Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности гаплопродукции разных генотипов пшеницы в культуре пыльников

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Особенности гаплопродукции разных генотипов пшеницы в культуре пыльников"

Р (Б СЕЛЕЩЮНН0-ГЕН5ТИЧ5СНИЙ ИНСТИТУТ

. Л »«»л '.П'ЛЛ

Не правах рукопг.ои

¡ПЕРЕ?

Наталья Владимировна

ОСОБЕННОСТИ ГАШТОПРОДУКЦИЙ РАЗНЫХ ГЕНОТИПОВ ПШЕНИШ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ

03.00.15. - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Одесса-!993

Работа выполнена' в 1987-1 ЭЭПгг. в отделе биотехнологии Селекционно-генетиче ского институ та

Научный руководитель - кандидат .биологических.наук, старший научный сотрудник I лукьянюк и.Ф. 1

Официальные ошоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Н.Тоцкий

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник В.К.Симоненко

Ведущее учреждение:

- Институт физиологии растений и генетики АН Украины'

Защита диссертации состоится 1993 Г-' в

часов на заседании специализированного совета Д 020.08.01 в Селекционно-генетическом институте (270036, г.Одесса, Овидаопольская дорога.З).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института..

Автореферат разослзн ¿г^ё^ЯМИээз г.

Ученый секретарь ■ специализированного совета . ^ ^^Г^5?анкевич А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОТЫ Актуальность темы. В селекции сельскохозяйственных культур в последние годы широко используются новые методы для создания сортов интенсивного типа, одним из таких методов является культура ш.'.ьников in vitro, позволяющая получать из гиоридных популяций гомозиготный материал и использовать его с целью ускорения селекционного процесса и повышения эффективности рекомоиногенеза сочетании с уменьшением ооъема изучаемого материала, с помощь» данного метода уже создан ряд сортов риса (Anonymous, -1976; H.Hu, 1984) и пшеницы Ui.Hu.et al., ivtw; «J.de buyaer et al., 198T), которые по продуктивности, устойчивости к заоолевайиям, зимостойкости к другим показателям превосходят лучшие, полученные традиционными спосооами, сорта.

Несмотря на значительный интерес к гаплоидам и рост фактического материала по гэплоидии, многие весьма важные вопросы этой проолеми продолжают оставаться нерешенными. Пока еще не. создана простая воспроизводимая методика индукции гаплоидов из' микроспор при культивировании пыльников люоых сортов и гибридов пшеницы.

Из имевшихся литературных данных ясно, что определи чм фактором культивирования пыльников является генотип, элементы генетической детерминации теплопродукции г.ока не установлены, хотя ведется их активный поиск, изучение генетики процесса пыль-никовой гаплопродукции представляет осооый интерес, так как управление этим процессом возможно, только зная его генетическую детерминацию.

Хотя гаплопродухционный процесс несомненно находится под контролем определенных наследственных факторов, он в то же время зависит и ot совокупности внешних условий, влияющих на реализацию гаплоггродукционной споссонсоти. изучение влияющих на пильни-ковую теплопродукции факторов вашо для дальнейшего развития и применения метода культивирования пыльников tr. vitro

Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, целью наших исследований было изучение генетической детерминации процесса теплопродукции в пыльникэвой культуре пшец.шы и разработка, комплекса условий культквировйния пъдыглкоб, новоооразова-ний и регепзоантов для оптимизации гашюпролукционного"процесса. Согласно поставленной цели Оыли определены задачи: 1 .Изучить пути морфогенеза пыльцы пшеницы.

2.Изучить влияние фактсрсг выращивания донорных растений, предоОраОоток срезанных колосьев и условий культивирования in vttro на пыльниковую гаплопродукцию.

.Определить роль генетических факторов в пыльниковсй культуре пшеницы на основании изучения:

-способность пыльников к эмориогенезу и к регенерации растений;

-влит м системы локусов Vrn на гашюпродукционный процесс; -влияния цитоплазмы на реализацию спорофитного пути развития микроспор.

4. Выявить ценные доноры для культуры пыльников из предложенных селекционных образцов.

* Научная новизна и практическая ценность. Установлено, что эмбриогенняя и .регенерационнзя способности изучаемых сортов и гибридов ьшеницы контролируются разными генетическими системами и обусловлены главным образом неаддитивными эффекгзми генов.

На основе сравнительного изучения гаплопродукции у пшениц, различающихся по системе генов Vrn, установлено, что результативность гаплопр Аукционного процесса увеличивается г^зи наличии в генотипе доминантного локуса Vrn 1 и уменьшается в присутствии Vrn 2. •

Показанс влияние цитоплазмы серии аллоплазматических линий Chinese Spring на различные этапы гаплопродукционного процесса. Выявлены цитоплазмы, увеличивающие эмориогенную способность пыльников, и повышающие частоту образования зеленых регенерантов.-

Проведено цитологическое изучение морфогенеза пыльцы пшеницы, позволившее предположить, что спорофитный путь развития мик- ' роспор детерминирован in vivo, а для своей реализации требует создания определенных условий.

Разработан и предложен к практическому использованию комплекс оптимальных условий выращивания донорных растений, предобработок срезанных кодссьев, культивирования пыльников, новообразований и регенервнтов, а также состав питательных сред, увеличивающие эффективность пыльниковой культуры пшеницы.

Получено 357 гомозиготных линий, которые переданы для дальнейшего изучения в отдел селекции и семеноводства пшениц виГИ.

Апробация работы, Материалы диссертации доложены на Всесо-Лзной конференции по биотехнологии злаковых культур (Алма-Ата, 1988); на Международной конференции "Биология культивируемых

клеток и биотехнология" (Новосибирск, 193S); на Всесоюзной конференции молодых учетах "Метода интенсификации селекционного процессе" (Одесса, 1990); На Всесоюзной конференции молодых ученых и специалистов сельского хозяйства "Соврекешшз проблем генетики и селекции сельскохозяйственных растений" (Одесса, 1991),

Ш/бликаш_1к. Основные результаты диссертации отр?жены в 7 печатных ргоотэх, список которых приведется в конце зь .-среферата.

SlßliUIXBS. й объем раОотн. Диссертация состоит из введения, 6 глаз, шзолов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 224 библиографические ссылки, 187 кя когорих иностранные. Работа изложена на 143 страницах машинописи, содержит 13 рисунков, 22 тсблнцп и 2 прил::.я:г:л.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДУ ИСС.;ЕД0ВА1Щ. В работе использованы ярозие и озимые сорта, формы и гкбри-дч мягкой пшеницы, предоставленные отделом селекции и семеноводства пшеницы ВСГИ, наборы линий, изогешгых по системе локусов Vrn, сортов Triple Dirk и Скороспелка 36, предоставленные лабораторией частной генетики шеницц ВСГИ, и серия аллонлазматичес-ких линий, со-дашшх на основе Chinese Spring, предоставленная отделе.*.: гепотяка и аптологаа растений ВСГИ.

"¿/.•"•.pi«« рзстш::ш впродагоалк в полекпх условиях с 193С-1939 годах на епктьвх. нолях института и в условиях искусственного климата. Ярсвизшг.в проростков озимых пшениц проводили при -¡2°С у. круглосуточном осз'яцешга в течение 4Ь-ьО суток в каморе КНТ-1. S'JTW.t полученииз растения выращивали в клжатаческоЯ камере при 1G -час.(f.oгоперисде, освсазююсти 18-20тис.дк н температурном оежимо: 22-^5°С днем vi 18-20°С ночью.

Колосья допорных растений срезали на одноядерной стадии розкякл ми"рсспор, ¡гндерживали та тгри +йсО в темноте втечение 4 суток. Стеркдизов2Л.1 нзсыщешшу раствором гипехларитз кальция (30 миь) и помеща ш на аичательные среди: N-5 (C.C.Ohu, 1978), Potato-2 (C.C.Chuang et al., 1978) и различные та модификации по 50-60 сальнике f. в пробирку. Инкубировала в темноте при +30°С. Подсчет частоты эмбриогенеза проведали относительно чкелз ssca-кенннх 1йлышог5. Частоту рэгенорах ни оценивали относительно числа эмбрисгешых пыльников.

Цигологичептз паолкдевия проводами на временных рцетокар-умюних припаратах с пемощыа Ш1-15.

Полученные новообразования пересаживали на безгормональную твердую питательную среду N-6 для регенераты и выдерживали вте-чение недели в тех же условиях, где инкубировались пыльники, а затем при той же температуре помечали на слабый рассеянный свет (16-час.день) на 7-10 дней. После этого новообразования с первыми появившимися регенеранташ переносили в условия более интенсивного освещения (2-Зтыс.лк.) и умеренной (25-26°С) температуры при том не фотопериоде. Затем только появившиеся зеленые регене-ранты помещали в жидкую•безгормональную питательную среду N-6 в условия короткого (10-час.) дня и погашенной температуры (9°С ночью и 12°С днем) до высадки в почву.

Диплоидизацшо получе!Шых регенерантов проводили введением раствора колхицин* (0,16% в 4% ДМСО) методом вакуум-инфильтрации (С.Л.Игнатова, С.Ф.Лук'ьянюк, 1980), погружением корней, или методом Белла (G.C.Beil, 1950). Выращивали регенеранты в условиях фитотрона.

Семенное потомство полученных ре.енерантов высевали в поле для анализа элементов структуры урожая растений Rg. По 1 зерну с каждого колоса регенеранта анализировали электрофоретически для определения глиадинового спектра.

Математическую обработку полученных данных проводили с использованием стандартных программ на IBM-PC/XT и ЭВМ СМ-4.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ .ОБСУЖДЕНИЕ

1 • Изучение путей пыльцевого морфогенеза швнишх Зд vivp к Iß vltrp. В результате цитологических наблюдений нами показано, что в пыльниках, акс.-каптируемых на стадии одноядерных микроспор, всегда наблюдалась некоторая асинхронность развития. В одном пыльнике обнаруживались микроспоры от ранней одноядерной стадии до двуядерного пыльцевого зерна. Kpoyb этого наблюдали различные морфологически аномальные пыльцевые зерна. К ним относили многоядерные или лшогоклеточные пыльцевые зерна. Были и мелкие невакуолизированные пыльцевые зерна с ярко окрашивающейся ацетокармином цитоплазмой, к пыльцевые зерна нормального размера, но отличающиеся большим количеством запасных веществ - крахмала или липидов. Число аномалий макроспор описанных типов было очень незначительным и, кроме того, такие явные морфологические аномалии через несколько дней культивирования дегенерировали.

Трудно предположить, что такие- аномалии я'вдяются инициалями мно~ геклеючшпе макроструктур, поскольку количество последних значительно Сольие. Не исключено, что оспсглюЯ к;слад о ¿оркихшан.:? жизнеспособных многоклеточных ертуктур вносят микроспоры, болкпески отдаччгзакся нжгсльикх кккрогло? ггу.???1х.\тл иго путл развития. К числу тгках ¿оп:."С;::чо. -м-носят.-л и

двукле'ючнке »шфсспогл; с ядрота ртопогг рглкора, "исло таких пыльцевых зерен увеличивается в первые дни кугьтквирсьашя (до щ тгчрй), после чего наблюдается появление многоклеточных структур (тоол."!, Олегует отметатъ, что ;;с Золение ;; г-ттатемьи;. среду 2,4-Д еяогыэаяс илипния .ч;| есряикнсвк-кие пальцевых зерен. 2,4-Д не сдвигала гаметофитное развитие микро-спср спорг^™"!^ тут: ?? п® у?влнчивчдч тчким .и'и.иис.м число многоклеточных структур.

Таблица 1

Характеристика популяции микроспор пшеницы сорта Чайка при разных сроках к, льтивирования

Питательная среда Рога- Срок куль-тиви-рова- 7'",-Я, ш;ей Проанализировано микро- гит". ' Жизнеспособных ?ликро- /"> Г1,, И Среди кигне способных микроспор

с рав- КЫМИ ядрз'а с не-рг вны- ытл а л— зрелая ПЧ-ИЬ- цо, ИТ. чети- рех- ллер- №10-гоя-дьр- ИКС

-.03 О 1 ООО 08.6? 03 42 8 0 0

¿•■¿-Л 30.4! 00' "; 40 0

1000 43,50 1 07 '04 203 о о

0 ; ссо 4 О Г ' 01 03 73 4 0

! ' ООО ' 6 ".80 11 01 34 п 2

¡0 ; ооо 2.00 о 0 12 4 0

'5 : ООО 0.70 0 0 0 О 7

с 2,.;->1 0 1 ООО П.: 7 Я 0 0 0

1 1000 39.98 61 70 29 О 0

3 1Ши за. 87 104 ■75 ¡68 О 0

5 1000 31 .04 59 93 135 0 4

7 ' ООО 8.30' 0 ' ' ' КЗ 1 9,

10 1 ООО 1 .о:: 0 0 2 о 3

': 5 'ООО 1 .20 0 0 С 0 12

Различали два типа образования ьпгфоструктур. В одном случае в результате повышенной митотическеЗ активности ядер образо-

: :п,:;.;,ись многоклеточнке пальцевые зер| а, енружгшше гбией оболочкой, Увеличение объема этих жкроструктур незначительно. Они •„остоят пз :далкпх топкостегошх "клеток с крупными ядрэми. После растрескивания оболочки продолжаются интенсивные клеточные дел"?-

ния, приводящие к образованию шаровидных проэмбрио, обнаруживающих упорядоченное строение. Наблюдали и другой тип развития микроструктур. Пыльцевая оболочка трескается уже после нескольких митоткческих делений клетки. Освобождающиеся при этом, клетки несколько больших размеров с более толстыми клеточными оболочками. Они неплотно ассоциированы между собой и быстро увеличиваются в размерах. Результатом такого типа развития является образование недифференцированного каллуса или эмбрионального клеточного комплекса.

2. Влияние внешних воздействий на эффективность

пнльниковой гаплопродукцки.

2.1. Условия выращивания донорных растений.

При выращивании донорных растений пшеницы Triple Dirk в поле частота образования эмбриогенных пыльников (?,9±1,2Ж) значительно выше, чем в условиях искусственного климата (1,5±0,2й). А частота регенерации составила 29,9*6,5% у полевых доноров и .4,4*1,5» у доноров, выращенных в фитотроне. Аналогичный результат получен у Скороспелки 36 (6,6±1,0 и 0,8±0,4% эмбриогенных пыльников соответственно). При выращивании донорных растений этого сорта в фитотроне регенерантов получить не удалось.

При посеве- в поле семян озимо-яровых гибридов ?2 в разные сроки (ранний - август, и оптимальный - октябрь) растения подвергались воздействию природных условий на разных стадиях развития. Обнаружили, что срок посева не влиял на выход эмбриогенных пыльников и их регенерационную способность. Эти показатели определялись генотипом донорных растений.

Изучение шльниковой культуры колосьев разных ярусов у 8 популяций Р0 озимо-яровых гибридов показало, что главные колосья донорных растений образовывали 3,17% эмбриогенных пыльников, колосья первого яруса - 4,37%, а колосья второго яруса - 1,61%. Отличия гашюпродукционной способности колосьев разных ярусов могут быть связаны как с разницей в сроках закладки колосьев и связанных с этим воздействием стрессовых факторов на разные стадии формирования колоса, так и с возможной разницей уровня эндогенных гормонов в колосьях разных ярусов.

Установлено также, что наличие эмбриогенно способных микроспор свойственно пыльникам любой части колоса в равной мере.

2.2. Предобработки ¿сонорного материала и оптимизация

питательной среда.

т

Известно (С.Ф.Лукьянюк, 1983; G.Shumann, 1986), что холодо-

вая предобработка повышает эффективность, пыльниковой культуры. Нами показано, что длительное воздействие пониженной температурой (более 4 дней) нецелесообразно, так как приводит к снижению эффективности гаплопродукции.

При изучении зависимости гаплопродукции от состава питательной среды установлено, что из двух использованных стандартных питательных сред Potato-2 оказалась благоприятней, чем N-6, для всех генотипов пшениц. Добавление в первичную питательную среду растворимого крахмала (1г/л) и яблочной кислоты (25мг/л) на фоне высокой 'концентрации сахарозы (10%) позволило заметно увеличить выход новообразований и зеленых регенерантов. Модифицированная таким образом среда N-б по своей эффективности ш уступает широко используемой в настоящее время среде Potato-2.

ОСогаще.чие среда Potato-2 пролином (200мг/л), глутамином (200 мг/л) и яблочной кислотой (25 мг/л) у 4 из 6 изучаемых генотипов способствовало увеличению частоты образования эмбриоген-ных пыльников (табл.2).-Особенно заметно влияние добавок сказалось на регенерации зеленых растений.

Налгае ауксина в питательной среде не всегда является Зя-зателышм.

При сравнительном изучегсл вещесть ауксиновой природы (2,4-Д, ИУК и 4-хлорфеноксиуксуоная кислота), для чего в модифицированную наш среду N-6 добавляли эти компоненты в количестве 1мг/л| было показано, что ауксины скорее всего не являются индукторами спорофитного развития микроспор. Так, удвух изучамых сортов (Чайка и Triple Dirk) на среде без 2,4-Д получены пыльцевые новообразования. Воздействию компонентами питательной среды подвергаются образу^лиеся многоклеточные структуры.

3. Получение и морфобиологический анализ • тальниковых регенерантов гпиениш.

3,1, Оптимизация питательных сре.д и температ^ ^но-световнх условий регенерации из,новообразований. Проведенные наблюдения показали, что процесс регенерации, как правило, индуцируется ут на первичной питательной среде. В некоторых случаях наблюдали возникновение регенерантов до пересадки на piгенерационную среду. Однако основная масса новообразований нуждается для этого в изменении условий, одним из которых является состав регенерационной среды.

Таблица 2

Влияние органических добавок к картофельной среде на гаплопрс.,укцию пшеницы

Пита- Выса- Получено

тель- жено эморио- зеленых хлорофилл-

Генотип ная пыль- генных регене- деф.реге-

среда ников, пыльни- рантов нерантов

шт. ков, % шт. % шт. %

хйС1апо 79 Р-2 480 2.1

_(!_ Р-2М 480 7.9

Чайка Р-2 360 2.2

Р-2М 360 16.7

РоЧайка х

X ОТ 4083 Р-2 480 2.5

Р-2М 600 5.0

ГР0Д51 х

X Иапо 79 Р-2 360 3.3

Р-2М 480 2.9

Р,Юннат х

х ОТ 4083 Р-2 480 5.8

Р-ги 480 12.5

РрЧайка х

хйС1апо 79 Р-2 480 4.3

Р-2М 480 3.2

16„„ 3.3 0.0

384 80.0 24 5.0

256**71.1

0.0 0„, 0.0 136 37.8

О.,, 0.0 12 24* 4.0 20

2.5 3.5

О,* 0-0 20„„ 5.6 32 6.7 0 0.0

16, 192

4 1

3.3

"40 .'О 160"33.3

0.8 0.2

8 2

1 .7 0.4

**

*

♦-достоверно при Р=0.05; »»-достоверно при Р=0.01 Р-2- сррца Рогаго-2;

Р-2М - среда Рога1;о-2 с добавлением пролина (200мг/л), глутамина (200мг/л) и яблочной кислоты (25мг/л).

Среда Р-8, которая была предложена для регенерации растений из пыльцевых новообразований тритикале и эмбриокультуры ячменя (С.Ф.Лукьянюк, 1983) а оказалась неподходящей для пыльниковой культуры пшеницы (табл.З). Процесс регенерации также ингибиро-

Таблица 3

Влияние состава регенерационной среды на получение пыльниковых регенерантов

" ............... Состав регенерационной среда Высажено новообразований, шт.. Получено регенерантов, шт. Частота регенерации, %

зеленых ■ хлоро- филл-де фектных зеленых хлорофилл-дефектных

N-6 без гормонов 30 16 19 53.33 63.33

И-б+крахмал,яб- 30 25

лочная к-та,ГК 14 83.33 46.66

И-б+АБК 27 0 0 0.0 0.0

Р-8 32 1 14 3.13 43.75

аллея добавлением в среду АБК. Количество зеленых регенерантов

заметно возрастало при обогащении среда N-6 крахмалом (1г/л), яблочной (25мг/л) и гибберелловой (0,5мг/л) кислотами.

При пересадке начавших регенерацию новообразований в жидкую питательную среду и в условия 10-час. дня и пониженной температуры, обеспечивающих свободнай доступ к питанию и способствующих развитию корневой системы, все регенеранты развиваются нормально, Кроме того, в таких условиях хлорофилл-дефектные регенеранты кршггически приостанавливают свой рост, что положительно отражается на выходе зеленых растений.

2.2. Дптлскдизаиия растений-регеперантоэ и хэрактеоисти-ка дигаплоидов.

Для удвоения числа хромосом у полученных растений использовала колхи^инирование через корни и вакуум-инфильтрацией. Оказалось (табл.4), что при этом гибнет много растений.

* Таблица 4

Эффективность разных способов диплоидизации щльниковых растений-регенерантов пшеницы Triple Dirk

Способ Всего Получе- Получе- Частота Частота

,Z'M глоидазаши расте- но ди- но гап- диплои- гибели

ний , гаплои- лоидов , дизации, расте-

шт. дов, шт. шт. % ний, %

спонтанная ! 53 24 81 15.8 31.8

Погружением

корней 203 35 117 17.2 25.1

Вакуум-ин- 65.0

фильтрацией 203 19 52 9.3

4.68* 26.63*"* 43.96***

»-достоверно .гри Р=0.1; **«-при Р=0.01

¡¡и у одного растения не удалось получить фертильных колосьев rxpti обработке методом Белла.

Вместе с тем для некоторых культур известно (J.Quyang, 1987; M.s.Cho, F.J.Zapata,1938), что в пыльниковой культуре имеет vecTo спонтанное удвоение. Проведенные наш исследования показали, что спонтанная диплоидизация для сорта Triple Dirk составила 'Jt.B%, п для Скороспелки 36 - 30.Sí. При колхицинироввнии через норы; частота диплоидизации для этих сортов составила 23,9 и 21.53 соответственно. При этом обработка колхицином значительно повышала гибель растений - примерно э Б раз у Triple Dirk и

втрое у Скороспелки 36. Решающее влияние на выход (,'ертильных регенерантов в пыльниковой культуре пшеничных гибридов оказывает генотип донорных растений.

таким, образом в методике получения удвоенных гаплоидов пшеницы колхищширование можно исключить.

Изучение морфоструктура растений-регенерантов (R,) из изо-генных линий Triple Dirk выявило различия по озерненности, высоте растений, длине и числу колосьев. Семенное потомство (Rg) этих изменений не сохраняло,Следовательно наблюдаемые наш изменения носили модификационный характер. Биохимический анализ растений R1 и R2 линий Triple Dirk также не выявил индукции генетических изменений. Отсутствие расщепления по изученным признакам в «Hg позволяет говорить о гомозиготности полученных линий.

4. Эффективность гаплопродукшт в культуре пыльников разгар генотипов мягкой ттаегошы.

4.1. Изучение яровых и озимых сортов, а так*:? изогенных по системе Vrn линий пшеницы.

При изучении семи сортов пшеницы (3 яровых и 4 озимых) отмечены различные показатели гаплопродукции (табл.5). По средним

Таблица 5

Результат-: культивирования пыльников различных, сортов пшеницы

Сорт

Всего К-во К-во

пыль- эмбрио- новооб-

ников, генных разова-

шт. пыльни- ний, ■

ков, % %

Частота регенерации, %.

зеленых

альби-но

Получено фертиль-ных растений.

яровые сорта

Glano 79 660 3.5 4.1 6.0 0.8 0.0

Veery 600 4.1 5.2 10.4 12.2 15.8

ОТ 4083 660 6.5 12.4 8.0 6.7 16.6

I 4.7 7.2 8.1 6.6 10.8

Sx 0.8 2.1 1.0 2.7 4.5

озимые сорта

Одесская 51 1260 0.7 0.9 0.8 0.0 40.0

Юннат 1140 1.3 1.6 0.4 0.3 0.0

Одесская 16 660 2.4 3.6 7.2 0.0 14.3

Чайка 1140 4.4 10.4 16.4 3.2 28.0

I 2.2 4.1 6.2 0.9 20.6

Ч 0.7 1.9 3.2 0.5 7.5

значениям этих показателей яровые сорта превосходили ози&ше.

Предположили, что данный факт может сыть связан с различиями в системе генов отзывчивости к яровизации. В связи с этим проведено изучение андрогенетичесхой отзывчивости у почти изсгенных по системе лонуcon Vrn линий сортов Triple Dirk и Скороспелка 36, выращенных в полевых условиях.

Обнаружили, что средний процент эмбриогенных пыльников был близок по своему значению у линий Tr:ple Dirk (табл.6) и Скороспелка 30 (таОл.7), составив .7,91 и 6.5S& соответственно. Вместе с .ем показатели регенерации у Скороспелки 36 были намного ниже, чем у Triple Dirk (3,4% и 29,9% - зеленых регенерантоз и 1,5% и 12,0% хлорофилл-дефектных, соответственно), в чем сказалось вли-.T.2IE генсфсиа скороспелки 36.

Среди изогенных по ci.-теме локусов Vrn линий обоих сортов линии с доминантным локусом Vrni выделены как наиболее отзывчивые на культивирование пыльников, а линии с доминантными локуса-ми Vrn2 Vrn3 характеризовались саговый низкими показателями частоты эмбриогенных пыльников и числом новообразований на них. Однако способность новообразований линии Скороспелки 36 доминантной по локусам Vrn2 Vrn3 к регенерации зеленых растений оказа-л-гл, вдвое превышающей среда»» по опыту , а регенерация хлорофилл-дефектных растений этой линией была незначительной. Аналогичная линия сорта Triple Dirk по регенерации зеленых растений была одной из худших (немногим лучше линии с минантным локусом ■'гп2). Показатели начальных этапов гаплопродукции у обоих сортов сникал доминантный лонус Vrn2. Данный локус не оказывал положительного влияния и на регенерационную способность пыльниковых новообразований.

4.2. Изучение влияния цитоплазм на пыльникозув гаплопро-

дукцию.

Сравнительное исследование аллоплазматичегтк линий шеницн Chinese Spring обнаружило различную отзывчивость к культивированию пыльников (табл.8). Получение эмбриогенных пыльников не зависело от цитоплазма Tr.dlcoccotdes, но регенерация зеленых растений на этой цитоплазме увеличивалась. Цитоплазма Tr.dicoccum значительно увеличила процент экбриогеншх пыльников и среди регенерэнтов на было хлорофилл-дефектных растений. Такой кэ эф-фэкт оказывала цитоплазма Ае.vcntricosa.

Лшпш с цитоплазмами Ae.aucherl, Ae.bicornla, Ae.unlarlatata и Ae.cyllnürica обладали пониженной вдвое эмбрио-

Таблица 22

EJErUKE ГЕКОВ Vrn НА ГАПЛОЯР^^ЩЖ 1" ЖЕ&Щь СОРТА Triple Dirk

К-бо : Доминантные локусы : К-ес :Н-во гмбрио-:К-го ковооб-: Частота регенерации, %

дней до: в гексфок(. :пкльни-:генных пыль-:разоза£Ий, :----------------------------

колоше-: Triple Dlr'i "ксз, шт:никоз, % : % : зеленых : • альбиносных нил : - j- - 4 . . . . .

114 j 600 7,5±М 20,5+1,6 26,6+1,8 . 13,0+1,4

52 vmi 300 12,"+1,9 51,7+2,& 37,3+2,8 2Г, ,3+2,6

58 Vxn 2 420 2,1+0,7 5,5+1,1 4,8+1,0 0,5+0,3

51 Vrn3 540 9,1+1,7 19,3+1,7 50,4+2,1 14,4+1,5

51 vrn Г Vrn Z 180 11,7+2,4 30,0+0, . 46,7+3,7 10,0+2,2

50 Vrn I Vrn 3 ЗСО 6,0+1,6 22,7+2,4 39,7+2,8' 7,2+1,5

52 Vrn 2 Vrn 3 240 5,С_1,1 14,6+2,3 5,0+1,4 15,0+2,3

Среднее по опыту 7,91 23,45 29,92 12,51

КСГ для сразненля со средней опыта 2,49 3,72 4,04 3,03

КС? длл попарного сравнения 3,81 5,69 ',17 . 4,62

' . Таблкга 23

БЖлВЕ ГЕНОВ 7га. КА ГАЛЛОЛРСД'ЗДШ У ПЕЕНИЦЫ СОРТА СКОРОСПЕЛКА 36

К-во : Доминантные локусы : К-во :К-ро эмбрио-:К-во ноаооб-: Частота регенерации, %

дней до: в генофоне :пыльни-:генкы>: пьшь-.'разований, ;—------------------------

колоше-: Скороспелка 35 :ков, шт:никог., % : % : зеленых ".альбиноскых

шл : : : : : :

109 - 240 7,9+1,3 20,0+2,6 1,7+0,8 0,0

■„ 48 Угп I 420 12,1+2,Г 20,0+1,9 10,5+1,5 0,9+0,5

56 Угп г 450 5,0+0,9 11,3+1,4 ' 2,5+0,7 2,1+0,6

49 Угп 3 420 5,7+1,1 14,0+1,? 0,0 4,3+0,9

47 Уга I Угп г 300 7,3+1,5 18,3+2,2 0,0 1,3+0,7

46 7тп I угп з • 430 5,2+1,0 14,2+1,6 2,5+1,7 1,2+0,5

43 • Угп.2 Угп 3 240 2,9+1,1 3,3+1,1 6,7*1,6 0,8+0,6

Средней по опыту 6,59 14,45 3,40 1,53

КС? для сраЕнек:;.-: с. средней опыта г.зо 3,31 1,68 1,22

НСР попарного сравнения 3,51 5,06 2,57 1,86

Таблица 8

Влияние цитоплазм на тальниковую теплопродукцию

Источник Выса- Получе- Получено ре- Частота ре-

жено но эмб- генерантов.шт. генерации,Ж

цитоплазмы пыль- риоген.

ников пыльни- зеле- альби- зеле- альби-

шт. ков, % ных но ных HO

Chinese Spring 360 1.94 0 6 0.0 ' 85.70

Tr.dlcoccoldea 660 1.96 4 0 30.77 7.69

Tr.dlcoccoldea

nudlglunls Tr.dlcoccum 120 0.66 0 0 0.0 0.0

660 3.03 10 0 50.00 0.0

Tr.tlmopfieevl 240 0.42 0 0 0.0 0.-

fr.zhukovekyt 300 0.0 0 0 0.0 0.0

Ae.heldreicnii 360 0.0 0 0 0.0 0.0

Ae.mtlca 300 0.0 0 0 0.0 0.0

Ae.searalt 120 0.0 . 0 0 0.0 0.0

/e.Munctolta

/e?Z .1 crlstata 240 0.0 0 0 0.0 0.0

420 0.24 0 0 0.0 0.0

Ae.aucherl 240 0.42 0 1 0.0 00.00

Ae.blcornta 540 0.55 0 1 0.0 33.33

Ae.cylindrica 720 0.69 0 2 0.0 40.00

Ae.speltoldea 20.00

(С г <) 480 1.04 0 1 и.О

Ae.3p&ltoidesiU)\Q0 0.66 0 . С 0.0 0.0

Ае.зпагопепз1з 360 5.55 0 0 0.0 10.00

Ae.bimctali8

Ae zUllmnarlB 240 6.25 0 4 0.0 26.66 '

360 0 4 0.0 30.77

Ae.kotschyt 360 4.19 0 4 0.0 26.66

Ае.сгазза 4x 480 2.03 0 2 0.0 20.00

Ае.сгазза бх 600 5.50 0 9 0.0 27.27

Ae.vmbellulata 300 0.66 1 1 50.00 50.00

Ae.speltoidea 27.27 13.04

Aellahtaibllla 420 480 2.62 4.79 1 1 3 3 9.09 4.35

Ae.Juvenallз ■•>0 2.86 5 4 41.66 33.33

Ae.ventrtcnsa Ь40 4.26 5 0 21.74 0.0

генной способностью микроспор. Все регенеранты этих линий были вльбиносными.

На все показатели процесса теплопродукции отрицательно влияли цитоплазмзтические факторы Тг.гЬик01)зку1, Ае .Ье1с1гв1сЬа Ae.mu.ttca, Ае.аеагаИ и Ае.Ыипс1аИз.

Линии с цитоплазмами Ае.зПагопепз1в, Ае.ЫипааНз, Ае.соХхшюПз, Ае.ЪогвсМг, Ае.сгазза 4х и Ае.сгазза бх, обладая-повышенной змбриогешюй способностью микроспор, оказались способными к регенерации только хлорофилл-дефектных растений. '

В контрольной линии Chinese Spring в нашем отите не было

получено зеленых регенератов. Они сформировались в присутствии цитоплазм Tr.dicocooides, Tr.dlcoccuvi, Ae.imbellulata, Ае.spelt о ides, Ае.variabilis, Ae.venirtcosa и Ae.Juvenal la. Мояззо предположить, что эти цитоплазмы в сочетании с ядром какой-либо другой линии пшеница, обладающей повышенной способностью к регенерации зеленых растений, могли бы значительно увеличить получение как эмбриогешшх пыльников, так и зеленых регене-рантов.

4.3. Изучение генетической детерминации процесса пылъникс-

вой гаплопродукции.

В системе тестеркых. скрещиваний озимых сортов с яровыми установлено, что все изучаемые признаки процесса гаплопродукции определялись генотипами как материнских, так и отцовских форм. Для расчета ОКО и СКС была использована четвертая модель Хеймп-на. В нашем опыте высокую ОКС по количеству эмбриогенных пыльников и новообразований тлеют сорта Чайка, Юннат, Veery, Журавка и д114, среднюю - MN73157. По способности к регенерации зеленнх растений выделились сорта Чайка, Veery, ОТ 4083 и д114. По выходу спонтанных дигаплоидов высоко ценными оказались сорта Одесская 16, Чайка, Veery и QT 4003.

По степени выраженности эффектов ОКС выявлены пенные доноры для увеличения эффективности шлышковой гаплопродукции, которц-?Я1 могут быть озимый сорт Чайка и яровые Veery и д114. Для повышения показателей начальных этапов гаплопродукции успешно могут быть использованы озимый сорт Юннат и яровые MN 73157 и Журавка. Л для увеличения регенерационной способности может быть рекомендован яровой сорт QT 4083, для которого характерен и высокий уровень спонтанной диплоидизации регенерантов.

Сравнивая вариант ОКС и СКС по изучаемым признакам у каждого сорта, обнаружили, что показатель во всех случаях выше °0КС' что може,г свидетельствовать о преобладающей роли яри ¡га-следовании гвплопродукционннх признаков неаддитивных эффектов генов.

Для генетического анализа тшлъниковой гаплопродукции провели скревдвания двух озимых сортов (Юннат и Альбатрос) и двух линяй (1л и ?.л), полученных из семян спонтанных дигаплоидов рвстений-регенераптоБ пыльниковой культуры. При наследовании эмбриогеннсй способности пыльников у 1л и 2л пресЛзздаюаую роль

играют гены с доминантшми и, возможно, эпистатическими эффектами' (°скс>0окс^ у С°РТ0В Юннат и Альбатрос не менее Бакное значение имеют и гены с аддитивными эффектами. Кроме того, относительно большое значение показвает, что 1л и 2л могут образовывать гибридные комбинации, характеризующиеся более высоким показателем эмбриогенной продуктивности, чем ожидается на основе средней ценности сортов, что было подтверждено полученными данными.

В детерминации эмбриогенной способности пыльников сущест-вешюе значение имеет неаллельное взаимодействие. Коэффициент регрессии (0,033) указывает на наличие комплементарного эписта-за. Высокий положительный коэффициент корреляции (0,619) между средними значениями признака у родителей, и (V^+ff ) отражает направленное доминирование и указывает на то, что большее значение признака контролируется рецессивными генами. В этом случае наибольшим числом факторов, положительно определяющих признак, обладают 1л и 2л, имеющие наибольшую оценку эффекта ОКС. Это, очевидно, связано с тем, что 1л и 2л являются результатом отбора по данному признаку, пыльники сортов ¡Оннат и Альбатрос отбору в культуре in vitro еще не подвергались.

При детерминации регенерациошюй способности в шльниковой

культуре основная роль принадлежит генам с аддитивными эффектами

у сорта Юннат, а у остальных изучавшихся форм преобладающую роль

при наследовании данного признака играют гены с доминантными и

'•эр эпистатическими эффектами (0скс>0ОКс''

Коэффициент корреляционной зависимости между получением регенерантов и наличием у генотипов соответствующих генов (0,012) указывает на разнонаправлешюсть действия генов.

Показатель (75ДН1+Р/77ДН|-Г)=1.095 свидетельствует о разном соотношении доминантных и рецессивных генов у родительских генотипов. Асимметрия между доминантными и рецессивными генами в генотипах скрещиваемых сортов при ненаправленном доминировании приводит к искажению параметров,, отражающих тип наследования.

ВЫВОДЫ

1. Сорта и гибриды мягкой пшеницы различаются по частоте пыльцевого эмбриогенеза, способности к регенерации и спонганной диплоидязации, что свидетельствует о генотипической специфичности андрогенеза в культуре пыльников.

г. Этапы процесса пыльниковой гаплопродукции контролируются резными генетическими системами, ипределено, что в использованных условиях частота пыльцевого эмбриогенеза и регенерзционная способность пыльцевых новообразован;::! определяется пвгнмуцьст-

вешге неаддитивными эффектами генов, лучшими донорами омориоген-ной способности пыльников являются :лнии, полученные в пыльнико-

итяяз.

3. Наличие доминантного локуса Vrnl в генофэнах скороспелки, ял « rlpio nir-k сп^^опотвова.по увеличению частоты формирования P««Qi-iTir\poOTJiiT ночоооччзовячий и рвгвнвпации и» них растений. Названные показ :ели снижались у обоих сортов доминантным локусом Yrn2.

4. Линии Chinese Spring с цитоплазмами Ae.stvarcmenala, Ae.bluncialea, Ав.columnar 1з, Ae.&otschil, Ае.сгазза 4x и Ае.сгазза бх обладают повышенной эмориогенной способностью пыльников, а цитоплазмы I'r.dtcoccoldes, TrMlcoccvm, Ae.imoellulata, Ae.speltotdea, Ae.varlobtlia, Ae.ventrtcoaa и As.juvenctalta поб;."2С!от частоту'образования зеленых рсгенерзнтов.

5. ццлъцовие зерна при культивировании шуькиков мягкой тпектаы могу., наряду с нормальным кикроспсрогекезсм, переходить i; спорсфитному развитию или дегенерировать, '"¡ализация программы споро^итнога развитая микроспор требует создания специфических yc.'ioinul in vitro. обнаружено, что наличие в питательной среде для культивирования пыльшпсов экзогешшх ауксинов не является .обязательным, дли реализации спорофктного пути.

6. Оптимизация температурно-световых условий и состава пи-тятел^ш'х сред позволяем повысить эффективность ' тальниковой кул'-турн мягкой пшеницы в 2-8 раз. .

7. Удвоенные гаплоида в тшшкевой культуре шешщы возникают спонтанно со средней частотой 35%. Применение колхицина не повышает выход фертильных регенерактов. .

• 3.' Результата еяохЕ»"1ческпх п «эрфелеппееких эьгяюов свидетельствуют о "омозиготнссти диггплоидов. условия культивирования пыльников, новообразований и растений-регенерантовне индуцируют генетических изменений.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для повышения эффективности пыльниковой культуры рекомендуется использовать озимый сорт Чайка и яровые Veery и Д114. Длч повышения показателей начальных этапов процесса гаплопродук-ции могут быть использованы озимый сорт Юннат и яроЕые Ш 73157 и Журавка, а для увеличения регенерационной способности и уровня спонтанной диплоидизации - яровой сорт QT 40S3.

2. Для получения гаплоидов предлагается выращивать донорнне растения в полевых условиях и использовать лишь колосья верхнего яруса.

3., В практике массового получения гзплоидое предлагается использовать модифицированные среды для культивирования пыльников: Pctato-2, обогащенную пролином (200мг/л), глутамином (200мг/л) при 10% концентрации сахарозы, и N-6 с такими s:e добавками и крахмалом (5г/л). Новообразования с первыми появившимися регенерантами рекомендуется культивировать б жидкой безгормональной среде в условиях короткого (10-час.) дня и пониженной (9°С ночью и 12°С днем) температуры. Переход из одних условий культивирования в другие должен осуществляться через адаптационный период (5-7 дней).

4. Для -получения фертильных регенерантов в шльннковой культуре пшеницы не рекомендуется применение колхицина.

5. Из сортовых образцов и гибридных фор/, предоставленных селекционерами, получены гомозиготные линии, которые предложено использовать в селекционном процессе.

Список работ, опубликованных но теме диссертации:

1. Лукьянюк С.Ф., Махновская М.Л., Игнатова O.A., Шерер Н.В. Значение условий выращивания в получении гаплоидов пшеницы и тритикале//Использовение искусственного климата в селекционно-генетических исследованиях. Сб.науч.тр. • - Одесса:ВСГИ, 1988. -С. 93-96.

2. Махновская М.Л., Лукьянюк С.Ф., Шерер Н.В., Игнатова С.А. Влияние питательной среды на гаплопродукцию гибридов мягкой пшеници//Тез.докл.Всес.конф. по биотехнологии злаковых культур. - Алма-Ата, 1938. - С. 12.

3. Лукьянюк С.Ф., Шерер Н.В., Махновская М.Л., Игнатова С.А. Разработка технологии получения гаплоидов гаденицы посредством культуры пылытшюв//Тез.донл.Ме:!!дунар.конф.:Биология культи-

вируемых клэток и биотехнология. - Новосибирск, 1988. - О. 209210.

4. Шврар Н.В., Козлов В.В. Получение растений-регенерангов мягкой пшеницы в культуре пыльников//Методы интенсификации селекционного процесса. Сб.науч.тр. - 0д8сса:ВСГИ, 1990. - 0. 100101.

6. Махновская М., Лукьянюк С., lilepep Н., Игнатова С., Лит-вяяенко Н., Максимов Н. Изучение условий культивирования пыльников пшеницы и тритикале с целью повышения эффективности гапло-продук: »//Вопросы селекции и генетики зерновых культур. Сб.КОЦ стран-членов СЭВ. - Берлин, 1990. - вып.4. - С.67-76.

ö. Шерер Н.В. Оценка чомбинациошюй способности яровых и озимых сортов мягкой пшеницы по показателям гаплопродукции в пыльниковой куль туре//Совремешше проблемы генетики, и селекции сельскохозяйственных растений. СО.науч.тр. - Одесса, 1991. С. 151-162.

7. Шерер Н.В. Влияние условий выращивания донорных растений пшеницы ва эффективность пыльниковой гаплопродукции//Матер. науч.конф.по сельхоз.биотехн. - Целиноград, 1991. - С. 57-58.