Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней"

/

На правах рукописи

Воробьева Ирина Валерьевна

Особенности репликации вирусов гриппа А человека в культуре эпителиальных клеток кишечника (линия CACO - 2)

03.00.06.- Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Москва - 2005 г

Работа выполнена в Институте вирусологии им Д И Ивановского Российской Академии Медицинских Наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Доктор биологических наук, профессор, чл - корр РАЕН

Олег Петрович Жирнов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Академик РАМН, профессор, доктор медицинских наук

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н Ф Гамалеи РАМН, Москва

специализированного совета Д 001 020 01 при ГУ НИИ вирусологии им ДИ Ивановского РАМН 123098 Москва, ул Гамалеи 16

С диссертацией можно ознакомтъся в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им ДИ Ивановского РАМН

Николай Вениаминович Каверин

Доктор биологических наук

Станислав Георгиевич Маркушин

Защита диссертации состоится <

2005 г в 12 часов на заседании

Автореферат разослан W/» 2005 г

Ученый секретарь специализированного Совета

Доктор медицинских наук

Н.П. Косякова

ZIS1730

/ Í f 7 О

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Грипп - массовое инфекционное заболевание вирусной этиологии, имеющее глобальное распространение - продолжает оставаться неуправляемым процессом Исключительная вариабельность поверхностных антигенов -гемагглютинина и нейраминидазы - у различных штаммов вируса гриппа объясняет недостаточную эффективность противогриппозных вакцин Широкая распространённость гриппа среди людей, домашних и диких животных, высокая контагиозная и инвазионная активность возбудителя, а, вследствие этого, масштабность и стремительное распространение заболевания среди восприимчивой прослойки населения, огромный экономический ущерб и отсутствие радикальных специфических противогриппозных средств защиты - основные причины, определяющие актуальность проблемы гриппа

Свойство вируса - использовать для своего размножения аппарат клетки -хозяина - является препятствием в создании препаратов, избирательно угнетающих вирус и не повреждающих клетку Вполне понятно, что успешное решение проблемы по преодолению вирусных инфекций определяется уровнем фундаментальных исследований по молекулярной биологии вируса и механизмов его взаимодействия с клеточным аппаратом Применение новейших методов молекулярной генетики, таких как' генная инженерия, обратная генетика и сайт специфический мутагенез в изучении вируса гриппа существенно расширило наши представления о структуре вируса гриппа и механизмах репликации, о функциях отдельных вирусных белков и их взаимодействии с клеточными факторами Проведение таких исследований позволяет лучше понять механизмы патогенеза, лежащие в основе инфекционного процесса при гриппе и конструировать пути аетигриппозной стратегии

Объектом исследования в настоящей диссертационной работе служили вирусы гриппа А человека и клетки, инфицированные этим вирусом Изучено внутриклеточное расщепление гемагглютинина вируса гриппа А человека клеточной протеиназой, вызывающее активирование вируса и его многоцикловую репродукцию в культуре клеток человека Изучены биохимические особенности и свойства клинических вирусов гриппа при размножении в перевиваемой культуре клеток человека

Существуют различные клеточные линии для культивирования вирусов гриппа Однако ни одна из используемых клеточных линий не обеспечивала многоцикловую репликацию вируса без дополнительного внесения экзогенного трипсина Более того, размножение вируса в таких системах нечеловеческого происхождения вызывало изменение свойств вируса гриппа Поэтому поиск системы человеческого происхождения представлял интерес

Особое внимание было уделено клеточной линии CACO - 2, полученной из умереннодифференцированной аденокарциномы толстого кишечника человека Так как эта линия клеток была выделена из опухоли человека, она оказалась превосходной моделью для культивирования человеческих вирусов Аденогенные клетки толстого кишечника имеют цитоморфологическое сходство и близость клеточных рецепторов с бокаловидными клетками эпителия респираторного тракта человека, что повышало интерес данного исследования При заражении клеток вирусом гриппа А человека в клетках развивался некроз, в то время как в других клеточных линиях нечеловеческого происхождения вирус гриппа А вызывал апоптоз

Установлено, что культура эпителиальных клеток аденокарциномы толстого кишечника человека (линия САСО-2) - это высокочувствительная культура клеток человека, где хорошо реплицируются вирусы гриппа и не требуется добавления экзогенного трипсина для поддержания многоцикловой репродукции вируса Ранее исследованные клеточные культуры, такие как fluu на

библиотека

этапах сборки вирионов и не содержали IAP - протеазы, поэтому для поддержания многоцикловой репродукции вируса требовалось добавление трипсина Появление клеточной культуры САСО-2 сделало возможным изоляцию клинических вирусов гриппа от больных людей с сохранением исходных генетических и фенотипических признаков вируса, свойственных вирусам гриппа человека Более того, как показывают наши наблюдения, эффективность выделения вирусов от больных людей в клеточной культуре САСО-2 оказалась более высокой, чем в других, используемых для этих целей, системах, таких как, клетки MDCK или куриные эмбрионы Это наблюдение, как мы считаем, объясняется близостью клеточных рецепторов в респираторном тракте человека и клетках САСО-2

Цель настоящей работы заключалась в изучении механизмов протеолиза гемагглютинина вируса гриппа А человека в инфицированных клетках, определении природы внутриклеточных протеиназ, участвующих в механизме его расщепления, а также изучение репликации вируса гриппа А человека и механизмов клеточной гибели в культуре CACO - 2, имеющей человеческое происхождение, и сравнительного анализа размножения вируса гриппа А человека в культурах клеток человека (CACO - 2) и собаки (MDCK), а также механизмов вирусного апоптоза и некроза

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1 Изучить возможность внутриклеточного протеолиза гемагглютинина с единичным аргинином в протеолигическом сайте у вирусов гриппа А человека в культуре клеток CACO- 2

2 Определить локализацию протеолиза гемагглютинина вируса гриппа А человека в зараженных клетках CACO - 2

3 Установить возможности ингибирования внутриклеточного протеолиза

4 Исследовать механизмы гибели клеток CACO - 2 при заражении их вирусом гриппа А человека

5 Провести сравнительный анализ биологических и структурных свойств клинических вирусов гриппа А человека при размножении в культуре клеток человека (линия CACO - 2)

Научная новизна и практическая ценность работы.

Проведено сравнение репродукции и биологических свойств вирусов гриппа А человека при пассировании на клетках MDCK и в эпителиальных клетках, производных аденокарциномы толстого кишечника человека (линия CACO - 2) Установлено преимущество использования этой высокочувствительной клеточной культуры для изучения биологических свойств вируса гриппа А человека Впервые исследованы механизмы гибели клеток CACO - 2 при заражении их вирусом гриппа А человека Впервые определили, что в клетках аденокарциномы происходит внутриклеточное расщепление молекулы гемагглютинина с единичным остатком аргинина в протеолигическом сайте при инфицировании вирусом гриппа А человека и показана принципиальная возможность его ингибирования с помощью природного антипротеазного полипептида - апротинина

Полученные нами результаты важны для понимания молекулярных механизмов, протекающих в клетках, инфицированных вирусом гриппа А человека, и углубляет знания о биологических свойствах вируса и клетки. С учётом этой новой информации возможны предпосылки для создания новых противогриппозных препаратов на основе антипротеазных ингибиторов, способных специфически блокировать внуд^цлеточный протеолиз вирусных белков

-иа£ >

Положения, выносимые на защиту.

1 Клеточная культура аденокарциномы человека высоковосприимчива к вирусам гриппа А (линия CACO - 2)

2 Клеточная культура аденокарциномы человека поддерживает многоцикловую инфекцию без добавления трипсина (линия CACO - 2)

3 В клетках аденокарциномы происходит внутриклеточное расщепление молекулы гемагглютинина с единичным остатком аргинина в протеолитическом сайте

4 Клетки аденокарциномы человека погибают некрозом при заражении вирусом гриппа А.

5 Клеточная культура CACO была более восприимчивой для клинических вирусов (вирусы, полученные от больных людей), чем клетки МДСК

6 В процессе эволюции вируса H3N2 идёт увеличение сайтов гликозилирования, что даёт вирусу возможность ускользать от вируснейтрализующих антител, изменять рецепторные и адаптационные свойства.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ и Отдела репродукции вирусов НИИ Вирусологии им Д И Ивановского РАМН 23 июня 2005 г Фрагменты настоящего исследования были представлены на 12 Международной конференции по негативно - нитевым вирусам (14 -19 июня 2003 г Пиза, Италия)

Публикации. По материалам исследования опубликовано 4 работы Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы Работа изложена на 132 страницах, содержит 3 таблицы и 34 рисунка Список литературы состоит из 205 источников отечественных и зарубежных авторов

Материалы и методы.

Клетки и вирусы. Использовали клеточную культуру MDCK-2 из коллекции института вирусологии Университета Филиппа (Марбург Германия) и CACO-2 из европейской коллекции ЕСАСС Данные культуры выращивали в модифицированной среде Дульбеко (DMEM, Gibco/BRL), содержащей 10% бычьей фетальной сыворотки (Gibco/BRL) Образцы клинических вирусов гриппа получали путем взятия носоглоточных смывов от больных гриппом, поступивших в Инфекционную клиническую больницу № 1 г Москвы в зимний период 2003 года Смывы делали стерильным физиологическим раствором, содержащем пенициллин (100 Ед/мл), стрептомицин (10 мкгр/мл) и канамицин (50 мкгр/мл), в объеме около 10 мл для одного больного Далее материал осаждали при 4000 об/мин при температуре 4С Полученные осадки суспендировали в 0,4 мл среды ДМЕМ, содержащей 100 Ед/мл пенициллина, 50 мкгр/мл канамицина, 50 мкгр/мл стрептомицина, и озвучивали в течение 3 мин на соникаторе "Branson" модель 4500 Полученный гомогенат разводили клеточной средой ДМЕМ, содержащей перечисленные выше антибиотики, вносили в культуру клеток и инкубировали в С02-инкубаторе при 37 С В ходе инкубации появление вируса определяли по гемагтлютинации 1% суспензии эритроцитов человека (O (I) группы крови), курицы, морской свинки При появлении гемагглютинирующей активности культуральную жидкость (1-ый пассаж) фильтровали через фильтр Millex-GV (0,22 цт) и использовали для дальнейшего изучения Выделенные в культуре клеток CACO от различных пациентов вирусы гриппа обозначены А/Москва/326/2003 (изолирован в феврале 2003), А\Москва/328/2003 (февраль 2003), А/Москва/343/2003 (март 2003), А/Москва/346/2003 (март 2003), А/Москва/450/2003 (январь 2003), А/Москва/352/03 (январь 2003).

RT - PCR и секвенирование вирусных генов. Вирусную РНК выделяли из клинических гомогенатов и культуральной жидкости после пассирования в культурах клеток САСО-2 и MDCK Для выделения РНК использовали набор "High Purification Kit" (Roche), который содержит этап обработки препаратов ДНК-азой I типа для снижения в препарате РНК загрязнений клеточной ДНК С полученной РНК-матрицы синтезировали ДНК-продукте помощью набора "One Step RT-PCR Kit" (Qiagen) и праймеров - BsmBI-OUni-HA#5, NA-Klon-Earl-fo, M-Klon-Earl-fo, Ns-Klon-Earl-fo, NA-Klon-Earl-re, M-Klon-Earl-re, NS-Klon-Earl-re, специфичных для концевых 3' и 5'-концевых участков вирусных генов НА, NA, M и NS, соответственно (Hoffmann et а! 2001) Полученные ДНК-продукты фракционировали в 1,0% агарозном геле с последующей экстракцией из геля набором "Gel Extraction Kit" ( Qiagen) Первичную структуру фрагмента ДНК определяли методом Сэнгера с флюорисцентными дидеоксиоснованиями в автоматизированном аппарате "Applierd Biosystems" с использованием набора вирус-специфических праймеров

Метод иммунных фокусов в клеточной культуре. Монослой клеток САСО-2 или MDCK в 24-луночных планшетах в течение 1 ч заражали вирусами в различных разведениях при 37 0 С и после заражения клеточный монослой покрывали 0,8 мл 1%-ной агарозы, приготовленной на среде Дульбеко, содержавшей 0,05%-ный БСА, пенициллин (100 ед/мл) и стрептомицин (25 мкг/мл) либо в случае MDCK дополнительно трипсин (0,3 мкг/мл) Через 45-60 часов клетки фиксировали в течение 4 часов 2%-ным раствором пара-формапьдегида, приготовленного на ФБ, и пермеабилизовали 0,2%-ным раствором неионного детергента NP-40 в течение 15 мин Далее монослой инкубировали 1 ч при 20° с моноклональными антителами к гриппозному белку NP (клоны Al или A3, коллекция Центра по контролю над заболеваниями, Атланта, США) либо к белку НА типа НЗ и HI (коллекция Института вирусологии Университета Филиппа, Марбург, Германия) и затем с антивидовым пероксидазным конъюгатом Иммунные комплексы окрашивали водонерастворимым тетраметилбензидиновым (ТМБ) субстратом True Blue («KPL», США)

Метод сорбции специфических лектинов на клеточных рецепторах Для изучения наличия сиало-содержащих рецепторов типа 2-3 и 2-6 на клетках MDCK и САСО-2 использовали специфические лектины, выделенные из Sambucus Nigra (SNA, Calbiochem) и Maackia amurensis (MAA; Sigma), которые служат специфическими лигандами для данного типа рецепторов, соответственно (Wang 1988, Shibuya 1987) Растворы указанных лектинов (2 мг/мл) подвергали мягкому мечению невысокой концентарцией (0,2 мгр/мл) NHS-биотина (Calbiochem) в течении 5 мин с последующей инактивацией свободного NHS-биотина избытком глицина и полученные растворы использовали как маточные для приготовления рабочих растворов Различные клетки, выращенные в 96-луночных планшетах, промывали ФБ++ и далее инкубировали в течение 50 мин на льду с двукратными разведениями биотинилированных лектинов, приготовленных на 20 мМ Трис-HCl (рН 7,7), содержащем 0,15 MNaCl, 0,05% БСА, 1мМ MgCl2, 1мМ СаСЬ, 1 мМ МпСЬ, начиная с 3 и 25 мкгр/мл для SNA и МАА, соответственно Затем клетки промывали ФБ++ и фиксировали 2% раствором параформальдегида в течение 30 мин Для идентификации сорбированного лектина фиксированные клетки инкубировали с стрептавидин-пероксидазным коньюгатом (Amersham-Biotech) с последующим окрашиванием комплексов водонерастворимым ТМБ субстратом Окрашенные препараты исследовали в световом микроскопе Для определения процентного соотношения фракции лектин-позитивных клеток использовали пробу с предпоследнем разведением, в котором еще выявлялось окрашивание

Электрофорез в ПААГ и идентификация белков методом вестерн-блот (ВБ). Электрофорез полипептидов проводили в ПААГ, содержавшем Ds-Na, в мини-аппарате (7x8 см) Анализируемые образцы перед электрофорезом

растворяли в буфере, содержавшем 1%-ный Ds-Na, 10 мМ дитиотреитол (ДТТ) и 10%-ный глицерин После электрофореза в ПААГ полипептиды переносили на протрановую мембрану («Schleicher & Schuell», Германия) полусухим методом Мембрану инкубировали с антивирусными антителами, растворенными в ФБ, содержавшем, 0,5%-ный БСА, в течение 1,5 ч при 20° и иммунные комплексы идентифицировали с помощью антивидового пероксидазного конъюгата («Dako», Дания) методом усиленной хемилюминесценции (ECL) с ECL-cyперсубстратом («Pierce», США)

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Известно, что расщепление молекулы гемагтлютинина вируса гриппа А » человека происходит в строго определенном участке - протеолитическом сайте По

первичной структуре протеолитического сайта НА все вирусы гриппа А подразделяются на две большие группы Первую группу составляют вирусы двух субтипов - Н5 и Н7, имеющие в протеолитическом сайте НА несколько основных аминокислотных остатков, чаще Arg (мультиосновной сайт) Такой гемагглютинин расщепляется внутриклеточно в аппарате транс-Гольджи под действием протеиназ из семейства субтилизина Вирусы с мультиосновным НА выходят из инфицированных клеток уже в виде полностью сформированных инфекционных вирусных частиц с НА1/НА2 и эффективно инфицируют соседние клетки-мишени Вторую группу составляют вирусы, у которых НА расщепляется в участке, содержащем единичный остаток Arg (моноосновной сайт) В эту группу входят все вирусы гриппа человека (субтипы HI - НЗ) и большинство вирусов гриппа птиц и животных (субтипы Hl - Н15, кроме Н5 и Н7) НАО этих вирусов расщепляется, как правило, вне клетки (или на плазматической мембране клетки) экстрацеллюлярными трипсиноподобными протеиназами Вирусы этой группы выходят из инфицированных клеток в неактивной форме с НАО и для приобретения способности инфицировать новые клетки требуют дополнительной активации в межклеточной среде

Указанное правило о внеклеточном протеолизе моноаргининового гемагппотинина вируса гриппа А человека, возможно, не столь строго Поэтому целью данной работы являлось определить характер протеолитического расщепления гемагтлютинина вируса гриппа А человека в культуре перевиваемых клеток карциномы толстого кишечника человека Также представлялось необходимым проверить чувствительность протеолиза НАО —♦НА1/НА2 к различным ингибиторам сериновых протеиназ

1. Многоцикловая репликация вирусов гриппа А человека в культуре клеток CACO - 2; протеолитическое расщепление вирусного гемагтлютинина в клетках CACO - 2 и его ингибирование апротинином.

Проведено исследование многоцикловой инфекции вирусов гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) и A/PR/8/34(HlNl) человека в клеточной линии CACO -2 Клеточный монослой заражали с множественностью -0,001 бляшкообразующих единиц на 1 клетку и определяли накопление вируса в культуральной жидкости Выяснено, что в культуре клеток CACO - 2 происходит эффективная репликация и накопление значительных количеств вируса до титров 25 - 26 гемагглютинирующих единиц на 1 мл через 48 - 72 ч после инфицирования, тогда как в клетках MDCK, которые, как известно, не расщепляют вирусный НАО, многоцикловой репродукции вируса не происходило (рис!)

Ig^AE

О

Время, ч

Рис.1 Многоцикловая репродукция вируса гриппа А в культуре CACO (1) и MDCK (2) без добавления трипсина

Это наблюдение позволило нам предположить, что клетки CACO - 2 расщепляют вирусный НАО и активируют вирус, обуславливая, таким образом, его многоцикловую репродукцию в культуре Дополнительно, для подтверждения этого предположения проведено исследование способности вирусов гриппа А человека формировать фокусы в культурах CACO - 2 и MDCK под агаровым покрытием с трипсином и без него Установлено, что в клетках CACO - 2 вирусные фокусы эффективно формировались без добавления трипсина в агарозное покрытие, тогда как в культуре MDCK для образования фокусов необходимо добавление трипсина (рис 2)

'i

•.íRfr

(v

САСО-2

MDCK+Tr

MDCK

Рис. 2 Образование фокусов вируса гриппа в культуре CACO и MDCK

Также определили белковый состав вируса в CACO и в MDCK В CACO обнаружены незначительные количества нерасщепленного гемагглютинина и продукты его расщепления НА1 и НА2 В то время как в клетках MDCK преимущественно обнаруживался лишь нерасщепленный гемагглютинин

Далее, исследовали влияние апротинина, ингибирующего внутриклеточный протеолиз НАО, на появление гликопротеина НАО во внеклеточном вирусе С этой целью исследовали полипептидный состав вируса гриппа, синтезированного в клетках САСО-2 в

присутствии апротинииа Вирус, синтезированный в САСО-2, содержал значительную часть гемагглютинина в расщепленном виде Напротив, клетки MDCK синтезировали вирус, в котором выявлялся преимущественно НАО Эти наблюдения показали, что в вирусных частицах, синтезированных в клетках САСО-2, доминирует расщеплённый гемагглютинин и такой активированный вирус индуцирует многоцикловую вирусную репродукцию, тогда как в MDCK расщепление НА отсутствовало, и многоцикловая репродукция вируса не развивалась При добавлении апротинина в культуральную жидкость, клетки САСО-2 продуцировали вирионы с преобладанием нерасщеплённого НАО Эти результаты полностью подтверждают наш вывод о синтезе клетками САСО-2 активированного вируса и об ингибирующем действии апротинина на протеолиз НАО —»HA1/HA2.

Дополнительно проведено изучение влияния на протеолиз НАО брефелдина А, который, как известно, повреждает цис- и среднюю области аппарата Гольджи и нарушает транспорт созревающих гликопротеинов из аппарата Гольджи к плазматической мембране В инфицированных клетках, обработанных брефелдином А, обнаруживался только нерасщеплённый гликопротеин НАО и отсутствовали продукты протеолиза НА1/НА2 после 2,5-часового чейза, тогда как в клетках без брефелдина отчётливо выявлялись HAI/2 Эти данные подтвердили вывод о том, что для протеолиза НАО —»HA1 + НА2 необходим его транспорт на поздних этапах внутриклеточного маршрута в зону транс-Гольджи и/или плазматическую мембрану

Таким образом, в перевиваемой культуре эпителиальных клеток аденокарциномы толстого кишечника человека (САСО-2) обнаружено внутриклеточное расщепление НАО—»HA1/HA2 вируса гриппа А человека клеточной протеиназой, вызывающая активирование вируса и многоцикловую репродукцию в культуре Протеолиз НАО —> НА1/НА2 происходит на поздних этапах внутриклеточного транспорта в зоне транс-Гольджи и плазматической мембраны клеток и он подавляется апротинином - природным ингибитором сериновых протеиназ

2. Некроз клеток САСО-2 при инфекции вирусом гриппа.

В работе исследовали участие апоптозной системы в гибели клеток САСО-2 при гриппозной инфекции Для этого сравнивали уровень гриппозного апоптоза в клеточной линии обезьян CV-1, собачьих клеток MDCK, в которых, как было установлено ранее, развивается типичный апоптоз к 16 - 20 ч после заражения вирусом (Zhirnov, Konakova et al, 1999), и человеческой линии САСО-2 Клетки заражали вирусами А /Aichi/68 и A/PR/34 со множественностью ~2 бляшкообразующие единицы на 1 клетку и определили уровень гибели клеток при изучении методом световой микроскопии по уровню апоптозной фрагментации хромосомной ДНК, уровню протеолиза вирусного белка NP (56 кДа)—>aNP (53 кДа), клеточными каспазами (Zhirnov, Konakova, 1999), обработкой пропидиумом иодидом (McGanon 1995) Оказалось, что клетки CV-1 и MDCK погибали и откреплялись от стекла через 18 - 22 ч после заражения, тогда как клетки САСО-2 имели лишь слабый цитопатический эффект через 48 ч и демонстрировали заметную гибель лишь к 60 - 70 ч после заражения Более того, в клетках CV-1 (рис 3) и MDCK отмечалась заметная апоптозная фрагментация ДНК с образованием типичных низкомолекулярных апоптозных фрагментов с размером 1,0-0,15 тысяч пар оснований В клетках CV-1 и MDCK обнаруживалось значительное накопление апоптозной формы вирусного белка aNP, что говорило о развитии апоптоза и заметной активации каспаз (3, 8 и 9) в этих клетках (Zhirnov, Konakova, 1999) Напротив, в клетках САСО-2 не обнаруживалось апоптозной фрагментации ДНК вплоть до 72 ч после заражения и выявлялись лишь минорные количества белка aNP

CV-1 CACO MDCK

Рис. 3 Определение маркёров апоптоза в клетках CACO, CV-1 и MDCK при заражении вирусом гриппа А человека В клетках CV-1 и MDCK отмечается апоптозная фрагментация ДНК, в CACO нет, что указывает на развитие некроза

Клетки CACO - 2 обработали стауроспорином - веществом, вызывающим апоптоз (Bertrand 1994) В результате в клетках появилась апоптозная фрагментация ДНК, указывающая, что апоптозная система является функциональной в клетках CACO - 2, но при заражении вирусом гриппа она не активируется (рис 4)

ST Ai

Рис. 4. Клетки CACO - 2, обработанные стауроспорином (ST) Дополнительно, зараженные вирусом гриппа клетки CACO - 2 и CV - 1 обработали пропидиумом иодидом (McGanon 1995) и анализировали в флюоресцентном микроскопе В погибшие клетки CACO - 2 пропидиум иодид проникал через повреждения плазматической мембраны и полностью окрашивал их в красный цвет, что указывало на некротическую гибель клеток В клетки CV - 1 краситель не попадал, т к сохранялась целостность плазматической мембраны, что указывало на развитие апоптоза

Эти наблюдения позволяют заключить, что клеточная культура САСО-2 резистентна к апоптозу, индуцированному вирусом гриппа, а её гибель развивается, вероятно, по механизму некроза и происходит существенно более медленно, чем при гриппозном апоптозе Однако, в клетках CACO - 2 апоптозная система функционирует, но при заражении гриппом она неактивна

3. Выделение клинических изолятов вируса гриппа А человека в культуре клеток САСО-2 и их биологическая характеристика.

Так как линия клеток CACO - 2 была выделена от человека, и обладает рядом преимуществ над другими клеточными культурами, поэтому представлял интерес исследовать клинические вирусы (вирусы, выделенные от больных гриппом во время эпидемической вспышки 2003 г), пассированные в этой культуре клеток и сравнить их с вирусами, пассированными на собачьих клетках и куриных эмбрионах,

В первой части работы сравнивали восприимчивость культуры клеток САСО-2 и MDCK для клинических вирусов С этой целью носоглоточные смывы, полученные от людей, больных гриппом, вносили в клеточную культуру и далее в процессе инкубации

следили за появлением вирусной гемагтлютинирующей активности с эритроцитами человека (О (I) группы крови), морской свинки и курицы Обычно данная активность появлялась к 6-9 дню (пассаж 1) для изолятов у разных пациентов от момента внесения клинического материала в клеточную культуру Из 16 исследованных больных мы изолировали вирус в САСО-2 от 8 больных 7 вирусов агглютинировали эритроциты человека, но не куриные эритроциты («человеческий» фенотип) Один из изолятов (А/Москва/450/03) агглютинировал куриные эритроциты в более высоких титрах, чем эритроциты человека («птичий» фенотип агглютинации) Попытки параллельного изолирования вируса в MDCK с добавлением экзогенного трипсина оказалось менее продуктивными и лишь от одного пациента удалось изолировать вирус А/Москва/450/03 Сходным образом не удавалось размножить клинические вирусы в аллантоисной полости куриных эмбрионах, по крайней мере, в течение 5 «слепых» пассажей

После появления ГА активности в первом пассаже делали последующее пассирование на культуре САСО-2 и MDCK с множественностью инфекции (МИ) около 1 бляшкообразующей еденицы (БОЕ) на 100 клеток При пассировании в САСО-2 гемагглютинирующая активность выявлялась лишь с эритроцитами морской свинки и человека и не обнаруживались с куриными эритроцитами Такой профиль эритроцитарной агглютинации был стабильным и сохранялся в течение, по крайней мере, 20 пассажей Согласно более ранним работам такой профиль агглютинации характерен для вирусов гриппа человека, имеющих аффинитет к сиалорецепторам с 2-6 типом связи (Nobusawa et al 2000) Заметное изменение профиля гемагглютинации наблюдалось при пассировании клинических изолятов в MDCK Уже после третьего пассажа в MDCK вирус агглютинировал одинаково эффективно куриные и человеческие эритроциты, а после 2-3 дополнительных пассажей титр с куриными эритроцитами уже превышал таковой с эритроцитами человека, т е вирус приобретал «Д» или иными словами «птичий» фенотип Далее изолированные вирусы изучали по способности размножаться в CACO и MDCK, а также идентифицировали антигенный тип НА и NA Для этого применяли три метода - ВБ с использованием антител, специфичных к гемагглютинину типов HI и НЗ, метод иммунных фокусов в культуре клеток, и ПЦР со специфическими для вирусных генов праймерами Оказалось, что 7 из 8 изолированных штаммов имели гемагглютинин типа НЗ, один штамм А/Москва/450/03 - HI (рис 5) Иммунное окрашивание фокусов в культуре САСО-2 показало аналогичное окрашивание вирусных фокусов антителами НЗ и HI у 7 и 1 изолята, соответственно Помимо типа НА определяли тип вирусной нейраминидазы методом ВБ с помощью антител к нейраминидазе N2 (коллекция CDC, Atlanta, USA) Этот тип NA обнаруживался у всех изолированных вирусов генотипа НЗ Этот результат был подтвержден также методом RT - PCR с праймерами, специфичными для генов N1 и N2 (рис 6). Таким образом, можно заключить, что изолированные вирусы гриппа относились к типу H3N2 (7 изолятов) и H1N1 (1 изолят)

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

цт- ЩШЩр "ШШч 1 ЩШ: щфт

/ .JH Ж

Рис. 5 Типирование гемагглютинина методом ВБ 1- Ai/2/68, 2 - Рг/8/34, 3 - Мс/343/03, 4 - Мс/346/03, 5 - Мс/450/03, 6 - Ai/2/68, 7 - Рг/8/34, 8 - Мс/328/03, 9 - Мс/450/03, 10 -Мс/346/03

1 2 3 4 5 6 7 8

N2 N1

Рис. 6 Определение типа вирусной нейраминидазы методом RT - PCR, с праймерами специфичными для N1 и N2 1 - маркер, 2 - Мс/450/03, 3 - Mc/328/ОЗ, 4 - Мс/343/03, 5 -Мс/346/03/ 6 - Мс/450/03, 7 - Мс/328/03, 8 - Мс/328/03/

Далее сравнивали синтез индивидуальных вирусных белков в клетках CACO и MDCK при заражении изолятами С и M Для идентификации синтеза применяли метод ВБ, в котором использовали антитела специфичные для вирусных белков НА, NP, М1 и NS1 Обнаружено, что как в клетках CACO, так и MDCK, зараженных клиническими изолятами вирусов гриппа, выявлялось заметное снижение синтеза вирусного белка М1 относительно белка NP по сравнению с лабораторным вирусом A/Aichi/2/68 В клетках MDCK выявлялась деградация белка NS1 клинических вирусов с образованием низкомолекулярных продуктов Обнаруженный дефицит белка М1 в клетках, инфицированных клиническими вирусами гриппа, мог вести к ограничению их репликации Механизм сниженного синтеза вирусного белка Ml у клинических вирусов пока остается не ясным, однако можно думать о сниженном уровне вторичной транскрипции поздних генов, включая ген M, у клинических изолятов в клетках CACO и MDCK.

В следующей части работы исследовали репликацию клинических вирусов в клетках CACO и MDCK, используя метод иммунных фокусов Культуры клеток CACO и MDCK заражали вирусами, пассированными в культурах CACO (С-вирус) и MDCK (М-вирус), и инкубировали под агарозным покрытием в течение 3 дней, наблюдая за размерами вирусных фокусов Во-первых, оказалось, что клинические изоляты имели различную заражающую способность для клеток человека и собаки Так, С-вирусы были в 102-104 раз инфекционными для клеток CACO, чем MDCK, тогда как М-вирусы практически не имели такой разницы и обладали сходным тропизмом для обеих клеточных культур Во-вторых, изоляты клинических вирусов имели выраженную гетерогенность по способности реплицироваться в клеточных культурах и формировали фокусы различного размера Данный тип гетерогенности был более выраженным у изолятов M В-третьих, лабораторные вирусы, такие как A/Aichi/68 (H3N2) и A/PR/8/34 (H1N1), прошедшие множество пассажей в куриных эмбрионах, не имели клеточной селективности и эффективно размножались в обеих клеточных культурах, образуя большие сходные по размеру фокусы

В следующем разделе исследовали эффективность адсорбции вирусов на рецепторах клеток CACO и MDCK С этой целью получали меченные биотином С- и М-вирусы, которые затем инкубировали с клетками при температуре около О С, чтобы исключить интернализацию адсорбированного вируса в клетки Для оценки адсорбции сравнивали количество вируса на клетках путем окрашивания на биотин Вирусы, пассированные на клетках CACO, характеризовались более высокой адсорбцией на клетках CACO, чем на клетках MDCK, а М-вирусы адсорбировались одинаково эффективно на клетках CACO и MDCK Эти данные показали, что клинические вирусы, пассированные на клетках CACO, сохраняли высокий аффинитет к рецепторам клеток человека, тогда как пассирование кинических вирусов на клетках MDCK приводило к утрате такой селективности Избирательная сорбция С-вируса на клетках CACO коррелировала с его более высокой инфекционностью и тропизмом для этих клеток

Известно, что вариации в уровне адсорбции вирусов гриппа могут быть связаны с различным соотношением рецепторов 2-3 и 2-6 на клетках (Ito et al 2000) На следующем этапе работы исследовали содержание рецепторов в клетках CACO и MDCK Для этого использовали метод селективного связывания пектинов SNA и МАА, специфичных для сиалосодержащих рецепторов типов 2-3 и 2-6, соответственно. Монослой растущих клеток CACO и MDCK инкубировали с предварительно биотинилированными лектннами и затем, для оценки связавшихся лекгинов, клеточный монослой окрашивали на наличие биотина с помощью пероксидазного коньюгата стрептавидина и ТМБ, и оценивали количество окрашенных (позитивных) клеток Обе клеточные культуры, CACO и MDCK, хорошо связывали оба лектина, что указывало на высокий уровень рецепторов обоих типов, 2-3 и 2-6, в данных клетках Оценка соотношения клеток, обогащенных рецепторами 2-3 и 2-6, показала его сходство в культурах CACO и MDCK Фракции клеток, позитивных по рецепторам типа 2-6 и 2-3, составляли 62 и 56% от общей популяции клеток в культуре CACO и 60 и 54% - в культуре MDCK, соответственно Таким образом, обе клеточные культуры богаты рецепторами обоих типов, чтобы обеспечивать высокую адсорбцию вирусов как «птичьего», так и «человеческого» фенотипов Эти данные позволили исключить тривиальное объяснение повышенного аффинитета С-вируса к клеткам CACO по сравнению с MDCK более высокой концентрацией рецепторов типа 2-6

Отсутствие заметных различий в содержании сиаловых рецепторов типа 2-6 в клетках CACO и MDCK позволило думать о том, что разница в адсорбции С и М вирусов на клетках CACO и MDCK обусловлена особенностями поверхностных вирусных белков НА и NA Эти особенности указанных белков могли быть как в белковой, так и в углеводной части молекул Дня проверки роли углеводного компонента белков НА и NA в адсорбционных свойствах вируса использовали прием перекрестного размножения С-вируса в клетках MDCK и М-вируса в культуре CACO Такая смена хозяина приводила к смене углеводного компонента в вирусных белках, поскольку тип гликоэилнрования определяется клеткой-хозяином (Klenk, 1990) После однократного перекрестного пассажа исследовали профиль гемагглютинации вирусов с различными эритроцитами, инфекционность вирусного потомства для клеток CACO и MDCK, а также оценивали количество вновь синтезированного вируса в клеточной среде и на инфицированных клетках Во-первых, в обоих случаях смена хозяина не вызывала заметного изменения профиля гемагглютинации вируса Вирус, пассированный в CACO и имевший «человеческий» фенотип, после однократного размножения в MDCK сохранял прежний профиль, агглютинируя только эритроциты человека Сходным образом М-вирус не изменял свой «птичий» фенотип после размножения в культуре клеток человека CACO и агглютинировал оба вида эритроцитов Таким образом, эти эксперименты показали, что смена типа гликозилирования с «человеческого» на «собачий» и, наоборот, у вирусных белков НА и NA не изменяет адсорбционные свойства вируса Во-вторых, в исследованных клеточных системах отмечалось различное соотношение вируса на клетках и во внеклеточной среде Обращало внимание высокое содержание вируса на клетках MDCK при их заражении вирусом С и формирование мелких фокусов в этой системе Оба наблюдения могут быть логично объяснены слабой нейраминидазой элюцией вируса М с клеток CACO на стадии вирусного почкования и его недостаточным распространением на соседние клетки

Чтобы оценить возможную связь изменений в вирусных белках с выявленными особенностями размножения клинических вирусов гриппа, сравнивали первичную структуру генов НА, NA, М и NS вирусных изолятов, пассированных в клетках CACO и MDCK Выбор данных генов определялся тем обстоятельством, что продукты этих генов взаимодействуют с клеточными факторами в ходе вирусной репликации и, следовательно, могут меняться в первую очередь при адаптации к хозяину Были проанализированы гены штаммов А/Москва/328/2003, А/Москва/343/2003,

А/Москва/346/2003, выделенных от 3-ех пациентов Во-первых, общий анализ гена НА показал наличие12 сайтов 1Ч-гликозилирования в белке НА вируса 328 и 11 - у вирусов 343 и 346, тогда как у вирусов начального этапа эпидемической эры НЗ, начавшейся в 1968 году, таких сайтов в молекуле выявлялось лишь 6 Интересно, что избыточный (12-ый) сайт Авп165 у штамма 328 находился в непосредственной близости к рецепторному участку в молекуле НА и мог влиять на его рецепторные свойства Анализ сайтов в молекуле НА также показал, что 6 новых сайтов (номера с 7 по 12) по сравнению с вирусами 68 года локализованы в зоне антигенных эпигопов А и С (участок аминокислот 122-165) и рецепторного центра (сайты 11 и 12) Из этого наблюдения можно заключить, что эволюционная изменчивость вирусов гриппа человека типа НШ2 идет в направлении увеличения углеводных цепочек, которые, с одной стороны, позволяют вирусу закрываться от вируснейтрализующих антител и, с другой, - изменить рецепторный центр и адаптироваться к клеточным рецепторам в организме-хозяине (рис 7)

Аю№/2/68 Москва/343/03

■ А

■ в

Н с Н D

■ Е

□ РСЦ Щ Глико

■ Мутации

Рис.7. Особенности структуры белка НА московских вирусов гриппа А человека 2003 Третичная структура НА (Wilson 1981) использована в качестве модели А, В, С, D и Е - антигенные сайты Черным указаны сайты гликозипирования в молекулах вируса гриппа A/Aichi/2/68 и /Москва/343/03 в порядке их эволюционного появления

Во-вторых, выявлялся ряд штаммоспецифических замен по сравнению с более ранними штаммами эры НЗ в позициях, которые локализовались в основном в антигенных сайтах А

- Е, что отражало ускользание вируса от иммунного процесса при циркуляции в человеческой популяции В-третьих, при анализе рецепторной области НА, которую образуют аминокислоты в позициях 98, 134-138, 153, 155, 183, 190, 193, 194, 195, 224-229 (Skehel & Wiley, 2000), не обнаружено каких-либо закономерных изменений у изолятов С по сравнению с M В наиболее важных позициях 193, 226 и 228 рецепторного центра выявлялись Ser, Val и Ser, соответственно, что характерно для «человеческого» фенотипа с аффинитетом к сиалорецепторам типа 2-6 (Rogers et al 1983, Conner et al 1994, Matrosovich 1997, Ito et al 2000; Medeiros et al 2004) У изолятов M вируса А/Москва/328/2003 и А/Москва/343/2003 обнаруживалась консервативная замена в рецепторной областиУа1226—»Не по сравнению с изолятом С, и лишь M изолят вируса А/Москва/328/2003 имел замену Lys453-»Glu (рис7)

220 210 240 250

№328 ро QTVIPNIQSR PKVRDVSSRI 8IXMTIVKPO DILLINSTGN

КАЭ28о12 ...............1........................

НА328т12 ........................................

НАЭ43с12 ...............1........................

HX343ml2 ........................................

НА346с12 ........................................

НА346ш12 ........................................

Рис.8 Выравнивание первичной структуры участков 210 - 250 а к изолятов С и M вирусов 328, 343 и 346

В совокупности эти наблюдения позволяют сделать вывод о том, что изменение профиля гемагглютинации при смене хозяина с CACO на MDCK может быть связана не только с изменением рецепторного участка НА, но и обусловливаться другими механизмами в зависимости от штамма вируса

Наиболее заметные изменения были выявлены в первичной структуре гена NA Во-первых, у штамма 328 удалось выявить заметные различия между С и M изолятами Так, изолят M по сравнению с вариантом С имел замены Aspl51—»Glu и Thrl48—»De и, таким образом, лишался сайга N-гликозилирования в позиции Asnl45 Вместе с тем, изоляты штамма 328 в отличие от штаммов 343 и 346 имели замену Asn245—»Ser, ведущую к потере сайта N-гликозилирования, который сохранялся у всех изолятов штаммов 343 и 346 Каких-либо различий между С и M изолятами в гене NA вирусов 343 и 346 не обнаруживалось Во-вторых, у штаммов 343 и 346 обнаруживалась делеция из 66 нуклеотидов в 5'-концевой области, кодирующей ножку нейраминидазы (аминокислоты 36-58) в непосредственной близости к N-концевому якорю липидной мембраны (Рис 9) Эта делеция была идентичной у С и M изолятов штаммов 343 и 346 и выявлялась также в вирусном материале из носоглоточного смыва у всех исследованных штаммов, включая штамм 328, (не показано) У пассажных вариантов вируса А/Москва/328/2003 данной делеции не обнаруживалось и ножка нейраминидазы имела полноценную длину

31 40 50 60 70

№328с12 ТТУТЬНЕКОУ ЕБИБРРШОУ МЬСЕРТИЕЛ Ы1ТЕ1УУЬТН

ИА328т12 ТТУТЬНРКОУ ЕР№РРШ0У МЬСЕРТНЕИ Ы1ТЕ1УУ1/ГО

ЫА346с12 ТТУТЬ----- -----------------1ЕЛ Ы1ТЕ1УУЬТИ

ЫА34бт12 ТТУТЬ----- -----------------ХЕИ Н1ТЕ1УУЬТН

ЫА343с12 ТТУТЬ----- -----------------ШЛ И1ТЕ1УУЬТЫ

№343т12 ТТУТЬ----- -----------------1ЕК н1ТЕ1\пгьта

Рис. 9 Выравнивание первичной структуры участков 31 - 70 а к изолятов С и М вирусов 328,343 и 346 36 - 58а к делеция ножки нейраминидазы у 343 и 346 вирусных изолятов

Факт обнаружения отмеченных мутаций говорит о выраженной гетерогенности штаммов вируса гриппа, циркулирующих у людей в период одной эпидемической вспышки в определенном регионе В-третьих, проведенный анализ показал наличие 10 потенциальных сайтов М-гликозилирования в молекуле NA московских вирусов 2003 года, тогда как у ранних изолятов НЗШ периода 1968 года их количество в КА составляло 5 (рис 10)

А1сЫ/2/68 Москва/343/03

Рис.10. Особенности структуры белка нейраминидазы N2 у С и М изолятов московских вирусов гриппа 2003 г Третичная структура глобулярной части нейраминидазы N2 (Vат^еве е! а1 1983) использована в качестве модели А, В, С -антигенные сайты, красным показаны аминокислотные замены

Таким образом, эволюционное нарастание количества сайтов >1-гликозилирования у вирусов гриппа в человеческой популяции свойственно обоим вирусным гликопротеинам - НА и ХА В-четвертых, у всех клинических изолятов 328, 343

и 346 в 5'-концевой области гена NA обнаружено 7 остатков в поли "U" тракте, который, как известно, направляет синтез поли "А" хвостов на З'-конце вирусных иРНК (Poon et al

1999) Это наиболее длинный поли U-тракт из всех известных у штаммов субтипа H3N2, которые обычно содержали 5-6 остатков U Роль удлиненного поли-U rpaKia в гене NA пока не ясна

Был проведен филогенетический анализ белков НА и NA полученных московских клинических изолятов вируса гриппа H3N2 Как видно, белки НА ранних изолятов (штаммы 343 и 346) и поздних (328) попадают в различные клэйды, что указывает на циркуляцию существенно различных дрейфовых вариантов вируса гриппа H3N2 в течение одной эпидемической вспышки в Московском регионе Интересно отметить, что изолят 328 был близок к эталонному штамму A/Fujian/2002, рекомендованному ВОЗ в качестве вакцинного эталона на период 2002-2004 гт, тогда как штаммы 343 и 346 располагались на дереве, на заметном отдалении от эталона, указывая на их эволюционный дрейф НА московских штаммов 2003 года имел сходство с вирусами 2002-2003 гт, циркулирующими как в Азии (A/Chungham/447/2002, A/Taiwan/2002, 2003, A/Chennam/2002) и Европе (A/Denmark/2003), так и в северной Америке (A/New York/2003, A/Charlottesville/2003) (рис11)

Филогенетическое дерево NA также показало, с одной стороны, - заметный эволюционный дрейф вируса 328 от вирусов 343 и 346, а с другой, - заметное различие пассажных вариантов САСО и MDCK у вируса 328 Белок NA всех трех московских штаммов заметно отличался от таковых у эталонных штаммов ВОЗ - А/Рапаша/99, A/Moscow/99 и A/Wellington/2004 NA московских изолятов была близка таковой азиатских изолятов 2002 г (A/Chennam/2002, A/Daej eon/2002) (рис 12) Близость московских НА и NA более ранним азиатским изолятам говорит о том, что вирус H3N2 пришел в Москву из Азии Полученные данные также наглядно демонстрируют быструю эволюцию поверхностных белков НА и NA у вируса гриппа субтипа H3N2 даже в ходе одной эпидемической вспышки в одном регионе

При сравнении первичной структуры генов M у вирусов 328, 343 и 346 обнаружено различие между M и С изолятами лишь у вируса 343 В позиции 219 основного матриксного белка Ml изолята С содержался Val, а у M - Leu У штаммов 328 и 346 в этой позиции определялся .Ile и Val, соответственно Таким образом, обнаруженные вариации у штамма 343 показывают, что белок Ml также может вовлекаться в процесс адаптации к хозяину Белок ионных каналов М2, транслируемый со второй альтернативной рамки гена М, оказался консервативным и у всех С и M изолятов 3 исследованных штаммов имел полную идентичность Интересно, что в трансмембранной зоне этот белок у всех исследованных вирусов содержал Leu26, Val27, А1а30 и Ser31, которые согласно данным (Suzuki et al 2003) характерны для вирусов гриппа, чувствительных для препаратов амантадинового ряда

Ген NS имел одну вирусоспецифическую штаммовую замену и не имел кпеточно-зависимых вариаций Вариабельной оказалась позиция 207 в СООН-концевой области в близи сайта связывания клеточного фактора РАВ-И в белке NS1, в которой у штамма 328 обнаруживался Asp, а у 343 и 346 -Asn Интересно отметить, что вирусы гриппа H5N1, выделенные от больных в Гонг Конге в 1997 году, имели Asp207, тогда как большинство других вирусов содержат Asn207 в белке NSI (Suarez DL & Perdue, 1998, Kawaoka et al 1998) Белок NEP (NS2), транслируемый со второй альтернативной рамки гена NS, оказался идентичным у всех С и M изолятов вирусов 328, 343 и 346 Эти данные говорят о консервативной природе гена NS и отсутствии вариаций, обусловленных адаптацией к хозяину

Филогенетическое дерево белков гемагглютинина НЗ вируса гриппа А (1 - 328 а.о.НА!)

,Лапд5и/131/04 Лапд5и/76/04 N ера 1/1713/04 Ыотоау/70/05 Ыера1/1660/04 641 ■ Са1/Л>гша/7/04(се11-ра55адес1) I-■ Са1г1от1аЯ/04(вдд-ра55адвс1)

- иоЬаппвзЬигд/2/04

54 1-

'Тэт

-■ \Л/е111пд№п/1/04

СЬаНоИевуШе/ОЗЛМ Та1\лгап/7099/03

-Л1ея'апд/81/03

Ме\«Уогк/31/04 - 0ептагк/07/03

• Рилап/411/02 СИипдпат/447/02 И1Мс11еЬигд/45/03 661 Овптагк/14-2/03 ^ Nвw Уогк/30/03 А Мовсо\«/328/03(с12) А Мо8с<т/328/03(т6)

А Moscow/328/03(cб)

АМо5С<т/328/03(т12) Ргв1опа/17/03 Taiwan/0S83/03 Тамгап/4963/02 А Мо8соуу/343/03(\у) А Moscow/343/03(m8)

А Мо5соуу/34в/03(т12) А Мо5сому/343/03(с8) Ц А 1Иовсою/343/03(т12) А Moscow/343/03(c12) ^ А Moscow/346/03(c12)

- СИеоппат/340/02

ГТ

эз[ 0оптагк/13/03

■ Ргапсв/1/00 '-• Рапата/2007/99

Референс штаммы ВОЗ 2004-2005/2006

Иэоляты. полученные в работе

Референс штаммы ВОЗ 1999/2002

Рис. 11.

Филогенетическое дерево гемагглютинина НЗ

Филогенетическое дерево белков нейраминидазы N2 вируса гриппа А (58 -447 а.о.)

Референс штаммы ВОЗ 2004/2005

Изоляты, полученные в работе

Референс штаммы ВОЗ 1999/2002

Singapore/36/04 Japan/120/04 —• Wellington/1/04 Brazil/1759/04 Argentina/126/04 |—Norway/807/04 Hong Kong/2982/04 Norway/70/05 A Moscow/328/03(m12)

_6£|-*

~1-1

— Pusan/504/02 A. Moscow/346/03(m12) ▲Moscow/343/03(m12) ▲Moscow/346/03(c12) AMoscow/343/03(c12) Daejeon/258/02 Denmark/24/03 ▲Moscow/328/03(c12) Chungnam/447/02 — Kwangju/219/02 — Kwangju/243/02 Hong Kong/1179/99(MDCK isolate) p New York/150/2000 -New York/161/99

Denmark/22511/98

Hong Kong/1144/99(Vero isolate) Ф Moscow/10/99

Рис. 12. Филогенетическое дерево нейраминидазы N2

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Роль протеолитического расщепления вирусного гемагглютинина в клетках САСО-2 для многоцикловой репликации вируса гриппа А человека.

Результатами настоящей работы нами установлено, что в клетках САСО-2 у вирусов гриппа А человека, имеющих поверхностный гликопротеин НА с единичным остатком Arg в протеолитическом сайте, может осуществляться внутриклеточное расщепление НАО—» НА 1/2 САСО-2 - культура клеток человека, вполне пригодна для культивирования вируса гриппа человека Линия САСО-2, в которой часть клеток, после образования полного монослоя, может приобрести признаки дифференцировки, происходит из аденокарциномы толстого кишечника человека Наши исследования доказывают возможность внутриклеточного протеолиза НАО с моноаргининовым протеосайтом в эпителиальных клетках кишечника Не исключено, что сходное внутриклеточное расщепление НАО вирусов гриппа А человека может происходить и в клетках респираторного эпителия человека

Расщепление вирусного гликопротеина НА и сопутствующая этому процессу активация вируса в культуре САСО-2 приводит к эффективной многоцикловой репликации вируса в этой культуре Это свойство позволяет исключить искусственное добавление трипсина к клеткам для продуктивного размножения вируса и делает человеческую культуру клеток САСО-2 весьма полезной для получения клинических изолятов вируса гриппа от больных людей, для экспериментов с получением вирусных вариантов методом «обратной генетики», для титрования вирусов методом бляшек или иммунных фокусов и т п

Результаты, полученные в нашей работе, показали, что расщепление моноаргининового сайта НАО —»HA1/HA2 может осуществляться в клетках на поздних этапах транспорта гликопротеинов в транс-Гольджи и/или в зоне плазматической мембраны В этом аспекте уместно отметить, что гемагглютинины Н5 и Н7 с полиаргининовым протеосайтом расщепляются в большинстве типов клеток протеиназой серинового типа из семейства субтилизина, циркулирующей между транс-Гольджи и плазматической мембраной Таким образом, можно думать, что в ряде типов эпителиальных клеток, таких как САСО-2, процесс протеолиза НАО —i►НА1/НА2 у вирусов с моно- и полиаргининовыми гемагглютининами может осуществляться сходным образом на поздних этапах внутриклеточного транспорта из транс-Гольджи в плазматическую мембрану Таким образом, можно предположить, что эпителиальные клетки слизистых оболочек содержат протеиназу, способную внутриклеточно активировать белок НА вирусов гриппа человека и подобно субтилизиновым протеиназам локализоваться и циркулировать между транс-Гольджи и плазматической мембраной Однако, в отличие от субтилизинов, такая протеиназа должна иметь специфичность к сайтам с единичным Arg

Роль апротинина в ингибировании внутриклеточного протеолиза НАО —»HA1/HA2 у вирусов гриппа в культуре клеток САСО-2.

Известно о возможности лечения гриппозной инфекции посредством ингибирования протеолиза вирусного белка НАО и подавления активации вируса в инфицированном организме (Жирнов 1983) Перспективным антигриппозным ингибитором представлялся апротинин, который является официальным препаратом и разрешен для применения у людей (Zhirnov, Kirzhner et al, 1996) Результаты нашей работы показывают заметную активность апротинина по ингибированию внутриклеточного протеолиза НАО—»HA1/HA2 у вирусов гриппа человека в культуре

эпителиальных клеток САСО-2, что согласуется с данными о лечебном эффекте апротинина у людей и животных при гриппе (Zhirnov et al, 1996)

2. В клетках САСО-2 при инфекции вирусом гриппа наблюдается некроз.

Известно, что вирусы гриппа вызывают гибель клеток на поздних сроках инфекции по механизму апоптоза (Takisawa et al ,1993), (Hinshaw, Olsen et al, 1994) В настоящей работе показано, что клетки САСО-2 резистентны к апоптозу, индуцированному вирусами гриппа А человека Даже через 72 ч после заражения вирусом гриппа, при явной гибели и распаде клеточного монослоя, в них не обнаруживались такие признаки апоптоза, как фрагментация хромосомной ДНК, активация каспаз и накопление апоптозного белка aNP Более того, инфицированные клетки САСО-2 были высокопроницаемыми и восприимчивыми для окраски ядерной ДНК пропидиумом иодида, что указывало на некротический механизм гибели САСО-2 при гриппозной инфекции Ранее была описана культура эпителиальных клеток лёгочной ткани свиньи (линия SJPL), проявляющая подобно САСО-2 устойчивость к апоптозу при инфекции вирусом гриппа и вызывала признаки некроза при гибели на поздних сроках инфекции (Seo et al, 2001) Механизмы устойчивости клеток САСО-2 и SJPL к апоптозу, так же как и механизм некротической гибели клеток при инфекции вирусом гриппа, пока остаются неясными и будут предметом дальнейшего исследования

3. Основные характеристики клинических изолятов вируса гриппа А человека, выделенных in vitro при пассировании в клеточных культурах САСО-2 и MDCK.

В настоящей работе изучалась культура эпителиальных клеток кишечника человека (САСО-2) в плане ее чувствительности для клинических вирусов гриппа Клетки этой культуры имеют свойства энтероцитов и характеристики дифференцированного эпителия, такие как секреторная активность и формирование секреторных куполов, появление поверхностных микроворсин и микроворсинчатой каймы, экспрессия ферментов микроворсинчатого слоя (сукразы, щелочной фосфатазы и др) (Pinto et al 1983, Vachon et al 1992) Линия САСО-2 - это практически первая культура клеток человека, в которой обнаружено хорошее размножение вирусов гриппа без добавления экзогенного трипсина (Yoshina et al 1998,) Недавно сообщалось, что линия печеночных клеток человека, Hep-2G, также восприимчива для клинических вирусов гриппа человека (Ollier et al 2004) Исследованные ранее клеточные культуры человека, такие как HeLa, А-549, линия 293 и др, во-первых, имели дефекты на этапах сборки вирионов, не позволяющие получать высоких урожаев вируса, и, во-вторых, не содержали вирус-активирующей протеазы и не поддерживали многоцикловую репродукцию вирусов гриппа (Conti et al 1980, Ter Meulen 1967) Отмеченные особенности клеток САСО-2 позволили изолировать вирусы гриппа человека от больных людей с большей эффективностью, чем в MDCK и куриных эмбрионах, обычно используемых для этих целей Более того, размножение вирусов гриппа в клетках кишечного эпителия человека позволяет предположить, что эпителий кишечника может поддерживать репликацию вируса и вовлекаться в патогенез гриппа в организме человека, вызывая кишечный синдром

При исследовании клинических изолятов нами идентифицированы в основном штаммы вируса гриппа А типа H3N2, которые имели сходный фенотип агглютинации различных эритроцитов Такая популяционная гомогенность клинических вирусов H3N2 согласуется с наблюдениями других авторов (Ito et al 1997, Nobusawa et al 2000, Mederios et al 2001, Romanova et al 2003, Ivanova et al 2004) Напротив, согласно имеющимся данным популяция вирусов гриппа H1N1, изолированных от людей, характеризовались

гетерогенностью их гемагтлютинирующих признаков Первичные клинические изоляты H1N1 имели все три возможных эритроцитарных фенотипа «О», «Д» и смешанный «О/Д» фенотип, при котором одинаково эффективно агглютинировали эритроциты как курицы, так и человека (Azzi et al, 1999) Наши данные об изоляции на человеческих клетках САСО-2 штамма А/Москва/450/2003 (H1N1), лучше агглютинирующего эритроциты курицы, чем человека и классифицированного как вирус «Д» фенотипа, согласуется с предположением о гетерогенности человеческой популяции вируса гриппа H1N1 Популяционная гетерогенность вирусов HI может быть обусловлена менее строгой рестрикцией рецепции вирусного белка НА типа HI на рецепторах различных клеток-мишеней по сравнению с таковой у белка НЗ

Культура клеток человека САСО-2 имела повышенную чувствительность для изолятов, пассированных в этой культуре клеток, по сравнению с таковыми, пассированными в культуре клеток собаки Такой тропизм изолятов С согласуется с более успешным выделением вирусов от больных гриппом людей на клетках САСО-2, однако механизм, лежащий в ее основе, пока ясен не полностью Сравнительный анализ генов НА, NA и М у вирусных изолятов С и М штаммов 328, 343 и 346 показал отсутствие общих для изолятов С мутаций, которые позволяли бы сделать заключение об универсальном механизме изменений, ведущих к усилению тропизма этих изолятов к клеткам CACO Лишь у штамма 328 обнаружена специфичная для изолята С мутация Ile226—»Val в рецепторной области белка НА, которая сопровождалась сменой фенотипа «О» —>«Д» С учетом этих данных более логичным кажется предположение о том, что механизм повышенного тропизма к клеткам человека, в частности CACO, может быть, с одной стороны, полигенным, а с другой, - специфичным для вирусного штамма

Один из механизмов высокой чувствительности САСО-2 к изолятам С по сравнению с MDCK заключался в более высокой адсорбции вируса на этих клетках Такое повышение не было связано с количественными различиями в содержании сиало-содержащих рецепторов типа 2-6 или 2-3 в клетках САСО-2, так как клетки MDCK и САСО-2 практически не различались по этому параметру Во-первых, это говорит об участии в рецепции вируса на клетках-мишенях не только терминальных остатков сиаловой кислоты в клеточном рецепторе, но и его окружения Это окружение может состоять из карбогидратных цепочек и белковой части самого рецептора и/или существования второго клеточного корецептора, как это имеет место у вируса ВИЧ (Weiss 2002) Такое предположение согласуется с данными других авторов, полученными в опытах in vivo на клетках с измененным гликозилированием (Shu &Whittaker, 2004) и in vitro с синтетическими рецепторами (Garnbaryan et al 2005), также подтверждающими роль белковой части и внутренних остатков карбогидратных цепочек самого клеточного рецептора в адсорбции вирусов гриппа Во-вторых, наблюдение о повышенной адсорбции на клетках CACO позволяют заключить, что структурные особенности рецепторов в клетках CACO более благоприятны, чем у клеток MDCK для адсорбции и последующего размножения клинических вирусов человека субгипа H3N2

Помимо адекватной структуры клеточного рецептора на адсорбцию вируса гриппа существенное влияние оказывают структурные особенности вирусного гемагглютинина В частности, сообщалось о том, что углеводная часть молекулы НА может вовлекаться в регуляцию процесса адсорбции вируса Сравнивая свойства вирусов гриппа субтипа H3N2, пассированных в клетках MDCK и обезьяньих клетках VERO, авторы установили, что смена хозяина и вместе с этим типа гликозилирования НА изменяла свойство вируса агглютинировать эритрощггы курицы Напротив, наши данные показали, что перекрестное размножение С и М изолятов в гетерологичных клетках MDCK и CACO, ведущее к смене гликозилирования, не изменяло профиль гемадсорбции вирусных штаммов Такое расхождение результатов, могло быть обусловлено различиями гликозилирования в фибробластных клетках обезьяны VERO (Romanova et al 2003) по сравнению с эпителиальными клетками человека CACO в нашей работе Таким образом,

как следует из наших данных, не во всех случаях клеточная специфичность гликозилирования вирусных белков оказывает заметное влияние на

гемагглютинирующие свойства вируса С другой стороны, интересно обратить внимание на близость двух углеводных сайтов (Asnl33 и Asnl44) к рецепторному центру в глобулярной области белка НА, которые появились у современных вирусов H3N2 Такое соседство может влиять на рецепторную специфичность вирусных штаммов и делать его более специализированным по отношению к рецепторам клеток человека Такое предположение хорошо согласуется с нашими результатами о более эффективном изолировании клинических вирусов на клетках САСО-2 и их более высоком тропизме для этих клеток по сравнению с культурой собачьих клеток MDCK

Помимо белка НА, другим вирусным фактором, определяющим повышенный тропизм клинических вирусов к клеткам САСО-2 может быть вирусная нейраминидаза Имеются данные об участии этого белка в кооперации с вирусным НА при взаимодействии вируса с клеточными рецепторами (Wagner et al 2002) и антивирусными сиало-содержащими ингибиторами (Bumet et al 1948, Gottschalk et al 1972) В настоящей работе мы обнаружили в гене NA у штамма 328 MDCK-специфическую мутацию Thel58—>11е, которая вела к утрате сайта гликозилирования у изолята M Наличие такой клеточно-зависимой мутации указывает на возможность участия NA в адаптации к хозяину С другой стороны, у штаммов 343 и 346 обнаружена деления ножки NA, которая, сохранялась как у С, так и у M изолятов, по сравнению со штаммом 328, у которого NA имела полную длину Важно отметить, что в респираторном тракте больных людей у всех 7 московских изолятов вируса гриппа H3N2 обнаруживалась нейраминидаза с делегированной ножкой Такая деления, как известно, ведет к укорочению ножки NA и может влиять на ее функцию особенно при взаимодействии с высокомолекулярными рецепторами (Els et al 1985) Можно лишь предположить, что укороченная NA у штаммов 343 и 346, сохраняющаяся при пассировании в клетках, по-видимому, способствовала более легкой адаптации данных клинических вирусов как к клеткам САСО-2, так и MDCK У этих штаммов не отмечалось заметных адаптационных изменений в генах NA и НА и их белках, функционирующих, как известно, в тесной кооперации (Wagner et al 2002)

Ранее у ряда лабораторных вариантов вирусов гриппа птиц и человека также выявлялось укорочение нейраминидазной ножки, которое, во-первых, вело к изменению функциональной активности NA (Els et al 1985, Castrucci & Kawaoka, 1993, Luo et al 1993, Baiget & McCauley, 2001, Liu et al 1995), и, во-вторых, y птичьих вирусов могло быть сцеплено с компенсаторным приобретением дополнительного сайта гликозилирования в белке НА в положении 158, которое соответствует положению 165 у НЗ (Matrosovich et al 1999) Наши данные показали существенное отличие этих характеристик у вирусов гриппа человека субтипа НЗ Во-первых, укорочение ножки NA московских штаммов сопровождалось не приобретением, а потерей сайта гликозилирования (Asnl65) в белке НА и, во-вторых, сопровождалось приобретением дополнительного сайта гликозилирования в самой NA в области рецепторного центра (Asn245) Такие различия, вероятно, отражали иной механизм адаптационной изменчивости и компенсаторной интеграции комплекса HA-NA у вирусов гриппа, циркулирующих в популяции людей, по сравнению с вирусами гриппа, циркулирующими у птиц

Анализ биологических свойств и структуры генов трех штаммов 328, 343 и 346 субтипа H3N2, выделенных в период одной эпидемической вспышки гриппа, показал выраженную гетерогенность вирусной популяции как в структурном плане по вариабельности генов НА, NA, M и NS, так и в функциональном плане по способности реплицироваться в клеточных культурах Вполне очевидно, что такая эпидемическая вариабельность вируса могла изменять его вирулентность для человека и влиять на тяжесть заболевания у различных пациентов Помимо этого, были обнаружены и более

общие закономерности эволюционной изменчивости вирусов в человеческой популяции Общее правило состоит в том, что вирусы гриппа по мере эволюции в популяции людей увеличивают количество сайтов гликозилирования у поверхностных вирусных белков НА и NA, против которых, как известно, в первую очередь формируется иммунный ответ организма В настоящее время количество сайтов составляет 12 для НА и 10 - для NA, тогда как в начале эры НЗ в 1968 году их количество составляло 6 и 5, соответственно Такое увеличение углеводной оболочки, имеющей специфичность организма-хозяина (Klenk 1990), у гликопротеинов НА и NA способствует мимикрии вируса и делает эти белки менее уязвимыми для антител, способствуя ускользанию вируса от иммунной реакции в инфицированном организме Эволюционная тенденция к гипергликозилированию у вируса гриппа сближает его с вирусом СПИД, у которого поверхностный гликопротеин GP имеет около 25 сайтов гликозилирования, затрудняющих его уязвимость для гуморального иммунитета (Wei et al 2003) Более того, такая эволюция вируса гриппа таит угрозу понижения в скором будущем эффективности используемых противогриппозных вакцин, сделанных на основе убитого вируса или его поверхностных белков (расщепленная вакцина) Наличие массивного карбогидратного панциря хозяйской специфичности у вирусных гликопротеидов НА и NA сведет к минимуму выработку антител против белковой части этих молекул - основных мишеней противовирусного иммунитета - и может заметно снизить противовирусный эффект вакцин

ВЫВОДЫ.

1 Впервые в культуре перевиваемых эпителиальных клеток, производных аденокарциномы толстого кишечника человека (САСО-2) обнаружено внутриклеточное расщепление НАО—»НА1/НА2 у вируса гриппа А человека, содержащего единичный аргинин в протеолитическом сайте НА, и синтез активированного вируса

2 Установлено, что протеолиз НАО —» НА1/НА2 под действием клеточной протеазы происходит на поздних этапах внутриклеточного транспорта из зоны транс-Гольджи в плазматическую мембрану клеток.

3 Протеолиз вирусного гликопротеина НАО в CACO - 2 подавляется апротинином - природным ингибитором сериновых протеаз

4 Впервые показано, что клетки САСО-2, зараженные вирусом гриппа, резистентны к апоптозу и погибают по некротическому механизму.

5 Обнаружено, что клетки САСО-2 более восприимчивы для современных клинических вирусов гриппа, чем клетки MDCK и куриные эмбрионы.

6 Методом специфической сорбции лектинов SNA и ММА выявлено сходное содержание рецепторов типа 2-3 и 2-6 в клеточных культурах CACO и MDCK

7 Анализ первичной структуры генов НА и NA московских изолятов вируса гриппа человека H3N2 2003г показал (1) увеличение количества сайтов гликозилирования по сравнению с аналогичными изолятами 68-70 гг, (2) делецию 66 нуклеотидов (22 аминокислот) в стеблевом регионе гена NA у всех клинических изолятов субтипа H3N2 Данные помещены в Генбанк под номерами DQ066936, DQ066937, DQ 086157-DQ086161, DQ089634-DQ089639, DQ090706-DQ090710, DQ091199, DQ096580, DQ096261 -096265, DQ098266-098269, DQ100422-100424

8 Секвенирование гена М московских вирусов H3N2 показало, что они кодируют белок М2, чувствительный к препаратам амантадинового ряда

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1 I V Vorobjeva, А V Ovcharenko, Н D Klenk and О Р Zhirnov Influenza virus hemagglutinin cleavage and infectivity activation occur in human intestinal CACO - 2 cells Тезисы XII International Conference on Negative Strand Viruses June 14-19, 2003 Pisa, Italy 228.

2 Жирнов О П, Воробьева И В , Веселовский Е М, Кленк X Д Ключевая роль Asp 16 в протеолизе NP белка вируса гриппа А каспазами в зараженных клетках Вопросы вирусологии 2003,ноябрь-декабрь, 48(6) 8-14

3 Жирнов О П, Воробьева И В , Овчаренко А В , Кленк X Д Внутриклеточное расщепление гемагглютинина вируса гриппа А человека и его ингибирование Биохимия 2003, том 68, вып 9, с 1247- 1255

4 Жирнов О П, Воробьева И В , Сафонова О А , Малышев Н А, Овчаренко А В , Анхлан Д, Кленк Н Д Биохимические особенности размножения клинических вирусов гриппа в перевиваемой культуре клеток кишечника человека Биохимия 2005, (в печати)

Благодарности.

Автор выражает благодарность своему научному руководителю, д б н , проф О П Жирнову за предоставленную возможность проведения настоящего исследования, интересно поставленные задачи, внимание и поддержку Автор благодарит проф НА Малышева и О А Сафонову за сотрудничество в изучении клинических материалов и помощь в проведении работы Автор выражает глубокую признательность проф Львову Н Д за ценные замечания и проф Гараеву М М за помощь в проведении секвенирования и благодарность всем сотрудникам лаборатории вирусного патогенеза Конаковой Т Е , Овчаренко А В и Назаровой П Г за помощь в работе, Пояркову С В за консультации в изучении вирусных последовательностей, и Шапошниковой И Ю за поддержку

Для заметок

4

V.

Заказ Ыа 1791 Подписано в печать 28.09.05 Тираж 100 экз Усл. п.л.0,96

¡^^, ООО "Цифровичок", тел. (095) 797-75-76 1 www.cfr.ru ; е-тай:info@cfr.ru

is 21 О 8 2

РНБ Русски Л фонд

2006-4 18570

«

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Воробьева, Ирина Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ стр.

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СЕМЕЙСТВА

ОгШотух(тпс1ае.

1.1. Основные признаки и классификация семейства.

1.2.Общая молекулярно-биологическая характеристика вирусов гриппа.

1.3. Медико-социальное значение изучения молекулярных основ репликации вируса гриппа.

ГЛАВА 2. СТРУКТУРА ВИРУСА ГРИППА А ЧЕЛОВЕКА.

2.1.Морфология и химический состав вирионов.

2.2. Строение и функции РНК-генома и полипептидный состав вируса гриппа А. :

2.3. А. Структура и функции гемагглютинина вируса гриппа А. 16 Б. Структура и функции нейраминидазы вируса гриппа А.

ГЛАВА 3. РЕПЛИКАЦИЯ ВИРУСА ГРИППА А ЧЕЛОВЕКА.

3.1. Адсорбция и проникновение вируса в клетки — мишени.

3.2.Внутриклеточная репликация вируса 30 А.Транскрипция и репликация вирусных РНК.

Б. Внутриклеточный транспорт вирусных РНП в инфицированных клетках.

3.3. Сборка и почкование вирусных частиц.

3.4. Цитопатическое действие вируса и механизмы гибели клеток.

3.5. Участие клеточных факторов в репликации вируса гриппа А. 37 А. Вирус-индуцированные клеточные факторы. 39 Б. Размножение вируса гриппа А в различных клеточных культурах.

В. Роль специфического взаимодействия с клеточными рецепторами и клеточный тропизм вируса.

ГЛАВА 4. КРУГ ХОЗЯЕВ ВИРУСА ГРИППА А.

4.1. Гриппозная инфекция у различных видов животных. £

А. Вирус гриппа в популяции птиц.

Б. Вирус гриппа в популяции людей.

ЧАСТЬ 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ.

2.1. Многоцикловая репликация вирусов гриппа А человека в культуре клеток CACO — 2; протеолитическое расщепление вирусного гемагглютинина в клетках CACO — 2 и его ингибирование апротинином.

2.2. Некроз клеток САСО-2 при инфекции вирусом гриппа.

2.3. Выделение клинических изолятов вируса гриппа А человека в культуре клеток CACO — 2 и их биологическая характеристика.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ юб

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней"

Грипп - массовое инфекционное заболевание вирусной этиологии, имеющее глобальное распространение - продолжает оставаться неуправляемым процессом. Исключительная вариабельность поверхностных антигенов - гемагглюгинина и нейраминидазы - у различных штаммов вируса гриппа объясняет недостаточную эффективность противогриппозных вакцин. Широкая распространённость гриппа среди людей, домашних и диких животных, высокая контагиозная и инвазионная активность возбудителя, а, вследствие этого, масштабность и стремительное распространение заболевания среди восприимчивой прослойки населения, огромный экономический ущерб и отсутствие радикальных специфических противогриппозных средств защиты — основные причины, определяющие актуальность проблемы гриппа.

Свойство вируса - использовать для своего размножения аппарат клетки — хозяина - является препятствием в создании препаратов, избирательно угнетающих виэ)с и не повреждающих клетку. Вполне понятно, что успешное решение проблемы по преодолению вирусных инфекций определяется уровнем фундаментальных исследований по молекулярной биологии вируса и механизмов его взаимодействия с клеточным аппаратом. Применение новейших методов молекулярной генетики, таких как: генная инженерия, обратная генетика и сайт специфический мутагенез в изучении вируса гриппа существенно расширило паши представления о структуре вируса гриппа и механизмах репликации, о функциях отдельных вирусных белков и их взаимодейс вии с клеточными факторами. Проведение таких исследований позволяет лучше понять механизмы патогенеза, лежащие в основе инфекционного процесса при гриппе и конструировать пути антигриппозной стратегии.

Объектом исследования в настоящей диссертационной работе служили вирусы гриппа А человека и клетки, инфицированные этим вирусом. Изучено внутриклеточное расщепление гемагглютинина вируса гриппа А человека клеточной протеиназой, вызывающее активирование вируса и его многоцикловую репродукцию в культуре клеток человека. Изучены биохимические особенности и свойства клинических вирусов гриппа при размножении в перевиваемой культуре клеток человека.

Существуют различные клеточные линии для культивирования вирусов гриппа. Однако ни одна из используемых клеточных линий не обеспечивала многоцикловую репликацию вируса без дополнительного внесения экзогенного трипсина.

Более того, размножение вируса в таких системах нечеловеческого происхождения вызывало изменение свойств вируса гриппа. Поэтому поиск системы человеческого происхождения представлял интерес.

Особое внимание было уделено клеточной линии CACO - 2, полученной из умереннодифференцированной аденокарциномы толстого кишечника человека. Так как эта линия клеток была выделена из опухоли человека, она оказалась превосходной моделью для культивирования человеческих вирусов. Аденогенные клетки толстого кишечника имеют цитоморфологическое сходство и близость клеточных рецепторов с бокаловидными клетками эпителия респираторного тракта человека, что повышало интерес данного исследования. При заражении клеток вирусом гриппа А человека в клетках развивался некроз, в то время как в других клеточных линиях нечеловеческого происхождения вирус гриппа А вызывал апоптоз.

Установлено, что культура эпителиальных клеток аденокарциномы толстого кишечника человека (линия САСО-2) - это высокочувствительная культура клеток человека, где хорошо реплицируются вирусы гриппа и не требуется добавления экзогенного трипсина для поддержания многоцикловой репродукции вируса. Ранее исследованные клеточные культуры, такие как HeLa, А-293 и др., имели дефекты на этапах сборки вирионов и не содержали IAP - протеазы. поэтому для поддержания многоцикловой репродукции вируса требовалось добавление трипсина. Появлеп.е клеточной культуры САСО-2 сделало возможным изоляцию клинических вирусов гриппа от больных людей с сохранением исходных генетических и фенотипических признаков вируса, свойственных вирусам гриппа человека. Более того, как показывают наши наблюдения, эффективность выделения вирусов от больных людей в клеточной культуре САСО-2 оказалась более высокой, чем в других, используемых для этих целей, системах, таких как, клетки MDCK или куриные эмбрионы. Это наблюдение, как мы считаем, объясняется близостью клеточных рецепторов в респираторном тракте человека и клетках САСО-2.

ЦЕЛЬ НАСТОЯЩЕЙ РАБОТЫ.

Цель настоящей работы заключалась в изучении механизмов протеолиза гемагглютинина вируса гриппа А человека в инфицированных клетках: определении природы внутриклеточных протеиназ, участвующих в механизме его расщепления, а также изучение репликации вируса гриппа А человека и механизмов клеточной гибели в культуре CACO - 2. имеющей человеческое происхождение, и сравнительного анализа размножения вируса гриппа А человека в культурах клеток человека (CACO - 2) и собаки (MDCK), а также механизмов вирусного апоптоза и некроза.

ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

1. Изучить возможность внутриклеточного протеолиза гемагглютинина с единичным аргинином в протеолитическом сайте у вирусов гриппа А человека в культуре клеток CACO- 2.

2. Определить локализацию протеолиза гемагглютинина вируса гриппа А человека в заражённых клетках CACO - 2 .

3. Установить возможности ингибирования внутриклсточного протеолиза.

4. Исследовать механизмы гибели клеток CACO - 2 при заражении их вирусом гриппа А человека.

5. Провести сравнительный анализ биологических и структурных свойств клинических вирусов гриппа А человека при размножении в культуре клеток человека (линия CACO - 2).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Проведено сравнение репродукции и биологических свойств вируса гриппа А человека при пассировании на клетках MDCK и в эпителиальных клетках, производных аденокарциномы толстого кишечника человека (CACO - 2) и установили преимущество использования этой высокочувствительной клеточной культуры для изучения биологических свойств вируса гриппа А человека. Впервые исследованы механизмы гибели клеток CACO - 2 при заражении их вирусом гриппа А человека. Впервые определили, что в клетках аденокарциномы происходит внутриклеточное расщепление молекулы гемагглютинина с единичным остатком аргинина в протеолитическом сайте при инфицировании вирусом гриппа А человека без добавления трипсина.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

Полученные нами результаты важны для понимания молекулярных механизмов, протекающих в клетках, инфицированных вирусом гриппа А человека, и для обогащения наших знаний о биологических свойствах вируса и клетки. С учётом этой новой информации возможны предпосылки для создания новых противогриппозных препаратов на основе антипротеазных ингибиторов, способных специфически блокировать внутриклеточный протеолиз вирусных белков.

Положения, выносимые на защиту.

1. Клеточная культура аденокарциномы человека высоковосприимчива к вирусам гриппа А (линия CACO - 2).

2. Клеточная культура аденокарциномы человека поддерживает многоцикловую инфекцию без добавления трипсина (линия CACO - 2).

3. В клетках аденокарциномы происходит внутриклеточное расщепление молекулы гемагглюгинина с единичным остатком аргинина в протеолитическом сайте.

4. Клетки аденокарциномы человека погибают некрозом при заражении вирусом гриппа А.

5. Клеточная культура CACO была более восприимчивой для клинических вирусов (вирусы, полученные от больных людей), чем клетки МДСК.

6. В процессе эволюции вируса H3N2 идёт увеличение сайтов гликозилирования, что даёт вирусу возможность ускользать от вируснейтрализующих антител, изменять рецептор! 1ые и адаптационные свойства.

Публикации и апробация работы. Полученные в ходе работы данные представлялись на 12 Международной конференции по негативно - нитевым вирусам (14 - 19 июня 2003 г. Пиза, Италия), а также опубликованы в журналах «Биохимия» и «Вопросы вирусологии».

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Воробьева, Ирина Валерьевна

выводы.

1. Впервые в культуре перевиваемых эпителиальных клеток, производных аденокарциномы толстого кишечника человека (САСО-2) обнаружено внутриклеточное расщепление НАО—»-HA1/HA2 у вируса гриппа А человека, содержащего единичный аргинин в протеолитическом сайге НА, и синтез активирозанного вируса.

2. Установлено, что протеолиз НАО —> НА1/НА2 под действием клеточной протеазы происходит на поздних этапах внутриклеточного транспорта из зоны транс-Гольджи в плазматическую мембрану клеток.

3. Протеолиз вирусного гликопротеина НАО в CACO - 2 подавляется апротинином - природным ингибитором сериновых протеаз.

4. Впервые показано, что клетки САСО-2, зараженные вирусом григпд. резистентны к апоптозу и погибают по некротическому механизму.

5. Обнаружено, что клетки САСО-2 более восприимчивы для современных клинических вирусов гриппа, чем клетки MDCK и куриные эмбрионы.

6. Методом специфической сорбции лектинов SNA и ММА выявлено сходное содержание рецепторов типа 2-3 и 2-6 в клеточных культурах CACO и MDCK.

7. Анализ первичной структуры генов НА и NA московских изолятов вируса гриппа человека H3N2 2003г. показал (1) увеличение количества сайтов гликозилирования по сравнению с аналогичными изолятами 68-70 гг., (2) делецию 66 нуклеотидов (22 аминокислот) в стеблевом регионе гена NA у всех клинических изолятов субтипа H3N2. Данные помещены в Генбанк под номерами DQ066936; DQ066937; DQ 086157-DQ086161; DQ089634-DQ089639; DQ090706-DQ090710; DQ091199; DQ096580; DQ096261-096265; DQ098266-098269; DQ100422-100424.

8. Секвенирование гена М московских вирусов H3N2 показало, что они кодируют белок М2, чувствительный к препаратам амантадинового ряда.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Воробьева, Ирина Валерьевна, Москва

1. Жирнов О.П. Молекулярные механизмы протеолитического процессинга вирусных белков. Молекулярная биология 1988, 22: 581-600

2. Жирнов О.П. Белки вируса гриппа: получение растворимого полипептида М1 посредством поэтапной депротеинизации вирионов. Молекулярная биология 1991,25. 375-379

3. Каверин Н. В., Смирнов Ю.А. Межвидовая трансмиссия вирусов гриппа А и проблема пандемий. Обзор. Вопросы вирусологии 2003г

4. Лобанова Т. П., Кихтенко Н. В. Обзор «Птичий грипп» 2004. www://Molbiol.ru/rcview/0.3-0.4.html

5. АМН СССР Патологоанатомическая диагностика опухолей человека. Руководство под редакцией академика АМН СССР проф. Краевского. Москва Медицина. 1982.

6. АМН СССР Цитологическая диагностика опухолей и предопухолевых процессов. Под редакцией проф. Петровой А. С. Москва Медицина 1985.

7. Максимова JT.B. Цитологическая диагностика опухолевых заболеваний толстой кишки. ГНЦ Колопроктологии МЗ России. Москва 1993

8. Гистология. Под редакцией Ю.И. Афанасьева, Н.А. Юриной Москва Медицина 1989.

9. Allen Н, McCauley J, Waterfield М, Gething MJ. Influenza vims RNA segment 7 has the coding capacity for two polypeptides. Virology- 1980;107:548-551a.

10. Apostolov K, Flewett TH. Internal structure of influenza virus. Virology 1965;26:506-508

11. Baigent SJ, McCauley JW. Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture. Virus Res 2001; 79: 177-185.

12. Baigent SJ, McCauley JW Influenza type A in humans, mammals and birds: determinants of virus virulence, host-range and interspecies transmission BioEssays 25: 657-671 2003.

13. Banks J. Speidel ES, Moore E, et al. Changes in the haemagglutinin and the neuraminidase genes prior to the emergence of highly pathogenic H7NI avian influenza viruses in Italy. Arch Virol 2001; 146:

14. Balachandran, S„ Kim, C.N., Yeh, W.C., Mak, T.W., Bhalla, K.and Barber. G.N. (1998) Activation of the dsRNA-dependentprotein kinase. PKR, induces apoptosis through FADD-mediateddeath signalling. EMBO J. 17, 6888-6902.

15. Bizebard T, Gigant B, Rigolet P, et al. Structure of influenza virus haemagglutinin complexed with a neutralizing antibody. Nature 1995;376:92-94.

16. Blake A. Jones and Gregory J. Gores. Physiology and pathophysiology of apoptosis in epithelial cells of the liver, pancreas and intestine. American Physiological Sosiety 1997.

17. Baum LG, Paulson JC. The N2 neuraminidase of human influenza virus has acquired a substrate specificity complementary to the hemagglutinin receptor specificity. Virology 1991;180:10-15

18. Barchet W, Krug A, Cella M, Newby C, Fischer JA, Dzionek A, Pekosz A, Colonna M. Dendritic cells respond to influenza virus through TLR7- and PKR-independent pathways. Eur J Immunol. 2005 Jan;35(l):236-42. PMID: 15593126 PubMed ir.de« d for MEDLINE.

19. Bullough PA, Hughson FM, Skehel JJ, Wiley DC. Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion. Nature 1994;371:37—43.

20. Burnet FM, Stone JD. The receptor-destroyingenzyme of V. cholerae. Aust J Ext Biol Med 1947; 25:227-233

21. Burnet FM, Stone JD, et al.The genetic character of O-D change in influenza A. Br J Exp Pathol. 1949 0ct;30(5):419-25

22. Bryans JT. Equine influenza. Blood Horse 1975;101:4526-4527

23. Bowie, A. and 0Neill, L.A.J. (2000) Oxidative stress and nuclear factor-kappa B activation — a reassessment of the evidence in the light of recent discoveries. Biochem. Pharmacol. 59, 13-23.

24. Edvard WA Brydon, Susan J. Morris, Clive Sweet. Role of apoptosis and cytokines in influenza virus morbidity. FEMS Miciobiology Reviews 2005

25. Castrucci MR and Kawaoka Y Biologic importance of neuraminidase stalk length "n influenza A virus. Journal of Virology 1993, 759-764

26. Cianci C, Tiley L, Krystal M. Differential activation of the influenza virus polymerase via template RNA binding. J Virol 1995;69:3995-3999.

27. Chen J, Skehel JJ, Wiley DC. N- and C-terminal residues combine in the fusion-pH influenza hemagglutinin HA2 subunit to form an N cap that terminates the triple-stranded coiled coil. Proc Natl Acad Sci U S-A 1999;96:8967-8972

28. Chu VC, Whittaker GR. Influenza virus entry and infection require host cell N-linked glycoprotein. Proe Natl Acad Sci USA. 2004 Dec 28; 101 (52): 18153-8. Epub 2004 Dec 15

29. Colman PM, Varghese JN, Laver WG. Structure of the catalytic and antigenic sites in influenza virus neuraminidase. Nature 1983;303:41-44

30. Colman PM, Laver WG, Varghese JN, et al. Three-dimensional structure of a comj le\ of antibody with influenza virus neuraminidase. Nature 1987;326:358-363.

31. Colman PM. Neuraminidase: Enzyme and antigen, In: Krug RM, cd. The influenza viruses. New York: Plenum Press,-1989:175-218.

32. Colman P.M. Influenza virus neuraminidase: Structure, antibodies, and inhibitors. Protein Science (1994), 3: 1687-1696

33. Class E. C., R Vanbeek., Osterhause., J. C. de Jong. G. F. Rimmelzwann, D.A. Senne. S Krauss and R. G. Webster. 1998. Human influenza A H5N2 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus/ Lancet 351: 472-477/

34. Connor RJ, Kawaoka Y, Webster RG, et al. Receptor specificity in human, avian, itid equine H2 and H3 influenza virus isolates. Virology 1994; 205: 17-23

35. Conti G, Valcavi P, Natali A, Schito GC. Different patterns of replication in influenza virus-infected KB cells. Arch Virol. l980;66(4):309-20

36. Chen J, Lee KH, Steinhauer DA, et al. Structure of the hemagglutinin precursor cleavage site, a determinant of influenza pathogenicity and the origin of the labile conforn.at:o i. Cell 1998;95:409-417.

37. De Jong, J.C.E.C. Class, A.D. Osterhaus, R.G. Webster, and W.L. Lim.1997. A pandemic warning. Nature 389: 554

38. Qingming Ding, Qingding Wang, Zizheng Dong and Mark Evers. Characterization and regulation of E2F activity during CACO 2 cell differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000, 278, 110-117.

39. Qingming Ding, Tien C. Ko and B. Mark Evers. Caco 2 intestinal cell differentiation is associated with Gl arrest and suppression of CDK2 and CDK4. American Physiological Society 1998.

40. Doms RW, Helenius A, White J. Membrane fusion activity of the influenza virus hemagglutinin: The low pH-induced conformational change. J Biol Che n 1985;260:2973-2981.

41. Duesberg P. Distinct subunits of the ribonucleoprotein of influenza virus. J Mol Biol 1969:42:485^199.

42. Easterday BC. Animal influenza. In: Kilbourne ED, ed. The influenza viruses and influenza. Orlando: Academic Press, 1975:449-481

43. Els MC, Air GM, Murti KG, Webster RG, Laver WG. An 18-amino acid deletion in an influenza neuraminidase. Virology. 1985 Apr 30;142(2):241-7.

44. Garten W, Klenk H-D. Characterization of the carboxypeptidase involved in the proteolytic cleavage ofthe influenza haemagglutinin. Intcrvirology 1983:20:181-189.

45. Guo Y, Wang M, Kawaoka Y, et al. Characterization of a new avian-like influenza A virus from horses in China. Virology 1992;188:245-255.

46. Geraci JR, St Aubin DJ, Barker IK, et al. Mass mortality of harbor seals: Pneumonia associated with influenza A virus. Science 1982;215:1129-1131.

47. Godley L, Pfeifer J, Steinhaucr D, et al. Introduction of intersubunit disulfide bonds in the membrane-distal region of the influenza hemagglutinin abolishes membrane fusion activity. Cell 1992;68:635-645.

48. Gottshalk A (1959) The chemistry of virus receptors. In The Viruses (Burnet F. M. and Stanley W. M.) Academic Press, New York, USA

49. Gottchalk A., Belyavin G., Biddle F. (1972) In.: Glycoproteins: Their Composition, Structure and Function. 2'nd edn., Part A., Gottchalk A. (eds). Elsevier Publishing Company: Amsterdam-London-New York, 1082-1096

50. Govorkova EA. Matrosovich MN, Tuzikov AB, Bovin NV, Gerdil C. Fanget B, Webster RG. Selection of receptor-binding variants of human influenza A and B viruses in baby hamster kidney cells. Virology. 1999 Sep 15;262(l):31-8.

51. Gorman OT., Bean WJ., Kawaoka Y. et al., Evolution of influenza A virus nucleoprotein genes: implication for the origin of H1N1 human and classical swine viruses //J. Virol. -1991 Vol.65-P. 3704-3714.

52. Gubareva LV. Robinson MJ, Bethell RC, et al. Catalytic and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-guar.id'n •>-Neu5Ac2en. J Virol 1997; 71: 3385-3390.

53. Gil. J. and Esteban, M. (2000) Induction of apoptosis by the dsRNA-dependent protein kinase (PKR): Mechanism of action. Apoptosis 5, 107-114

54. Ilinshaw VS, Bean WJ, Geraci J, et al. Characterization of two influenza A viruses from a pilot whale. J Virol 1986;58:655-656.

55. Hausmann J. Kretzschmar E, Garten W, Klenk HD. N1 neuraminidase afinfluenza virus A/FPV/Rostock/34 has haemadsorbing activity. J Gen Virol 1995:76:1719-28.

56. J. Hausmann, E. Kretzschmar, W. Garten and HD Klenk. Biosynthesis, intracellular transport and enzymatic activity of an avian influenza A virus neuraminidase: role of unpaired cysteines and individual oligosaccharides. J Virol 1997: 78. 3233-3245

57. Hirst GK. Agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embr\os infected with influenza virus. Science 1941; 94: 22-23

58. Hoffmann E, Stech J, Guan Y, Webster RG, Perez DR. Universal primer set for the lull-length amplification of all influenza A viruses. Arch Virol. 2001 Dec: 146( 12):2275-89.

59. Hughes MT, Matrosovich M, Rodgers ME, et al. Influenza A viruses lacking sialidase activity can undergo multiple cycles of replication in cell culture, eggs, or mice. J Virol 2000; 74: 5206- 5212.

60. Taisuke Horimoto and Yoshihiro Kawaoka Pandemic threat posed by avian influenza A viruses. Clinical Microbiology Reviews 2001, 129-149

61. Inglis SC. Lamb RA, Carroll AR, Mahy BWJ. Polypeptides specified by the infuenra virus genome. I. Evidence for eight distinct gene products specified by fowl plague virus. Virology 1976:74:489-503.

62. Klingborn B, Englund L, Rott R, et al. An avian influenza A virus killing a mammalian species: The mink. Arch Virol 1985;86:347-351.

63. Kobasa D. Rodgers ME, Wells K, Kawaoka Y. Neuraminidase hemadsorption activity, conserved in avian influenza A viruses, does not influence viral replication in ducks. J Virol 1997;71:6706-6713

64. Karen J. Cross. Laura M. Burleigh and David A. Steinhauer Mechanisms of cell entry by influenza virus expert reviews in molecular medicine 2001

65. Kawaguchi A. Naito T, Nagata K. Involvement of influenza virus PA subunit in assembly of functional RNA polymerase complexes. J Virol. 2005 Jan;79(2):731-44.PMID: 15613301 PubMed indexed for MEDLINE.

66. Kawaoka Y., Krauss S., Webster R.G. Avian to - human transmission of the PB1 gene of influenza A virus in the 1957 and 1968 pandemics // J. Virol. - 1989. - Vol. 63. - P. 4603-4608.

67. Kawaoka Y, Gorman OT, Ito T, Wells K, Donis RO, Castrucci MR. Donatelli I, Webster RG. Influence of host species on the evolution of the nonstructural (NS) gene of influenza A viruses. Virus Res. 1998 Jun;55(2): 143-56.

68. Kobasa D, Kodihalli S, Luo M, et al. Amino acid residues contributing to the substrate specificity of the influenza A virus neuraminidase. J Virol 1999; 73: 6743-6751.

69. Kaverin NV, Matrosovich MN, Gambaryan AS, et al. lntergenic HA-NA interactions in influenza A virus: postreassortment substitutions of charged amino acid in the hemagglutinin of different subtypes. Virus Res 2000; 66: 123-129.

70. Kemble GW, Danieli T, White JM. Lipid-anchored influenza hemagglutinin promotes hemifusion, not complete fusion. Cell 1994;76:383-391.

71. Kidd, V.J., Lahti, J.M. and Teitz, T. (2000) Proteolytic regulation of apoptosis. Semin. Cell Dev. Biol. 11, 191-201.

72. Kittel C, Sereinig S, Ferko B, Stasakova J, Romanova J. Wolkerstorfer A,Katinger H. Egorov A. Rescue of influenza virus expressing GFP from the NSI reading frame. Virology. 2004 Jun 20;324(l):67-73.

73. Khatchikian D, Orlich M, Rott R. Increased viral pathogenicity after insertion of a 28S ribosomal RNA sequence into the hemagglutinin gene of an influenza virus. Nature 1989;340:156-157.

74. Krug RM, Soeiro R. Studies on the intranuclear localization of influenza virus-specific proteins. Virology 1975;64:378-387.

75. Krug RM, Alonso-Caplen FV, Julkunen I, Katze MG. Expression and replication of the influenza virus genome. In: Krug RM, ed. The influenza viruses. New York: Plenum, 1989:89-152.

76. Donald Kayc and Craig R. Pringle. Avian influenza viruses and their implication for human health. Clinical Infectious Diseases, 2004, 108-112.

77. Klenk HD, Rott R, Orlich M, Biodorn J. Activation of influenza A viruses by trypsin treatment. Virology. 1975 Dec;68(2):426-39.

78. Klenk I I.D. (1990) In: Van Regenmortel MNV., Neurath A.R. (eds) Immunochemistry of viruses. II. The basis for serodiagnosis and vaccines. Elsevier, Amcrsham. pp 25-37

79. S Kumar. K Tamura, and M Nei (2004) MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinfor nati':s 5:150-163

80. Krug RM. Alonso-Caplen FV, Julkunen I, Katze MG. Expression and replication of the influenza virus genome. In: Krug RM, ed. The influenza viruses. New York: Plenum, 1989:89-152

81. Lamb RA, Choppin PW. Synthesis of influenza virus polypeptides in cells resistant to alpha-amanitin: Evidence for the involvement of cellular RNA polymerase 11 in virus replication. J Virol 1977;23:816-819.

82. Lamb RA, Lai C-J. Conservation of the influenza virus membrane protein (Mi) amino acid sequence and an open reading frame of RNA segment 7 encoding a second protein (M2) in HIN 1 and H3N2 strains. Virology 1981-112:746-751.

83. Lamb RA, Choppin PW. The gene structure and replication of influenza virus. Annu Rev Biochem 1983:52:467-506

84. Lamb RA, Choppin PW, Chanock RM, Lai C-J. Mapping of the two overlapping genes for polypeptides NS1 and NS2 on RNA segment 8 of influenza virus genome. Proc Natl Acad SciUSA 1980;77:1857-1861.

85. Lamb RA, Choppin PW. Synthesis of influenza virus proteins in infected celb: Translation of viral polypeptides, including three P polypeptides, from RNA produced by primary transcription. Virology 1976;74:504-519

86. Laver WG, Colman PM, Webster RG, et al. Influenza virus neuraminidase with hemagglutinin activity. Virology 1984;137:314-323.

87. Lazarowitz SG, Compans RW, Choppin PW. Influenza virus structural and nonstructural proteins in infected cells and their plasma membranes. Virology 1971;46:830-843.

88. Lazarowitz SG, Choppin PW. Enhancement of the infectivity of influenza A and B viruses by proteolytic cleavage of the hemagglutinin polypeptide. Virology. 1975 Dec;68(2):440-54

89. R. Joel Lowy. Influenza virus induction of apoptosis by intrinsic and extrinsic mechanisms. International Reviews of Immunology, 22: 425-449, 2003/

90. Liu C, Eichelberger MC, Compans RW, Air GM Influenza type A virus neuraminidase does not play a role in viral entry.rep!¡cation, assembly, or budding. J Virol. 1995 Feb;69(2): 1099-106.

91. Luo G, Chung J, Palese P. Alterations of the stalk of the influenza virus neuraminidase: deletions and insertions. Virus Res. 1993 Aug:29(2):141-53. Erratum in: Virus Res. 1993 Sep;29(3):321.

92. Mumford JA, Chambers TM. Equine influenza. In: Nicholson KG. Webster RG, Hay AJ, eds. Textbook of influenza. Oxford: Blackwell Scienccs, 1998:146-162.

93. Mould JA, Li H-C, Dudlak CS, et al. Mechanism lor proton conduction of the M(2) ion channel of influenza A virus. J Biol Chem 2000:275:8592-8599.

94. Matlin KS, Reggio H, Helenius A, Simons K. The entry of enveloped viruses into an epithelial cell line. Prog Clin Biol Res 1982;91:599-611.

95. Murti KG, Bean WJ Jr, Webster RG. Helical ribonucleoproteins of influenza virus: An electron microscope analysis. Virology 1980;104:224-229.

96. Mikhail Matrosovich, Nannan Zhou, Yoshihiro Kawaoka, and Robert Webster 1999. The surface glycoproteins of H5 influenza virus isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties.J Virol

97. Matrosovich MN, Matrosovich TY, Gray T, Roberts NA. Klenk HD. Neuraminidase is important for the initiation of influenza virus infection in human airway epithelium. J Virol. 2004 Nov;78(22): 12665-7.

98. McKimm-Breschkin JL, Sahasrabudhe A, Blick TJ, et al. Mutations in a conserved residue in the influenza virus neuraminidase active site decreases sensitivity iO Neu5Ac2en-derived inhibitors. J Virol 1998; 72: 2456-2462.

99. McClelland L, Hare R. The adsorption of influenza virus by red cells and a new in vitro method of measuring antibodies for influenza virus. Can J Public Health 1941:32:530-538.

100. Mitnaul LJ, Matrosovich MN, Castrucci MR, et al. Balanced hemagglutin.n ar d neuraminidase activities are critical for efficient replication of influenza A virus. J Virol 2000; 74:6015-6020.

101. Matlin KS, Reggio H, Helenius A, Simons K. The entry of enveloped viruses into an epithelial cell line. Prog Clin Biol Res 1982;91:599-611.

102. Matrosovich M, Zhou N, Kawaoka Y, et al. The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties. J Virol 1999; 73: 1146-1155.

103. Matrosovich M, Klenk HD Natural and synthetic sialic acid-containing inhibitors of influenza virusreceptor binding. Rev Med Virol. 2003 Mar-Apr; 13(2):85-97. Review.

104. Matrosovich MN, Matrosovich TY, Gray T, Roberts NA. Klenk HD. Hunan and avian influenza viruses target different cell types in cultures on human airway epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Mar 30; 101 (13):4620-4. Epub 2004 Mar 15.

105. Marsh M, Helenius A. Virus entry into animal cells. Adv Virus Res 1989:36:107151.

106. Martin K, Helenius A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (Ml) promotes export and inhibits import. Cell I99l;67:l 17130

107. Mersich SE, Baumeister EG, Riva D, Lewis AP, Cadario ME, Pontoriero r\V, Savy VL. Influenza circulating strains in Argentina exhibit differential induction of cytotoxicity and caspase-3 in vitro. J Clin Virol. 2004 Oct;31(2): 134-9.

108. Nakajima K., Desselberger U., Palese P ., Recent human influenza A (HI \Ii) viruses are closely genetically to strains isolated in 1950 11 Nature. 1978. - Vol. 274. -P. 334-339.

109. O'Neill RE, Talon J, Palese P. The influenza virus NEP (NS2 protein) mediates the nuclear export of viral ribonucleoproteins. EMBO J 1998; 17:288-296

110. Oilier L, Caramella A, Giordanengo V, Lefebvre JC. High permissivity of human HepG2 hepatoma cells for influenza viruses. J Clin Microbiol. 2004 Dec:42(12):5861-5.

111. Osterhaus AD, Rimmelzwann GF, Martina BE, et al. Influenza B virus in seals. Science 2000;288:1051-1053.

112. Poon LL, Pritlove DC, Fodor E, Brownlee GG. Direct evidence that the poly(A) tail of influenza A virus mRNA is synthesizedby reiterative copying of a U track in the virion RNA template J Virol. 1999 Apr;73(4):3473-6.

113. Pyle G. F., Patterson K.D., Influenza diffusion in European history: Patterns and paradigms // Ecol. Dis. 1984 - Vol. 2 - P. 174 - 184.

114. Palese P, Tobita K, Ueda M, Compans RW. Characterization of temperature sensitive influenza virus mutants defective in neuraminidase. Virology 1974:61:397-410

115. Paulson JC. Interactions of animal viruses with cell surface receptors. In The Reccptors, vol 2, Conn M (ed.). Academic Press: Orlando, 1985: 131-219

116. Pilaipan Puthavathana, Prasert Auewarakul, Pakapak Chor Charoenying, Kantima Sangsiriwut et al., Molecular characterization of the complete genome of human influenza H5N1 virus isolates from Thailand. J Virol 2005 86.423-433.

117. Porter AG, Barber C, Carey NH, et al. Complete nucleotide sequence of an influenza virus haemagglutinin gene from cloned DNA. Nature 1979:282:471-477.

118. Pons MW, Schulze IT, Hirst GK, Hauser R. Isolation and characterization of the ribonucleoprotein of influenza virus. Virology 1969:39:250-259.

119. Pinto LH, Holsinger LJ, Lamb RA. Influenza virus M2 protein has ion channel activity. Cell 1992;69:517-528.

120. Plotch SJ, Bouloy M, Ulmanen I, Krug RM. A unique cap(m7GpppXm)-dep',ndent influenza virion cndonuclease clcaves capped RNAs to generate the primers that initiate viral RNA transcription. Cell 1981;23:847-858.

121. Röhm C, Zhou N, Süss J, Mackenzie J, et al. Characterization of a novel influenza hemagglutinin. HI5: Criteria for determination of influenza A subtypes. Virology 1996;217:508-516.

122. Rota PA, Rocha EP, Harmon MW, et al. Laboratory characterization of a swine influenza virus isolated from a fatal case of human influenza. J Clin Microti )l 1989;27:1413-1416

123. Rogers GN, Paulson JC, Daniels RS, Skehel JJ. Wilson I A. Wiley DC. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 1983 Jul 7-13;304(5921):76-8.

124. Rogers GN, Paulson JC. Receptor determinants of human and animal influenza virus isolates: differencesin receptor specificity of the H3 hemagglutinin based on species of origin. Virology. 1983 Jun;l27(2):361-73.

125. Shope RE. Swine influenza. III. Filtration experiments and etiology. J Exp Med 1931;54:373-380.

126. Scholtissek C, Hinshaw VS, Olsen CW. Influenza in pigs and their role as the intermediate host. In: Nicholson KG, Webster RG, Hay AJ, eds. Textbook of influenza. Oxford: Blackwell Sciences, 1998:137-145

127. Saumendra N. Sarkar, Ganes C. Sen. Novel function of protein encoded by viral stress-inducible genes. Pharmacology & Therapeutics 103, 2004. 245-259.

128. Seo SH, Webby R, Webster RG. No apoptotic deaths and different levels of inductions of inflammatory cytokines in alveolar macrophages infected with influenza viruses.Virology. 2004 Nov 24;329(2):270-9.

129. Smith GL, Hay AJ. Replication of the influenza virus genome. Virology 1982; 1 18:96108.

130. Shibuya N, Goldstein IJ, Broekaert WF, Nsimba-Lubaki M, Peeters B, Peumans WJ. The elderberry (Sambucus nigra L.) bark lectin recognizes the Neu5Ac(alpha2-6)Gal/GalNAc sequence. J Biol Chem. 1987 Feb 5;262(4): 1596-601

131. Stegmann T, Morselt HWM, Scholma J, Wilschut J. Fusion of influenza virus in an intracellular acidic compartment measured by fluorescence dequenching. Bioc.iim BiophysActa 1987;904:165-170.

132. Schotlissek C., Rohde W., Von Hoyningen V et al., On the origin of the human influenza virus subtype H2N2 and H3N2 // Ibid. Vol.87. P. 13 - 20

133. Steinhauer DA. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza vi'us. Virology 1999:258:1-20

134. Steinhauer DA. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology 1999;258:1-20

135. Skehel JJ, Wiley DC. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem 2000; 69: 531-569

136. Suarez DL, Perdue ML. Multiple alignment comparison of the non-structural genes of influenza A viruses. Virus Res. 1998 Mar;54(l):59-69.

137. Suzuki Y, ItoT, Suzuki T, Holland RE Jr, Chambers TM, Kiso M, Ishida H.Kawaoka Y. Sialic acid species as a determinant of the host range of influenza A viruses. J Virol. 2000 Dec;74(24): 11825-31.

138. Suzuki H. Saito R, Masuda H, Oshitani H, Sato M. Sato I. Emergence of amantadine-resistant influenza A viruses: epidemiological study.J Infect Chemother. 2003 Sep;9(3): 195-200. Review.

139. Tai CY, Escarpe PA, Sidwell RW, et al. Characterization of human influenza virus variants selected in vitro in the presence of the neuraminidase inhibitor GS 4(71. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 3234-3241

140. Tan, S.L. and Katze, M.G. (1999) The emerging role of the interferon-induced PKR protein kinase as an apoptotic effector: a new face of death. J. Inlerf. Cytokine Res. 19. 543-554.

141. Ter Meulen V. Love R. Virological, immunochemical, and cytochemical studies of lour HeLa cell lines infected with two strains of influenza virus. J Virol. 1967 Jun;l(3):626-39.

142. Ulmanen I, Broni BA, Krug RM. Role of two of the influenza virus core P proteins in recognizing cap 1 structures (m7GpppNm) on RNAs and in initiating viral RNA transcription. Proc Natl Acad Sci U S-A 1981;78:7355-7359.

143. Varghese JN, Laver WG, Colman PM. Structure of the influenza virus glycoprotein antigen neuraminidase at 2.9 A resolution. Nature. 1983 May 5-11:303(5912):35-40.

144. Van-Regenmortel MH Fauquet CM, Bishop CM, et al. Virus Taxonomy: The Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego: Ac&de-n'c Press, 2000.

145. Veit M, Klenk H-D, Kendal A, Rott R. The M2 protein of influenza A virus is acylated. Virology 1991;184:227-234

146. Vines A. Wells K, Matrosovich M, Castrucci MR, lto T. Kawaoka Y.The role of influenza A virus hemagglutinin residues 226 and 228 in receptor specificity and host range restriction. J Virol. 1998 Sep;72(9):7626-31.

147. Vines A. Wells K, Matrosovich M, Castrucci MR. lto T, Kawaoka Y.The role of influenza A virus hemagglutinin residues 226 and 228 in receptor specificity and host range restriction.J Virol. 1998 Sep;72(9):7626-31.

148. Vreede FT, Jung TE, Brownlee GG. Model suggesting that replication of influenza virus is regulated by stabilization of replicative intermediates.! Virol. 2004 Scp;78(l7):956<i-72. PM1D: 15308750 PubMed indexed for MEDLINEJ

149. Yasuda J, Nakada S, Kato A, et al. Molecular assembly of influenza virus: Assoi iaMcn of the NS2 protein with virion matrix. Virology 1993;196:249-255.

150. Yoshino S, Yamamoto S, Kawabata N. Use of Caco-2 cells for isolation of influenza virus. Kansenshogaku Zasshi. 1998 Apr;72(4):347-51. Japanese

151. Winter G, Fields S. The structure of the gene encoding the nucleoprotein of human influenza virus A/PR/8/34. Virology 1981;114:423-428.

152. Wiley DC, Wilson IA, Skehel JJ. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation. Nature 1981;289:373-378.

153. Wilson I A, Skehel JJ, Wiley DC. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 resolution. Nature 1981;289:366-373.

154. Wiley DC, Skehel JJ. Crystallization and x-ray diffraction studies on the haemagg'ul'n'n glycoprotein from the membrane of influenza virus. J Mol Biol 1977; 112:343-347.

155. Weis W, Brown JH, Cusack S, et al. Structure of the influenza virus haemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid. Nature 1988;333:426-431.

156. Wei X, Decker JM, Wang S, Hui H, Kappes JC, Wu X. Salazar-Gonzalez JF.Salazar MG. Kilby JM. Saag MS, Komarova NL, Nowak MA, Hahn BH.Kvvong PD. Shaw GM. Antibody neutralization and escape by HIV-l. Nature. 2003 Mar 20:422(6929):307-12.

157. Webster RG, Yakho MA, Hinhaw VS, Bean WJ, Murti KG. intestinal influenza: replication and characterization of influenza viruses in duckes/ Virology 1978; 84: 268 -78.

158. Webster RG. Influenza: An Emerging Disease, Emerging Infection Disease 1998; 4(3): 436-441.

159. Webster RG, Laver WG. Antigenic variation in influenza virus: Biology and chemistry. Prog Med Virol 1971;13:271-338

160. Webster RG, Laver WG, Air GM, Schild GC. Molecular mechanisms of variation in influenza viruses. Nature 1982;296:115-121

161. Webster RG, Yakhno M, Hinshaw VS. et al. Intestinal influenza: Replication and characterization of influenza viruses in ducks. Virology 1978;84:268-278.

162. Weiss RA. HIV receptors and cellular tropism. IUBMB Life. 2002 Apr-May;53(4-5):201-5. Review.

163. Wagner R, Matrosovich M, Klenk HD. Functional balance between haemagglutiniri ai.d neuraminidase in influenza virus infections. Rev Med Virol. 2002 May-Jun; 12(3): 15966. Review.

164. Ralf Wagner 1, Mikhail Matrosovich 1 and Hans-Dieter Klenk Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections Rev. Med. Virol. 2002; 12: 159-166.

165. Ralf Wagner, Anke Feldmann, Thorsten Wolff, Stephan Plcschka. Wolfgang Garten, Hans-Dieter Klenk. Hemagglutinin and neuraminidase as determinants of influenza virus pathogenicity. International Congress Series 1219 (2001) 533-543

166. Wylie, A.H. (1981) Cell Death: a new classification separating apoptosis from necrosis. In: Cell Death and Pathology (Bowen, I.D. and Locksin, R.A. Eds.), pp. 9-29. Chapman & Hall Ltd, New York.

167. Wurzer WJ. Planz O, Ehrhardt C, Giner M, Silberzahn T, Pleschka S. Ludwig S. Caspase 3 activation is essential for efficient influenza virus propagation. EMBO J. 2003 Jun 2;22(11):2717-28.

168. Whittaker GR, Helenius A. Nuclear import and export of viruses and virus genomes. Virology 1998:246:1-23.

169. Youil R. Su Q, Toner TJ, Szymkowiak C, Kwan WS, Rubin B, Petrukhin L.Kiseleva I, Shaw AR. DiStefano D.Comparative study of influenza virus replication in Vero iiid MDCK cell lines. J Virol Methods. 2004 Sep 1;120(1):23-31.

170. Young RJ, Content J. 5 '-Terminus of influenza virus RN A. Nature 1971:230:140-142.

171. Maria C. Zambon The pathogenesis of influenza in humans. Rev. Med. Virol. 2001; 11; 227-241.

172. Zhang J, Pekosz A, Lamb RA. Influenza virus assembly and lipid raft microdomainr: \ role for the cytoplasmic tails of the spike glycoproteins. J Virol 2000:74:4634^644.

173. Zhou NN, Senne DA, Landgraf JS, et al. Genetic reassortment of avian, swine, and human influenza A viruses in American pigs. J Virol 1999:73:8851-8856.

174. Zhirnov OP. Isolation of matrix protein Ml from influenza viruses by acid-dependent extraction with nonionic detergent. Virology 1992;186:324-330.

175. Zhirnov OP, Konakova TE, Garten W, Klenk H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. J Virol 1999;73:10158-10163.

176. Zhirnov, O.P. Konakova, T.E., Wolff, T. and Klenk, H.D. (2002) NS1 protein of influenza A virus downregulates apoptosis. J. Virol. 76. 1617-1625

177. Zurcher T, Luo G, Palese P. Mutations at palmitylation sites of the influenza virus hemagglutinin affect virus formation. J Virol 1994;68:5748-5754

178. Weekly epidemiological record. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2005 2006 influenza season. №8. 2005,80 65 -76 http://www.who.int/wer

179. Weekly epidemiological record. Recommended composition of influenza v.rus vaccines for use in the 2005 influenza season. №41, 2004,79 369 376 http://www.who.int/wer

180. СПИСОК РАБОТ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

181. Жирное О.П., Воробьева И. В., Овчаренко А.В., Кленк Х.Д. Внутриклеточное расщепление гемагглютинина вируса гриппа А человека и его ингибирование. Биохимия 2003, том 68, вып. 9, с. 1247- 1255.

182. Жирнов О.П., Воробьева И. В., Веселовский Е.М., Кленк Х.Д. Ключевая роль Asp 16 в протеолизе NP белка вируса гриппа А каспазами в заражённых клетках. Вопросы вирусологии 2003,ноябрь-декабрь; 48(6):8-14