Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности углеродного метаболизма и способы его контроля у гороха Pisum sativum при симбиозе с клубеньковыми бактериями
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Особенности углеродного метаболизма и способы его контроля у гороха Pisum sativum при симбиозе с клубеньковыми бактериями"
ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ
На правах рукописи
ДОЛГИХ ?Го ОД
Елена Анатольевна 1 § Д^Ц
ОСОБЕННОСТИ УГЛЕРОДНОГО МЕТАБОЛИЗМА И СПОСОБЫ ЕГО КОНТРОЛЯ У ГОРОХА PISUM SATIVUM ПРИ СИМБИОЗЕ С КЛУБЕНЬКОВЫМИ
БАКТЕРИЯМИ
АВТОРЕФЕРАТ Диссертации аа соискание ученой степени кандидата биологических наук
Специальность 03.00.07 - микробиология. 03.00.12 - физиология растений
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2000
Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии
Научные руководители доктор биологических наук, профессор ИА.Тихонович
кандидат биологических наук АА-Филатов
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Т-АГавриленко кандидат биологических наук О.П.Онищук
Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский государственный университет
^^ Защита диссертации состоится декабря 2000 г. в
// часов на заседании Диссертационного совета К 020.26.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, 3.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского института сельскохозяйственной микробиологии.
Автореферат разослан «_»_2000 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета,
канд. биол. наук А-Н.3арецкая
/7 М/./З-Лг./М
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность работы. Важным следствием адаптации бобовых растений и клубеньковых бактерий к взаимному влиянию при внутриклеточном симбиозе является глубокая интеграция обменных процессов, предполагающая значительное изменение метаболизма клубеньков. Это обуславливает интерес к азотфиксирующей симбиотической системе как к интересной модели для изучения фундаментальных проблем внутриклеточного симбиоза.
В основе эффективности симбиотической азотфиксации лежит обеспеченность симбионтов энергией и субстратами для ассимиляции азота (Lawn and Brun, 1974; Verma et.al., 1978; Gordon et al., 1985). Таким образом, при формировании эффективных азотфиксирующих клубеньков может иметь место значительная перестройка процессов углеродного (С) метаболизма. Именно в ходе реакций углеродного обмена образуются энергетические эквиваленты и предшественники для биосинтетических процессов. В связи с этим закономерен интерес к изучению процессов углеродного обмена при симбиозе.
В клубеньках бобовых растений процессы С-обмена осуществляются в условиях, близких к анаэробным (Witty et.al., 1986). На основании этого предложена гипотеза о сходстве метаболизма клубеньков бобовых и корней растений при кислородном дефиците (De Vries et.al., 1980). Приспособленность у устойчивых к гипо- и аноксии растений может определяться качественными изменениями процессов дыхания, усилением продукции дикарбоновых кислот, отсутствием накопления в токсических концентрациях продуктов анаэробного обмена и других изменениях (McMommon, Crawford, 1971; Chirkova, 1978). Однако представления об особенностях анаэробного и аэробного катаболизма поли- и моносахаров, механизмах утилизации продуктов анаэробного обмена в клубеньках бобовых еще далеки от понимания и требуют дальнейшего изучения. Тем более что данные процессы могут значительно отличаться от характеристик других органов растения, что делает их изучение еще более актуальным.
Адаптация клеточного метаболизма к изменяющимся условиям среды может происходить двумя путями: регулированием скорости синтеза ферментов и их каталитической активности (Кретович, 1986; Plaxton, 1990). Вместе с тем представления о молекулярных механизмах, регулирующих биосинтез и активности ферментов при симбиозе, очень ограничены. Особенно на уровне экспрессии генов, кодирующих соответствующие ферменты.
Возможные механизмы регуляции были нами изучены на примере одного из ферментов углеродного метаболизма в клубеньках - фосфоенолпируваткарбоксилазы (КФ 4.1.1.31), участвующего в заключительных реакциях катаболизма углеводов до дикарбоновых
кислот. Среди наиболее известных функций фермента в этих органах - обеспечение предшественниками (оксалоацетатом, 2-кетоглутаратом) процесса ассимиляции аммония и участие в синтезе дикарбоновых кислот, используемых в метаболизме бактероидов для обеспечения энергией процесса азотфиксации. Таким образом, регуляция активноеги этого фермента может играть критическую роль при формировании эффективного симбиоза. Это демонстрирует актуальность изучения регуляции ФЕПК при симбиозе и определяет цели и задачи нашего исследования.
Цели и задачи исследования. Целью работы являлось изучение изменений С-метаболизма в клубеньках, направленных на создание условий для эффективной азотфиксации, и регуляторных механизмов, обеспечивающих эти изменения.
В связи с этим в задачи нашей работы входило:
- изучить активности ферментов, участвующих в мобилизации основного резервного вещества (полисахарида крахмала) в клубеньках гороха по сравнению с корнями;
- изучить изменения катаболизма моносахаров в клубеньках гороха, направленные на обеспечение энергией и С-субстратами процесса азотфиксации;
- выяснить роль различных анаэробных процессов на конечных этапах углеводного метаболизма в клубеньках;
- установить наблюдается ли изменение изоферментного спектра ФЕПК при клубенькообразовании и связано ли оно с увеличением активности ФЕПК;
- сопоставить данные об изменении удельной активности, содержания ферментного белка и мРНК ФЕПК в процессе развития эффективных клубеньков гороха с целью изучить возможные механизмы регуляции активности этого фермента;
- установить с какими стадиями развития клубенька связана экспрессия гена ФЕПК (методом in situ гибридизации);
- сравнить влияние мутаций, блокирующих развитие симбиоза на разных стадиях, на уровень экспрессии ФЕПК (используя различные модели неэффективного симбиоза);
- оценить уровни активностей ферментов некоторых других метаболических путей в неэффективных клубеньках и сделать вывод о возможности их координированной с ФЕПК регуляции при симбиозе.
Научная новизна работы. Показано, что у растительного партнера изменения путей углеродного метаболизма выражаются в трансформации процессов дыхания - усилении катаболизма поли- и моносахаров в гликолитическом пути. Выяснено, что из-за ограничения доступности конечного акцептора электронов Ог в дыхательной цепи митохондрий процессы реокисления НАДН преимущественно связаны с активацией ферментной системы ФЕПК/МДГ и образованием дикарбоновых кислот, а в меньшей степени - со спиртовым брожением.
Показано, что мобилизация крахмала играет существенную роль в С-обмене, поскольку получены новые экспериментальные данные о снижении содержания крахмала и об увеличении активности амилолитических процессов в клубеньках гороха на той стадии, когда высокой является скорость азотфиксации.
Изучены механизмы регуляции важного фермента С-обмена -ФЕГ1К. Сравнительный анализ содержания белка Nst-ФЕПК и соответствующей мРНК в эффективных и неэффективных клубеньках гороха показал возможность транскрипционного и посттрансляционного контроля активности ФЕПК. Выявление а/к мотива, участвующего в фосфорилировании фермента у всех изученных ФЕП-карбоксилаз, подтвердило возможность посттрансляционной ковалентной модификации белка в результате фосфорилирования.
Анализ результатов in situ гибридизации показал, что дифференциальная экспрессия гена, кодирующего ФЕПК, в клубеньках гороха зависит от стадии развития и связана с определенными тканями клубенька. Следовательно, выявление локализации мРНК ФЕПК в клубеньках, имеющих морфологические аномалии, - удобный маркер для различных стадий гистогенеза клубенька.
Впервые использование мутантов с блоком на ранних стадиях развития симбиоза позволило показать роль морфогенетических превращений (развития инфекционных нитей, процесса эндоцитоза, дифференцировки бактероидов) в редукции активности ФЕПК.
Теоретическое и практическое значение работы. Результаты исследований показали возможность использования конкретных физиологических показателей (активности ферментов С-обмена) для проведения селекции бобовых растений на повышение эффективности биологической азотфиксации. Знание механизмов, лежащих в основе регуляции экспрессии растительных генов и активности соответствующих ферментов в клубеньках, позволит контролировать обменные процессы. В перспективе получение симбиотических систем с заранее заданными свойствами позволит оптимизировать соотношение затрат С к фиксированному N и, тем самым, повысить продуктивность бобовых растений.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы .доложены на Всероссийском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, Россия, 1993), на I Европейской Конференции по азотфиксации (Сегед, Венгрия, 1994), на Баховском Коллоквиуме молодых ученых (Пущино, Россия, 1995), на X Международном Конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 1995), на VIII Международном Конгрессе по молекулярным взаимодействиям между растениями и бактериями (Кноксвилл, США, 1996) и на II Европейской Конференции по азотфиксации (Познань, Польша, 1996).
Публикации. Материалы диссертации представлены в шести публикациях.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, обобщения, выводов и списка цитируемой литературы (225 источников, в том числе 205 работ на иностранных языках).
Работа изложена на _ страницах машинописного текста,
иллюстрирована 16 рисунками и 4 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал и штаммы клубеньковых бактерий. В
работе использованы линии гороха Pisurn sativum L. из генетической коллекции института ВНИИСХМ: эффективная линия Спринт-2 (Kosterin, Rozov, 1993) и мутантная по фиксации азота линия CnpnHT-2Fix~ (Borisov et.al., 1992); эффективная линия SGE (Kosterin, Rozov, 1993) и мутантные линии SGEFix"-l, SGEFix"-2, полученные на одном исходном генотипе SGE (Tsyganov et.al., 1998). Все три сим-биотических мутанта являются неаллельными. Для инокуляции растений использовали производственный штамм Rhizobium leguminosa-rum cv viciae CIAM 1026.
Условия выращивания растений. Семена гороха стерилизовали в концентрированной серной кислоте (15 мин) и после отмывки проточной водой высевали в песок. Инокуляцию семян производили " водной суспензией бактерий при разведении 107-108 клеток на растение. Растения выращивали в условиях теплицы с освещенностью 15000-20000 лк при чередовании свет-темнота 16 и 8 ч соответственно. Дневная температура ~21°С, ночная ~15°С. Для всех экспериментов растения выращивали в сосудах со стерильным кварцевым песком на безазотном питательном растворе Прянишникова.
Измерение ферментативных активностей. Нитрогеназную активность растений измеряли ацетиленовым методом (Алисова, Чун-дерова, 1976). Измерение всех других ферментативных активностей проводили в термостатируемых кюветах объемом 1 мл на спектрофотометре LKB при определенных температурах. Концентрацию белка измеряли по методу Bradford (1967). Активность ФЕП-карбоксилазы (КФ 4.1.1.31) была измерена в сопряженной реакции с малатдегидрогеназой (Vance et al., 1983). Стандартная реакционная смесь содержала в 1 мл 100 мМ трис-HCl буфер (рН 8.0 при 30°С) -5 мМ MgCl2, 10 mM NaHC03, 2 шМ ФЕП, 0.16 тМ НАДН2, 5 единиц (5 U) кристаллической МДГ и 25 мкл экстракта. После инкубации в течение 5 минут при 30°С в кювету добавляли 25 мкл экстракта и реакцию "запускали" добавлением аликвоты ФЕП. Контрольная проба не содержала ФЕП. За ходом реакции следили по уменьшению
ri
оптической плотности при 340 нм не менее 2 минут.
Измерение активности фосфоглюкомутазы (КФ 2.7.5.1), фосфо-гексозизомеразы (КФ 5.3.1.9), фруктозобифосфатазы (КФ 3.1.3.11), гексокиназы (КФ 2.7.1.2) и фруктокиназы (КФ 2.7.1.4) проводили по методу Stowers и Elkan (1983).
Активность малик-энзима (НАДФ-зависимого, КФ 1.1.1.40) измеряли в реакции образования пирувата из малата, сопровождаемой восстановлением НАДФ (McKay et al.,1988); активность малатдегид-рогеназы (КФ 1.1.1.37) - по методу Waters с соавт. (1985); алкогольде-гидрогеназы (КФ 1.1.1.1) - по методу Tajima и LaRue (1982).
Измерение активности амилазы (а-амилазы, КФ 3.2.1.1 и ß-амилазы КФ 3.2.1.2) проводили в 50 мМ NaOAc (pH 4.8), 5 шМ СаС12 и в качестве субстрата реакции использовали 2.5 мг растворимого крахмала. Определение редуцирующих Сахаров проводили по методу Nelson (1944). Отдельно определяли количество образовавшейся глюкозы энзиматическим методом (в сопряженной реакции с 1U гексокиназы и 1U глюкозо-6-Ф-дегидрогеназы). Контрольные реакции проводили без субстрата (I) и без ферментативного экстракта (II). Активность крахмал-фосфорилазы (КФ 2.4.1.1) определяли по скорости синтеза крахмала (Ozbun et.al., 1973).
Определение содержания крахмала в растительных тканях. Определение крахмала осуществляли методом Pucher с соавт. (1948), который основан на извлечение крахмала хлорной кислотой и его осаждении в виде йодного комплекса для освобождения от сопутствующих углеводов. Для типичного опыта по определению крахмала использовали 300-500 мг клубеньков и 1-2 г корней. Крахмал-йодный комплекс обрабатывали спиртовым раствором 0,25 н NaOH, а выделившийся крахмал отделяли центрифугированием.
Гидролиз крахмала проводили в 0,7 н HCl на кипящей бане 2,5 часа. После гидролиза и охлаждения раствор нейтрализовали 0,7 н NaOH в присутствии индикатора - фенофталеина. В нейтральном растворе определяли содержание редуцирующих Сахаров.
Нативный электрофорез в ПААГ. Электрофорез проводили с использованием стандартной трис-глициновой системы (Ornstein, 1964; Davis, 1964). В гель (7.5%) добавляли 10% этиленгликоля для предотвращения инактивации фермента. Перед нанесением проб проводился преэлектрофорез в течение 30-40 минут. Активность ФЕПК выявляли после инкубации геля 20-30 минут при комнатной температуре в 100 мМ трис-НС1-буфере (pH 8.5), содержащем 5 мМ ФЕП, 10 мМ MgCl2 и 20 мМ NaHC03. Затем гель ополаскивали в воде и инкубировали в растворе Fast Violet В (2 мг/мл воды) в темноте около часа.
Вестерн-блот-анализ. Белковые образцы (40 мкг) разделяли электрофоретически в 10% ДСН-ПААГ по методу Laemmli (1970) и переносили на нитроцеллюлозу. Для инкубации использовали поли-
клональные антитела к клубенек-стимулируемой форме ФЕПК люцерны (предоставленные проф. Vance, Университет Миннесоты, США). Для визуализации полос преципитации применяли антитела козы против IgG кролика, конъюгированные с пероксидазой. Полосы выявляли после реакции с 4-хлор-1 -нафтолом. Белки-маркеры окрашивали Ponco R.
Нозерц-гибридизация. Суммарную РНК изолировали из корней, клубеньков и листьев гороха линии SGE с гуанидинтиоционатом и хлористым литием по методу, описанному Gregersori с соавт. (1993). РНК разделяли в 1.5% агарозном геле, содержащем формальдегид. На каждую дорожку наносили по 15-20 мкг РНК. О равномерности нанесения суммарной РНК судили по интенсивности свечения в УФ-свете полос рРНК, окрашенных бромистым этидием. Перенос на мембрану ZetaProbe (Bio-Rad Laboratories, США) осуществляли в 10Х SSC (IX SSC - 150 мМ NaCl, 15 mM цитрат Na) в течение ночи. Перенесенную РНК закрепляли на мембране прокаливанием в вакууме при 80°С в течение 2 часов. Мембраны инкубировали с соответствующими меченными 32Р-дЦТФ ДНК зондами: вставкой плаз-миды рФЕПКЗ/2 гороха (размером 3,6 т. п. о.) и вставкой плазмиды рААТЗ/9/2 гороха (1,7 т. п. о.) при 42°С в течение ночи при слабом перемешивании согласно методу, описанному ранее (Pathirana et. а]., 1992). Гибридизационный буфер содержал 50% формамид, 120 мМ Na2HP04 рН 7.2, 250 мМ NaCl, 7% ДСН, 1 мМ ЭДТА. После гибридизации мембраны отмывали в условиях высокой жесткости (2Х SSC, 0.1% ДСН - 10 минут при комнатной температуре и в 0.2Х SSC, 0.1% ДСН - 30 минут при температуре 65°С) и экспонировали с рентгеновской пленкой.
Выделение и анализ последовательностей кДНК. С этой целью осуществляли скрининг библиотеки кДНК клубеньков гороха, сконструированной в jiZAPII-BeKTope (Stratagene, США). Скрининг библиотеки проводили при 37°С в течение ночи в растворе следующего состава: 1% блокирующий реагент, 50% деионизованный формамид, 5 X SSC, 0,1% саркозил, 0,02% ДСН. В качестве зонда применяли фрагмент-вставку плазмиды рААТ37 люцерны (1,7 т.п.о.), (предоставленную профессором Vance, США). Был использован нерадиоактивный метод скрининга, так как для приготовления зонда использовали нуклеотиды, меченные дигоксигенином (Dig-набор для мечения, Boehringer Mannheim, Германия). Всего было проверено около 2х106 рекомбинантных колоний. После третичного скрининга был отобрана одна бляшка, давшая положительный сигнал. После изоляции очищенной бляшки, содержащей специфичную кДНК, вставка была вырезана из вектора, ее размеры были определены методом электрофореза.
Секвенирование ДНК. Определение последовательностей нук-леотидов 3' и 5'-областей выделенных из библиотеки фрагментов-
вставок кДНК проводили по методике, предлагаемой фирмой "Amerscham" для секвенирования по методу Sanger с соавт. (1977), при использовании Sequenase 2.0 (Amersham Pharmacie Biotec Inc., США). Электрофорез секвенированных фрагментов проводили, используя установку "BDH" по рекомендациям фирмы-производителя.
In situ гибридизация. Для приготовления sense и antisense 35S-меченных РНК зондов pBluescriptSK+/-, содержащий фрагмент ФЕПК гороха (1,7 т.п.о.), линеаризовали рестриктазами Xho I и Not I. В наших экспериментах рибопробы в sense-ориентации получали с помощью ТЗ-РНК-полимеразы (sense-рибопроба), а рибопробы в antisense-ориентации - с Т7-РНК-полимеразой (antisense-рибопроба). Для мечения проб был использован метод in vitro транскрипции. Все дальнейшие манипуляции по подготовке проб для гибридизации проводили по рекомендациям фирмы Stratagene (США). Гибридизацию осуществляли по методу Fleming (1993). Гибридизационный буфер, содержащий формамид, был приготовлен по протоколу фирмы Promega. 3-5 х 105 срт в 50 мкл гибридизационного раствора было добавлено на каждое стекло. Гибридизацию проводили в течение ночи при +42°С. Отмывку проводили по протоколу Fleming (1990). Стекла были экспонированы с фотоимульсией NBT2 (Eastman Kodak, США) от 2 до 4 недель, проявлены и окрашены с 0,05% Tolu-idine Blue О. После дегидратации срезы были заключены в смолу Permount (Fisher, США).
Глава 3- РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Особенности углеродного метаболизма в корневых клубеньках и корнях гороха
Микроаэробные условия в клубеньках бобовых растений могут влиять на характер углеродного обмена. Предположение, что низкая концентрация 02 должна ограничить аэробное дыхание и эффективность образования АТФ в митохондриях клубеньков подтверждается экспериментальными данными (Rawsthorne, LaRue, 1986; Day, Mannix, 1988). В связи с этим представляло значительный интерес изучить возможные пути катаболизма поли- и моносахаров в "клубеньках гороха. С этой целью проведено тестирование активностей пяти ферментов: фосфоглюкомутазы (КФ 5.4.2.2), фосфоглюкозизомеразы (КФ 5.3.1.9), фосфофруктокиназы (АТФ-зайисимой) (КФ 2.7.1.11), глюкокиназы (2.7.1.1) и фруктокиназы (КФ 2.7.1.2). В таблице 1 представлены результаты измерения удельных активностей ферментов в клубеньках, неинфицированных корнях гороха и бактероидах. Активности всех изученных ферментов были более высокими в клубеньках по сравнению с корнями. Мы показали, что активность фосфоглюкомутазы в клубеньках гороха, катализирующей превращение глюкозо-1-Ф в глюкозо-6-Ф, была приблизительно в 20 раз выше, чем в корнях (табл.1). Эти данные
соответствуют представлению о том, что расщепление дисахарида сахарозы посредством сахарозсинтазы является доминирующим в клубеньковом метаболизме. В пользу этого, на наш взгляд, также свидетельствует и более высокая активность фруктокиназы, которая участвует в АТФ-зависимом фосфорилировании фруктозы, по сравнению с глюкокиназой (табл.1).
Таблица 1. Сравнение удельных активностей ферментов, контролирующих синтез и распад углеводов в клубеньках и неинфицированных корнях гороха линии БСЕ на 28 день после инокуляции (нмоль/мин мг белка)_
Название фермента клубеньки Н/корни бактероиды
Содержание белка (мг/г сырого веса); 22 4,4 1,2
Фосфоглюкомутаза; 117 (п=4) 6 (п=4) 20 (п=3)
Фосфоглюкозизомераза; 1023 (п=9) 374 (п=3) 90 (п=3)
Гглюкокиназа; 33 (п=5) 19 (п=3) 25 (п=3)
Фруктокиназа; 98 (п=4) 56 (п=4) - (п=3)
Фосфофруктокиназа (АТФ-зависимая); 106 (п=4) 5 (п=4) - (п=3)
а, р-амилаза
по образованию редуцирующих Сахаров; 305 (п=3) 126 (п=3) -(п=3)
по образованию глюкозы; - (п=9) - (п=9) -(п=3)
Кр ахмалфосфор илаза; 6 (п=3) . - (п=3) -(п=3)
АДФ-глюкозопирофоефорилаза; 30 (п=4) - (п=4) -(п=3)
Фруктозобифосфатаза; 0-5 (п=4) - (п=4) -(п=3)
п - число независимых экспериментов, - активность не выявлена.
Потенциальным источником С субстратов и энергии в клубеньках может являться запасной полисахарид крахмал. С целью изучить возможную роль этого полисахарида мы сравнили уровни его содержания и активности ферментов синтеза и распада крахмала в клубеньках и корнях гороха (рис.1). Были изучены уровни активности следующих ферментов: а,р-амилазы (КФ 3.2.1.1, КФ 3.2.1.2), крахмал-фосфорилазы (КФ 2.4.1.1), АДФ-глюкозопиро-фосфорилазы (КФ 2.7.7.12) и: фруктозобифосфатазы (КФ 3.1.3.11) (табл.1). В распаде крахмала могут участвовать два фермента - а,Р~ амилаза и крахмал-фосфор илаза. Вместе с тем соотношение активностей а,р-амилазы и крахмал-фосфорилазы (-40/1) показывает, что распад крахмала в клубеньках гороха контролируется преимущественно а,р-амилазой (табл.1). Нам удалось выявить в клубеньках активность фермента АДФ-глюкозопиро-фосфорилазы, участвующего в синтезе крахмала, тогда как в неинфицированных корнях активность этого фермента практически отсутствовала. Полученные данные показывают, что в фиксирующих азот клубеньках гороха крахмал находится в состоянии активного метаболизма.
Результаты измерений содержания крахмала показали, что наиболее высоким оно было в клубеньках 13 ДПИ, а к 27 ДПИ -
-«« а
п
снижалось в несколько раз. В неинфицированных корнях содержание крахмала было ниже и мало менялось в процессе развития корней (рис.1). При сравнительном изучении а,(3-амилазы в клубеньках 13 ДПИ и 27 ДПИ более высокий уровень активности фермента наблюдали на 27 ДПИ (рис.1). В корнях гороха активность а,р-амилазы была меньше по сравнению с клубеньками. Таким образом, нами была выявлена обратная корреляция между содержанием крахмала и азотфиксирующей активностью клубеньков и установлено, что снижение содержания крахмала в клубеньках гороха определяется увеличением активности амилолитических ферментов.
150 п
5000 350 300
2000 150 -____ 100
1 6 11 16 21 26 Дни после инокуляции (ДПИ)
клубеньки
корни
Рис. 1. А) активность нитрогеназы (1) (мкмоль С2Н4/МИН) и содержание крахмала в клубеньках (2) и в неинокулированных корнях гороха линии БОЕ (3) (мг/г сырого веса); Б) активность а,(3-амилазы в клубеньках на 13 (16), 19 (26) и 27 (36) день после инокуляции и в 27-дневных неинокулированных корнях гороха линии БОЕ (нмоль/мин-мг белка)
Распад сахарозы и крахмала завершается образованием моносахаров. Значительное увеличение в клубеньках гороха активности ключевого фермента гликолиза фосфофруктокиназы (АТФ-зависимой) по сравнению с корнями показало, что распад моносахаров осуществляется преимущественно по этому пути. В бактероидах, напротив, нам не удалось выявить активности фосфофруктокиназы (АТФ-зависимой). Полученные данные показывают, что гликолиз играет важную роль в утилизации углеводов в цитоплазме растительных клеток, но неэффективен у бактероидов КЫгоЪшт Ыдиттозагит.
На заключительных этапах катаболизма углеводов в клубеньках из-за ограничения доступности конечного акцептора электронов 02 в дыхательной цепи митохондрий важную роль могут играть процессы, в которых происходит реокисление НАДН.
О
Eh
©
Рис. 2. Изоферменты ФЕПК в корнях, листьях и клубеньках гороха линии БОЕ 1-эффективные клубеньки гороха (инокуляция Rh.leguminosa.rum С1АМ 1026), 2 - неинокулированпые корни гороха, 3 - листья
Рис. 3. Вестерн-блот-анализ полипептида ФЕПК Выявление полипептида ФЕПК в: 1 — эффективных клубеньках гороха линии Спринт-2, 2 — неиноку лированных корнях гороха линии Спринт-2, 3 — эффективных клубеньках гороха линии БОЕ, 4 ~ неинокулированных корнях гороха линии БОЕ, 5 — бактероидах, выделенных из эффективных клубеньков гороха линии
Сходство(%)
5' (М A S I D A Q L Я)"
||| 20 5'-АТГАСПСААТТГАТГСАСАГСТТАГГС.ДАТТГГСАССТГСААААПТАГТ1АА1 ,\11А1АА 81
|2| (100%) 113 ----------------------------------------------------------- 172
|3| (94%) 129 ---г-»---------------------«-------тт----------------------- 188
|4| (95V.) 2150 -г-«-----------------------------тт---------------------------2209
|5| (85%) 143 -г-»—г--------т-------е—-тг-----тт--г—t-------г-------с- 202
Рис.4. Сравнительный анализ последовательности нуклеотидов 5'-обласги фрагмента-вставки кДНК (размером 3,6 т.п.н.) плазмиды рФЕПК-4, кодирующей ФЕПК клубеньков гороха I - кДНК ФЕПК гороха SGE (рФЕПК-4), 2- кДНК ФЕПК гороха Sparkle (pPsPEPCl), 3 -кДНК ФЕПК люцерны, 4 - ген ФЕПК люцерны, 5 - кДНК ФЕПК сои *а/к последовательность, по которой происходит фосфорилирование у известных форм ФЕП-карбоксилаз
u
1 2 3
1 2 3
Щш*
t
щ
щ „ з.бт.п.о. I
II
Рис. 5. Нозерн-блот-гибридизация суммарной РНК из различных тканей
гороха с 32Р-кДНК ФЕПК гороха Гибридизация с РНК из: 1 - листьев,
2 — эффективных клубеньков,
3 — неинокулированных корней
гороха линии БСЕ
1 3 5 Т 1 11 13 19 17 19 21 23 2В 2Г 29 Дни после инокуляции (ДПИ)
Рис.6. Динамика активности ФЕПК (1) и нитрогеназы (2) при развитии эффективных клубеньков гороха Представлены средние арифметические значения п-независимых экспериментов и стандартные ошибки среднего
юо кД -
13
15 19
27
Рис. 7. Динамика содержания полипептида ФЕПК в развивающихся эффективных клубеньках гороха линии БОЕ, собранных на 7, 9, 11, 13, 15, 19 и 27 сутки после инокуляции
12 3 4
3,6 т.п.о. _
Рис.8. Нозерн-гибридизация суммарной РНК из клубеньков гороха разного возраста с 32Р-кДНК ФЕПК гороха
Гибридизация с РНК из: 1 - клубеньков гороха 11 ДПИ,
2 - клубеньков 13ДПИ, 3 - клубеньков гороха 19ДПИ, 4 - клубеньков гороха 28 ДПИ
Рис.9. Локализация экспрессии ФЕПК гена в клубеньках гороха линии SGE 33 ДПИ методом in situ гибридизации Римскими цифрами обозначены зоны, клубенька согласно классификации Vasse (1990): ¡-меристема, II-зона инфицирования, П-Ш-интерзона, Ill-зона, в инфицированных клетках которой бактероиды, фиксируют азот, TV-зона старения
1-1
100 кД _
1
3
4
5
Рис. 10. Вестерн-блот-анализ полипептида ФЕПК в эффективных и неэффективных клубеньках гороха Выявление полипептида ФЕПК в экстрактах клубеньков: 1 - Спринт-2, 2 - Спринт-2Ргх-, 3 - БОЕ, 4 - БСЕПх--!, 5 ~ЗСЕПх--2
1 2 3 4 5
3,6 т.п.о. тф
7,5
- 4,4
- 2,4
- 1,4
С прян г-J Tlx-
■ С при fli-1
с
£ SGEFir-2
s
X
t5 SGEFiil
see
"""'"fa E Ml
Ради««к1няяость,р »пии'мт
Ji64 1
Рис. 11. Нозерн-блот-гибридизация суммарной РНК из разных эффективных и неэффективных клубеньков гороха с 32Р-кДНК ФЕПК гороха Гибридизация с РНК из клубеньков: 1 - Спринт-2, 2 - Спринт-2Пх~, 3 - ЯОЕ, 4 - 5 - .ТОЕГгх--^.
Рис. 12. Динамика активности ФЕПК при развитии эффективных (Fix+) и неэффективных (Fix") клубеньков гороха
1 2 3 4 5
1,6 т.п.о. - «•
Рис. 13. Нозерн-блот-гибридизация суммарной РНК из разных эффективных и неэффективных клубеньков гороха с 32Р-кДНК ААТ-2 гороха Гибридизация с РНК из клубеньков:
1 - Спринт-2, 2 - Спринт-2Пх~, 3 - ЯвЕ, 4 -8СЕПх'-2, 5 - 8СЕЬЧх'-1
• I ч
Для изучения механизмов реокисления НАДН, образуемого в ходе гликолиза, на следующем этапе работы мы предприняли измерение активностей следующих ферментов: алкогольдегидро-геназы (КФ 1.1.1.1), лактатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.27), ФЕП-карбоксилазы (КФ 4.1.1.27), малатдегидрогеназы (НАД-зависимой, КФ 1.1.1.37) и малик-энзима (КФ 1.1.1.40) (табл.2). Выявленное нами соотношение между активностями АДГ/ЛДГ (~Ю/1) дает основание предполагать, что в клетках клубеньков может активироваться спиртовое брожение, а не молочно-кислое. При сравнении активности АДГ в прямой и обратной реакциях более высокую активность фермента наблюдали в реакции этанол-ацетальдегид (табл.2). Сходные результаты были получены при изучении АДГ из клубеньков сои (Тангла, ЬаНие, 1982). Анализ этих данных дает основание утверждать, что в клубеньках бобовых может наблюдаться обращение конечных этапов спиртового брожения. Следовательно, спиртовое брожение в меньшей степени связано с процессами реокисления НАДН.
Таблица 2. Удельные активности ферментов анаэробного метаболизма в клубеньках и неинфицировакных корнях гороха линии ввЕ.
Соотношение
Название фермента клубеньки активностей
неинфицир. корни
(клуб./корни)
22
Общий белок (мг/г сыр.веса) Алкоголъдегидрогепаза: этанол—»ацетальдешд ацетальдегид—»этанол Пирувагпдекарбоксилаза Лактатдегидрогеиаза: лактат—>гшруват пиру ват—клактат ФЕП-карбоксила за Малатдегидрогеназа Малик-энзим (НАДФ-зависимый) п - число независимых экспериментов; "-" — активность не выявлена.
100 (п= 3) 64 (п=3) 26 (п=3)
- (п=3) 12 (п=4) 239 (п=4) 8240 (п=6) 19 (п=3)
4,4
73 (п=3) 64 (п= 3) 5 (п=3)
- (п=3) 23 (п=4) 15 (п=4) 6130 (п=5) 25 (п=3)
1,4/1 1/1 5/1
-/1/2 16/1 1,3/1 1/1,3
На следующем этапе работы были измерена активность ферментов ФЕПК и МДГ, участвующих в образовании дикарбоновых кислот. Установлено, что активность ФЕПК была в среднем в 10-15 раз выше, а МДГ - в 1.5-2 раза выше в клубеньках по сравнению с корнями (табл.2). Таким образом, реокисление НАДН в клубеньках преимущественно осуществляется в реакции превращения ФЕП-оксалоацетат-малат. Полученные данные свидетельствуют, что увеличение интенсивности гликолиза сопровождается процессами реокисления НАДН ферментной системой ФЕПК/МДГ и образованием дикарбоновых кислот. В меньшей степени процессы реокисления НАДН связаны с функционированием фермента АДГ и
спиртовым брожением. Таким образом, создание микроаэробных условий в клубеньках приводит к изменениям углеродного обмена у растительного партнера, выражающимся в увеличение интенсивности гликолиза, усиление продукции дикарбоновых кислот и обращение конечных реакций спиртового брожения, что препятствует накоплению в токсических концентрациях продуктов брожений. В конечном итоге, эти изменения лежат в основе успешной метаболической адаптации партнеров к взаимному существованию при внутриклеточном симбиозе. Механизм этот, по-видимому, универсален для растений, поскольку он активируется также в корнях устойчивых к кислородному дефициту растений (СЫгкоуа, 1978).
3.2. Регуляция активности ферментов углеродного обмена в клубеньках гороха на примере фосфоенолпируваткарбоксилазы
(ФЕПК)
Увеличение активности ФЕПК в клубеньках гороха было одним из наиболее значительных, что свидетельствует о важной. роли фермента в метаболизме клубеньков. В связи с этим представляло интерес выяснить: изменяется ли в клубеньках изоферментный спектр ФЕПК по сравнению с другими органами, как соотносится уровень удельной активности ФЕПК с содержанием белка фермента и соответствующей мРЕК, какие события в процессе развития азотфиксирующих (эффективных) клубеньков влияют на активность фермента. Анализ этих данных, на наш взгляд, позволил бы выяснить, как регулируется активность ФЕПК в клубеньках гороха.
Изоферментный состав и субъединичное строение ФЕПК в разных органах гороха. Анализ изоферментного спектра ФЕПК из разных органов гороха показал наличие двух изоформ фермента. Активность ФЕПК была связана с одной и той же формой фермента в клубеньках и корнях гороха линии БОЕ (ФЕПК I), тогда как в листьях присутствовала другая форма с меньшей подвижностью (ФЕПК II) (рис.2). Таким образом, изменение активности ФЕПК в клубеньках по сравнению с корнями не было связано с изменением изоферментного спектра. Однако увеличение интенсивности окраски полосы в геле в случае клубеньков свидетельствовало о повышенной активности ФЕПК в этих органах по сравнению с корнями - либо в результате увеличения количества фермента в клетке, либо в результате изменения его кинетических свойств.
Вестерн-гибридизация с использованием поликлональных антител к ФЕПК клубеньков люцерны показала, что ФЕПК из клубеньков и корней гороха иммунологически неотличима (рис.3). Расположение полосы ФЕПК гороха при денатурирующем электрофорезе соответствовало приблизительно 100 кДа, что совпадает с размерами полипептида этого фермента у других видов
бобовых (Miller et.al., 1987). Значительное увеличение синтеза ферментативного белка наблюдалось в клубеньках по сравнению с корнями, что являлось, по-видимому, причиной повышенной активности ФЕПК, наблюдаемой in vitro (рис.3). Различие в уровне синтеза фермента в клубеньках и корнях позволяет сделать вывод, что ФЕПК I является клубенек-стимулируемым ферментом (Nst-ФЕПК).
Сравнительный анализ содержания мРНК, кодирующей ФЕПК, в корнях, листьях и клубеньках гороха. Для того чтобы выяснить, как может регулироваться активность ФЕПК, на следующем этапе работы мы оценили содержание мРНК, кодирующей ФЕПК, в разных органах гороха. Для оценки содержания мРНК нами был использован метод Нозерн-гибридизации, а в качестве зонда - выделенный из библиотеки фрагмент кДНК.
Предварительно нами были определены последовательности яуклеотидов 5' и 3' областей выделенного фрагмента. Сравнительный анализ показал, что они имели 98-100% идентичности с аналогичными последовательностями мРНК, кодирующей ФЕПК клубеньков другого сорта гороха Sparkle, а также высокий процент идентичности (85-90%) с последовательностями мРНК и гена, кодирующими Nst-форму ФЕПК клубеньков люцерны (EMBL/Genebank) (рис.4). Анализ состава аминокислот, полученный на основе изучения кодирующей ФЕПК клубеньков. гороха кДНК, выявил наличие известной последовательности, которая участвует в фосфорилировании фермента у всех изученных ФЕП-карбоксилаз.
Результаты Нозерн-гибридизации показали, что в клубеньках наблюдается значительное увеличение экспрессии мРНК Nst-ФЕПК по сравнению с корнями, о чем судили по усилению интенсивности гибридизационного сигнала (рис.5). В листьях, которые были использованы нами в качестве негативного контроля, экспрессию клубеньковой мРНК ФЕПК не наблюдали.
Полученные данные позволили сделать вывод о том, что увеличение активности ФЕПК в клубеньках гороха прежде всего связано с увеличением транскрипционной активности гена, кодирующего Nst-ФЕПК. Отличия в уровне экспрессии ФЕПК в двух органах, испытывающих (клубеньки) и не испытывающих (корни) влияние бактерий, могут быть следствием отличий в активности промоторов в разных органах и (или) в доступности trans-факторов, регулирующих экспрессию этого гена. Однако это предположение требует дальнейшей проверки.
Вместе с тем выявление последовательности, участвующей в фосфорилировании фермента, дает основание полагать, что регуляция активности Nst-ФЕПК также возможна путем изменения каталитических свойств в результате ковалентной модификации (фосфорилирования). Так как на основании изучения фотосинтетических форм ФЕПК установлено, что фосфорилированная форма не
«J
обладает чувствительностью к ингибированию малатом и, вследствие этого, она обладает большей активностью (Nimmo, 1993).
Динамика активности, содержания белка фермента и соответствующей мРНК при развитии эффективных клубеньков гороха. С целью выяснить, какие события в процессе развития клубеньков влияют на увеличение активности ФЕПК в клубеньках, мы сравнили содержание белка фермента и мРНК, кодирующей ФЕПК, с функциональной активностью фермента в процессе развития эффективных (Fix+) клубеньков гороха.
Нам удалось показать, что на ранних этапах формирования эффективных клубеньков, уже до начала фиксаций азота, активность ФЕПК в них достоверно увеличивалась по сравнению с корнями (в 1,5-2 раза). Максимум активности фермента наблюдали в сроки развития клубеньков с наиболее высокой нитрогеназной активностью (рис.6). Вестерн-гибридизация показала, что увеличение содержания полипептида ФЕПК происходило практически прямо пропорционально активности фермента, измеренной in vitro, при развитии Fix+ клубеньков (рис.7).
Несмотря на небольшое увеличение активности и количества белка фермента в молодых клубеньках (10-11 ДПИ), содержание мРНК ФЕПК в них было уже достаточно высоким (рис.8). Мы полагаем, что "более ранний старт" экспрессии гена, кодирующего -Nst-ФЕПК, может "быть связан с необходимостью осуществления таких событий как накопление мРНК, трансляция и "доработка" готового продукта.
Сравнительный анализ динамики активности, содержания белка фермента и соответствующей мРНК в процессе развития эффективных клубеньков гороха показал, что их увеличение может быть связано с влиянием двух разных групп сигналов, одни из которых действуют при формировании клубеньков, другие - с началом азотфиксации. Следствием начальной индукции ФЕПК (несколько раньше собственно азотфиксации) может быть создание необходимых условий в клубеньках перед началом работы нитро-геназы: накопление достаточного пула С-содержащих соединений, к которым потом будет присоединяться аммоний, обеспечение энергией развивающихся бактероидов. При изучении других бобовых растений сои (Hata et.al., 1998) и люцерны (Pathirana étal., 1992) также была выявлена более ранняя по сравнению с нитро-геназой индукция экспрессии ФЕПК. Следовательно, эта закономерность может быть универсальной для всех бобовых растений.
Локализация экспрессии гена, кодирующего Nst-ФЕПК, на срезах клубеньков гороха методом in situ гибридизации. Для того чтобы выяснить, с какими ранними событиями при формировании клубеньков может быть связана индукция экспрессии ФЕПК, мы
• м
использовали метод in situ гибридизации. В недетерминированных клубеньках, которые образуются у гороха, клетки центральной части расположены по возрастному градиенту, поэтому в ней выделяют различные зоны, которые отличаются по стадии развития (Vasse et.al., 1990). Следовательно, локализация транскриптов ФЕПК на продольном срезе клубенька позволит связать экспрессию этого гена с определенной стадией развития симбиотических структур и бактероидов. В клубеньках 33 ДПИ экспрессия мРНК ФЕПК начинается в зоне II, а максимальная экспрессия транскриптов связана с интерзоной II-III и зоной III в клубеньках. Более низкий уровень экспрессии мРНК ФЕПК был выявлен в зоне старения IV (рис.9). Согласно данным Brito с соавт. (1995) нитрогеназа в клубеньках гороха экспрессируется в интерзоне II-III и зоне III. Максимальная экспрессия мРНК ФЕПК в этих же зонах показывает взаимосвязь между процессом образования органических кислот и азотфиксацией в эффективных клубеньках.
Вместе с тем, если транскрипты ФЕПК появляются перед районом, где активна нитрогеназа (зона II), то можно заключить, что экспрессия гена ФЕПК индуцируется у гороха раньше и независимо от азотфиксации. Известно, что в зоне II инфекционные нити проникают в цитоплазму растительных клеток, бактерии эндоцитируются из них и начинается их пролиферация (Vasse et.al., 1990). ). Следовательно, экспрессия, гена ФЕПК может.бы.ть связана с этими событиями. Для проверки такого предположения мы сравнили экспрессию мРНК ФЕПК в неэффективных клубеньках трех Fix" растительных мутантов CnpnHT-2Fix", SGEFix"-l и SGEFix"-2, у которых блокирование развития симбиоза наблюдалось при образовании инфекционных нитей, эндоцитозе бактерий в цитоплазму растительных клеток, дифференцировке бактерий в бактероиды (т.е. на стадии инфицирования и формирования клубеньков).
Анализ экспрессии гена, кодирующего Nst-ФЕПК, при неэффективном симбиозе. Сравнительный анализ показал разную степень редукции содержания белка фермента у различных типов Fix" клубеньков по сравнению с эффективными клубеньками родительских линий (рис.10). Минимальным содержание полипептида было в клубеньках линии SGEFix-2 по сравнению с двумя другими мутантами. Сходная закономерность была выявлена при сравнении содержания мРНК, кодирующей Nst-ФЕПК в тех же типах клубеньков. Минимальная экспрессия мРНК ФЕПК отмечена в корневых клубеньках мутанта SGEFix~-2 (в 8 раз меньше по сравнению с эффективными клубеньками линии SGE и в 2-3 раза меньше по сравнению с неэффективными клубеньками SGEFix'-l) (рис.11). Уровень содержания мРНК в клубеньках SGEFix"-2 был сравним с корнями. Эти данные позволили сделать вывод, что на
ранних этапах развития симбиоза регуляция синтеза фермента может осуществляться на транскрипционном уровне.
В то. же время результаты гибридизации показали, что в клубеньках SGEFix~-l и Спринт2Е1х~ сохраняется достаточно высоким уровень содержания мРНК и белка фермента по сравнению с корнями, а уровень активности фермента (табл.3), напротив, является таким же низким, как в корнях. Следовательно, на последующих стадиях развитая клубеньков регуляция активности ФЕПК может осуществляться на посттрансляционном уровне (быстрый протеолиз белка, ковалентная модификация). В пользу этого свидетельствует выявление аминокислотного мотива, участвующего в фосфорилировании фермента у всех изученных ФЕП-карбоксилаз, а также данные по изучению экспрессии ФЕПК в клубеньках мутанта люцерны Saranacinl, у которого мутация блокировала более поздние стадии развития клубеньков (Pathirana et.al., 1992).
Таблица 3. Удельные активности ФЕПК и содержание общего белка в эффективных и неэффективных клубеньках гороха
„ Общее содержание белка Активность ФЕПК
Линии гороха ,, \ / л/г / г \ ___ (мг/г сырого веса)_(нМоль/мин мг белка)
Спринт2 (клубеньки) 15,2±0,8 197±11
Спринт2БЧх_ (клубеньки) 5,5+0,2 7±1
Спринт2 (корни) 4,3+0,4 5+1
SGE (клубеньки) 11,1+0,9 172+13
SGEPix'-l (клубеньки) 5,4±0,2 17±3
SGEFix"-2 (клубеньки) ' 6,2+0,3 3+1
SGE (корни) 3,9±0,5 10+2
Различия в уровне экспрессии ФЕПК между разными неэффективными клубеньками, возможно, обусловлены особенностями их метаболизма. Переход к симбиотическому существованию может быть связан с изменением характера питания - переходом от использования преимущественно углеводов в качестве источника энергии к питанию органическими кислотами. Можно предположить, что более высокий уровень индукции ФЕПК в клубеньках мутантов SGEFix"-l и CnpHHT2Fix" может быть связан с тем, что после эндоцитоза в цитоплазму растительной клетки бактерии претерпевают некоторые этапы трансформации бактерий в бактероиды и, следовательно, у них увеличивается потребность в дикарбоновых кислотах.
В клубеньках гороха SGEFix~-2 мутация блокирует процесс эндоцитоза бактерий из инфекционных нитей в растительную цитоплазму (Tsyganov et.al., 1998). Наиболее низкий уровень экспрессии гена ФЕПК в клубеньках SGEFix"-2 (по сравнению с другими изученными мутантами) позволил предположить, что именно с эндоци-
тозом бактерий может быть связана индукция экспрессии гена, кодирующего Nst-ФЕПК. С этой целью более подробно нами была изучена экспрессия ФЕПК в клубеньках этого мутанта.
В клубеньках мутантов гороха SGEFix'-l и SGEFix~-2 были выявлены отличия в локализации экспрессии мРНК Nst-ФЕПК методом in situ гибридизации. Положение и морфология зон значительно изменена в клубеньках этих двух мутантов. В клубеньках SGEFix~-2 практически нет тканей, где присутствовали бы эндоцитированные бактерии. Нам не удалось выявить транскриптов ФЕПК в тканях этих неэффективных клубеньков. В клубеньках SGEFix"-l, напротив, присутствуют внутриклеточные бактерии и наблюдается некоторая дифференциация зон перпендикулярно основной оси корня. Диффузный характер гибридизационного сигнала в центральной части клубеньков этого типа, позволяет предположить, что экспрессия гена преимущественно связана с теми участками клубенька, в которых присутствуют эндоцитированные бактерии. Таким образом, несмотря на морфологические аномалии, выражающиеся в нарушении зональности в центральной части клубеньков, ген ФЕПК экспрессируется в тканях, в которых присутствуют внутриклеточные бактерии. Следовательно, локализация экспрессии гена ФЕПК является маркером определенной стадии гистогенеза клубеньков — эндоцитоза бактерий в цитоплазму растительной клетки. Это позволяет рассматривать экспрессию ФЕПК как удобный маркер для изучения гистогенеза неэффективных клубеньков.
Динамика активпости ФЕПК и витрогеназы при развитии эффективных и неэффективных клубеньков гороха. Вместе с тем сравнительный анализ динамики активности ФЕПК продемонстрировал некоторое небольшое увеличение удельной активности фермента на ранних стадиях развития неэффективных клубеньков линии SGEFix~-2 (13-15ДПИ) (рис.12). На основании этого мы полагаем, что активация морфогенетических программ и начальная индукция активности ФЕПК при симбиозе могут контролироваться общим, вероятно, бактериальным сигналом. Однако дальнейшие пути передачи сигналов отличаются, поскольку блокирование образования симбиотических структур клубенька не приводило к полному ингибированию активности ФЕПК.
Отсутствие увеличения активности ФЕПК на более поздних сроках после инокуляции в клубеньках SGEFix_-2, которое наблюдалось в Fix+ клубеньках, подтвердило, что дальнейшее увеличение активности фермента может наблюдаться только при азотфиксации и быть связанным с эффективностью клубеньков. С началом азотфиксации образующийся аммоний может являться индуктором активности ФЕПК (как в результате усиления экспрессии гена, так и в результате ковалентной модификации белка фермента). Для фотосинтетических форм ФЕПК показано, что
аммоний является индуктором экспрессии соответствующего гена и, вместе с тем, его появление может приводить к активации протеинкиназы, которая участвует в фосфорилировании фермента. Таким образом, с началом азотфиксации в клубеньках регуляция активности фермента может осуществляться и на транскрипционном и на посттрансляционном уровне.
Экспрессия мРНК некоторых других ферментов в эффективных и неэффективных клубеньках гороха- Для сравнения нами было оценено содержание мРНК некоторых других ферментов в эффективных (ЭбЕ, Спринт-2) и неэффективных клубеньках гороха (80ЕР1х"-1, з6еЕ1х"-2, Спринт-2Их'). Для оценки состояния И-метаболизма наиболее показательным мог быть фермент аспартатаминотрансфераза (ААТ). В связи с этим мы сравнили уровни экспрессии мРНК Ш1>формы фермента ААТ-2 в эффективных и неэффективных клубеньках разных линий гороха (рис.13).
Сравнительный анализ показал, что уровень редукции мРНК ААТ-2 был разным у всех неэффективных клубеньков. Минимальная экспрессия мРНК ААТ-2 также отмечена в корневых клубеньках мутанта ЗОЕПх"-2. Эти результаты позволяют заключить, что регуляция некоторых ключевых ферментов N и С-метаболизма может осуществляться под влиянием сходных сигналов.
ВЫВОДЫ
1. Проведено сравнительное исследование С-метаболизма в двух гетеротрофных органах растений, испытывающих (клубеньки) и не испытывающих (корни) влияние бактерий. Установлено, что особенностью обмена клубеньков является изменение процессов дыхания -увеличение активности гликолиза при катаболизме поли- и моносахаров. Усиление активности гликолиза сопровождается образованием значительных количеств дикарбоновых кислот (малата), а не накоплением в токсических концентрациях продуктов брожений (этанола), что обеспечивает успешное существование партнеров, при симбиозе.
2. Выяснено, что способность к образованию значительных количеств дикарбоновых кислот, определялась повышенным уровнем экспрессии гена, кодирующего клубенек-стимулируемую форму ФЕПК. Показано, что увеличение активности фермента связано с процессами морфогенеза клубеньков и началом азотфиксации. Выявлено, таким образом, влияние двух различных групп сигналов на активность ФЕПК.
3. При сравнительном изучении активности, содержания белка и мРНК №1>ФЕПК в клубеньках мутантов гороха установлено, что регуляция активности фермента осуществляется как на транскрипционном уровне, так и посттрансляционном уровне.
4. Анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих ФЕПК клубеньков гороха, выявил их гомологию с ранее идентифи-
цированными генами. При анализе аминокислотного состава выявлен участок, который у всех изученных ФЕПК участвует в фосфорили-ровании фермента, что подтверждает данные о возможности регуляции активности ФЕПК в результате ковалентной модификации (фосфорилирования).
5. Анализ результатов in situ гибридизации показал, что локализация экспрессии гена ФЕПК является маркером определенной стадии гистогенеза клубеньков _ эндоцитоза бактерий в цитоплазму растительной клетки.
6. На основании сравнительного изучения у неэффективных мутантов гороха экспрессии мРНК ААТ (фермента N метаболизма) установлено, что снижение интенсивности обменных процессов при нарушении морфогенеза клубеньков носят комплексный характер и затрагивают не только С, но и N метаболизм.
Публикации по теме диссертации
1. Fedorova М., Borisov A., Tsyganov V., Dolgikh Е., Filatov A., Tik-honovich I. 1994. Control of a nodule-enhanced aspartate aminotransferase expression in pea root nodules. Proceedings of the 1st European Nitrogen Fixation Conference, Szeged, Hungary Aug 28 - Sept 2, 1994, PP. 229-233.
2. M. Федорова, А. Борисов, В. Цыганов, К Долгих, А. Филатов, И. Тихонович. 1995. Генетический контроль клубенек-стимулируемой ас-партат аминотрансферазы-2 из симбиотических клубеньков гороха (Pisum sativum L.). 9-й Баховский Коллоквиум по Азотфиксации. Тезисы докладов. Москва 24-26 января 1995 года. Изд-во ОНТИ ПНЦ РАН, Пу-щино, 1995. стр. 46.
3. E.Dolgikh, М. Fedorova, A. Filatov, I. Tikhonovich. 1995. Biochemical characterization of plant-controlled ineffective nodules of pea (Pisum sativum L.). Abstracts of the 10th Int. Congress on Nitrogen Fixation, May 28-June3, 1995, St.-Petersburg, Russia, C. 585.
4. E. Dolgikh, M. Fedorova, A. Filatov and I. Tikhonovich. 1996. Expression of the key N-assimilating enzymes in the effective and ineffective root nodules of pea (Pisum sativum L.). Proceedings of 8th International Congress on Molecular plant-microbe interactions. Knoxville, Tennessee, USA. July 14-19, 1996.
5. E. Dolgikh, M. Fedorova, A. Filatov, I. Tikhonovich and C.P. Vance. Cellular expression of nodule-enhanced genes involved in nitrogen assimilation in the effective and plant-controlled ineffective root nodules of pea (Pisum sativum L.). Proceedings of 2nd European Nitrogen Fixation conference and NATO Advanced Research Workshop. Poznan, Poland, September 8-13, 1996.
6. E.A. Долгих, М.Ю. Федорова, A.A. Филатов, И.А. Тихонович. Фосфое-нолпируваткарбоксилаза корневых клубеньков гороха. Физиология растений. 1998. Т. 45, N 3. С. 401-412.
Научное издание. Отпечатано на дубликаторе
ООО "ИННОВАЦИОННЫЙ ЦЕНТР ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ- ВИЗР Лицензия ПЛД № 69-253
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Долгих, Елена Анатольевна
Введение
Глава 1. (Обзор литературы)
1.1. Интеграция растительного и бактериального метаболизма в азотфиксирующей системе бобовые растения - клубеньковые бактерии
1.1.1. Морфологические особенности клубеньков и своеобразие физиологических условий в них
1.1.2. Метаболическая адаптация клубеньковых бактерий и бобовых растений к симбиотическому существованию
1.1.2.1. Метаболизм и транспорт соединений азота в симбиотических клубеньках бобовых растений
1.1.2.2. Энергетический и углеводный обмен в клубеньках
1.2. Механизмы регуляции активностей ферментов в клубеньках бобовых растений
1.2.1. Фосфоенолпируваткарбоксилаза клубеньков бобовых растений: функции, структура белковой молекулы и организация генов, кодирующих фермент
1.2.2. Механизмы регуляции фермента ФЕПК
1.2.2.1. Регуляция каталитической активности ФЕПК клубеньков бобовых растений
1.2.2.2. Регуляция синтеза ФЕПК
1.2.3. Сравнительное изучение неэффективных и эффективных клубеньков - важный подход для выяснения механизмов регуляции активности ферментов в клубеньках
1.3.1. Влияние разных Fix" мутаций на уровень синтеза N- и Nstполипептидов в клубеньках
Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности углеродного метаболизма и способы его контроля у гороха Pisum sativum при симбиозе с клубеньковыми бактериями"
Среди растений широко распространена способность образовывать мутуалистические ассоциации с микроорганизмами, относящимися к различным таксономическим группам (бактериями, грибами, простейшими). В одних случаях микроорганизмы развиваются на поверхности растения, используя продукты его жизнедеятельности (эпифитная микрофлора). В других обитают в полостях растительного организма (межклеточная эктомикориза). Наконец, многие м/о проникают непосредственно в ткани и клетки хозяина, вступая во внутриклеточный симбиоз (азотфиксирующие бактерии сем. КЫгоЫасеае).
Большое внимание исследователей привлекает широко распространенный симбиоз бобовых растений с азотфиксирующими клубеньковыми бактериями. Во многих биоценозах (агроценозах) наличие связанного азота является лимитирующим фактором биологической продуктивности. Это определяет важное экономическое и экологическое значение азотфиксирующего симбиоза. Вместе с тем, изучение внутриклеточного симбиоза затрагивает важные фундаментальные проблемы биологии. В ходе последовательных взаимодействий между растениями и м/о реализуется способность партнеров влиять на процессы морфогенеза и дифференцировки клеток, характер питания и обмен веществ.
Важным следствием адаптации бобовых растений и клубеньковых бактерий к взаимному влиянию при внутриклеточном симбиозе является интеграция обменных процессов и их глубокая метаболическая зависимость друг от друга. Для обеспечения энергоемкого процесса азотфиксации бактероиды используют продукты фотосинтеза растения (углеводы), тогда как заключительные этапы ассимиляции аммония путем включения в аминокислоты осуществляется уже в цитозоле клетки хозяина. Таким образом, при формировании эффективных азотфиксирующих клубеньков может иметь место глубокая перестройка процессов С-метаболизма. Именно в ходе реакций углеродного обмена образуются энергетические эквиваленты и предшественники биосинтеза аминокислот. Особый интерес представляет изучение процессов С-обмена в клубеньках в связи с осуществлением всех реакций в условиях, близких к анаэробным. Однако представления об особенностях анаэробного и аэробного катаболизма, о механизмах утилизации продуктов анаэробного обмена, о метаболизме запасных 6 питательных веществ в условиях недостатка кислорода, а также об энергетическом балансе в клетках клубенька еще далеки от понимания и требуют дальнейшего изучения.
Характер обмена веществ в любом организме зависит от специфического набора ферментов и соотношения скоростей отдельных ферментативных процессов. При этом адаптация клеточного метаболизма к изменяющимся условиям среды может происходить двумя путями: регулированием скорости синтеза ферментов и их каталитической активности (Кретович, 1986; Р1ах1;оп, 1990).
Регуляция каталитической активности направлена в основном на быстрое удовлетворение метаболических потребностей клетки, поскольку обеспечивает адаптацию к кратковременным изменениям внешних условий. Длительное изменение условий существования организма может требовать принципиально другого характера обмена веществ. Такой способ регуляции может быть связан с изменением количества ферментов в клетке: как синтезом уже существующих форм, так и появлением новых форм (Р1ах1:оп, 1990). Возрастание количества молекул фермента, который ранее синтезировался на низком уровне, может обеспечить лучшее выполнение функции, а появление новых форм фермента может привести к появлению новых свойств клеток и лучшей приспособляемости организмов к изменяющимся условиям среды. Поэтому этот способ регуляции встречается при дифференцировке тканей или при значительных изменениях условий среды обитания.
Симбиотические клубеньки представляют собой структуры, образовавшиеся в процессе дифференцировки клеток и тканей, и имеют ряд специфичных физиологических особенностей (низкое содержание 02, щелочное значение рН и т.п.). Это позволяет предположить, что перестройка обмена веществ при клубенькообразовании сопровождается изменением состава ферментов в клетках. Сравнительный анализ состава растворимых белков в клубеньках и корнях многих бобовых, который выявил качественные и количественные различия, подтверждает такое предположение. Значительную часть белков, содержание которых изменяется в клубеньках, составляют ферменты. Синтезируемые только в клубеньках формы ферментов принято называть клубеньковоспецифичными (ЪГ-формы), а формы, 7 содержание которых значительно увеличивается - клубенек-стимулируемыми (Nst-формами) ферментов.
Однако представления о молекулярных механизмах, регулирующих биосинтез и активности ферментов при симбиозе еще далеки от понимания, хотя эта область исследований бурно развивается в последние годы (Gantt et.al., 1992; Reynolds et.al., 1992; Miller et.al., 1993; Vance et.al., 1994; Robinson et.al., 1996). Особенностью внутриклеточного симбиоза бобовых растений с клубеньковыми бактериями является вовлечение как межклеточных, так и внутриклеточных систем регуляции в контроль обменных процессов. Так на самых первых этапах взаимодействия партнеров (стадии прединфекции) осуществляется регуляция биологически активными веществами (БАВ). Бобовые растения выделяют вещества флаваноидной природы, обеспечивающие избирательное развитие клубеньковых бактерий в ризосфере корней растения, а у клубеньковых бактерий синтезируются липохитоолигосахаридные молекулы (Nod-факторы), которые способствуют проникновению бактерий в растение и развитию морфогенетических программ, определяющих появление опухолеподобных образований на корнях бобовых растений - клубеньков (Wong, 1970; Verma, 1992; Denarie et.al., 1996). После проникновения бактерий в растение взаимодействие партнеров также может осуществляться с помощью БАВ, регулирующих метаболическую активность клубеньков. Однако эти соединения пока не выявлены. С другой стороны в последние годы была предложена и активно разрабатывается модель, связывающая воздействие экзогенных БАВ и эндогенных факторов (фитогормонов), в регуляции морфогенетических и физиологических программ при симбиозе (Hirsch et.al., 1989; Schultze and Kondorosi, 1998). Влияние фитогормонов на транспорт метаболитов и на процессы обмена в растениях представляется весьма возможным. Например, широко известно влияние ауксина на транспорт фотоассимилятов у растений (Patrick, 1976).
При возникновении симбиоза между партнерами устанавливается тесная трофическая связь, обусловленная интенсивным обменом различными субстратами (трофическая система регуляции). Эксперименты с мечеными предшественниками наглядно показали, что скорость потока метаболитов в симбиотической системе клубеньковые бактерии - бобовое растение очень высока, что свидетельствует об 8 интенсивном обмене веществ у партнеров (Day and Copeland, 1991). Следовательно, поступающие в клетку метаболиты наряду с БАВ могут оказывать влияние на характер обменных процессов в клубеньках.
Таким образом, значительная перестройка обменных процессов в ходе формирования клубеньков и влияние на эти процессы специфичных веществ, выделяемых обоими партнерами по симбиозу, обуславливают интерес к азотфиксирующему симбиозу как к интересной модели для изучения общих вопросов регуляции экспрессии растительных генов и активности соответствующих ферментов.
В представленной работе в качестве модели была использована симбиотическая система горох Pisum sativum L. - азотфиксирующие бактерии Rhizobium leguminosarum. Целью работы являлось изучение изменений углеродного (С) метаболизма в клубеньках, направленных на создание условий для эффективной азотфиксации, и регуляторных механизмов, обеспечивающих эти изменения. Нарушения в последовательном развитии физиологических программ при симбиозе влияют на характер обменных процессов в клубеньках. В связи с этим, удобным для выяснения механизмов регуляции является использование генетически и морфологически охарактеризованных симбиотических (Fix") мутантов гороха, у которых нарушен процесс эффективной азотфиксации. Возможные механизмы регуляции были нами изучены на примере одного из ферментов С метаболизма в клубеньках - фосфоенолпируваткарбоксилазы (КФ 4.1.1.31), участвующего в заключительных реакциях распада углеводов до С4-органических кислот. 9
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Долгих, Елена Анатольевна
Выводы.
1.Проведено сравнительное исследование метаболизма С-соединений в двух гетеротрофных органах растений, испытывающих (клубеньки) и не испытывающих (корни) влияние бактерий. Установлено, что особенностью обмена клубеньков является изменение процессов дыхания - увеличение активности гликолиза при катаболизме поли- и моносахаров. Усиление активности гликолиза сопровождается образованием значительных количеств дикарбоновых кислот (малата), а не накоплением в токсических концентрациях продуктов брожений (этанола).
2. Выяснено, что способность к образованию значительных количеств дикарбоновых кислот определялась повышенным уровнем экспрессии гена, кодирующего клубенек-стимулируемую форму ФЕПК. Показано, что увеличение активности фермента связано с процессами морфогенеза клубеньков и началом азотфиксации. Выявлено, таким образом, влияние двух различных групп сигналов на активность ФЕПК.
3. При сравнительном изучении активности, содержания белка и мРНК Nst-ФЕПК в клубеньках мутантов гороха установлено, что регуляция активности фермента осуществляется как на транскрипционном, так и посттрансляционном уровне.
4. Анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих ФЕПК клубеньков гороха, выявил их гомологию с ранее идентифицированными генами. При анализе аминокислотного состава выявлен участок, который у всех изученных ФЕПК участвует в фосфорилировании фермента, что подтверждает данные о возможности регуляции активности ФЕПК в результате ковалентной модификации (фосфор илирования).
5. Анализ результатов in situ гибридизации показал, что локализация экспрессии гена ФЕПК является маркером определенной стадии гистогенеза клубеньков - эндоцитоза бактерий в цитоплазму растительной клетки.
Заключение.
В основе эффективности симбиотической азотфиксации лежит обеспеченность клубенька энергией и С-субстратами для ассимиляции азота, которая прежде всего определяется скоростью метаболических превращений С-соединений (С-метаболизма).
На первом этапе работы были обобщены имеющиеся в литературе данные и установлено, что важным следствием адаптации бобовых растений и клубеньковых бактерий к взаимному влиянию при симбиозе является интеграция обменных процессов и их глубокая метаболическая зависимость друг от друга. Мы предположили, что следствием этой адаптации будут значительные изменения путей С-метаболизма у партнеров при симбиозе. Основное внимание было уделено изучению путей катаболизма углеводов в клубеньках, поскольку эти вещества могут являться основными субстратами для дыхания и значительно доминируют в С-метаболизме этих нефотосинтезирующих органов.
Мы показали, что скорость утилизации углеводов в клубеньках значительно возрастает и, вместе с тем, наблюдаются значительные перестройки некоторых заключительных этапов метаболизма. В частности, в клубеньках сильно активируется ферментная система ФЕПК/МДГ, которая обеспечивает окисление восстановленных пиридиннуклеотидов и тем самым обеспечивает высокие скорости катаболизма углеводов.
Четкая скоординированность метаболических превращений в клубеньках предполагает строгую регуляцию этих процессов и в первую очередь активностей ключевых ферментов, контролирующих эти превращения. В качестве примера нами были изучены механизмы регуляции ФЕПК при симбиозе, поскольку увеличение активности этого фермента было одним из наиболее значительных и свидетельствовало о важной роли фермента в клубеньковом метаболизме. На основании изучения механизмов регуляции ФЕПК в клубеньках гороха мы пришли к выводу, что несмотря на специфические особенности метаболизма клубеньков эти механизмы могут быть универсальными. Эта универсальность выражается в увеличении экспрессии определенных N- и Nst-форм ферментов при симбиозе и регуляции каталитической активности ферментов посредством механизмов, общих для всех систем (ковалентная модификация и т.п.).
112
Однако индукция активностей ферментов специфична, поскольку связана с определенными событиями при формировании клубеньков, как показал сравнительный анализ эффективных и неэффективных клубеньков гороха. В связи с этим она строго дифференцирована по времени и наблюдается только в определенных тканях клубенька.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Долгих, Елена Анатольевна, Санкт-Петербург
1. Алисова С.М., Чундерова А.И. Использование ацетиленового метода для изучения активности симбиотической фиксации атмосферного азота // Бюлл. ВНИИ сельхозмикробиологии. 1976. Вып. 1. N 18. С. 29-32.
2. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по физиологии растений. М., 1976.
3. Кретович В. Л. Биохимия растений. М.: Высш. шк., 1986. 445 с.
4. Кретович В.Л. Усвоение и метаболизм азота у растений. М.: Наука, 1987. 485 с.
5. Кретович В.Л. Биохимия усвоения азота воздуха растениями. М.: Наука. 1994. 168с.
6. Курсанов А.Л. Транспорт ассимилятов в растении. М.: Наука, 1976. 646 с.
7. Матус В. К., Мелик-Саркисян С. С., Кретович В. Л. // Микробиология. 1973. Т. 42. С. 112-118.
8. Мишустин E.H., Шильникова В.К. Биологическая фиксация атмосферного азота. М.: Наука, 1968. 531 с.
9. Петрова А.Н., Черменская И.Е, Кретович В.Л. // Докл. АН СССР. 1974. Т. 217. С. 479-480.
10. И. Полевой В.В. Физиология растений.: Учебн. для биол. спец. вузов. М.: Высш. шк., 1989. 464с.
11. Прянишников Д.Н. Вегетационный метод и его роль в агрохимическом исследовании. 1963. Избр. соч. Т. 1. С. 702-720.
12. Романов В.В., Юшкова Л. А., Кретович В.Л. Синтез и распад поли-ß-оксимасляной кислоты у Rhizobium Lupini // Микробиология. 1975. Т. 44, N 5. С. 820-824.
13. Романов В. И., Иванов Б.Ф., Федулова Н.Г., Райхинштейн М.В., Черменская И.Е., Земленухин A.A., Кретович В.Л. Обмен глюкозы в изолированных бактероидах клубеньков люпина // Биохимия. 1980. Т. 45, N 12. С.2139-2145.
14. Федорова М.Ю., Борисов А.Ю., Цыганов В.Е., Розов С.М., Филатов А.А., Тихонович И.А. Генетический контроль клубенек-стимулируемой изоформы ААТ-2 у гороха (Pisum sativum L.) // Генетика. 1994. Т. 30. С. 1293-1297.
15. Чиркова Т.В., Настинова Г.Э., Семенова И.Н. Пути детоксикации продуктов анаэробного обмена в корнях растений, различающихся по устойчивости к кислородному дефициту//Физиол. и биохим. культ, растений. 1978. Т. 10, N5. С. 469-475.
16. Чиркова Т.В. Метаболические пути адаптации растений к анаэробиозу // Автореф. дисс.док. биол. наук СПб., 1985, 40 с.
17. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987. 567 с.
18. Andreo C.S., Gonzalez D.H., Iglesias A.A. Higher plant phosphoenolpyruvate carboxylase. Structure and regulation// FEBS Lett. 1987. V. 213. P. 1-8.
19. Anthon G. E., Emerich D.W. Developmental regulation of enzymes of sucrose and hexose metabolism in effective and ineffective soybean nodules// Plant Physiol. 1990. V. 92. P. 346-351.
20. Antoniw L.D., Sprent J.I. Primary metabolites of Phaseolus vulgaris nodules// Phytochemistry. 1978. V. 17. P. 675-678.
21. Antoun H., Bordeleau L.M., Sauvageau R. Utilization of the tricarboxylic acid cycle intermediates and symbiotic effectiveness in Rhizobium meliloti// Plant Soil. 1984. V. 77. P. 29-38.
22. Appleby C. A. Leghaemoglobins and Rhizobium respiration// Annu. R$v. Plant Physiol. 1984. V. 35. P. 443-477.
23. Appleby C.A. Electron transport systems of Rhizobium japonicum. 1. Haemoprotein P-450, other co-reactive pigments, cytochromes and oxidases in bacteroids from N2-fixing root nodules// Biochimica et Biophysica Acta. 1969. V. 172. P. 71-87.
24. Atkins C.A., Shelp B.J., Storer P.J., Pate J.S. Nitrogen nutrition and the development of biochemical functions associated with nitrogen fixation and ammonia assimilation of nodules on cowpea seedlings// Planta. 1984. V. 162. P. 327-333.116
25. Auger S., Verma D.P.S. Induction and expression of nodule-specific host genes in effective and ineffective root nodules of soybean//Biochemistry. 1981. V. 20. P. 1300-1306.
26. Banvaldi Z., Sakanyan V., Koncz C, Kiss A., Dusha I., Kondorosi A. Location of nodulation and nitrogen fixation genes on a high molecular weight plasmid of R. meliloti//Mol. Gen Genet. 1981. V. 184. P. 318-325.
27. Bergersen F. E., Turner G. L. Leghemoglobin and the supply of O2 to nitrogen fixing root nodule bacteroids: presence of two oxidase systems and ATP production at low free 02 concentrations// J. Gen. Microbiol. 1975. V. 91. P. 345-354.
28. Bergmann H., Preddie E., Verma D.P.S. Nodulin-35: A subunit of specific uricase (uricase II) induced and localized in uninfected cells of nodules// EMBO J. 1983. V. 2. P. 2333-2339.
29. Bisseling T., Moen A.A., Van den Bos R.C., van Kämmen A. The sequence and appearance of leghaemoglobin and nitrogenase components I and II in root nodules of Pisum sativum// J. of Gen. Microb. 1980. V. 118. P. 377-381.
30. Bisseling T., Been C., Klugkist J., vanKammen A., Nadler K. Nodule-specific host proteins in effective and ineffective root nodules of Pisum sativum// EMBO Journal. 1983. V. 2. P. 961-966.
31. Borisov A.Yu., Morzhina E.V., Kulikova O.A. New symbiotic mutants of pea (Pisum sativum L.) Affecting either nodule initiation or symbiosome development // Symbiosis. 1992. V. 14. P. 297-313.
32. Campos F., Padilla J., Vazquez M., Ortega J.L., Enriquez C., Sanchez F. Expression of nodule-specific genes in Phaseolus vulgaris L.// Plant Mol. Biol. 1987. V. 9. P. 521-532.
33. Carter K.R., Rawlings J., Orme-Johnson W.H., Becker R.R., Evans H.J. Purification and characterization of a ferredoxin from Rhizobium Japonicum bacteroids//J.Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 4213-4217.
34. Chen F.L., Cullimore J.V. Two isoenzymes of NADH-dependent glutamate synthase in root nodules of Phaseolus vulgaris L. Purification, properties and activity changes during nodule development// Plant Physiology. 1988. V. 88. P. 1411-1417.
35. Chirkova T.V. Some regulatory mechanisms of plant adaptation to temporal anaerobiosis. In: Plant life in anaerobic environments. Hook D., Crawford R. eds., UK. 1978. P. 137-155.
36. Chollet R., Vidal J., O'Leary M.H. Phosphoenolpyruvate carboxylase. A ubiquitous, highly regulated enzyme in plants// Annu. Rev. Plant Physiol. 1996. V. 47. P. 273-298.
37. Christensen A.H., Schubert K.R. Identification of a Rhizobium trifolii plasmid coding for nitrogen fixation and nodulation genes and its interaction with pJB5JI, a Rhizobium leguminosarum//J. Bacteriol. 1983. V. 156, N 2. P. 592-597.
38. Coker G.T., Schubert K.R. Carbon dioxide fixation in soybean roots and nodules. I. Characterization and comparison with N2 fixation and composition of xylem exudate during early nodule development // Plant Physiol. 1981. V. 67. P. 691696.
39. Cookson C., Hughes H., Coombs J. Effects of combined nitrogen on anapleurotic carbon assimilation and bleeding sap composition in Phaseolus vulgaris L.// Planta. 1980. V. 148. P. 338-345.
40. Copeland L., Vella J., Hong Z. Enzymes of carbohydrate metabolism in soybean nodules// Phytochemistry. 1989. V. 28, N. 1. P. 57-61.
41. Coruzzi G. Molecular approaches to the study of amino acid biosynthesis in plants// Plant Science. 1991. V. 74. P. 145-155.
42. Cretin C., Keryer E., Tagu D., Lepiniec L., Vidal J., Gadal P. Complete cDNA sequence of sorghum ' phosphoenolpyruvate carboxylase involved in C4 photosynthesis//Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 658.
43. Cretin C., Santi S., Keryer E., Lepiniec L., Tagu D., Vidal J., Gadal P. The phosphoenolpyruvate carboxylase gene family of Sorghum: Promoter structures, amino acid sequences and expression of genes// Gene. 1991. V. 99. P. 87-94.
44. Cullimore J.V., Lara M., Lea P J., Miflin B.J. Purification and properties of two forms of glutamine synthetase from the plant fraction of Phaseolus root nodules// Planta. 1983. V. 157. P. 245-253.
45. Davies D.D. Control of and by pH// Symp. Soc. Exptl. Biol. 1973. V. 27. P. 513-530.
46. Davies D.D. The central role of phosphoenolpyruvate in plant metabolism// Annu. Rev. Plant Physiol. 1979. V. 30. P. 131-158.
47. Davis B.J. Disc electrophoresis. I. Background and theory // Ann. NY Acad. Sci. 1964. V. 121. P. 321-349.
48. Day D.A., Copeland L. Carbon metabolism and compartmentation in nitrogen-fixing legume nodules// Plant Physiol. Biochem. 1991. V. 29, N 2. P. 185-201.
49. Day D.A., Mannix M. Malate oxidation by soybean nodule mitochondria and the possible consequences for nitrogen fixation// Plant Physiology and Biochemistry. 1988. V. 26. P. 567-573.
50. De Vries G.E., In't Veld P., Kijne J.W. Production of organic acids in Pisum sativum root nodules as a result of oxygen stress// Plant Science Letters. 1980. V. 20. P. 115-123.
51. Denarie J., Debelle F., Prome J.-C. Rhizobium lipo-chitooligosaccharide nodulation factors: Signaling molecules mediating recognition and morphogenesis//Annu. Rev. Biochem. 1996. V. 65. P. 503-535.
52. Dennis D.T., Emes MJ. Regulation by compartmentation. In:Plant Physiology, Biochemistry and Molecular Biology. Dennis D.T., Turpin D.H. eds., 1990. P. 45-57.
53. Deroche M.-E., Carrayol E., Jolivet E. Phosphoenolpyruvate carboxylase in legume nodules//Physiologie Vegetale. 1983. V. 21. P. 1075-1081.
54. Deroche M-E., Carrayol E. Nodule phosphoenolpyruvate carboxylase: a review // Physiol. Plant. 1988. V. 74. P. 775-782.
55. Deroche M.-E., Carrayol E. Some properties of legume nodule phosphoenolpyruvate carboxylase// Plant Physiology and Biochemistry. 1989. V. 27. P. 379-386.
56. Dickstein R, Bisseling T., Reinhold V.N., Ausubel F.M. Expression of nodule-specific genes in alfalfa root nodules blocked at an early stage of development// Genes and Development. 1988. V. 2. P. 677-687.
57. Ditta G., Virts E., Palomares A., Kim C.-H. 1987. The nifA gene of Rhizobium melilotti is oxygen regulated// J. Bacterid. 1987. V. 169. P. 3217-3223.
58. Dudley M.E., Jacobs T.W., Long S.R. Microscopic studies of cell divisions induced in alfalfa roots by Rhizobium meliloti// Planta. 1987.
59. Dunn S.D., Klucas R.V. Studies on possible routes of ammonium assimilation in soybean root nodule bacteroids// Canadian Journal of Microbiology. 1973. Y. 19. P. 1493-1499.
60. Engvild K.J. Nodulation and nitrogen fixation mutants of pea (Pisum sativum)// Theor. Appl. Genet. 1987. V. 74. P. 711-713.
61. Finan T.M., Hirsch A.M., Leigh J.A., Johansen E., Kuldau G.A., Deegen S., Walker G.C., Signer E.R. Symbiotic mutants of Rhizobium meliloti that uncouple plant from bacteria differentiation// Cell. 1985. V. 40. P. 869-877.
62. Finan T.M., Oresnik I., Bottacin A. Mutants of Rhizobium meliloti defective in succinate metabolism// Ibid. 1988. V. 170, N 8. P. 3396-3403.
63. Fleming A.J., Mandel T., Roth I., Kuhlemeier C. The patterns of gene expression in tomato apical meristem// The Plant Cell. 1993. V. 5. P. 297-309.
64. Forrest S.I., Verma D.P.S., Dhindsa R.S. Starch content and activities of starch-metabolizing enzymes in effective and ineffective root nodules of soybean// Can. J. Bot. 1991. V. 69. P. 697-701.
65. Fujihara S., Yamaguchi M. Asparagine formation in soybean nodules// Plant Physiology. 1980. V. 66. P. 139-141.
66. Fujita N., Miwa T., Ishijima S. The primary structure of phosphoenolpyruvate carboxylase of Escherichia coli. Nucleotide sequence of the ppc gene and deduced aminoacid sequence// J. Biochem. 1984. V. 95. P. 909-916.
67. Fuller F., Verma D.P.S. Appearance and accumulation of nodulin mRNAs and their relationship to the effectiveness of root nodules//Plant Mol. Biol. 1984. V. 3. P. 21-28.
68. Glenn A.R., Poole P.S., Hudman J.F. Succinate uptake by free-living and bacteroid forms of Rhizobium leguminosarum//J. Gen. Microbiol. 1980. V. 119. P. 267-271.
69. Glenn A.R., Dilworth M.J. The uptake and hydrolysis of disaccharides by fastand slow-growing species of Rhizobium// Archives of Microbiology. 1981. V. 129. P. 233-239.
70. Glenn A. R., McKay I.A., Arwas R., Dilworth M.J. Sugar metabolism and the symbiotic properties of carbohydrate mutants of Rhizobium leguminosarum// Journal of General Microbiology. 1984. V. 130. P. 239-245.
71. Gloudemans T., De Vries S.C., Bussink H.-J., Malik N.S.A., Franssen H.J., Louwerse J., Bisseling T. Nodulin gene expression during soybean (Glycine max) nodule development// Plant Mol. Biol. 1987. V. 8. P. 395-403.
72. Goodchild D.J., Bergersen F.J. Electron microscopy of the infection and subsequent development of soybean nodule cells// Journal of Bacteriology. 1966. V. 92. P. 204-213.
73. Gordon A.J., Ryle G.J.A., Mitchell D.F., Powell C.E. The flux of 14C-labeled photosynthate through soybean root nodules during N2 fixation// Journal of Experimental Botany. 1985. V. 36. P. 756-769.
74. Gordon A.J., James C.L. Enzymes of carbohydrate and amino acid metabolism in developing and mature nodules of white clover//J. of Exp. Botany. 1997. V. 48. P. 895-903.
75. Govers F., Gloudemans T., Moeran M., Van Kämmen A., Bisseling T. Expression of plant genes during the development of pea root nodules// EMBO J. 1985. V. 4. P. 861-867.
76. Gregerson R.G., Miller S.S., Twary S.N., Gantt G.S., Vance C.P. Molecular characterization of NADH-dependent glutamate synthase from alfalfa nodules// The Plant Cell. 1993. V. 5. P. 215-226.
77. Hague D.R., Sims T.L. Evidence for light-stimulated synthesis of phosphoenolpyruvate carboxylase in maize leaves//Plant Physiol. 1980. V. 66. P. 505509.
78. Hardy R.W.F., Holsten R.D., Jackson E.K., Burns R.C. The acetylene reduction assay for N2 fixation: laboratory and field evaluation // Plant Physiol. 1968. V. 43. P. 1185-1207.
79. Haser A., Robinson D.L., Due G., Vance C.P. A mutation in Vicia faba results in ineffective nodules with impaired bacteroid differentiation and reduced synthesis of late nodulins//J. ofExperim. Botany. 1992. V. 43. P. 1397-1407.
80. Hata S., Izui K, Kouchi H. Expression of a soybean nodule-enhanced phosphoenolpyruvate carboxylase gene that shows striking similarity to another gene for a house-keeping isoform// The Plant J. 1998. V. 13, N 2. P. 267-273.
81. Heim U., Weber H., Bumlein H., Wobus U. A sucrose-synthase gene of Vicia faba L. Expression pattern in developing seeds in relation to starch synthesis and metabolic regulation//Planta. 1993. V. 191. P. 394-401.
82. Henson C.A., Duke S.H., Koukkari W.L. Rhythmic oscillations in starch concentrations and activities of amylolytic enzymes and invertase in Medicago sativa nodules// Plant Cell Physiology. 1986. V. 27. P. 233-242.
83. Hermans J., Westhoff P. Analysis of expression and evolutionary relationships of phosphoenolpyruvate carboxylase genes in Flaveria trinervia (C4) and F. pringlei (C3)// Mol. Gen. Genet. 1990. V. 224. P. 459-468.
84. Hirel B., Bouet C., King B., Layzell D., Jacobs F., Verma D.P.S. Glutamine synthetase genes are regulated by ammonia provided externally or by symbiotic nitrogen fixation// EMBO Journal. 1987. V. 6. P. 1167-1171.
85. Hirsch A.M., Bang M., Ausubel F.M. Ultrastructural analysis of ineffective alfalfa nodules formed by nif::Tn5 mutants of Rhizobium meliloti// Journal of Bacteriology. 1983. V. 155, N 1. P. 367-380.
86. Hirsch A.M., Smith C.A. Effects of Rhizobium meliloti nif and fix mutants on alfalfa root nodule development// Journal of Bacteriology. 1987. V. 169, N 3. P. 11371146.
87. Hirsch A.M., Bhuvaneswari T.V., Torrey J.G., Bisseling T. Early nodulin genes are induced in alfalfa root outgroths elicited by auxin transport inhibitors// Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 1989. V. 86, N 4. P. 1244-1248.
88. Hong Z.Q., Copeland L. Pentose phosphate pathway enzymes in nitrogen-fixing leguminous root nodules// Phytochemistry. 1990. V. 29. P. 2437-2440.
89. Htun H., Dahlberg J.E. Single strands, triple strands and kinks in H-DNA// Science. 1988. V. 241. P. 1791-1796.
90. Huber S.C., Huber J.L., McMichael R.W.Jr. Control of plant enzyme activity by reversible protein phosphorylation // Int. Rev. Cytol. 1994. V. 149. P. 47-98.
91. Huber T.A., Streeter J.G. Purification and properties of asparagine synthetase from soybean root nodules// Plant Science. 1985. V. 42. P. 9-17.
92. Hudspeth R.L., Grula J.W. Structure and expression of the maise gene encoding the phosphoenolpyruvate carboxylase isozyme involved in C4 photosynthesis. // Plant Mol. Biol. 1989. V. 12. P. 579-589.
93. Hunt S., King B.J., Layzell D.B. Effects of gradual increase in 02 concenrtation on nodule activity in soybeans// Plant Physiol. 1989. V. 91. P. 315-321.
94. Iguchi-Ariga S.M.M., Schaffner W. CpG methylation of the cAMP-responsive enhancer/promotor sequence TGACGTCA abolishes a specific factor binding as well as transcriptional activation// Genes Dev. 1989. V. 3. P. 612-619.
95. Iismaa S., Watson J.M. A gene upstream the Rhizobium trifolii nifA gene encodes a ferredoxin-like protein//Nucleic. Acids Res. 1987. V. 15, N 7. P. 3180-3186.
96. Israel D.W., Jackson W.A. Ion bbalance, uptake, and transport processes in N2-fixing and nitrate- and urea-dependent soybean plants // Plant Physiol. 1982. V. 69. P. 171-178.
97. Izui K., Kawamura T., Okumura S., Toh H. Molecular evolution of phosphoenolpyruvate carboxylase for C4 photosynthesis in maize. In: Murata N. (ed). Research in Photosynthesis, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. 1992. V. III. P. 827-830.
98. Jiao J.-A., Podesta F.E., Chollet R., O'Leary M.H., Andreo C.S. Isolation and sequence of an active-site peptide from maize leaf phosphoenolpyruvate carboxylase inactivated by pyridoxal 5'-phosphate// Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1041. P. 291-295.
99. Jiao J-A., Chollet R. Posttranslational regulation of phosphoenolpyruvate carboxylase in C4 and Crassulacean acid metabolism plants // Plant Physiol. 1991. V. 95. P. 981-985.
100. Jones R., Wilkins M.B., Coggins J.R., Fewson C.A., Malcolm A.D. Phosphoenolpyruvate carboxylase from the Crassulacean plant Bryophyllum fedch.//Biochem. J. 1978. V. 175. P. 391-406.
101. Kahn D., Batut J., Boistard P., Daveran M.L., David O. et.al.Molecular analyses of a fix cluster from Rhizobium meliloti. In: Molec. Genetics of plant-microbe interactions. Verma D.P.S., BrissonN. eds., USA. 1987. P. 258-263.
102. Kano-Murakami Y., Matsuoka Gene expression of PEP carboxylase gene. In: Murata N. (ed). Research in Photosynthesis, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. 1992. V. III. P. 843-846.
103. Keister D., Jones B., Kondorosi A. Characteristics of glutamine synthetase I and II mutants of Rhizobium// J. Gen. Appl. Microbiol. 1987. V. 33, N 2. P. 267-273.
104. King B.J., Layzell D.B., Canvin D.T. The role of dark carbon dioxide fixation in root nodules of soybean // Plant Physiol. 1986. V. 81, P. 200-205.
105. Klein Lankhorst K., Katinakis P., Van Kämmen P., Van den Bos R.C. Identification and characterization of a bacteroid specific dehydrogenase complex in Rhizobium leguminosarum PRE//Appl. Envir. Microb. 1988. V. 54. P.3008.
106. Klugkist J., Haaker H., Veeger C. Studies on the mechanism of electron transport to nitrogenase in Azotobacter vinelandii// Eur. J. Biochem. 1986. V. 155. P. 41.
107. Kneen B.E., LaRue T.A., Hirsch A.M., Smith C.A., Weeden N.F. syml3 A gene conditioning ineffective nodulation in Pisum sativum//Plant Physiol. 1990. V. 94. P. 899-905.
108. Kosterin O.E., Rozov S.M. Mapping of the new mutation bib and the problem of integrity of linkage group I // Pisum Genetics. 1993. V. 25. P. 27-31.
109. Kouchi H., Fukai K., Katagiri H., Minamisawa K., Tajima S. Isolation and enzymological characterization of infected and uninfected cell protoplasts from root nodules of Glycine max// Physiologia plantarum. 1988. V. 73. P. 327-334.
110. Kouchi H., Nakaji K., Yoneyama T., Ishizuka J. Dynamics of carbon photosynthetically assimilated in nodulated soybean plants under steady-state conditions// Annals of Botany. 1985. V. 56. P. 333-346.
111. Kouchi H., Yoneyama T. Metabolism of 13C-labelled photosynthate in plant cytosol and bacteroids of root nodules of Glycine max// Physiologia Plantarum. 1986. V. 68. P. 238-244.
112. Kretovich W. L., Romanov V.l., Yushkova L.A., Shramko V.l., Fedulova N.G. Nitrogen fixation and poly-ß-hydroxybutyric acid content in bacteroids of Rhizobium lupini and Rhizobium leguminosarum// Plant Soil. 1977. V. 48. P. 291-302.
113. Krol A.J.M., Hontelez J.G., Van Kämmen A. Only one of the large plasmids in Rhizobium leguminosarum strain PRE is strongly expressed in the endosymbiotic state//J.Gen.Microbiol. 1982. V. 128. P. 1839-1947.
114. Kruger N.J. Carbohydrate synthesis and degradation. In:Plant Physiology, Biochemistry and Molecular Biology. Dennis D.T., Turpin D.H. eds., 1990. P. 59-75.
115. La Rue T.A., Peterson J. B., Tajima S. Carbon metabolism in legume nodules. In: Advances in nitrogen fixation research, C. Veeger and W.E. Newton eds., Dordrecht: Niihoff, 1984. P. 437-444.125
116. Laane C., Krone W., Konings W.N., Haaker H., Veeger C. The involvement of the membrane potential in nitrogen fixation by bacteroids of Rhizobium leguminosarum//FEBS Lett. 1979. V. 103. P. 53-57.
117. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.
118. Lang-Unnasch N., Ausubel F.M. Nodule-specific polypeptides from effective alfalfa root nodules and from ineffective nodules lacking nitrogenase// Plant Physiol. 1985. V. 77, N4. P. 833-839.
119. Last R.L., Fink G.R. Tryptophan requiring mutants of the plant Arabidopsis thaliana//Science. 1988. V. 240. P. 305-310.
120. Latzko E., Kelly GJ. The many-faceted function of phosphoenolpyruvate carboxylase in C3 plants// Physiol. Yeg. 1983. V. 21. P. 805-813.
121. Lawn R.J., Bran W.A. Symbiotic nitrogen fixation in soybeans. 1. Effect of photosynthetic source sink manipulations// Crop. Sci. 1974. V. 14. P. 11-16.
122. Lawrie A.C., Wheeler C.T. Nitrogen fixation in the root nodules of Vicia faba L. in relation to the assimilation of carbon. II. The dark fixation of carbon dioxide// New Phytologist. 1975. V. 74. P. 437-445.
123. Layzell D. Oxygen and regulation of N2 fixation in legume nodules// Physiol. Plant. 1990. V. 80. P. 322-327.
124. Legocki R.P., Verma D.P.S. Identification of «nodule-specific» plant proteins (nodulins) involved in the development of Rhizobium-legume symbiosis// Cell. 1980. V. 20. P. 153-163.
125. Leigh J.A., Signer E.R., Walker G.C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82, N 18. P. 6231-6235.
126. Lepiniec L., Keryer E., Philippe H., Gadal P., Cretin C. Sorghum phosphoenolpyruvate carboxylase involved in C4 photosynthesis// Plant Mol. Biol. 1993. V. 19. P. 339-342.126
127. Lepiniec L., Santi S., Keryer E., Amiet V., Vidal J., Gadal P., Cretin C. Complete nucleotide sequence of one member of the sorghum phosphoenolpyruvate carboxylase//Plant Mol. Biol. 1991. V. 17. P. 1077-1079.
128. Lepiniec L., Vidal C.P., Chollet R., Gadal P., Cretin C. Phosphoenolpyruvate carboxylase: structure, regulation and evolution// Plant Science. 1994. V. 99. P. 111124.
129. Lohda M.L., Johari R.P., Sharma N.D., Mehta H.L. Nitrogen fixation in relation to dark CO2 fixation in developing nodules of Arachis hypogaea L.// Ind. J. Exp. Biol. 1983. V. 21. P. 629-632.
130. Lu G., Ferl R.J. Site-specific oligodeoxynucleotide binding to maize Adhl gene promoter represses Adhl-GUS gene expression in vivo// Plant Mol. Biol. 1992. V. 19. P. 715-723.
131. Lugwig R. Physiological roles of glutamine synthetases I and II in ammonium assimilation in Rhizobium sp. 32HI// Ibid. 1980. V. 141, N 3. P. 1209-1216.
132. Macdonald F.D., ap Rees T. Enzymic properties of amyloplasts from suspension cultures of soybean//Biochim. Biophys. Acta. 1983. V. 755. P. 81-89.
133. Marczewski W. Kinetic properties of phosphoenolpyruvate carboxylase from lupin nodules and roots // Physiol. Plant. 1989. V. 76. P. 539-543.
134. Matsuoka M., Hata S. Comparative studies of phosphoenolpyruvate carboxylase from C3 and C4 plants// Plant Physiol. 1987. V. 85. P. 947-951.
135. Matsuoka M., Minami E. Complete structure of the gene for phosphoenolpyruvate carboxylase from maize// Eur. J. Bioche. 1989. V. 181. P. 593598.
136. Maxwell C.A., Vance C.P., Heichel G.H., Stade S. C02 fixation in alfalfa and birdsfoot trefoil root nodules and pardoning of 14C to the plant // Crop. Sci. 1984. V. 24. P. 257-264.
137. McCormick D.K., Farnden K.J.F., Boland M.J. Purification and properties of glutamine synthetase from the plant cytosol fraction of lupin nodules// Archives of Biochemistry and Biophysics. 1982. V. 218. P. 561-571.
138. McCourt P., Somerville C.R. Plant amino acid requiring mutants. In: The biochemistry of plants. Davies D. eds. 1987. P. 32-64.127
139. McKay I.A., Dilworth M.J., Glenn A.R. C4-dicarboxylate metabolism in free-living and bacteroid forms of Rhizobium leguminosarum MN 3841// Journal of General Microbiology. 1988. V. 134. P. 1433-1440.
140. Mcmanmom M., Crawford R.M. A metabolic theory of flooding tolerance: the significance of enzyme distribution and behavior// New Phytol. 1971. V. 70. P. 299306.
141. McNaughton G.A.L., Wilkins M.B., Nimmo H.G. Purification, oligomerization state of maize leaf phosphoenolpyruvate carboxylase// Biochem. J. 1989. V. 261. P. 349-355.
142. McParland R.H., Guevara J.G., Becker R.R., Evans H.J. The purification and properties of the glutamine synthetase from the cytosol of soybean root nodules// Biochemistry Journal. 1976. V. 153. P. 597-606.
143. Meeks J.C., Wolk C.P., Schilling N., Shaffer P.W. Initial organic products of fixation of 13N dinitrogen by root nodules of soybean (Glycine max L.)//Plant Physiol. 1978. V. 61. P. 980-983.
144. Mellor R.B., Christensen T.M., Werner D. Choline kinase II is presented only in nodules that synthesize stable peribacteroid membranes// Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 1986. V. 83. P. 659-663.
145. Miao G.H., Hirel B., Marsolier M.C., Ridge R.W., Verma D.P.S. Ammonia-regulated expression of a soybean gene encoding cytosolic glutamine synthetase in transgenic Lotus corniculatus // Plant Cell. 1991. V. 3, N 1. P. 11-22.
146. Miller S.S., Boylan K.L.M., Vance C.P. Alfalfa root nodule carbon dioxide fixation. III. Immunological studies of nodule phosphoenolpyruvate carboxylase // Plant Physiol. 1987. V. 84. P. 501-508.
147. Miller S.S., Gregerson R.G., Vance C.P., Gantt J.S. NADH-glutamate synthase in alfalfa nodules: expresión at the mRNA level and isolation of a complete genomic clone//Plant Physiol. 1993. V. 102. P. 69-73.
148. Minchin F.R., Pate J.S. Diurnal functioning of the legume root nodule// Journal of Experimental Botany. 1974. V. 85. P. 295-308.
149. Minchin F.R., Sheely J.E., Ines-Mingues M., Witty J.F. Characterization of the resistance to oxygen diffusion in legume nodules// Ann. Bot. 1985. V. 55. P. 53-60.128
150. Miziorko H.M., Nowak T., Mildvan A.S., Spinach leaf phosphoenolpyruvate carboxylase: purification, properties and kinetic studies//Arch. Biochem. Biophys. 1974. V. 163. P. 378-389.
151. Mohapatra S.S., Puhler A. Detection of nodule-specific polypeptides from effective and ineffective root nodules of Medicago sativa L.// J. Plant Physiol. 1986. V. 126, N2-3. P. 269-281.
152. Morell M., Copeland L. Enzymes of sucrose breakdown in soybean nodules. Alkaline invertase// Plant Physiology. 1984. V. 74. P. 1030-1034.
153. Nelson T., Langdale J.A. Developmental genetics of C4 photosynthesis// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1992. V. 43. P. 25-47.
154. Nelson. // J. Biol. Chem. 1944. V. 153. P. 375.
155. Newcomb E.H., Kaneko Y., Van den Bosch K.A. Specialization of the inner cortex for ureide production in soybean root nodules// Protoplasma. 1989. V. 150. P. 150-159.
156. Newcomb W. Nodule morphogenesis and differentiation// International review of Cytology. 1981. V. 13. P. 247-298.
157. Nimmo H.G. The regulation of phosphoenolpyruvate carboxylase by reversible phosphorylation. In: Battey N.H., Dickinson H.G., Hetherington A.M. (eds). Post-Translational Modifications in Plants, Cambridge Univ. Press, 1993. P. 161-170.
158. Norris J.H., Macol L.A., Hirsch A.M. Nodulin gene expression in effective alfalfa nodules and in nodules arrested at three different stages of development// Plant Physiol. 1988. V. 88, N 2. P. 321-328.
159. O'Leary 1982. 1. Phosphoenolpyruvate carboxylase: an enzymologist's view // Annu. Rev. Plant Physiol. 1982. V. 33. P. 297-315.
160. Ohyama T., Kumazawa K. Nitrogen assimilation in soybean nodules I. The role of GS/GOGAT system in the assimilation of ammonia produced by ^-fixation// Soil Science and Plant Nutrition. 1980. V. 26. P. 109-115.
161. Ornstein L. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum protein // Ann. NY Acad. Sci. 1964. V. 121. P. 404-427.
162. Padilla J.E., Miranda J., Sanchez F. Nodulin regulation in common bean nodules induced by bacterial mutants// Mol. Plant-Microbe interactions. 1995. V. 4, N 5. P. 433-439.
163. Pate J.S., Gunning B.E.S., Briarty L.G. Ultrastructure and functioning of the transport system of the leguminous root nodule// Planta. 1969. V. 85. P. 11-34.
164. Pathirana M.S., Samac D.A., Roeven R., Yoshioka H., Vance C.P., Gantt J.S. Analyses of phosphoenolpyruvate carboxylase gene structure and expression in alfalfa nodules//The Plant J. 1997. V. 12, N 2. P. 293-304.
165. Patrick J.W. Hormone-directed transport of metabolites. In: Transport and transfer processes in plants. Wardlaw I.F., Passioura J. eds., USA. 1976. P. 433-446.
166. Peterson J.B., Evans H.J. Phosphoenolpyruvate carboxylase from soybean nodule cytosol. Evidence for isozymes and kinetics of the most active component // Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 567. P. 445-452.
167. Peterson J.B., Evans H.J. Properties of pyruvate kinase from soybean nodule cytosol// Plant Physiology. 1978. V. 61. P. 909-914.
168. Phillips D.A. Efficiency of symbiotic nitrogen fixation in legumes// Annual Review of Plant Physiology. 1980. V. 31. P. 29-49.
169. Plaxton W.C. Biochemical regulation. In: Plant physiology, biochemistry and molecular biology. Dennis D.T. and Turpin D.H. (eds), USA. 1990. P. 28-44.
170. Podesta F.E., Andreo C.S. Maize leaf phosphoenolpyruvate carboxylase. Oligomeric state and activity in the presence of glycerol// Plant Physiol. 1989. V. 90. P. 427-433.
171. Poetsch W., Hermans J., Westhoff P. Multiple cDNAs of phosphoenolpyruvate carboxylase in the C4 dicot Flaveria trinervia// FEBS Lett. 1991. V. 292. P. 133-136.
172. Postgate J.R. In: The fundamentals of nitrogen fixation. Cambridge, 1982. 252 c.
173. Raghavendra A.S., Yin Z.-H., Heber U. Light-dependent pH changes in leaves of C4 plants. Comparison of the pH response to carbon dioxide and oxygen with that of C3 plants// Planta. 1993. V. 189. P. 278-287.
174. Rajagopalan A.V., Devi M.T., Raghavendra A.S. Patterns of phosphoenolpyruvate carboxylase activity and cytosolic pH during light activation and dark deactivation in C3 and C4 plants// Photosynth. Res. 1993.V. 38. P. 51-60.
175. Rao N.V., Reddy R.S., Sastry K.S. Allantoinases of nodulated Arachis hypogaea// Phytochemistry. 1988. V. 27. P. 693-695.
176. Rawsthorne S., LaRue T.A. Metabolism under microaerobic conditions of mitochondria from cowpea nodules// Plant Physiology. 1986. V. 81. P. 1097-1102.
177. Reding H.K., Lepo J.E. Physiological characterization of dicarboxylate-induced pleomorphic forms of Bradyrhizobium japonicum// Applied and Environmental Microbiology. 1989. V. 55. P. 666-671.
178. Reibach P.H., Mask P.L., Streeter J.G. A rapid one-step method for the isolation of bacteroids from root nodules of soybean plants, utilizing self-generating Percoll gradients// Can. J. Microbiol. 1981. V. 27. P. 491-495.
179. Reibach P.H., Streeter J.G. Metabolism of 14C-labeled photosynthate and distribution of enzymes of glucose metabolism in soybean nodules// Plant Physiol. 1983. V. 72. P. 634-640.
180. Reynolds P.H.S., Smith L.A., Dickson J.M., Jones W.T.,Rodber K.A.Molecular cloning of a cDNA encoding aspartate aminotransferase P2 from lupine root nodules// Plant Mol.Biol. 1992.V. 19. P. 465-472.
181. Robert F.M., Wong P.P. Isoenzymes of glutamine synthetase in Phaseolus vulgaris L. and Phaseolus lunatus L. root nodules// Plant Physiol. 1986. V. 81. P. 142148.
182. Robinson D.L., Lahn M.L., Vance C.P. Cellular localization of nodule-enhanced aspartate aminotransferase in Medicago sativa L.//Planta. 1994. V. 192. P. 202-210.
183. Robinson D.L., Pathirana S.M., Gantt J.S., Vance C.P. Immunogold localization of nodule-enhanced phosphoenolpyruvate carboxylase in alfalfa//Plant,Cell and Envir. 1996. V. 19. P. 602-608.
184. Romanov Y.I., Hajy-zadeh B.R., Ivanov B.F., Shaposhnikov G.L., Kretovich W.L. Labelling of lupine nodule metabolites with 14C02 assimilated from the leaves// Phytochemistry. 1985. V. 24. P. 2157-2160.
185. Ronson C.W., Primrose S.B. Carbohydrate metabolism in Rhizobium trifolii: Identification and symbiotic properties of mutants// Journal of General Microbiology. 1979. V. 112. P. 77-88.
186. Rosendahl L., Dilworth M.J., Glenn A.R. Exchange of metabolites across the peribacterooid membrane in pea root nodules//J. Plant Physiol. 1992. V. 139. P. 635638.
187. Rosendahl L., Vance C.P., Pederson W.B. Products of dark C02 fixation in pea root nodules support bacteroid metabolism // Plant Physiol. 1990. V. 93. P. 12-19.
188. Roth E.L., Stacey G. Bacterium release into host cells of nitrogen-fixing soybean nodule: The symbiosome membrane comes from three sources// European J. of Cell Biology. 1989. V. 49. P. 13-23.
189. Salminen S.O., Streeter J.G. Uptake and metabolism of carbohydrates by Bradyrhizobiumjaponicumbacteroids//Plant Physiology. 1987. V. 83. P. 535-540.
190. Sambrook J., Maniatis T., Fritsch E.F. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989. V. 3.
191. Sanchez F., Campos F., Padilla J.E., Bonneville J.-M., Enriquez C., Caput D. Purification, cDNA cloning and developmental expression of the nodule-specific uricase from Phaseolus vulgaris L.// Plant Physiol. 1987. V. 84. P. 1143-1147.
192. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467.
193. Saroso S., Dilworth M.J., Glenn A.R. The use of activities of carbon catabolic enzymes as a probe for the carbon nutrition of snakebean nodule bacteroids// Journal of General Microbiology. 1986. V. 132. P. 243-249.
194. Sawhney V., Saharan M.R., Singh R. Nitrogen fixing efficiency and enzymes of C02 assimilation in nodules of ureide and amide producing legumes// Journal of Plant Physiology. 1987. V. 129. P. 201-210.132
195. Schaffner A.R., Sheen J. Maize C4 photosynthesis involves differential regulation of phosphoenolpyruvate carboxylase genes// Plant J. 1992. V. 2. P. 221232.
196. Schnabl H., Denecke M., Schultz M. In vitro and in vivo phosphorylation of stomatal phosphoenolpyruvate carboxylase from Vicia faba L.// Bot. Acta. 1992. V. 105. P. 367-369.
197. Schubert K.R. Products of biological nitrogen fixation in higher plants: synthesis, transport and metabolism// Annu. Rev. Plant Physiol. 1986. V. 37. P. 537574.
198. Schubert K.R., Boland M.J. // Advances in nitrogen fixation. The Hague etc.: NidhoMJunk, 1984. P. 445-451.
199. Schuller A.K., Werner D. Phosphorylation of soybean (Glycine max L.) nodule phosphoenolpyruvate carboxylase in vitro decreased sensitivity to inhibition by L-malate // Plant Physiol. 1993. V. 101. P. 1267-1273.
200. Schuller K.A., Turpin D.H., Plaxton W.C. Metabolite regulation of partially purified soybean nodule phosphoenolpyruvate carboxylase // Plant Physiol. 1990. V. 94. P. 1429-1435.
201. Schultze M., Kondorosi A. Regulation of symbiotic root nodule development//Annu. Rev. Genet. 1998. V. 32. P. 33-57.
202. Sengupta-Gopalan C. and Pitas J. Expression of nodule specific glutamine synthetase genes during nodule development in soybeans // Plant Mol. Biol. 1986. V. 7. P. 189-199.
203. Sheen J.-Y., Bogorad L. Differential expression of C4 pathway genes in mesophyll and bundle sheath cells of greening maize leaves// J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 11726-11730.
204. Sims T.L., Hague D.R. Light-stimulated increase of translatable mRNA for phosphoenolpyruvate carboxylase in leaves of maise // J. Biol. Chem. 1981. V. 256. P. 8252-8255.
205. Sk0t L., Minchin F.R., Timms E., Fortune M.T., Webb K.J., Gordon A.J. Analysis of the two nodulins, sucrose synthase and ENOD2, in transgenic Lotus plants//Plant and Soil. 1996. V. 186. P. 99-106.133
206. Skrdleta V., Nasinec V., Sindelar L. et.al. Relationship between nitrogenase activity, dihydrogen evolution and root nodule respiration in peas (Pisum sativum L.)// Soil. Biology and Cons, of the Biosphere. Budapest, 1983. P. 463-472.
207. Smith A.M. Capacity for fermentation in roots and Rhizobium nodules of Pisum sativum L.// Planta. 1985. V. 166. P. 264-270.
208. Sprent J.I. Root nodule anatomy, type of export product and evolutionary origin in some Leguminosae// Plant, Cell and Environment. 1980. V. 3. P. 35-43.
209. Sprent J.I. Which steps are essential for the formation of functional legume nodules? // New Phytologist. 1989. V. 111. P. 129-153.
210. Stone S.R., Copeland L., Kennedy I.R. Glutamate dehydrogenase of lupin nodules: Purification and properties//Phytochemistry. 1979. V. 18. P. 1273-1278.
211. Stowers M.D. Carbon metabolism in Rhizobium species// Annual Review of Microbiology. 1985. V. 39. P. 89-108.
212. Stowers M.D., Elkan G.H. // Canad. J. Microbiol. 1983. V. 29. P. 398-406.
213. Streeter J.G. Carbohydrates in soybean nodules. II. Distributin of compounds in seedlings during the onset of nitrogen fixation// Plant Physiology. 1980. V. 66. P. 471476.
214. Streeter J.G. Effect of nitrate on acetylene reduction activity and carbohydrate composition of Phaseolus vulgaris nodules// Physiologia Plantarum. 1986. V. 68. P. 294-300.
215. Streeter J.G. Transport and metabolism of carbon and nitrogan in legume nodules//Adv. Bot. Res. 1991. V. 18. P. 129-187.134
216. Stripf R., Werner D. Differentiation of Rhizobium japonicum. II. Enzymatic activities in bacteroids and plant cytoplasm during the development of nodules of Glycine max// Zeitschrift fur Naturforschung, Teil C. 1978. V. 33. P. 373-381.
217. Suganuma N., Kitou M., Yamamoto Y. Carbon metabolism in relation to cellular organization of soybean root nodules and respiration of mitochondria aided by leghemoglobin// Plant Cell Physiology. 1987. V. 28. P. 113-122.
218. Suganuma N., LaRue T.A. Comparison of enzymes involved in carbon and nitrogen metabolism in normal nodules and ineffective nodules induced by a pea mutant E135f (sym 13) // Plant Cell Physiol. 1993. V. 34, N. 5. P. 761-765.
219. Suganuma N.,Tamaoki M., Kouchi H. Expression of nodulin genes in plant-determined ineffective nodules of pea//Plant Mol. Biology. 1995. Y. 28. P. 1027-1038.
220. Sugimoto K., Kawasaki T., Kato T., Whittia R.F., Shibata D., Kawamura Y. cDNA sequence and expression of a phosphoenolpyruvate carboxylase gene from soybean//Plant Mol. Biol. 1992. V. 20. P. 743-747.
221. Ta T.-C., Faris M.A., Macdowall F.D.H. Pathways of nitrogen metabolism in nodules of alfalfa (Medicago sativa L.)//Plant Physiology. 1986.V. 80. P. 1002-1005.
222. Tajima S., LaRue T.A. Enzymes for acetaldehyde and ethanol formation in legume nodules// Plant Physiol. 1982. V. 70. P. 388-392.
223. Thummler F., Verma D.P.S. Nodulin-100 of soybean is the subunit of sucrose synthase regulated by the availalability of free heme in nodules// The Journal of Biological Chemistry. 1987. V. 262. P. 14730-14736.
224. Ting I.P., Osmond C.P. Multiple forms of plant phosphoenolpyruvate carboxylase associated with different metabolic pathways// Plant Physiol. 1973. V. 51. P. 448-453.
225. Tomaszewska B., Mazurowa H., Schramm R.W. Activities of some enzymes of carbon metabolism connected with nitrogen fixation in the root nodules of the growing yellow lupin Lupinus luteus L.// Acta Physiol. Plant. 1988. V. 10, N 2. P. 73-84.
226. Trinchant J.C., Birot A.M., Rigaud J. Oxygen supply and energy-yielding substrates for nitrogen fixation (acetylene reduction) by bacteroid preparations// Journal of General Microbiology. 1981. V. 125. P. 159-165.
227. Tsyganov V.E., Morzhina E.V., Stefanov S.Y., Borisov A.Y., Lebsky V.K., Tikhonovich I.A. New pea (Pisum sativum L.) genes sym33 and sym40 control infection thread formation and root nodule function//Mol. Gen. Genet. 1998. V. 256. P. 491-503.
228. Tyson R.H., ap Rees T. Starch synthesis by isolated amyloplasts from wheat endosperm//Planta. 1988. V. 175. P. 33-48.
229. Udvardi M.K., Price G.D., Gresshoff P.M., Day D.A. A dicarboxylate transporter on the peribacteroid membrane of soybean nodules// FEBS Letters. 1988. V. 231. P. 36-40.
230. Utter M.F., Kolenbrander H.M. Formation of oxaloacetate by CO2 fixation on phosphoenolpyruvate carboxylase. In: Boyer P.D. (ed). The enzymes, Academic Press, NY, 1972. V. 6. P. 117-168.
231. Van Quy L., Foyer C., Champigny M.-L. Effect of light and N03" on wheat leaf phosphoenolpyruvate carboxylase activity. Evidence for covalent modification of the C3 enzyme// Plant Physiol. 1991. V. 97. P. 1476-1482.
232. Vance C.P., Gregerson R.G., Robinson D.L., Miller S.S., Gantt J.S. Primary assimilation of nitrogen in alfalfa nodules: molecular fearures of the enzymes involved// Plant Science. 1994. V. 101. P. 51-64.
233. Vance C.P., Heichel G.H. Carbon dioxide assimilation in pulvini of Phaseolus vulgaris L.// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1991. V. 42. P. 37-42.
234. Vance C.P., Johnson L.E.B. Plant determined ineffective nodules in alfalfa (Medicago sativa L.): structural and biochemical comparison// Can. J. Bot. 1983. V. 61. P. 93-106.
235. Vance C.P., Stade S. Alfalfa root nodule carbon dioxide fixation. II. Partial purification and characterization of root nodule phosphoenolpyruvate carboxylase // Plant Physiol. 1984. V. 75. P. 261-264.
236. Vasse J., de Billy F., Camut S., Truchet G. Correlation between ultrastructural differentiation of bacteroids and nitrogen fixation in alfalfa nodules// Journal of Bacteriology. 1990. V. 172. P. 4295-4306.
237. Verma D.P.S. Signals in root nodule organogenesis and endocytosis of Rhizobium//Plant Cell. 1992. V. 4. P. 373-382.
238. Verma D.P.S., Fortin M.G., Stanley J., Mauro V.P., Purohit S., Morrison N. Nodulins and nodulin genes of Glycine max. A perspective// Plant Molec. Biol. 1986. V. 7. P. 51-61.
239. Verma D.P.S., Haugland R., Brisson N., Legocki R.P., Lacroix L. Regulation of the expression of leghemoglobin genes in effective and ineffective root nodules of soybean // Biochem. Biophys. Acta. 1981. V. 653, N 1. P. 98-107.
240. Vidal J., Nguyen J., Perrot-Rechenmann C., Gadal P. Phosphoenolpyruvate carboxylase in soybean root nodules. An immunochemical study// Planta. 1986. V. 169. P. 198-201.
241. Wadham C., Winter H., Schuller K.A. Regulation of soybean nodule phosphoenolpyruvate carboxylase in vivo// Physiologia Plant. 1996. V. 97. P. 531-535.
242. Wagner R., Gonzales D.H., Podestra F.E., Andreo C.S. Changes in the quarternary structure of phosphoenolpyruvate carboxylase induced by ionic strength affect its catalytic activity. // Eur.J.Biochem. 1987. V. 164. P. 661-666.
243. Walker G.H., Ku M.S.B., Edwards G.E. Phosphoenolpyruvate carboxylase in relation to oligomerization// Plant Physiol. 1986. V. 80. P. 848-855.
244. Wang Y.-H., Duff S.M.G., Cretin C., Lepiniec L., Sarath G., Gordon S.A., Vidal J., Gadal P., Chollet R. Site-directed mutagenesis of the phosphorylatable serineo
245. Ser ) in C4 phosphoenolpyruvate carboxylase from sorghum. The effect of negative charge at position 8.// J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 16759-16762.137
246. Wedding R.T., Kay Black M., Meyer C.R. Inhibition of phosphoenolpyruvate carboxylase by malate//Plant Physiol. 1990. V. 92. P. 456-461.
247. Weigend M., Hincha D.K. Quaternary structure of phosphoenolpyruvate carboxylase from CAM-, C4- and C3-plants//J. Plant Physiol. 1992. V. 140. P. 653660.
248. Witty J.F., Scot L., Revsbech N.P. Direct Evidence for changes in the resistance of legume root nodules to 02 diffusion// Journal of experimental Botany. 1987. V. 38, N. 192. P. 1129-1140.
249. Wong E. Structural and biogenetic relationships of isoflavonoids. In: Progress in the Chemistry of organic natural products. Herz W., Grisebach H., Scott A. eds., Austria. 1970. V. 1.
250. Wu M-X., Wedding R.T. Temperature effects on phosphoenolpyruvate carboxylase from a CAM and a C4 plant//Plant Physiol. 1987. V. 85. P. 497-501.
251. Yanagisawa S., Izui K. Multiple interaction between tissue-specific nuclear proteins and the promoter of the phosphoenolpyruvate carboxylase gene for C4 photosynthesis in Zea mays// Mol. Gen Genet. 1990. V. 224. P. 325-332.
252. Zhang X.-Q., Li B., Chollet R. In vivo regulatory phosphorylation of soybean nodule phosphoenolpyruvate carboxylase// Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 1561-1568.138
253. Автор испытывает чувство глубокой благодарности Федоровой Марии Юрьевне за постоянную поддрежку, консультации по любым вопросам, помощь в подготовке и проведении некоторых экспериментов.
254. Автор признателен Онищук Ольге Петровне и Струнниковой Ольге Кондратьевне за критические замечания и ценные советы, сделанные ими при рецензировании диссертации.
255. Автор благодарен всем сотрудникам лаборатории за создание атмосферы дружбы и взаимопомощи, способствовавшей плодотворной работе и появлению данной диссертации.
-
Долгих, Елена Анатольевна
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2000
-
ВАК 03.00.07
- Молекулярно-генетический анализ клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений трибы Vicieae, произрастающих на территории Республики Башкортостан
- Селекция гороха (Pisum sativum L.) на повышение эффективности симбиотической азотфиксации
- Генетическая система гороха посевного (Pisum sativum L. ), контролирующая развитие симбиозов с клубеньковыми бактериями (Rhizobium leguminosarum bv viceae) и эндомикоризными грибами (Glomus sp. )
- Генетический анализ процесса развития симбиотических клубеньков у гороха посевного (Pisum sativum L. )
- Реализация азотфиксирующего потенциала гороха и сои в условиях Алтайского Приобья в зависимости от уровня минерального питания растений
