г химуса в преджслудке и от 16.8 до 237.0 мкмоль/мин на 1г химуса в слепой кишке. Средние значения ЭА в преджелудке и в слепой кишке равны, соответственно, 24.4 и 79.5 мкмоль/мин на 1г химуса. В преджелудке ЭА практически всегда ниже, чем в слепой кишке, независимо от вида.

В отличие от слепой кишки, наполнение преджелудка у полёвок непостоянно. Нулевые значения ЭА, как правило, соответствовали пустым преджелуд-

кам или лишь со следами содержимого, поэтому при анализе игнорировались во избежание артефактов.

Как видно из рис. 1, существуют тенденции к более высокому уровню ЭА у М. ю$$1аетеп&опаШ по сравнению с М. агга^, но статистически достоверной зависимости обнаружено не было, поэтому в дальнейших расчетах выборку

не делили по видам для увеличения надежности используемых статистических критериев. Наблюдавшаяся тенденция, скорее всего, связана с избирательностью питания. Можно предположить большую эврифагию восточноевропейской полевки, её ббльшую толерантность к смене рациона. Данные о естественной избирательности питания видов-двойников (Башенина, 1994) не противоречат этой гипотезе. В её пользу говорит и большее разнообразие пристеночных симбионтов ЖКТ у М. rossiaemeridionalis по сравнению с М. arvalis. Нельзя однозначно исключить и влияние большей изоляции слепой кишки у восточноевропейской полёвки (кольцевидная створка илеоцекального клапана против 8-образной у обыкновенной полёвки).

Мы предполагаем, что меньший уровень ЭЛ в преджелудке по сравнению со слепой кишкой связан с тем, что микробная популяция в преджелудке подвержена резким колебаниям численности в зависимости от наличия или отсутствия субстрата, в то время как в слепой кишке условия стабильны. То есть, популяция микробов в слепой кишке находится в фазе плато и синтезирует эк-зоферменты в большем количестве, чем популяция преджелудка, находящаяся большую часть времени в фазе роста, в которой синтез экзоферментов ограничен. Однако вполне сравнимый уровень ЭА в преджелудке и в слепой кишке серых полёвок заставляет усомниться в их принадлежности к классическому типу кишечной ферментации. Возможно, этот тип корректнее обозначать как смешанный. Предварительный визуальный анализ (Варшавский, Наумова, Тихонов, 2003) показал заметную, хотя и недостоверную разницу в уровне ЭА самцов и самок. Однако в ходе дальнейшего анализа была выявлена зависимость ЭА от лактации, по крайней мере, в слепой кишке1, близкая к достоверной (р = 0.052). При исключении из выборки кормящих самок разница в ЭА между самцами и самками была в значительной степени нивелирована. Это позволило предположить, что наблюдавшаяся тенденция к проявлению зависимости ЭА от пола связана в первую очередь с лактацией, как с состоянием

1 Разброс значений ЭА в преджелудке значительно выше, чем в слепой кишке, соответственно выше и относительная ошибка. Поэтому к интерпретации данных по преджелудку следует относиться с особой осторожностью, основные выводы в работе делались по значениям ЭА в слепой кишке.

17

значительного расхода энергии и легкоусвояемых нутриентов. Исходя из этого предположения, мы включили в анализ самцов для увеличения выборки. В результате была показана достоверная зависимость ЭА в слепой кишке от лактации (рис. 2).

20 40 60 80 100 120 140 ЭЛ в преджелудке. Критерий Спирмена: N = 33. Я = 0.55, г(Ы-2) = 3.69, р - 0.0008 Критерий гамма:N - 33, гамма = 0.39, Ъ = 3.16, р = 0.0016 Рис. 3. Корреляции ЭА (дмоль/мин • г химуса) в преджелудке и в слепой кишке серых полевок

Была показана также достоверная корреляция между ЭА в преджелудке и в слепой кишке (рис. 3). Это можно объяснить в первую очередь реинокуляцией преджелудка целлюлолитическими бактериями путем цекотрофии. Не исклю-

чсна также и связь бактериальных популяций преджелудка и слепой кишки через ЖКТ.

Сравнение ЭА у разных видов грызунов. Даже тот небольшой объём данных по ЭА песчанок и слепышей, который нам удалось получить, демонстрирует картину, весьма сходную с таковой у серых полёвок (рис. 4).

□ Преджелудох □ Слепая кишка

Рис. 4. эндоглюканазная активность в ЖКТ различных видов грызунов.

Значения ЭА сравнительно близки, учитывая большой внутривидовой разброс, характерен меньший уровень ЭА в преджелудке. Последнее можно объяснить теми же причинами, что и у полёвок. Очень близкий к полевкам уровень ЭА в однокамерных желудках песчанок также вполне объясним. Угловая или серповидная складка в желудке песчанок делает его функционально двухкамерным. Во всяком случае, рН в безжелезистой части желудка поддерживается на уровне 6, что является оптимальным для микросимбионтов. Нулевую ЭА в преджелудке слепыша так просто не объяснить. Можно предположить, что причина заключается в составе корма слепышей, но не исключено и то, что тип ферментации обыкновенного слепыша - классический кишечный. Однако, дис-кожелезистый желудок предполагает развитие специфической микрофлоры. Возможно, подобно хомякам (Наумова, 1981), симбионты преджелудка слепышей заменяют или дублируют эндогагаые ферменты, например, амилолитиче-

ские. Исходя из того, что ЭА в преджелудке песчанок сравнима с активностью в слепой кишке, мы предполагаем, что Р. оЬеяыя и М. ега^т, очевидно, обладают смешанным типом ферментации. Меньшая ЭА в слепой кишке М. ега$$ы$ по сравнению с другими изученными видами, возможно, связана со смешанным типом питания и/или с малыми относительными размерами слепой кишки (~ 1.5% от массы тела у М. сгахшх, ~ 5-7% у остальных видов).

Азотфиксация в ЖКТ исследованных видов грызунов. У серых полёвок максимальные значения, зарегистрированные в различных опытах, достигают 0.9, 1.5 и 1.6 нмоль N2 на грамм химуса в час в преджелудке, в слепой и в ободочной кишке. Средние значения составляют 0.4, 0.3 и 0.7 нмоль N3 на грамм химуса в час. Следует отметить максимальную НГА в ободочной кишке.

Впервые среди мелких млекопитающих обнаруженная у красной полёвки (Наумова и др., 2000) НГА достигала в среднем 0.6, 1.6 и 8.1 нмоль N2 на грамм химуса в час в преджелудке, в слепой и в ободочной кишке. У обыкновенного слепыша - 0.2 и 0.6 в преджелудке и в слепой кишке (максимумы 0.4 и 1.9). У Р. оЬеяыя максимумы НГА были 0.4 и 0.6 в преджелудке и в ободочной кишке, однако эти цифры могут оказаться заниженными в связи с длительной транс -портировкой образцов. В пользу этого говорит то, что повторные измерения тех же проб всего через двое суток хранения показали 7-10-кратное падение активности.

Общим для всех исследованных видов является соотношение уровня НГА по отделам ЖКТ - близкие значения в преджелудке и в слепой кишке с некоторой тенденцией к повышению в последней и максимальная активность диазо-трофов в ободочной кишке. Вышеупомянутые повторные измерения НГА песчанок проводились на обоих видах и по всем отделам ЖКТ. Они показали такое же распределение активности. Можно предположить, что ободочная кишка является для мелких зеленоядных грызунов (по крайней мере, для исследованных видов) основным локусом симбионтной азотфиксации. К сожалению, из ободочной кишки слепыша не производился отбор проб, и мы можем только экстраполировать на него тенденцию, демонстрируемую другими видами.

Измерение НГА в химусе мелких млекопитающих сопряжено со многими трудностями, связанными, например, с малым объёмом химуса и крайней нестабильностью проб in vitro. Фактически проблема фихсации азота симбионтами млекопитающих находится в начальной стадии разработки. Мы уделили особое внимание отработке методики сбора проб для сохранения НГА. Полученные количественные данные следует интерпретировать с осторожностью. Тем не менее, их вполне можно использовать как ориентировочные и при сравнении групп.

Приближённые расчёты, строящиеся на значениях НГА, полученных в ходе данной работы, показывают суточный выход азота в количестве ~0.1% от азотного минимума восточноевропейской полёвки. Однако делать какие-либо выводы о количестве поступающего в организм полёвки азота пока ещё рано. Исследования симбионтной азотфиксации в пищеварительном тракте различных видов термитов, организмов наиболее хорошо изученных в этом аспекте, показали интересные несоответствия данных, полученных разными методами. При близком к млекопитающим (2.7-33.7 нмоль/час-г) уровне НГА у разных видов термитов (Golichenkov et al., 2002), изотопный анализ показывает долю фиксированного из атмосферы азота в тканях термитов порядка 30-60% (Tayasu et al., 1994; Tayasu, 1998). Можно предполагать, что подобное явление вызвано несовершенством методики измерения НГА, и, следовательно, что трофический вклад диазотрофов в метаболизм травоядных грызунов отнюдь не столь мал.

Ещё одним независимым свидетельством в пользу такого предположения является работа Г. Ю. Лаптева (1995) по исследованию симбионтной азотфик-сации в рубце жвачных. Факультативная микрофлора (НГА не отмечалась при кормлении домашних животных стерилизованным кормом и у диких в зимний период) развивала меньшую (0.06-3.6 нмоль N2 в 1 мл в час) активность, чем облигатные симбиоценозы ЖКТ исследованных нами грызунов. При этом изотопный анализ показал, что количество усвоенного атмосферного азота составляет 4-6% от потребности животного. Таким образом, логично предположить, что микрофлора травоядных грызунов, образующая постоянные внутренние

цепи питания и проявляющая в среднем более высокую НГА, нежели у жвачных, способна обеспечить хозяина и более значительным количеством азота. Возможно, усовершенствование методики измерения НГА в химусе, параллельно с использованием изотопного метода, прояснит этот вопрос.

Влияние рациона на ферментативную активность симбионтов слепой кишки восточноевропейских полёвок. Результаты измерения активностей ферментов диазотрофно-целлюлолитического комплекса представлены в таблице №2.

Таблица №2. Влияние рациона на ферментативную активность симбионтов слепой кишки восточноевропейских полёвок.

Несмотря на достаточно высокий разброс, связанный с малым объемом выборки, критерий Краскела-Уоллиса показал достоверную зависимость НГА и ЦА, и близкую к ней (р = 0.057) зависимость ЭА от корма (рис. 5-7).

Азотфиксация - чрезвычайно энергоемкий процесс, и требует присутствия легкоусвояемого субстрата, например, глюкозы. Основным источником ее в организме фитофагов являются растительные полисахариды, как аморфные (различные глюканы), так и высокоупорядоченные (целлюлоза), содержащиеся в пище. Млекопитающие не обладают собственными ферментными системами, разлагающими целлюлозу и сопутствующие ей глюканы, и эту функцию выполняют микросимбионты пищеварительного тракта. Такая система представляет собой типичный пример переноса функций. В сильно упрощенном виде цепочка выглядит так: целлюлоза и глюканы разлагаются целлюлолитическими микроорганизмами, образующаяся глюкоза частично усваивается хозяином, частично - диазотрофами, что дает последним энергию для связывания N2 (Варшавский, Наумова, Тихонов, 2003).

0.090

0.043 |

листья одуванчиков

зерно

Корм

К\У-Н(1,21)_ 9.01515152, р = 0.0027 • Среднее I I ±0.95 доверит, интервал *Ст. отел. Рис. 7. Влияние корма на ЦА в слепой кишке восточноевропейской полевки.

Мы исходили из предположения, что основным источником энергетического субстрата (глюкозы) в диазотрофно-целлюлолитическом комплексе является расщепление аморфных (}-глюканов и целлюлозы, а потребителем -азотфиксация. Однако отсутствие статистически значимых корреляций между основными ферментативными активностями опровергает эту гипотезу. Нельзя исключать, что такие корреляции проявятся на более крупных выборках, однако существуют и другие объяснения наблюдаемых фактов.

Один из вариантов состоит в том, что расщепление целлюлозных фибрилл, как энергоёмкий процесс, конкурирует с азотфиксацией в области потребления энергии. Источником её, скорее всего, служат сравнительно легкоусвояемые Р-глюканы. Другая гипотеза, в принципе, не исключающая первой, предполагает использование целлюлозы как значимого для симбиоза источника углерода только в случае дефицита легкоусвояемого субстрата. Подобные условия для полёвок могут реализоваться в зимний период. В пользу этого предположения свидетельствует повышение ассимиляции целлюлозы у рыжей полёвки при потреблении исключительно волокнистого корма по сравнению со смешанным (Нестерова и др., 1997). В то же время, отсутствие «высокоэнергетического»

корма означает и дефицит диетарного азота, т.е., необходимость микробной азотфиксации. Как травоядные грызуны решают эту проблему, покажут дальнейшие исследования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Внутренние цепи питания - важнейшее функциональное приспособление растительноядных млекопитающих, ставящее их вне зависимости от концентрированных кормов, подверженных сезонным и годовым колебаниям (Наумова, 1981). В обеспечении организма основными структурными элементами -углеродом и азотом - наиболее велика роль диазотрофно-целлюлолитического комплекса микросимбионтов пищеварительного тракта, исследованию которого посвящена эта работа. Полученные данные позволяют предположить универсальность этого комплекса у зеленоядных грызунов,, таксономически отстоящих друг от друга достаточно далеко, но близких по пищевой специализации и морфологии ЖКТ. Является ли эта универсальность только функциональной, конвергентной, или же следствием коэволюции с микроорганизмами на ранних путях формирования зеленоядности, чему служило бы подтверждением сходный видовой состав симбионтов у различных видов грызунов, могут показать дальнейшие эксперименты.

Обнаруженная автором толерантность диазотрофно-целлюлолитического комплекса серых полёвок к физиологическому состоянию хозяина при жёсткой зависимости от поставляемого им субстрата наводит на мысль о том, что роль этого комплекса не только трофическая, но и в некотором роде экологическая. Хорошо известно, что микроорганизмы, в отличие от многоклеточных, обладая широким спектром метаболических путей, не используют их все одновременно. Они переключаются на тот или иной путь в зависимости от состояния популяции и наличия в доступе того или иного субстрата. Неизвестно пока, как именно реализуется этот процесс во внутренних цепях питания грызунов, на уровне переключения метаболических путей одного вида микробов, или же преимущественной активизации различных компонентов симбиоценоза в зависимости от

условий, но такой modus vivendi симбионтов как нельзя лучше объясняет удивительную толерантность серых полёвок к смене кормов. Такая неприхотливость в выборе корма приводит и к экологической пластичности вида. Особенно это относится к восточноевропейским полёвкам (Башенина и др., 1994), но в той или иной степени сказывается и на других травоядных грызунах.

Выводы

1) Диапазоны активностей ферментов диазотрофно-целлюлолитического комплекса у исследованных видов весьма схожи, что может служить аргументом в пользу функциональной универсальности комплекса у различных видов зеленоядных мышевидных грызунов.

2) Для серых полёвок характерна высокая толерантность эндоглюканазной активности к физиологическому состоянию хозяина, что косвенно подтверждает стабильность диазотрофно-целлюлолитического комплекса в целом.

3) Продемонстрировано влияние состава корма на активность диазотроф-но-целлюлолитического комплекса восточноевропейских полёвок. Увеличение содержания соответствующего субстрата в корме вызывает увеличение ферментативной активности в 1.5-3 раза.

4) Судя по сравнительно высоким значениям ЭА в преджелудке, предже-лудочная ферментация у серых полёвок и песчанок играет важную роль, и эти виды можно отнести к смешанному типу ферментации.

5) Полученные данные по ЭА двух видов песчанок подтверждают гипотезу о функциональной билокулярности их желудка.

6) Исходя из полученных данных, основным локусом азотфиксации для всех исследованных видов является ободочная кишка, а основным ло-кусом переработки целлюлозы - слепая кишка. Такая общность также может служить аргументом в пользу функциональной универсальности комплекса у различных видов зеленоядных мышевидных грызунов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Варшавский А.А. Адаптации растительноядных млекопитающих: симбиоз с азотфиксирующими бактериями. Проблемы эволюционной и экологической морфологии. Школа-семинар (Москва, 15-16 мая 2001 г.), программа и материалы. М.: Пиоинформсерпис, 2001, с. 85-88.

Варшавский А.А., Наумопа Е.И., Тихонов И.А. Исслсдопание гшдопнока-нашой" активности микрофлоры слепой кишки и преджелудка серых полевок. Тернофауна России и сопредельных территорий; материалы Международного совещания 6-7 февраля 2003г., Москва.

Ушакова Н.А., Белов Л.П., Варшавский А.А., Козлова А.А;, Колганова Т.В., Булыгина Е.С., Турова Т.П. Расщепление целлюлозы при дефиците азота бактериями, выделенными из кишечника растительноядных позвоночных. Микробиология, 2003, т. 72, №3, с. 1-7.

Варшавский А.А., Пузаченко А. 10., Наумова Е. И., Костина Н. В. Ферментативная активность микрофлоры пищеварительного тракта обыкновенного слепыша Spalax microphtalmns (Spalacidea, Rodentia). ДАН, 2003, т. 392, №4, с. 564-567.

Варшавский А.А., Наумова Е.И., Тихонов И.А. Особенности функционирования целлюлолитических симбионтов в преджелудке и слепой кишке серых полёвок. Зоологический журнал, в печати.

Мещерский И.Г., Наумова Е. И., Костина Н. В., Варшавский А. А., Умаров М. М., Юрьева О. С. Влияние дефицита диетарного азота на переваримость целлюлозы и активность азотфиксирующей микрофлоры у восточноевропейских полёвок Microtus rossiaemeridionalis. Известия АН, в печати.

Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakazfa) stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 445 т тираж 100 экз. Подписано в печать 22.01.2004 г.

РНБ Русский фонд

2004-4 20307

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Варшавский, Александр Андреевич

Особенности внутренних цепей питания зеленоядных мышевидных грызунов.

Введение

Основные этапы исследования пищеварительной системы млекопитающих.

Часть

Особенности морфологии пищеварительной системы и симбионтного пищеварения у растительноядных грызунов.

Глава

Особенности кормовой базы и физиологии питания.

Растения как пища и связанные с этим адаптации ЖКТ.

Различные классификации растительноядных млекопитающих.'.

Стратегии пищеварения фитофагов и их связь с размерами тела.

Пищевая специализация грызунов как функция размеров тела.

Глава

Морфология пищеварительной системы мелких зеленоядных грызунов и её связь с симбионтной ферментацией.

Морфологические особенности желудка и кишечника.

Приспособления ЖКТ грызунов к симбионтной ферментации.

Глава

• Симбионтное пищеварение.

Целлюлолитические симбионты пищеварительного тракта животных.

Микробные целлюлазы.

Азотфиксирующие симбионты, обнаруженные у животных.

Микробная азотфиксация.

Взаимосвязь диазотрофных и целлюлолитических симбионтов в ЖКТ зеленоядных грызунов.

Часть

Материал и методика.

Глава

Объекты исследования и экспериментальные условия.

Выбор объектов исследования.

Сбор материала.

Условия эксперимента.

Глава

Методы исследования.

Вискозиметрическое измерение эндоглкжаназной активности (по Синицын и др., 1990; с изменениями).

Методика измерения нитрогеназной активности по восстановлению ацетилена (по Звягинцев, 1991; с изменениями).

Методика флуориметрического измерения целлюлазной активности.

Часть

Исследование диазотрофно-целлюлолитического комплекса мышевидных грызунов.

Глава эндоглюканазная активность в жкт серых полёвок.

Глава

Сравнение эндоглюканазной активности микросимбионтов у разных видов грызунов.

Глава

Азотфиксация в ЖКТ исследованных видов грызунов.

Глава

Влияние рациона на ферментативную активность симбионтов слепой кишки восточноевропейских полёвок.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности внутренних цепей питания зеленоядных мышевидных грызунов"

Основные этапы исследования пищеварительной системы млекопитающих

В истории исследований пищеварительной системы млекопитающих условно можно выделить три основных этапа. Первый этап, охвативший конец XIX - начало XX столетий, заключался в накоплении сравнительно-морфологических данных на макро- и микроскопическом уровнях. Именно тогда было выявлено большое структурное разнообразие пищеварительной системы растительноядных млекопитающих. Существенный вклад в развитие этих исследований был внесён анатомами немецкой школы (Toepfer, 1891; Oppel, 1896; Tullberg, 1899; Weber, 1927). Активно проводившиеся сравнительно-анатомические исследования выявили необычайное морфологическое разнообразие желудочно-кишечного тракта растительноядных млекопитающих по сравнению с плотоядными и всеядными. Среди этих работ следует выделить фундаментальную монографию «Система грызунов» Т. Тульберга (Tullberg, 1899), в которой рассмотрено строение органов пищеварения представителей крупных таксонов грызунов. Во многом благодаря именно этой монографии грызуны в тот период оказались лучше изученными в обсуждаемом аспекте, чем крупные млекопитающие (за исключением домашних животных).

Следующий этап, длившийся примерно до 60-х годов прошлого столетия, совпал с периодом бурного развития экологии, что радикально изменило направление морфологических исследований в сторону изучения адаптивных преобразований пищеварительной системы (Наумова и др., 1998). Это время авторы цитируемой статьи обозначают как этап эколого-морфологических исследований. Однако поиск прямых связей между экологией питания и морфологией пищеварительной системы не прояснил характера эволюционного взаимодействия пищевой специализации и морфологии пищеварительного тракта. Остались невыясненными и причины несравнимо большего морфологического разнообразия желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) млекопитающих-фитофагов по сравнению с плотоядными и всеядными. Главным итогом этого периода можно считать известную монографию Н. Н. Воронцова (1967), в которой изложена теоретическая основа эволюции пищеварительной системы, применимая не только к грызунам, на примере которых она была разработана, но и к млекопитающим в целом.

Третий этап, продолжающийся и в настоящее время, ознаменовался выходом исследований на новый качественный уровень — экспериментально-физиологический. Появилось множество экспериментальных работ, касающихся конкретных функций пищеварительной системы и её отдельных структур. В это время стала проясняться и роль симбионтов в пищеварении жвачных и сумчатых (например, Hungate, 1966, 1975; Hume, 1982). Однако на фоне активизации функциональных исследований в целом, значительно сузился круг изучаемых объектов. Основные исследования проводились преимущественно на домашних животных и лишь в редких случаях на отдельных видах диких млекопитающих. Отчасти это происходило в силу специфики экспериментальной работы, трудновыполнимой на диких животных, отчасти в силу хозяйственной важности исследуемых объектов. Так или иначе, большинство представителей мировой фауны млекопитающих, в частности грызунов, осталось в тени.

Такое распределение приоритетов в изучении обсуждаемого вопроса оказало влияние на специфику исследований ЖКТ млекопитающих, проводимых в нашей лаборатории - экологии, поведения и функциональной морфологии высших позвоночных ИПЭЭ РАН. Прежде всего, объектами работы избраны крайне слабо изученные дикие, главным образом мелкие, млекопитающие. В ходе ряда зарубежных экспедиций, организованных академиком В.Е. Соколовым, был собран стандартизированный экспериментальный материал, пригодный для проведения широкого спектра анализов. Был подобран комплекс методов для сбора и первичной обработки экспериментального материала в полевых условиях. Акцент был сделан на методах, использование которых могло позволить с функциональной точки зрения интерпретировать данные о структуре органов пищеварительного тракта на разных уровнях организации — от организменного до биохимического. Такой комплексный подход привёл к неожиданным результатам. Сравнительный анализ архитектоники поверхности слизистых оболочек разных отделов ЖКТ с использованием сканирующего электронного микроскопа выявил существенные межвидовые различия не только в микрорельефе выстилающей поверхности эпителиоцитов, но и в составе ассоциаций симбионтов, колонизирующих ороговевающий и железистый эпителий. Эти данные, проанализированные и обобщённые в монографиях и многих специальных публикациях (Соколов и др., 1979, 1989; Наумова, 1981, 1988, 1999; Жарова и др., 1996, 1997, 2002; Наумова, Нестерова, 1994; Наумова и др., 1998, 2000; и др.), определили новое направление в работе нашей лаборатории — изучение роли эндосимбиоза в эволюционном формировании пищевой специализации и морфологии пищеварительной системы растительноядных млекопитающих. Было введено понятие «внутренние цепи питания» — механизмы симбиотической трансформации труднопереваримого корма в легкоусвояемый в ЖКТ хозяина. Сами микросимбионты тоже перевариваются, являясь основным источником белка для многих млекопитающих-фитофагов. Например, в рубце жвачных скапливается до 7 кг бактериальной массы (Ку-рилов и др., 1968), ассимилирующейся в сычуге и тонком кишечнике.

Основной источник углерода для синтеза бактериального белка у растительноядных млекопитающих - целлюлоза и прочие растительные полисахариды. Однако для успешной трансформации растительных углеводов в полноценную белковую пищу необходимо достаточное количество диетар-ного азота, которым бедны вегетативные части растений. Выходом из этой ситуации является использование хотя бы в небольших количествах богатой белком пищи или же симбионтная азотфиксация. Последний аспект, как и симбиотическая утилизация волокнистых компонентов фитомассы у мелких грызунов, практически не изучен, что открывает перспективу для исследований вопроса на разных уровнях — от физиологического до экологического.

С практической точки зрения результаты исследования симбиоценозов мелких млекопитающих-фитофагов могут быть использованы для выделения наиболее активных микробных ассоциаций диазотрофно-целлюлолити-ческого комплекса в целях дальнейшего использования в биотехнологии кормопроизводства и переработки целлюлозосодержащих отходов (Павлов и др., 1999; Ушакова и др., 2001).

Заключение Диссертация по теме "Зоология", Варшавский, Александр Андреевич

Выводы

1) Диапазоны активностей ферментов диазотрофно-целлюлолитиче-ского комплекса у исследованных видов весьма схожи, что может служить аргументом в пользу функциональной универсальности комплекса у различных видов зеленоядных мышевидных грызунов.

2) Для серых полёвок характерна высокая толерантность эндоглюканазной активности к физиологическому состоянию хозяина, что косвенно подтверждает стабильность диазотрофно-целлюлолитического комплекса в целом.

3) Продемонстрировано влияние состава корма на активность диазотрофно-целлюлолитического комплекса восточноевропейских полёвок. Увеличение содержания соответствующего субстрата в корме вызывает увеличение ферментативной активности в 1.5-3 раза.

4) Судя по сравнительно высоким значениям ЭА в преджелудке, пред-желудочная ферментация у серых полёвок и песчанок играет важную роль, и эти виды можно отнести к смешанному типу ферментации.

5) Полученные данные по ЭА двух видов песчанок подтверждают гипотезу о функциональной билокулярности их желудка.

6) Исходя из полученных данных, основным локусом азотфиксации для всех исследованных видов является ободочная кишка (НГА в 1.5-2 раза выше, чем в других отделах ЖКТ), а основным локусом симби-онтной переработки полисахаридов — слепая кишка (ЭА в 4-6 раз выше, чем в преджелудке). Такая общность также может служить аргументом в пользу функциональной универсальности комплекса у различных видов зеленоядных мышевидных грызунов.

Заключение

Морфофункциональные исследования пищеварительной системы показали, что все виды грызунов способны усваивать животные корма. Другой вопрос заключается в том, насколько они необходимы каждому виду для поддержания жизнедеятельности. Значительное число видов грызунов может обходиться без обогащения животными кормами употребляемой ими растительной пищи, которая бедна многими незаменимыми биохимическими компонентами. Способность грызунов обходиться без животных кормов характеризуется степенью развития у них внутренних цепей питания — важнейшего функционального приспособления растительноядных млекопитающих, которое ставит их вне зависимости от концентрированных кормов, подверженных сезонным и годовым колебаниям (Наумова, 1981). Суть внутренних цепей питания состоит в использовании в качестве белковой пищи желудочных и кишечных микросимбионтов, растущих на специфическом растительном субстрате. Поставщиком этого субстрата является хозяин. В случае преджелудочной ферментации бактерии естественным для продвижения пищевых масс путём проходят в железистый желудок и затем в тонкий отдел кишечника, где и перевариваются. В случае кишечной ферментации симбиотические микроорганизмы попадают из слепой кишки в желудок и тонкий кишечник посредством цекотрофии. Ранее предложенная классификация некоторых мышевидных грызунов как относящихся к смешанному типу ферментации (Наумова, 1999) подтверждается результатами исследования активностей ферментов симбионтного происхождения в преджелудке и слепой кишке серых полёвок и двух видов песчанок. На рис. 27 показана предполагаемая схема продвижения пищевых компонентов по ЖКТ в случае смешанной ферментации.

Рис. 27. Возможные пути трансформации и усвоения пищи в ЖКТ грызунов, обладающих смешанным типом ферментации.

1 - белок бактерий-симбионтов преджелудка; 2 - продукты азотфиксации симбионтов ободочной кишки; 3 - вывод мягких фекалий; 4 - цекотрофия. Красно-бурым обозначены вещества, богатые азотом, зелёным - растительные углеводы, жёлтым -целлюлоза. Жёлто-зелёные стрелки обозначают обогащение химуса целлюлозой за счёт ассимиляции легкоусвояемого субстрата в желудке и в тонком кишечнике.

Продемонстрированная на примере диазотрофно-целлюлолитического комплекса серых полёвок сложность внутренних цепей питания, стабильность его работы практически независимо от внешних факторов свидетельствует о недооценке роли симбионтного пищеварения у мелких млекопитающих-фитофагов. Комплексный подход к исследованию переваримости растительной пищи грызунами позволил чётко разделить утилизацию собственно целлюлозы и полисахаридов, не обладающих упорядоченной структурой. Эти процессы осуществляются разными группами ферментов, хотя и объединёнными в единую макромолекулярную машину, но, судя по всему, способными действовать по отдельности друг от друга в зависимости от наличия специфического субстрата. Интересно отметить, что подобная же вариабельность достаточно давно была обнаружена и в эндогенных ферментных системах млекопитающих (Бартник, Чарновска-Мишталь, 1966; Шлыгин, 1966; Bolin et al., 1969). Изменение биосинтеза и интенсивности секреции отдельных ферментов наблюдалось в зависимости от количества соответствующих субстратов в пище и даже от введения компонентов, не являющихся субстратом для этих ферментов.

Хорошо известно, что микроорганизмы, в отличие от многоклеточных, обладая широким спектром метаболических путей, не используют их все одновременно. Они переключаются на тот или иной путь в зависимости от состояния популяции и наличия в доступе того или иного субстрата. Неизвестно пока, как именно реализуется этот процесс во внутренних цепях питания грызунов, на уровне переключения метаболических путей одного вида микробов, или же преимущественной активизации различных компонентов симбиоценоза в зависимости от условий, но такой modus vivendi симбионтов как нельзя лучше объясняет удивительную толерантность серых полёвок к смене кормов. Такая неприхотливость в выборе корма приводит и к экологической пластичности вида. Особенно это относится к восточноевропейским полёвкам (Соколов, Башенина и др., 1994), но в той или иной степени сказывается и на других травоядных грызунах.

Отсутствие надёжных количественных данных пока не позволяет с уверенностью говорить о значимости роли микробной азотфиксации в работе симбиоценозов и в жизнедеятельности мышевидных грызунов. Однако результаты исследований содержания азота атмосферного происхождения в тканях членистоногих (Tayasu et al., 1994; Tayasu, 1998) и жвачных (Лаптев, 1995) косвенно свидетельствуют в пользу этого предположения. Если дальнейшие исследования подтвердят его, симбиоз с диазотрофными микроорганизмами можно будет считать одной из наиболее совершенных пищевых адаптаций растительноядных млекопитающих.

Наконец, с практической точки зрения, микробные ассоциации, выделенные из пищеварительного тракта мышевидных грызунов, могут быть использованы для обогащения целлюлозосодержащих отходов производства и последующего применения их в биотехнологии и в сельском хозяйстве (Павлов и др., 1999; Ушакова и др., 2001).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Варшавский, Александр Андреевич, Москва

1. Абатуров Б. Д. Биопродуктивный процесс в наземных экосистемах.1. М.: Наука. 1979. 128 с.

2. Абатуров Б. Д., Лопатин В. Н. Связь уровня потребления пищи с размерами тела у растительноядных млекопитающих. // Журнал общ. биол. 1987. Т. 66. №6. С. 763-770.

3. Абатуров Б. Д., Хашаева М. Г. Усвоение зелёных растительных кормов грызунами разной пищевой специализации в зависимости от фазы вегетации кормовых растений. // Зоол. журнал. 1995. Т. 74. №4. С. 132-141.

4. Бартник Я., Чарновска-Мишталь Э. Влияние клетчатки в диете крыс на морфологию кишечника и способность переваривания в пищеварительном тракте. В кн.: Проблемы биохимической адаптации. М.: Медицина. 1966. С. 184-185.

5. Бигон М., Харпер Дж., Таунсенд К. Экология. Особи, популяции и сообщества: в 2-х т. М.: Мир. 1989. Т. 1. 667 с.

6. Воронцов Н. Н. Эволюция пищеварительной системы грызунов (мышеобразные). Новосибирск: Наука. 1967.240 с.

7. Воронцов Н. Н. Млекопитающие. Низшие хомякообразные (Cricetidae) мировой фауны. Ч. 1. Морфология и экология. Л.: Наука. 1982. Фауна СССР. Т. 3. Вып. 6. 452 с.

8. Гриценко И. Н. Микрофлора мелких млекопитающих Западной Сибири. Новосибирск: Наука. 1971. 263 с.

9. Доброхотов Б. П., Малыгин В. М. Применение электрофореза гемо-глобинов для идентификации серых полёвок группы Microtus arvalis (Rodentia, Cricetidae). // Зоол. журнал. 1982. Т. 61. №3. С. 436-439.

10. Жарова Г. К., Наумова Е. И., Нестерова Н. Г. Редукция клетчатко-вых волокон в пищеварительном тракте рыжей полёвки Clethrionomys glareolus. // ДАН. 1997. Т. 356. №2. С. 275-277.

11. Жарова Г. К., Наумова Е. И., Чистова Т. Ю. Динамика прохождения пищи по пищеварительному тракту рыжей полёвки. // ДАН. 1996. Т. 349. №5. с. 712-714.

12. Жарова Г. К., Наумова Е. И., Чистова Т. Ю., Нестерова Н. Г., Под-тяжкин О. И. Особенности прохождения пищи по пищеварительному тракту серых полёвок. // ДАН. 2002. Т. 382. №4. С. 560-562.

13. Звягинцев Д. Г. (ред.). Методы почвенной микробиологии и биохимии: учеб. пособие. М.: Изд-во МГУ. 1991. 304 с.

14. Киликовский В. В., Умаров М. М. Активность ванадийзависимой («альтернативной») нитрогеназы в некоторых типах почв. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 17, Почвоведение. 1993. №1. С. 62-64.

15. Курилов Н. В., Грызлова О. Н., Лищенок В. Ф. Роль микроорганизмов в питании жвачных: обзор литературы. М.: 1968. 114 с.

16. Лаптев Г. Ю. Нитрогеназная активность содержимого рубца жвачных животных. // 9-й Баховский коллоквиум по азотфиксации памяти чл.-корр. РАН В. Л. Кретовича. Тез. докл. ОНТИ ПНЦ РАН. Пущино. 1995. С. 91.

17. Наумова Е. И. Копрофагия у грызунов и зайцеобразных в свете микроскопического строения пищеварительного тракта. // Зоол. журнал. 1974. Т. 53. №12. С. 1848-1855.

18. Наумова Е. И. Пути специализации пищеварительной системы потребляющих клетчатку млекопитающих (Rodentia, Lagomorpha). // Журнал общ. биол. 1976. Т. 37. №2. С. 276-285.

19. Наумова Е. И. Функциональная морфология пищеварительной системы грызунов и зайцеобразных. М.: Наука. 1981. 262 с.

20. Наумова Е. И. Морфологические и функциональные ограничители трофических ниш у млекопитающих-фитофагов. М.: // Актуальные проблемы морфологии и экологии высших позвоночных. 1988. С. 181-213.

21. Наумова Е. И. Эволюционные пути освоения грызунами растительной кормовой базы. М.: Научный мир. // Экология в России на рубеже XXI века. 1999. С. 181-212.

22. Наумова Е. И., Жарова Г. К. Пищевая специализация и особенности желудочной секреции у млекопитающих. // ДАН СССР. 1984. Т. 275. №5. С. 1256-1260.

23. Наумова Е. И., Жарова Г. К., Нестерова Н. Г. Новые подходы к исследованию питания и пищеварительной системы растительноядных млекопитающих. // Зоол. журнал. 1998. т. 77. №1. С. 1-10.

24. Наумова Е. И., Нестерова Н. Г. О пищеварительных функциях преджелудка грызунов. // ДАН. 1994. Т. 336. №1. С. 135-137.

25. Наумова Е. И., Ушакова Н. А., Мещерский И. Г., Костина Н. В., Умаров М. М. Азотфиксация — новый феномен в питании грызунов. // Изв. АН. Сер. биол. 2000. №3. С. 341-343.

26. Нестерова Н. Г., Жарова Г. К., Наумова Е. И. Опыт оценки интенсивности расщепления клетчатки симбионтами в желудке и слепой кишке рыжей полёвки Clethrionomys glareolus. II ДАН. 1997. Т. 356. №2. С. 280-281.

27. Орлова Э. А. Микрофлора кишечника термитов. // Тр. энтомол. сектора проблем н.-и. лаб. по разработке методов борьбы с биол. по-врежд. материалов биол. факультета. Термиты. 1972а. Вып. 2. С. 167178.

28. Орлова Э. А. Целлюлозолитические ферменты в кишечнике термитов. // Тр. энтомол. сектора проблем н.-и. лаб. по разработке методов борьбы с биол. поврежд. материалов биол. факультета. Термиты. 1974. Вып. 5. С. 150-164.

29. Павлов Д. С., Наумова Е. И., Ушакова Н. А., Нестерова Н. Г., Жарова Г. К., Чернуха Б. А. Патент на изобретение РФ № 2153813. Способ приготовления корма для животных из растительного сырья. М.: 1999.

30. Пивняк И. Г., Тараканов Б. В. Микробиология пищеварения жвачных. М.: Колос. 1982. 248 с.

31. Проссер JI. Питание. М.: Мир. // Сравнительная физиология животных. 1977. Т. 1.С. 241-284.

32. Рабинович М. Л., Болобова А. В., Кондращенко В. И. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Кн. 1. древесина и разрушающие ее грибы. М.: Наука. 2001. 264 с.

33. Рабинович М. JL, Мельник М. С. Прогресс в изучении целлюлоли-тических ферментов и механизм биодеградации высокоупорядочен-ных форм целлюлозы. // Успехи биол. химии. 2000. Т. 40. С. 205-266.

34. Синицын А. П., Черноглазов В. М., Гусаков А. В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. М.: ВИНИТИ. // Итоги науки и техники, сер. «Биотехнология». 1990. Т. 25. 152 с.

35. Соколов В. Е., Башенина Н. В. (отв. ред.). Обыкновенная полёвка: Виды-двойники. М.: Наука. 1994.432 с.

36. Соколов В. Е., Бочарова-Месснер О. М., Евгеньева Т. П., Наумова Е. И. Адаптивные свойства эпителия и его производных: атлас микрофотографий. М.: Наука. 1979. С. 1-177.

37. Соколов В. Е., Наумова Е. И., Жарова Г. К. Пищевая специализация жвачных: роль эндосимбиоза в её формировании. // Изв. АН СССР. 1989. №2. С. 165-174.

38. Умаров М. М. Ассоциативная азотфиксация. М.: Изд-во МГУ. 1986. 135 с.

39. Умаров М. М. Современное состояние и перспективы развития микробной азотфиксации. М.: МАКС Пресс. // Перспективы развития почвенной биологии: Всерос. конф.: Москва, 22 фев. 2001: Труды. Отв. ред. Д. Г. Звягинцев. 2001. С. 47-56.

40. Ушакова Н. А., Наумова Е. И., Павлов Д. С., Чернуха Б. А. Патент на изобретение РФ № 2202224. Способ получения биологически активной кормовой добавки из растительного сырья. М.: 2001.

41. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир. 1987. 567 с.

42. Шлыгин Г. К. Приспособляемость железистого аппарата кишечника к роду пищи. В кн.: Проблемы биохимической адаптации. Л.: 1966. С. 165-173.

43. Шмидт-Ниельсен К. Физиология животных. Приспособление и среда. М.: Мир. 1982. Т. 1. 414 с.

44. Alexander R. McN. Optimization of gut structure and diet for higher vertebrate herbivores. // Phil. Trans. R. Soc. (B). 1991. V. 333. P. 249-255.

45. Alexander R. McN. The relative merits of foregut and hindgut fermentation. // J. Zool., Lond. 1993. V. 231. P. 391-401.

46. Bauchop Т., Martucci R. W. Ruminant-like digestion of the langur monkey. // Science. 1968. V. 161. P. 698-700.

47. Bayley H. S. Comparative physiology of the hindgut and its nutritional significance. //J. Anim. Sci. 1978. V. 46. №6. P. 1800-1802.

48. Beguin P., Alzari P. M. The cellulosome of Clostridium thermocellum. II Biochem. Soc. Trans. 1998. V. 26. №2. P. 178-85.

49. Behman H. Vergleihend- und fiinctionell-anatomische Untersuchungen am Caecum und Colon myomorpher Nagetiere. // Zeitschr. wiss. Zool. 1973. V. 186. H. 3/4. S. 173-294.

50. Bolin T. D., Pirola R. C., Davis A. E. Adaptation of intestinal lactase in the rat. // Gastroenterology. 1969. V. 57. №4. P. 406-409.

51. Brune A. Termite guts: the world's smallest bioreactors. // Tibtech J. 1998. V. 16. P. 16-21.

52. Demment M. W. The scaling of ruminoreticulum size with body weight in East African ungulates. // Afr. J. Ecol. 1982. V. 20. P. 43-47.

53. Dierenfeld E. S., Hintz H. F., Robertson J. В., Van Soest P. J., Oftedal О. T. Utilization of bamboo by the giant panda. // J. Nutr. 1982. V. 112. №4. P. 636-641.

54. Ehle F. R., Vainer R. J. Nutritional implications of the hamster fores-tomach. // J. Nutr. 1987. V. 108. №7. P. 1047-1053.

55. Foley W. J., Corck S. J. Use of fibrous diets by small herbivores: how far the rules be «bent»? //Trends Ecol. Evol. 1992. V. 7. №5. P. 159-162.

56. Foley W. J., Hume I. D. Digestion and metabolism of high-tannin Eucalyptus foliage by the brushtail possum (Trichosurus vulpecula) (Marsupi-alia: Phalangeridae). //J. Сотр. Physiol. 1987. V. 157B. P. 67-76.

57. Guerinot M. L., Patriquin D. G. N2-fixing vibrios isolated from the gastrointestinal tract of sea urchins. // Can. J. Microbiol. 1981. V. 27. №3. P. 311-317.

58. Hammond K. A., Wunder B. A. The role of diet quality and energy need in the nutritional ecology of a small herbivore, Microtus ochrogaster. II Physiological Zoology. 1991. V. 64. P. 541-567.

59. Hornicke H. Utilization of caecal digesta by caecotrophy (soft faeces ingestion) in the rabbit. // Livest. Prod. Sci. 1981. V. 8. P. 361-366.

60. Hume I. D. Digestive physiology and nutrition of marsupials. Cambridge, N. Y.: Cambr. Univ. Press. 1982.

61. Hume I. D. Optimal digestive strategies in mammalian herbivores. // Physiological Zoology. 1989. V. 62. №6. P. 1145-1163.

62. Hungate R. E. The rumen and its microbes. N. Y.: Acad. Press. 1966. 236 p.

63. Hungate R. E. The rumen microbial ecosystem. // Ann. Rev. Ecol. Syst. 1975. V. 6. P. 39-66.

64. Janis C. The evolutionary strategy of the Equidae and the origin of rumen and caecal digestion. // Evolution. 1976. V. 30. №4. P. 757-774.

65. Justice К. E., Smith F. A. A model of dietary fiber utilization by small mammalian herbivores, with empirical results for Neotoma. II The Amer. Naturalist. 1992. V. 139. №2. P. 398-416.

66. Keys J. E., Van Soest P. J. Digestibility of forages by the meadow vole (Microtus pennsylvcmicus). II J. Dairy Sci. 1970. V. 53. P. 1502-1508.

67. Kuhn H.-J. Zur Kenntnis von Bau und Funktion des Magens der Schlankaffen (Colobinae). II Folia Primatol. 1964. V. 2. P. 193-221.

68. Langer P. Der Verdauungstrakt bei pflanzenfressenden Saugetieren. Be-ziehung zwischen Nachrung und funktioneller Anatomie. // Biologie in unserer Zeit. 1986. V. 17. №1. S. 9-14.

69. Langer P. Evolutionary patterns of Perissodactyla and Artiodactyla (Mammalia) with different types of digestion. // Z. zool. Syst. Evolut.-forsch. 1987. V. 25. №3. S. 212-236.

70. Langer P. Evolution of the digestive tract in mammals. // Verh. Dtsch. Zool. Ges. 1991. V. 84. S. 169-193.

71. Lanyon A. M., Limpus C. J., Marsh H. Dugong and turtles: grasers in the seagrass system. Amsterdam etc.: // Biol, seagrasses: Treatise biol. sea-grasses spec. ref. Austral, reg. 1989. P. 610-634.

72. Myrcha A. Variations in the length and weight of the alimentary tract of Clethrionomys glareolus (Schreber, 1780). I I Acta theriol. 1964. V. 9. №914. P.139-148.

73. Myrcha A. Length and weight of the alimentary tract of Apodemus jlavi-collis (Melchior, 1834).//Actatheriol. 1965. V. 10.№10-17. P. 225-228.

74. Nagy J. G., Steinhoff H. W., Warel G. M. Effects of essential oils of sagebrush on deer rumen microbial function. // J. Wildl. Managem. 1964. V. 28. №4. P. 785-790.

75. Ohwaki K., Hungate R. E., Lotter L., Hoffmann R. R., Maloiy G. Stomach fermentation in East African colobus monkeys in their natural state. // Appl. Microbiol. 1974. V. 27. P. 713-723.

76. Oppel A. Lehrbuch der vergleichenden mikroskopischen Anatomie der Wirbeltiere. I T. Der Magen. Jena: G. Fischer. 1896. 543 s.

77. Orpin C. G. Studies on the rumen flagellate Sphaeromonas communis. // J. Gen. Microbiol. 1976. V. 94. №2. 270-280.

78. Orpin C. G. The occurrence of chitin in the cell walls of the rumen organisms Neocallimastix frontalis, Piromonas communis and Sphaeromonas communis. //J.Gen. Microbiol. 1977. V. 99. №1. 215-218.

79. Orpin C. G., Letcher A. J. Utilization of cellulose, starch, xylan and other hemicelluloses for growth by the rumen phycomycete Neocallimastix frontalis. II Curr. Microbiol. 1979. V. 3. P. 121-124.

80. Parra R. Comparison of foregut and hindgut fermentation in herbivores. Washington D. C.: Smithsonian Inst. Press. // Ecology of aboreal folivores. 1978. P. 205-229.

81. Penry D. L., Jumars D. A. Chemical reactor analysis and optimal digestion. // Bioscience. 1986. V. 36. P. 310-315.

82. Rabinovich M. L., Melnik M. S., Bolobova A. V. Microbial cellulases (Review). //Appl. Biochem. and Microbiol. 2002. V. 38. №4. P. 305-321.

83. Robbins С. Т., Mole S., Hagerman A. E., Hanley T. A. Role of tannins in defending plants against ruminants: reduction in dry matter digestion? // Ecology. 1987. V. 68. P. 1606-1615.

84. Schroder W., Kofler H. Coexistence and competitive exclusion between ibex Capra ibex L. and chamois Rupicapra rupicapra L. II Acta zool. fenn. 1985. V. 172. P. 87-88.

85. Short J. Diet and feeding behavior of the forest elephant. // Mammalia. 1981. V. 45. №2. P. 177-185.

86. Smith A. P. Diet and feeding strategies of the marsupial sugar glider in temperate Australia. //J. Anim. Ecol. 1982. V. 51. P. 149-166.

87. Sperber I., Bjornhag G., Ridderstrale Y. Function of proximal colon in lemming and rat. // Swed. J. Agric. Res. 1983. V. 13. P. 243-256.

88. Stevens С. E., Hume I. D. Contributions of microbes in vertebrate gastrointestinal tract to production and conservation of nutrients. // Physiol. Rev. 1998. V. 78. №2. P. 393-427.

89. Tayasu I. Use of carbon and nitrogen isotope ratios in termite research. // Ecol. Res. 1998. V. 13. P. 377-381.

90. Tayasu I., Sugimoto A., Wada E., Abe T. Xylophagous termites depending on atmospheric nitrogen. // Naturwissenschaften. 1994. V. 81. P. 229231.

91. Toepfer K. Die Morphologie des Magens der Rodentia. // Morph. Jahrb. 1891. V. 17. S. 380-407.

92. Tullberg T. Ueber das System der Nagetiere: eine phylogenetische Studie. Uppsala: Act. Reg. Soc. Sci. 1899. 514 s.

93. Van Soest P. J. Nutritional ecology of the ruminant. Corvallis, Oregon: О. & B. Books. 1982. 373 p.

94. Wang R.-F., Cao W.-W., Cerniglia С. E. PCR detection and quantitation of predominant anaerobic bacteria in human and animal fecal samples. // Appl. Envir. Microbiol. 1996. V. 62. №4. P. 1242-1247.

95. Weber M. Die Saugetiere. I. Anatomischer Teil. Jena: G. Fischer. 1927. 365 p.

96. Weiner J., Gorecki A., Zielinski J. The effect of rodents on the rate of matter and energy cycling in ecosystem of arid steppe of Central Eastern Mongolia. // Pol. Ecol. Stud. 1982. V. 8. №1-2. P. 69-86.

97. Список работ, опубликованных по теме диссертации

98. Варшавский А.А. Адаптации растительноядных млекопитающих: симбиоз с азотфиксирующими бактериями. Проблемы эволюционной и экологической морфологии. Школа-семинар (Москва, 15-16 мая 2001 г.), программа и материалы. М.: Биоинформсервис. 2001. С. 8588.

99. Варшавский А.А., Пузаченко А. Ю., Наумова Е. И., Костина Н. В. Ферментативная активность микрофлоры пищеварительного тракта обыкновенного слепыша Spalax microphtalmus (Spalacidea, Rodentia). ДАН. 2003. Т. 392. №4. С. 564-567.

100. Варшавский А.А., Наумова Е.И., Тихонов И.А. Особенности функционирования целлюлолитических симбионтов в преджелудке и слепой кишке серых полёвок. Зоологический журнал, в печати.

101. Выполнение этой диссертационной работы было бы невозможно без помощи ряда людей, которых автор искренне хотел бы поблагодарить.