Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности азотфиксации в желудочно-кишечном тракте речного бобра (Castor fiber)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности азотфиксации в желудочно-кишечном тракте речного бобра (Castor fiber)"

На правах рукописи

Вечерский Максим Валерьевич

Особенности адотфиксацин в желудочно-кишечном тракте речного бобра (Castor fiber)

Специальность 03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008

1 6 ОНТ 2008

003448803

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Умаров Марат Мутагарович доктор биологических наук, Наумова Елена Ивановна доктор биологических наук, профессор Ивановский Руслан Николаевич доктор биологических наук, Холодова Марина Владимировна

Научный консультант

Официальные оппоненты

Ведущая организация

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН

Защита диссертации состоится 11 ноября 2008 г в 15 ч 30 мин в аудитории М-1 на заседании Диссертационного Совета Д 501 001 21 при Московском Государственном Университете имеии M В Ломоносова

Адрес 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ имени MB Ломоносова, д 1, корп 12, биологический факультет, аудитория М-1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени M В Ломоносова

Автореферат разослан «10> QjC сД 2008 г

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании Диссертационного Совета Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах просим направлять по адресу 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ имени MB Ломоносова, биологический факультет

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Актуальность темы. Речной бобр (Castor fiber L, 1758) широко распространен в водных экосистемах Европейской части России, его численность достшает 270 тыс особей (Завьялов, 2005) Особенностью этих грызунов является потребление трудно перевариваемых низкобелковых, целлюлозосодержащих кормов, содержание азота в которых не превышает 3% Вопросы усвоения клетчатки бобрами традиционно привлекали внимание исследователей (Nasset, 1953, Новиков и др, 1976, Соловьев, 1991), в то же время, проблема обеспечения азотом этих животных остается не изученной Известно, что у животных со схожими диетарными предпочтениями (термиты, жвачные, зайцеобразные и др) выработался ряд адаптивных механизмов, компенсирующих недостаток азота в пище поедание разлагающихся растительных волокон, богатых микробной биомассой (Batra et al, 1966, Жужиков, 1979), реутилизация мочевины (Stevens, Hume, 1998, Singer, 2003), копрофагия (Breznak et al, 1973, Наумова, 1981) Дополнительным источником азота, позволяющим животным существовать на бедных этим элементом кормах, может служить микробная азотфиксация в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) К настоящему времени активная азотфиксация выявлена у некоторых беспозвоночных, например, термитов (Breznak et al, 1973, Lilburn et al, 2001, Noda et al, 2005), а также позвоночных животных жвачных, полевок, песчанок, слепышей (Лаптев, 1995, Наумова и др , 2000, Варшавский и др , 2003, Кузнецова и др , 2005) Для бобра таких данных пока нет

По функциональной морфологии ЖКТ (железистый желудок, а также объемные слепая и ободочная кишки, в которых происходит ферментация растительных волокон) бобров относят к группе млекопитающих с постгастричкой (заднекишечной) ферментацией Подобное строение ЖКТ оптимально подходит и для протекания микробной фиксации азота В этой связи речной бобр является удачной моделью для изучения особенностей микробной азотфиксации у позвоночных животных

Кроме того, эти животные интересны как преобразователи не только водных, но и наземных экосистем - они формируют так называемые «бобровые запруды», которые существенно влияют на гидрологический режим значительных территорий (Завьялов, 2005) При этом изменяется целый ряд параметров смещение линии уреза воды, искажение характера водного потока, увеличение освещенности водной толщи,

понижение окислительно-восстановительного потенциала прилегающих почв, а также увеличение содержания азота в водах и грунтах «бобровых запруд», приводящее к цветению водоемов и смене прибрежных фитоценозов (Ыанпап, МеЬПо, 1984)

Цель работы - изучение нитрогеназной активности и структуры прокариотного комплекса ЖКТ речного бобра и оценка его влияние на биологическую активность почв прилегающих территорий

В задачи исследования входило

1 Оценить интенсивность процесса азотфиксации и накопления азота в химусе речного бобра

2 Изучить структуру и функциональное разнообразие комплекса микроорганизмов ЖКТ бобра

3 Оптимизировать методику определения таксономического состава бактериального сообщества ЖКТ путем анализа нуклеотидной последовательности 168-рибосомальных генов, выделенных из суммарной прокариотной ДНК

4 Изучить биологическую активность почв, затапливаемых водами бобровых запруд

Научная новизна Впервые выявлена азотфиксирующая активность в пищеварительном тракте речного бобра, следствием которой является увеличение содержания азота в химусе при прохождении ЖКТ Максимальная азотфиксация отмечена в слепой кишке - основном микробном «ферментере» кишечника речного бобра Впервые для изучения таксономического состава микробного комплекса ЖКТ применен ряд оптимизированных молекулярно-генетических методик и получена функциональная характеристика микробного комплекса ЖКТ Проведена комплексная оценка влияния бобров на микробиологические показатели почв в местах их обитания Установлено, что в местах наибольшего влияния речного бобра, происходит накопление азота, кроме того обнаружено изменение таксономического состава и функциональных характеристик микробных сообществ, а также

интегральных показателей микробиологическом активности (азотфиксации, деиигрификации, эмиссии С02)

Практическая значимость Результаты исследований позволяют рассматривать ЖКТ речного бобра как модель пе только успешной утилизации целлюлозосодержащих кормов, но и существенного обогащения их бактериальным белком, в том числе за счет микробной азотфиксации Изучение особенностей пищеварения речного бобра может быть использовано в практических целях, например, при преобразовании целлюлозосодержащих отходов в корма для животных Оптимизированная нами методика определения видового состава кишечных прокариот на основе секвенирования 168-рибосомальных генов позволяет упростить и ускорить процесс изучения таксономического состава бактерий ЖКТ Данные по азотфиксации в ЖКТ бобров могут быть использованы при расчете баланса азота у этих животных, а также в соответствующих биогеоценозах Результаты исследования могут быть использованы в учебных курсах по биогеоценологии, микробиологии, зоологии, экологии и почвенной биологии в высших учебных заведениях

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 2 тезисов докладов Апробация работы. Основные положения работы представлены на конференции «Актуальные проблемы экологии и эволюции в исследованиях молодых ученых» (Москва, 2006), на V съезде Общества почвоведов им В В Докучаева (Ростов-на-Дону, 2008) и на заседаниях кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов экспериментов, выводов и списка литературы Материалы диссертации изложены на 101 странице текста, содержат 27 рисунков, 5 таблиц Список литературы включает 151 источник, в том числе 73 на иностранном языке

Автор выражает глубокую благодарность за помощь в подготовке диссертации Костиной Наталье Викторовне и Квону Дмитрию Аркадьевичу

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили образцы химуса речного бобра (Castor fiber L.. 1758). Животных (9 особей, в том числе 4 самки и 5 самцов в возрасте от 1 до 5 лет) добывали в различных районах Московской, Калужской и Тверской областей. Масса изученных особей колебалась в пределах 10-18 кг, в том числе масса ЖК'Г -3,4-4,0 кг. Отбор образцов производили стерильными инструментами не позднее 12 часов после отстрела животного из следующих отделов ЖКТ: желудка, тонкого кишечника и разных отделов толстого кишечника: вершина слепой кишки, тело слепой кишки, ампула ободочной кишки, проксимальная часть ободочной кишки и дистальная часть ободочной кишки (рис. 1). В образцах определяли активность азотфиксации, содержание азота и углерода, общую численность бактерий, таксономическую структуру и функциональное разнообразие комплекса микроорганизмов.

Также объектами исследования служили образцы аллювиальных почв, отобранные с территорий, пе подвергавшихся воздействию бобров (контроль), с норовых участков, а также с территорий, затапливаемых водами бобровой запруды. В образцах почв определяли сезонную динамику процессов азотфиксации, денитрификации и дыхания, а также общую численность, таксономическую структуру и функциональное разнообразие прокариотного комплекса.

Рис. 1. Схема отбора образцов из толстого кишечника речного бобра:

1 - вершина слепой кишки, 2 - тело слепой кишки, 3 - ампула ободочной кишки, 4 - проксимальная часть ободочной кишки, 5 - промежуточная часть ободочной кишки, 6 - дистальная часть ободочной кишки. Прорисовка фотографии.

Активность азотфиксации, денитрификации и эмиссии С02 измеряли методами газовой хроматографии (Методы почвенной микробиологии, 1991)

Анализ содержания общего азота и углерода проводили на CHNS-анализаторе (Elementar Analysensysteme GmbH VarioEL)

Определение параметров функционального разнообразия микробного сообщества ЖКТ и почв проводили методом мультисубстратного тестирования (МСТ) (Горлснко, 2001)

Общую численность прокариот учитывали методом люминесцентной микроскопии с использованием красителя акридина оранжевого (Методы , 1991)

Исследование архитектоники слизистой ЖКТ проводили с использованием сканирующей электронной микроскопии (JSM-840A, Япония)

Выделение микроорганизмов проводили методом посева и методом накопительных культур на средах Эшби с карбоксиметилцеллюлозой, Эндо и глюкозо-пептонно дрожжевой (ГПД) Идентификацию чистых культур проводили по морфологическим и физиолого-биохимическим признакам (Определитель бактерий Берджи, 2003)

Кроме того, изучение таксономического состава микробного комплекса ЖКТ бобра (включая анаэробные и некультивируемые виды) проводили с помощью анализа нуклеотидных последовательностей 16й-рибосомалы1ых генов, выделенных из суммарной прокариотной ДНК Выделение и очистку суммарной прокариотной ДНК из образцов химуса осуществляли по методике BioRad (Cody, 2000) с незначительными модификациями

Для получения ПЦР-фрагментов генов 16S рРНК использовали спроектированные нами праймеры F1 и R1 Проектирование праймеров F1 и R1 осуществляли с использованием базы GenBank и программного обеспечения Vector NTI Амплификацию проводили на термоциклере (Eppendorf, Германия)

Полученные ПЦР-фрагменты разделяли с помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза на оборудовании Вю-Rad DeCode System (Bio-Rad, Великобритания)

Результаты электрофореза регистрировали с помощью системы гель-документирования BioDoc Analyzer II (Biometra, Германия) после окрашивания этидий бромидом

Выделенные фрагменты клонировали в векторе PTZ19R Продуктами легирования трансформировали компетентные клетки Escherichia coh штамм DHlObeta Выделение и очистку плазмидной ДНК производили с помощью набора PCR-Purification KIT (Quiagen)

Секвенирование проводили по методу Сенгера на базе Межинститутского ЦКП «Геном» ИМБ РАН

Поиск близкородственных последовательностей проводили в GenBank с помощью пакета BLAST2 по стандартному алгоритму (в режиме «discontiguous megablast»)

Для определения наличия mfH- гена в суммарной бактериальной ДНК, выделенной из химуса речного бобра, проводили ПЦР с использованием праймеров F2 и R2 Эти вырожденные праймеры были сконструированы на основе данных по нуклеотидной изменчивости mfH -гена различных микроорганизмов (Oda et а!, 2003) Полимеразная реакция считалась успешной, если по данным агарозного гель-электрофореза детектировался ПЦР-продукт длиной ~ 400 пар нуклеотидов

Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета Statistica 6 0

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Активность азотфиксации и содержание азота в ЖКТ речного бобра

Актуальная нитрогеназная активность была выявлена в содержимом разных отделов ЖКТ у всех исследованных бобров (рис 2) Несмотря на значительный разброс ее показателей у разных особей, максимальная достоверная нитрогеназная активность зафиксирована в содержимом вершины слепой кишки (до 0,19 нмоль С2Н4/гхч) Для ободочной кишки были характерны более низкие значения (в среднем 0,05 нмоль С2Н4/гхч) Еще ниже актуальная азотфиксация была в желудке и тонком кишечнике (0,01 нмоль С2Н4/гхч)

Рис 2 Активность азотфиксации в содержимом разных отделов ЖКТ речного бобра 1 - желудок, 2 - тоикий кишечник, 3 - вершина слепой кишки, 4 - ампула ободочной кишки, 5 - тело слепой кишки, 6 - проксимальная часть ободочной кишки, 7 - промежуточная часть ободочной кишки, 8 - дистальная часть ободочной кишки

1 2 3 4 5 6 7

□ Среднее I | ±Ст ошбка

96 Ст ошбй

Различия в уровне активности азотфиксации в разных участках ЖКТ хорошо объясняются его функциональной морфологией Считается, что быстрое прохождение химуса через тонкий кишечник недостаточно для осуществления микробиологических процессов, требующих длительного времени инкубации (Наумова, 1981) и именно этим могут быть обусловлены низкие значения азотфиксации в указанном отделе Строение толстого кишечника - объемная слепая кишка и ряды мускульных кармашков, сформированных стенкой ободочной кишки -существенно замедляет продвижение химуса, благодаря чему именно в этом отделе происходит длительная микробная ферментация клетчатки, обеспечивающая азотфиксаторов легкодоступным энергетическим субстратом

Результаты измерения активности азотфиксации согласуются с данными по содержанию азота в химусе ЖКТ животных (рис 3) Установлено, что содержание азота прогрессивно увеличивалось от 1,3% в химусе желудка почти до 3% в ободочной кишке Напротив, содержание углерода в химусе по мере прохождения через ЖКТ существенно не менялось и находилось на уровне 43%, а отношение углерода к азоту (С/Ы) последовательно уменьшалось от желудка (34,1) к дистальной части ободочной кишки (14,3) Различия по этому показателю между отделами толстого кишечника меньше, чем различия между толстым и тонким кишечником Для всех изученных особей просматривается следующая закономерность в толстом

кишечнике отношение С/Н ниже, а содержание азота выше, чем в тонком кишечнике или желудке Очевидно, что содержание азота в химусе прогрессивно увеличивается по мере прохождения его по ЖКТ, что можно объяснить деятельностью бактерий-азотфиксаторов Важно отметить, что подобная зависимость — увеличение содержания азота в химусе - уже была обнаружена ранее у других грызунов-фитофагов -песчанок Кроме того, активная микробная азотфиксация в ЖКТ была отмечена у полевок, песчанок и слепышей (Наумова, 2000, Варшавский и др, 2003, Кузнецова, 2007) Подобное сходство позволяет говорить о существовании адаптивных механизмов, общих для ряда грызунов

1 2 3 4 5 6 7

о Среднее I I *Ст сшбка ~Г ±196*Ст опека

о Среднее I I ±Ст ш*бка ~Г ±1S6-CT ошйка

(а)

(б)

Рис 3 Содержание общего углерода (а) и азота (б) в образцах ЖКТ речного бобра 1 — желудок, 2 - тонкий кишечник, 3 - вершина слепой кишки, 4 - ампула ободочной кишки, 5 - тело слепой кишки, 6 - проксимальная часть ободочной кишки, 7 - промежуточная часть ободочной кишки, 8 - дистальная часть ободочной кишки

Нарастающая в кишечнике биомасса бактерий (в том числе диазотрофов) не усваивается в толстом кишечнике, а потребляется бобрами уже в процессе копрофагии - поедании обогащенного микробами эвакуата из слепой кишки Отметим в этой связи, что копрофагия - регулярный и обязательный поведенческий акт у бобров (Швдловская, 1960) Рад исследователей (Bayley, 1978, Калугин, 1980, Наумова, 1981, Hornicke, 1981, Langer, 1991) рассматривают копрофагию (цекотрофию), именно как способ утилизации микробных белков Мягкие поедаемые

фекалии отличаются высоким содержанием бактериальной массы и питательных веществ и представляют собой эвакуат из слепой кишки. Физиологическая необходимость копрофагии для бобра подчеркивает значимость процесса микробной азотфиксации для животного.

Поскольку фиксацию атмосферного азота осуществляют прокариоты, обладающие ферментом нитрогеназой, был осуществлен поиск гена нитрогеназы («////-ген редуктазы динитрогеназы) у микроорганизмов ЖКТ. Для этого была проведена ПЦР суммарной бактериальной ДНК из кишечника бобра со специфическими вырожденными ираймерами Р2 и Г12, учитывающими изменчивость т/Н -гена нитрогеназы (по Оба еI а/., 2003). ПЦР успешно прошла с суммарной прокариотной ДНК, выделенной из химуса слепой кишки (рис. 4), что подтвердило возможность микробной азотфиксации в этом отделе ЖК'Г. Полимеразная реакция считалась успешной, если по данным агарозного гель-электрофореза детектировался ПЦР-продукт длиной - 400 пар нуклеотидов.

Рис. 4. Гель электрофорез (агароза 6%) продуктов ПЦР суммарной бактериальной ДНК из химуса слепой кишки с праймерами И2 и Я2 «¡У?/-ген. 1 - продукт ПЦР суммарной прокариотной ДНК, выделенной из химуса тела слепой кишки; 2, 3 -контроль.

Особенности бактериального комплекса ЖКТ речного бобра

Проведенный прямым люминесцентно-микроскопическим методом подсчет численности бактерий в разных отделах ЖКТ дал следующие результаты: в вершине слепой кишки 5,8* 109 кл./г субстрата, в теле слепой кишки 3,7х 109 кл./г, на всем

протяжении ободочной кишки 3,6х 109 кл./г, и в ампуле ободочной кишки 1,0х 109 кл./г . Согласно общеэкологическим представлениям, такая численность бактерий достаточна для осуществления физиологически значимых процессов и хорошо подтверждает наше предположение, что слепая кишка является основной ферментативной камерой ЖКТ речного бобра.

Электронная микроскопия эпителия кишечника подтвердила наличие значительного количества прокариотных клеток различной морфологии, колонизирующих поверхность кишки (рис. 5). Обращает на себя внимание морфология поверхности слизистой слепой и ободочной кишок: она покрыта микроячейками, служащими убежищем для клеток прокариот, ассоциированных с эпителием, и предохраняющими их от вымывания (рис. 5а).

(а) (б)

Рис. 5. Архитектоника слизистой оболочки толстого кишечника речного бобра (электронная микроскопия). Видны специальные «карманы» - микроячейки (а), и бактериальные клетки (б).

Таксономический состав бактериального комплекса ЖКТ бобра был определен методом посева на различные питательные среды. Наибольший интерес представляют данные посева на среду Эшби, с помощью которой выделяли диазотрофов. Они были обнаружены во всех изученных отделах толстого кишечника. По результатам подсчета колоний максимальная численность, составляющая 5*103 КОЕ/г, была отмечена для образца из вершины слепой кишки. Численность азотфиксаторов в ободочной кишке была несколько меньше - 1хЮ5 КОЕ/г. Качественный состав сообщества кишечных

микроорганизмов в разных отделах толстого кишечника, определенный на основании морфологических и физиолого-биохимических признаков, был практически одинаков, а различия имелись только в их численности Доминирующие на среде Эшби бактерии были отнесены к родам Bacteroides и Bacillus В то же время на специализированной среде Эидо для кишечной микрофлоры таковыми были представители родов Alcaligenes и Enterobacter, а на среде ГПД - различные представители рода Bacillus и Flavobacterium

Обращает на себя внимание низкое таксономическое разнообразие бактериального сообщества, выделяемого из кишечника бобра методом посева Исследование накопительных культур не привело к «увеличению» ыксонимического разнообразия Кроме того, примененные нами методы не позволяли учесть строго анаэробные и некультивируемые формы, присутствие которых в ЖКТ уже известно (Stecher et al, 2007) Поэтому стала очевидна необходимость применить альтернативный метод, который бы позволил более полно охватить таксономический состав кишечных прокариот Для этого нами было проведено изучение нуклеотидной последовательности 168-рибосомальных генов, выделенных из суммарной бактериальной ДНК слепой кишки речного бобра Преимущество этого метода состоит также в том, что он позволяет отказаться от этапа выделения чистых культур

Из образцов химуса слепой кишки речного бобра была выделена суммарная прокариотная ДНК по методике BioRad (Cody, 2000) с незначительными модификациями

Для получения ПЦР-фрагментов генов 16S-PHK были использованы спроектированные нами праймеры Fl и R1 Также в состав реакционной смеси входили 5 единиц Taq-полимеразы, по 10 ммоль каждого из dNTP, 10 пмоль прямого и обратного праймеров, ДНК-матрица, а также буферный раствор для Taq-полимеразы (Силекс, Россия)

Проектирование праймеров Fl и R1 осуществлялось с использованием базы GenBank и программного обеспечения Vector NTI После лайнирования обнаруженных последовательностей была выбрана для анализа область 16S-PHK гена, приблизительно соответствующая положению 50-800 для Е coli Праймеры включают сайт рестрикции BamHI EcoRI для осуществления клонирования Прямой праймер также содержит сорокануклеотидный GC-кламп, обеспечивающий

протекание градиентного фореза Согласно литературным данным GC-кламп часто препятствует нормальной амплификации, но в нашем случае это было учтено Праймеры Fl и R1 имеют температуру отжига 60°С и обладают оптимальными термодинамическими параметрами Увеличение размера анализируемого участка обеспечивает включение в него менее консервативных областей и приводит к тому, что исследуемый участок имеет высокое сходство с ограниченным набором последовательностей генбанка Хотя величина гомологии при этом оказывается невысокой и составляет, как правило, не более 95%

Эффективно разделить продукты ПЦР с помощью клонирования не удавалось, так как основную массу клонов составили участки генов единичных доминант, выделить прочие элементы также не удавалось, а выявляемый таким способом таксономический состав, как и при использовании метода посева, получался неполным Для повышения эффективности разделения амплифицированных участков был использован метод электрофореза в полиакриламидном геле с градиентом по денатурирующему фактору с последующим клонированием элюатов

Для этого формировали 5% акриламидный гель с градиентом мочевины в формамиде вдоль хода дорожки 50%-70% Величина градиента была выбрана предварительно в ходе эмпирических экспериментов Длительность электрофореза составляла 6 часов, напряжение электрического поля - 150В При соблюдении этих параметров все продукты ПЦР разделялись и занимали индивидуальные места на геле Фотодокументация результатов была проведена на гель-документирующей системе Biometra Однако высокая степень загрязнения продуктов ПЦР не позволила провести секвенирование продуктов RePCR эллюатов и потребовалась процедура клонирования Выделенные фрагменты клонировали в векторе PTZ19R Продуктами легирования трансформировали компетентные клетки Е coli штамм DHlObeta После очистки плазмидной ДНК было проведено секвенирование ее нуклеотидной последовательности

Секвенирование проводили по методу Сенгера на базе Межинститутского ЦКП «Геном» ИМБ РАН

Рис. 6. Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (полиакриламид 5%) продуктов ПЦР суммарной бактериальной ДНК из химуса слепой кишки с универсальными бактериальными праймерами Р1 и Ш. На рисунке увеличен фрагмент геля, на котором произошло разделение компонентов ПЦР-продукта. Можно различить отдельные полосы. Увеличенный фрагмент геля соответствует градиенту концентрации мочевины (сверху вниз) 60-65%.

Поиск близкородственных последовательностей проводили в GenBank. с помощью пакета BLAST2 по стандартному алгоритму (в режиме «discontiguous megablast»). Отметим, что все обнаруженные с помощью этого метода микроорганизмы являются доминантами и имеют численность не ниже 1% от суммарной.

Были идентифицированы следующие микроорганизмы: Bifidobacterium adolescentis, Parabacteroides distasonis. Bacteroides sp., Flavobacterium sp., Pseudomonas sp., Eggerthella sp., клон группы Bacteroidetes, клон группы Actinobacteridae.

Помимо этих микроорганизмов были также обнаружены неидентифицированные микроорганизмы, известные по данным метагеномных проектов. Так, зафиксирована

высокая гомология с иуклеотидной последовательностью двух микроорганизмов, обнаруженных в ЖКТ собаки (Beasley et al, 2006)

Обращает на себя внимание наличие строгих анаэробов и типично-кишечных бактерий, которые не удавалось выделить с использованием чашечного метода В то же время известно, что многие из них обладают способностью к азотфиксации В целом сообщество доминант ЖКТ речного бобра сходно с сообществами других грызунов Наиболее близким оказалось кишечное сообщество мыши (Babilomi et al, 2005) Особо отметим, что молекулярно-биологическими методами не были обнаружены представители рода Bacillus, легко выделенные методом посева Объяснить это можно, вероятно, тем, что доминанты, выделяемые чашечным методом, не всегда являются доминантами in vivo Напротив, микроорганизмы группы Bacteroides, которые сложно культивировать чашечным методом, обнаруживаются методом молекулярной биологии

В целом, данный метод зарекомендовал себя как высокоэффективный и быстрый способ определения таксономического состава кишечной микрофлоры

Результаты определения численности и таксономии бактериального населения ЖКТ бобра были дополнены данными по функциональному разнообразию сообщества микроорганизмов в толстом отделе кишечника (метод МСТ) (табл 1) Обращает на себя внимание, что сообщества разных участков толстого кишечника существенно отличались по числу потребляемых субстратов (ЧПС) Так, максимальное ЧПС наблюдалось в образцах дисталыюй и проксимальной частей ободочной кишки (29 из имевшихся 47 субстратов), причем в основном за счет большего разнообразия используемых олигосахаридов В ампуле ободочной кишки, куда, как отмечалось, попадает обедненный питательными веществами химус, величина ЧПС минимальна - 22 Несколько большее число субстратов потребляется микроорганизмами в содержимом тела слепой кишки - месте наиболее интенсивной азотфиксации Индекс Шеннона (показатель биоразнообразия) был максимален для комплекса микроорганизмов ободочной кишки (4,7 - 4,8) и был минимален для комплекса слепой кишки (4,4 - 4,5) Для микробных комплексов толстого отдела ЖКТ была характерна очень высокая выравненность - отсутствие выраженных доминант Данные, полученные методом МСТ, указывают на сравнительно высокую специфичность сообщества слепой кишки, в которой, как отмечалось, протекает

основная ферментация растительны* полимеров и сопряженная с ней фиксация атмосферного азота Напротив, микробное сообщество ободочной кишки обладает меньшей специфичностью (за исключением ампулы) из-за потребления продуктов этой ферментации, поступающих из слепой кишки и тонкого кишечника

Таблица 1

Показатели функционального разнообразия микробных комплексов различных отделов толстого кишечника речного бобра

Объект Число потребляемых субстратов (ЧПС) Средняя метаболическая активность, V/ Индекс Шеннона, Н Выравненность, Е

Ампула ободочной кишки 22 990 4,422 0,991

Ободочная кишка, дистальная часть 29 850 4,823 0,992

Тело слепой кишки 24 1050 4,543 0,990

Ободочная кишка, проксимальная часть 27 950 4,716 0,991

Вершина слепой кишки 22 1020 4,436 0,994

Влияние поселений речного бобра на биологическую активность почв

С целью определения воздействия бобра на окружающую территорию была проведена комплексная оценка биологической активности почв Потенциальная нитрогеназная активность в местах обитания речного бобра существенно отличалась от значений, полученных на контрольном участке (табл 2) Максимальная активность была отмечена в образцах почв, затапливаемых водами запруды и в образцах, отобранных на норовом участке, а в образцах контрольной почвы была на порядок ниже Таким образом, присутствие поселений бобра повышает нитрогеназную активность почв

Активность денитрификации для всех образцов почв была достаточно высокой, исключение составляла почва, отобранная на норовом участке (табл 2) Наиболее

высокие значения процесса денитрификации наблюдались в летнее время, а осенью активность процесса снижалась

Максимальная активность дыхания была характерна для почвы, находящейся у входа в нору бобра В почвах, затапливаемых водами бобровой запруды, значения были несколько ниже К концу осени эмиссия углекислого газа значительно возрастала из всех изучаемых почв

Таблица 2

Биологическая активность почв, затапливаемых водами бобровой запруды (средние значения ± ст ошибка)

Объект Активность азотфиксации (нмоль С2Н4/ГХ4) Активность дыхания (мкмоль ССЬ/гхсут) Активность денитрификации (мкмоль Ы20/ гхсут)

лето/осень лето/осень лето/осень

Затапливаемая почва в районе «бобровой запруды» 88±19/75±31 4,Ш,5/3,0±1,6 0,47±0,И/0,3±0,10

Затапливаемая почва контрольного участка 8±6/24±7 3,5±1,3/3,1±2,0 0,38±0,09/0,25±0,06

Норовый участок 96±15/85±35 5,0±1,5/4,9±2,5 1,2±0,22/1,6±0,21

Результаты определения биологической активности почв и фунтов были дополнены данными по содержанию в них углерода и азота (табл 3) Отношение углерода к азоту было минимальным в образцах, отобранных вблизи норы и в образцах почв, прилегающих к «бобровой запруде» Максимальным это соотношение было в образцах контрольной почвы Приведенные данные показывают роль бобров в обогащении почв азотом, который может поступать в почвы вместе с прижизненными выделениями бобров

Таблица 3

Содержание общего азота и углерода в почвах, затапливаемых водами бобровой запруды (средние значения, достоверность значений установлена прибором)

Объект Содержание углерода, % Содержание азота, % Отношение С/ТЧ

Затапливаемая почва в районе «бобровой запруды» 1,11 0,11 10,53

Затапливаемая почва контрольного участка 1,92 0,12 16,48

Норовый участок 2,34 0,21 11,36

Для комплексной оценки биологической активности почв нами был проведен анализ микробиологического сообщества изучаемых почв По данным прямого счета в летний период общая численность микроорганизмов была достоверно выше в почве, затапливаемой водами бобрового пруда, чем в контроле Осенью эти различия нивелировались По данным посева наличие поселений бобров не приводит к изменению качественного состава микробного комплекса почв, представтенного родами Rhodococcus, Arthrobacter, Flavobacterium и Bacillus, но вызывает сокращение доли бацилл и увеличению доли флавобактерий

тулыисубстратное тестирование выявило более БшСОкпС показатели функционального разнообразия микробных сообществ почв бобровой запруды по сравнению с контролем (табл 4) Они проявились в увеличении количества потребляемых субстратов (ЧПС) (рис 7) и в большем их разнообразии (индекс Шеннона) Однако отмечалась более низкая устойчивость микробного сообщества запруды по ранговому распределению по сравнению с контрольной почвой Известно, что подобные изменения характерны для систем, испытывающих привнос дополнительных субстратов

Таблица 4

Показатели функционального разнообразия микробных комплексов мест поселений речного бобра

Объект Число потребляемых субстратов, N Средняя метаболическая активность, W Выравненность, Е Индекс Шеннона, Н Коэффициент рангового распределения, d

Затапливаемая почва контрольного участка 21 1107 0,984 4,3 0,288

Норовый участок 24 1122 0,981 4,5 0,371

Затапливаемая почва в районе «бобровой запруды» 30 1180 0,979 4,8 0,590

гексозы олитосахара спирты аминок-ты кислоты полимеры Ы-компоненты1

¡□контроль Шноровый участок □ затапливаемый участок

Рис.7. Спектр поглощаемых субстратов почв мест поселений речного бобра.

Таким образом, в местах наибольшего влияния речного бобра, так называемых норовых участках, происходит увеличение содержания азота и углерода, что в свою очередь приводит к увеличению активности процессов трансформации этих элементов. Соответственно, увеличивается численность и функциональное разнообразие почвенных микроорганизмов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование выявило наличие активной бактериальной азотфиксации в кишечнике всех особей речного бобра, принадлежащих к разным популяциям. Несомненна ее важная физиологическая роль в азотном питании как одного из источников «биологического» азота для этого животного. При этом характер накопления азота в химусе - увеличение его содержания к концу кишечника - позволяет утверждать, что его потребление в виде бактериального белка происходит в результате копрофагии. Исходя из степени обогащения азотом корма при прохождении через ЖКТ, его содержания в эвакуате прямой кишки, учитывая среднее количество химуса, проходящее за сутки через ЖКТ, можно приближенно заключить, что бактериальная азотфиксация может обеспечивать до 1/3 потребностей речного бобра в азоте. Очевидно также, что этот феномен в питании бобра приводит к дополнительному привнесу азота в места обитания животных и отражается на азотном балансе окружающих акваторий и прилегающих почв.

Особый интерес представляет таксономический состав кишечного сообщества бобра, впервые установленный нами с помощью специально адаптированной методики: изучения

нуклеотидиой последовательности 163-рибосомальиых генов, выделенных из суммарной прокариотиой ДНК Использование градиентного электрофореза амплификонов позволило получить достаточно полную картину доминирующих в ЖКТ речного бобра бактерий Bifidobacterium adolescentts, Parabacteroides distasoms, Bacteroides sp, Pseudomonas sp, Flavobactenum sp, Eggerthella sp Нами обнаружено наличие mfil гена у кишечных микроорганизмов, что подтверждает микробное происхождения дополнительною азота в ЖКТ бобра

ВЫВОДЫ

1 Впервые обнаружена нитрогеназная активность, а также наличие ш/Н-гена в кишечнике речного бобра Отмечено увеличение содержания азота в химусе по мере прохождения ЖКТ, обусловленное бактериальной азотфиксацией

2 Оптимизирована методика определения таксономического состава кишечных бактерий с помощью анализа нуклеотидной последовательности 16S-рибосомальных генов, выделенных из суммарной бактериальной ДНК, с использованием градиентного электрофореза Она позволяет более эффективно определять таксономический состав доминантов бактериального сообщества ЖКТ речного бобра, в том числе анаэробные и некультивируемые формы

3 Установлена структура и численность кишечных микроорганизмов речного бобра Общая численность прокариот достигает физиологически значимых величин (до 109 КОЕ/г), в структуре микробного комплекса преобладают Bifidobacterium adolescentis, Parabacteroides distasoms, Bacteroides sp, Pseudomonas sp, Flavobacterium sp, Eggerthella sp, многие из которых способны к фиксации атмосферного азота

4 В местах наибольшего влияния речного бобра, выявлено повышенное содержание азота и увеличение активности процессов его трансформации по сравнению с контрольными участками, что сопровождается ростом численности и функционального разнообразия почвенных микроорганизмов

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1 Вечерский М В , Наумова Е И , Костина Н В, Умаров М М Особенности азотфиксации в пищеварительном тракте речного бобра (Castor fiber) II Доклады АН 2006 Т411 №1 С 128-130

2 Вечерский М В , Наумова Е И , Костина Н В , Умаров М М Ассимиляция биологического азота у европейского речного бобра // Изв РАН Сер биологич 2008 Т 413 № 6 (в печати)

3 Наумова Е И , Жарова Г К , Вечерский М В , Варшавский А А, Чистова Т Ю Механизмы утилизации целлюлозосодержащих кормов речным бобром Castor fiber И Успехи биологии 2008 (в печати)

4 Вечерский М В , Наумова Е И, Костина Н В , Умаров М М Влияние речного бобра (Castor fiber) на некоторые процессы азотного цикла почв, прилегающих к «бобровым запрудам» // Тезисы докладов молодых ученых ИПЭЭ РАН Москва 2006 С 78-82

5 Умаров М М, Костина Н В , Кузнецова Т А, Вечерский М В , Манаева Е С Микробиологическая трансформация азота в почвах мест поселений животных // Тезисы докладов V съезда Общества почвоведов им В В Докучаева Ростов-на-Дону 2008 С 135

Подписано в печать 09 10 2008 Формат 60x88 1/16 Объем 1 5 п л Тираж 100 экз Заказ № 750 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вечерский, Максим Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Х.Х. Симбионтное пищеварение как адаптивный механизм при освоении растительной кормовой базы.

1.2. Микробная азотфиксация.

1.3. Речной бобр. Характеристика вида.

1.3.1. Общие сведения.

1.3.2. Особенности питания и пищеварения речного бобра.

1.3.3. Структура и особенности желудочно-кишечного тракта речного бобра.

1.3.4. Бобр как компонент водных биоценозов.

1.3.5. Строительная деятельность бобров.

1.3.6. Влияние бобров на заселяемые водоемы.

1.3.7. Влияние бобров на почвы, прилегающие к бобровым запрудамЗО

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования.

2.1.1. Образцы ЖКТ.

2.1.2. Образцы почв.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Газохроматографические методы.

2.2.2. Микробиологические методы.

2.2.3. Химические методы.

2.2.4. Молекулярно-биологические методы.

ГЛАВА. 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Азотфиксация и содержание азота в содержимом ЖКТ речного бобра

3.2. Особенности бактериального комплекса ЖКТ речного бобра.

3.3. Оптимизация методики определения качественного состава бактериального сообщества ЖКТ путем анализа нуклеотидной бактериальной ДНК.

3.4. Влияние речного бобра на биологическую активность почв.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности азотфиксации в желудочно-кишечном тракте речного бобра (Castor fiber)"

Речной бобр (Castor fiber L., 1758) широко распространен в водных экосистемах Европейской части России, его численность достигает 270 тыс. особей (Завьялов, 2005). Особенностью этих грызунов является потребление трудно перевариваемых низкобелковых, целлюлозосодержащих кормов. Вопросы усвоения клетчатки бобрами традиционно привлекали внимание исследователей (Nasset, 1953; Новиков и др., 1976; Соловьев, 1991), однако проблема обеспечения азотом этих животных остается не изученной. Известно, что у животных со схожими диетарными предпочтениями (термиты, жвачные, зайцеобразные и др.) выработался ряд адаптивных механизмов, компенсирующих недостаток азота в пище: реутилизация мочевины (Stevens, Hume, 1998; Singer, 2003), поедание разлагающихся растительных волокон, богатых микробной биомассой (Batra et al., 1966; Жужиков, 1979; Brauman et al., 1992), копрофагия (Наумова, 1981). Дополнительным источником азота, позволяющим животным существовать на бедных этим элементом кормах, может служить микробная азотфиксация в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ). К настоящему времени она выявлена у некоторых беспозвоночных, например термитов, (Breznak et al. 1973; Lilburn et al., 2001; Noda et al., 2005), а также позвоночных животных: полевок, песчанок, слепышей (Лаптев, 1995; Наумова и др., 2000; Варшавский и др., 2003; Кузнецова и др., 2005). Для бобра таких данных пока нет.

По функциональной морфологии ЖКТ (железистый желудок, а также объемные слепая и ободочная кишки, в которых происходит ферментация растительных волокон) бобров относят к группе млекопитающих с постгастричной (заднекишечной) ферментацией. Подобное строение ЖКТ оптимально подходит и для протекания микробной фиксации азота. В этой связи речной бобр является удачной моделью для изучения особенностей микробной азотфиксации у позвоночных животных.

Кроме того, эти животные интересны как преобразователи не только водных, но и наземных экосистем — они формируют так называемые «бобровые запруды», которые существенно изменяют гидрологический режим значительных территорий (Завьялов, 2005). При этом изменяется целый ряд параметров: смещение линии уреза воды, искажение характера водного потока, увеличение освещенности водной толщи, понижение окислительно-восстановительного потенциала прилегающих почв, а также существенное увеличение содержания азота в водах и грунтах «бобровых запруд», приводящее к цветению водоемов и смене прибрежных фитоценозов (Naiman, Melillo, 1984).

Цель работы: изучение нитрогеназной активности и структуры прокариотного комплекса ЖКТ речного бобра и оценка его влияния на биологическую активность почв прилегающих территорий.

В задачи исследования входило:

1. Оценить интенсивность процессов фиксации и накопления азота в химусе речного бобра.

2. Изучить структуру и функциональное разнообразие комплекса микроорганизмов в ЖКТ бобра.

3. Оптимизировать методику определения качественного состава бактериального сообщества ЖКТ путем анализа нуклеотидной последовательности 168-рибосомальных генов, выделенных из суммарной бактериальной ДНК.

4. Изучить влияние поселений бобров на биологическую активность почв, затапливаемых водами бобровых запруд.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Вечерский, Максим Валерьевич

выводы

1. Впервые обнаружена нитрогеназная активность, а также наличие nifH-гена в кишечнике речного бобра. Отмечено увеличение содержания азота в химусе по мере прохождения ЖКТ, обусловленное бактериальной азотфиксацией.

2. Оптимизирована методика определения таксономического состава кишечных бактерий с помощью анализа нуклеотидной последовательности 168-рибосомальных генов, выделенных из суммарной бактериальной ДНК, с использованием градиентного электрофореза. Она позволяет более эффективно определять таксономический состав доминантов бактериального сообщества ЖКТ речного бобра, в том числе анаэробные и некультивируемые формы.

3. Установлена структура и численность кишечных микроорганизмов речного бобра. Общая численность прокариот достигает физиологически значимых величин (до 109 КОЕ/г), в структуре микробного комплекса преобладают Bifidobacterium adolescentis, Parabacteroides distasonis, Bacteroides sp., Pseudomonas sp., Flavobacterium sp., Eggerthella sp., многие из которых способны к фиксации атмосферного азота.

4. В местах наибольшего влияния речного бобра, выявлено повышенное содержание азота и увеличение активности процессов его трансформации по сравнению с контрольными участками, что сопровождается ростом численности и функционального разнообразия почвенных микроорганизмов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование выявило наличие активной бактериальной азотфиксации в кишечнике всех особей речного бобра, принадлежащих к разным популяциям. Несомненна ее важная физиологическая роль в азотном питании как одного из источников «биологического» азота для этого животного. При этом характер накопления азота в химусе — увеличение его содержания к концу кишечника — позволяет утверждать, что его потребление в виде бактериального белка происходит в результате копрофагии. Исходя из степени обогащения азотом корма при прохождении через ЖКТ, его содержания в эвакуате из слепой кишки, учитывая среднее количество химуса, проходящее за сутки через ЖКТ, можно приближенно заключить, что бактериальная азотфиксация может обеспечивать до 1/3 потребностей речного бобра в азоте. Очевидно также, что этот феномен в питании бобра приводит к дополнительному привносу азота в места обитания животных и отражается на азотном балансе окружающих акваторий и прилегающих почв.

Особый интерес представляет таксономический состав кишечного сообщества бобра, впервые установленный нами с помощью специально адаптированной методики: изучения нуклеотидной последовательности 16S-рибосомальных генов, выделенных из суммарной прокариотной ДНК. Использование градиентного электрофореза ампликонов позволило получить достаточно полную картину доминирующих в ЖКТ речного бобра бактерий: Bifidobacterium adolescentis, Parabacteroides distasonis, Bacteroides sp., Pseudomonas sp., Flavobacterium sp., Eggerthella sp. Нами обнаружено наличие nifH гена у кишечных микроорганизмов, что подтверждает микробное происхождения дополнительного азота в ЖКТ бобра.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вечерский, Максим Валерьевич, Москва

1. Абатуров Б. Д., Девятых В.А., Зубкова JI.B. Роль роющей деятельности сусликов (Citellus pygmaeus Pall.) в перемещении минеральных веществ в полупустынных почвах Заволжья // Почвоведение. 1969. №12. С.93-99.

2. Абатуров Б. Д. Млекопитающие как компонент экосистем. М.: Наука. 1984. 286 с.

3. Абатуров Б.Д., Лопатин В.Н. Связь уровня потребления пищи с размерами тела у растительноядных млекопитающих // Журнал общ. биологии. 1987. Т.66. Вып. 6. С. 763-770.

4. Абатуров Б.Д., Магомедов М.-Р. Д. Питательная ценность и динамика кормовых ресурсов как фактор состояния популяции растительноядных млекопитающих // Зоол. журнал. 1988. Т. 67. Вып.2. С. 223-234.

5. Абатуров Б.Д., Хашаева М.Г. Усвоение зеленых растительных кормов грызунами разной пищевой специализации в зависимости от фазы вегетации кормовых растений // Зоол. журнал. 1995. Т. 74. Вып. 4. С. 132-141.

6. Бабин В.Н., Домарадский И.В. Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры // Рос. хим. журн. (ЖРХО им. Менделеева). 1994. Т. 38(6) С. 66-78.

7. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ. 1989. С.49-51.

8. Белов Л.П., Костина Н.В., Наумова Е.И., Умаров М.М. Особенности трансформации азота в дерново-подзолистой почве на участках, заселенных обыкновенной полевкой Microtus arvalis II Известия АН. Серия Биологическая. 2002. N 1. С. 102-105.

9. Варшавский А. А., Пузаченко А. Ю., Наумова Е. И., Костина Н. В. Ферментативная активность микрофлоры пищеварительного трактаобыкновенного слепыша Spalax microphtalmus (Spalacidea, Rodentia) // ДАН. 2003. Т. 392. №4. С. 564-567.

10. Варшавский А.А. Особенности внутренних цепей питания зеленоядных мышевидных грызунов: Дис. . канд. биол. наук : 03.00.08 : Москва. 2004. 90 с.

11. Варшавский А.А., Наумова Е.И., Тихонов И.А. Особенности функционирования целлюлолитических симбионтов в преджелудке и слепой кишке серых полевок Microtus arvalis и М. rossiaemeridionalis II Зоол. журн. 2004. С. 739-750.

12. Воронцов Н.Н. Эволюция пищеварительной системы грызунов (мышеобразные). Новосибирск: Наука. 1967. 239 с.

13. Вэнс К. Rhizobiaceae молекулярная биология бактерий взаимодействующих с растениями. СПб.: 2002. С. 541—564.

14. Голиченков М.В., Костина Н.В., Ульянова Т.А., Умаров М.М. Особенности азотфиксации и денитрификации у термитов Neotermes castaneus, Zootermopsis angusticollis и Reticulitermes lucifugus II Известия АН. Сер. биол. 2002. №2. С. 214-218.

15. Горленко М.В., Кожевин П.А. Дифференциация почвенных микробных сообществ с помощью мультисубстратного тестирования //Микробиология. 1994. Т. 63 (2). С.289-293.

16. Гревцев В.И. К методике прогнозирования численности бобра // Методические основы прогнозирования численности и возможностей добычи зверей. Сб. научных трудов ВНИИОЗ. Киров. 1994. С. 91-108.

17. Гриценко И.Н. Микрофлора мелких млекопитающих Западной Сибири. Новосибирск: Наука. 1971. 216 с.

18. Дежкин В.В., Дьяков Ю.В., Сафонов В.Г. Бобр. 1986. М.: Агропромиздат. 256 с.

19. Добринский JI. Н., Давыдов В. А., Кряжимский Ф. В., Малафеев Ю.М. Функциональные связи мелких млекопитающих с растительностью в луговых биогеоценозах. М.: Наука. 1983. С. 33, 66-71, 108-109.

20. Жарова Г. К., Наумова Е. И., Чистова Т. Ю. Динамика прохождения пищи по пищеварительному тракту рыжей полёвки // ДАН. 1996. Т. 349. №5. С. 712-714.

21. Жарова Г. К., Наумова Е. И., Чистова Т. Ю., Нестерова Н. Г., Подтяжкин О. И. Особенности прохождения пищи по пищеварительному тракту серых полёвок // ДАН. 2002. Т. 382. №4. С. 560-562.

22. Жужиков Д.П. Термиты СССР. М.: Изд-во Моск. ун-та. 1979. 225 с.

23. Завьялов Н. А., Зуева С.С. Влияние бобровых плотин на почвенный покров (на примере Дарвиновского заповедника) // Лесоведение. 1998. №5. С. 25-35.

24. Завьялов Н. А. Динамика численности и средообразующая деятельность речного бобра в Дарвиновском заповеднике //Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 1999. 25 с.

25. Завьялов Н. А. Избирательное кормодобывание бобра и его влияние на разные типы прибрежных лесов Дарвиновского заповедника // Лесоведение. 2002. №6. С. 43-49.

26. Завьялов Н. А., Крылов А.В., Бобров А. А. и др. Влияние речного бобра на экосистемы малых рек. М.: Наука. 2005. 186 с.

27. Злотин Р. И. Ценозообразующая роль сурка в высокогорных ландшафтах внутреннего Тянь-Шаня // Структура и функционально-биогеоценотическая роль животного населения суши. 1.967. С. 94-97.

28. Калугин Ю.А. Физиология питания кроликов. М.: Колос. 1980. 175 с.

29. Киликовский В. В., Умаров М. М. Активность ванадий зависимой («альтернативной») нитрогеназы в некоторых типах почв // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 1993. №1. С. 62-64.

30. Кирюшенко С. П. Влияние роющей деятельности копытных леммингов на растительный покров арктических тундр острова Врангеля // Бюл. МОИП. Отд. Биол. 1978. Вып. 2. С. 28-35.

31. Кокшайский Н.В. О принципе эволюционной стабилизации функций // Современные проблемы эволюционной морфологии. М.: Наука» 1988. С. 28-47.

32. Крапивный А.П. К вопросу о лабильности и индикаторных формах строительного стереотипа поведения бобров в Белоруссии. Деп.в ВИНИТИ. 1983. № 1391-83-ДЕП.

33. Кретович B.JI. Биогеохимия усвоения азота воздуха растениями. М.: Наука. 1995. 137 с.

34. Кузнецова Т. А., Рощина Е. С., Костина Н. В., Умаров М. М. Биологическая активность почв Черных земель Калмыкии, заселенных песчанками Meriones tamariscinus и М. meridianus II Изв. РАН. Сер. биологич. 2005. № 6. С. 124-130.

35. Кузнецова Т.А. Особенности азотфиксации в желудочно-кишечном тракте песчанок и их влияние на биологическую активность почв. Дис. канд. биол. наук : 03.00.08 : Москва, 2007. 100с.

36. Кучерук В.В. Норы млекопитающих их строение, использование и типология // Фауна и экология грызунов. 1983. Вып. 15. С. 5-54.

37. Лаптев Г. Ю. Нитрогеназная активность содержимого рубца жвачных животных // 9-й Баховский коллоквиум по азотфиксации памяти чл.-корр. РАН В. Л. Кретовича. Тез. докл. ОНТИ ПНЦ РАН. Пущино. 1995. С. 91.

38. Лысак Л.В., Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н. Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий. М.: МАКС Пресс. 2003. 120 с.

39. Львов Н.П. Молибден в ассимиляции азота у растений и микроорганизмов. М.: Наука. 1989. 135 с.

40. Методы почвенной микробиологии и биохимии. Под ред. Звягинцева Д. Г. учеб. пособие. М.: Изд-во МГУ. 1991. 304 с.

41. Мишустин Е.Н., Шильникова В.К. Биологическая фиксация атмосферного азота. М.: Наука. 1968. 368 с.

42. Мэгарран Э. Экологическое разнообразие и его измерение. М.: Мир. 1992. 184 с.

43. Наумов Н.П. Очерки сравнительной экологии мышевидных грызунов. М.: Изд-во АН СССР. 1948. 58 с.

44. Наумова Е. И. Морфологические и функциональные ограничители трофических ниш у млекопитающих-фитофагов // Актуальные проблемы морфологии и экологии высших позвоночных. М. 1988. С. 181-213.

45. Наумова Е.И. Эволюционные пути освоения грызунами растительной кормовой базы // Проблемы фундаментальной экологии. М.: Научный мир. 1999. С. 181-212.

46. Наумова Е. И., Ушакова Н. А., Мещерский И. Г., Костина Н. В., Умаров М. М. Азотфиксация — новый феномен в питании грызунов // Изв. АН. Сер. биол. 2000. №3. С. 341-343.

47. Наумова Е.И. Функциональная морфология пищеварительной системы грызунов и зайцеобразных. М.: Наука. 1981. 262 с.

48. Наумова Е.И., Валенсия-Леон Р.А. Структура и функции полужелезистого и дискожелезистого желудков лесных полевок (Rodentia, Clethrionomys) // ДАН. 1993. Т.331. №2. С.251-254.

49. Наумова Е.И., Кучерук В.В. Функциональные аспекты толерантности большой песчанки к грубым кормам: стратегия использования диетарных клетчатковых волокон // Зоол. журнал. 1996 а. Т.75. Вып.1. С. 103-113.

50. Наумова Е.И., Кучерук В.В. Экспериментальное исследование скорости и динамики продвижения разных кормов по пищеварительному тракту большой песчанки // Известия РАН. 1996 б. Серия биол. № 6. С. 716-724.

51. Наумова Е.И., Нестерова Н.Г. О пищеварительных функциях преджелудка грызунов // ДАН. 1994. Т. 336. № 1. С. 135-137.

52. Наумова Е.И., Жарова Г.К., Вечерский М.В., Варшавский А.А., Чистова Т.Ю. Механизмы утилизации целлюлозосодержащих кормов речным бобром Castor fiber II Успехи биологии. 2008 (в печати).

53. Новиков С.С., Дьяков И.П., Куликов Н.А. // Тр. Воронежского гос. заповедника. 1976. Т. 2. Вып. 21. С. 13.

54. Определитель бактерий Берджи. М.: Мир 1997. Т. 1-2. 800 с.

55. Пивняк И. Г., Тараканов Б. В. Микробиология пищеварения жвачных. М.: Колос. 1982. 248 с.

56. Покаржевский А. Д. Геохимическая экология наземных животных. М., Наука. 1985.300 с.

57. Рабинович М. JL, Болобова А. В., Кондращенко В. И. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Кн. 1. Древесина и разрушающие ее грибы. М.: Наука. 2001. 264 с.

58. Работнов Т. А. О биогеоценотическом подходе к разработке научных основ луговодства // Журнал общей биологии. 1967. Т. 28. №5. С. 557-562.

59. Соловьев В. А. Речной бобр Европейского Северо Востока. JL: Изд-во Ленинградского университета. 1991. 208 с.

60. Умаров М. М. Ассоциативная азотфиксация. М.: Изд-во МГУ. 1986. 136 с.

61. Умаров М. М. Современное состояние и перспективы развития микробной азотфиксации // Перспективы развития почвенной биологии: Всерос. конф.: М.: МАКС Пресс. 2001: Труды. Отв. ред. Д. Г. Звягинцев. 2004. С. 47-56.

62. Умаров М.М., Добровольский Г.В. Почва, микробы и азот в биосфере //Природа. 2001. №6. С. 15-22.

63. Умаров М.М., Кураков А.В., Степанов А.Л. Микробиологическая трансформация азота в почве. М.: ГЕОС. 2007. 137 с.

64. Холодова М. В., Нестерова Н. Г., Касайе Ф. Эджегдегсей Терриологические исследования в Эфиопии. М.: Наука 1995. С. 80— 85.

65. Чибилев Е. А. Бобр речной (Castor fiber) в городской черте Челябинска // Животные в антропогенном ландшафте: Материалы 2 Международной научно-практической конференции Астрахань: Из-во Астраханского гос. ун-та. 2004. С. 38-41.

66. Чибилёв Е. А. // Природное и культурное наследие Урала: материалы IV регион, науч.-практ. конф. Челябинск, 2006. С. 99-103.

67. Шидловская Н.К. Копрофагия у бобров // Тр. Воронежского гос. Заповедника. 1960.Вып. 9. С. 221.

68. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир. 1987. 567 с.

69. Bibiloni R., Simon М.А., Albright С., Sartor В. Tannock G.W. Analysis of the large bowel microbiota of colitic mice using PCR/DGGE // Letters in Applied Microbiology. 2005. №41. P. 45-51.

70. Batra L.R., Batra S.W.T. Fungus-growing termites of tropical India and associated fungi // Journal of the Kansas Entomological Society. 1966. V.39. P.725-738.

71. Bauchop Т., Martucci R. W. Ruminant-like digestion of the langur monkey // Science. 1968. V. 161. P. 698-700.

72. Bayley H. S. Comparative physiology of the hindgut and its nutritional significance // J. Anim. Sci. 1978. V. 46. №6. P. 1800-1802.

73. Behar A., Yuval В., Jurkevitch E. Enterobacteria-mediated nitrogen fixation in natural populations of the fruit fly Cerotitis capitata II Mol. Ecol. 2005. V.14. P.2637-2643.

74. Benemann J.R. Nitrogen fixation in termites // Science. 1973. V. 181, P. 164-165.

75. Beasley S.S., Manninen T.J., Saris P.E. Lactic acid bacteria isolated from canine faeces // J. Appl. Microbiol. 2006. V. 101. №1. P. 131-138.

76. Bergersen F.J., Hipsley E.H. The presence of N2-fixing bacteria in the intestines of man and animals // J. Gen. Microbiol. 1970. V. 60. P. 61-65.

77. Bjorndal K.A., Bolten A.B., Moore J.E. Digestive fermentation in herbivores; effect of food particle size // Physiol. Zool. 1990. V. 63. № 4. P. 710-721.

78. Bonn S. van, Buschinger A., Boomsma J.J., Billen J. Tetraponera ant have gut symbionts related to nitrogen-fixing root-nodule bacteria // Proc.R. Soc. Lond. 2002. V. 269. P. 2023-2027.

79. Bozinovich F. Nutritional energetics and digestive responses of an herbivorous rodent (Octodont degus) to different levels of dietary fiber // Journal of Mammology. 1995. V. 76.1. 2. P. 627-637.

80. Brauman A., Kane M.D., Labat M., Breznak J.A. Genesis of acetate and methane by gut bacteria of nutritionally diverse termites // Science. 1992. V. 257. P. 1384-1387.

81. Breznak, J. A., Brill W. J., Mertins J. W., Coppel H. C. Nitrogen fixation in termites // Nature. 1973. V.244. P.577-580.

82. Breznak JA, Mertins JW, Coppel HC. Nitrogen fixation and methane production in wood-eating cockroach, Cryptocercus punctulatus Scudder (Orthoptera: Blattidae) // Univ. Wis. For. Res. 1974. Notes 184, Madison, WI.

83. Breznak J. A. Intestial Microbiota of Termites and other Xylophagus Insects // Ann. Rev. Microbiol. 1982. P.323-343.

84. Breznak J.A. Acetogenesis // Ed. Drake H.L. Chapman and Hall. 1994. P. 303-330.

85. Bridges J.R. Nitrogen-fixing bacteria associated with bark beetles // Microb. Ecol. 1981.V. 7. P.131-137.

86. Carpenter E.J., Cullin'ey J.I. Nitrogen fixation in marine shipworms // Science. 1975. V. 187. P. 551-552.

87. Citernesi U., Neglia R., Seritti A., Lepidi A.A., Gilippi C., Bagnoli G., Nuti M.P., Galluzzi R. Nitrogen fixation in the gastro-enteric cavity of soil animals // Soil Biol. Biochem. 1977. V. 9. P. 71-72.

88. Cody D., Leff L. Analysis of Bacterial Assemblage Genetic Diversity in Environmental Samples Using the DCode™ System, 2000.

89. Daly M., Daly S. Behaviour of Psammamys obesus (Rodentia: Gerbillinae) in the Algerian Sahara // Tierpsychol. 1975. V. 37. P. 298-321.

90. Daly M., Daly S. Spatial distribution of leaf-eating Saharan gerbil (Psammomys obesus) in relation to it food. // Mammalia. 1974. 38. P. 545561.

91. Degen A.A., Каш R., Khokhlova I.S. and Zeevi K. Fiber digestion and energy utilization of fat sand rats (Psammomys obesus) consuming the chenopod Anabasis articulata II Physiological and Biochemical Zoology. 2000. V.73. 5. P. 574-580.

92. Demment M.W. The scaling of rumenorecticulum size with body weight in East African ungulates // Afr. J. Ecol. 1982. V. 20. P. 43^17.

93. Ehle F. R., Varner R. J. Nutritional implications of the hamster forestomach. //J. Nutr. 1987. V. 108. №7. P. 1047-1053.

94. Fitchet-Calvet E., Jomaa I., Zaafouri В., Ashford R.W., Ben-Ismail R., Delattre P. The spatio-temporal distribution of a rodent reservoir host of cutaneous leishmaniasis // J. Appl. Ecol. 2000. V. 37 P. 603-615.

95. Fuller M.F., Reeds P.J. Nitrogen cycling in the gut // Annu. Rev. Nutr. 1998. V. 18. P. 385-411.

96. Grant W. E., McBrayer J. F. Effects of Mound Formation by Pocket Gophers (Geomys bursarius) on Old-field Ecosystems // Pedobiology. 1981. V. 22. № 1. P. 21-28.

97. Guerinot M. L., Patriquin D. G. N2-fixing vibrios isolated from the gastrointestinal tract of sea urchins // Can. J. Microbiol. 1981. V. 27. №3. P. 311-317.

98. Hammond K. A., Wunder B. A. The role of diet quality and energy need in the nutritional ecology of a small herbivore, Microtus ochrogaster II Physiological Zoology. 1991. V. 64. P. 541-567.

99. Hornicke H. Utilization of caecal digesta by caecotrophy (soft faeces ingestion) in the rabbit // Livest. Prod. Sci. 1981. V. 8. P. 361-366.

100. Hume I. D. Optimal digestive strategies in mammalian herbivores // Physiological Zoology. 1989. V. 62. №6. P. 1145-1163.

101. Hoover W. H., Clarke S. D. Fiber Digestion in the Beaver // J. Nutr. 1972. №102. P. 9-16.

102. Janis C. The evolutionary strategy of the Equidae and the origin of rumen and caecal digestion // Evolution. 1976. V. 30. №4. P. 757-774.

103. Justice К. E., Smith F.A. A model of dietary fiber utilization by small mammalian herbivores, with empirical results for Neotoma // The Amer. Naturalist. 1992. V. 139. №2. P. 398-416.

104. Kam M., Degen A.A. Water, electrolyte and nitrogen balances of fat sand rats (Psammomys obesus) when consuming the saltbush Atriplex halimus II J. Zool., Lond. 1988. 215. P. 453-462.

105. Kam M., Khokhlova I.S., Degen A.A. Granivory and plant selection by desert gerbils of different body size // Ecology. 1997. V. 78. 7. P. 22182229.

106. Keys J.E., Jr., Van Soest F.J. Digestability of forages by the meadow vole {Microtus pennsylvanicus) //J. Dairy Sci. 1970. V.53. P. 1502-1508.

107. Khokhlova I.S., Degen A.A., Kam M. Body size, gender, seed husking and energy requirements in two species of desert gerbilline rodents, Meriones crassus and Gerbillus henleyi II Functional ecology. 1995. V. 9. P. 720— 724.

108. Kuranouchi Т., Nakamura Т., Shimamura S., Kojima H., Goka K., Okabe K., Mochizuki A. Nitrogen fixation in the stag beetle, Dorcus (Macrodorcus) rectus (Motschulsky) (Col., Lucanidae) // Journal of Applied Entomology. 2006. Vol. 130.1. 9-10. P.471-472.

109. Langer P. Evolution of digestive tract in mammals // Verh. Dtsch. Zool. Ges. 1991. V. 84. P. 169-193.

110. Lee К. E. The role of soil fauna in nutrient cycling // In: Management and Conservation of Soil Fauna. 1991. P. 465-471.

111. Lee W. В., Houston D.C. Tooth wear patterns in voles {Microtus agrestis and Clethrionomys glareolus) and efficiency of dentation in preparing food for digestion // J. Zool. Lond. 1993. V. 231. P. 301-309.

112. Lesser M.P., Mazel C.H., Gorbunov M.Y., Falkowski P.G. Discovery of symbiotic nitrogen-fixing cyanobacteria in corals // Science. 2004. V. 305(5686) P. 997-1000.

113. Lilburn T.G., Kim K.S., Ostrom N.E., Byzek K.R., Leadbetter J.R., Breznak J.A. Nitrogen fixation by symbiotic and free-living spirochetes // Science. 2001. V. 292(5526) P. 2495-2498.

114. Ludden P.W., Roberts G.P. Nitrogen fixation by photosynthetic bacteria // Photosynth. Res. 2002. V. 73.1.(1-3). P. 115-118.

115. McBurney W., Mangold M., Munro K., Schultz M., Rath H.C., Tannock G.W. PCR/DGGE and 16S rRNA gene library analysis of the colonic microbiota of HLA-B27/f32-microglobulin transgenic rats // Letters in Applied Microbiology. 2006. V. 42. № 2. P. 165-171.

116. Murphy K.M., Teable D.S., MacRae I.C. Kinetics of colonization of adult Queenslanl fryit flies (Bactrocera tryoni) by denitrogen-fixing alimentary tract bacteria // Applied and Environmental Microbiology. 1994. V. 60. № 7. P. 2508-2517.

117. Naiman R.J., Melillo J.M. Nitrogen Budget of a subartic stream altered by beaver // Oecologia. 1984. V. 62. P.150-155.

118. Nasset, E. S. Gastric secretion in the beaver (Castor canadensis) // J. Mammal. 1953. V.34. P. 204-209.

119. Oda Y., Samanta S., Rey F., Wu L, Liu X., Yan Т., Zhou J., Harwood C. Functional Genomic Analysis of Three Nitrogenase Isozymes in the Photosynthetic Bacterium Rhodopseudomonas palustris II Journal of Bacteriology. 2005. Vol. 187. №22. P. 7784-7794.

120. Ohwaki К., Hungate R. E., Lotter L., Hoffmann R. R., Maloiy G. Stomach fermentation in East African colobus monkeys in their natural state // Appl. Microbiol. 1974. V. 27. P. 713-723.

121. Persson T. Influence of soil animals on nitrogen mineralization // New Trends in Soil Biology. Eds. P. Lebrun, H. M. Andre., A. de Medts, C. Gregoire-Wibo. Louvain-la-Neuve, Dieu-Brichart. 1983. P. 117-126.

122. Rees D.C., Howard J.B. Nitrogenase: standing at the crossroads // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. V.4 (5). P.559-566.

123. Shenbrot G., Krasnov В., Rogovin, K.A. Spatial ecology of desert rodent communities. Springer-Verlag. Berlin. 1999. 292 p.

124. Szilagyi R.K., Schwab D.E.: Sulfur K-edge X-ray Absorption Spectroscopy as an Experimental Probe for S-nitroso Proteins // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2005. V.330(l). P. 60-64.

125. Singer, Michel A. Do mammals, birds, reptiles and fish have similar nitrogen conserving systems? // Comparative Biochemistry and Physiology. 2003. V.134. P.543-558.

126. Sperber I., Bjomhag G., Ridderstrale Y. Function of proximal colon in lemming and rat// Swed. J. Agric. Res. 1983. V.13. P. 243-256.

127. Stevens C.E., Hume I.D. Contributions of microbes in vertebrate gastro intestinal tract to production and conservation of nutrients // Physiological reviews. 1998. V.78. № 2. P. 393-427.

128. Tayasu I. Use of carbon and nitrogen isotope ratios in termite research // Ecol. Res. 1998. V. 13. P. 377-381.

129. Wang D.H., Pei Y.X., Yang J.C. Wang Z.W. Digestive tract morphology and food habits in six species of rodents // Folia Zool. 2003. V. 52(1). P. 51-55.

130. Watanabe I. Biological Nitrogen Fixation and its Use in Agriculture. 2000. http://www.asahi-net.or.jp/~it6i-wtnb/BNF.html

131. Yamada A., Inoue Т., Noda S., Hongoh Y., Ohkuma M. Evolutionary trend of phylogenetic diversity of nitrogen fixation genes in the gut community of wood-feeding termites // Mol. Ecol. 2007. V. 16(18). P.3768-3777.