Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические механизмы действия координационных соединений гиалуроновой кислоты с металлами переменной валентности при острой интоксикации фенолом

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические механизмы действия координационных соединений гиалуроновой кислоты с металлами переменной валентности при острой интоксикации фенолом"

На правах рукописи

pre од

to ukk m

Потапчук Ирина Николаевна

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ КООРДИНАЦИОННЫХ СОЕДИНЕНИЙ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ С МЕТАЛЛАМИ ПЕРЕМЕННОЙ ВАЛЕНТНОСТИ ПРИ ОСТРОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ФЕНОЛОМ

03.00.04 - биохимия 14.00.25 - фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Башкирском государственном медицинском университете

Научные руководители:

доктор мед ицинских наук, профессор Ф.Х. Камилов; доктор биологических наук, профессор С. А. Башкатов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Е. Рябинин; доктор медицинских наук В.А. Мышкин

Ведущая организация - Омская государств ei тая медицинская академия

Защита состоится «/г- на л_2ооо г.

в /¿7 часов на заседании диссертационного совета Д 084.35.01 при Башкирском государственном медицинском университете (450000, г.Уфа-центр, ул. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета (450000, г.Уфа-центр, ул. Ленина, 3)

Автореферат разослан "/¿¡¿¿п/звл я 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы; Проблема поиска средств, повышающих адапта-донные возможности организма к неблагоприятным воздействиям окружающей реды, постоянно привлекает исследователей (Баренбойм Г.М., Маленков А.Г., 986; Денисенко ПЛ., 1986). В этом отношении недостаточно изучена роль гетеро-шисахаридов - кислых гликозаминогликанов (гликозаминогликуронанов), содержащих в своем составе гексозамины н гексуроновые кислоты, и включающие в ос-îobhom гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфаты, гепарансульфаты и гепарин, ликозаминогликуронаны (ГАГ) содержатся в межклеточном матриксе, клеточных кмбранах (Demopoulos Н.В., 1973; Hunter G.K., Heeische J.N.M., Aubin J.E., 1983; /ogei K.G., Peterson D.W., 1981), а также в ядрах клеток в ваде ассоциированных с роматиши протеоглшсансв (Stem G.S., Roberts Р,.М., Davis J.L. et al., 197S).

Башкатовым С. A (1996) показано, что при введении экспериментальным жи-отным ГАГ образующиеся за счет их деполимеризации свободные уроновые ки-логы метаболизируются в клетке сопряженно с компонентами гексозомонофос-эатного шунта. Это приводит к повышенной продукции НАДФ*Ы и активации за-;исимых от них биосинтетических и антитоксических процессов. Парентеральное ¡ведение суммарных ГАГ, включающих гиалуроновую кислоту (ПС), хондроютн-уяьфаты (ХС) и гепараисульфаты (ГС), при воздействии в условиях эксперимента кстремалышх факторов ( отравление гидрофильньми и липофидными ксенобиотиками, термические ожоги ) увеличивало выживаемость животных и способство-;ало более быстрому восстановлению нормальных физиологических процессов Башкатов С.А., 1997). Препараты ГАГ плаценты человека существенно снижали юбочное действие цитостатиков и иммуносупрессоров (Пахомов Д.В., 1997).

Важную роль в процессах дегоксшсации играют ионы ряда металлов переленной валентности, в частности марганца, кобальта, цинка, модулирующих ак-"ивность различных ферментов и входящих в состав соответствующих металлопро-•евдов. В связи с этим для усиления антитоксических эффектов ГАГ и, в частности ТС, представлялось целесообразным обеспечение клеток в достаточном количестве геобходимыми микроэлементами. Однако для этого было необходимо создание со-)тветствующих транспортных форм, препятствующие неспецифической сорбции гонов указанных металлов и избирательно направляющих их в клетки. Такими ранспортными формами могут быть гликозаминогликаны и, в частности, гиалуро-говая кислота, которая легко поступает в клетки путем эндоцитоза (Булычев АГ.,

1991). С зтех позиций представлял интерес исследовать перспективность примеке ния комплексов кислых ГАК с некоторыми металлами переменной валентности ка фармакологических субстанций, повышающих устойчивость организма по отаоше шш к действию химических раздражителей и токсикантов. Комплексы ПС с Мп,й Со были получены в лаборатории биологически активных веществ Института нефтехимии и катализа АН РБ и УНЦ РАН научным сотрудником Костроминой Л.Е.

Цель работы: изучение биохимических механизмов антитоксического дейсз вия комплексов металлов переменной валентности с гиалуроновой кислотой при остром отравлении фенолом.

Задачи исследования:

1. Оценить изменения содержания и фракционного состава гликозаминогликанов, уровня свободных уроновых кислот в печени и сыворотке крови лабораторных зкиботных при остром отравлении фенолом б дозе

2. Изучить влияние интоксикации фенолом в дозе на уровень цкгохромов Р-4.50, Ь5 и активность глюкозо-6-фосфат-, лакгат- и малатдегидрогеназ в печени крыс.

3. На модели флуоресцентного зондирования пиреном тенен эритроцитов оценить интегральное состояние биомембран при воздействии фенола.

4. Для выбора терапевтической дозы и схемы лечения оценить токсичность комплексов гиалуроновой кислоты с ионами металлов переменной валентности (Со Мп, га):

5. Изучить воздействие комплексов ГК с металлами переменной валентности на токсикокинетику фенола и биохимические показатели токсического действия фснолд.

6. Изучить влияние введения комплексов гиалуроновой кислоты с металлами пере менной валентности на уровень и соотношение в ткани печени окисленной и восстановленной форм НАДФ, активность ряда пиридинзависимых дегидроге-наз, содержание цитохромов Р-450 и Ь5.

7. Оцените влияние эхзогенно вводимых комплексов ГК с Со, Мп, 2п на уровень кислых гликозаминогликанов и их фракций, а также содержание свободных уро новых кислот в печени и крови при остром отравлении фенолом.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований уточнены некоторые молекулярные ме

ишзмы острой интоксикации фенолом: дестабилизация плазматических мембран и ;мбран субклеточных образований, изменение тканевого содержания и состава [слых гликозаминогликанов, сдвиги в соотношении окисленных и восстаговлен-лх форм никотинамидадешшдгшуклеотндфосфатов.

О дестабилизации биомембран при остром отравлении фенолом свидетель ство-1ли снижение мшфовязкостиэритрощггарных мембран (многократное падение >эффициента эксимергоации флуоресцентного зонда пирена ), падение активности ятохондриального ( малатдегидрогеназа), микросомальных цитохромы Р - 450 и Ь5 ) и цитоплазматического (лактатдегидрогеназа и глюкоза 6 - фосфатдегидрсгеназа) ферментов.

Впервые показало защитное действие комплексов ГК с металлами переменной шентности (марганцем, кобальтом и цинком ) при острой интоксикации фенолом, сгановлено, что основу фармакологического эффекта указанных комплексных сомнений гиалуроновой кислоты составляют стабилизация в тканях системы эндо-:шшх гликозаминогликанов и состояния биологических мембран, активация ряда ерментов углеводно-энергетического обмена, усиление продукции восстановлен-мх никотшамидадениндинуклеотидфосфатов, ускорение детоксикацяи и элимк-ации фенола гепатоцитами, а также активация секреции глюкокортикоидов.

Научно-практическая значимость.

Результаты работы расширяют существующие представления о фармакологиче-скх свойствах экзогенных гликозаминогликанов, позволяют наметить дальнейшие ути изыскания и изучения комплексов гиалуроновой кислоты с металлами пере-енной валентности, как новых антитоксических лекарственных препаратов профи-исгеческогв и лечебного действия при тяжелых отравлениях углеводородами аро-атического и циклического рядов

Обоснована возможность внедрения в клиническую практику определения ин-гисивносга флуоресценции пирена в тенях эритроцитов для характеристики со-гояния биомембран при различных патологических состояниях, а также для обьек-явизации оценки тяжести острого отравления фенолом в целях прогнозирования езистентности организма к полученной дозе токсиканта.

Результаты проведенных исследований отражены в монографии С АБашкатова Гликозаминогликаны в механизмах адаптации организма» (1996 г.), используются научно-исследовательской работе лаборатории биологически активных веществ [нституга нефтехимии и катализа АН РБ и УНЦ РАН, в обучении студентов на ка-

федрах биологической химии, военной и экстремальной медицины Башгосмедуш верситета.

Положения, выносимые на защиту:

- В токсическом эффекте фенола существенное значение имеет дестабилизация биологических мембран и системы гликозаминогяиканов.

- Острое отравление фенолом в дозе LD50 приводит к снижению в печени содержания компонентов микросомальной монооксигеназной системы цитохрома

. Р-450, активности митохондриальных и цнтоплазматических ферментов.

- Комплексные соединения гиалуроновой кислоты с металлами переменной валентности проявляют антагонизм в отношении токсического действия фенола.

- В молекулярных механизмах фармакологического эффекта комплексов гиалур новой кислоты существенное значение имеют стабилизация в тканях системы эндогенных глвкозаминогликанов и биологических мембран, активация ряда ферментов углеводно-энергетического обмена, ускорения гепатоцитами деток-сикацяи и элиминации фенола.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы долож( ны на Всероссийской конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск,^^; на заседании секции медицинской биохимии Башкирского отделени: Всероссийского биохимического общества (Уфа, 2000), на совместном заседании кафедр биологической химии и фармакологии № 2 Башгосмедуниверсигета ( мар 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 работы. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 110 страниц маааш( писи, содержит 22 таблицы, 29 рисунка и состоит из введения, обзора литературы описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных ис следований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включаю щего 180 источников, из которых 75 отечественных и 105 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 1000 белых неинбредных половозрелых мыш; и 400 крысах. Животных содержали на стандартном рационе вивария. Условия пр ведения экспериментов для контрольных и опытных групп были идентичными. В работе использовали гиалуроновую кислоту (ПС) чистотой 99%, выделенную в Институте нефтехимии и катализа АН РБ и УНЦ РАН из пупочных канатиков чел

века. Фраздия ПС из пуповины имела хорошую растворимость и прозрачность. Комплексные соединения ГК с переходными металлами (Мл, Со, Zn), получаемые в молярном соотношении 2:1, вводили внутрибрюшинно (в/б) в дозе 10 мг/кг, исходя из того, что вводимая доза должна быть оптимальной для обеспечения фармакологического эффекта.

В экспериментах на крысах изучали шгаяние однократного внутрижелудочно-го введения фенола в дозе LD50 (250 мг/кг), которую определяли по стандартной , методике Литчфилда-Уилкоксона (Беленький М.Л., 1963). Через 10 минут после отравления животные получали препарата ГК (10 мг/кг, в/б). К концу третьего часа эксперимента животных забивали декапитацией и определяли в печени и сыворотке крови следующие биохимические показатели: микровязкость мембран эритроцитов (Добрецов Г.Е., 1989), содержание гликозаминогликанов и уроновых кислот (УК) (Шараев П.Н., Иванов Б.Г., Рябов В.К. и др.,1989), НАДФ я НАДФ»Н, активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеяазы (Г6Ф-ДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и малатде-гидрогеназы (МДГ) (Прохорова М.И., 1982).

Воздействие комплексов ГК на токсикокинетику исследовали с применением 3Н-фенола (100 мкКи/ммоль) в дозе LD50 (250 мг/кг) и максимально перенасимой дозе -100 мг/кг. У животных, получавших "Н-фенол, анализировали на радиоактивность гомогената печени и сыворотки крови).

Влияние препаратов на токсичность фенола изучали на модели острого отравления белых кеинбредных мышей. Контрольные группы получали внутрижелу-дочно фенол в дозе, общепринятой в токсикологии для выявления защитных эффектов потенциальных антидотов, - 1,5 LDs4 (405 мг/кг). За 10 минут до отравления веодили виутрибркшппшо изучаемые комплексы в дозе 10 мг/кг. О действии препаратов судили по продолжительности жизни и выживаемости животных в кон-грольной и опытных группах.

Для оценки воздействия комплексов на систему цитохромов в микросомальной фракции печени крыс (через 3 часа после внутрибрюшинной инъекции препаратов в дозе 10 мг/кг) определяли содержание цитохромов Р-450 и bs (Карузина И.И., Арча-ков А.И.,1977; Omura Т., Sato R.,1964).

Радиоиммунологическим методом оценивали динамику содержания кортазо-та в крови крыс (Стерон-К-ш1,1996).

Противовоспалительное действие ГК изучали на модели острого воспаления, зызываемого каррагенином (1%) и формалином (3%), которые вводили (по 0,05 мл) губплантарно.

Статистическая обработка полученных данных проводилась на ПЭМВ IBÎv "Pentium-233" с применением программного обеспечения Microsoft Excel с вычи( лением средних значений, доверительных интервалов, среднеквадратических отклонений и сравнением средних с использованием параметрического t-критерия Стьюдента.

При указании в тексте на увеличение или уменьшение того или иного пока теля имеются в виду статистически достоверные различия (Р< 0,05). На рисунка* логарифмической шкалой ординат звездочкой (*) обозначены статистически дос верные различия с контрольной группой.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные нами исследования с использованием белых мышей и крыс,

продемонстрировали низкую токсичность гиалуроновой кислоты и ее соединени: металлами переменной валентности при внутрибрюшшшом введении (табл.1). Наименьшей токсичностью среди комплексов ГК с металлами обладало соедине] ГК-Мп- 450 (380 -f 520) мг/кг дня мышей и 350 (283 i 417) иг/кг - для крыс.

Таблиц

Острая токсичность (по Лнтчфилду-Уилкоксону) гиалуроновой

кислоты и ее соединений с металлами переменной валентности для белы:

мышей и крыс

Препарат LDS0 (мг/кг)

мыши крысы

ГК > 1000 > 1000

ГК-Мп 450 (380 f 520) 350 (283 т 417)

ГК-Со 260 (210-f 310) 210 (172-f 248)

ГК-Fe 257 (218 -f 296) 180 (155 f 205)

ГК-Zn 125 (104 т 146) 90 (69 т 111)

ГК-Ni 125 (100 -î 150) 84 (68 ~ 100)

ГК-Cu 19 (15 т23) 14 (12-Мб)

Примечание. ГК - Мп, ГК - Со, ГК - Тл и т.д. ~ комплексное соединение гиалуроновой кисло с соответствующим металлом.

Антитоксические свойства комплексов ГК были изучены на модели острого отра ления белых неинбредных мышей фенолом (табл.2). Животные получали соедин<

ння ГК с металлами в дозе ОД LD5() за 30 минут до введения фенола per os в абсолютно смертельной дозе (1,5 LDS1 430 мг/кг). Подопытных мышей наблюдали в течение суток, фиксировали выживаемость и среднюю продолжительность жизни павших животных.

Таблица 2.

Защитная эффективность комплексных соединений гиалуроновой кислоты с металлами переменной валентности при отравлении __белых мышей фенолом _

№ Группп Кол-во Выжило Пало Длительность жизни

шп животных животных (в течение (в течение павших

суток) суток) животных (мин.)

1 Фенол 20 0 20 21+3*

2 ГК + фенол 20 5 15 81+6 *

3 ГК-Мп + фенол 20 10 10 123+12* *

4 ГК-Со + фенол 20 8 12 115+14*"

5 ГК-2п + фенол 20 6 14 105+9 *

6 ГК-Ре + фенол 20 0 20 33+8 *

7 ГК-№ + фенол 20 0 20 29+5*

о о ГК-Си фенол 20 0 20 22+4*

Примечание: * - статистически достоверные различия по отношению к первой группе, * - по отношению ко второй группе..

Представляется важным, что гиалуроновая кислота при индивидуальном применении защищала 25% животных и в 3 раза увеличивала среднюю продолжительность жизни павших мышей по сравнению с незащищенной группой. Наибольшую защитную эффективность проявил комплекс ГК-Mn, который обеспечивал выживаемость 50% животных при наибольшей средней продолжительности жизни павших мышей (123 +12 минуты, Р < 0,05). На втором месте по эффективности оказалось соединение ГК-Со (выживаемость 40%, продолжительность жизни 115 +14 минут, Р < 0,05), а на третьем - ГК-Zn (выживаемость 30%, продолжительность жизни 105 +9 минут). Комплексы ГК с железом, никелем и медью не защищали животных от острого отравления фенолом. В этой связи в дальнейших сериях экспериментов нами изучалось действие комплексных соединений гиалуроновой кислоты только с Zn, Со, Мл.

В литературе описана способность гиалуроновой кислоты и других гликоза-миногликанов как полианионов связывать в межклеточном матрнкее гидрофильные вещества, ограждая таким образом клетки от различных неблагоприятных воздействий (Лабори Г.,1970; Башкатов С. А.,1996). В связи с этим нами было предпринято изучение противовоспалительной активности у исследуемых соединений. Прове-

денные эксперименты подтвердили их антифлогистичекую активность (табл.3). Как видно го приведенных данных, через 5 часов после введения наибольшей э<| фективностью обладало соединение ГК - Мл (Р < 0,05).

Таблш

Противовоспалительная активность гиалуроповой кислоты (п = 6)

Модель воспаления Процент'увеличения отека

Нелеченые Леченные ГК Леченные ПС-Мл Леченные ГК-Со Леченные гк-гп

Каррагениновое 46,3+7,4 29,1+3,5* 15,4+2,7* 33,7+5,5 34,6±6,1

Формалиновое 36,9+5,7 17,7+5,4* 13,1+2,1* 19,3+4,2 20,2±5,3

Приемчание: * - статистически достоверные различия с нелеченой группой.

С целью уточнения механизма противовоспалительной активности мы опред{ ли в сыворотке крови уровень кортизола. Введение ГК интактным мышам повьп ло уровень этого гормона через 1 час после начала эксперимента на 20,1 + 2,1% через 3 часа - на 31,1 + 3,0 % и через 5 часов - на 35,4 + 3,0 %.

После моделирования формалинового воспаления содержание кортизола е крови возрастало незначительно - до 114% (109+ 12 нМ) к пятому часу наблюл ния.У мышей с воспалением, леченных ГК, концентрация этого гормона в крови была выше показателей интактных животных: через 1 час после начала опыта -, 130% (143 + 20 нМ), через 3 часа - на 41 % (148 + 11 нМ, Р < 0,05)и через 5 часо! на 47% (141 + 22 нМ). Применение комплексов гиалуроповой кислоты с металла переменной валентности в качестве антифлогистика также способствовало повы шению уровня кортизола в сыворотке крови. Наибольший эффект отмечался пр использовании в качестве противовоспалительного средства ГК-Мп, в меньшей степени - ГК - Со и еще менее -ГК с ¿п .

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о наличии выражет противовоспалительной активности у гиалуроновой кислоты и ее комплексов с г-таллами переменной валентности при парентеральном введении, в механизмах к торого существенную роль играет их воздействие на секрецию глюкокортикоид< Результаты наших исследований согласуются со сведениями, полученным Неделькой А.Ф. и соавт. (1999), изучавшими в клинике фармакологическую акп ность соединения гиалуроновой кислоты с цинком в комплексном лечении ожог глаз и кожи век. При этом, исследуемый препарат проявлял антисептическое дei вие, обеспечивал оптимальные условия для заживления поврежденных тканей, с мулирозал ангиогенез и регенерацию тканей. Использование препарата цинк-ГК для лечения ожогов глазного яблока и его защитного аппарата позволило получи

>олее благоприятные исходы, сократить сроки лечения больных при ожогах глаз • гегкой и средней степени.

Известно, что гиалуроновая кислота в частности и гликозаминогликаны в це-юм поступают в клетку путем эндоцитоза (Булычев А.Г.,1991; Авцын А.П. и ф.,1991), деполимеризуются в лизосомах до гексуроновых кислот и гексозами-юв.Уроновая кислота метаболизируется сопряженно с пентозофосфатпым циклом Лабори Г., 1970), поставляющим восстановленный НАДФ и рибозу-5-фосфат для жосинтетических процессов. Глюкозамин, в свою очередь, фосфоршгаруясь под «шянием специального изоэнзима гексоккназы, имеющегося в гепатоцитах Мильман Л.С., Юровицкий Ю.Г., 1973; Бойтлер Э.31981), может существенно :нижать потребление фруктозо-б-фосфата, а в конечном итоге глюкозо-б-фосфата ia образование глюкозамин-6-фосфата, активно используемого в клетке на биосинтез гдикоиротеидов и ГАГ. Таким образом, дальнейший метаболизм обоих струк-[урных комплексов, образующихся при внутриклеточной деградации ГК, интимно ;вязан с дихотомическим и апотомическим путями углеводного обмена. Поэтому тредставлялось целесообразным изучение влияния гиалуроновой кислоты на содержание НАДФ, НАДФ-Н и активность некоторых ферментов углеводно энергети-îecKoro обмена.

Выполненный эксперимент подтвердил определенные энергетические выгода метаболизма гиалуроновой кислоты: введение интактиым животным ГК приво-хпло к достоверному повышению содержания НАДФ-Н и снижению уровня НАДФ } печени через 3 часа после начала эксперимента. Использование комплексов ГК с металлами переменной валентности приводило к однонаправленным изменениям в печени уровня восстановленных и окисленных НАДФ, НАДФ-Н (табл.4).

Таблица 4.

Влияние ГК и ее соединений иа уровень НАДФ и НАДФ-Н в печени крыс (нМ/г)

Соединения

>=6) Контроль ГК ГК-Мл ГК-Со Гк-Zn

Содержание ЗАДФ 137,4±8.S 108,3+9,0* 94,9*10, I* 104,б±10,б* 109,1+8,1*

Содержание МДФ-Н 507,1+40,3 643,5+43.7* 734,3±48,9* 665,3±39,8* 638,4±41,б*

Примечание: * - различия с контролем статистически достоверны.

Профилактическое введение ГК и ее препаратов при отравлении фенолом препятствовало снижению содержания НАДФ-Н пропорционально их воздействии на величину этого показателя у интакгных животных. Так, у незащищенных отравленных фенолом животных соотношение НАДФ-Н /НАДФ уменьшалось через тр! часа до 37%. Применение ГК, ее соединений с марганцем, кобальтом и цинком препятствовало падению данного коэффициента и сохраняло этот показатель на уровне 44%, 67%, 51% и 46% соответственно.

Воздействие ГК и ее соединений с металлами на интакгных животных привс дило к изменению активности пиридинзависимых ферментов углеводно-энергетического обмена (табл. 5).

Таблица 5

Влияние ГК и ее производных на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназь в печени крыс (иМ/мин мг белка)

1! ■г> Соединения

Контроль ГК ГК-Мя ГК-Со гк-гп

Г-6-фДГ 18,31+1,47 23,3±1,63* 23,5+1,77* 23,8+1,75* 23,1+1,52*

Прнме,алис: * - различия с контролен статистически достоверны.

Отравление животных фенолом, приводило к существенному снижению активности Г-б-фДГ в печени . У этих крыс сохранялось лишь 56% (10,2 + 3,20 нМ/мин мг белка, Р < 0,05) активности фермента. У подопытных крыс, получавшг ГК и ее комплексы с металлами переменной валентности, она была значительно выше и оставалась на уровне 70-75% (ГК - 73% (13,4 +1,61 нМ/мин мг белка), ГК-Мп -71% (13,01 + 1,85 нМ/мин мг белка), ГК-Со - 78% (14,30 ± 0,91 нМ/мин мг белка), ГК-гп - 75% (13,72 ± 1,32 нМ/мин мг белка), Р < 0,05) (рис.1).

нМ/мин

Рис. 1. Влияние ГК и ее производных на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени крыс, отравленных фенолом.

Полученные данные о динамике содержания НАДФ и НАДФ-Н, активности НАДФ-зависимого фермента Г-6-фДГ, свидетельствуют об воздействии ГК и ее комплексов с металлами на пентозофосфатный метаболический путь, а также на уровень восстановленных и окисленных форм пиридиновых нуклсотндов.

Острое отравление фенолом на 30% (323 ± 48 мкМ НАДН/ мин мг белка, Р < 0,05) снижало активность в печени лакгатдегадрогеназы. Профилактическое применение ГК и ее препаратов несколько уменьшало токсическое действие фенола, в частности ГК-Мп доводило, этот показатель до 393 ± 37 мкМ НАДН/ мин мг белка.

Влияние гаалуроновоя кислоты и комплексных препаратов этого полисахарида с металлами переменной валентности на активность НАДФ- специфической де-карбоксилиругощей малатдегидрогеназы (МДГ), содержащей в своем составе марганец, было неодинаковым. Соединение ГК-Мп доводило этот показатель до 153,7 % (52,74 + 5,77 нМ/мин мг белка, Р < 0,05) по сравнению с контролем, в то время как гиалуроновая кислота и ее соединения с кобальтом и цинком увеличивали активность МДГ соответственно лишь на 15,1% (39,5 ± 1,63 нМ/мин мг белка), 16,6% (40,03 ± 3,75 нМ/мин мг белка) и 14,1 % (39,1 ± 3,52 нМ/мин мг белка). Поскольку. это обусловлено тем, что марганец в комплексе с ГК активно путем эндо-цитоза поступал в гепатощпы и эффект препарата складывался из воздействий металла и полисахариднсго компонента. Сказанное под тверждается выраженным антагонизмом комплекса ГК -Мд в отношении иигибирующего МДГ воздействием фенолом: отравление фенолом существенно снижало активность МДГ, профилактическое введение ГК-Мп стабилизировало этот показатель максимально по сравне-. шло с другими соединениями (Рис. 2).

нМ/мин на мг белка 40

Контроль Фенол ГК ГК-Мп ГК-Со

Рис. 2. Влияние ГК и ее производных на активность малатдегидрогеназы в печени крыс, отравленных фенолом.

гк-гп

Полученные данные свидетельствуют о том, что гиалуроновая кислота и ее комплексы с Мп, 2л и Со проявляет фармакологические свойства, характерные для глшсозаминогликанов, а именно: антитоксическую и противовоспалительную активность, в механизмах которой существенная роль принадлежит стабилизации биологических мембран, изменению метаболизма гексозаминов и реакций пентозо-фосфатного метаболического цикла.

В отдельной серии опытов'изучалось влияние ГК и ее комплексов с металлами на токсикокинетику фенола. При этом мы исходили из данных, что максимум метаболизма фенола в организме приходится на третий час после его введения (Га-даскина И.Д., Филов В.А.,1971), оценивали степень радиоактивности 3Н-фепола, введенного в дрозе ЬБ5о, в крови и печени крыс именно через 3 часа после острого отравления (табл. 6). Полученные данные позволили констатировать, что гиалуроновая кислота ускоряла метаболизм фенола, приводя к снижению радиоактивности в печет и увеличению ее в сыворотке крови. Преднизолон по своей эффективности напоминал ГК. Комбинация ГК с преднизолоном проявляла еще большую эффективность. Соединения ГК с металлами при индивидуальном введении и в сочетании с преднизолоном также усиливали метаболизм фенола. Наибольшая эффективность выявилась при комбинации ГК-Мп с преднизолоном.

Таблица 6.

Влияние препаратов на радиоактивность (ерш) в крови и печени, __________________________I п з„ А______

Группа Фе- ГК П гк+п Мп Мп+ Со Со+П га 2а+И

(п=б) нол П

Кровь 32103 70795 47154 5967 5196 3420 24833 17783 10011 8710

кмп/5 уин/ ил 4- + ± О. 4- Л. ±

3187 7534* 3773* 488* 512* 366* 2517 3516* 964* 843*

Печень 12483 7244 7943 3394 3466 2912 6278 5220 6112 4995

ямд^5 иик/ г ± + ± ± ± ± ± ± + +

1339 805* 698* 372« 379* 314* 939* 522* 635* 475*

Примечание: * - различия с группой «фенол» статистически достоверны; ерш. - количество импульсов в минуту.

Повышение радиоактивности крови животных подопытных групп по сравнению с контрольной (фенол), по-видимому, обусловлена интенсивно образующимися 3Н-фенилглюкуронидами, что подтверждается данными прямого определения содержания глюкуронидов в сыворотке крови и печени. Отравление фенолом приводит к резкому повышению уровня уроновых кислот в печени и в сыворотке крови, что свидетельствует об интенсификации процессов глюкуронидной конъюгации. Использование ГК, ее соединений с металлами переменной валентности и комбиниро-

¡ание их введения с преднизолопом способствовали дальнейшему усилению этого iponecca. В этой серии экспериментов наибольшей эффективностью обладало сомбинирование введения комплекса ГК-Ма и преднизалона.

Интоксикация животных фенолом приводила к изменению содержания цито-ромов Р-450 и Ь5 в печени и сыворотке крови: их уровни повышались в крови и яижались в печени. Применение ПС, ее соединений с металлами и преднизолона нижало данный эффект фенольного отравления. Сочетание же препаратов ПС с реднизолоном обладало при этом большей эффективностью. Наиболее выражение действие наблюдалось при применении комбинации ГК-Mn с преднизолоном. 'ак, если в группе крыс, подвергнутых только действию фенола, уровнь цитохро-гов Р-450 и Ь5 снижались в печени соответственно на 39,8% и 60,2% (Р < 0,05), то животных, получавших ГК-Mn + преднизолон, снижение этих показателей соста-ило лишь 15,1% и 20,7%. Возрастание концентрации иитохромов Р-450 и Ь5 в кроя, указанной группы крыс также было менее выражено и составило соответственно 23,1% (0.560 ± 0,013 мкМ/г) и 153,8% (0,123 ±0,032 мкМ/г) (у нелеченых живот-ых 183,8% (0,239 + 0,021 мкМ/г) и 222,5% (0,178 ± 0,021 мкМ/г)) по отношению к эовню у интакгпьк -животных..

Таким образом, изучение содержания в печени микросомальных ферментов -ятохромов Р-450 и Ь5 активности ммтохондриальной НАДФ-завксимой МДГ и ттоллазматических растворимых ферментов - ЛДГ и Г-6-фДГ свидетельствуют о 1билизации различных биомембрал клетки при действии острых ток-сических доз енола. Субстраты комплексных соединений ГК с Mn, Zn, и Со, как и самой ГК, эепятствуя снижению содержания исследуемых ферментов в печени при действии гнола, оказывают мембранопротекторное действие.

Другим важным механизмом действия вводимых препаратов ГК и ее комплек-1в с металлами явилось выраженное влияние на общее содержание и фракцион-,ш состав в печени и сыворотке крови эндогенных ГАГ. Острое отравление крыс аволом существенно уменьшало содержание ГАГ в печени на 59,5% и повышало в гооротке крови крыс на 160,2%. Применение препаратов ГК и преднизолона, а кже их комбинаций способствовало торможению этих биохимических сдвигов.

Одновременно при отравлении фенолом были выявлены сдвиги содержания дельных фракций ГАГ. Так, в печенн более 2 раза увеличивалась фракция гиалу-новой кислоты, уменьшалась доля хондроитинсульфатов в 1,6 раза, а фракция пгарансульфатов обнаруживалась лишь в следовых количествах (табл.7).

Аналогичная динамика смещений фракций ГАГ наблюдались и в сыворотке крови. Среда изучаемых соединений наиболее эффективным действием обладал комплекс ГК с Мп, введение которого статистически значимо предотвращало не только падение общего содержания ГАГ в печени, но и более выражено, чем друп; использованные в опытах соединения ГК, приближал к норме фракционный состаг ГАГ.

Таблица

Влияние препаратов на содержание фракций ГАГ (мкМ/г) в печени крыс

через 3 часа досле отравления фенолом в дозе ЬРбо

Группа Кон- Фе- ПС п ГК+П Мп Мп+П Со Со+П гп 2п+П

(п=6) троль нол

ГАГ 0,726 0,163 0,222 0,370 0,431 0,433 0,667 0,262 0,303 0,269 0,347

± + + + + ± ± ± + + ±

0,082 0,021 0,018 0,043 0,055 0,047 0,081 0,024 0,044 0,037 0,041

* * * * * * 4 * *

ГК 0,220 У, 102 0,149 0,114 • 0,144 0,152 0,390 •0,097 0Д22 0,096 6,142

± 4- ± ± ± ± + ± + х ±

0,05 0,013 0,22* 0,015 0,027 0,026 0,031 0,012 0,009 0,008 0,011

* * * * ■ * * * *

ХС 0,421 0,061 0,073 0,135 0,194 0,219 0,217 0,132 0,139 0,149 0,174

+ ± + • + ± ± ± + ± ± ±

0,06 0,008 0,006 0,009 0,028 0,033 0,030 0.009 0.021 0.019 0.021

* * * * * * * * ч *

ГС 0,085 0,003 0,004 0,121 0,092 0,024 0.063 0,033 0,039 0,024 0,031

+ + ± + ± " ± + + + ±

0,007 0,001 0,001 0,020 0,008 0,004 0,009 0,004 0,005 0.003 0.002

* * * * *

Примечание: * - статистически достоверные различия с группой "контроль"; Мл, Со и - соединения ГК с этими металлами.

Учитывая указанное мембравостабнлизирующее влияние изучаемых соединений, и с целью уточнения механизмов токсического действия фенола нами была ис следовала микровязкость мембран эритроцитов у крыс через три часа после отравления фенолом. Полученные результаты позволили констатировать выраженное уменьшение вязкости биомембран и подтверждают данные о том, что в молекулярных механизмах токсического действия фенола одно из ведущих мест принадлежи: дестабилизации биологических мембран (Назаров П.В., Лидер В.А., 3996 г.). Об этом свидетельствуют изменения лшшдного состава мембран печени и других тка ней с нарастанием при введении фенола фосфатидилсерина, фосфатвдных кислот, лизофосфолипидов с уменьшением содержания фосфатидилхолина и сфингомиели на. Одновременно происходит снижение уровня ненасыщенных жирных кислот и увеличение концентрации свободного холестерина.Авторы полагают, что наиболее

вероятным механизмом действия фенола является инициирование в мембранах пе-рекисного окисления липидов в результате пепосредствешгого взаимодействия кислотного центра фенола с полиненасьпценньши жирными кислотами, входящими в состав фосфолипидов биологических мембран. Вероятнее всего, что фенол с поли-аенасыщенными жирными кислотами образуют 71-комплексы, и такое встраивание жесткого» каркаса фенола в мембрану приводит к разобщению отдельных молекул з фосфолишшюм бислое с изменением избирательной проницаемости, а также ак-гавности ферментных комплексов интегральных и периферических белков. Не ис-опочено, что фенол сам инициирует в мембранах реакции перекисного окисления шпидов. Эти рассуждения не противоречат данным о том, что даже после одно-сратного подкожного введения фенола в дозе 50 мг/кг у крыс в различных тканях головной мозг, сердце, легкие, печень, селезенка, почки, плазма крови) обнаружи-¡ается значительный рост уровня ТБК - активных соединений ( Голиков С.Н. и др., 986 ; Бадгкатов С.А., 1997), уменьшается кислотная резистентность эритроцитов, одержание белковых и не белковых сульфгидрильных групп (Корнеева Р.В., Паль-шна Н.П., 1989). Следствием является заметное изменение качественного состава ипидной, а позднее и белковой фазы мембран с нарастанием их ригидности, нару-гениями текучести и хомпартменталюация. Важно, что имеется зависимость межу количеством введенного фенола и глубиной качественных изменений мембран-ых фосфолипидов ( Назаров П.В., 1998).

Таким образом, в целом полученные нами данные о лабилизации ферментов азличных субклеточных структур и изменении физико-химических свойств эрит-огитарных мембран при отравлении животных фенолом подтверждают концеп-ию о роли активации перезшсного окисления липидов как общего механизма iük-мности при действии различных экзотоксикантов в условиях острого и хрониче-сого их действия (Мышкин В А, 1998; Мышкин В. А., Камилов Ф.Х., 1997).

Все исследованные препараты и их сочетания проявляли антагонизм в отноше-öi этого воздействия фенола, однако наиболее эффективное мембранопротекгор-)е свойства показала комбинация комплексного соединения ГК с марганцем в соланин с преднизолоном.

Таким образом, комплексы ГК с Mn, Со, Za при внутрибрюшинном введении спериментальным животным в дозе 10 мг/кг оказывали фармакологический )фекг, в ряде случаев более выраженной, чем субстанция чистой ГК. Особенно юспекгавными в этом отношении являются комплексы ГК с Мп и Zn. Связано ли о с активным влиянием самих металлов (Mn,Zn) на обмен ГАГ в коже соедини-

тельной, хрящевой, костной и других тканях (Во!хе M.S. et all., 1987; Yang P., Klimis -Tavanzis D.J., 1998), а также более широким метаболическим спектром их действия на организм, требует дальнейших целенаправленных исследований.

Среди молекулярных механизмов действия, изучаемых соединений гиалуроно-вой кислоты при остром отравлении фенолом, существенную роль шрают их способность стабилизировать плазматические мембраны и мембраны субклеточных структур, усиление связывания и детоксикации фенола, стабилизация системы эндогенных гликозаминогликанов. Определенное значение в фармакологических эффектах комплексов ГК с металлами имеет и стимуляция при их введении секреции глюкохортикоядов. Вводимые в организм извне препараты гиалуроновой кислоты, поступая в клепш и подвергаясь деполимеризации, образуют продукты, активно влияющие на метаболизм гексозофосфагов и их производных. При этом изменяется соотношение уровней восстановленных и ские,шЗКгГпТл пиридиновых нуклеоткдов, происходит, вероятно, перераспределение метаболических потоков использования углеводов в клетке.

В заключение отметим, что соединения из класса гликозаминогликанов и, в частности, их соединения с металлами переменной валентности в силу своей фармакологической активности и безопасности перспективны для дальнейшего изучения в качестве адаптагенов с целью создания на их основе новых эффективных лекарственных препаратов, повышающих устойчивость организма к действию неблагоприятных факторов.

ВЫВОДЫ

1. В патохимическом механизме токсичности фепола существенное значение имеет дестабилизация биологических мембран. Об этом свидетельствуют многократное снижение интенсивности флуоресценции отрена в мембранах эритроцитов при остром отравлении фенолом, а также снижение в печени экспериментальных животных содержания микросомальных цитохромов Р-450 и Ь5, активности ми-тохондриальной малатдегидрогеназы и цитоплазматаческих глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и лакгатдегидрогеназы на фоне возрастания в сыворотке крови содержания цитохромов Р-450 и Ь5.

2. Отравление фенолом в дозе LD50 приводит к резкому падению в печени содержания ГАГ с существенным сдвигом фракционного состава. При этом в сыворотке крови животных с интоксикацией выявляется повышение как общего содержания, так и отдельных фракций ГАГ.

5. Гиалуроновая кислота и ее соединения по токсичности располагаются в следующем порядке: гиалуроновая кислота, комплексы гиалуроновой кислоты с марганцем, кобальтом, цинком, никелем и медью.

I. Комплексные соединения гиалуроновой кислоты с марганцем, цинком и кобальтом проявляют защитный эффект при остром отравлении фенолом в дозе 1,51Л)50, способствуют увеличению продолжительности жизни и выживаемости животных.

¡. Комплексные соединения гиалуроновой кислоты с металлами переменной валентности (Мп,Со,2Ь1) проявляют противовоспалительное действие.

>. В основе молекулярных эффектов гиалуроновой кислоты и ее комплексов с Мп, 7х1, Со лежат мембраносгабилизирующие действия, и сдвиг в соотношении окисленных и восстановленных форм пиридиновых нуклеотидов, а также ускорение метаболизма и выведения фенола.

'. Применение комплексных соединений гиалуроновой кислоты с металлами переменной валентности (Мп, Со, 2п) при острой интоксикации фенолом оказывает выраженное стабилизирующее влияние на систему эндогенных глтеозамивог-ликанов.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Биохимические эффекты гиалуроновой кислоты, сопряженные с пентозофосфат-ным циклом // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии /Мат-лы конф.биохнмиков Урала, Поволжья и Западной Сибири.-Челябинск, 1959.-0.12-15 (сбавт. Б откатов С. А., Азпабаев Б.М., Камвлов Ф.Х. и др.); Сопряженность метаболизма гиалуроновой кислоты с функционированием системы цитохрома Р-450 // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии /Мат-лы конф.биохимиков Урала, Поволжья н Западной Снбири.-Челябинск,1999.-С.16-19. (соавт. Башкатов С.А., Азнабаев Б.М., Камилов Ф.Х. и ДР-)-

Антитоксические эффекты комплексов металлов переменной валентности с гиалуроновой килотой /Сборник научных трудов БГАУ,- Уфа. 2000- стр. 226-227 (соавт. Башкатов С.А..)