Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности микробной трансформации азота в кишечнике термитов и в термитниках

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности микробной трансформации азота в кишечнике термитов и в термитниках"

02-4

1494-1

На правах рукописи

ГОЛИЧЕНКОВ Максим Владимирович

ОСОБЕННОСТИ МИКРОБНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ АЗОТА В КИШЕЧНИКЕ ТЕРМИТОВ И В ТЕРМИТНИКАХ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2002

Работа выполенена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 3 декабря 2002г. на заседании диссертационного совета К501.001.05 в МГУ им. М.В. Ломоносова

Адрес: 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ. Автореферат разослан «......»........................2002г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании Диссертационного совета. Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах просим направить по указанному выше адресу.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

д. б. н., проф. М М. Умаров д.б.н., проф. В.Т. Емцев д.б.н., Д.П. Жужиков Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН

Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н.

Л.М. Полянская

Аь^адьность темы. '

: Термиты - типичные почвообитающие общественные насекомые.* живущие колониями в гнездах-термитниках. В настоящее время известно свыше 2000'видов термитов, объединенных в 9 семейств. Некоторые особенности биоДОгий* и экологии термитов делаю:- их, по нашему мнению, весьма перспективным объектом исследований для многих смежных областей естественных наук. Например, высокая численность и плотность термитов в местах их расселения, которая может достигать' 3-4 г термитов на I дм3 почвы (в Заире) или 10 млн. особей на гектар (в Малайзии) (Кииятков, 1991), несомненно, указывает на значительный вклад' этих насекомых в биогеохимическую обстановку тропических регионов. При этом геохимическое значение среднеазиатских термитов, обитающих в пустынях, не менее велико, однако, изучено значительно хуже (Кипятков, 1991). Одна из первых работ по этой тематике была- выполнена почвоведом -Николаем Александровичем Димо (Димо, 1916). В дальнейшем, определенный вклад в изучение влияния термитов на почву был сделан другими исследователями (Союнов, 1973; Мамаев, Союнов, 1976). В то же'время вопросы, связанные с исследованием влияния термитов на круговорот основных биофильных элементов, в частности, азота, до настоящего времени остаются не решенными.

Являясь ксилофагамй, термиты не в состоянии усваивать потребляемую ими древесину, которая служит им основным кормом, без помощи разнообразных микроорганизмов. Известно, что содержание азота в древесине не превышает. 0.15% (РоЫсиэ, Вгеглак, 1981), поэтому проблема обеспечения этим элементом является важнейшей для колонии термитов. Впервые мысль о роли бактерий - аэотфиксаторов в азотном питании термитов была высказана Дж. Кливлендом в 1925 году, но только во второй половине XX столетия эта идея получила экспериментальное подтверждение, когда изотопным методом (13М) удалось показать, что до 60 % азота, входящего в состав термита, имеет атмосферное происхождение (Тауази, 1998). Тем не менее, до сих яар малоисследованным остается обширный пласт вопросов, касающихся особенностей азотфиксации у различных видов термитов, аспектов йх взаимодействия с азотфиксирующими бактериями.

Делью работы являлось изучение особенностей взаимодействия термитов с диазотрофными бактериями и оценка микробиологической активности в термитниках Туркмении.

Задачи, исмедования:

1. Изучить особенности азсггфиксации и денитрификации в пищеварительном тракте и гнездовом материале термитов.различных видов.

2. Охарактеризовать групповой состав бактерий - азотфиксаторов кишечника термитов и материала термитников.

3. Изучить аспекты взаимодействия бактерий-азотфиксаторов с термитами.

. 4. Оценить, активность процессов азотфиксации, денитрификации, дыхания и меганогенеза в термитниках Туркмении.

новидна;

Впервые проведено сопряженное изучение азсгтфиксации и денитрификации у термитов Neotermes castaneus и в их гнездовом материале. Установлено, что в структуре сообщества бактерий-азсггфиксаторов кишечника этих термитов преобладают факультативно-анаэробные бактерии,. представленные p. Bacteroides, членами семейства Enterobacteriaceae (с доминированием рода Escherichia) и родом Staphylococcus.

. Впервые для . изучения особенностей азогфиксации и взаимодействия азотфиксирующих бактерий с организмом «хозяина» применен метод спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО). . Показано, что бактерии -аз отф икс агоры, обитающие в термитах, способны к прижизненной экскреции азотсодержащ их продукте в во внешнюю среду, т.е. в кишечник термита.

Опытным путем доказано, что для поддержания баланса азота термитам необходимо постоянно пополнять пул бактерий-азотфиксаторов, главным образом, за счет представителей рода Bacteroides, из чего следует, что эти бактерии являются транзитными формами, а не облигатными симбионтами.

Изучение термитников Туркмении позволило выявить их неоднородность как по распределению органического вещества, так и по микробиологическим процессам его трансформации. Показано, что в термитниках происходят, процессы накопления азота и углерода.

Практическая;!^

Материалы исследования будут полезны при оценке вклада термитов в азотный баланс почв. Коллекция бактерий-азотфиксаторов, полученная в ходе исследования, представляет интерес для биотехнологии.

Основные положения работы доложены на VI Международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов - 99» (Москва, 1999), на III Съезде Докучаевского общества почвоведов (Суздаль, 2000), на II Международной конференции «Актуальные проблемы современного естествознания» (Калуга, 2001), VI Международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков» (Москва, 2001).

Данные, полученные в ходе исследования, были представлены также на VIII и IX Международных симпозиумах по азотфиксации у небобовых (Сидней, 2000; Бельгия, 2002).

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 8 тезисов.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа изложена на......страницах текста, содержит...... иллюстраций,......

таблиц. Список литературы включает.......наименований.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили лабораторные культуры термитов Neotermes castaneus Burmister, Zootermopsis angusticollis Hagen и Riíiculitermes lucißigiis Iloxsi, а также их гнездовой материал, так называемые «лепки». Этот материал был любезно предоставлен нам Дмитрием Павловичем Жужиковым, в.н.с. кафедры энтомологии Биологического факультета МГУ. Кроме того, в своей работе мы использовали термитов Anacanlholermes ahngeriemus Joe., образцы почвы из их термитников и типичного серозема, полученные с исследовательской станции Баба-Дурмаз из Республики Туркменистан.

Определение интенсивности процессов азотфиксации, денитрификацин, змнссии метана и углекислого газа проводили методами газовой хроматографии (Методы почвенной микробиологии и биохимиии, 1991). Групповой состав азотфиксаторов изучали

методом посева на среду Эшби при инкубировании в аэробных и анаэробных условиях. В последнем случае чашки с посевами инкубировали в анаэростатах, заполненных азотом, после предварительного вакуумирования. Идентификацию чистых культур проводили по микроморфологическим и физиолого-биохнмическим показателям с помощью Определителя бактерий Берджи (1997) и с использованием автоматизированной системы для идентификации микроорганизмов Vitek-60 (bioVíereux).

Оценку состояния азотсодержащих компонентов клетки осуществляли методом спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения (H1IBO) (Королев 1973, 1998).

Определение содержания азота и углерода в образцах термитников и почвы выполняли методом Къельдаля и на HCN -анализаторе.

Статистическую обработку данных проводили при помощи программ Excel.

Результаты исследований Нет^огеназнаяаетивн

В аэробных и анаэробных условиях инкубации определяли актуальную активность азотфиксации у живых термитов Reticulitermes lucífugas, Neotermes castaneus и Zootermopsis angusticollis, содержащихся в лабораторных культурах, а также у природной популяции термитов Anacanthotermes ahngeriamis и в материале их термитников (табл. 1).

Для всех изучаемых объектов характерен значкгельный уровень нитрогеназной активности, причем азотфиксирующая активность термитов в 2-10 раз выше, чем в материале -термитника. Максимальная нитрогеназная активность, измеренная в аэробных условиях, отмечена у термитов N. castaneus и Z angusticollis.

Отметим, что у термитов 2. angusticollis столь высокая нитрогеназная активность выявлена впервые. Ранее Джон Брезнак (Breznak, 1982) показал наличие низкой азотфиксирующей активности у представителей рода Reticuliíermes (Я JJavipes) и Zootermopsis sp., что существенно отличается от результатов наших измерений. Сведения для вида Neotermes castaneus получены нами впервые.

Меньшим уровнем нитрогеназной активности обладали термиты R. hicifugus и Anacanthotermes ahngerianus. Таким образом, изученные виды термитов резко различаются по уровню азотфиксации при измерении в стандартных условиях. Отметим, что лабораторные культуры термитов показали даже большую азотфиксиругощую активность, чем термиты природных популяций (из термитников Туркмении).

Исходя из представления, что азотфиксация - процесс анаэробный, нитрогеназную активность измеряли также и в анаэробных условиях как у термитов N. сах1апеи.ч и II 1иа/и&!$, так и в лепках всех представленных видов. Показано, что в анаэробных условиях азотфиксация у термитов примерно в 2 раза выше, чем в аэробных, а максимальной разницы нитрогеназная активность достигает в лепках. Исходя из полученных данных можно полагать, что азотфиксация у термитов и в их лепках осуществляется, главным образом, факультативно-анаэробными бактериями.

Таблица 1

Актуальная нитрогеназная активность [ймоль СгНУг х ч] у живых термитов и в

материале термитников

Вид термита Термиты Материал термитника

аэробно анаэробно аэробно анаэробно

Neotermes сэ81апеи8 8.90Ю.95 11.23±1.1 0.70±0.11 3.60±0.45

Zooteгmops¡s апдивНсоШз 5.57 ±0.53 нет данных 2.50±0.33 1.95±0.26

ЯеИсиШегтез /исЯидиз 0.90±0.11 1.90±0.29 0 12±0.02 0.60±0.09

АпасаМШегтев аЬпдепапиз 0.79±0.12 нет данных 0.40±0.05 нет данных

Дктивность^ен^

Поскольку денитрификация - важное звено в цикле азота, а многие бактерии -азотфиксаторы являются одновременно и денитрификаторами (Умаров, 1986), то представлялось интересным оценить активность этого процесса у термитов и в их лепках (табл. 2). Отметим, что в литературе практически нет данных о денитрификации у термитов. Достаточно высокий уровень денитрификации выявлен нами в лепках Я. /ма/н£7« и N. сах/апеих. В то же время, у термитов обоих видов, в пределах чувствительности использованного метода, денитрификацию обнаружить не удалось даже

5

при добавлении нитратов и глюкозы, что свидетельствует о наличии неких механизмов регуляции этого процесса.

Таблица 2

Потенциальная активность деннтрнфикации |мкг [Ч-МгО/г х мае] в материале термитников и у термитов [ИиЫ/ициа и Л/.сдл/ал<?;м\

Вид Термиты Гнездовой материал

Neotermes castaneus He обнаружена 3.15 ± 0.57

Reticulitermes lucifugus He обнаружена 3.98 ±0.47

кишечника термин

Следующим этапом работы явилось изучение численности и состава бактерий пищеварительной системы термитов и материала термитника. Следует подчеркнуть, что характеристика бактериального комплекса N.. castaneus получена впервые. Согласно многократным оценкам, численность бактерий-азотфиксаторов в кишечнике и в лепках термитов N. castcmeus составляет в среднем 3.7x106 и 1. 1х106 КОЕ/г соответственно и мало отличается от данных для других видов термитов (Орлова, 1972).

В структуре бактериального сообщества кишечника термитов (рис. 1) преобладают анаэробные и факультативно - анаэробные бактерии, составляющие до 60% от общего числа "кишечных" бактерий. Этот комплекс включает представителей семейства Enterobacteriaceae (20%) (с доминированием рода Escherichia), p.p. Bacteroides и Staphylococcus (24% и 17%, соответственно). Все эти бактерии являются характерными обитателями кишечника многих беспозвоночных животных (Третьякова и др., 1996). Специфической особенностью бактериального сообщества кишечника термитов N. castaneus можно считать наличие в числе доминантов бактерий рода Arthrobacter (33%) -типичного педобионта.

Для изучения структуры комплекса анаэробных и факультативно-анаэробных азотфиксирующих микроорганизмов использовали анаэростат, культивируя микроорганизмы в атмосфере азота. Было установлено, что доминантами среди

б

факультативно-анаэробных бактерии являются представители родов BacleroiJes. Bacillus и коринеформные бактерии (рис. 2).

Бактериальное сообщество, сформировавшееся в лепках (рис. 3) имеет иную таксономическую структуру по сравнению с "кишечным" сообществом. Главным отличием является доминирование облигатно-аэробных бактерий порядка Myxobacterales, для которых характерна высокая целлюлозолитическая активность; они часто встречаются со спутниками, в том числе и азотфиксаторами (Определитель бактерий Берги, 1997). Кроме того, в бактериальном сообществе материала термитника в качестве содоминанта присутствуют факультативно-анаэробные бактерии p. jfjacteroides, характерные для кишечника термитов и, вероятно, попадающие в лепки с экскрементами. Представители других родов, выделенные из этого субстрата в качестве минорных компонентов, являются типичными педобионтами: Arlhrobacter (11%), Bacillus (8%), Rhodococcus (1%).

Ометим, что все выделенные из кишечника термитов бактерии обладали значительным уровнем нитрогеназной активности при культивировании на безазотистых средах.

Примечательно, что структура микробного комплекса кишечника «туркменских» термитов Anacanthotermes ahngerianus отличалась существенно меньшим разнообразием бактерий, причем безусловными доминантами являлись бактерии р. Micrococcus. Подобную структуру микробного сообщества, вероятно, нельзя считать типичной для термитов этого вида в естественной среде обитания, поскольку выявленное нами доминирование микрококков совпало с гибелью всех насекомых, наступившей на 7 - 10 сутки после изъятия их из природной среды. Косвенно нетипичность подобной структуры микробного комплекса подтверждается и невозможностью культивирования термитов этого вида в лабораторных условиях (сообщение Д.П. Жужикова). Кроме того, такое же резкое увеличение доли Micrococcus (примерно, в 1000 раз) было отмечено Э.А. Орловой (1972) у термитов R. lucifugus при недельном содержании их вне гнезда.

пор. МухсЬас1ега(е5

р. ЭЫрИу^ососсиБ 17%

Рис. I Структура бактериального комплекса кишечника термитов N.

_саа1апеи5________

Коркисформньм

27%

Рис. 2 Структура комплекса факультативно-анаэробных бактерий кишечника термитов N. саз(апеиз

Рис. 3 Структура бактериального комплекса гнездового материала термитника N. саз(апеиз

Меха|жзмыпередачифик^

Одним из наименее изученных вопросов биологии термитов остаются механизмы передачи азота, фиксированного бактериями, термиту. Для разрешения этой проблемы нами впервые был использован метод спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО). Метод спектроскопии НПВО позволяет анализировать клетку по слоям без ее разрушения, получать данные о прижизненном биохимическом составе этих слоев и сведения о степени пространственной организации биохимических компонентов, присутствующих в клетке (Королев, 1998).

В качестве объекта исследования нами была выбрана культура ВасШи.% ИсИеп1/огпнх, выделенная из кишечника термитов N1 с\astanens. Она являлась активным азотфиксатором, демонстрировала хороший рост на селективных безазотистых средах (Федорова-Калиниской - (ФК)), и, что немаловажно, была обильно представлена в кишечнике термитов и в материале термитника. В процессе эксперимента были получены ИК-спсктры в параллельно и перпендикулярно поляризованном свеге, позволяющие оценить степень пространственной ориентации биополимеров. На спектрах отчетливо видны полосы поглощения, соответствующие группам АМИД-1 и АМИД-2, соотвествующие связям С-О и Ы-Н (рис. 4).

Сравнение литературных данных (Королев, 1973, 1998) по спектрам различных бактериальных клеток со спектрами, полученными нами для культуры Bacillus licheniformis, показало необычное раздвоение полосы АМИД-2, а так же значительное увеличение этой полосы относительно АМИД-1. Поскольку полоса АМИД-2 характеризует наличие связи N-H, то вполне допустима ее связь с азотфиксиругощими свойствами исследуемой культуры. Кроме того, в спектре культуры, выращенной на безазотистой среде (ФК), полоса АМИД-2 значительно интенсивнее, чем у культуры, выращенной на МПА. Так как интенсивность полосы АМИД-2 в области клеточной стенки практически не

|«вС I5&0

I )

A) Б)

B)

\лгп

амид-1 амид-2

А)

МПА Б>

В)

1S60 ., i ™

МПА

ФК

амид-1 амид-2

Спектры целой клспси в параллельно поляризованном

Спектры клеточной стенки а параллельно поляризованном свете

Рис. 4 Спектры НПВО бактериальных культур

а- типичный спектр бактерии, не фиксирующей азот; ß- Bacillus licheniformis (из Neoiermes castaneus) на МПА (нитрогеиаэная активность отсуствует); в- Bacillus licheniformis (из Neoiermes castaneus) на ФК (нитрогеназная активность есть)

отличается от таковой в целой клетке, то можно утверждать, что компоненты связи N-H, характеризуемые данной полосой, в основном локализованы в области клеточной стенки. На основании этого можно сделать предполржение, что клетка экскреггирует продукты азотфиксацин в окружающую среду, что представляется логичным, учитывая тот факт, что эта бацилла выделяется не только из термитов, но и из материала термитника.

Влияние.цмлюлодиой

термитов

Проведенные нами многочисленные измерения азотфиксирующей активности выявили значительную вариабельность этого показателя у термитов одного возраста и живущих в одном I иезде. Иными словами, азотфиксирующая активность не является постоянной величиной и значительно изменяется во времени. Очевидно также, что азотфискирующая активность, обнаруживаемая в данный момент у термитов, определенным образом связана с наличием и активностью бактерий-азотфиксаггоров, присутствующих в пищеварительном тракте термитов в момент измерения. Вопрос наличия и степени влияния диазотрофов, постоянно пристствующих в термитах! и диазотрофов, получаемых термитом вместе с кормом, на общий уровень азотфиксации у термитов до сих пор не изучен. Итак, представленный ниже опыт имел своей целью' выявить факт присутствия и степень влияния «облигатных» (присутствующих в пищеварительном тракте термита постоянно) и «транзитных» (получаемых термитом с кормом из окружающей среды) бактерий-азотфиксаторов на общий уровень азотфиксации у термитов.

Для этого две группы термитов N. саэ/апеиз по 12 особей в каовдЬй содержались в чашках Петри на стерильной фильтровальной бумаге в течение 70-100 суток. У первой группы («контроль») фильтровальную бумагу не заменяли на протяжении всего опыта, а у второй группы («опыт») фильтр периодически меняли. Соответственно, термиты из контрольной группы имели возможность регулярно пополнять состав кишечной флоры за счет реутилизации собственных экскрементов, что характерно для термитов, а у группы «опыт» такой возможности не было, и, следовательно, кишечная флора, особенно та ее часть, которая могла быть представлена транзитными формами бактерий, должна была прогрессивно обедняться. Опыт был проведен в двух сериях 100 и 70 суток, соответственно. Результаты представлены на рисунке 5.

В первой серии опыта наблюдалось закономерное уменьшение нитрогеназной активности у обеих групп термитов, причем особенно резкое снижение нирогеназной активности отмечено в течение первых четырех суток опыта. При этом у опытной группы термитов за указанный период нитрогеназная активность снизилась практически до нуля. Далее, к 25-м суткам, следовал незначительный подъем и затем, до конца опыта, относительная стабилизация азотфиксирующей активности в обеих группах. Обращает на

себя внимание определенная синхронность нитрогеназной активности в контрольной и опытной группе термитов, однако, у опытной группы термитов нитрогеназная активность была всегда достоверно ниже, чем у контрольной.

Вторая серия опьгга (рис. 5) существенно отличается от первой ярко выраженной тенденцией к увеличению диазотрофной активности обеих групп термитов. Причины этой тенденции, по всей вероятности, обусловлены или индивидуальными особенностями термитов (Waller и др., 1989), или сезонной динамикой их активности (Pandey и др., 1992).

. Во второй серии опыта также отчетливо выделяется синхронность нитрогеназной активности, демонстрируемая контрольной и опытной группами термитов. Кроме того, так же как и в первой серии опыта, нитрогеназная активность опытной группы термитов во все сроки наблюдения достоверно ниже, чем в контрольной группе.

Наиболее существенным результатом этого эксперимента можно считать появление случаев каннибализма, который был отмечен только у термитов опытной группы как в первой (на 4-е сутки), так и во второй сериях опыта (на 36-е и 56-е сутки). Из литературы известно, что для термитов характерен каннибализм как способ консервации азота при его дефиците (Lee, 1991). После случаев каннибализма наблюдалось резкое падение нитрогеназной активности (рис. 5), что можно связать с поступлением в пищеварительный тракт термитов аммонийных соединений, которые ингибируют азотфиксацию. В дальнейшем происходила стабилизация азотфиксирующей активности, обусловленная деятельностью азотфиксаторов, полученных термитами из съеденной особи (напомним, что у опытной группы термитов не было возможности потреблять собственные экскременты, могущие содержать доступные соединения азота и азотфиксаторов). Важно отметить, что полученные в ходе эксперимента данные являются доводом в пользу транзитного характера азотфиксаторов, обитающих в кишечнике термита и для нормального существования ему необходимо регулярно пополнять пул бактерий кишечного тракта. Основными механизмами пополнения служат копрофагия, проктодеальный трофаллаксис и каннибализм - в случае крайнего дефицита азота.

4,5 4 3,5

Й 2.5 ^ 2 |1,5 1

0,5 О

1

Г" ^^^ 1 1. Г

\------

/ 1 п М(н1<

4

сутки

25

•Групп« 1 "Контроль" - - Группа 2 " Опыт*

100

Серия 1

14 12

8 10 8 6 4 2 О

г

л §

Серия 2

Рис. 5 Динамика нитрогеназной активности термитов в ходе экперимента

системы, тер.мэт^

я.и.та

В контексте нашей работы особенно важным представляется показать, как изменялся комплекс азотфиксаторов у термитов за время эксперимента, поскольку изменение диазотрофной активности в ходе модельного опыта, безусловно, было обусловлено и сопровождалось значительными изменениями в структуре микробного сообщества кишечника термитов (рис. 6, 7). За время эксперимента структура микробного сообщества кишечника термитов претерпела значительные изменения, которые затронули и контрольную и опытную группу термитов. К 20-м суткам опыта из числа доминантов обеих групп исчезают типичные почвенные бактерии рода Arlhrobacter. При этом доля представителей порядка Myxobacterales значительно возрастает, что можно связать со специфической целлюлозной диетой термитов. При этом, у термитов опытной группы наблюдается резкое уменьшение численности бактерий представителей рода Bacteroides (до 1%) и увеличение доли представителей рода Escherichia (рис. 7 А) Однако, соотношение представителей этих родов у термитов контрольной группы незначительно отличается от такового в начале эксперимента (рис. I; рис. 6 А). В дальнейшем, у термитов контрольной группы, где подстилку не заменяли, на 70-е сутки эксперимента ' состав микробного сообщества азотфиксаторов кишечника практически не изменился по сравнению с 20-ми сутками. Наблюдается лишь незначительное увеличение доли миксобактерий и уменьшение количества представителей рода Bacteroides (рис. 6 Б). . Напротив, у термитов опытной группы состав микробного сообщества существенно меняется к концу эксперимента (к 100-м суткам). Сохраняется тенденция увеличения численности представителей рода Escherichia, порядка Myxobacterales. Доля представителей рода Bacteroides, как и на 20-е сутки, составляла менее 1%, при этом существенно уменьшилось количество бактерий рода Bacillus. Кроме того, у опытной группы термитов к концу эксперимента наблюдалось расширение группового состава микроорганизмов. Так, в составе микробного сообщества появились представители p.p. Cörynebacterium, Rhodococcus, Azospirillum (рис. 1; рис. 7 А, Б). В отдельном эксперименте нами было установлено, что бактериии рода Bacteroides являются характерными обитателями именно содержимого кишечника, то есть представителями «полостного сообщества)), а представители семейства Enterobacteriaceae, доминируют на

74

А)

АриазрмпИит 24

Б)

Рис. 6 Изменения в структуре микробного сообщества кишечника термитов контрольной гулпы на 20-е (А) и 62-е (Б) сутки

стенках кишечника и их можно назвать обитателями «пристеночного сообщества». В связи с этим необходимо отметить, что представители семейства Й1(«го6асГеп'асеа« часто обнаруживаются в «пристеночном сообществе» кишечника многих почвенных беспозвоночных, например, кивсяков РасИуЫи.чАа^реэ (Третьякова и др., 1996). Таким образом, можно полагать, что бактерии рода Вас1егснс!е.^ являются транзитными азотфиксаторами, поскольку они легко выводятся из организма и обильно представлены в материале термитника. Если за счет капрофагии не происходит их восполнения, как в контрольной группе термитов, то освободившуюся экологическую нишу занимают

15

Б)

Рис..7. Изменения в структуре микробного сообщества кишечника термитов опытной группы А) 20 -е сутки Б) 100-е сутки

бактерии рода Escherichia, нитрогеназная активность которых заметно ниже, вследствие чего они не могут обеспечить термита азотом в достаточной степени. Таким образом, для нормальной жизнедеятельности термитам, по крайней мере этого вида, необходимо присутствие и постоянное восполнение так называемых "транзитных" симбионтов-азотфиксаторов в пищеварительном тракте.

TiPKüffl.?.

Отдельным этапом нашей работы было изучение и количественная оценка процессов азотфиксации, денитрификации, дыхания и метаногенеза в природных термитниках. В опытах использовали образцы термитников Anacanthotermes ahngeriamts н серозема типичного - почвы, на которой формируется термитник, отобранные на биостанции Баба-Дурмаз в Туркмении.

Термитник, являясь неотъемлемой частью почв аридных пустынных ландшафтов, существенно повышает мозаичность почвенного покрова, и сам по себе является достаточно неоднородной и структурированной системой. Согласно полученным нами данным, содержание азота достигает максимальных значений в выстилке ходов и камер термитника (табл. 3). Аналогичная картина характерна и для распределения углерода, содержание которого в выстилке может достигать 15 % (в среднем 11%), а в фоновой почве не превышает 2%. Отметим, что выстилка представляет собой гумусоподобный, переработанный термитами почвенный и растительный материал темного цвета, резко отличающийся от фоновой почвы и от почвы, образующей купол термитника (далее «термитник»).

Таблица 3

Содержание азота и углерода в исследованных субстратах

Субстрат N общ % С общ %

Выстилка ходов и камер 0,95 11

Термитник (внешний слой , «купол») 0,42 нет данных

Фоновая почва 0,23 2.3

Данные об активности азотфнксации в различных компонентах термитника представлены на рис. 8. Они наглядно иллюстрируют высокую структурированность термитника.

Максимальной интенсивности азотфиксация достигает в термитах и составляет в среднем около 0,79 нмоль СгНУг * ч. Несколько ниже интенсивность процесса в выстилке ходов и камер термитника, в которых нитрогеназная активность составляет 0,4 нмоль С2Нд/г * ч. Во внешнем слое термитника значения азотфиксации минимальны и по своей интенсивности приближаются к уровню фоновой почвы.

1

0,9 0,8 ?0,7 $0,6 §0,5 ¿0,4

1аз 0,2 0,1 0

терлетн* терл-тгы вьстигка

1

■Зи

! |—| . Н

Рис. 8 Азотфнксирующая активность разных компонентов термитника

Подобная закономерность выявляется и при измерении метаногенной активности в тех же объектах (рис. 9). Выявленное распределение представляется вполне закономерным, поскольку выстилка является материалом, наиболее сильно подверженным воздействию термитов.

термитник почва термиты выстилка

Рис. 9 Метаногенная активность различных компонентов термитника

Как известно, азотфиксация и денитрификация являются противоположными процессами в цикле азота, поэтому данные по динамике и соотношению этих процессов в термитнике и в фоновой почве позволяют получить представление об азотном балансе в этих объектах. Кроме того, сведения о сезонной динамике этих процессов необходимы и для оценки вклада термитников в конкретный биоценоз.

Из данных, представленных на рис. 10, следует, что азотфиксирующая активность всех изученных субстратов достигает максимальных значений в летний период; минимальных - зимой.

Противоположная картина наблюдается для денитрификационной активности (рис. И). Характерно, что независимо от сезона наблюдений, интенсивность этих процессов в термитнике выше, чем в фоновой почве.

1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

гп

г ¿г *

1]

□ термитник

□ почва

5Г

сроки отбора образцов

Рис. 10 Сезонная динамика азотфиксирующей активности термитника и почвы

январь февраль март июнь сроки отбора образцов

□ термитник

□ гютва

Рис. 11 Сезонная динамика активности денитрификации о термитнике и в почве

Как известно, эмиссия углекислого газа является одним из важных, универсальных показателей биологической активности почв Данные по сеюнной динамике интенсивности выделения СО; из термитника и фоновой почвы представлены на рис. 12.

Из полученных данных следует, что максимальных значений этот показатель достигает в термитнике и в почве в конце зимы - начале весны, причем в термитнике, активность дыхания всегда достоверно выше, чем в почве.

Таким образом, полученные нами данные наглядно демонстрируют концентрационную функцию термитников в природных экосистемах, что согласуется и с литературными сведениями.

Учитывая достаточно большие площади, занимаемые термитниками, можно полагать, что их вклад в биологический круговорот основных биофилькых элементов, в частности азота, весьма значителен.

1,4 1,2

и ш

Й 0.8 -О ! о

6 0,6 *

а 0,4 -

I

0,2 4

I

о -I

1------

г&

□ почва

□ термитник

январь февраль март июнь

Рис. 12 Эмиссия С02 из термитника и из почвы

Заключительным этапом нашей работы явилась оценка численности и группового состава бактерий из образцов термитников («купол») и фоновой почвы -серозема, полученных из Туркмении. Для посева использовали образцы, отобранные в весенний период. Посевы производили на агаризованную безазотистую среду Эшби, а идентификацию бактерий до вида, в данном случае, осуществляли при помощи автоматизированной системы Vitek-60.

Согласно нашим оценкам, численность бактерий в термитнике и почве существенно различалась и составляла для термитника 0.7х10б и для почвы 5.5х106 КОЕ/г. Подобное распределение подтверждает нашу мысль о структурированности термитника, а небольшая численность бактерий хорошо коррелирует с данными по азотфиксирующей и метаногенной активности (рис. 8, 9), которые снижены во внешнем слое термитника.

Структура микробного комплекса термитника и фоновой почвы существенно различалась. В бактериальном сообществе термитника (Рис. 13 (А)) безусловным доминантом являлась Bukholderia cepacia (83%), которая, кстати, не была обнаружена нами в почве, где доминирует В. Hchemformis (81%) (Рис. 13 (Б)). Характерной особенностью обоих субстратов можно считать наличие представителей рода Micrococcus (М. roseus и М. luteus). Этот факт представляет определенный инетерес в связи с тем обстоятельством, что микробное население кишечного траката туркменских термитов было представлено бактериями именно этого рода (см. стр. 7).

Мюгососси&

говеиз М1сгососсиз 1% .- 1Ыеи» 1%

ВааПив

------арЬаепсиз

11%

ВикЬоИвла серэсга (Рвеиботопда серасга) 79%

А)

Б)

Рис. 13 Структура бактериального комплекса внешнего слоя термитника (А) н фоновой почвы (серозем типичный) (Б)

Выводы

1. Впервые обнаружен высокий уровень азотфиксации у термитов Neoterme.у

casianens.

2. Впервые исследована структура микробного сообщества азо1 фиксаторов в гнездовом материале и у термитов N. castanens. Показано, что в бактериальном сообществе кишечника термитов преобладают факультативно-анаэробные бактерии, представители семейством flnterobacteriaceae (с доминированием рода Escherichia), родами Bacteroiäes и Staphylococcus.

3. Показано, что для восполнения недостатка азота, термитам необходимо пополнять пул бактерий - азотфиксаторов, главным образом, за счет представителей рода Bacteroiäes, которые являются транзитными формами, а не облигатными симбионтами.

4. Выявлено, что запасы органического вещества и сопряженные с трансформацией этого вещества биологические процессы в термитниках Anacanthotermes ahngeriamis, приурочены к выстилкам ходов и камер.

5. Установлено, что термитники, являясь неотъемлемой частью почв аридных пустынных ландшафтов, не только повышают мозаичность почвенного покрова, но и представляют собой локусы повышенной напряженности всех основных микробиологических процессов.

Ш..И.?Х?Р.Н9Д%И.ЯНЕЕЙИЯ!ШИ опх(микдваны. ^

1. Голиченков М.В. Азотфиксация и денитрификация у термитов / Тезисы докл. Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 99». М. 19У9. С. 22.

2. Костина Н.В., Голиченков М.В. Симбкотическиая азотфиксация у термитов / Тез. докл. III съезда Докучаевского общества почвоведов. Суздаль. 2000. С. 77-78.

3. Савельев И.Б., Голиченков М.В., Калабеков А.Л. Методологические подходы к анализу интактных клеток / Тезисы докл. II Международной конференции «Актуальные проблемы современного естествознания». Калуга. 2000. С. 16-11.

4. Малахов Ю.И., Савельев И.Б., Калабеков А.Л., Голиченков М.В. Выявление биообъектов на фоне природного разнообразия / Тезисы докл. II Международной конференции «Актуальные проблемы современного естествознания». Калуга. 2000. С. 7879.

5. Golichenkov M.V., Kostina N.V., Umarov М. М. Symbiotic Nitrogen Fixation in Termites / 8Л Intcmetionai Symposium on Nitrogen Fixation with non-Legumes. Sydney. 2000. p. 127.

6. Королев Ю.Н., Малахов Ю.И., Калабеков А.Л., Голиченков М.В. Вопросы спектрального анализа скрытой анизотропии биологических объектов / Труды VI Международной научно-технической конференции "Оптические методы исследования потоков." М. 2001. С. 396-399.

7. Селях И.О., Воронцова Г.В., Голиченков М.В. Поляризация источника излучения и спектры целых клеток / Труды VI Международной научно-технической конференции "Оптические методы исследования потоков." М. 2001. С. 402-405.

8. Голиченков М.В., Умаров М.М., Костина Н.В. Микробная активность термитников Туркмении // Вести. Моск. ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 2002. №1. С. 50-52.

9. Голиченков М.В., Костина Н.В., Ульянова Т.А., Добровольская Т.Г., Умаров М.М. Особенности азотфиксации и денитрификации у термитов // Известия АН. Сер. Биологическая. 2002. №2. С. 214-218.

10.Golichenkov M.V. Symbiotic Nitrogen Fixation in Termites / 9"1 International Symposium on Nitrogen Fixation with non-Legumes. Leuven. 2002. p. 216.

Подписано в печать 22.10.2002. Формат 60 х 84 1/16.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 2,09. Усл. кр.-отт. 8,37. Уч.-изд. л. 2,25. Тираж 100 экз. С 563

Московский государственный институт радиотехники, электроники и автоматики (технический университет) 117454 Москва, просп. Вернадского, 7Х

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Голиченков, Максим Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

Обзор литературы

Общие сведения по биологии термитов

Сведения по биологии термитов Riticulitermes lucifugus (Rossi), Anacanthotermes ahngerianus (Jacobson),

Neotermes castaneus (Burmister) и Zootermopsis angusticollis (Hagen)

Экосистема пищеварительного тракта термитов

Особенности симбиотической азотфиксации у термитов

Влияние термитов на почву

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ОБЪЕКТЫ

Лабораторные культуры термитов и материал термитников

Образцы сероземов, термитников и термиты Anacanthotermes ahngerianus

МЕТОДЫ

Газо-хроматографические методы

Измерение нитрогеназной активности

Определение потенциальной денитрификации

Определение эмиссии метана

Определение интенсивности дыхания (эмиссии СОг)

Определение содержания азота

Определение содержания углерода

Выделение чистых культур микроорганизмов

Изучение некоторых свойств азотфиксаторов методом спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение актуальной нитрогеназной активности у живых термитов и в материале их термитников

Определение потенциальной денитрификации у термитов и в материале их термитников

Численность и групповой состав бактерий-азотфиксаторов, выделенных из кишечника термитов и из материала термитников

Применение метода спектроскопии НПВО для изучения механизмов передачи фиксированного азота от азотфиксирующей бактерии термиту

Влияние целлюлозной диеты на азотфиксирующую активность и поведение термитов

Г о л и ч е и ков М. П.

Особситхнш микрооной трансформации с ¡г та кишечнике н/еритши: и в термитниках

Стру ктура комплекса азотфиксирующих микроорганизмов пищеварительной системы термитов N. сазЮпею, длительное время содержавшихся на целлюлозной диете

Основные показатели микробиологической активности на примере природных термитников

Туркмении

Структура бактериального комплекса термитника и фоновой почвы

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Голиченков, Максим Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Впервые обнаружен высокий уровень азотфиксации у термитов Neotermes castaneus.

2. Впервые исследована структура микробного сообщества азотфиксаторов в гнездовом материале и у термитов N. castaneus. Показано, что в бактериальном сообществе кишечника термитов преобладают факультативно-анаэробные бактерии, представители семейства Enterobacteriaceae (с доминированием рода Escherichia), родов Bacteroides и Staphylococcus.

3. Показано, что для восполнения недостатка азота, термитам необходимо пополнять пул бактерий - азотфиксаторов, главным образом, за счет представителей рода Bacteroides, которые являются транзитными формами, а не облигатными симбионтами.

4. Выявлено, что запасы органического вещества и сопряженные с трансформацией этого вещества биологические процессы в термитниках Anacanthotermes ahngerianus, приурочены к выстилкам ходов и камер.

5. Установлено, что термитники, являясь неотъемлемой частью почв аридных пустынных ландшафтов, не только повышают мозаичность почвенного покрова, но и представляют собой локусы повышенной напряженности всех основных микробиологических процессов.

Гo.i и ч о н кое М. И

Особенности микробной транс/формации атто <• кишечника терминам: и с. тсриитниких

Заключение

Таким образом, в представленном исследовании были изучены особенности симбиотической азотфиксации у ряда термитов. Наиболее высокие значения азотфиксирующей активности впервые были выявлены у термитов N. casataneus. Было показано, что многие бактерии, обитающие в кишечнике термитов являются азотфиксаторами и участвуют в снабжении термитов фиксированным азотом. Примечательно, что большинство из них, как, например, представители рода Bacteroides, являются транзитными формами, то есть выводятся из кишечника термитов вместе с экрементами и представлены не только в кишечнике термитов, но и в материале термитника. Исследование механизмов передачи фиксированного азота от бактерии термиту выявило способность азотфиксаторов (на примере Bacillus licheniformis) экскрети-ровать продукты азотфиксации во внешнюю среду. Этот факт косвенно подтверждает транзитный характер изученных азотфиксаторов.

Таким образом, нами впервые установлено, что термитам для нормальной жизнедеятельности необходимо постоянное пополнение азотфиксаторов в пищеварительном тракте, что и происходит в естественных условиях благодаря многократной переработке материала термитника и копрофагии. При этом происходит значительное обогащение материала термитника, а преимущественно выстилки ходов и камер, азотфиксирующими микроорганизмами и органическими соединениями, следствием чего и является повышенное содержание азота в термитниках, по сравнению с фоновой почвой. Этот факт подтвержден исследованием природных термитников, которое показало несомненную концентрационную функцию термитников по отношению к органическому веществу и микробиологическим процессам его трансформации (на примере азотфиксации, денитрификации, дыхания и метаногенеза) в аридных экосистемах

Голи ч г к ко в Л-/. Л.

Особенное ти микробной транс/формации еноте: ч кишечнике термина ¡е. и и термитниках

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Голиченков, Максим Владимирович, Москва

1. Алехина Л.К., Невская Д.В., Добровольская Т.Г., Звягинцев Д.Г. Бактериальное разнообразие в лесных почвах (сукцессионный анализ) // Микробиология. 1997. Т.66. N 4. С. 558-562.

2. Беляева Н.В., Жужиков Д.П. Материалы по фауне и распространению термитов СССР // Тр. энтомол. сектора проблем н.-и. лаб. По разработке методов борьбы с биол. поврежд. материалов биол. факультет. Термиты. Вып. 5.1974. С. 7-61.

3. Жужиков Д.П. Биологические испытания материалов на устойчивость к повреждениям термитами // Тр. энтомол. сектора проблем н.-и. лаб.1. Голи ч с и к о <? Л/. В.

4. Особенноечпи микробной трансформации asoma ч кишечнике ни'рмитги: и п тер митниках

5. Тр. энтомол. сектора проблем н.-и. лаб. По разработке методов борьбы891. Гол и ч е н к о в М. В

6. Особенности микробной трансформации ammo е. кишечнике термине к: и а термитниках

7. Hungate R.E. Studies on nutrition of Zootermopsis. 1. Role of Bacteria in molds and cellulose decomposition I I Zbl. Bacterid. 1936. Ser. 11. Bd. 94. No. 13. P. 240-249.

8. Hungate R.E. Studies on nutrition of Zootermopsis. 2. The relative importance of the termite and the protozoa in wood digestion // Ecology. 1938. Vol. 19. P. 1-25.

9. Krishna K., Weesner F.M. Biology of termites. New York and London Academic Press. 1969. Vol. 1. P. 407-411.

10. Nel J.J.C. Aggressive behaviour of the harvester termites Hodotermes mos-sambicus and Trinervitermes trinervoides II Insect. Soc. 1968. Vol. 15. P. 145-156.

11. Nutting W.L. Reciprocal protozoan transfaunation between the roach Cryptocercus and the termite Zootermopsis II Biol. Bull. 1956. Vol. 110. P. 83-90.

12. Nye P.H. Some soil-forming processes in the humid tropics. IV. The action of soil fauna//J. Soil Sci. 1955. Vol. 10. P. 73-83.

13. Olleir C.D. A two-cycle theory of tropical pedology // J. Soil. Sci. 1959. Vol. 10. P. 137-148.

14. Oshima M. White ants injurious to wooden structures and methods of preventing their ranages / Proc. Pan-Pacific Sci. Congr. Australia. Vol. 1. Section 4. Entomology. 1923. P. 332-334.

15. Pandey S., Waller D.A.,. Gordon A.S Variation in acetylene-reduction (nitrogen-fixation) rates in Reticulitermes spp. (Isoptera: Rhinotermitidae) // Virginia J. Sci. 1992 Vol. 43. P. 333-338.1.o.i u u en k oe M. ii

16. Jlavipes, its relation to oxygen, and evidence for oxygen-dependent aceto951. Г о.i и ч с и ков ,\1. В