Особенности динамики фосфоинозитидов, фосфатидилсеринов в крови и грануляционной ткани при заживлении ран кожи в условиях применения гиалуроновой кислоты

Харитонова, Елена Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности динамики фосфоинозитидов, фосфатидилсеринов в крови и грануляционной ткани при заживлении ран кожи в условиях применения гиалуроновой кислоты
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности динамики фосфоинозитидов, фосфатидилсеринов в крови и грануляционной ткани при заживлении ран кожи в условиях применения гиалуроновой кислоты"

Р г в од

На правах рукописи

о - * *

И I;

ХАРИТОНОВА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

ОСОБЕННОСТИ ДИНАМИКИ ФОСФОИНОЗИТИДОВ, ФОСФАТИДИЛСЕРИНОВ В КРОВИ И ГРАНУЛЯЦИОННОЙ ТКАНИ ПРИ ЗАЖИВЛЕНИИ РАН КОЖИ В УСЛОВИЯХ ПРИМЕНЕНИЯ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ

03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кэмпндато биологических паук

Тверь - 1997

Работа выполнена на кафедре медицинской биологии и генспикн и в биохимической лаборатории научно-исследовательского центра Тверской государственной медицинской академии

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Г.В.Хомулло доктор медицинских наук, профессор Н.Н.Стосарь

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Л.Б.Ребров кандидат биологических наук, доцент Д.В. Ильяшенко

Ведущая организация: Российская медицинская академия последипломного образования

Защита диссертации состоится "//" мл^_._1997г.

в "часов на заседании специализированного диссертационного совета К.063.97.09 Тверского государственного университета (170002, I .Тверь, пр. Чайковского, 70А, корп. 4 , аудитория 34)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета (г.Тверь, ул. Володарского, 44 А)

Автореферат разослан " М'^У.уС-Л^ 1997г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук доцент

Л.Н.Панкрушнна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность 1фаблем>1< Изучение изменения качественного состава фосфолипидов биологических мембран в процессе репаратнвной регенерации кожи является весьма актуальным. В то же время, в последние годы повысился интерес к фосфоинозитидам (ФИН), особенно к их фосфорилированиым формам. Возникает необходимость в изучении механизмов участия этих соединений в процессах репаратнвной регенерации. Рядом авторов (A.B. Каргаполов, 1987, 1988; Н.Н.Слгосарь, 1989-1993; М.Б. Петрова, 1993; В.Г.Шсстакова,199б) получены данные о действии физических и химических факторов на обмен фосфоинозитидов. Однако, в литературе мы не встретили работ о влиянии гиалуроновой кислоты на обмен фосфоинозитидов при заживлении ран кожи.

Учение о ране относится к числу актуальных проблем хирургии я травматологии и отражает уровень развития различных разделов биологии, а также теоретической и практической медицины. Основным видом послеоперационных и посгтралматических осложнений является хирургическая инфекция. Увеличение числа послеоперационных гнойных осложнений, учащение случаев генерализации инфекции и различного рода токсико-аллергяческих реакций ( В.И.Сгручков,1975; Б.М. Даценко,1985; М.И.Кузин, Б.М.Коспоченок, 1990), неудовлетворительные результаты лечения больных с этой патологией свидетельствуют о нерешенности этой проблемы лечения ран.

Гиалуроновая кислота (ГК), впервые выделенная Мейером 1936 году, благодаря работам Н.Ф.Гамалеи достаточно широко применялась я клинике, в том числе и для лечения ран. Однако применение ангибиоппсотерапии и гормонотерапии вытеснило этот препарат из клинической практики. В последние годы возник теоретический и практический интерес к веществам биогенного пронехожпеиня-гликозамнношиканам, в том числе и к ГК. Однако, теоретического обоснования применения этого препарата нет.

Особое значение кисет изучение биохимических тиснений в тканях в условиях применения ГК, а частное», ФИН и продуктов метаболизма фосфолипидов • соединений, принимающих непосредственное участие в реализации различных этапов заживления ран кожи, которые могут отражаться не только их изменениями в регенерирующей ткани, но и других биологических объектах, в частности в цельной крови и клетках крови.

Цьныо шетоащей работы явилось изучение динамики изменений содержания фосфоннозитидов, фосфатидшюеринов и продуктов метаболизма фосфолипидов в макрофагах крови (моноцитах-стволовых клетках макрофагов), цельной крови и регенерирующей ткани в ходе заживления ран кожи в условиях применения ГК.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить изменения уровня содержания фосфоннозитидов и фосфатидшюеринов в макрофагах крови, цельной крови и грануляционной ткани в ходе посправ магической регенерации асептических ран кожи, а также выяснить влияние ГК при заживлении асептических ран.

2. Определить динамику фосфоннозитидов и фосфатшошсеринов в макрофагах крови, цельной крови и регенерирующей ткани в условиях заживления инфицированных ран при использовании ГК.

3. Исследовать изменения количества днацшттицеролов, арахидоновой кислоты и простата ндинов в макрофагах крови, цельной крови и грануляционной ткани при заживлении асептических и инфицированных ран в условиях применения ГК.

4. Изучить морфофункционапьные особенности течения заживления ран в условиях применения ГК на субклеточном, клеточном н органном уровнях.

Няучнаа номом. Установлено, что влияние гиалуроновой кислоты сопровождается изменением уровня содержания ФИН, фоофагидилсеринов (ФС) и продуктов метаболизма фосфолипидов в макрофагах крови, цельной крови я грануляционной ткани. Впервые обнаружены изменения количества отдельных фракций ФИН - фосфатидошшознт 3,4 оифосфатов

(ФИДФ1), фосфатидилинозиг-3,4,5-трифосфатов (ФИТФ), ФС и простагландинов (ПГ) в макрофагах крови, цельной крови и регенерирующей ткани у животных на различных этапах заживления асептических ран. Показано, что процесс репаратавной регенерации инфицированных ран сопровождается изменением количества ФИН, ФС, диацилглинеролов (ДГ). арахидоновой кислоты (АК) я ПГ в макрофагах крови, цельной крови и грануляционной ткани. Изучена динамика изменений ФИН, ФС, ДГ и ПГ в макрофагах крови, цельной крови и регенерате в условиях заживления инфицированных ран кожи у животных в условиях применения ГК. Выявлено влияние ГК на течение репаративиого процесса на субклеточном, клеточном и органном уровнях. Показано, что применение ГК создает благоприятные условия для заживления асептических ран и обладает выраженным стимулирующим влиянием при заживлении инфицированных ран кожи.

Теоретическое и практическое зншчеше работы. Выполненные исследования позволили расширить существующие представления о биохимических механизмах, сопровождающих течение реларативного процесса при заживления асептических и инфицированных ран. Полученные данные дополняют имеющиеся представления о стимулирующе mi эффекте ПС при посггравматической регенерации кожи. Комплексное морфобнохммичесхое исследование позволяет обосновать возможность использования показателей фосфоииознтидов в цельной крови, макрофагах крови и регенерирующей ткани дня оценки эффективности лекарственных препаратов с ГК и для рационального назначения препаратов с ГК в клинике для достижения стимулирующего эффекта при заживлении асептических я инфицированных ран кожи.

Anpofaivn работы. Основные положения диссертация и отдельные фрагменты доложены на: няучнор конференции " Современные вопросы диагностики и лечения". г.Тверь.-1994; заседании сотрудников Центра по рациональному использованию природных ресурсов НПФ "НА.РТ".-г.Моосва.-1994; Ш Кошгреоое ассоциации морфологов (А1"Э).-г.Тверь.-1996. Материалы диссертации обсуждались на совместном заседании

кафедр медицинской биологии и генетики, гистологии и эмбриологии, общей и бионеорганической химии, научно-исследовательского центра Тверской государственной медицинской академии.-г.Тверь.-1997.

Публика шм. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, 2 приняты в печать и оформлено 3 рационализаторских предложения.

Объем н структур* диссертации. Диссертация изложена на 2(13 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов и списка литературы, включающего 279 источников, из которых 137 отечественных и 142 иностранных. Работа иллюстрирована 27 таблицами, 49 рисунками и графиками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены на 362 беспородных белых крысах, преимущественно самцах, средней массой 167 -г. Для решения поставленных задач использовалась модель лолноспойной асеитичееской и инфицированной раны. Животные делились на 3 серии: 1 - интактная-животным этой серии рану не наносили, II • контрольная-крысы со стандартными поли основными дефектами, которые ежедневно смазывали ланолиново-вазепиновой основой, III - опытная • на рану ежедневно наносили Г/о мазь с ГК. Для получения инфицированных ран в область повреждения вводили 1 мл суточной культуры патогенного стафилококка штамма 209Р (I мл взвеси содержал I млрд. микробных тел).

Изменение биохимических показателей в макрофагах крови, цельной крови и грануляционной ткани исследовали до операции и в различные сроки после операции. Для этого взятие материала проводили через 6 часов, 5, 10 и 15 дней после нанесения повреждения у животных с асептической раной. У животных, с инфицированной раной материал забирали через 3, 7, 14 и 21 день после операции. Сроки операции определяли в соответствии с данными шнературы (Петрова М,К.,1943;

Хомулло Г.В., 1965-1996). Для этого у каждого животного брали навеску (500 мг) грануляционной ткани и 5-7 мл крови. Моноцты цельной крови-стволовые клетки макрофагов, которые, учитывая их роль в процессах репаративной регенерации, мы будем называть макрофагами крови, выделяли из цельной крови на градиенте плотности фиколла-верографина (Бейум А., 1968 ).

Из отмытых клеточных суспензий макрофагов крови, цельной крови (0,8 мл), грануляционной ткани (500 мг) экстрагировали липиды. Выделение ФИН и ФС осуществлялось с помощью

усовершенствованного метода проточной горизонтальной хроматографии (Каргаполов A.B., Слюсарь H.H. 1991-1996), ДГ - тонкослойной хроматографии ( Финдлей Дж.Б. и соавт., 1990). Содержание АК в исследуемых биологических объектах определялось с помощью газожндкостнои хроматографии ( Богдарин Ю.А. и соавт., 1982) с использованием газового хроматографа "Цвет-HO" (Россия). ПГ определяли радиоиммунологическим методом (Некрасова A.A. и соавт., 1977), а их количество подсчитывалось с помощью сцинтилляционного счетчика "Mark-3" фирмы "Nuclear Chicago". Для фосфатидилинозитов (ФИ), фосфатидилинозит-3-фосфатов (ФИФ1), фосфатидилинознг-4-фосфатов (ФИФ), ФИДФ1, ФИДФ и ФИТФ результаты выражали в н молях фосфора соответствующего ФИН на 1 мг белка, ФС- в нмолях фосфора ФС на мг белка, ДГ - в нмолях на 1 мг белка, АК - в процентах (%), ПГ для крови-в пг на мл крови, для ткани- в нгна грамм ткани.

Для изучения морфологических изменений в ходе репаративной регенерации кожи использовались цитологические, гистологические и электронномикроскопические методики. Пролиферативная активность различных зон регенерата оценивалась с помощью метода гисто авторадиографии с "С-тимидином (Англия). Интенсивность клеточного размножения определялась путей подсчета клеток, включивших изотоп, и вычисления индекса меченых ядер ( ИМЯ ) в процентах. Результаты обрабатывались статистически на персональной

ЭВМ - "1ВМ - 386 - ОХ" с применением стандартного пакета прикладных программ "ЯТАТОКАР" версия 2,0,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изменения количества фосфоинпзитидок. фосфятцднлсеринов, дгашлглниерслов, ярахидоновой кислоты и простаг.жидинпв в микрофагах крови, цельной крови н транулядоонной ткани при заживлении асептических реп

Анализ полученных данных позволил установить, что в макрофагах крови, цельной крови и грануляционной ткани отмечались существенные различия в содержании фосфоинозкпШов и некоторых продуктов их обмена в различные сроки заживления рак. Кроме того, биохимические показатели, полученные при репарации кожной раны в условиях стимуляции ГК, отличались от данных, характеризующих спонтанное заживление раневого дефекта.

Установлено, что в макрофагах крови у животных, получавших воздействие ГК через 6 часов и через 5 дней уровень содержания ФИ ниже, чем у животных контрольной и интактной серий. Через 10 дней посте операции количество ФИ в макрофагах крови у крыс опытной серии было в среднем в 1,97 раза выше, чем в контроле, а через 15 дней восстанавливалось до уровня ушгтактных крыс (рис.I).

Вместе с тем, отмечался разнонаправленный характер изменений количества ФИФ1, ФИФ и ФИДФ в макрофагах крови при заживлении ран у животных контрольной и опытной серий: на фоне повышения содержания ФИФ у животных опытной серии снижалось количество ФИФ1 и ФИДФ, тогда как в контроле наблюдался обратный эффект.

Одновременно отмечено, что содержание ДГ в макрофагах крови у животных, раны которых смазывали мазью с ГК, через 6 часов снижалось незначительно по сравнению с контролем, а начиная с 5 дня и до конца периода наблюдения соответствовало показателям у неоперированных крыс. В контроле уровень содержания ДГ на всех этапах наблюдения

Имтнтиая > ч»0О» " • дней 10ли»Й ИдшА

Рис. 1. Содержание ФИ в макрофагах крови до операции и в различные сроки заживлени асептических ран (нмоль Р ФИ/мг белка), п=12.

ШИИГНИ ) <1111 !««•■ Юли» 16ДН11

Рис.2. Содержание ДГ в макрофагах крови до операции и на различных этапах заживления этнических ран (нмоль/мг белка), п~ 12.

существенно отличался от их значений у животных опытной и интактной серий (рис.2).

Установлено, что количество АК в макрофагах крови в условиях применения ГК соответственно нуже в 2,52 н 1,78 раза по сравнена с животными контрольной и интактной серий. На фоне снижения количества АК одновременно отмечено увеличение количества ПГЕ по сравнению с их содержанием у крыс контрольной оерии.

В цельной крови, согласно нашим исследованиям, выявлены те же закономерности изменений ФИН, что и в макрофагах крови. Обращает на себя внимание тот факт, что соотношение ФИДФ1/ФИДФ через 6 часов после операции в цельной крови в контроле было 0,13:0,10, тогда как у животных опытной серии 0,9:0,18. В данном случае отмечена отчетливая тенденция к фосфорилированию в сторону образования ФИДФ1 через б часов после операции, которая сохраняется и в последующие сроки заживления.

Нами установлено, что в условиях применения ГК соотношение и количественное содержание полифосфоинознтидов и продуктов их метаболизма восстанавливалось быстрее, чем в контроле. Известно (КА. Коуас8,1995; .Г.Р.Вга&ЬаиОЭЭб), что при гидролизе полифосфоинозипадов могут образовываться различные вторичные нессенджеры-инозитол-1,3,4-трнфосфаты и ннознтол-1,4,5-трифосфаты, которые способны изменять функциональную активность клеток крови. Этот факт может свидетельствовать о возможной активации клеточных элементов, участвующих в осуществлении репаративного процесса, в том числе, и его начальной стадии • воспалении.

Цитологические исследования, проведенные нами, показали, что применение ПС определяет высокую активность нейгрофилов в очаге повреждения, что стимулирует миграцию моноцитов и лимфоцитов и их последующую дифференцировку в макрофаги, количество которых через 12 часов в мазках почт в 3 раза превышает контрольные показатели. Макрофаги раневого отделяемого характеризуются крупными размерам)!, цитоплазма содержит огромное количество пищеварительных вакуолей.

Столь значительно выраженная реакция со стороны нентрофилов и макрофагов в условиях применения ГК приводит х стимуляции элементов фибробластического ряда, что сокращает сроки и характер образования грануляционной ткани.

На всех этапах сепаративного процесса уровень содержания ФИ в Грануляционной ткани при использовании ПС был в 1,3 раза ниже, чем в контроле, причем через 15 дней их количество восстанавливалось до значений у неоперированных крыс. Изменение содержания ФИ в регенерирующей ткани сопровождалось изменением количества фосфорилированных в И-З и Б-4 позициях инозитолыюго кольца ФИН.. Так, содержание ФИФ1 и ФИФ на всех этапах заживления асептических ран под влиянием ГК было выше их значений у шггактных животных, тогда как в контроле их количество было значительно ниже, чем у интактных крыс. Вместе с тем, наблюдалась разнонаправленная динамика показателей ФИДФ1: у животных опытной серии отмечалась тенденция к снижению их показателей, тогда как в контроле их значения повышались. В процессе заживления ран в грануляционной ткани в условиях применения ГК через 15 дней после операции отиечалось восстановление до исходного уровня показателей ФИН (рис.3).

Вместе с тем, через 5 дней после операции к периоду, соответствующему формированию грануляционной ткани, количество ДГ у животных опытной серии было в среднем в 1,3 раза выше, чем в контроле, а уже через 10 дней восстанавливалось до интактных показателей. Известно, что ДГ активируют протеинкиназу С, которая, в свою очередь, приводит в действие связанный с мембранами механизм обмена ионов (Вегпс^е М. « а1.,1989). При этом повышается рН внутри клетки. По мнению некоторых исследователей (Бабенко А.В.,1986; Никольский Н.Н.,1987; Е.А.,1990; Утешев Б.С.,1992) одновременное повышение рН и мобилизация Са'+ вызывает ускоренную подготовку клетки к репликации ДНК, а также активирует процессы синтеза и-РНК и белков.

гИитактная

Рис,3. Содержание ФИФ1, ФИФ, ФИДФ1, ФИДФ н ФИТФ в формирующейся ткани через 15 дней при зажнвлспин асептических ран (нмоль Р соотв. ФИН/иг белка.), п-12.

Содержание АК на всех этапах заживления асептических ран ко,m в условиях применения ГК было ниже в среднем в 1,7 раза через 5 дней после нанесения травмы, в 1,4 раза - через 10 и 15 дней после операции по сравнению с их уровнем у животных контрольной серии. Одновременно отмечено повышение уровня ПГТга в грануляционной ткани, что особенно ярко проявляется через 5 дней после операции. Это не противоречит данный Bernard E.F.,1994; Tammi R., 1994, отмечавших повышение синтеза ГК и ПГ группы Fia в фибробластах кожи на начальных этапах репаративного процесса.

Одновременно с биохимическими исследованиями нами проведено морфологическое изучение влияния ГК на заживление ран на субклеточном, клеточном и органном уровнях. Оптимизирующее действие ГК, как доказывают наши исследования, способствует более благоприяшому течению репаративного процесса, что выражается в сокращении общих сроков заживления на 2 дня по сравнению с контролем. Основными реактивными элементами новоибразующейся ткани являются фибробласты, ультратонкое изучение которых выявило существенные различия в их структуре. В контроле преобладают молодые фибробласты, roi да как в условиях применения Г'К в состав новообразуюшенея ткани входят, в основном, зрелые фибробласты, характеризующиеся высокой коллагенообразующен функцией. Об этом свидетельствует развитый цитоппазматический реткулум с огромным количеством фиксированных на ею мембранах рибосом, большое количество везикулярных элементов пластинчатого комплекса, которые участвуют в выведении образующегося прсколлага» в экстрацеллгапярное пространство, где заканчивается образование коллагеновых волокон.

Итенеипя юшгдотва фпсфоншимкдов, фосфа гндилсерншв, дшппт 1 ;oniqx>;№n, ярятичоипеом кнс;ю1ы и простяглшшотв в мигрпф»чят крлчи, грлнюП крови н грануляционной nea m при ismBwioni

нифиюфляяшплх ран В макрофагах кропи уровень елчгржаннч ФИ через Л дня ноте оп«фяцнн я ус.чопч.чх применения ГК быч п !,?.3 ргт гмнпч, ;

120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 о.оо-И

тш

>'■>■ I-

Контроль

ГК

ВИнтактная Ш*ня ■ 7 ди«А В"дн«й О 21 дам.

Рис. 4. Содержание ФИ в макрофагах крови до операции и в различные сроки заживления инфицированных ран (ниоль Р ФИ / мг белка), п=!2.

60,00 м.оо

40,00 30,00 20,00 10,000,00

—

-- Й I Т

т .7

•г т ':

' > Т а:

■я'. Л,

•Ч -у 'Л

• 1 ; . ■■г;

- .*;? -;;

Инт»ктн»я ) дня 7дн<й 14 дней

V Л

К'

□ Интактная ■ Контроль ОГК

Рис. 5. Содержание ФС в макрофагах крови до операции и в различные сроки заживления инфицированных ран (нмояь Р ФС / мг белка), п=12.

кооперированных крыс, а на последующих этапах репаративного процесса соответствовал их значениям, тоща как в контроле их показатели на всех сроках заживления были выше (рис.4). Выявлен разнонаправленный характер реакций фосфорилирования ФИ и взаимопревращений полифосфоннозитидов при заживлении инфицированных ран у животных опытной серии. Обращает на себя внимание соотношение ФИФ1 и ФИФ в различные сроки заживления ран: 3,27:1,17 через 14 дней в контроле против 1,7:3,0 в этот же срок наблюдения у животных, получавших воздействие ГК. Отмечалось увеличение количества ФИДФ в макрофагах крови у крыс опытной серии с инфицированными ранами, тоща как у животных с асептическими ранами в условиях применения ГК значения ФИДФ снижались по мере заживления ран. Вместе с тем, через 14 дней от начала наблюдения отмечалось восстановление уровня содержания ФИТФ у животных, на раны которых наносили мазь с ГК, тоща как в контроле их показатели не были восстановлены и через 21 день после операции. Известно, что на поверхности клеток имеются рецепторы к ПС (С.М.Бычков ,1986; М.А.Португалова,1989;. Е.Ветагй.,1994). Возможно, ГК связывается с рецепторами на плазматической мембране клетки, вследствие чего С-белки плазматической мембраны активируют фосфолипазы (М.Вегпс!ее.11989), расщепляющие полифосфоинозитнды до вторичных мессенджеров: ДГ и инозитолгрифосфатов. Последние диффундируют в Цитоплазму, ще вызывают высвобождение еще одного вторичного мессеиджера - Саг+ из цитоплазматического ретикулума (М.Вегп<^е.,1989). Как правило, вторичные мессенджеры связываются с регуляторной субъединицей протеинкиназы - фермента, который фосфорилирует белки, тем самым активируя процессы синтеза (Б. Ра ту., 1990; РЛУ1Угаоп.,1992) и пролиферации (М.Ои1уШ, 1988).

Уровень содержания ФС в макрофагах крови в условиях применения ГК всех этапах репаративного процесса был выше, чем у интактных животных, тогда как в контроле их показатели были значительно ниже (рис.5). Следует отметить, что содержание ДГ в макрофагах крови через 3

дня после операции в условиях применения ГК было в среднем в 1,2 раза ниже, чем в контроле и в 2,2 раза ниже, чем у неолерированных крыс. Вместе с тем, уже через 14 дней после операции уровень ДГ у животных опытной серии восстанавливался до исходных значений.

В грануляционной ткани у животных с инфицированными ранами в условиях применения ГК наблюдалось изменение процесса фосфорилирования ФИ в сторону образования ФИДФ1, ФИДФ и ФИТФ. Именно при гидролизе этих соединений могут образоваться вторичные нессенджеры, способствующие реализации внутриклеточных процессов (М.Д.Беррндж, 1985; Б.С.Утешев,1992).

В определенной степени это подтверждается количественными изменениями метаболитов фосфолипидов-ДГ и АК, уровень которых в новообразованной ткани через 7 н через 14 дней после операции у животных в условиях применения ПС был значительно выше, чей в контроле, что объясняется активными формообразовательными процессами в области регенерата (рис.б). Известно, что АК может непосредственно влиять на репаративные процессы, изменяя сосудистую проницаемость (L.Fisher.,1985) и повышая функциональную активность нейтрофилов (W.Scott.,1980). Ключевое значение придается АК как источнику для образования лейкотриенов (Sanmeisson B.B.,1982), тромбоксанов (М.И.Кузин.,1990), просгагландннов (Ажпшш И,С.,1972).

Вместе с тем, через 7 дней после операции содержание ПГЕ в грануляционной ткани было в среднем в 1,5 раза, а ПГТи в 1,3 раза ниже, чем у неоперированных крыс (рис.7). Через 14 дней после нанесения повреждения у животных, находившихся в условиях применения ПС, уровень ПГ восстанавливался до исходного уровня, тогда как у контрольных животных исследуемые биохимические показатели не восстанавливались и через 21 день после травмы.

Изменения содержания ФИН, ФС, ДГ, АК и ПГ в инфицированных ранах в условиях применения ГК приводят, по видимому, к переключению клеточного метаболизма, необходимого для пролиферации ч

18,00 14,00 12,00 10,009,00 в,00 4,00 2,00 0,00

□ Иктактная о»ри* 3 Контроль

агк

Инт*ктн»я 7дн«й 14дн»й 21 д«нь

Рис. 6. Содержание АК в грануляционной ткани до операции и на различных этапах заживления инфицированных ран в условиях применения ГК (%), п=12.

700,00 000,00 300,00400,00300,00200,00100,00 0,00

гЬ

5 Г !

! •

Щ\ ;

ОИит»ктн»я е«рмч ВКомтроль ■ ГК

И|ГГ»КТН»Я

7 дн«й

14 дн«й

21 д«нь

Рис. 7. Содержание ПГТга в грануляционной ткани до операции и на различных этапах заживления инфицированных ран в условиях применения ГК (нг/г), п=12.

дифференцировкн клеточных элементов, что подтверждается результатами проведенного нами авторадиографического исследования.

Под влиянием ГК через 7 и 14 дней после операции значения ИМЯ у животных опытной серии значительно выше, чем в контроле (табл. 1,2). На начальных этапах заживления изотоп преимущественно включается фибробластами и клетками эндотелия сосудов молодой соединительной ткани и составляет 10,6% против 5,7% в контроле. Через 14 дней пролпферативная активность перемещается в пограничную зону эпителиального регенерата и составляет 13,4% против 9,7% в контроле. В условиях применения ГК наиболее активно включают «С-тимидин ядра клеток пограничной зоны эпителия в базальном и шиповатом слоях, тоща как в контроле можно отметить лишь единичные меченые клетки базального слоя.

Анализ биохимических результатов и данные авторадиотрафин находятся в полном соответствии с результатами морфологических исследований. Нами доказано, что ГК обладает выраженным стимулирующим эффектом на всех этапах осуществления посгтравматической регенерации инфицированных ран кожи. У животных, находившихся в условиях применения ГК, восстановительный процесс завершался на 3 дня раньше, чем в контроле.

В условиях применения ГК развивающаяся в области дефекта грануляционная ткань хорошо васкуляризована, причем слой вертикально ориентированных капилляров формируется уже на начальных этапах образования грануляций. Новообразованная ткань богата клеточными элементами различного генеза, среди которых преобладают молодые и высокодифференцированные фибробласты. В контроле через 21 день после операции наблюдается полная эпителизация. Эпителиальный регенерат ровный, утолщенный и имеет значительную протяженность. У животных, на раны которых наносили мазь с ГК полная эпителизация наступает через 18 дней, а через 21 день формируется органоспецифнческий регенерат со всеми производным»', волосяными фолликулами VI сальными железами.

Таблица I

ИНДЕКС МЕЧЕНЫХ ЯДЕР В КЛЕТКАХ ЭПИТЕЛИЯ И СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ В % (ЧЕРЕЗ I ЧАС ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ "С -ТИМИДИНА) ЧЕРЕЗ 7 ДНЕЙ ПОСЛЕ ОПЕРАЦИИ (п=Ю)

Грануля- Молодая Эпители- Погра- Неповре-

Серии М ционная соедини- альны! ничная жденный

±ш ТИШЬ тельная юна зон« эпителий

пгапь

М 3,73 5,76 3,34 4,35 6,64

Контроль ±т 0,42 0,39 0,39 0,71 0,47

М 6,17* 10,68* 5,25* 8,54* 7,44

Опыт ±т 0,31 0,74 0,63 0,36 0,51

Примечание: *- р < 0,05

Таблица 2

ИНДЕКС МЕЧЕНЫХ ЯДЕР В КЛЕТКАХ ЭПИТЕЛИЯ И СОЦЦИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ В % (ЧЕРЕЗ I ЧАС ПОСЛЕ ВВЦДЕНИЯ "С -ТИМИДИНА) ЧЕРЕЗ 14 ДНЕЙ ПОСЛЕ ОПЕРАЦИИ (п= 10)

Грануля- Молодая Эпители- Погра- Неповре-

Серии М ционная соедини- альный ничная жденный

±ш ТКЯНЬ тельная клин зона эпителий

ткань

М 6,44 6,19 5,03 9,67 7,26

Контроль ±т 0,51 0,35 0,43 0,61 0,57

• М 12,2* 8,68* 6,56 13,39* 8,75

Опыт ±т 0,36 0,45 0,53 0,26 0,64

Примечание: *-р < 0,05

Различия, выявленные на клеточном и тканевом уровнях организации особенно четко проявились на субклеточном уровне исследования. Электронно микроскопические исследования показали, что в формирующейся ткани контрольных животных с инфицированными ранами имеется большое количество незрелых фибробластов. Они имеют крупное ядро, в котором гетерохроматин почти не определяется. Эндоплазматический рстикупум развит слабо, а единичные митохондрии отличаются лизированными кристами. Оптимизирующее действие ГК проявляется в сильном развитии гранулярного регикупума, рибосомы обнаруживаются в виде больших агрегатов. Именно такие розетковидные н спиралевидные скопления рибосом активнее включают аминокислоты (Шехтер А.Б.,1982). В фибробластах животных опытной серии гипертрофируется пластинчатый комплекс. Высокая

коллагенообразующая функция фибробластов должна обеспечиваться достаточным . количеством энергии, поэтому фибробласгы характеризуются наличием многочисленных крупных митохондрий с протяженными кристами (Фролов В.А.,1989). Анализ' ультраструктурных изменений фибробластов в условиях применения ГК свидетельствует о значительном усилении процессов биосинтеза специфического белка в клешах регенерата, что вызывает ускорение коллагено- и фибриллогенеза.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что содержание фосфоршшрованных в О-З позиции . форм фосфатилинозитов в грануляционной ткани контрольных животных в процессе заживления асептических ран в среднем в 1,24 раза, а при заживлении инфицированных ран в 1,97 раза ниже, чем у кооперированных животных. Применение гиалуроновой кислоты приводило к разнонаправленным изменениям количества фосфатидилинозит-3,4-днфосфатов в грануляционной ткани: у крыс с асептическими ранами отмечалось снижение их значений, тоща как в процессе репарации инфицированных ран - их повышение.

2. В условиях применения гиалуроновой кислоты изменялся процесс фосфорилироваиия фосфоинозигидов, что Сопровождалось повышением количества полифосфоинозитидов в ходе заживления асептических н инфицированных ран кожи в среднем в 1,2 раза по сравнению с их уровнем у ингахтиых животных.

3. Уровень содержания фосфоинозигидов - фосфатидклинозит-3,4-дифосфатов, фосфатидилинозит-4,5-дифосфатов и фосфатидилинозит-3,4,5-трифосфатов, а также уровень вторичных мессенджеров-диацилглицеролов у животных опытной серии восстанавливался до их показателей у интактных животных через 15 дней после нанесения повреждений у крыс с асептическими ранами и через 21 день - при заживлении инфицированных ран. Эти изненения проявлялись в сокращении сроков воспалительной реахции, ускоренном развитии грануляционной ткани, быстрой трансформации ее в соединительную и, ген самым, приводили к стимуляции роста эпителиального регенерата.

4. В условиях применения гиалуроновой кислоты на начальных этапах .заживления асептических и инфицированных ран кожи обнаружено повышение уровня содержания фосфатндилсеринов в крови и грануляционной ткани в среднем в 1,4 раза по сравнению с их количеством в контроле, причем у животных опытной серии их количество восстанавливалось до исходного уровня быстрее, чем в контроле.

5. У животных контрольной серии выявлены более высокие, чем у интактных животных, показатели просгагландинов на начальных этапах заживления ках асептических, так и инфицированных ран. Однако, значения просгагландинов в макрофагах крови и грануляционной тхани у животных контрольной серии не восстанавливались до их уровня у неоперированных животных и крыс, находившихся в условиях применения гиалуроновой кислоты, что отражалось на продолжительности заживления ран у крыс сравниваемых серий.

6. В условиях применения гиалуроновой кислоты отмечалось усиление пролиферативных процессов при заживлении инфицированных ран. Авторадиографическое исследование с применением "С-тимидина,

проведенное одновременно с изучением показателен фосфоинознтидов, фосфатидилсеринов и продуктов метаболизма фосфолипндов, вышило выраженный стимулирующий эффект гиалуроновой кислоты. Он проявлялся в значительном увеличении ИМЯ в ДНК-синтезирующих клетках грануляционной ткани и пограничной зоны эпителия.

7- При заживлении инфицированных ран кожи гиалуроновая кислота оказывала стимулирующий эффект на развитие и дифференцировху фибробласгов. При ультрамикроскопическом исследовании этот эффект проявлялся в увеличении суммарной протяженности канальцев гранулярного регнкулума и количества фиксированных рибосом, гипертрофии пластинчатого комплекса, обилии везикулярных элементов, увеличении количества и размеров митохондрий, образовании лучков коллагеновых волокон в эксграцелшолярном пространстве, что свидетельствовало об ускоренном коллагено- и фибриллогенезе.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

I. Полученные данные позволяют обосновать показания к применению мази с ПС и считать наиболее целесообразным использовать ее для стимуляции восстановительных процессов в осложненных инфекцией ранах.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Липидный состав, фосфолипндный спектр и содержание элементов в миокарде и печени крыс при электропунктурных воздействиях различной сипы и деятельности// Медико-биологические и технические аспекты рефлексодиагностики и рефлексотерапии. Калинин, 1987.-С. 18-21 (соавт. Бельченко Д.В., Голованов С.А., Калинкин М.Н., Петрова М.Б.).

2. Скорость и характер заживления ран кожи в условия применения гиалуроновой кислоты// Современные вопросы диагностики и печения. Материалы научной конференции. -Тверь.-1994.-С.84-85.

3. Особенности репаратавной регенерации в условиях применения гналуроновой кислоты// Морфология.-199б.-Ы2-С. 100..

4. Морфофуикцноналыше и биохимические аспекты заживления ран кожи в условиях применения гналуроновой кислоты// Струюурно-функцнональная организация органов и тканей в норме, патологии и эксперименте.-Тверь.-1996.-С.155.

5. Динамика некоторых биохимических показателей в крови при заживлении асептических и инфицированных ран// К 60-летию областной клинической больницы.-Тверь.-1997 (соавт. Петрова М.Б.)-принята в печать.

6. Изменение фосфоинозитидного обмена в грануляционной ткани при заживлении инфицированных ран в условиях применения гналуроновой кислоты// К бО-летгао областной клинической больницы.-Тверь.-1997-принята в печать.

РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Рационализаторское предложение № 1739. Способ 'забора материала для цитологического * исследования раневого эксудата.-Тверь,1995.

2. Рационализаторское предложение N5 1740. Способ улучшения ' качества пропитки биологического материала заливочной средой во время

приготовления Препаратов для'электронной микроскопии.-Тверь,1995.

3. Рационализаторское предложение № 1748. Способ контрастирования ультратонкнх срезоп для эпектронномикросконических нссл^доплний. -Тверь 1995.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А К - араяидоновая кислота

ГК- гиалуроновзя кислота

ДГ - диацилпгицеролы

ПГ-простаптандины

ПГЕ-просгаглаидины группы В

ПГТг„-простатандины группы Рза