Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности микробного пейзажа, эндотоксинемии и показателей гемостаза у женщин с бактериальным вагинозом

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности микробного пейзажа, эндотоксинемии и показателей гемостаза у женщин с бактериальным вагинозом"

На правах рукописи

ГАЙСИНА ЮЛИЯ РАМИЛЕВНА

ОСОБЕННОСТИ МИКРОБНОГО ПЕЙЗАЖА, ЭНДОТОКСИНЕМИИ И ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЕМОСТАЗА У ЖЕНЩИН С БАКТЕРИАЛЬНЫМ

ВАГИНОЗОМ

03.02.03 - Микробиология 03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2ШР 2013

Уфа - 2013

005050999

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Мавзютов Айрат Радикович доктор медицинских наук, профессор Гильманов Александр Жанович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Оренбургский научный центр РАМН,

зав. лабораторией клеточного симбиоза Гриценко Виктор Александрович

доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Минздрава

России, зав. кафедрой биохимии Галян Сергей Леонидович

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится 13 года в «/Легчасов на заседании Диссерта-

ционного совета Д 208.1^7.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, доцент

Л.С. Латюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема дисбиотического нарушения микробиоценоза влагалища ввиду его широкой распространенности считается одной из наиболее актуальных в акушерской и гинекологической практике. Частота бактериального вагиноза (БВ) у беременных составляет в среднем 14-20 %, а в группах повышенного риска она возрастает до 30-38% (Анкирская A.C., 2005). Изменение микробиоты влагалища у хирургических больных в гинекологических стационарах наблюдается в 45-86% случаев и является основой послеоперационных инфекционных осложнений. В патогенезе последних нередко наблюдаются расстройства микроциркуляции, связанные чаще всего с нарушениями в системе гемостаза (Ness R.B. et al., 2005).

Поскольку одним из факторов патогенности грамотрицательных бактерий является капсульный липополисахарид (ЛПС), можно предположить определенную роль микробных эндотоксинов в развитии указанных выше осложнений. Учитывая такие особенности патогенеза бактериального вагиноза, как дезинтеграция эпителиального слоя слизистой протеолитическими ферментами, незавершенность фагоцитоза (Кира Е.Ф., 2001), возможно проникновение ЛПС грамотрицательных бактерий через влагалищную стенку в венозные и лимфатические сосуды паравагинальной клетчатки и попадание в дальнейшем в системный кровоток. Предположительные изменения гемостаза при БВ еще очень мало изучены, а имеющиеся сведения разрознены и не имеют интегрированного обобщения.

Цель исследования. Определить особенности микробного пейзажа влагалища, выраженность эндотоксинемии и ассоциированных с ней сдвигов гемостаза у женщин с вагинальным дисбиозом.

Задачи исследования.

1. Оценить встречаемость бактериального вагиноза и состояние вагинальной микрофлоры у женщин репродуктивного возраста.

2. Изучить уровень эндотоксинемии, выраженность острофазового ответа и антиэндотоксинового иммунитета у женщин с дисбиозом влагалища.

3. Определить состояние системы гемостаза, антикоагулянтной системы и параметров дисфункции эндотелия в связи с особенностями клинической и микробиологической картины вагиноза и эндотоксинемии у женщин репродуктивного возраста.

4. Обозначить патогенетическое значение обнаруженных сдвигов, определить необходимость и направление подходов их коррекции.

Научная новизна исследования. Установлено, что влагалищная микро-биота женщин при бактериальном вагинозе характеризуется повышением общей микробной обсемененности на фоне существенного уменьшения концентрации Lactobacillus spp., с превалированием аэробных и факультативно-анаэробных грамотрицательных бактерий. Определена этиологическая роль представителей семейства Mycoplasmataceae, в частности М. hominis и U. urea-lyticum в развитии бактериального вагиноза.

У женщин с бактериальным вагинозом выявлено умеренное повышение уровня ЛПС грамотрицательных бактерий в системном кровотоке, сопровождающееся активацией неспецифического иммунитета, с существенным повышением уровня провоспалительных цитокинов (IL-2, IL-6, TNF-a), увеличением плазменной концентрации главного острофазового реактанта - С-реактивного белка, уровень которого четко коррелирует с выраженностью вагинального дисбиоза. Особенностью специфического иммунного ответа при БВ является увеличение выработки антител к соге-региону ЛПС и тенденция к активации синтеза ЛПС-связывающего белка - LBP на начальных этапах БВ и их снижением при утяжелении дисбиоза.

При БВ в условиях системной эндотоксинемии впервые показаны: развитие слабых гипокоагуляционных сдвигов (незначительное удлинение АЧТВ и ПВ, неизменность уровня фибриногена, D-димера и РФМК), тенденция к активации антикоагулянтного звена с увеличением уровня плазменного антитромбина и протеина С, коррелирующая с выраженностью дисбиоза. Реакция эндо-телиальной системы проявлялась умеренно выраженной тенденцией к нарастанию уровня эндотелина, адгезивных молекул sPECAM-1 и sVCAM-1 и снижению концентрации фактора Виллебранда по мере утяжеления дисбиотического процесса. В целом отклик системы гемостаза носил адаптивный характер и свидетельствовал о компенсированности эндотоксинового воздействия, вместе с тем, допуская возможность выхода из-под контроля при продолжающейся эн-дотоксической агрессии и развития осложнений вплоть до ДВС крови.

Теоретическая и практическая значимость работы. Определены подходы к оценке значимости выявления этиологического фактора при вагинозах у женщин репродуктивного возраста, диагностическая значимость определения

уровня циркулирующих эндотоксинов и компонентов антиэндотоксиновой защиты, а также сдвигов параметров гемостаза. На основании обнаруженных изменений сформулированы подходы к выявлению и коррекции сдвигов гемостаза и эндотелиальной дисфункции на фоне эндотоксинемии при бактериальном вагинозе, предполагающие контроль состояния гемостаза при декомпенсации БВ и, при необходимости, принятие коррегирующих мер.

Положения, выносимые на защиту:

1. Бактериальный вагиноз у женщин возрастной категории 20-29 лет обнаружен в 65% случаев. Видовой и количественный состав влагалищной микрофлоры при вагинозе характеризуется повышением общей микробной обсеме-ненности на фоне снижения количества Lactobacillus spp. и преобладания аэробных и факультативно-анаэробных грамотрицательных бактерий; во всех случаях наблюдаются ассоциации микроорганизмов. Грамотрицательная микрофлора при бактериальном вагинозе в основном представлена бактериями семейства Enterobacteriaceae.

2. При прогрессировании бактериального вагиноза наблюдается тенденция к нарастанию уровня липополисахарида грамотрицательных бактерий в плазме крови пациентов.

3. Бактериальный вагиноз сопровождается активацией неспецифического иммунитета с повышением уровня провоспалительных цитокинов (IL-2, IL-6, TNF-a) и плазменной концентрации С-реактивного белка, уровень которого четко коррелирует с выраженностью вагинального дисбиоза. Специфический иммунный ответ организма на начальных этапах бактериального вагиноза проявляется умеренным повышением концентрации липополисахарид-связывающего белка и нарастанием титров антител к соге-региону липополисахарида с последующим их снижением при утяжелении дисбиоза.

4. При бактериальном вагинозе отмечается умеренно выраженная тенденция к гипокоагуляции - незначительное удлинение активированного частичного тромбопластинового времени и протромбинового времени на фоне неизменного уровня фибриногена и отсутствия маркеров активации свертывания крови. Реакция антикоагулянтного звена заключается в тенденции к увеличению плазменной антитромбиновой активности и возрастанию уровня протеина С.

5. В условиях дисбиоза отмечается вовлеченность клеток сосудистого эндотелия в антиэндотоксиновые реакции с относительным ростом уровня молекул

адгезии эРЕСАМ-1 и зУСАМ-1 и фазными изменениями уровня маркеров эндо-телиальной дисфункции (эндотелии-1, фактор Виллебранда).

6. Поступление липополисахарида грамотрицательных бактерий в организм при бактериальном вагинозе в целом не вызывает иммунопатогенного эффекта, не выходит за рамки «физиологической системной эндотоксинемии» и может служить фактором поддержания иммунного гомеостаза организма.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в работу женской консультации и гинекологического отделения МУ «Городская клиническая больница № 21» города Уфы, а также в учебный процесс кафедры лабораторной диагностики НПО ГБОУ ВПО «Башкирский Государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ.

Апробация. Материалы диссертации представлены на международных, всероссийских, региональных научно-практических конференциях (IV международный конгресс «Проблемы репродукции» (Москва, 2010); II ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2010); IV региональный научный форум «Мать и дитя» (Екатеринбург, 2010); IX Всероссийский научный форум «Мать и дитя» (Москва, 2007); I региональный научный форум «Мать и дитя» (Казань, 2007); 21 конгресс Международной федерации клинической химии и лабораторной медицины (Берлин, 2011). Апробация работы состоялась на совместном заседании сотрудников кафедр лабораторной диагностики НПО, фундаментальной и прикладной микробиологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 6 -в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 109 страницах компьютерного текста, содержит 16 таблиц, 18 рисунков, включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации и список использованной литературы, включающий 98 отечественных и 103 зарубежных авторов.

Конкурсная поддержка работы. Работа выполнена при поддержке феде-

ральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия 1.2.1 «Государственный контракт № П385 от 30 июля 2009 г.»

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Объектом исследования явились 305 женщин репродуктивного возраста, обратившиеся в женскую консультацию МУ «Городская клиническая больница № 21» города Уфы в 2009-2010 годы. Из них 183 здоровых составили контрольную группу; у 122 женщин, составивших основную группу наблюдения, был поставлен диагноз БВ. Проводили анкетирование (возраст, характер профессии, некоторые социально-демографические сведения), регистрировали данные акушерско-гинекологического анамнеза, жалобы на момент поступления, данные объективного и вагинального осмотров, результаты клинико-лабораторных и специальных исследований.

Для оценки микроскопической картины влагалищного биоценоза проводили световую микроскопию окрашенных по Граму мазков (микроскоп Люмам-Р8, ЛОМО, г. Санкт-Петербург). Степень дисбиоза влагалища определялась микроскопически по критериям, предложенным Мавзютовым А.Р. и соавт. (2001). Количественно и качественно влагалищный микробиоценоз характеризовали культуральным методом у 45 женщин основной группы и 26 клинически здоровых женщин на соответствующих питательных средах. Для культивирования использовались сухие коммерческие питательные среды производства НПО «Питательные среды» (г. Махачкала) и фирмы «Bio-Merieux» (Франция). Микроорганизмы культивировали в термостате при 37°С, дрожжеподобные грибы - при 22°С. Микроаэрофилы (G. vaginalis, Lactobacillus spp.) выращивали в эксикаторах с использованием газ-паков GEN Bag Anaer фирмы «Bio-Merieux», Франция. По окончании инкубации производился подсчет всех выросших колоний (КОЕ) и пересчет на 1 мл клинического материала. Результаты бактериологического исследования выражали в КОЕ/мл и рассчитывали десятичный логарифм колониеобразующих единиц - lg КОЕ/мл (логарифмическое микробное число). В качестве критериев нормоценоза учитывали микробную обсемененность 106-108 КОЕ/мл. а условно-патогенными микроорганизмами -не более 104 КОЕ/мл Микроорганизмы идентифицировали по биохимическим

7

признакам с использованием коммерческих тест-систем «JIAXEMA», Чехия (Strepto-test, Stafi-test, Entero-test, EnteroRapid-test, Neferm-test); «Bio Merieux», Франция (ID 32 E, ID 32 Staf, ID 32 Strep, ID 32 GN, ID 32 Cand, ID 32 А); НПО «Диагностические системы», г. Н.Новгород (ПБДЕ, ПБДС). Методом ПЦР определялись специфические фрагменты ДНК Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae с использованием стандартных наборов («Ин-терлабсервис», «Литех», «ДНК-технология», Россия) на амплификаторе «Тер-цик МС-2» («ДНК-технология», Россия). Этиологическую значимость М. ho-minis и U. urealyticum оценивали методом ИФА с использованием тест-систем

фирмы «Вектор-Бест» (Россия).

Для оценки уровня эндотоксина в плазме крови и выраженности антиэн-дотоксинового иммунитета у 122 женщин с БВ (основная группа) и 183 здоровых женщин из группы контроля в сыворотке крови были определены концентрации липополисахаридов, липополисахарид-связывающего белка (LBP) и титров IgG к соге-региону липополисахарида (IgG EndoCab) в плазме крови. Пациентки из основной группы по выраженности БВ были разделены на три подгруппы: 1-ю подгруппу составили 26 (21%) женщин с первой степенью дис-биоза; 2-ю - 10 (8%) пациенток со второй степенью; 86 (70%) с 3-й степенью дисбиоза влагалища - 3-ю подгруппу наблюдения. Для определения уровня ЛПС использовали тест-набор ENDOSAFE® ENDOCHROME™ («HyCult biotechnology», Голландия). Предел чувствительности метода - 0,01 EU/мл, диапазон измеряемых концентраций - от 0,01 до 10 EU/мл. Тест основан на способности липополисахарида вызывать коагуляцию белковых фракций гемолимфы амебоцитов краба Limulus polyphemus. Количественное определение человеческого LBP и IgG EndoCab-антител в плазме крови осуществляли имму-ноферментным методом при помощи наборов Hbt human LBP ELISA и Hbt EndoCab ELISA («HyCult biotechnology», Голландия).

Концентрации в плазме крови TNF-a, IL -lp, IL-2, IL-6, IL-8 и противовоспалительных цитокинов (IL- 4, IL - 10) определяли методом ИФА («Вектор-Бест», Россия), СРБ - при помощи набора hsCRP ELISA, («Biomerica», Австрия).

Для определения скрининговых параметров плазменного звена гемостаза (АЧТВ, ПВ, уровень фибриногена) использовали клоттинговый метод. Материалом служила свежая цитратная плазма, исследование проводили с помощью

коагулометра АСКа-2-01 фирмы «Астра» (Россия) с использованием тест-наборов фирмы «Технология Стандарт» (Россия). Определение маркеров дисфункции эндотелия (фактор Виллебранда, большой эндотелии-1, sPECAM-1, sVCAM-1) в плазме крови применялся ИФА-метод с использованием наборов: Technozym vWF Ag ELISA, производства «Technoclone» (Австрия); BIG ENDOTHELIN («Biomedica Gruppe», Австрия); «Bender MedSystems». При определении маркеров активации свертывания (РФМК, D-димер) применялся метод экспресс-оценки содержания в плазме крови РФМК - паракоагуляционный о-фенантролиновый тест (НПО «РЕНАМ», Россия); полуколичественный метод латекс-агглютинации с использованием стандартных тест-систем «Tulip Diad», (Индия) для D-димера. Для определения концентрации факторов антикоагу-лянтной системы (AT-III, протеин С) в плазме крови использовали количественный ИФА-набор Technozym Protein С ELISA, фирмы «Technoclone» (Австрия) и тест-систему Antithrombin ELISA (фирма Siemens, Германия). Иммуно-ферментные исследования проводились на ИФА-анализаторе «BioRad ¡Mark» (США).

Обработка данных осуществлялась с применением современных пакетов прикладных программ математико-статистического анализа (Реброва О.Ю., 2003). Характер распределения количественных признаков оценивался по критерию Колмогорова-Смирнова. Если показатель имел нормальное распределение, то применялись методы параметрической статистики (расчет средней арифметической и ее стандартной ошибки, критерия Стьюдента, коэффициента линейной корреляции Пирсона). Для показателей, не имеющих нормального распределения, вычислялась медиана и проводился ранговый анализ по методу Краскела-Уоллиса. Достоверность различий количественных показателей оценивалась по критерию Манна-Уитни, а относительных показателей - по %2-критерию Пирсона. С целью проверки гипотезы о влиянии степени дисбиоза влагалища на уровень эндотоксина (LAL) и иммунного ответа (LBP и антитела к соге-региону) нами был использован метод однофакторного дисперсионного анализа. Результаты анализа выражались через коэффициент силы влияния фактора г)2, показывающий долю (в %) вариации исследуемого признака под действием контролируемых факторов, и критерии достоверности влияния -критерий F, и его уровень значимости р. Влияние фактора менее 5% в расчет не принималось. Результаты дисперсионного анализа по Фишеру интерпретирова-

лись по значению г - коэффициента корреляции количественного признака с качественным или категориальным; в роли фактора выступали как количественные, так и качественные переменные. Результаты также представлялись в виде «отклика» переменной на действие фактора или сочетаний факторов -средник значений переменных (с указанием границ их вариации) при различных градациях фактора. Для сравнения отдельных средних значений использовался критерий Fd (Гареев Е.М., 2009).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Возраст пациенток основной группы составил в среднем 28,1±0,6 лет, женщин контрольной группы - 26,4±0,3 лет (р>0,05). Доля женщин с БВ в возрастной категории 20-29 лет достигала 64%, тогда как в возрасте 30-39 лет и 4049 лет - 25% (р<0,001) - 12% (р<0,0001), соответственно.

На обильные выделения из половых путей указывали 90% женщин основной группы, на зуд, жжение во влагалище и в области гениталий - каждая вторая пациентка. Женщины с бактериальным вагинозом чаще отмечали наличие «специфического» запаха влагалищного отделяемого (р<0,001). Положительный аминный тест имел место у 45 % женщин с БВ. При этом были выявлены статистически достоверные различия между показателями рН содержимого влагалища у женщин основной и контрольной групп (соответственно 5,67±0,04 и 3,89±0,03, р<0,001). Присутствие ключевых клеток было обнаружено в 85% влагалищных мазков основной группы и полностью отсутствовали у здоровых пациенток. Результаты бактериоскопического исследования мазков влагалищного отделяемого соответствовали 1-й степени дисбиоза (компенсация) в 21% случаев, 2-й степени дисбиоза (субкомпенсация) и 3-й степени (декомпенсация) - в 8 % и 71 % соответственно.

При бактериологическом исследовании вагинального секрета у женщин обеих сравниваемых групп было выявлено значимое повышение уровня микробной обсемененности влагалища в условиях дисбиоза до 11,2±1,32 lg КОЕ/мл против 8,23±0,74 lg КОЕ/мл в группе контроля (р<0,0001). В 64,5% посевов у пациенток с БВ регистрировалось наличие Lactobacillus spp. в средней концентрации 3,53±0,56 lg КОЕ/мл (в норме 7-8 lg КОЕ/мл). Между степенью дисбиоза и уровнем колонизации Lactobacillus spp. имелась обратная корреляционная связь (г=-0,6; р<0,01). В 100% случаев у женщин с БВ микроорганизмы

выявлялись в ассоциациях; среднее количество видов-ассоциантов составляло 2,75±0,08. Напротив, в условиях влагалищного нормоценоза в 69% случаев выделялись монокультуры бактерий при среднем количестве высеваемых штаммов условно-патогенных микроорганизмов 1,73±0,13 (р<0,001). Спектр микроорганизмов, выделенных при БВ, отличался большим разнообразием и включал в себя представителей семейства Streptococcaceae, бактерии рода Staphylococcus, Clostridium spp. В каждом третьем случае у женщин с дисбио-тическими нарушениями влагалищного микробиоценоза были выделены дрож-жеподобные грибы рода Candida

Степень обсемененности влагалища аэробными и факультативно-анаэробными грамотрицательными бактериями при дисбиозе в 2,5 раза превышала данные контрольной группы (р<0,0001).

Видовая идентификация микрофлоры во влагалище женщин с БВ показала превалирование Enterobacteriaceae (Е. coli, Е. agglomerans, Е. aerogenes, К. cryocrescens, Н. alvei, S. odorífera, К. ozaenae), которые были обнаружены в 38% случаев. У женщин с дисбиозом влагалища в 4,4% случаев выделены нефер-ментирующие грамотрицательные диплококки - Moraxella (Branhamella) catarrhalis и Stenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia (уровень обсемененности 6 и 2 lg КОЕ/мл соответственно), в то время, как у здоровых женщин флора в каждом пятом случае была представлена исключительно бактериями рода Escherichia (табл.1).

Таблица 1

Частота выделения и концентрация условно-патогенных грамотрицательных бактерий в вагинальном секрете женщин с бактериальным вагинозом и здоровых женщин

Вид микроорганизма Бактериальный вагиноз Нормоценоз

Частота выделения, % (абс. число случаев) Среднее содержание, lg КОЕ/мл (M±Se) Частота выделения, % (абс. число случаев) Среднее содержание, lg КОЕ/мл (M±Se)

Stenotrophomonas maltophilia 2,20 (1) 2,00 - -

Branhamella catarrhalis 2,20(1) 6,00 - -

Enterobacter agglomerans 2,20(1) 11,00 - -

Enterobacter aerogenes 2,20 (1) 9,00 - -

Вид микроорганизма Бактериальный вагиноз Нормоценоз

Частота выделения, % (абс. число случаев) Среднее содержание, lg КОЕ/мл (M±Se) Частота выделения, % (абс. число случаев) Среднее содержание, lg КОЕ/мл (M±Se)

Escherichia coli 22,00 (10) 6,10±0,80 23,30 (5) 2,60±1,10

Klebsiella ozaenae 2,20(1) 2,00 - -

Kluyvera cryocrescens 2,20(1) 4,00 - -

Hafnia alvei 4,40 (2) 7,90±0,60 - -

Serratia odorífera 2,20 (1) 11,00 - -

Итого 42,20 (19) - 23,30 (5) -

U. urealyticum методом ПЦР были выявлены у 6,6 % пациенток основной группы и у 7,6 % здоровых женщин, М. hominis - у каждой третьей женщины с БВ (31 %) и у 15 % пациенток с влагалищным нормоценозом. В 6,6 % образцов вагинального отделяемого при БВ одновременно обнаруживались М. hominis и U. urealyticum. В 67 % случаев при этом методом ИФА было выявлено превышение пороговых титров антиуреаплазменных IgG в 2-8 раз (в среднем в 4 раза). Среди пациенток основной группы, во влагалищном отделяемом которых присутствовали М. hominis, в 100% случаев отмечалось превышение концентрации антимикоплазменных IgG в среднем в 3,5 раза. У 6,6 % обследованных пациенток БВ развивался на фоне урогенитального хламидиоза.

Уровень ЛПС в образцах плазмы обеих исследуемых групп находился в пределах физиологической концентрации (норма 0-1 EU/ мл) и статистически значимо не различался, составив в среднем 0,43±0,03 EU/мл у здоровых женщин и 0,54±0,52 EU/мл у пациенток с БВ (р>0,05). Однако при этом выявлено статистически значимое (F=5,7, р<0,001), но относительно слабое (if=10%; г*=0,32) влияние на уровень ЛПС степени дисбиоза влагалища. Так, при третьей степени БВ средний уровень ЛПС (0,688±0,56 EU/ мл) оказался достоверно (р<0,001) выше, чем при первой и второй степенях (0,37±0,22 EU/ мл и 0,38±0,33 EU/ мл, соответственно) (рис.1). При дисбиозе третьей степени мера внутригрупповой случайной вариации уровня ЛПС (Sd) была статистически значимо выше (р<0,003), чем при первых двух степенях дисбиотического процесса. Критерий Краскела-Уоллиса подтвердил, что наблюдаемые тенденции

статистически значимы (Нк=8,1, р<0,05), равно как и различие третьей степени дисбиоза с первой и второй по критерию Манна-Уитни (11>200, р<0,03).

Рис. 1. Средние значения концентрации липополисахарида при различных степенях вагинального дисбиоза. По оси абсцисс - степень дисбиоза, по оси ординат - концентрация ЛПС в EU/мл, ГДИ - границы доверительных интервалов для средних значений, СО - стандартная ошибка средней.

Концентрации липополисахаридсвязывающего белка (LBP) в крови пациенток с БВ и здоровых женщин (33,4±1,9 мкг/мл и 36,5±1,2 мкг/мл; р>0,05) значимо не различались, но зависели от степени дисбиотических изменений во влагалищном биотопе. Влияние этого фактора достоверным, но слабым (г|2=7%, F=3.5 р<0,02). Тем не менее, средний уровень LBP при третьей степени бактериального вагиноза (23,3±16,5 мкг/мл) оказался значимо (р<0,02, Нк=7,3) ниже показателя при первых двух степенях (34,5±10,9 мкг/мл и 31,8±12,7 мкг/мл, соответственно), которые, в свою очередь, достоверно не различались (р>0,3).

Уровень LBP при третьей степени БВ достоверно (р<0,05) отличался от первых двух степеней дисбиоза влагалища, тенденции различия показателей по подгруппам 1 и 3 были статистически значимыми (Нк=7,3; р<0,05). Отмечалось некоторое снижение однородности пациенток (увеличение Sd) по уровню LBP при третьей степени дисбиоза.

При оценке уровня антител класса IgG к соге-региону липополисахарида -было констатировано их увеличение в 2,3 раза в плазме крови женщин с БВ по сравнению с контролем (0,78±0,39 MU/мл и 0,34±0,17 MU/мл; р=0,0015).

Уровень anti-core IgG зависел от степени БВ (if=32%, r*=0,56; F=22,6; р<0,0001): был выше при первой степени БВ (1,15±0,81 MU/мл) в сравнении со

второй (0,56±0,28 ми/мл) и третьей (0,45±0,27 Ми/мл) степенями; различия последних не были выраженными (р>0,3).

Рост уровня к соге-региону при первой степени дисбиоза влагалища ' сопровождался 3-4-кратным статистически значимым (р<0,001) ростом межиндивидуальной вариации (Нк=35,2; р<0,0001).

Для определения возможных корреляций уровня липополисахарида мы провели определение концентрации ряда цитокинов различной направленности.

Плазменная концентрация ТЫР-а в основной группе в 2 раза превышала уровень контроля. При вагинальном дисбиозе отмечалось статистически значимое повышение уровня 1Ь-2 (5,77±0,87 пг/мл у больных и 3,1 ±0,48 пг/мл у здоровых) и 11,-6 (0,88±0,1 пг/мл и 0,48±0,043 пг/мл, соответственно, р<0,001). В то же время концентрация 1Ь-10 почти вдвое превышала среднестатистическую норму в обеих группах. Установлена взаимосвязь между уровнями цитокинов различной направленности и степенью тяжести дисбиотического процесса, что проявлялось тенденцией к уменьшению концентрации ТОТ-а, 1Ь-1 р и по мере усугубления дисбиоза. Косвенным подтверждением этому были иные тенденции изменений уровня 1Ь-2 и 1Ь-6 (существенное повышение при БВ 2-й степени и некоторое снижение в дальнейшем). Уровень противовоспалительного 1Ь-4, напротив, имел тенденцию только к повышению, а 1Ь-10 изменялся мало.

Корреляционный анализ выявил наличие, в основном, небольшой сопряженности показателей уровня эндотоксина (ЬАЬ-тест), антиэндотоксинового иммунитета и цитокинов различной функциональной направленности у пациенток с БВ (табл. 2). Установлена статистически значимая слабая прямая корреляционная связь между уровнем эндотоксина и концентрацией ГЬ-2 и 1Ь-10 (р<0,05), а также обратная связь средней силы между уровнем ЬВР в крови и концентрацией 1Ь-4. Уровень ЬВР и содержание 1Ь-1р также имели слабую прямую корреляционную взаимозависимость, ЬВР и ТОТ- а - слабую обратную взаимосвязь. При повышении уровня антител класса к соге-региону ЛПС проявлялась статистически не очень отчетливая тенденция к снижению уровня 1Ь-4.

Таблица 2

Корреляция уровня липополисахарида и связывающих его белков с плазменной концентрацией различных цитокинов у женщин с БВ

Показатели: Связь с уровнем липополисахарида (ЬАЬ-тест) Связь с уровнем 1ВР Связь с уровнем anti-core IgG

TNF- а г = 0,138 Р = 0,153 г = -0,233 Р = 0,022* R = 0,187 P = 0,U6

IL-ip г = 0,139 Р = 0,153 г = 0,232 Р = 0,022* R = 0,187 P = 0,116

IL-2 г = 0,218 Р = 0,023* г = -0,406** Р < 0,001 r = 0,015 P = 0,899

IL-4 г = -0,001 Р = 0,986 г = 0,046 Р = 0,658 r = -0,227 P = 0,058

IL-6 г = 0,122 Р = 0,247 г = -0,007 Р = 0,944 r = 0,105 P = 0,423

IL-8 г = 0,170 Р = 0,078 г = -0,192 Р = 0,061 r =-0,137 P = 0,250

IL-10 г = 0,282 Р = 0,004* г = -0,108 Р = 0,305 r =-0,061 P = 0,616

Примечание: * - достоверная корреляционная связь любой степени, ** - достоверная корреляционная связь средней степени

Концентрация С-реактивного белка была статистически значимо выше у женщин с БВ в сравнении с контролем (р<0,0001). Средний уровень СРБ в плазме крови пациенток при 1-й степени дисбиоза составил 0,47±0,17 мг/л, при 2-й степени - 0,78±0,36 мг/л, при 3-й - 3,12±0,53 мг/л соответственно. Таким образом, заметна тенденция к возрастанию уровня СРБ по мере прогрессирования дисбиотического процесса (р<0,05).

У пациенток с БВ отмечена тенденция к удлинению АЧТВ (37,8±0,7 сек). В контрольной группе этот показатель составил 32,7±2,1 сек (референтные пределы 21-35 сек); отличия не были статистически значимыми (р>0,05). Показатель протромбинового времени (ПВ) у пациенток с БВ также имел тенденцию к возрастанию, составив 14,3±0,7 сек против 12,8±2,4 сек в контрольной группе (референтный интервал - 10-14 сек). Уровень фибриногена в плазме крови пациенток с БВ и здоровых женщин практически не различался, составив

2,70±0,06 г/л и 2,71±0,07 г/л соответственно (референтные пределы 2,0 - 4,0 г/л).

У женщин как с дисбиозом влагалища, так и с нормоценозом влагалищного биотопа результаты исследования РФМК в плазме крови были отрицательными (уровень РФМК не превышал физиологических значений 4,0 мг/л). Концентрация D-димера в обеих группах не превосходила 0,2 нг/мл, что также соответствовало его физиологическому уровню в крови.

Существенным явилось обнаружение (в 1,3 раза; р<0,001) увеличение концентрации протеина С в плазме крови женщин основной группы по сравнению с контролем, причем по мере усугубления дисбиоза влагалища прослеживается тенденция к нарастанию уровня протеина С в плазме крови.

В результате проведенных исследований выявлено, что активность AT III в плазме крови пациенток с БВ и здоровых женщин составила 98,6 и 94,5 % от уровня референтной пулированной плазмы соответственно (табл. 6). В целом антитромбиновая активность при БВ укладывалась в границы референтного коридора (75-125 %) и лишь слегка превышала уровень контроля, что можно связать с небольшим ускорением его синтеза ввиду слабого «раздражения» ткани печени циркулирующим эндотоксином, либо цитокинами. В ходе исследования проявлялась легкая тенденция к снижению активности AT III у пациенток по мере усугубления дисбиоза влагалища.

Для оценки степени раздражения или повреждения тромбоцитов у пациенток с БВ определялся уровень sPECAM-1 - эндотелиальной молекулы адгезии тромбоцитов (CD13). В ходе экспериментов нами было выявлено, что у женщин с дисбиозом влагалища и в контрольной группе концентрация sPECAM-1 сохранялась в референтных пределах (42,8 - 91,0 нг/мл). Однако отмечалось ее достоверное увеличение у пациенток с БВ III степени по сравнению со всеми остальными группами, что указывает на активацию клеток эндотелия с экспрессией CD 13 на их поверхности и, соответственно, на более высокую степень «готовности» к адгезии и агрегации тромбоцитов.

При оценке уровня плазменной концентрации эндотелина-1 у пациенток с БВ и здоровых женщин контрольной группы он не превышал предела физиологической нормы (1 пг/мл), но вместе с тем наблюдалась некоторая тенденция к повышению его уровня при БВ. Были установлены статистически значимые различия исследуемого показателя по мере прогрессирования дисбиотического

процесса: уровень эндотелина-1 был выше в 1,7 раза у женщин с 3-й степенью дисбиоза по сравнению со 2-й степенью тяжести дисбиотического процесса, и в 1,4 раза выше по сравнению с 1-й степенью БВ (р=0,03).

Обнаружена недостоверная тенденция к возрастанию не менее важного маркера дисфункции эндотелия - фактора Виллебранда у женщин с БВ (р>0,05). В зависимости от степени дисбиоза влагалища у пациенток статистически значимых различий уровня vWF выявлено не было, хотя его уровень несколько снижался при утяжелении БВ (р>0,05).

Определение уровня sVCAM-1 - сосудистой молекулы адгезии (CD 106) выявило, что у пациенток с дисбиозом влагалища не выходил за референтные пределы (675-1693 нг/мл), но прослеживается его рост по мере утяжеления бактериального вагиноза: при I степени - на 19 %, при II степени - на 28,2 %, при III степени - на 39,6 %, причем у 16 % пациенток показатель превысил референтный предел. Различия между контрольной группой и группами пациенток с бактериальным вагинозом были статистически значимыми (р=0,021, р=0,05 и р=0,037 соответственно). Полученные данные свидетельствовали о значимой активации лейкоцитарного звена при вагинальном дисбиозе.

ВЫВОДЫ

1. У женщин в возрастной категории 20-29 лет бактериальный вагиноз диагностируется в 65% случаев, что в три раза превышает показатели в возрасте 30-39 лет и в пять раз - в возрастной категории 40-49 лет. При этом бактериальный вагиноз характеризуется повышением общей микробной микробной обсе-мененности до 11,2±1,32 lg КОЕ/мл (в контроле - 8,23±0,74 lg КОЕ/мл) на фоне снижения количества Lactobacillus spp. до 3,53±0,56 lg КОЕ/мл (в контроле -6,67±0,46 lg КОЕ/мл). Преобладающую часть микрофлоры (61,2 - 82,3%) составляют аэробные и факультативно-анаэробные грамотрицательные бактерии; в 100% случаев обнаруживаются ассоциации микроорганизмов со средним количеством видов-ассоциантов 2,75±0,08.

2. Среди представителей влагалищной грамотрицательной микрофлоры при бактериальном вагинозе превалируют бактерии семейства Enterobacteriaceae (38% случаев). Дисбиоз различной степени тяжести не сопровождается значимыми изменениями уровня липополисахарида грамотрицательных бактерий в плазме крови пациенток, но наблюдается тенденция к нарастанию концентра-

ции эндотоксина при прогрессировании дисбиотического процесса во влагалище.

3. Вагинальный дисбиоз сопровождается активацией неспецифического иммунитета и сдвигами цитокинового баланса с существенным повышением уровня провоспалительных цитокинов (1Ь-2, 1Ь-6, ТОТ-а) в плазме крови пациенток. Следствием цитокиновой стимуляции является выраженный рост плазменной концентрации главного острофазового реактанта - С-реактивного белка, уровень которого четко коррелирует с выраженностью вагинального дисбиоза. В то же время специфический иммунный ответ организма на начальных этапах бактериального вагиноза проявляется умеренным повышением концентрации липополисахарид-связывающего белка и нарастания титров антител к соге-региону липополисахарида с последующим их снижением при утяжелении дисбиоза.

4. У женщин с дисбиозом влагалища отмечается умеренно выраженная тенденция к гипокоагуляции, проявляющаяся незначительным удлинением активированного частичного тромбопластинового времени и протромбинового времени на фоне неизменного уровня фибриногена и отсутствия маркеров активации свертывания крови (растворимые фибрин-мономерные комплексы, Б-димер). Реакция антикоагулянтного звена заключается в тенденции к увеличению плазменной антитромбиновой активности и статистически значимому возрастанию уровня протеина С.

5. В условиях бактериального вагиноза отмечается вовлеченность клеток сосудистого эндотелия в патогенетический процесс, проявляющаяся относительным ростом уровня молекул адгезии зРЕСАМ-1 и бУСАМ-1 в плазме крови пациенток и неотчетливыми фазными изменениями уровня маркеров эндотели-альной дисфункции (эндотелии-1, фактор Виллебранда).

6. Поступление липополисахарида грамотрицательных микробов в организм при бактериальном вагинозе, в целом, не вызывает выраженного иммунопато-генного эффекта, не выходит за рамки физиологической системной эндотокси-немии и может служить фактором поддержания иммунного гомеостаза организма. Реакцию иммунной системы и системы гемостаза в ответ на поступление липополисахарида при вагинальном дисбиозе можно расценить как адаптивную, но способную при наличии отягчающих факторов перерасти в патологическую.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для повышения информативности лабораторных исследований при бактериальном вагинозе необходимо учитывать наиболее показательные количественные изменения микрофлоры при дифференцировании дисбиотических состояний вагинального микробиоценоза по степени тяжести.

2. Для выявления специфических вариантов дисбиоза влагалища, ассоциированных с M.hominis и U.urealyticum, необходимо определение уровней соответствующих видоспецифических IgG и учет в качестве диагностически значимого признака лишь их выявления у женщин с дисбиозом влагалища 3 степени (декомпенсированного).

3. При декомпенсированных вариантах дисбиоза влагалища для оценки степени вовлеченности иммунной системы и системы гемостаза рекомендуется дополнительное определение концентрации липополисахарида, уровня ли-пополисахарид-связывающего белка, антител к соге-региону ЛПС в плазме крови, а также мониторинг показателей плазменного и эндотелиального звеньев системы гемостаза для адекватного реагирования на выявленные изменения посредством проведения дезинтоксикации и соответствующей иммунокоррекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1 Бондаренко, K.P. Социально-гигиеническая и эпидемиологическая характеристика женщин с бактериальным вагинозом / K.P. Бондаренко, Ю.Р. Гай-сина // Актуальные вопросы инфекционной патологии в клинической практике: сборник научных трудов, посвященный 70-летию кафедры инфекционных болезней. - Уфа, 2006. - С. 126-128.

2 Гайсина, Ю.Р. Бактериальный вагиноз и течение беременности, ее исходы, послеродовый период / Ю.Р. Гайсина, K.P. Бондаренко, JI.H. Гараева, С.Г. Хасанова, Г.Ф. Хасанова, А.Р. Мавзютов // Мать и дитя: материалы первого регионального научного форума. - Казань, 2007. - С. 30-31.

3 Бондаренко, K.P. Клинико-лабораторные особенности бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста / K.P. Бондаренко, Л.Н. Гараева, Ю.Р. Гайсина, С.Г. Хасанова, Г.Ф. Хасанова, А.О. Акбашева, А.Р. Мавзютов // Мать и дитя: материалы первого регионального научного форума. - Казань, 2007.-С. 204-205.

4 Аглямова, Д.Р. Акушерские и перинатальные осложнения у беременных, страдающих бактериальным вагинозом / Д.Р. Аглямова, K.P. Бондаренко, Ю.Р. Гайсина, А.Р. Мавзютов // Мать и дитя: материалы девятого всероссийского научного форума. - М., 2007. - С. 7-8.

5 Гайсина, Ю.Р. Концентрация липополисахаридсвязывающего белка и некоторые параметры гемостаза при бактериальном вагинозе / Ю.Р. Гайсина, Д.Р. Аглямова, А.Ж. Гильманов, А.Р. Мавзютов // Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - № 9. - С. 25.

6 Гайсина, Ю.Р. Уровень липополисахарид-связывающего белка и некоторые особенности системы гемостаза при бактериальном вагинозе / Ю.Р. Гайсина, K.P. Бондаренко, А.Н. Еникеев, А.З. Муллагалина, А.Ж. Гильманов, А.Р. Мавзютов // Проблемы репродукции: материалы четвертого международного конгресса по репродуктивной медицине. - М., 2010. - С. 173.

7 Хамадьянов, У.Р. Анализ особенностей течения беременности и послеродового периода у женщин с высоким инфекционным риском / У.Р. Хамадьянов, А.Р. Мавзютов, А.Н. Еникеев, Ю.Р. Гайсина, K.P. Бондаренко // Проблемы репродукции: материалы четвертого международного конгресса по репродуктивной медицине. - М., 2010. - С. 133.

8 Бондаренко, K.P. Оценка эффективности применения сорбента «Энте-росгель» в лечении бактериального вагиноза / K.P. Бондаренко, А.Н. Еникеев, Ю.Р. Гайсина, А.З. Муллагалина, А.Р. Мавзютов // Проблемы репродукции: материалы четвертого международного конгресса по репродуктивной медицине. — М., 2010.-С. 171-172.

9 Бондаренко, K.P. Противомикробный антиэндотоксиновый иммунитет у женщин при бактериальном вагинозе / K.P. Бондаренко, А.Н. Еникеев, Ю.Р. Гайсина, А.Р. Мавзютов // Материалы Второго ежегодного всероссийского конгресса по инфекционным болезням. - М., 2010. - С. 44.

10 Бондаренко, K.P. ПС-ассоциированные иммунопатогенетические особенности урогенитального хламидиоза / K.P. Бондаренко, А.Н. Еникеев, Ю.Р. Гайсина, А.Р. Мавзютов // Клиническая лабораторная диагностика. -2010.- №9. -С. 33-34.

11 Бондаренко, K.P. Некоторые иммунопатогенетические особенности бактериального вагиноза в период беременности / K.P. Бондаренко, А.Н. Еникеев,

Ю.Р. Гайсина, P.M. Муллагулова, А.Р. Мавзютов // Мать и дитя: материалы четвертого регионального научного форума. - Екатеринбург, 2010. - С. 43-44.

12 Ахмадуллина, Ю.А. Параметры гемограммы при бактериальном вагинозе у женщин репродуктивного возраста / Ю.А. Ахмадуллина, Ю.Р. Гайсина, K.P. Бондаренко, А.Ж. Гильманов, А.Р. Мавзютов // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - № 10. - С. 19.

13 Гайсина, Ю.Р. Взаимосвязи параметров гемостаза и клинических проявлений бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста / Ю.Р. Гайсина, K.P. Бондаренко, А.Н. Еникеев, Ю.А. Ахмадуллина, А.Ж. Гильманов, А.Р. Мавзютов // Клиническая лабораторная диагностика. -2010.-№ 10.-С. 20.

14 Гайсина, Ю.Р. Эндотоксинемия и влияние микробных липополиса-харидов на систему гемостаза у женщин с бактериальным вагинозом / Ю.Р. Гайсина, Ю.А. Ахмадуллина, А.Ж. Гильманов, А.Р. Мавзютов // Медицинский вестник Башкортостана. — 2011. - Т. 6, № 3. - С. 155-158.

15 Гайсина, Ю.Р. Об исследовании сывороточных иммуноглобулинов у женщин репродуктивного возраста при дисбиозе влагалища / Ю.Р. Гайсина, K.P. Бондаренко, Ю.А. Ахмадуллина, А.Ж. Гильманов, А.Р. Мавзютов // Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. - № 10. - С. 6.

16 Ахмадуллина, Ю.А. Адгезивные молекулы, эндотелии и фактор Виллеб-ранда как показатели реакции эндотелия на эндотоксическое воздействие при бактериальном вагинозе / Ю.А. Ахмадуллина, Ю.Р. Гайсина, Г.А. Идрисова, А.Р. Мавзютов, А.Ж. Гильманов // Современная лаборатория№4. Медицинский алфавит - 2011. - № 22. - С. 22-23.

17 Ахмадуллина, Ю.А. Маркеры эндотоксинемии и эндотелиальной дисфункции у женщин с бактериальным вагинозом / Ю.А. Ахмадуллина, Ю.Р. Гайсина, А.Р. Мавзютов, А.Ж. Гильманов // Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований: материалы Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной диагностике. - Омск, 2011. - С. 36-40.

18 Бондаренко, K.P. Иммунопатогенетические эффекты липополисахари-дов грамотрицательных бактерий при бактериальном вагинозе / K.P. Бондаренко, Ю.Р. Гайсина, Ю.А. Ахмадуллина, A.A. Мавзютова, А.Р. Мавзютов // Мать и

дитя: материалы V регионального научного форума. - Геленджик, 2011. - С. 185186.

19 Ahmadullina, Yu. Hemostasis and CBC shifts caused by entotoxicosis at vaginal dysbiosis / Yu. Ahmadullina, Yu. Gaisina, K. Bondarenko, A. Mavzjutov, A. Gilmanov // 21 International congress of clinical chemistry and laboratory medicine. -Berlin, 2011.-P.- S605.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ В АВТОРЕФЕРАТЕ:

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время ПВ - протромбиновое время AT III - антитромбин III

РФМК - растворимые фибрин-мономерные комплексы БВ - бактериальный вагиноз ИФА - иммуноферментный анализ ЛПС - липополисахарид

EndoCAb - endotoxin-core antibody / антитела к соге-региону липополисаха-рида

IgG — immunoglobulin G /иммуноглобулины класса G LBP — lipopolysaccharide binding protein /липополисахарид-связывающий белок

vWF - von Willebrand factor / фактор Виллебранда

ГАЙСИНА ЮЛИЯ РАМИЛЕВНА

ОСОБЕННОСТИ МИКРОБНОГО ПЕЙЗАЖА, ЭНДОТОКСИНЕМИИ И ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЕМОСТАЗА У ЖЕНЩИН С БАКТЕРИАЛЬНЫМ

ВАГИНОЗОМ

03.02.03 - Микробиология 03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 12.03.2013 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Заказ 912. Гарнитура «Т1те5№\у11отап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 2 п.л. Уфа, Карла Маркса 12, корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Гайсина, Юлия Рамилевна, Челябинск

«о °

О

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ГБОУ ВНО «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

Гайсина Юлия Рамилевна

ОСОБЕННОСТИ МИКРОБНОГО ПЕЙЗАЖА, ЭНДОТОКСИНЕМИИ И ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЕМОСТАЗА У ЖЕНЩИН С БАКТЕРИАЛЬНЫМ ВАГИНОЗОМ

03.02.03 - микробиология 03.01.04 - биохимия

О

со см

со со

Ю Диссертация

с\]

^ на соискание ученой степени

лі кандидата медицинских наук

* х О

Научные руководители: д.м.н., профессор, Мавзютов А.Р. д.м.н., профессор, Гильманов А. Ж. Уфа - 2013

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

AT III - антитромбин III

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

БВ - бактериальный вагиноз

ИФА - иммуноферментный анализ

JIAJI - лизат амебоцитов Limulus

ПВ - протромбиновое время

ЛПС - липополисахарид

ПЦР - полимеразно-цепная реакция

РФМК - растворимые фибрин-мономерные комплексы

ЭТ - эндотоксин

BPI - бактерицидный белок гранул нейтрофилов, повышающий проницаемость бактерий (bactericidal/permeability-increasing protein)

EndoCAb - антитела к соге-региону липополисахарида (endotoxin-core antibody)

IgG - иммуноглобулин класса G IL - интерлейкин

LBP - липополисахарид-связывающий белок (lipopolysaccharide binding protein)

PrC - протеин С

TNF-a - фактор некроза опухолей a СРБ - С-реактивный белок vWF - фактор Виллебранда

N ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................12

1.1. Этиология и патогенез дисбиотического нарушения микробиоценоза влагалища у женщин репродуктивного возраста...............................12

1.2. Липополисахариды грамотрицательных бактерий, их физиологические эффекты и роль в патогенезе бактериального вагиноза........................17

1.3. Влияние микробных эндотоксинов на систему гемостаза................24

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...................31

2.1. Обследованный контингент.....................................................31

2.2. Бактериоскопический метод.....................................................32

2.3. Культуральный метод............................................................33

2.4. Молекулярно-биологический метод (ПЦР)..................................34

2.5. Определение уровня антител к возбудителям уреаплазменной и мико-плазменной инфекций методом ИФА..............................................34

2.6. ЛАЛ-тест - определение концентрации липополисахаридов в плазме крови.................................................................................................35

2.7. Определение концентрации человеческого ЬВР (липополисахаридсвя-зывающего белка), ^ й к соге-региону липополисахарида, цитокинового профиля, С-реактивного белка в плазме крови методом ИФА...............35

2.8. Определение скрининговых параметров гемостаза (АЧТВ, ПВ, уровень фибриногена), маркеров дисфункции эндотелия (фактор Виллебранда, эндотелии-1, бРЕСАМ-1, бУСАМ-1), активации свертывания (РФМК, Б-димер) и антикоагулянтной системы (АТ-ІІІ, протеин С)......................37

2.9. Методы статистической обработки............................................40

ГЛАВА 3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................42

3.1 Состояние вагинальной микрофлоры у женщин репродуктивного возраста .......................................................................................42

3.2 Эндотоксинемия, выраженность антиэндотоксинового иммунитета и острофазного ответа у женщин с дисбиозом влагалища........................52

3.3 Состояние гемостаза и маркеры дисфункции эндотелия при эндотокси-

немии, ассоциированной с БВ......................................................65

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................76

ВЫВОДЫ.................................................................................85

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.............................................87

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................88

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Актуальность проблемы дисбиотического нарушения микробиоценоза влагалища определяется рядом факторов. Это, прежде всего, связано с широкой распространенностью данной патологии в акушерской и гинекологической практике, а также влиянием на репродуктивное здоровье. Частота заболевания зависит от исследуемой популяции, характера применяемых методов диагностики, трактовки клинических проявлений данного заболевания. По некоторым данным, выделения, характеризующие бактериальный вагиноз, встречаются примерно у 10 млн. женщин в развитых странах [8,151]. По данным других авторов, частота заболевания у женщин репродуктивного возраста составляет 19,2% в общей популяции, у 86,6% с патологическими белями и у 64% пациенток, проживающих в районах с постоянным воздействием малых доз радиации [1,33]. Частота бактериального вагиноза у беременных составляет в среднем 14-20%, а в группах повышенного риска она возрастает до 30-38% [12,61,189]. Научно-практический интерес к данной проблеме также обусловлен наличием патогенетической связи БВ с некоторыми формами патологии в гинекологической и акушерской практике. В частности, изменение микробиоты влагалища у хирургических больных в гинекологических стационарах наблюдается в 45-86% случаев и является основой послеоперационных инфекционных осложнений. Не исключается, что в механизме развития ранних послеоперационных осложнений лежат расстройства микроциркуляции, связанные чаще всего с нарушением в системе гемостаза. С одной стороны, эти осложнения проявляются в виде нарушения функции органов, с другой - в виде геморрагического синдрома; повышенной кровоточивости тканей, кровотечения из мест инъекций, длительного поступления геморрагического отделяемого по дренажам из брюшной полости, кровотечения из желудочно-кишечного тракта. Также наблюдаются кровоточивость тканей во время операции, гипертермия, тошнота, рвота, длительный выход из пост-

наркозной депрессии [2,39,99,111,141]. БВ рассматривается как пусковой механизм гнойно-септических осложнений в акушерстве и гинекологии. Клиническое значение бактериального вагиноза у беременных подтверждается фактом возникновения таких осложнений как гестозы, преэклам-псия, эклампсия, преждевременное прерывание беременности, нарушение маточно-плацентарного кровообращения. Также повышена вероятность рождения детей с клиническими признаками дистресс-синдрома и болезнью гиалиновых мембран, гипотрофией [3,21,71,73,106]. Имеются данные о влиянии БВ на предимплантационную и имплантационную стадию эмбрионального развития, и, как следствие, возникновением замерших беременностей и самопроизвольных выкидышей [128].

Поскольку одним из факторов патогенности грамотрицательных бактерий является липополисахарид (ЛПС), можно также предположить определенную роль микробных эндотоксинов в развитии указанных выше осложнений. В настоящее время роль эндотоксинов при БВ преимущественно связывают с их локальными эффектами в нижних отделах женской репродуктивной системы [168]. Тем не менее, предположительные изменения гомеостаза при БВ еще очень мало изучены, а имеющиеся сведения не систематизированы, разрозненны и не имеют интегрированного обобщения. В попытке найти взаимосвязь между деятельностью определенных систем организма и БВ мы исследовали некоторые аспекты эндотоксине-мии и ассоциированных с ней сдвигов в системе гемостаза.

Цель исследования: Определить особенности микробного пейзажа влагалища, выраженность эндотоксинемии и ассоциированных с ней сдвигов гемостаза у женщин с вагинальным дисбиозом.

Задачи исследования

1. Оценить встречаемость бактериального вагиноза и состояние вагинальной микрофлоры у женщин репродуктивного возраста.

2. Изучить уровень эндотоксинемии, выраженность острофазового ответа и антиэндотоксинового иммунитета у женщин с дисбиозом влагалища.

3. Определить состояние системы гемостаза, антикоагулянтной системы и параметров дисфункции эндотелия в связи с особенностями ваги-ноза и эндотоксинемии у женщин репродуктивного возраста.

4. Обозначить патогенетическое значение обнаруженных сдвигов, определить необходимость и направление подходов к их коррекции.

Научная новизна исследования

Выявлено, что влагалищная микробиота женщин с бактериальным вагинозом характеризуется значительным повышением общей микробной обсемененности на фоне существенного уменьшения концентрации Lactobacillus spp. с превалированием аэробных и факультативно-анаэробных грамотрицательных бактерий. Определена этиологическая роль при развитии бактериального вагиноза представителей семейства Mycoplasmataceae, в частности М. hominis и U. urealyticum.

У женщин, страдающих бактериальным вагинозом, выявлены особенности системной эндотоксинемии, заключающиеся в умеренном повышении уровня липополисахарида грамотрицательных микробов в плазме крови пациенток. Показано, что вагинальный дисбиоз сопровождается активацией неспецифического иммунитета и сдвигами цитокинового баланса с существенным повышением уровня пповоспалительных питокинов (1L-2.

J - J Г Ж~ v /

IL-6, TNF-a) в плазме крови пациенток. Следствием цитокиновой стимуляции является выраженный рост плазменной концентрации главного острофазового реактанта - С-реактивного белка, уровень которого четко коррелирует с выраженностью вагинального дисбиоза.

Особенностями специфического иммунного ответа организма являются существенное увеличение выработки антител к соге-региону ЛПС и тенденция к активации синтеза липополисахарид-связывающего белка -LBP на начальных этапах бактериального вагиноза с их снижением при

утяжелении дисбиоза. Определены клинико-лабораторные параллели между различными степенями дисбиоза влагалища, концентрацией липополи-сахарида в плазме крови и показателями антиэндотоксиновых защитных механизмов макроорганизма.

Впервые проведенная оценка состояния эндотелия и звеньев системы гемостаза в условиях системной эндотоксинемии при БВ показала развитие слабых гипокоагуляционных сдвигов (незначительное удлинение АЧТВ и ПВ, неизменность уровня фибриногена, Э-димера и РФМК), а также тенденцию к активации антикоагулянтного звена с увеличением уровня плазменного антитромбина и протеина С, коррелирующим с выраженностью дисбиоза. Умеренно выраженная реакция эндотелиальной системы проявлялась тенденцией к нарастанию уровня эндотелина, адгезивных молекул зРЕСАМ-1 и бУСАМ-1 и снижению концентрации фактора Виллебранда при утяжелении дисбиотического процесса. В целом отклик системы гемостаза носил адаптивный характер и свидетельствовал о ком-пенсированности эндотоксинового воздействия, вместе с тем допуская возможность выхода из-под контроля при продолжающейся эндотоксиче-ской агрессии и развития осложнений вплоть до ДВС крови.

Научно-практическая значимость работы

Определены подходы к оценке значимости выявления этиологического фактора при вагинозах у женщин репродуктивного возраста, диагностическая значимость выявления циркулирующих эндотоксинов и компонентов антиэндотоксиновой защиты, а также сдвигов параметров гемостаза. На основании обнаруженных изменений сформулированы подходы к выявлению и коррекции сдвигов гемостаза и эндотелиальной дисфункции на фоне эндотоксинемии при бактериальном вагинозе, предполагающие контроль состояния гемостаза при декомпенсации БВ и, при необходимости, принятие коррегирующих мер.

Положения, выносимые на защиту:

1. Бактериальный вагиноз обнаружен в 65% случаев - в возрастной категории 20-29 лет. Видовой и количественный состав влагалищной микрофлоры при БВ характеризуется повышением общей микробной обсеме-ненности на фоне снижения количества Lactobacillus spp. и преобладания аэробных и факультативно-анаэробных грамотрицательных бактерий; в 100% случаев наблюдаются ассоциации микроорганизмов. Грамотрица-тельная микрофлора при БВ в основном представлена бактериями семейства Enterobacteriaceae.

2. БВ различной степени тяжести не сопровождается значимыми изменениями уровня ЛПС грамотрицательных бактерий в плазме крови. При прогрессировании БВ наблюдается тенденция к нарастанию концентрации эндотоксина.

3. БВ сопровождается активацией неспецифического иммунитета с повышением уровня провоспалительных цитокинов (IL-2, IL-6, TNF-a) и повышением плазменной концентрации С-реактивного белка, уровень которого четко коррелирует с выраженностью вагинального дисбиоза. Специфический иммунный ответ организма на начальных этапах БВ проявляется умеренным повышением концентрации ЛПС-связывающего белка и нарастанием титров антител к соге-региону ЛПС с последующим их снижением при утяжелении дисбиоза.

4. При БВ отмечается умеренно выраженная тенденция к гипокоагуля-ции - незначительное удлинение АЧТВ и ПВ на фоне неизменного уровня фибриногена и отсутствия маркеров активации свертывания крови (РФМК, D-димер). Реакция антикоагулянтного звена заключается в тенденции к увеличению плазменной антитромбиновой активности и возрастанию уровня протеина С.

5. В условиях БВ отмечается вовлеченность клеток сосудистого эндотелия в антиэндотоксиновые реакции с относительным ростом уровня мо-

лекул адгезии 8РЕСАМ-1 и бУСАМ-1 и фазными изменениями уровня маркеров эндотелиальной дисфункции (эндотелии-1, фактор Виллебранда). Поступление ЛПС грамотрицательных бактерий в организм при БВ в целом не вызывает иммунопатогенного эффекта, не выходит за рамки «физиологической системной эндотоксинемии» и может служить фактором поддержания иммунного гомеостаза организма. Реакцию иммунной системы и системы гемостаза в ответ на поступление ЛПС при вагинальном дисбиозе можно расценить как адаптивную, но способную при наличии отягчающих факторов перерасти в патологическую.

Апробация

По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 6 - в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации. Материалы диссертации представлены на международных, всероссийских, региональных научно-практических конференциях (IV международный конгресс «Проблемы репродукции» (Москва, 2010); II ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2010); IV региональный научный форум «Мать и дитя» (Екатеринбург, 2010); IX Всероссийский научный форум «Мать и дитя» (Москва, 2007); I региональный научный форум «Мать и дитя» (Казань, 2007); 21 конгресс Международной федерации клинической химии и лабораторной медицины (Берлин, 2011), совместном заседании сотрудников кафедр лабораторной диагностики ИПО, фундаментальной и прикладной микробиологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Внедрение результатов исследования в практику

Методы, использованные в диссертационном исследовании, внедрены в работу женской консультации и гинекологического отделения МУ «Городская клиническая больница № 21» города Уфы, а также в учебный процесс кафедры лабораторной диагностики ИПО ГБОУ ВПО «Башкирский Государственный Медицинский Университет» Министерства Здравоохранения Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 109 страницах компьютерного текста, содержит 16 таблиц, 18 рисунков, включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждения, заключение, выводы, практические рекомендации и список использованной литературы, включающий 98 отечественных и 103 зарубежных авторов.

Вклад автора

Эксперименты и обобщение результатов исследований представленных в диссертации выполнены автором лично. Часть исследований была проведена с участием сотрудников ООО «Исследовательский центр «Лаборатория», г. Уфа (директор В.Р. Мавзютов) и бактериологической лаборатории Городской клинической больницы № 21 г. Уфы (зав. лабораторией С.Г. Хасанова).

Конкурсная поддержка работы

Работа выполнена при поддержке федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия 1.2.1. Государственный контракт № П385 от 30 июля 2009 г.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Этиология и патогенез дисбиотического нарушения микробиоценоза влагалища у женщин репродуктивного возраста

Вагинальная микрофлора, представляющая собой динамичную микроэкосистему, играет чрезвычайно важную роль в поддержании здоровья женщин [19,49,76]. В норме во влагалище существуют достаточно надежные механизмы защиты от инвазии патогенных возбудителей. В первую очередь, это микробиоценоз влагалища (сложившаяся совокупность микроорганизмов влагалищной среды и их взаимодействия). Колонизационную резистентность генитального тракта обеспечивает ряд механизмов, поддерживающих постоянство количественного и видового состава нормальной микрофлоры: кислая среда, конкуренция на уровне пищевых субстанций и др. Тем самым предотвращается заселение влагалища патогенными микроорганизмами или чрезмерное размножение условно-патогенных микроорганизмов, входящих в состав нормального микроценоза, и распространение их за пределы своих экологических ниш [79]. Проведенные исследования свидетельствуют �