Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности метаболизма энергетических компонентов у зимующей молоди карпа и роль адаптивных механизмов в ее выживаемости

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности метаболизма энергетических компонентов у зимующей молоди карпа и роль адаптивных механизмов в ее выживаемости"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ

АКАДЕМИЯ НАУК УССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.В.ПАЛЛАДИНА

На правах рукописи

ЕИДЕНКО Алла Александровна

ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ У ЗИМУЮЩЕЙ МОЛОДИ КАРПА И РОЛЬ АДАПТИВНЫХ МЕХАНИЗМОВ В ЕЕ ВЫЖИВАЕМОСТИ

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КИЕВ - 1930

Работа, выполнена в Черниговском государственном педагогическом институте имени Т.Г.Шевченко

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор ЯВОНЕНКО Ак.Ф.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор КУРСКИЙ И.Д, . доктор биологических наук, старш.научн.сотр.СОЛОЫАТИНА В.Д.

Ведущая организация¡Киевский государственный университе* им.Т.Г.Шевченко

Защита состоится "(5°" агга^У&Ъу. в 14.30 на заседают специализированного совета К 016.07.01 в Института биохимии ш.А.В.Палладина АН УССр /252030 Киев-30, ул. Леонтовича, 9/. •

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии им.А.В.Палладина АН УССР

Автореферат разослан " -/"/чо.яЧдц 1990г.

Ученый секретарь я? <

специализированного совета О.В.Кнрсе

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность тобшт. Одним из направлений интенсификации прудового рыбоводства является получение достаточного количества качественного рыбопосадочного материала. Нормативный выход молоди карпа из зшовкн составляет 80-85$ в рыбоводческих хозяйствах зоны укоренного климата европейской ■части СССР.Однако в производственных условиях он ниже: в отдельных случаях достигает только 20% /Козлов,1980/. Первоначально было показано, что выгизаемость сеголеток во многом определяется уровней их упитанности в начале голодания /Себенцов и соавт.,1940;Поляков,1954/, в частности, содержанием общего протеина, лира, влага /Щербина,1976/.По данным веществам установлены количественные показатели химического состава тела сеголеток в осенний период /Карзинкин,1952; 1!1ухина,1973;Каназв,1976/. Однако общие показатели-упитанности рыб часто не отображают объективного состояния зшлуэдей тлолодп и приводят к ошибочным результатам при прогнозировании зимовки. В более поздних исследованиях', причиной гибели рыб, кро:.:з неблагоприятных условий зимовки и истощения рыб в результате голодания, предложено считать нарушение гокеостага внутренней среда организма под воздействием кнзкпх темпэра1ур /Остроумова я соавт. ,1979/.Выдвинуто предположение, что.физиологическую подготовленность рыб к зимовке определяет группа вещестз, наиболее метаболически активных в ■ этот период, обеспечивающих достаточный для поддержания гоме-остаза уровень обмена, способствующей внкизае?,гости рыб. Предполагается, что одним из зозмсетцх биохимических отклонений, Ензизаюзих данные нарушения и ведущих к 'гибели рыб, тагу? 5нть ПЕКЭнения ^осфолипидного состава кекбрзн клеток различ-гых органов /Сидоров и соавт.,1935;Лизенко и соавт.,1985/.Принято считать, что под воздействигм голодания во зрекя зимовки г тканях колода карпа происходят функцзональныо парусензя,пришлой которых такяа является комплекс абиотических и биотичес-сих факторов, среди которых первостепенным следует считать ювиестное воздействие на организм неблагоприятных условий и гедостаточность энергообеспеченности обменных процессов при дефиците запасного эндогенного материала.Однако в доступной нагл Еитвратуре, гш не обнаружили сведений о нарушениях обмена в ор-•анпзглэ зимующих сеголеток карпа. Кроме того невыяснены моле-

кулярные принципы адаптации к неблагоприятным условиям зимнего голодания, не установлены возможные компенсаторные механизмы сохранения энергетического гомеостаза, как важнейшего условия для поддержания жизненных функций организма рыб в этот период.

Пелъ и задачи ксслепованщ.Работа посвящена изучению особенностей обмена отдел^щсс веществ и энергии у зимующей молода карпа и исследованию адаптивных механизмов энергетического гомеостаза организма рыб.

Объект исследования - основной представитель прошаленных Прудовых рыб - карп (Cyprinuo carpió l.).

В число основных задач работы входило:

- 'изучение содержания запасных энергетических компонентов /липидов,белков и углеводов/ в тканях ыолода.щша в процессе зимовки и возможность образования глюкозы с помощьэ реакций глюконеогенеза;

- установление уровней активности лактатдегвдрогеЕазы,сук-вднатдегядрогеназы.мадатдвгидрог-еназы и содержания субстратов этих реакций /лакгата, пнрувата, шлата, оксалоацетата/;

- изучение дяяашки содержания глакроэргаческпх соединений в тканях молода рыб з течение зк овки;

- исследование некоторых адаптнзных механизмов поддараанш энергетического гомеостаза в организмэ карла. в период ег„-.:эв::::.

раучнзя нотазра работа. Впервые установлена зависимость ыазду содер2ание?а свободных адснокпслот в нплцах молода карпа и' показателем выхода рыб из зимовка /% выхода/; предложен ковы: критерий возможности прогнозирования протекания зимовки карпа ■ количество свободных аминокислот в иысечной ткани сеголеток осенью. Найдены различия в механизмах энергообеспечения в тканях мозга, печена и белых шлщ молода карпа в процесса и по выходу рыб из зимовка. Показано адаптивное сохранение энергетического гомеостаза у зимующей молоди карпа. Установлены особенности взаимопревращения 2-оксоглутарат-глута-»1ат в митохондриях мозга исследуемых организмов,направленные на детоксикацнз избыточного аммиака в данный период.

На основании.полученных данных выдвинуто предположение о ведущей роли фактора энергообеспечения организма,рыб в дх выдпва-емос?и.

Практическая ценность работы.Результаты настоящей работы мо-

гут быть попользованы для оценки выживаемости зимующей молодя карпа з прогнозирования течения ее зимовка. Предложен критерий, определяющий физиолого-биохимическую подготовленность входящих на зкмовку сеголеток.Полученные в естественных условиях результаты являются основанием для выяснения причин ги~ V. 'ли прудовых рыб и могут служить предпоссылкой по оптимизации проведения зимовки молоди карпа.

Анпобация работы. Основные положения доложены на:

1. Всесоюзном бнохпдяческом съезде /Киев, 1986/.

2. 7-м Украинском биохимическом съезде /Ивано-Франковск, 1987/.

3. 1-м Всесоюзном симпозиуме но экологической биохимии рыб /Ярославль, 1987/.

4. Всесоюзном совещании "Экологическая энергетика животных" /Суздаль, 1553/.

5. У11 Всесоюзной конференции "Экологическая физиология и биохимия рыб "/Ярославль, 1939/.

Публнкалтт. По материалам диссертации опубликовано

12 работ.

Структура и объем паботн.Диссертация состоит из введения, сбзора литературы /1 глаза/, экспериментальной части /4 главы/,заключения и выводов. Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков, 15 таблиц, 261 литературный источник, в том числе 117 иностранных.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В работе использовали особей карпа (сургииз сагрзо х.) зозрастом до года, массой 20-60г. Ежемесячно или тризды /в начале , сэреданз и по окончанию зимовки/ отбирали по 20-30 экземпляров из зимовального пруда К2 Черниговского рыбопитомника.В апреле были выделены две группы-рыб: к первой /сильные/ отнесены активные, подвижные особи, быстро реагирущие на внешнее раздражение. Ко второй группе /слабые/ - неактивные, вялые,мало-подвияные особи с замедленной реакцией на раздражение /Сидоров п соавт.,1985; Лизенко и соавт.,1985/.Изучение изменений содержания эндогенных питательных субстратов проводили следующими методами:содержание свободных аминокислот определяли методой бумажной хроматографии /Пасхина,1964¡Починок,1976/; содержание белка и его фракций - методом Кьельдаля после фракционирования /Яковенко и соавт.,1982/; содержание суммарных лили-

дов определяли с использованием стандартных наборов реактивов фирмы Chemapol /ЧССР/; содержание гликогена - по Зафтеру фотометрически;.! методом по интенсивности цветной реакции гидроли-зованного гликогена с о-толуидпновым реактивом /Асатиани, 1957/; глюкозу - такке с помощью о-толуидинового реактива; кетоновые тела методом, описанном в работе /Баев,1973/в некоторой модификации. Определение лактата, малата, оксалоацетата, пирувата осуществляли ферментативным! методами /éergaeyer » 19Ô3;Прохорова и соавт.,1982/в безбелковом тканевом экстракте,' который готовили /Eergaeyei*, 1963; Faupol ,1972/на &% хлорной кислоте, при охлаждении жидким азотом.Кроне того оксалоацетат и пируват определяли методом тонкослойной хроматографии на si-lufol UV -254 /ЧССР/ по Ляснях /1381/. Для определения изменений содержания аденилатов при приготовлении безбелкового экстракта использовали 8% хлорную кислоту и далее -по методике Ks— лярегской и соавт./1985/.При исследовании состояния экергоге-нерирующей системы в тканях рыб были изучены уровни некоторых ферментативных активностей:зденилаткиназкая - по методике Окунцова /1988/;сукцинатдегидрогеназнач - по Прохоровой и coaî /1982/;.малатдегидрогеназная покип et.а1./1963/;лактатдогидро-геназная по schwer et.al. /1963/;3-оксибутиратдегидрогеназная - по Brady /1986/; глюкозо-6-фосфатазщш - по Львовой /1985/; фруктозо-1,6-дифссфатазная - по Орехович и соазт./1964/.

Для определения уровня активности ыктохондркальшх .ферментов проводили выделение митохондрий методом дифференциального центрифугирования /schacfcaan ,1959/ в модификации /Ар-сан, 1980;Cassj ,1982/,с дополнительной очисткой в градиенте плотности сахарозы 0,32-1,2М /Арутюнян,1978/. Чистоту митохон-дриальной фракции контролировали с помощью электронного микроскопа /Уикли,1975/.

С целью изучения особенностей взаимопревращения 2-оксо-глутарат-глутачат в митохондриях мозга молоди рыб уровень соответствующих ферментативных активностей определяли по известным методам: naep-глутаматдегидрогеназу - спектрофотомет-рически по oison,Anfinaon /1952/ в"некоторой модификации: 2-оксоглутаратдегидрогеназу - спектрофотометрически по Зиничу/Г спектрофотометричесш ферментативным методом было также определено содержание 2-оксоглутарата /èergmeyer ,1963/. Кроме

. а*

того глутамкнсинте тазу - фосфатным методом по Евстигнеевой и соавт./1980/;глутачиназу - по Магарламову и соавт./1979/;аммиак - по ЗеНнаоа вЬ .а1.Д95з/; глутамин - по Силаковой и соавт./1962/;глутамат - бумажной хроматографией по Пасхиной /1964/. Содержание белка определяли методом Лоуря/1951/.Статистическую обработку результатов осуществляли по Ойвину/1960/.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВММ 1.Динамика содержания резервных энергетических компонентов тканей молот каопа в процессе зимовки.

При исследовании зимнего голодания рыб возникает вопрос о соотношении снижения интенсивности метаболизма с одной стороны и поддержания достаточного уровня энергетического гоме-эстаза для жизнедеятельности - с другой. Причем формы аккумуляции энергии у животных по Щульману /1972/ определяют несколькими путями, важнейшим из которых является уровень резервных жиров,углеводов и белков.

В результате наших исследований установлено, что во всех ¡зучаемых тканях рыб в период зимовки происходит интенсивное расходование общих лшгидов. Это,вероятно,объясняется тем,что апасы энергии в теле рыб аккумулируются в форме нейтральных яров - триацилглицеринов /шгега, 1964; Шатуновский, 1967/, ко-орне составляют до 755? всей массы резервного жира рыбЛдпко, 964/.В начальный период зимовки более быстро расходуются япиды печени/за 4 месяца уменьшение в 2,5раза/,т.к.печень основное место окисления и синтеза лиггадоз /Романенко, 1578; ¡21сгз!га, 1982/.В течение всего процесса' зимнего голодания шбольшие потери общих ли'лидов наблюдаются в белой г.^ускула-фэ /87$/.Это вероятно связано с преобладающим содержанием мышечной ткани триацилглицеринов,которые относительно быст-г обмениваются при мобилизации и ресинтезе жировых резервов 1псе11а, 1966/.При изучении содержания общих лнпидов в тка-х двух групп рыб в апреле /после окончания зимовкл/псказа-,чю различий в количественных пох'лзателях исследуемого па-метра в белых мыпцах, печени и мозге слабых и сильных осой карпа не обнаруживается. -Такт.! образом можно сделать виги что при эндогенном питании в условиях зимнего голодания ровые запасы необходимы и их накопление осуществляется к зни, достигая наибольших величин /в мышцах - 6,06*1,18$; в

печени --18,49*3,63$;в мозге - 26,62-4,62%/.В течение зимовш происходит интенсивное использование общих липидов,, но в вопросе выживаемости содержание общих липидов в тканях молоди карпа не играет, по-видимому, решающей роли.

Для органов рыб,в особенности'мышечной ткани, не характерно высокое содержание глюкозы.и гликогена- /тагг,1958;Ана-ничев,1961/. Мы не наблюдали накопление глюкозы и гликогена в тканях молоди карпа в.осенний период. Если жировые запасы ( переходом рыб на эндогенное питание к середине зимовки интенсивно расходовались и их уровень резко снижался во всех иссле дуемых тканях, то содержание и гликогена, и глюкозы к февраля наоборот увеличивалось /для .глюкозы в мышцах до 35,6^7,3; в печени до 132,6±11,7;в мозге до 31,5±2,6 иг%/.Полученные результат); можно объяснить,исходя из исследований необратимых реакций глюконеогенеза. Так, увеличение активности цитоплазме тических Г-6-Зазь; и £-1,6Д<Эазы, характеризующих уровень глюке неогенеза в целом, в печени зимующей молоди рыб,свидетельствз ет об активизации этого процесса к середине зимовки /февраль/ Созданные в январе-феврале запасы гликогена в тканях карпа весной дают возможность организму получать глюкозу обычным щ тем /посредством гликогеколиза/, не расходуя так нужные в весенний период макроэргические соединения в процессе глюконеогенеза. Это отражается на уровнях активности Г-6-Фазы и Ф-1,6-ДФазы.В апреле они значительно меньше,чем зимой, что также ве дет к уменьшению содержания глюкозы и гликогена во всех иссле дуемых тканях в апреле по сравнению с февралем. Величина гликогена в мозге в апреле,равная 156,0±19,5:.тг$, превышающая ocei • ний показатель, доказывает невозможность значительных накопле ний этого углевода перед зимовкой и об обязательном минимальном их количестве, особенно,в печени и мозге.Когда же этого f происходит, что мы видим сравнивая данные ' двух групп рыб пс окончанию зимовки,возможна их гибель из-за недостатка энергетических субстратов.

Известно,что другими важнейшими энергетическими субстратен для малоподвижных рыб являются' свободные аминокислоты и белок /Сгэас»й966;Шульман,1972/.В связи с этим была изучена динамика содержания белка и свободных аминокислот в мышечной ткани сеголеток в .условиях зимовки.В результате исследований

установлено,что с октября по январь в. мышечной ткани сеголеток количество свободных аминокислот уменьшается в 6 раз;при этом степень расходования серина,глицина,аланина.гистидкяа, лейцина и изолейцина в 3-6 раз больше,чем других аминокислот. Расходования общих белков за этот период не происходит.Однако обнаружены уменьшения количества белков,растворимых в воде и Ъ% растворе хлорида натрия;-количество нерастворимых белков возрастает.В феврале после истощения запаса свободных аминокислот энергетическая мобилизация белков мышц'увеличивается. Содержание общего белгса в феврале ниже'в 2 раза,чем в декабре; отдельных фракций белка тоне меньше в 2 раза,но по сравнению с октябрем.Количество свободных аминокислот при этом увеличиваете. Объяснением зтого монет служить активизация лкзо-сомалъных.протеаз /Сгеас'Ь,1965,1969;Сидоров,1937/.Таким образом в процессе зимнего голодания молоди карпа исключительно важное значение в энергетическом метаболизме,по-видимому, играют свободные аминокислоты и белки мышечной ткани.Перс:о являются энергетическим субстратом на начальных стадиях голодания, вторые - эндогенными ресурсами питания организма во второй половине физиологического ритма голодания.Это позволяет считать высокий уровень свободных аминокислот до голодания одним из определяющих факторов'успешной зимовки,что подтверждается результатами исследований изучаемых показателей у двух групп рыб.Годовики первой группы /сильные/ отличаются от второй /слабые/ более высоким содержанием как суммы свободных аминокислот,так и уровнем каждой из них,особенно это относится к глицину,аланину,серину,аспарагиновой кислоте,лизину,концентрация которых у слабых годовиков в 2,5 раза ниже,чем у зильных. Аналогичные изменения наблюдаются и в содержании 5елков.Например,их концентрация в нерастворимой фракции мы- -печной ткани слабых годовиков в 7,5 раза ниже,чем у сильных. Таким образом,слабые,гибнущие в результате зимовки карпы отдаются от хорошо перенесших зкмовку прежде всего содержанием наиболее важных аминокислот и нерастворимых белков.Опыты, проведенные на протяжение трех лет,показа®? ,что выход годови-' сов карпа из зимовки коррелирует с относительным содержанием 5 их мышцах свободных аминокислот.Установлено,что в 1984 году цо зимовки молодь рыб характеризовалась содэрианпеы около 15

мкмоль аминокислот на 1г сухой ткани мышц и ее гибель после зимовки была наиболее значительной - 68?. Б другие годы- после дуемый показатель составлял 50,16 /1985/ и 30,20мкмодь на 1г сухой ткани мышц/1985/.Соответственно выход молоди в эти годы составил 85$ и Ъ2%.Установленный уровень /около 15мкмолъ на 1г ткани/, согласно проведенным исследованиям, по-вишмот-ту, можно считать критически.!.

2.Состояние энергогекерирутотей систем в тканях мололи рыб в период и по окончанию зимовки.

Общеизвестно,что зимовка рыб представляет собой не пассивный процесс,в котором замедлены или отсутствуют обменные реакции, как у многих зимоспящих млекопитающих,а адаптивно метаболически активный период жизни экзотермных животных,при котором они переходят на эндогенное питание.Однако голодание можно рассматривать не только как переход на.экономное эндогенное .питание организма,но и как состояние длительного стрес са,связанное с изменением, активности многих ферментов.Процесс окислительного фосфорилирования, снабжающий клетку макроэрги-ческими фосфорными соединениями зависит от функционального состояния гликолиза и трикарбонового цикла,о котором можно судить как по активности отдельных ферментов,так и по изменению концентрации самих метаболитов. Так,количественное исследование оксалоацетата,малата,пирувата и лактата показало,что в осенний.период не происходит накопления исследуемых метаболитов в белой мускулатуре,печени и мозге сеголеток карпа.В октябре наименьшее содержание вышеперечисленных метаболитов среди изучетшх тканей.наблюдается в белых мышцах /для оксалоацетата 0,15±0,01;для лактата 0,18±0,03 мкмоль на 1г ткани: для пирувата 3,36*0,18;для. малата 1,65±0,05 мкмоль на ЮОг ткани/;наибольшее - в пеЧени.В феврале,когда температура вода снизилась имеет место достоверное уменьшение уровня оксало-ацетата в мышцах,пирувата и малата в мышцах и печени.В то же время содержаний лактата увеличилось,т.е.в тканях возможно происходит активирование гликолитическнх процессов.Это подтверждается как снижением окислительной способности клеток мышц и печени,рассчитанной по соотношению свободных мл15-пар; так и возрастанием лактатдегидрогеназной активности,особенно в печени зимующих рыб.Для ферментов трикарбонового цикла су-

;естзует тканевая специфичность в изменении митохондриальной активности в течение зимовки молоди карпа.Если,для белой мус-улатурн характерно наибольшее значение СДГ-азной активности I осенний период и уменьшение ее с поншгеннем температуры во-;ы,то для печени и мозга зафиксированы противоположные тенден-ш,т.е.возрастание исследуемой активности в 3 и з 6 раз со-тветственно. ЗДГ-азная активность в этот период в митохонд-иях печени снизилась в 2 раза,в белой мускулатуре - з 2,5 аза,а в той яе фракции мозга наблюдается незначительное ее величение..Таким образом в период зимнего голодания на ио-одь карпа оказывают атаяние два важнейших фактора: голодание температура. Известно,что активность ферментов,связанных с шгом Кребса и переносом электронов значительно возрастает зи акюшмацш к холоду рыб/Лав, 1976; зЬакхеа, 1977;Хочачка, Э88/ и снижается при голодании,особенно в мышцах /Сорвачев, 382;ТГЦауагаеЬалгап, 1985/. Поэтому адаптивный ответ пойкило-;рмного организма на каадый из них монет быть противополоз-гм.что мн и наблюдаем в данном исследовании. По мере повшпе-1Я температуры воды и ■ окончания периода зимовки в митохонд-[ях исследуемых тканях происходит увеличение ферментативной :тивности. Наиболее высокий уровень МДГ-азной и СДГ-азной :тивности в этот период имеет место в митохондриях мозга ,91-0,33 мкмоль НАШ на мг белка за ш.;6,22^0,44шм.пъ сук-ната на мг белка за мин./.Сравнивая данные по МДГ-азной ахс-вности цитоплазмы и митохондрий,на протяжении всей зимовки, гшо заметить,что отношение активности митохондриальной к топлазматической в мозге больше единицы, в других тканях -ныне единицы.Как уже отмечалось раннее,после зимнего голо-гая рыб.последние были разделень' на две группы:первая/силь-з/,вторая/слабые/. Анализ мышечной ткани,печени и мозга ос ркб показал,что у молоди карпа второй группы еодеркакке эувата,лактата,оксалоацетата меньше,а малата значительно гьше.чем у первой.При этом уровень калатдегидрогеназкой ак-шости обеих фракций в исследуемых тканях первой группы рыб тболее отличается от второй', что отражается на содеркании '»стратов,которые окончательно истощается,ингибируя гкткв-:ть энергогекерирущкх реакций /Островский,1984/.В резуль-■е этого возникает .энергодефицит и возмояна гибель рыб.

Известно,что :шзнедеятельность пойкклотермннх организмов зависит от энергообеспеченности важнейших органов рыб,т.е.от уровня макроэргических соединений и в первую очередь от количества АТР,а также от соотношения аденкловых куклеотидов.В процессе всего периода зимовки /ноябрь-апрель/в белой мускулатуре, печени и мозге карпа происходят значительные изменена в содержании аденозинфосфатов. Наиболее резкое уменьшение уровней АТР.АДР в исслеДуемых органа:« отмечается за первые два месяца зимовки.Количество AMP в тканях в октябре наименьшее,к февралю оно увеличивается в мышцах доф0^0,02;в печени до 0,26¿0,01;b мозге до 0,20±0,01 мкмоль. на 1г ткани.Затем практически не меняется в белой мускулатуре и в мозге до okoi чания зимовки,достоверно возрастая в печени.В апреле после анализа тканей двух групп рыб было установлено,что у слабы?: особей содержите исследуемых аденкловых нукяеотадов.их сумма значительно меньше,чем у сильных.Например,в печени количество А.ТР в 6 раз,а в мозге в 4 раза больше у сильных oco6ei Что касается соотношения АТР/АДР,то у второй группы рыб оно изменяется в пользу АДР как в печени,так и в мозге. Характерно, что во всех изучаемых тканях АЗЗ/аденилатный энергетический заряд/ почти не изменяется у двух групп рыб в апреле,хотг в середине зимовки ыояно наблюдать его снижение во всех иссл« дуемых тканях.Проведенные расчеты показывает возрастание со-дсрлжня AMP в белой мускулатуре ровно вполовину уменьшения количества АДР, что дает возможность предположить,что допол-готельный ресинтез АТР происходит с помощью миокиназной реакции, БКралепной следующим уравнением: АДР+АДР-»- АТР+АМР. Что касаатся меньшего содержания АТР в это время, то объяснением "слунгг использование данного макроэрга для поддержания гизне-дектелыюсш риб» В -гкани мозга-молода карпа протекают аналогичные процоссн.Дяя печени резкое снижение количества АДР и особенно АТР за первый период голодания объясняется очевидно важностью данного органа душ поддержания гомеостаза внутренней среда организма, требукгцего повышенных энергетических затрат,в таких процессах как глвконоогенез и пентозофосфатюи шунт,а1:тивизируюц2хся Б эимний период /Ньюсхолм,1977¡Щербина, 1978 Дочачка,1988/.Еще одним доказательством наиего предположения служат изменения отношений действующих масс аденилат-клназной реакции.Данный показатель возрастает к январю во

:ех исследуемых тканях. К апрелю продолжает увеличиваться в ¡лой мускулатуре и в гепатопаккреасе,в мозге сохраняется в ¡х же пределах.Косвенным доказательством может служить до-1лыю высокий уровень АЭЗ в апреле,который можно объяснить [Р-дезамипазным механизмом / bouengct oír Д972/,согласно потому снижение аденилатного энергетического заряда яомпенсяру-ся дезаминированием А1ЛР и KM?. По выходе рыб из зимовки наедается повышение количества АТР и АДР в белой мускулатуре в печени сильных особей карпа по отношению к январю.Можно едположить адаптивные перестройки обмена веществ я энергии б к эндогенному питанию,при котором интенсивно используют- _ свободные.аминокислота и белки мышечной ткани.Происходит кяе рост уровней активности ферментов ЦТК,увеличение содер-ния некоторых метаболитов,как например маяата во всех тка-к в первой группе рыб по сравнению со второй.

3.Адаптивные изменения Функционирования (Ферментативной системн энергетического обмена.

Поддержание энергетического гомеостаза обеспечивается н-з гько стационарной работой цикла трикарбонозых кислот.Извест-и другие механизма выработки энергии в клетке,служащие для ¡спеяения достаточного уровня лабильности и являпциеся спе-шческой метаболической адаптацией,одной из которых есть жиназный ресинтез АТР.С целью доказательства существования жиназного пути ресинтеза АТР в тканях рыб,з марте был про-(ен опыт на молоди карпа,выдерживаемой в естественных усло-з водоема.Были установлены изменения содержания адениловых леотидов в белых мышцах,печеня и мозге годовиков карпа при кцкоккровании и ингибировании аденклаткиназы.Так.уменьше-содернакия АДР в 'исследуемых тканях соответствует и не-лько больше,чем возрастание суммы АТР+АМР.Последние можно яснить высокой активностью АМР-дезаминизы в тканях рыб в т период /bowengstein,1972/.Осуществление ресинтеза АТР ько миокиназным путем невозможно,так как произойдет сниже-обшего содержания аденилатов,что приведет к нарушению нионарностп оптимального уровня затрат энергии.Известно, поддержание энергетического баланса организма служит осой процесса адаптации /Хаскин,1975/. Для выживаемости рыб в эвиях заднего голодания с целью обеспечения их энергией и тествления процессов дыхания и гликолиза необходимы допол-

нительные источники энергии,одним из них могут быть кетоновг тела.

ИзЕестно,что у рыб система катаболизма жирных кислот щ способлена для их интенсивного использования в качестве эне] гетического субстрата:при адаптации,продолжительном плаванш голодании у рыб не наблюдается значительного накопления кете новых тел в крови,как это происходит в аналогичных ситуация; у млекопитающих /восЪасЪка, 1962/.Наше исследование отразило изменения в содержании кетоновых тел в тканях молоди карпа I протяжении всей зимовки.Установлено,что наиболее низкий уровень кетоновых тел и наиболее высокий уровень 3-оксибутират-дегидрогеназной активности /8,06*1,02 нмоль КАЕ*на 1мг белкг 1мин./в октябре наблюдается в белой мускулатуре,что подтвер? дает первоочередность расходования общих липидов в мышечной ткани. В опытах,проведенных в середине зимовки /февраль/ обнаружено резкое увеличение содержания 3-оксибутирата в мышцг ацетоацетат в печени,обоих веществ - в мозге. Причиной э: го может быть снижение уровня ОБДГ-азной активности,вероятне связанной со значительным израсходованием в этот период резервных жиров,а также с возможностью, существования у зимуют рыб,как и у млекопитающих животных, механизма образования к< тоновых тел по схеме: 2адетилСоА -«- ацетоацетилСоА—ацетоац( тат 3-оксибутират. Уменьшение содержания оксалоацетата /з мышцах до 0,08*0,02 мкмоль на 1г ткани/ в процессе зимовки, начиная с февраля,по-видимому,способствует к переориентации ацетилСоА из цикла трикарбоновых кислот на синтез кетоновых тел по вышеприведенной схеме. Кроме того исследование двух групп рыб в апреле,показавшее пониженное содержание оксалоацетата в печени и глюкозы в мозге у слабой молоди карпа по сравнению с сильными может служтгь доказательством наличия вышеописанного компенсаторного механизма образования кетоновых тел в качестве добавочного энергетического субстрата.Бо-лее высокая ОБДГ-азная активность в периферических тканях второй группы рыб подтверждает данный вывод. Концентрация к< тоновых тел представляет собой баланс между образованием их в печени и утилизацией в периферических тканях/Аникеева,198' Это равновесие наблюдается в данном случае;в печени на прот. нении зимовки уровень З-оксибутиратдегидрогеназной активное

ти практически не менялся /октябрь 1,74-0,19;февраль 2,20^0,43; апрель: сильные 1,80^0,88;слабые 1,81-0,38 нмолыио'1' на 1мг белка за 1юш/.Зто монет свидетельствовать об отсутствии утилизации кетоновых тел в печени п расходовании их в мозге и мшнцах.Накопление этих веществ в периферических тканях второй группы рыб, вызывает интоксикации организма,нарушение буферного гомеостаза я служит одной из возможных причин гибели зимующей молоди рыб.

Еще одним высокотоксичным веществом,которое может вызвать отравление рыб в условиях энергодефицита является аммиак, т. к.установлено, чтб он -.конечный продукт обмена азотсодер-щих веществ в организме карповых рыб,а не мочевина /сгеас'Ь е^ а1-1963,1966,1967/.Кроме того как было сказано выше в условиях зимнего голодания возрастает доля свободных аминокислот и белков в качестве источника энергии для организма рыб,а также происходит интенсификация дезамияировавия небелковых азотистых субстратов /сгеас'11 1966;каГГ1а 1990/.В наших исследованиях в феврале наблюдается достоверное /на 4,75 мкмоль/уве-личение содержания глутамина в мозге молоди рыб,что коррелирует со значительным возрастанием в этот период активности глутаминсинтетазы,достигающей 9,30^0,67 мкмоль Р^ на 1мг белка за 1мян..являющейся одним из основных ферментов детокслка-ции аммиака у рыб /сгаас'Ь1974/.Однако накопление аммиака /231,33^20,96 мкмоль на 100г ткали/к середине зимовки может свидетельствовать о недостаточной эффективности его связывания в нетоксичный глутачин в глутакянсинтетазной реакции из-за возникновения у зимующей молоди карпа энергодефицитного состояния.В таких условиях возможно включение других механизмов детоксикации аммиака. Одним из них является восстанови-гельноо ампнированпе 2-оксоглутаровой кислоты с образованием глутамиковой.Известно,что равновесие ГДГ-азной реакции сдвп-*уто обычно в сторону синтеза глутамата /кгеЬз, 1969/.Поэтому, эбнаруненное нами наибольшее количество 2-оксоглутарата в гозге рыб в сентябре /1,95^0,23мкмоль на 100г ткаяи/подтверя-(ает потенциальную возможность участия ыАЕ?-глутаматдегидро-'еназы в детоксикации аммиака.Происходящий при этом отток вал-гейше го промежуточного продукта цикла Кребса - 2-оксоглутара-'а не влияет на работу ЦТК.т.к. реакции.отвлекающие промежу-

точные продукты из лимонного цикла к реакщш,восполняющие их убыль при нормальных условиях находятся в состоянии динамического равнозе сия.Концентрация 2-оксоглутарата в митохондриях мозга исследованных рыб на протяжении первых 4-х4месяцев зимовки изменялась недостоверно /р<0,1/.Однако к конпу зимовки при изучении двух групп рыб,га установили резкое уменьшение 22 раза/в содержании 2-оксоглутарата в мозге сильных рыб по сравнении с сентябрем. Кроме того,содержание глутамина и уровень глутаминсинтетазной активности с февраля по апрель снизился, особенно у рыб второй группы.Из этого" следует,что концентрация аммиака,образующегося в это время за счет утилизацга аминокислот должна возрасти.Однако этого не произошло,количес во аммиака наоборот снизилось /у сильных особей до 78,40^6,35 у слабых до 143,08±9,37мкмоль на 100г ткани/.Это позволяет предположить возможность связывания аммиака вне глутаминскнте-тазного пути,т.е. в пае?-глутамлтдегидрогеказной реакции,активность которой у слабых особей больше,чем у сильных,что при вело к возрастанию глутамата до 23,70^1,ЭЭмкыоль на 100г ткан в мозге слабых рыб. Таким образом следует предположить возмож ность оттока 2-оксоглутарата из пула субстратов ЦТК в штохон дрнях мозга молоди карпа весной,по выходе их из зшовки.Невоз можность компенсаторного восполнения промежуточных метаболитов из-за недостаточности питательных субстратов и дефицита энергии может вызвать нарушение процессов' выведения аммония и вероятно,является одной из причин гибели' рыб.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Б результате настоящей работы установлена важная роль углеводов,липидов,особенно,белка и свободных аминокислот в эндогенном питании сеголеток в условиях зимнего голодания.Рас смотрены возможности выбора цикла для рециркуляции глюкозы > лактата между мышцами и печенью,которые зависят от состояния редокс-системы,а также вопросы энергообеспеченности белой мускулатуры,печени и,особенно,мозга в связи с направленность! взаимопревращения 2-оксоглутарат-глутамат в митохондриях меток этого органа.

Провзденше исследования служат доказательством предположения о существовании адаптивных перестроек обмена веществ в энергии,направленных на выживаемость молоди карпа в услови-

Pnc.il. Общая схема особенностей метаболизма энергетических компонентов у зимующей

молоди карпа.

-ях зимнего голодания. Обобщение полученных результатов, позв ляет предложить общую схему, отобращакэдую особенности метаб лизма у' зимующей молоди карпа и направленность адаптивных м ханизмов, которые заключаются в следующем:' обеспечение субс ратами тканей рыб в зимний период для успешного протекания реакций глюконеогенеза; образование кетоновых тел в качеств дополнительного источника .энергии для периферических тканей возможность детоксикации аммиака в мозге посредством 2-оксо глутарата и миокиназный путь ресинтеза АТР. Решением этих з дач может быть применение в искусственных кормах витаминов групп В, микроэлементов, увеличение доли протеина и развита естественной кормовой базы для накопления биохимически важных для сеголеток карпа свободных аминокислот, белков и ста билизации энергетического обмена. ...

ВЫВОДЫ

1. При изучении использования возможных энергетических компонентов'/жиров, углеводов, белков, свободных аминокислот/ в процессе эндогенного питания зимующей молоди карпа показано преимущественное значение свободных аминокислот Обнаружена зависимость между их уровнем в мышцах сеголеток осенний период и-выживаемостью рыб по окончанию зимовки /% выхода рыб - рыбоводный показатель зимовки/.

2. Установленное преобладание содержания„свободных аминокислот, оксалоацетата, малата, пирувата, аденилатов, отношения действующих масс аденилаткиназной реакции, величи ны фосфатного потенциала, уровня сукцинат- и малатдегидроге назной активности в печени, белой мускулатуре и мозге сильных особей /1 группа/ над слабыми /2 группа/ в апреле, по . окончанию зимовки, доказывает наличие, адаптивных механизмов сохранения энергетического гомеостаза у зимующей молоди кар па. Оно заключается в следующем: а/ усиленный синтез глюкозы путем глюконеогенеза и кетоновых тел в качестве энергети ческих субстратов для тканей рыб, в первую очередь мозга; б/ протекание аденилаткиназной реакции ресинтеза АТР; в/ де токсикация избыточного аммиака в реакции 2-оксоглутарат-глу тамат в мозге рыб.

3. Найдены различия в механизмах энергообеспечения

зга, печени и белых мышц рыб в условиях зимовки, заключаете ся в усилении гликолитическнх процессов в мчшцах и печек середине зимовки. Об этом свидетельствует увеличение со-онания лактата и возрастание уровня активности лактатде£нд-геназы. Для мозга характерно увеличение сукцикатдегцдрогв-зной, малатдегидрогеназной активности на протяжении всей тавки. В этот период в тканях молоди карпа наблюдается ио-генке уровня концентрации восстановительных эквивалентов, ) ведет к снижению окислительной способности клеток.

4. Предложен новый критерий отбора рыб на зимовку - опыление количества свободных аминокислот з шгцах в осенний гпод, исходя 'лз того, что 15 мкмоль на 1 г сухой ткакп яэ-!тся критической концентрацией. Поэтс:лу в пернод подготовки юда карпа к земовяо при разработке кормовых смесей нуяно .тнвать необходимость повышения уровня свободных амикокис-в их организме. •

Список основных работ по теме диссертации: Яковенко Б.В., Грубинко З.В., Ниденко A.A., Явоненко А.Ф. Сезонная динамика глицина в водоемах и мышечной ткапп карпа // Гидробпол.яурн.- 1985.- ÄS438-85 Деп. - 11 с. Яконенко Б.В., Грубинко В.В., Третяк А.П., .Ниденко A.A., Явоненко А.Ф. Исследование ферментов дезаминпрования глицина в мышечной тканп карпа чешуйчатого // 7 Всесоюз.био-хим.съезд: Тез.стенд.сообз. М.:Наука,1986.-?Т.З.-С.291-292. Зидснко A.A., Явоненко А.Ф., Грубинко В.В. Роль свободных аминокислот в вкяиваемости молоди карпа в условиях зимовки /,/ У Укр.биохим.съезд: Тез.докл., Ивано-Франковск,сент. 1987г.- Киез:1987.- Ч.1.- С.56-57 /на укр.языке/. Яковенко Б.В., Жидеяко A.A., Явоненко А.Ф. Влияние температуры па содержание глицина в отдельных органах карпа Ч Там жа 4.2.- С.324-325 /на укр.языке/. 1воненко А.Ф., Яковенко Б.В., Грубинко В.В., Жиденко A.A. Ферментативная адаптация азотистого обмена карпа к голоданию // Первый Всес.симп.по экол.биох.рыб:Тез.докл., Ярославль,окт.1387г.-Ярославль:Акад.наук СССР,1987.-С. :24-226.

[воненко А. 5., Яковенко Б.В., Грубинко В.В., Жиденко A.A. 'лутаминсинтетазная и глутаминазная активность е организ-

мо молоди карпа при выходе из зимовки //Рыб.хоз-во.-19£ . -Вып.42.- С.45-49.

7. Грубинко З.В., Еиденко A.A.,' Явоненко А.Ф. Конкурентные взаимоотношения клв? -глутаматдегидрогеназы и ес-кетоглэ ратдегидрогеназы в митохондриях мозга зимующей молоди i па //Экол.знерг.кив.:Тез.докл.Всесоаз.Совещ..Суздаль,33 -3 нояб. 1988г.- Пущийо:Акад.наук СССР.- С.54-55.

8. Явоненко А.Ф., Яковенко Б.В., Грубинко В.В., Еиденко А. Особенности функционирования ферментативных путей обра: ванкя энергии у карповых рыб в условиях зимовки //Там : С.214-216.

9. Еиденко A.A., Грубинко В.В., Явоненко А.Ф. Особенности таболизма-кетоновых тел у зимующей молоди карпа //Зкол ческая физиол.и биох.рыб: Тез.докл. У11 Всесоюз.кокф., лавль, май 1989г.- Ярославль:Акад.наук СССР,1989.-Т.1. 137-138.

10. Явоненко А.Ф., Яковенко Б.В., Грубинко В.В., Еиденко Зависимость выживаемости молоди карпа в условиях зимое от содержания свободных аминокислот и белков в мышечке ни рыб // Рыб.хоз—во.— 1989.- Вып.43,- С.24-29.

11. Еиденко A.A., Яковенко Б.В., Явоненко А.Ф. Состояние г гогенеркруюцей системы в тканях у зимующей молоди Kapi //Гидробиол.журн.-1990.~ &61-В 90 Деп.- 26 с.

12. Жиденно A.A., Грубинко В.В.. Явоненко А.Ф. Роль кетош тел в энергообеспечении пойкилотермных организмов в yi виях зимнего голодания //Укр.биохим.курн.-1990,-62,К 72-76.

IfJXc^e^