Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности полигенизации ДНК при ЭУ-гетероматиновых перестройках у DROSOPHILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности полигенизации ДНК при ЭУ-гетероматиновых перестройках у DROSOPHILA MELANOGASTER"

РГ6 од

2 * СсЯ №

На правах рукописи

ЛАВРОВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ОСОБЕННОСТИ НОЛИТЕНИЗАЦИИ ДНК ПРИ ЭУ-ГЕТЕРОХРОМАТИНОВЫХ ПЕРЕСТРОЙКАХ У ШЮБОРНПА МЕГАРЮСАвТЕК

(03.00.03- молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1998

Работа выполнена в отделе молекулярной генетики животных Института молекулярной генетики РАН и на кафедре молекулярной биологии биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н. А. Чуриков кандидат биологических наук И. А. Александров

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН

Защита состоится « » О'О 1998 г. в // часов на засе-

дании Диссертационного совета Д. 002. 79. 01 при Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгартда РАН по адресу 117984, г. Москва, ул. Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан " ^ " ^¿¿^ТЛ сри ¡993 г

доктор биологических наук, профессор В. А. Гвоздев

Ученый секретарь диссертационногс кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Существование двух различных по свойствам компартментов генома эукариот - гетерохроматина и эухроматина - было обнаружено более 70 лет назад. С тех пор был достигнут огромный прогресс в понимании организации и механизмов функционирования эухроматтеских последовательностей, к числу которых относится большинство традиционных генов. Вместе с тем, молекулярный анализ организации гетерохроматипа встретил значительные трудности и до сих представления об организации гетерохроматина достаточно ограничены. При этом, по современным представлениям, именно гетерохроматические последовательности отвечают за реализацию ряда фундаментальных клеточных футций, таких как сшпез рибосомных РНК, сегрегация хромосом в мейозе, нормальное протекание сперматогенеза. В гетерохроматине локализован ряд функциональных генов. В гетерохроматине многих организмов протекают мало изученные процессы, приводящие к изменениям структуры ДНК Это, в частности, формирование экстрахромосомных копий генов рРНК и элиминация части гетерохроматических последовательностей у некотороых беспозвоночных, в том числе у дрозофилы.

Интерес к гетерохроматину обусловлен в частности открытием в 30-х годах эффекта положения - явления, при котором гетерохроматические последовательности вызывают'репрессию эухроматических генов, расположенных на большом расстоянии от гетерохроматина. Последние исследования показали, что явлепие это связано с изменениями организации хроматина, однако механизмы его не ясны до сих пор.

В настоящей работе приведен молекулярный анализ эу-гетерохроматической границы перицентрической инверсии Х-хромосомы 1п(11М)рп2а (далее рп2а), приводящей к эффекту положения ряда эухроматических генов. Показано, что точка разрыва перестройки локализована в эухроматине внутри гена винкулина дрозофилы, а в гетерохроматине - в пределах протяженного блока сателлита ЛАДЛО. Последовательность винкулина обрывается на границе с последовательностью сателлита. Было исследовано также наблюдаемое в политенных хромосомах явление элиминации ДНК на границе эу- и гетерохроматина (в литературе описано как недопредстав-

ленность (шккпгсргеБепШюп) или недорешшкация (иМеггерЦсаНоп)). Показано, что эффект положения в перестройке рп2а и в ее производных сопровождается в полигенных хромосомах «недопредставленностью» (снижением количества) эухроматической ДНК вблизи точки разрыва Степень недопредставленное™ кореллнруст со степенью эффекта положения (ЭП) и на нее оказывают влияние модификаторы ЭП. С другой стороны, обнаружено, что степень представленности гетерохроматических последовательностей, оказавшихся рядом с эухроматином, возрастает.

Задачи исследования.

Целями настоящей работы являлась: 1) точная локализация границы между гетерохро-матином и подвергающемся инактивации эухроматическим районом в перестройки 1п(1Ш)рп2а на молекулярном уровне; 2) исследование процессов элиминации последовательностей ДНК на разных расстояниях от границы эухроматина с гетсрохроматином.

Научная новизна результатов исследования.

Определена структура и нуклеотцдная последовательность района точки разрыва перестройки 1п(11К)рп2а (в литературе известны лишь несколько примеров определения последовательности гетерохроматина, примыкающего к точке разрыва в приводящей к эффеету положения перестройке). Получены данные по ведопредставленности ДНК эухроматических районов вблизи точки разрыва. Впервые продемонстрировано, что инактивация генов при эффекте положения, вызванном 1п(11Л)рп2а, наблюдается на больших расстояниях, чем распространяется недопредставленность. Впервые описан эффект увеличения (по сравнению с нормой) числа копий гетерохроматических последовательностей, перенесенных к эухроматину. Продемонстрирована сильная зависимость степени недопредставлсшшсти ДНК от модификаторов эффекта положения, в частности, от направления скрещивания.

Практическая ценность.

Полученные в ходе работы данные позволяют приступить к исследованию молекулярных механизмов элиминации ДНК при формировании полигепных хромосом.

Апробация работы.

Работа апробирована на лабораторном семинаре ОМГЖ. Данные, представленные в работе, докладывались на 1-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (1994), на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-96» (1996 г) и на 37-ой и 38-ой ежегодных научных конференциях по дрозофиле (США. 1996, 1997)

Объем диссертации

Материал диссертации изложен на страницах машинописного текста, содержит рисунков и таблицы. Список цитированной литературы состоит из работ.

Материалы и методы:

Линии Ого5орЫ1а те1аподаБ1ег.

Из линии & В. Е. Алаторцевым была получена геномная библиотека, являвшаяся источником использованных в работе клонов. Линия Батуми является линией дикого типа, из которой при облучении получена инверсия рп2а, характеризующаяся выраженным эффектом положения по ряд)' эухроматических генов. Линия Батуми использовалась в качестве контроля в экспериментах по изучению «недопредставленности» ДНК. Линии шЮО, гЗО, г20, т141 бьига получены Е. В. Толчковым при облучении рп2а и являются вторичными перестройками с ослабленным относительно рп2а ЭП. Особи с хромосомными перестройками поддерживались в гете-розиготе с балансером РМ7, 5С® от"2 %* В. Линии взяты из коллекции ОМГЖ, описания мутаций см. ПшЫеу&гипт, 1992.

Молекулярно-биологические методы

Очистка геномной ДНК. ДНК из взрослых мух выделяли согласно стандартному протоколу (АБЬЬитег, 1989). ДНК из слюнных желез выделялась согласно методике (ЬатЬ&Ьат!, 1987, с модификациями). Агарозные блок-вставки с образцами ДНК из слюнных желез и има-

гинальных дисков личинок приготовляли по протоколу Карпена и Спрадлинга (Karpea&Spradling, 1990).

Клонирование. Саузерн-анализ. пульс-электрофорез. секвенирование и другие операции осуществлялись согласно стандартным протоколам. (Sambrook et. al. 1989)

Полимеразная пспная реакция. При клонировании точки разрыва ПЦР проводили согласно стандартной методике. Были использованы следующие праймеры:

(1) 5'AAGAATTCGGCTACCAACAAGACCCT;

(2) 5'AGAAGCTTAGGCGGATAACTCTGAGG;

(3) 5'GCGGATCCTCAGGCGGGCAATGTTCG

Подчеркнуты сайты узнавания рестриктаз EcoRI (1), HindIII (2) и ВатШ (3), соответственно. Температура отжига праймеров составляла 48° С

Компьютерный анализ экспериментальных данных

Для анализа нукпеотидных последовательностей использовали программу PC_GENE. Для поиска гомологичных последовательностей в базах данных использовали сервер blast Национального центра биогехнологической информации (http://www.ncbi.Dlm.nih.gov/BLAST/). Подбор праймеров для ПЦР осуществлялся с помощью программы Oligo 1.0 Для анализа оптической плотности радиоавтографов при измерении недорепликации применяли программу ImageQuant 3.3 (Molecular Dynamics). Полученные численные значения обрабатывали в MS Excel 95.

Результаты и обсуждение

Локализация точки разрыва хромосомной перестройки In(lLR)pn2a

Перестройка In(¡LR)pn2a является периценгрической инверсией Х-хромосомы. Ранее было показано (Толчков и др., 1984), что точки разрыва перестройки лежат в районе 2E-2F левого плеча Х-хромосомы и в гетерохроматине правого плеча. Перестройка приводит к эффекту положения генов, расположенных в перенесенном к основному блоку гетерохроматина фрагменте 1А-2Е Х-хромосомы. На рис. 1 указано местоположение генов из района 2Е, для которых на-

б.иодался эффект положения. В районе 2Б, соединенном с дисгальным фрагментом правого плеча (район теломеры хромосомы рп2а), эффект положения пе наблюдается.

Рис 1. Происхождение и структура перестройки 1п(1Ш)рп2а.

Гстерохроматин обозначен блоками с различной штриховкой (по РшршеШ -„вдичр*. а1. а1. 1983), эухроматин -тонкая линия. Белый кружок - центромера. Стрелки

Инаюиваци* генов при эффекте пслвмиия_

' (ТР) указывают располо-

жение точек разрыва. В

2Е

рА334

■ ■ —j д t fe . а .4 ' нижней части рисунка

20 представлен район эухро-

матина, подвергающийся действию эффекта положения, и показано положение космиды рА334 относительно точки разрыва.

В нашем распоряжении имелась космидная библиотека, получепная из ДНК мух линии

gt w" (см. Материалы и Методы). Из библиотеки В. Е. Алаторцевым (Алаторцев, 1988) был отобран набор космид (контиг), перекрывающий район точки разрыва, и были получены предварительные данные о локализации точки разрыва.

С целью точной локализации точки разрыва была проведена серия гибридизаций in situ политенных хромосом самцов In(l LR)pn2afY с космидами контига. Космида рА334 на препаратах политенных хромосом гибрядизовалась сразу с двумя фрагментами района 2Е, прицентро-мерныч и теломерным (рис. 1), и, следовательно, перекрывает то>псу разрыва. Была построена карта рА334 по рестриктазам Xbal и ВатШ (рис. 2), после чего разрыв был локализован в одном из рестриктных фрагментов. Для этого ДНК из самцов Батуми и самцов рп2а были переварены рестриктазами Xbal и ВатШ, подвергнуты электрофорезу, перенесены на нейлоновые фильтры и фильтры затем прогибрвдизованы с меченой космидой рА334. На основании полученных данных можно заключить, что точка разрыва перестройки In(lLR)pn2a лежит в пределах

ВашШ-ВатШ фрагмента размером примерно 600 п. н. (далее В600), так как он отсутствует в ДНК рп2а, но имеется в Батуми, по остальным же фрагментам линии не отличаются. Структура коемцды рА334 и расположение точки разрыва представлены на рис. 2

После того, как точка разрыва рп2а была локализована в пределах фрагмента В600, фрагмент был клонирован и секвенирован. Как было показано, точка разрыва находится внутри кодирующей последовательности гена винхулина дрозофилы (см. рис 2). Винхулин представляет собой один из белков цитоскелета, участвующий в образовании межклеточных контактов. В перестройке рп2а и производных от нее он полностью инакпширован. Так как гемизиготтше по рп2а самцы и гомозиготные по производным от рп2а перестройкам (напр., гЗО, см. рис. 2 и рис. 5) самки жизнеспособны и фертильны, то винкулин не существенен для жизнеспособности мух.

prune о

20

30

vinculin

40

50

60

70 Kb

в BBB

в вв в в

pA334

Фрагмент 3.5 т.п.н. Xbal-Xbal

В T п.н. 9.0-

гЗО рп2а Батуми

1.8-

0.80.6-

Точка разрыва

Рис 2. Локализация точки разрыва хромосомной перестройки рп2а.

A. Рестрикгная карта района точки разрыва в линии Батуми. Указано положение 3.5 т.п.н. ХЪа1-ХЪа1 фрагмента и фрагмента 0.6 т.п.н. ВашШ-ВатШ, содержащего точку разрыва, а также положение генов prune, vinculin и кг,

B. Саузерн-анализ геномной ДНК линий с перестройкой (гЗО и рп2а) и исходной линии, Батуми. Геномная ДНК была расщеплена BamHI, в качестве зонда использован 3.5 т.п.н Xbal-Xbal фрагмент (см. выше). Стрелкой указано положение фрагмента В600.

Клонирование и секвенирование района эу-гетерохроматической границы

Район точки разрыва был клонирован и затем секвенирован с использованием полиме-разной цепной реакции. Схема клонирования представлена на рис. 3.

Хромосома дикого типа ВашН1 „

.У

Перестройка эухроматин

ВатН1 У

гегерохромагим

Расщепление днказой до фрагментов 1-1.5 т. п. н.

ВашН V

Точка разрыва V

Рис. 3 Схема клонирования района эу-гетерохроматической границы. Черным цветом выделен фрагмент ВатШ-ВатН! размером 0.6 т.п.н. Стрелки с цифрами обозначают использованные при амплификации праймеры (см. Материалы и Методы).

Рестрикция ВатН1, достройка концов фрагментом Кпенова

I

Лигированме лри милкой концентрации ДНК

I С

Амплификация с п рай мерами 1 и2

1

Амплификация с праймерами Зи2 , 1

Клонирование и секвенирование

Гемизиготные по рп2а самцы появляются в популяции очень редко, а гомозиготные самки нежизнеспособны. Поэтому для клонирования была использована ДНК из самок, гомозиготных по перестройке гЗО. Перестройка гЗО является производной рп2а с ослабленным эффектом положения, однако в ней сохраняется район эу-гетерохроматической границы исходной перестройки рп2а (см. рис. 5).

Геномная ДНК была подвергнута воздействию ДНКазы 1, причем время обработки было подобрано так, чтобы средний размер образовавшихся фрагментов составил примерно 1 т.п.н. Суммарная ДНК была затем расщеплена рестршстазой ВатН1, достроена фрагментом Клснова и обработана ДНК-лигазой фага Т4. .Цитирование осуществляли при низкой концентрации ДНК, препятствующей межмолекулярному лигированию. Полученный препарат был ам-

плифицирован в две стадии с использованием праймеров, синтезированных к конпу фрагмента В600 и ориентированных «вовне» относительно друг друга (Рис. 3). После амплификации смесь разделяли электрофорезом и фрагменты размером более 600 п. н. выделили из геля. Амплифи-цированные фрагменты были клонированы в рТг19Я с использованием введенных в праймеры сайтов узнавания рестриктазами НшсПН и ВашН1. Три независимо отобранных клона были сек-вснировакы. Результаты представлены на рис. 4. Можно видеть, как последовательность гена винкулина переходит в последовательность простого сателлита ААСАв.

Рис. 4. Секвенирование района эу-гетерохроматической границы перестройки гЗО. Последовательность экзона гена винкулина переходит в сателлит ДАвАв

Таким образом, гетерохроматическая точка разрыва рп2а лежит в блоке сателлита АА-ОАС. На основании результатов Саузерн-гибридизации фрагмента В600 с расщепленными ре-

стриктазой Sau3A препаратом геномной ДНК из самцов рп2ЫУ можно утверждать, что сателлит AAGAG распространяется по крайней мере на 15 т.п.н. от точки разрыва в обе стороны. На таких автографах отсутствует Sau3 А-фрагмент, содержащий точку разрыва, а вместо него наблюдается гибридизация на старте геля, в области фрагментов размером более 15 т.п.н.

По данным (Lohe et al. 1993) в районе гетерохроматической точки разрыва рп2а расположен блок сателлита AAGAG размером примерно 1.2 м.п.н. Мы предприняли попытку оценить размер фрагментов сателлитного блока в прицещромерном и пригеломерном районах инверсии рп2а. Для этого высокомолекулярная ДНК из самок pn2a/gt w" быта выделена в агарозных блоках, растеплена рестриктазой Hindin н разделена при помощи пульс - электрофореза. Блоты прогибридизовали с фрагментами ДНК, расположенным и по обе стороны от точки разрыва. В результате было установлено, что районе теломеры (2F, район, где эффект положения отсутствует, см рис 1) оказался фрагмент протяженностью примерно 150 т. п. н, состоящий предположительно из сателлита AAGAG. Размер фрагмента с другой стороны по результатам гибридизации определить не удалось, скорее всего, из-за проблем с переносом крупных фрагментов ДНК на фильтр. Но на основали оценок Lohe размер блока сателлита со стороны 1А-2Е составляет примерно 1 м.п.н. Приведенные оценки согласуются с данными, полученными при F1SH-гибрвдизации сателлита AAGAG с препаратами митогаческих хромосом рп2а. Интенсивность гибридизации с приценгромерным фрагментом блока сателлита была в 5-7 раз выше, чем с при-теломерным. (Tolchkov etal, 1997)

Недорепликация эухроматических последовательностей при эффекте положения

Ряд гетерохроматиновых последовательностей недореплицируется в слюнных железах при полшенизации. Известно, что эффект положения может сопровождаться недопредставлен-ностью уже эухроматиновой ДНК в политенных хромосомах. Некоторые авторы (Shultz, 1936, Kaipen&Spradling, 1990) предполагали, что наблюдаемая при эффекте положения соматическая элиминация ДНК может быть причиной инактивации генов. Вместе с тем литературные данные о связи эффекта положения и нсдопрсдставлешгости ДНК разноречивы: в ряде случаев при сильном эффекте положения недопредставленность не наблюдается вовсе.

Перестройка рп2а приводит к сильному эффекту положения по генам из района 2Е (см. рис. 1). С целью исследования влияния структуры гетерохроматина на эффект положения Е. В. Толчковым и В. И. Рашевой были получены производные от рп2а вторичные перестройки, эффект положения в которых ослаблен по сравнению с рп2а. Одной из таких перестроек является уже упомшившаяся ранее гЗО. Мы использовали в своей работе перестройки гЗО, шЮО, т141, г20, рп2а. На основе данных Е. В. Толчкова по степени инактивации гена кар!, по силе эффекта положения перестройки можно расположить следующим образом: рп2а>т\А\>г20>т 100>г30 (в перестройке гЗО инактивация генов, в том числе и>ар1, не наблюдалась). Степень инактивации мгар1 оценивали по снижению жизнеспособности и масштабам нарушений строения глаз и крыльев у мух, несущих летальный аллель \\>ар1 в гетерозигоге с перестройкой.

На рис. 5 представлены структуры вторичных перестроек, определенные генетическими (Е. В. Толчков, В. И. Рашева) и цитологическими (Э. Вопассога) методами. Во всех случаях район эу-гетерохроматической границы не затронут. Эффект положения в целом ослабевает по мере укорочения примыкающего к точке разрыва гетерохроматинового блока. Исключение составляет г20, где инактивация распространяется со стороны меньшего гетерохроматического блока, однако она усилена благодаря близости к основному гетерохроматическому блоку X-хромосомы.

Сила эффекта 120 положения ослабевает

Рис 5. Структура вторичных перестроек, исследованных в работе (по данным Е.В.Толчкова). Район границы «гетерохроматин-2Е» обведен.

2— ■»

Инактивация генов не обнаружена

Нами было определено относительное содержание ДНК в политенных хромосомах слюнных желез в районах Х-хромосомы, находящихся на расстояниях 5, 30 и 65 т. п.п от точки разрыва в перестройке рп2а и производных от нее вторичных перестройках. Проверепо также

влияние на степень представленности ДНК таких модификаторов эффекта положения, как добавочная У-хромосома и источник наследования перестройки (отцовский эффект).

Степень представленности находящихся рядом с точкой разрыва эухроматических последовательностей определялась следующим образом. Сначала был проведен поиск рестрикгно-го полиморфизма между линиями и>° и Батуми (рп2а и вторичные перестройки получены из Батуми и по рестриктной карте от нее не отличаются). Для этого с помощью Саузерн-анализа сравнили автографы препаратов геномных ДНК линий рп2а и Батуми, переваренных различными рестриктазами. Зондами для гибридизации служили космиды из района 2Е. Были обнаружены три участка рестрихтного полиморфизма на расстояниях 5 (участок 1), 30 (2) и 65 (3) т. п. н. от точки разрыва. Причиной полиморфизма в случае участка 1 было различное число повторов последовательности длиной примерно 350 п. н. Полиморфизм в участке 2 вызван инсерцией мобильного элемента МДГ2 в линии gt V (Алаторцев, 1988). Полиморфизм в участке 3 обусловлен исчезновением сайта рестрикции Нш<Ш1 в gt к" по сравнению с Батуми. Фрагменты космид, выявляющие рсстрикгный полиморфизм, были субклонированы в рТ219К и использованы в дальнейшем в качестве зовдов. Во всех трех участках полиморфизм может бьггь выявлен при расщеплении геномной ДНК рестрикгазой Нш<1Ш. Это делало возможным измерение степени недопрсаставленности ДНК на трех разных расстояниях от точки разрыва на одном автографе.

Дня измерения количества ДНК на разных расстояниях от точки разрыва использовали мух генотипа \ijgt м»а (Я - хромосома с перестройкой). Были проведены три серии скрещиваний: получены гегерозиготы, в которых перестройка приходит от отца либо от матери, а также гете-розиготы, в геном которых была введена добавочная У-хромосома. Измерения степени представленности проводились путем сравнения интенсивности полос, соответствующих хромосоме с перестройкой и хромосоме и>а на радиоавтографах препаратов ДНК из слюнных желез гибридов. В качестве контроля использовались гибриды Батуми/^»/ уР. Автографы сканировали в проходящем свете на планшетном сканере и полученные изображения экспортировали в программу 1подс<3иаш для количественного анализ. Для всех вариантов скрещиваний были проведены по крайней мере два независимых эксперимента.

Пример автографа с недопредсгавленносгью приведен на рис. б, а результаты обработки результатов всех проведенных измерений представлены в виде графиков на рис. 7.

рч'

Ват Ва1 гЗО ш100 г20 тп141 рп2а

-Л

Рис. 6

Недопредставленность ДНК при эффекте положения. Во всех скрещиваниях перестройка наследовалась от самца. И - полоса, соответствующая хромосоме с перестройкой. В качестве пробы использован зонд 1.

Распространение эффекта положения

Рис. 7

игарI

■[Ъ

ям«»

•я

Перестройка от самца

Перестройка от самки

Перестройка от самки * добавочная У-хромосоиа

40 60 80 Расстогние втп н

&>г Зависимость степени недопред-ставленносги ДНК от расстояния до границы с гетерохроматином. Изображена молекулярная карта района; указаны (цифры 1, 2, 3) места расположения использованных в работе зондов. На графиках по оси X отложено расстояние до границы с гетерохроматином, по оси У - отношение количества ДНК в ненарушенной хромосоме к количеству ДНК в том же районе хромосомы с перестройкой. Для каждого из графиков приведены данные об источнике перестройки (от отца или матери).

В хромосоме рп2а и ее производных обнаруживается недопредставленность последовательностей эухроматической ДНК вблизи эу-гетерохроматической границы. Так, в рп2а на расстоянии 5 т. п. и. от точки разрыва при наследовании перестройки от отца содержание ДНК снижено примерно в 13 раз. Степень недопредсгавленности убывает с увеличением расстояния от точки разрыва: в рп2а на расстоянии 30 т. п. н. содержание ДНК снижено только в 8 раз, а на расстоянии 65 т. п. н. количество ДНК в перестройке не отличается от количества ДНК в нор-

мальной хромосоме. Сравнение перестроек с разной силой эффекта положения показало, что степень недопредставленносш положительно кореллирует со степенью инактивации генов. Если в рп2а содержание ДНК на расстоянии 5 т.п.и. снижено в 13 раз, то в mlOO (перестройка с самым слабым, но детектируемым, эффектом положения) только в 3.5 раза. Степень недопред-ставленности зависит от направления скрещивания, она в 3 раза выше когда перестройка наследуется от отца. Введение в геном добавочной Y-хромосомы приводит к супрессии эффекта: степень недопредставленности в этом случае в 2 раза ниже. Следует отметить, что те же закономерности справедливы и для степени инактивации генов из района 2Е.

В случае рп2а инактивация генов наблюдается на значительно больших расстояниях, чем распространяется недорепликация. Для гена Pgd (кодирует фермент 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, 6ФГД) Слободянюком (Слободянюк&Серов, 1984) была продемонстрирована заметная (1.7 раза) инактивация в слюнных железах. Результаты получены при сравнении активностей изоферменгов 6ФГД из нормальной и перестроенной хромосом. Pgd находится на расстоянии 110 т. п. н. от точки разрыва, тогда как недопредставленность не распространяется далее 65 т. п. н. Таким образом, в случае перестройки рп2а инактивацию генов при ЭП невозможно объяснить элиминацией ДНК даже в полигенных тканях.

В гЗО инактивации генов рп и wapl при ЭП не отмечено, однако наблюдалась заметная (в 1.5 раза) недопредставленность ДНК (см. рис. 6 и 7). Следует отметить, что ближайший из проанализированных на наличие эффекта положения генов, prune, находится на расстоянии примерно 35 т. п. н. от точки разрыва, тогда как недопредставленность наблюдалась не далее чем на расстоянии 5 т. п. и. Возможно, в гЗО транскрипционная инактивация не распространяется далее 5-10 т.п.н. отточки разрыва. Таким образом, недопредставленность в случае гЗО служит указанием на наличие в этой перестройке слабого эффекта положения, не обнаруживаемого генетическими методами.

Литературные данные свидетельствуют о том, что эффект положения не всегда сопровождается недопредегавленностью ДНК политенных хромосом. В частности, недопредставленность не наблюдалась на расстоянии 4 т. п. н. от точки разрыва, при том что находящийся там же ген rosy был инактивирован в 7 раз по сравнению с нормой (Rushlov&Chovnick, 1984). Описаны ситуации, когда при инсерции Р-элементов в прицентромерный гетерохроматин репортер-

ный ген инакгивировался, давая типичную картину ЭП, а последовательности ДНК в районе инсерции бьши представлены на уровне нормального эухроматина. В то же время известны примеры (Karpen&Spradling, 1990, данная работа), когда хромосомные перестройки сопровождались сильной недопредставленносгью эухроматической ДНК. Следовательно, возникновение недопредставлешгасти определяется дополнительными факторами, помимо общих для гетеро-хроматина, вызывающих ЭП. К сожалению, известно только несколько примеров работ, в которых была бы измерена недопредставленность ДНК и в то же время определен характер примыкающих к точке разрыва (или сайту инсерции Р-элеменга) гетерохроматических последовательностей. На основании литературных данных, в частности работ Карпена (Karpen&Spradling, 1990) а также представленного выше материала, можно предположить, что недопредставленность при эу-гетерохроматических перестройках наблюдается в тех случаях, когда эухроматин соседствует с блоком тавдемных повторов. Когда же эухроматин соседствует с достаточно протяженным районом уникальной ДНК недопредставленность может не наблюдается несмотря на. наличие эффекта положения. Для возникновения недопредсгавленности необходимы специфические гетерохроматические факторы, так как модификаторы эффекта положения (такие как дополнительная Y-хромосома) влияют и на степень недопредсгавленности.

Увеличение представленности гетерохроматических последовательностей политенных хромосом при приближении к эухроматину.

В перестройке mlOO блок гетерохроматина, содержащий кластер генов Stellate, оказался перенесенным в эухроматиновос окружение (Толчков и. др., в печати, см. рис. 8). Гены представлены в геноме Drosophila melanogaster двумя тандемными кластерами: в эухроматине, в районе 12Е (euSte) и в гетерохроматине в блоке 26h и на границе блоков 26 и 27 (hetSte), а также отдельными копиями, часто содержащими повреждения. Гены Stellate в составе гетерохроматинового кластера могут кодировать белок, гомологичный р-субъединице казешшиназы П (Tulin et. al. 1997). Гетерохроматический кластер Stellate сильно недопредставлен в политенных хромосомах слюнных желез (Шевелев, 1992).

Представляло интерес выяснить, влияет ли отделение от основного блока гетерохроматина и перенос к эухроматину па степень представленности гетерохроматического кластера

Stellate. Мы сравнили соотношение количеств euSte и hetSte в хромосомах рп2а и ml00 в поли-тенных и диплоидных тканях. Это возможно, так как элементы эу- и гетерохроматического кластера дают различающиеся по размерам фрагменты при рестрикции по Cfol.

Так как ml00 в гомозиготе нежизнеспособна, были получены мухи генотипа ml00/Df(l)hSte и /?n2a/Df(l)hStc. Df(l)hSte - производная от рп2а перестройка с делецией дис-тального гстсрохроматина, включающего гены Stellate. Гетерозигот /M.2a/Df(l)hSte использовали в качестве контроля. Скрещивания были поставлены при 18 и 25°С для изучения влияния температуры на степень недопредставленности ДНК. Анализ недопредставленности был основан на сравнении интенсивности гибридизации зонда с последовательностями hetSte и euSte на Сау-зерн-блотах ДНК m слюнных желез.

C?F SD 12F

2E 1A

lr>(1LR)pn2a

Сложная перестройка приводит к переносу фрагментов Х-хромосомы на 2 хромосому. Кластер Ие151е оказывается приближен к эухроматину

-1В4

12F 20F

Рис 8. Происхождение перестройки тЮО. Стрелками указаны точки разрыва в хромосоме рп2а.

20F

xpouoeou«2 ЛЯГТ

euSte/hetSte

pn2a, 18 С т100,18 С т100,25С

S имаго ■ с.ж.

Рис 9. Отношение количества зухроматиче-ских Ste к гетерохроматическим Sie в рп2а и шЮО. В ДНК мух количество euSte примерно в 10 раз меньше, чем hetSte. С. ж. -слюнные железы.

Результаты анализа представлены на рис. 9. В линии Батуми и ее производных - рп2а и вторичных перестройках количество копий генов эухроматических Stellate примерно в 10 раз меньше чем гетерохроматических. В политенных хромосомах слюнных желез содержание hetSte снижено примерно в 18 раз, поэтому соотношение эухроматических копий к гетерохроматическим резко возрастает (см. рп2а, рис 9). В политенных хромосомах шЮО количество hetSte снижено только в 4.7 раза (при 18°С), таким образом, количество ДНК увеличено в 3,7 раза по сравнению с нормальной хромосомой. Повышение температуры выращивания личинок приводит к дальнейшей супрессии недопредставленное™ - при 25°С hetSte недопредставлены в три раза. Приведенные выше цифры были получены, исходя из предположения о том, что при поли-

тенизации кластер эухроматических Stellate реплицируется полиостью и степень представленности euSte соответствует степени представленности эухроматина. Если euSte в какой-то степени недопредставлены в политешшх хромосомах, то абсолютные цифры недопредставленности het-Ste будут выше указанных, но соотношение между рп2а и ml 00 останется тем же.

Таким образом, не только гетерохроматические последовательности могут влиять на степень представленности соседних эухроматических. Наблюдается и обратная сшуация, когда близость к эухроматину заставляет гетерохроматиновые последовательности приобретать некоторые свойства эухроматина, в частности, полнее реплицироваться. Это, в свою очередь, означает что недопредставленность вызвана не только локальными свойствами гетерохроматиновых последовательностей, для ее возникновения нужно специфическое гетерохроматиновое окружение.

Выводы

1. Определена нуклеотидная последовательность ДНК на границе эухроматина и гетерохрома-тина в инверсии Х-хромосомы In(lLR)рп2а, вызывающей эффект положения генов. Разрыв в эухроматине произошел внутри гена винкулина, а в гегерохромагине - в блоке сателлита AAGAG в правом плече Х-хромосомы.

2. Показано, что соседство с блоком сателлита приводит к «недопредставленности» эухромати-ческих последовательностей вблизи границы эу - и гетерохроматина в политенных хромосомах слюнных желез. Степень недопредставленности падает по мере удаления от границы: максимальна (13 - кратная) на расстоянии 5 т.п.н., 8 - кратная на расстоянии 30 т.п.н. и на расстоянии 65 т.п.н. недопрздставленность не обнаружена. Инактивация генов распространяется на значительно большие расстояния - до 600 т. п. н. Модифицирующие эффект положения факторы (материнское или отцовское происхождения перестройки, дополнительная Y-хромосома), влияют на степень недопредставленности так же, как и на степепь инактивации генов.

3. Степень недопредставленности ДНК в производных от In(lLR)/jn2a перестройках с ослабленным эффектом положения снижалась параллельно снижению инактивации генов. В одной из перестроек фрагмент блока сателлита AAGAG вызывает неаопредставленность ДНК в 1.6 раза на расстоянии 5 т.п.н. от точки разрыва, при этом инактивации генов в перестройке обнаружено не было.

4. Перенос в результате хромосомной перестройки мЮО гетерохроматических повторов Stellate в эухроматиновое окружение приводит к возрастанию их содержания в политенных хромосомах в три раза по сравнению с нормой. В норме содержание гетерохроматических повторов Stellate в полигенных хромосомах снижено в 18 раз.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Крамерова И. А., Лавров С. А. Картирование эухромагической точки разрыва перицентриче-екой инверсии In(lLR)/m2a.// 1 Съезд Вавиловского общества генетиков н селекционеров (ВОГИС). Тезисы докладов. Генетика. - 1994. - Т. 28 (Приложение). - С. 81.

2. Лавров С. А., Толчков Е. В., Крамерова И А., Гвоздев В А.. Нарушение политенизации ДНК эухроматического района Х-хромосомы Drosophila melanogaster, вызванное эу-гстерохроматической перестройкой.// Молекулярная биология. - 1998,- Т. С.

3. Kramerova I. A., Frolov M. V., Lavrov S. A., Westphal V„ Alatortsev V. A. Drosophila Vinculin gene is non-essential for viability of flies.// 37tli Annual Drosophila research conference. San Diego. - 1996. - Abstract book. - P. 98.

4. Lavrov S. A., Tolchkov E. V., Kramerova I. A. DNA representation in a set of chromosome rearrangements with various strength of РЕV.// 38th Annual Drosophila research conference. Chicago. - 1997,- Abstract book. - P. 116.

5. Tolchkov E. V., Kramerova I. A., Lavrov S. A., Rasheva V. I., Bonaccorsi S., Alatortsev V. E.. Gvozdev V. A. Position-effect variegation in Drosophila melanogaster X chromosome inversion with a breakpoint in a satellite block and its suppression in a secondary rearrangement. // Chromo-soma. - 1997. - V. 106. N. 8. - P. 520-525.

6. Alatortsev V. E., Kramerova I. A., Frolov M. V., Lavrov S. A., Westphal E. D. Vinculin gene is non-essential in Drosophila melanogaster.// FEB S Letters. - 1997. V. 413. N. 2. -P. 197-201.