Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности белкового комплекса зерна проса и идентификация морфотипов по маркерным генам

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Особенности белкового комплекса зерна проса и идентификация морфотипов по маркерным генам"

| * На правах рукописи^

¥

КОНОВ Сергей Александрович

ОСОБЕННОСТИ БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА ЗЕРНА ПРОСА И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОРФОТИПОВ ПО МАРКЕРНЫМ ГЕНАМ

Специальность 03.00.12 — физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лабораториях биохимии и селекции проса Всероссийского научно-исстедоватечьского института зернобобовых и крупяных культур

Научные руководители:

доктор биологических наук Н Е Павловская кандидат сельскохозяйственных наук В С Сидоренко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Новиков Н Н

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Азаркович М И

Ведущее учреждение:

Главный Ботаническии сад им Н В Циаина РАН

Защита состоится « » мая 2005г в часов на тседании дис-

сертационного совета Д 220 04308 при Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева по адресу 127550, Москва, ут Тимирязевская 4е) Ученый совет МСХА

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

//

Автореферат разослан «_» апреля 2005г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

✓ ^ _ С. ^ --нп Карсункина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время возникла ситуация, в результате которой практически не учитывается качество белка зерна проса, которое по вкусовым и пищевым достоинствам является денным и недорогим продуктом питания. Проблема повышения содержания белка и улучшения его качества- в зерне проса заключается в выявлении и создании новых форм, источников ценных биохимических свойств и их идентификации.

Изучение запасных белков проса позволит разработать способы идентификации генотипов и выявить сопряженность изменчивости состава данных белков с морфофизиологическими показателями, определяющими продуктивность растений. Полигенная природа большинства признаков ограничивает возможности генетического маркирования и контроля за переносом полезных генов в новые формы растений. Данных об использовании белковых и ДНК ло-кусов как генетических маркеров хозяйственно значимых признаков, крайне недостаточно, а вопросы ценности различных аллелей в отношении пищевых и кормовых достоинств зерна проса вообще не исследованы. Информацию о биохимических особенностях белкового комплекса и применении современных методов идентификации исходного и гибридного материала необходимо целенаправленно использовать при разработке новых селекционных технологий.

Диссертационная работа выполнена в рамках задания 08.02.03 «Провести комплексную биохимическую и технологическую оценку генофондов зернобобовых и крупяных культур, выделить источники высокобелковости, провести идентификацию сортов гороха, проса и гречихи по белковым формулам и ДНК-маркерам» по программе НИР Россельхозакадемии на 2001.. .2005 гг.

Цель и задачи исследований. Цель данной работы - определение особенностей различных морфотипов проса по содержанию и составу белка, выявление полиморфизма фракций запасных белков и идентификация генотипов с маркерными генами.

Для этого решались следующие задачи:

1 провести оценку генетической коллекции проса по продуктивности, морфофизиологическим показателям, содержанию и составу запасных белков;

2 установить различия между изучаемыми генотипами по содержанию

отдельных аминокислот и выявить связь между ними;

3 изучить полиморфизм фракций запасных белков проса; ■.•■■■

4 установить отличия генотипов от стандарта по белковым спектрам;

5 определить возможность использования ПЦР анализа для идентификации просовидньгс культур и генотипов проса;

6 выделить новый ценный исходный материя д г мярк-ррнт.тми генами.

ЦН5 МС5СД Фопд ЭДГОуй лотгрзтуры

МО

Научная новизна работы. Установлено, что процессы накопления белка в зерне проса посевного имеют отрицательную связь с морфофизиологически-ми показателями, определяющими продуктивность растений.

Впервые при изучении полуизогенных линий проса выявлены повышенное содержание бетеа у генотипов с рецессивными аллелями мутантных генов тр, м/ Установлены особенности аминокислотного состава белков проса и проведена группировка генотипов по соотношению отдельных блоков аминокислот, влияющих на адаптивные свойства и пищевую ценность зерна Проведена идентификация генотипов проса по фракциям запасных белков и установлена степень отличия в электрофоретических спектрах от сорта стандарта Благодатное Впервые обнаружен ДНК маркер мутантного гена тр, указывающий на повышенное содержание белка. Используя ПЦР анализ ДНК, подтверждена возможность идентификации гибридов проса посевного и проса итальянского

Практическая значимость и реализация результатов исследований. Выявлен ценный исходный материал с повышенным содержанием белка и отдельных незаменимых аминокислот. Предложен новый подход для подбора родительских пар при создании генотипов с улучшенным качеством белков и возможным увеличением выхода белка с единицы площади

Показана возможность применения белковых и ДНК маркеров для филогенетических исследований проса посевного и выявления высокобелковых форм При разработке новых селекционных технологий предложен комплексный подход для отбора генотипов проса на основе электрофоретического анализа запасных белков и их идентификации с помощью полимеразной реакции (ПЦР) Создан и передан на Государственное сортоиспытание новый высокобелковый сорт проса Вельсовское

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология — состояние и перспективы развития» (Москва 2002), на V съезде общества физиологов растений России и на международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), на научно-практической конференции молодых ученых и аспирантов «Биологические основы современной агрономии» (Орел, 2004), на научно-методической конференции «Физиологические аспекты продуктивности растений» (Орел, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах и включает введение, обзор литературы, материал и методику исследований, три главы экспериментальной части, выводы, практические рекомендации, Работа содержит 16 таблиц и 21 рисунок. Список литературы, включает 183 источника из которых 33 на иностранном языке

Условна, материал и методы исследований

Научно-исследовательская работа выполнена в ГНЦ ГНУ ВНИИЗБК в 2001-2004 гг. Экспериментальные посевы были размещены в селекционном севообороте лаборатории селекции проса и условиях искусственного климата селекционно-тепличного комплекса ВНИИЗБК.

Метеорологические условия 2001 г. характеризовались пониженными температурами в начале и в конце периода вегетации, в середине преобладала тёплая, временами жаркая погода. В 2002 г. отмечалась резко выраженная почвенная засуха, особенно во второй половине вегетационного периода. Погодные условия 2003 г. были прохладными, преимущественно дождливыми, неблагоприятными для теплолюбивых просовидных культур.

Материалом исследований являлись полуизогенные линии, аналоги сорта Благодатное, созданные во ВНИИЗБК: компоненты мультилинейного сорта Квартет - линии SP1950, SP2007, SP1965, SP1963 (с генами резистентности к головне Spl, Sp2, Sp3, Sp4); с могарообразным типом метелки: М02172, MB1904 (с геном тр), соргообразным - С02171, КС02187 (с геном sd) и ДМ2083 (с генами тр, sd); с различной окраской зерна В2161 (коричневой), ЛД1906 (белой); с видоизмененными листьями СКЛ2183 (со скрученным листом), ХМ 2137 (с хлорофильной недостаточностью листьев) и ультраранний аналог УР2098-9; полиплоид сорта Благодатное (4п=72), а также сорта: Благодатное, Вельсовское (селекции ВНИИЗБК), Ильиновское (НИИСХ Юго-Востока). Впервые изучались особенности белкового комплекса полуизогенных линий проса посевного, созданных на почти однородном генетическом фоне.

Для ДНК анализа использовались указанные полуизогенные линии и сорта проса посевного (Panicum miliaceum L.), а также образцы основных просо-видных культур селекции ВНИИЗБК: просо африканское {Pennisetum glaucum L.), просо итальянское (Setaria italica L.) и межродовые гибриды (Setaria italica L. X Panicum miliaceum L.).

В лаборатории биохимии ВНИИЗБК проведены аналитические и биохимические исследования. Содержание белка в зерне проса определяли методом Къельдаля в модификации Ермакова (1987).

Аминокислотный анализ проводили на автоматическом аминокислотном анализаторе Hitachi 835. Навеску размолотых семян подвергали гидролизу в 6М НС1 особой чистоты при температуре +110°С в непрерывном токе аргона. Отношение навески к кислоте составляло 1:500. Продолжительность гидролиза 22-24 часа. По окончаннии гидролиза соляную кислоту удаляли под вакуумом, в токе аргона при температуре не выше +55°С.

Фракционирование белков по растворимости: солерастворимые белки извлекали из образцов тонкоразмолотого эндосперма путем обработки охлажден-

ных навесок трис-аскорбатным буфером pH 7 0 (1:10) дважды Глобулины отделяли от альбуминов путем осаждения при 50% насыщении раствора (NH4)2S04 на холоде в течение суток Осадок отдетяли центрифугированием, из супернатанта вылетали альбумины посредством осаждения при 70% насыщении раствора (NH4)2S04 Как альбумины, так и глобулины растворяли в буфере, содержащем 0,125 М трис-С1 pH 6,8, 4 % ДДС-Na, 20 % глицерол; 10 % 2-меркаптоэтанол Проламины извлекали 70% раствором спирта

SDS-электрофорез белков проводили при денатурирующих условиях (в присутствии 2-меркаптоэтанола) по стандартной методике (Laemmli, 1970)

Выделение ДНК проводили из молодых листьев проса с помощью набора реагентов DIAtom™ TMA Prep 100

ПЦР проводили в амплификаторе производства «БиоКом» с помощью сухого набора реагентов для ПЦР амплификации GenePak Universal Амплификация включала 1 цикл продолжительностью 2 мин денатурации при +94°С, 30 циклов (1 мин денатурации цепей ДНК при +94°С, 40 с отжига праймеров с матрицей при +50°С, 100 с синтеза комтементарных цепей ДНК при +72°С) и завершающего синтеза в течение 7 мин при +72°С Для разделения продуктов амплификации использовали электрофорез в 1,5%-ном агарозном геле

Математическую обработку данных проводили методами корреляционного, дисперсионного, вариационного анализов на ПК Данные по аминокислотному составу и бе тку статистически обрабатывали путем оценки существенности средней разности (сопряженные выборки) методом разностей попарных сравнений с показателями стандарта Благодатное и между собой по Б А Дос-пехову (1979), степень различий (CP) в аминокислотном составе по В Ф Семи-хову (1984) Существенные корреляции *, **, *** на уровнях 0,05, 0,01, 0,001

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Особенности белкового комплекса зерна различных морфотипов проса посевного.

Многолетними исследованиями во ВНИИЗБК отмечена несбалансированность протеина и установлен внутривидовой полиморфизм аминокислотного состава белка пшеницы, зернобобовых и крупяных культур Основным недостатком зерна злаковых культур является очень низкое содержание лизина В зерне проса содержание протеина составляет 10 . 15%, что несколько ниже чем у пшеницы, однако содержание незаменимых аминокислот (HAK) выше в 1,4...1,5 раза Несмотря на низкое содержание лизина, характерное для просо-видных культур, просо является одним из основных источников лейцина и превосходит по содержанию метионина большинство зерновых и зернобобовых культур Высокое содержание лейцина у проса в сравнении с пшеницей и дру-

! гими культурами связано прежде всего с различными типами проламинов, сложившихся в процессе эволюции видов семейства Роасеа (Семихов и др., 2000).

При анализе сортообразцов проса мировой коллекции ВИР выявлены источники из различных эколого-географических групп с повышенным содержанием белка и отдельных дефицитных незаменимых аминокислот. Однако, отсутствуют сведения о выявлении высокобелковых морфотипов и создании высокопродуктивных сортов с повышенным содержанием и улучшенным качеством белка.

Влияние морфофизиологических показателей растений на продуктивность н содержание белка в зерне проса. Современные сорта проса различного происхождения практически не отличаются по протеиновому комплексу, поэтому в наши исследования были включены полуизогенные линии с маркерными генами. Большинство изучаемых морфотипов не отличалась по длине вегетационного периода от исходной формы стандартного сорта Благодатное, за исключением среднепозднего сорта Ильиновское и оригинальной ультраранней линии УР2098-9.

Реализация потенциальной продуктивности растений, а также процесс накопления белка связаны с морфофизиологическими показателями. Сорта селекции ВНИИЗБК характеризуются оптимальной высотой и длинной метелки, высоким показателем массы зерна с растения, который обусловлен высоким уборочным индексом до 49% (Благодатное и Квартет). В отличии от них, у сорта Ильиновское, выращенного в нетипичной для него зоне, отмечена высокая сухая надземная биомасса, но снижение уборочного индекса до 40%.

Установлено, что у полуизогенных линий с мутантным типом метелки не сбалансированы процессы, связанные с накоплением и реутилизацией ассими-лятов - сухая надземная биомасса растения изменяется в широких пределах от 5,3 г до 13,7 г, отмечены колебания по показателю массы зерна с растения у отдельных форм: от 0,8 г/раст. у димутанта ДМ2083 до 5,2 г/раст. у соргообраз-ной формы С02171. Уборочный индекс, отражающий эффективность использования пластических веществ генеративными органами, у большинства морфотипов с мутантной формой метелки, а также у полиплоидной формы, находится в диапазоне от 12...24%. Исключением является мутантная линия со скрученными листьями СКЛ2183, которая при очень высоком уборочном индексе (57%) существенно уступает по продуктивности приведенным ранее сортам из-за очень низкого потенциала вегетативной массы. Ультраранняя форма УР2098-9 также отличается максимальным , уборочным индексом (58%), что указывает на высокий уровень интенсивности физиологических процессов, связанных с коротким периодом накопления пластических веществ в зерне (табл. 1).

Таблица 1

Морфофизиологическая характеристика сортов и линий проса, 2001-2003 гг

Сорта, тинии Продуктивность зерна, г/ м Сухая нал-земная масса, г/раст Масса зерна, г/раст Уборочный индекс, % Содержание бетаа в зерне, %

Сорта

Благодатное, ст 398 10,9 5,4 49 12,4

Вечьсовское 386 11,0 46 42 14,9

Ильиновское 372 14.0 56 40 12,9

Квартет 384 11,4 56 49 12.8

Полуизогенные іинии с мутантним типом метелки

МВ 1904 295 13.4 32 24 16,3

МО 2172 309 12 2 24 20 15 6

СО 2171 344 12 6 52 41 129

КСО 2187 213 13 7 3,1 23 14.8

СКЛ 2183 307 53 30 57 13,1

ДМ 2083 173 7.1 08 12 17,7

Линии с развесистым типом метелки

ХМ 2137 393 11,1 5,6 51 14,8

В 2161 364 10 4 52 50 12,5

ЛД 1906 370 10,6 43 41 12 8

УР 2098-9 170 24 1 4 58 15.5

Благодатное П 209 67 1,4 21 15 0

Среднее 312 10 2 3.8 38 14,3

Коэффициент вариации % 26,4 32,9 45,2 38,6 11,4

В представленном наборе сортов и линий наблюдается высокое варьирование по изучаемым морфофизиологическим показателям (32,9%, 45,2%, 38,6%), что указывает на значительное разнообразие морфотипов и играет важную роль для определения корреляций между этими характеристиками и их связью с продуктивностью растений и содержанием белка Коэффициенты вариации средних значений морфофизиологических показателей и содержания белка можно рассматривать, прежде всего, как генотипическое варьирование, поскольку модификационный компонент выровнен данными разных по погодным условиям лет. Незначительное варьирование сортов и линий по содержанию белка (11,4%) подтверждает невысокий уровень изменчивости по этому показателю изучаемого материала, что указывает на определенную сложность при выявлении внутривидового полиморфизма

Корреляционный анализ (табл 2) позволил установить, что высота растения, длина метечки, сухая надземная масса зерна положительно связанны между собой и продуктивностью зерна (г=0,45 ..0,71) Это указывает на сопряженность морфологических и физиологических показателей, которые в конечном

итоге обеспечивают определенную продуктивность морфотипа. Вместе с тем, отмечена слабая положительная связь уборочного индекса с длинной метелки и массой зерна с растения (г=0,43 и г=0,54) отсутствие связи с высотой растения (г=0,07) и наличие слабой, отрицательной связи с надземной массой растения (г=-0,27) и длинной вегетационного периода (г=-0,41). •

На продуктивность проса существенное влияние оказывает масса зерна с растения (г=0,91), также отмечены положительные средние и сильные корреляции со всеми изучаемыми показателями. Можно предположить, что селекционная работа по данной культуре была направлена, в первую очередь, на достижение урожайности за счет оптимизации процессов накопления и использования пластических веществ. Вместе с тем, заслуживает особого внимания наличие отрицательной корреляции содержания белка — от слабой с периодом вегетации и надземной биомассы (г= -0,22, г= -0,27) до сильной с массой зерна с растения (г= -0,73), что свидетельствует о сложности повышения содержания белка без снижения морфофизиологических показателей, определяющих высокую урожайность современных сортов проса.

Таблица 2

Коэффициенты корреляции морфофизиологических показателей с про-

дуктивностью и содержанием белка в зерне

Показатели • Продуктивность зерна Содержание белка

Период вегетации 0,38 -0,27

Сухая надземная масса 0,56* -0,22 -

Масса зерна 0,91** -0,73**

Уборочный индекс 0,45 -0,63*

Высота 0,71** " -0,44

Длина метелки 0,63* -0,60*

Вышеуказанные зависимости" обуславливают сильную отрицательную связь между продуктивностью и содержанием белка в зерне (г= - 0,70), что подтверждается аналогичными исследованиями при изучении селекционного материала Восточной лесостепи Украины, в которых также указывается на отрицательную взаимосвязь между данными показателями в различные годы г =-0,46...-0,55 (Горбачева, 1990,1994). .

Таким образом, можно сделать заключение, что процессы, связанные с накоплением белка и его качеством имеют отрицательную связь с морфофизио-логическими показателями и продуктивностью. Поэтому, с целью повышения содержания и качества белка в процессе селекции и для улучшения питательной ценности зерна проса, биохимические механизмы, связанные с белковым синтезом, требуют детального и всестороннего рассмотрения. ,

А.С. Образцов (2001) обращает внимание на то, что сбор протеина не всегда пропорционален урожаю биомассы. В условиях, не благоприятных для рос-

та растений, например в условиях засухи, прирост урожая замедляется в большей степени, чем накопление и сбор протеина В наших исследованиях установлена слабая отрицательная зависимость между содержанием белка и его сбором с единицы площади (г=-0,37) и сильная положительная - между урожайностью и сбором белка (г=+0,92)

Повышенное содержание белка в зерне и НАК в белке у мутантных форм компенсирует снижение урожайности и сбор белка с единицы площади ниже чем у сортов Это характерно и для высокобелковой димутантной формы ДМ2083, продуктивность которой почти в 2 раза меньше по сравнению с рек-курентным сортом Благодатное Это препятствует эффективному использованию высокобетковых мутантных форм проса непосредственно для получения более качественной продукции с учетом примерно одинаковых затрат при выращивании Перспективным решением проблемы увеличения сбора белка является привлечение в скрещивание нового сорта Вельсовское и линии ХМ2137, существенно превосходивших стандарт (на 14,6 и 17,3%) по данному показателю (табл. 3)

Таблица 3

Сбор и содержание белка сортов и полуизогенных линий проса, г/м2

Сорта и линии 2001г | 2002г 2003 г | Среднее | 1кст,%

г/м' ] % г м-1 1 % Г/м' °а 1 Г/М' 1 % 1 сбор 1 белок

Сорта

Благодатное, ст і 56 8 12 0 41.7 11.5 49 1 13 7 49,2 I 12 4

Вельсовское 55 1 12,0 , 56 2 16 0 58 0 16.7 56,4 1 14 9 14 6 20 2

Илышовское 63 7 14 4 | 44 3 і 13 1 37 2 11,1 48 4 12,9 -I 6 4,0

Квартет 1 57,6 12,6 , 43.4 |12 4| 45,7 13.2 48 9 1 12,8 -0 3 3.2

Полуизогенные тинин с мутантним типом метелки

МВ 1904 57,2 16 3 45.1 16.8 41.7, 15.7 48,0 16 3 I -2 4 31.5 26 5

МО 2172 55.5 і 15.1 43.9 15 6 45 1 16 2 1 48 1 15 6 -2 2

СО 2171 51.2 1 12 5 41 3 13 2 40.6 13.1 44,3 12,9 -10.0 4 0

КС02187 36,5 і 14 4 28.3 14 6 29 5 15 4 31.4 14 8 -36.2 19 3

СКЛ 2183 47,1 12,9 і 34,9 12.5 38 4 13.9 40 2 13.1 -18.3 56

ДМ 2083 35 8 1 17.4 , 29,9 19 0 26.2 16,8 30 6 17 7 -37.8 42.7

Линии с развесистым типом метелки

ХМ 2137 1 64 5 13.8 55,1 1 15 4 153,4 15.1 57 7 1 14 8 1 17 3 1 19 3

В 2161 48 9 11.3 45,7 і 13,8 41.0 12.5 45 2 12,5 | -8,1 і 1.5

ЛД 1906 60,3 13,7 37,7 11,2 45 ЗІ 13 6 47 8 12,8 і -2,8 1 3,2

УР 2098-9 26,7 13.2 28.9 1 18,7 22,3 14 6 26,0 15,5 1 -47 2 і 25.0

Благодатное П 38,3 15.4 28,1 1 14,8 28,0 14,9_ 31,5 15,0 -36 01 21 0

НСР05 1 4,91 | 1.6 4 81 | 2.1 3,89 1.7 1

Генетически обусловленные различия стали основой для детального изучения белкового комплекса, выявления внутривидового полиморфизма и определения источников для улучшения качества зерна проса

За годы исследований, несмотря на различные погодные условия, в опытах среднее значение содержания белка изменялось незначительно (13,6...14,2%), содержание HAK в белке - 34,1...35,8%. Мугантные формы как по содержанию белка, так и по содержанию HAK по годам отличались от стандарта. У сорта проса Благодатное и линии мультилинейного сорта Квартет с генами устойчивости к головне (Sp), адаптированных к условиям выращивания, содержание белка по годам изменялось от 12,2 до 13,7%. Южный экотип проса (сорт Ильиновское) в 2001 и 2002 гг. превысил стандарт Благодатное по содержанию белка в зерне, но в условиях влажного 2003 года у него наблюдалось резкое снижение этого показателя до 11,1%, хотя по среднему значению за 3 года он был на уровне стандарта. Тенденция снижения количества белка во влажные годы и повышения его накопления в жарких засушливых условиях отмечена при изучении коллекций ВИР (Ярош, 1977; Курцева, 1985; Подвезько, 1988). ,

Аминокислотный состав белка в зерне проса. В наших исследованиях установлена более значительная роль генетических факторов на содержание белка, чем влияние погодных условий, что обусловлено нормой реакции полу-изогенных линий, содержащих мутантные гены. Однако, некоторые сортооб-разцы, несмотря на высокое содержание белка, имели низкое значение суммы HAK: MB 1904, КСО 2187, ХМ 2137. У образцов ЛД 1906, SP 2007, ДМ 2083 наблюдалось высокое значение этого показателя, хотя линия ЛД1906, несмотря на высокое содержание HAK, имела пониженное содержание протеина. Диму-тантная форма ДМ 2083 отличалась наиболее высоким значением HAK в сочетании с максимальным содержанием белка в зерне.

Установлена высокая положительная корреляция между данными по содержанию белка в зерне по годам (г=+0,54...+0,65) и со средним значением за три года (г=+0,81, +0,90, +0,84). Показатель суммы HAK между годами имеет очень слабую положительную корреляцию (г=+0,1...+0,20). Вместе с тем, среднее значение содержания HAK имеет высокую положительную корреляцию с данными по годам исследований, соответственно (г=+0,59, г=+0,57, г=+0,79), что подтверждает необходимость многолетнего изучения этого показателя.

Результаты корреляционного анализа также подтверждают, что погодные условия оказывают меньшее влияние на общее содержание белка в зерне по сравнению с качественным изменением белка (сумма HAK). На основании исследования генетически разнородного набора образцов, можно предположить, что существует возможность изменения качества белка проса без существенных потерь в его количестве.

Установлена степень различия между общим аминокислотным составом (АК) и различия в сумме HAK стандартного сорта проса Благодатное от других

исследуемых форм Степень различия (СР) аминокислотного состава устанав-тавали методом попарных сравнений Самые минимальные значения СР по составу аминокислот (коэффициент <1) имели Вельсовское, Благодатное П, М02І72, ХМ2137, а максимальные значения СР (коэффициент >2) были у ЛД1906, УР2098-9, СКЛ2183, 8Р1963, ДМ2083 (рис 1)

Рис 1 Степень различия морфотипов проса по составу и содержанию аминокислот

Отклонения по содержанию НАК отображают качественное изменение белка в сравнении со стандартом Благодатное Минимальные отличия имели большинство изучаемых генотипов Вельсовское, Ильиновское, Благодатное П, МВ1904, М02172, С02171, КС02187, ХМ2137, В2161, УР2098-9, СКЛ2183, 8Р1963, 8Р1950, эти различия не превышали 1% от обшего содержания НАК в стандарте Благодатное Вместе с тем, отмечено высокое содержание НАК >1% у ЛД1906, БР2007, ДМ2083, БР1965 (рис. 1)

Образцы ДМ2083 и ЯР2007 имеют значительные отличия по АК составу и по сумме НАК от стандарта Благодатное, в данном случае основные изменения в АК составе произошли за счет незаменимых аминокислот Таким образом, установлен внутривидовой полиморфизм по аминокислотному составу Отдельные полуизогенные линии и мутантные формы, имеющие маркерные гены, отличаются от стандарта не только АК составом, но и содержанием НАК

На основе оценки разности попарных сравнений генотипов проса со стандартом Благодатное отмечено, что процентное содержание отдельных ами-

нокислот в данном наборе генотипов изменяется и не имеет общей направленности с аминокислотным составом у стандарта

Установлено, что наибольшее количество в белках проса занимают следующие аминокислоты глутаминобая (24,7%), лейцин (12,9%) и аланин (10,7%) Содержание каждой из остальных аминокислот меньше 10% от их общего состава Отмечены превышения содержания фенилаланина, валина, аргинина, пролина, изолейцина, глицина, лизина у отдельных сортов и линий по сравнению со стандартом и более низкое содержание глутаминовой кис юты, лейцина, аланина, серина, тирозина, метионина

Таблица 4

Отличия по аминокислотному составу белков проса от стандартного

сорта Благодатное

Сорта, -шнии Оттичия по незаменимым аминокислоты Отчичия по заменимым аминокиспотм Всего отличий

Благодатное П - пролин 1

СО 2171 пролин 1

СКЛ 2183 - пролин 1

КС0 2187 тирозин 1

УР 2098-9 - глутаминовая к-та, глицин 2

МО 2172 метионин - 1

В 2161 треонин - 1

БР 1963 лейцин 1

SP 1950 1ИЗИН - 1

8Р 2007 тейцин серии 2

8Р1965 фенилаланин аланин аргинин 3

,МВ 1904 фспилаланин метионин пролин 3

ДМ 2083 валин изолейцин іизин - 3

Мутантные формы в различной степени отличались от стандарта по аминокислотному составу (табл 4) Так, полиплоидная форма проса Благодатное П, мутанты со скрученным листом СКЛ2183 и соргообразный карлик С02171 отличаются по содержанию пролина, что не отмечалось в исследованиях других авторов по АК составу проса Ультраранний аналог УР2098-9 характеризуется низким содержанием глутаминовой кислоты и повышенным содержанием глицина, что, возможно, связано с особенностями онтогенеза этой формы и коротким периодом синтеза проламинов Следует отметить линию В2161 с высоким содержанием треонина, могарообразные аналоги М02172, МВ1904 - с пониженным содержанием метионина, но у последнего мутанта выявлено повышенное содержание фенилаланина и пролина По аминокислотному составу отличались также линии 8Р, являющиеся компонентами мультилинейного сорта проса Квартет с генами резистентности к головне. Димутантная форма ДМ2083, которая существенно превосходит стандарт по содержанию белка.

также превышала стандарт, по трем незаменимым аминокислотам - валину, изолейцину и лизину, содержание последней в белке проса, как и в белках других злаков, находится в недостаточном количестве. Не обнаружены достоверные отличия от стандарта у сортов Вельсовское и Ильиновское.

Все это свидетельствует о том, что обнаруженные отличия в аминокислотном составе проявляются под воздействием генетического фактора, т.е. под влиянием отдельных мутантных аллелей или целой группы генов, хотя содержание отдельных аминокислот в белке проса колеблется в определенном диапазоне и является видоспецифичным.

Для установления взаимосвязей в аминокислотном составе белка проса был проведен корреляционный анализ. Выделены две основные группы аминокислот, которые имеют положительные связи внутри групп и отрицательные с аминокислотами другой группы (рис. 2).

Рис. 2. Положительные корреляции между отдельными аминокислотами в белке проса .

• . Выявленные корреляционные зависимости отражают процессы, связанные с накоплением белка в зерне проса. Так, первая группа аминокислот в большем количестве содержится в спирторастворимой фракции белков семян, что отмечено ранее (Джонс, 1970,) и связана с адаптивными свойствами прола-

минов злаков (Семихов и др, 2000), а во вторую группу входят НАК, кроме лейцина

Учитывая адаптивные свойства проламинов проса (паникоинов), а также необходимость улучшения качества белка культуры, связанного с повышением количества дефицитных незаменимых аминокислот (треонина, метионина, чи-зина, триптофана), проведена оценка и группировка изучаемых генотипов (табл 5)

Таблица 5

Оценка и группировка по аминокислотному составу генотипов проса

Гру ппа «Проламиновые» АК Дефицитные НАК Количест-t во генотипов Сорта и линии

А f - 0

в ; 1 Благодатное П

С * - 3 MB 1904, М02172. КС02187

D г V 3 Ильиновское. ДМ2083 SP 1965

Е - ± 8 і Благодатное, Ветьсовское, С02171, ХМ2137, В2161, SP 1963 SP1950, SP2007

F * _ 0

G 2 ЛД1906 СКЛ2183

Н - І 1 УР2098-9

I - - 0

Примечание - высокое содержание, - низкое содержание, ^ среднее значение

При распределения сортов и линий просапо группам учтены их различия в среднем за 3 года по сумме глутаминовой кислоты, лейцина, аланина и серина (\сювно обозначенные как «проламиновые» аминокислоты) и по сумме дефицитных незаменимых аминокислот треонина, метионина, лизина, триптофана На основании статистического анализа установлены диапазоны различий для первой группы аминокислот «+» больше 1,5% и «-» меньше -1,5% от среднего значения суммарного показателя и, соответственно, «+» больше 0,5% и «-» меньше -0,5% для второй группы аминокислот

Наибольшее количество генотипов со средними значениями показателей относится к группе Е в которую входят высокоурожайные сорта Благодатное, Вельсовское, три компонента сорта Квартет (8Р) и наиболее продуктивные аналоги Полиплоидная форма сорта Благодатное (группа В) отличается от всех изученных генотипов повышенным содержанием «проламиновых» аминокислот без снижения показателя суммы дефицитных НАК Наиболее ценными для улучшения качества продукции являются генотипы, относящиеся к группе О, в том числе сорт Ильиновское, с высоким качеством крупы (Золотухин и др, 1999) Большой интерес для селекционно-генетических исследований представ-

ляют группы С и G, генотипы которых характеризуются контрастом по аминокислотному составу белка и отличаются по маркерным генам. К группе Н относится ультраранняя форма УР2098-9, которая имеет пониженное содержание «проламиновых» аминокислот, что обусловлено коротким периодом налива зерна. .

Распределение изучаемых генотипов по группам на основе соотношения выделенных двух блоков различных аминокислот в белках семян проса является важным критерием оценки исходного материала и при подборе пар для гибридизации и указывает на целесообразность скрещивания форм, относящихся к той или иной группе. Если генотипы принадлежат одной группе, то в результате гибридизации между ними маловероятно получение новых форм, отличающихся от родительских компонентов по аминокислотному составу белка.

Электрофорез запасных белков семян проса

В результате сравнительного анализа методом электрофореза проламинов - наиболее вариабельной фракции белкового комплекса, выявлено у проса посевного {Panicum miliaceum L.) 4 основных белковых локуса в зоне от 14 до 20 кДа. Установленные отличия сортообразцов проса от родов Setaria и Sorgum свидетельствуют о различном составе проламинов, что связано с физиолого-биохимическими и генетическими особенностями этих родов.

Исследования только одной проламиновой фракции ограничивает представление об изменчивости других белковых фракций. Исходя из этого, проведен электрофоретический анализ компонентов запасных белков проса посевного: альбуминов, глобулинов и проламинов. Различия по электрофореграммам выявлены компьютерным анализом белковых спектров с учетом выраженности отдельных зон. В качестве критерия определения выраженности спектров принят показатель «светимость». Степень различия от стандартного сорта Благодатное выражена в процентах. Подобный подход использовали Kumar и Parameswaran (1998) при оценке сортов проса итальянского.

Проведя анализ альбуминовой фракции белков проса, выявлено, что основные белковые спектры сосредоточены в диапазоне 25...94,0 кДа и 20... 14 кДа. Выделены две основные белковые зоны, которые одинаковы у всех образцов в диапазоне 50 кДа и 35 кДа. Изменчивость по спектрам альбуминовой фракции (7... 12%), возможно, связана с функциональной ролью водорастворимых белков в процессе прорастания семян.

В глобулиновой фракции (рис. За) отмечены изменения: основных белковых блоков, которые находятся в диапазоне 28...94 кДа и 14...20,1 кДа. Имеются также три четкие стабильные белковые зоны с массой 28 кДа, 55 кДа и 90 кДа, характерные для данных генотипов. По качественному составу спектры

глобулинов более разнообразны, чем спектры альбуминовой фракции. Следует выделить изменения по отдельным локусам лептодермальной формы ЛД1906 и димутанта ДМ2083, у которых отсутствовал белковый компонент в диапазоне 60 94 кДа

I

а е

ЛД 1906 - 24,96% А Б

Рис 3 Электрофореграмма (а) и отличия спектров (б) побутанов запасных бетеов проса

Максимальные отличия по спектрам, которые отражают качественный состав глобулинов, имели стедующие сортообразцы С02171, ЛД1906, ДМ2083 - 20,26%, 24,96% и 20,73% Характерные отличия по спектрам у линии ЛД1906 (рис 36), вероятно, связаны с влиянием доминантного аллеля который обу-счавливает тонкопленчатость и легкообрушиваемость зерна

Проламины проса имеют более бедный спектральный состав, в отличие от легкорастворимых фракций В составе проламиновых белков присутствуют только 3 основных компонента 16 кДа, 18 кДа, 20 кДа Вместе с тем, линии МВ1904, ЛД1906 и ДМ2083 имеют еще две дополнительные зоны 14 кДа и 25 кДа(рис 4а)

По спектрам проламиновой фракции отличия от стандарта, сорт проса Вельсовское и линии: МВ1904, ЛД1906 и ДМ2083, на 16,52%, 17,35%, 25,20% и 36,45% соответственно Заслуживает особого внимания, максимальное отличие бечковых спектров у димутантной линии ДМ2083 (рис. 46), которая как отмечалось ранее, является ценным источником повышенного содержания белка и отдельных незаменимых аминокислот Вероятно, именно электрофорез прола-минов может служить методом для выявления высокобелковых форм проса Следует также подчеркнуть, что проламины проса, как наиболее адаптивная фракция белков, отличаются высоким полиморфизмом, в исследованном наборе сортов и линий проса отличия от стандарта составляют 10,49% ..36,45% Выявлены особенности проламинов не только у полуизогенных линий, но и у сор-

тов. Новый сорт проса Вельсовское наряду с крупностью семян характеризуется повышенным содержанием белка, что отражается на белковых спектрах про-ламиновой фракции.

кд.

Jttül

4...Í-4-Í

iibif

too 1» seo Ж too

Благодатное, ст.

Р i Р § § § г е

й 5

ДМ 2083 - 36,45%

..........А Б

Рис.4. Электрофореграмма (а) и отличия спектров (б) проламинов запасных белков проса

У изучаемых сортообразцов, на основании анализа фракционного состава запасных белков, выделены 4 группы. Группа 1 - (мутантная форма ДМ 2083) характеризуется максимальными отличиями от стандарта по трем фракциям; группа 2 — (линия МО 2171) по двум фракциям альбумины и глобулины, (линии МВ 1904 и ЛД 1906) по глобулинам и проламинам; группа 3 - отличие (линии СО 2171) по глобулинам, (КСО 2187) по альбуминам и (сорта проса Вельсовское) по проламинам; к группе 4 относятся сорт Ильиновское и линия СКЛ 2183, не имеющие существенных отличий по показателю светимости белковых спектров/Представленный подход рекомендуется использовать при изучении белкового комплекса проса и просовидных культур, так как он отражает не только наличие или отсутствие белковых компонентов на электрофореграмме, но и учитывает концентрацию белка в определенных зонах, что позволяет более четко выявлять отличия по полиморфным запасным белкам.

Анализ ДНК проса и просовидных культур Использование молекулярных маркеров для анализа генома просовидных культур и оценка гибридов (Setaria italica L. X Panicum miliaceum

L.j. Для определения межродового полиморфизма в работе анализировались образцы основных просовидных культур селекции ВНИИЗБК: просо посевное (Panicum miliaceum L.), просо африканское (Pennisetum glaucum L.), просо итальянское (Setaria italica L.), отличающиеся морфобиологическими особенностями. Указанные виды просовидных культур наиболее широко распростра-

нены в мировом производстве зерна и относятся к семейству Роасеае (мятли-ковые), подсемейству Panicoidae (просовидные), трибе Paniceae (просовые)

В результате ПЦР анализа ДНК просо-видных культур установлено, что у Pennisetum gíaucum L и Setaria italica L при реакции амплификации образовали минорные фрагменты, соответствующие 800 пни 950 п н , у Panicum miliaceum L. в зоне маркера молекулярного веса отмечен только основной фрагмент, в зоне более 1 ООО п н В месте с тем различий между чумизой Setaria itahca ssp maxima и могаром Setaria itahca ssp moharicum, не установлено (рис 5)

Данные, полученные в результате изучения продуктов амплификации, могут быть использованы для идентификации и анализа межвидовых гибридов, а также новых генотипов просовидных купьгур, и повышения эффективности селекционного процесса Внутривидовые гибридные формы Setaria italica L были использованы для скрещивания с раннеспелым сортом проса Быстрое (Ратсит mliaceum ssp effusum), характеризующимся развесистым типом метелки, красной окраской зерна и наличием антоциана. В первом поколении гибридов проса итальянского с просом посевным проявляется материнский тип растений, однако, отмечены отклонения по форме метелки (расширение, разветвление в средней или верхней части), стерильность растений, наличие пигментации Во втором поколении преобладают формы близкие по морфотипу к виду Setaria italica L , доля растений с маркерными признаками отцовской формы проса посевного незначительна В результате ПЦР-анализа гибридных F; растений обнаружены отличия в амплифицированных спектрах ДНК

Использование ПЦР-анализа для идентификации генотипов проса (Panicum milliaceum L.) Для выявления внутривидового полиморфизма проса нами исследованы альтернативные по морфофизиологическим признакам генотипы, в том числе с мутантными генами. Нами впервые исследованы с помощью ПЦР-анализа ДНК полуизогенные линии проса, отличающиеся по типу метелки и устойчивости к расам головни Электрофорез продуктов амплификации (рис 6) показал, что у генотипов проса основной фрагмент находится в зоне 900 п н, что характерно для всех аналогов сорта Благодатное и сорта Ильи-новское, однако у генотипов МО 2172, MB 1904, СО 2171 образовался минор-

11

t

е -

ti

r¡

г I

• ■в

Рис 5 Продукты амплификации ДНК основных просовидных культур с праймером PawS^

-200 п. а.

ный продукт реакции 490 п.н., который является специфичным для мутантных аналогов.

Проведены аналогичные ис--юоо п. а. следования ДНК с короткими праймерами (10 п.н.). Выявлен полиморфизм в данном наборе гено--190 п н. типов при использовании праймера Р21 (АСХЗССОТАТС). Выделены 4 основные ПЦР локуса в зоне 2500л.н., 2000п.н., НООп.н., 800п.н., которым присвоены коды А21В21Сг102ь подстрочным индексом обозначено название праймера. На основании наличия и отсутствия указанных локусов предлагается использовать для идентификации проса следующие формулы: Аг^^Сг^ - С02117, М02172, МВ1904; Вг^г^] -КС02187; Сг^л - Благодатное, Вельсовское, Ильиновское, 8Р1950, БР2007, СКЛ2183, ЛД1906, Благодатное П, УР2089. В дальнейшем с использованием других праймеров и характеристики с помощью формул наличия или отсутствия ампликонов возможна идентификация сортов, доноров и источников ценных признаков.

Рис.б Продукты амплификации ДНК генотипов проса посевного с праймерами Ра\у81б+Ра\у817

ВЫВОДЫ

1. Установлено высокое варьирование морфофизиологических показателей у сортов и полуизогенных линий и менее выраженная изменчивость по содержанию и составу белка в зерне проса.

2. Морфофизиологические показатели различных морфотипов проса тесно связанны с продуктивностью растений, но отрицательно коррелируют с содержанием белка в зерне (г=-0,22...-0,73), поэтому высокобелковые мутантные формы не обеспечивают высокий сбор белка.

3. Погодные условия оказывают меньшее влияние на общее содержание белка в отличие от качественных показателей^ сумма НАК? вместе с тем, отмечено влияние генотипа на аминокислотный состав белка.

4. Выявлены различия между сортами и полуизогенными линиями проса с маркерными генами по содержанию белка и его аминокислотному составу, установлено влияние маркерных генов на содержание отдельных аминокислот.

' 5. Характерной особенностью запасных белков проса посевного является высокое содержание незаменимой аминокислоты лейцина, которая положи-

тельно коррелирует с содержанием глутаминовой кислоты, аланина, серина, и отрицательно с дефицитными HAK' треонин, метионин, лизин, триптофан

6. На основе соотношения двух блоков аминокислот, выявлено 6 групп генотипов, что позволяет оценить исходный материал для селекции Если генотипы относятся к одной из выделенных групп, то в результате гибридизации между ними маловероятно получение новых форм, отличающихся от родительских форм по аминокислотному составу белка.

7 В результате сравнительного анализа электрофоретических спектров запасных белков проса посевного установлена незначительная изменчивость альбуминов, отмечен полиморфизм в глобулиновой и проламиновой фракциях, что позволяет проводить идентификацию генотипов

8 Вылечено 4 группы генотипов, отличающихся по спектрам запасных белков различных фракций, максимальные различия характерны для мутантных форм с маркерными генами и лептодермальной тонкопленчатой линии

9 С помощью анализа ДНК наряду с морфофизиологическими и биохимическими различиями выявлен полиморфизм просовидных культур и генотипов проса (Ратсит mihaceum L ), выделены основные ПЦР локусы, идентифицированы чутантные гены тр и sei для использования в разработке новых се-текционных технологий, направленных на изменение и качественное утучше-ние белков

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1 Выявлены доноры и генетические источники повышенного содержания бетка и отдельных аминокислот в зерне проса, дано их паспортное описание

2 Перспективным решением проблемы увеличения сбора белка является привлечение в гибридизацию высокобелковых мутантных форм проса, а также использование в производстве высокопродуктивного сорта Вельсовское и "танин ХМ2137

3 Для изменения и улучшения качества белка, на основе группировки сортов и линий по аминокислотному составу, целесообразно использовать в скрешиваниях генотипы, относящиеся к группе С с могарообразным типом ме-течки и высоким содержанием «проламиновых» аминокислот, и линии группы G с повышенным содержанием дефицитных HAK

4 Показана возможность идентификации сортов и линий проса по элек-трофоретическим спектрам белка и амплифицированной ДНК и применение данных методов для анализа генетических коллекций и выявления ценных межродовых и внутривидовых гибридов, в результате чего возможно существенно повысить эффективность селекционно-генетических исследований.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сидоренко B.C., Конов С .А., Павловская Н.Е. Идентификация мутантных , генотипов проса с использованием ПЦР-анализа // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. -2002. -№5, -С.7-9

2. Сидоренко B.C., Конов С.А., Павловская Н.Е. ДНК технологии для идентификации генотипов проса //1 Международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития» / Материалы конгресса Москва, октябрь 14-18,2002. -М., -С.110^_

3. V.S.Sidorenko, S.A.Konov, N.E.Pavlovskaya DNA technologies for millet genotype identification //1 Международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития» / Материалы конгресса Москва, октябрь 14-18, 2002.-М., -С. '111

4. Прусаков А.Н., Новожилова O.A., Тимошенко A.C., Арефьева Л.П., Сидоренко B.C., Конов С.А., Молканова О.И., Семихов В.Ф. Экспериментальная проверка гипотезы адаптивной роли проламинов на примере данных по внедрению чужеродных проламинов в семена кукурузы (Zea mays L.) II Отдаленная гибридизация. Современное состояние и перспективы развития/ Труды Международной конференции по отдаленной гибридизации Москва 1617 декабря 2003г.-М.: изд-во МСХА, 2003.-С.204-208

5. Сидоренко B.C., Конов С.А., Павловскя Н.Е. Создание новых форм чумизы и гибридов Setaria itálico L. х Panicum miliaceum L. // Физиологические аспекты продуктивности растений. 4.1 / Материалы научно-методической конференции. -Орел, 2003. -С.242-245

6. Сидоренко B.C., Вельсовский В.П., Вельсовская Л.А., Жук Г.П., Глазова З.И., Старикова Ж.В., Соболев А.Н., Конов С.А. // Создание среднеспелого крупнозерного сорта проса Вельсовское с рассоспецифической устойчивостью к головне / Отчет о завершенной НИР. № Гос. регистрации 01200403465, Инв. №02200401376. -Орел, 2003. -8с.

7. Конов С.А. Использование молекулярных маркеров для анализа генома просовидных культур // Биологические основы современной агрономии. -Орел, 2004. -С.62-65

8. Конов С.А. Аминокислотный состав запасных белков семян различных морфотипов проса (Panicum miliaceum L.) // Биологические основы современной агрономии. -Орел, 2004. -С.72-76

9. Сидоренко B.C., Жук Г.П., Варлахова Л.Н., Вилюнов С.Д., Гуринович С.О., Конов С.А., Котляр А.И., Старикова Ж.В., Чумакова Н.В. // Паспорта доноров селекционно ценных признаков сельскохозяйственных культур. Вып. 5. Просо посевное {Panicum miliaceum L.). -Орел, 2004. -39с.

Объем 1 25 п т

Чак 187

Тир 100 экз

Издатеїьство МСХА 1275^0 Москва, vi Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Конов, Сергей Александрович

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Морфобиологиеская и биохимическая характеристика проса

1.2. Перспективы использования белковых и ДНК маркеров в 25 исследованиях злаковых культур

И. УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1.Условия проведения исследований

2.2. Материал исследований

2.3. Методы исследований

III. ОСОБЕННОСТИ БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА ЗЕРНА 50 РАЗЛИЧНЫХ МОРФОТИПОВ ПРОСА ПОСЕВНОГО

3.1. Влияние морфофизиологических показателей на 54 продуктивность и содержание белка в зерне

3.2. Аминокислотный состав белка в зерне проса

IV. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ СЕМЯН ПРОСА

V. АНАЛИЗ ДНК ПРОСА И ПРОСОВИДНЫХ КУЛЬТУР

5.1. Использование молекулярных маркеров для анализа генома 94 просовидных культур и оценка гибридов (Setaria italica L. X

Panicum miliaceum L.)

5.2. Использование ПЦР-анализа для идентификации генотипов 106 проса (Panicum milliaceum L.)

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности белкового комплекса зерна проса и идентификация морфотипов по маркерным генам"

Зерновые культуры обеспечивают свыше 50% белка для питания человека, поэтому в современных условиях важной проблемой является создание новых сортов злаковых культур, сочетающих высокое содержание и качество белка с достигнутым уровнем урожайности и устойчивостью к неблагоприятным факторам среды и биотическим стрессам.

По данным FAO (2000), мировое производство просовидных культур составляет 29,7 млн.т, из них 13,35 млн.т (45%) - просо жемчужное (Pennicetum), просо итальянское или чумиза, могар (Setaria) - 5,78 млн.т (19%), просо посевное (Panicum miliaceum L.) - 5,06 млн.т (17%). В России и странах СНГ сосредоточено около 50% от мирового производства проса посевного, в Китае - около 30%, также данная культура выращивается в Индии (10%), Северной Корее (3%), Аргентине (3%) и Северной Америке (2%).

Просо обладает высокой устойчивой урожайностью, что обусловлено его биологическими особенностями. Высевая 25.30 кг/га семян, можно получить 5.6 т зерна с гектара (Елагин И.Н., 1981). Положительным качеством проса является большая по сравнения с другими зерновыми культурами устойчивость его к болезням и вредителям (Романенко Г.А. и др. 1999).

Основным и наиболее ценным продуктом, является крупа проса -пшено, по вкусовым качествам и пищевым достоинствам занимающее одно из первых мест среди других круп. Пшено содержит 12,0. 14,7% белка -больше, чем рисовая, ячневая, кукурузная и сортовая крупы. В составе белка выявлены все незаменимые аминокислоты. По этому показателю пшено превосходит крупы из других культур, а также ржаной и пшеничный хлеб.

Эффективность исследований по улучшению качества зерна проса, зависит, прежде всего, от надежного исходного материала. И если до настоящего времени подбор исходного материала и методы селекции проса на продуктивность, устойчивость к патогенам можно признать вполне успешными, то биохимические особенности белка зерна проса слабо изучены. Не выяснена природа высокобелковости, ее генетическая обусловленность, не разработаны эффективные селекционно-генетические методы получения генотипов проса с использованием маркерных генов.

Актуальность работы. В настоящее время возникла ситуация, в результате которой практически не учитывается качество белка зерна проса, которое по вкусовым и пищевым достоинствам является ценным и недорогим продуктом питания. Проблема повышения содержания белка и улучшения его качества в зерне проса заключается в выявлении и создании новых форм, источников ценных биохимических свойств и их идентификации.

Изучение запасных белков проса позволит разработать способы идентификации генотипов и выявить сопряженность изменчивости состава данных белков с морфофизиологическими показателями, определяющими продуктивность растений. Полигенная природа большинства признаков ограничивает возможности генетического маркирования и контроля за переносом полезных генов в новые формы растений. Данных об использовании белковых и ДНК локусов как генетических маркеров хозяйственно значимых признаков, крайне недостаточно, а вопросы ценности различных аллелей в отношении пищевых и кормовых достоинств зерна проса вообще не исследованы. Информацию о биохимических особенностях белкового комплекса и применении современных методов идентификации исходного и гибридного материала необходимо целенаправленно использовать при разработке новых селекционных технологий.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с заданием 08.02.03 по программе Россельхозакадемии на 2001.2005гг. «Провести комплексную биохимическую и технологическую оценку генофондов зернобобовых и крупяных культур, выделить источники высокобелковости, отличных потребительских, пищевых и кормовых достоинств, провести паспортизацию сортов гороха, проса и гречихи по белковым формулам и ДНК-маркерам».

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - определение особенностей различных морфотипов проса по содержанию и составу белка, выявление полиморфизма фракций запасных белков и идентификация генотипов с маркерными генами.

Для этого решались следующие задачи:

1 провести оценку генетической коллекции проса по продуктивности, морфофизиологическим показателям, содержанию и составу запасных белков;

2 установить различия между изучаемыми генотипами по содержанию отдельных аминокислот и выявить связь между ними;

3 изучить полиморфизм фракций запасных белков проса;

4 установить отличия генотипов от стандарта по белковым спектрам;

5 определить возможность использования ПЦР анализа для идентификации просовидных культур и генотипов проса;

6 выделить новый ценный исходный материал с маркерными генами.

Научная новизна работы. Установлено, что процессы накопления белка в зерне проса посевного имеют отрицательную связь с морфофизиологическими показателями, определяющими продуктивность растений.

Впервые при изучении полуизогенных линий проса выявлены повышенное содержание белка у генотипов с рецессивными аллелями мутантных генов тр, sd. Установлены особенности аминокислотного состава белков проса и проведена группировка генотипов по соотношению отдельных блоков аминокислот, влияющих на адаптивные свойства и пищевую ценность зерна. Проведена идентификация генотипов проса по фракциям запасных белков и установлена степень отличия в электрофоретических спектрах от сорта стандарта Благодатное. Впервые обнаружен ДНК маркер мутантного гена тр, указывающий на повышенное содержание белка. Используя ПЦР анализ ДНК, подтверждена возможность идентификации гибридов проса посевного и проса итальянского (Setaria italica L. X Panicum miliaceum L.).

Практическая значимость и реализация результатов исследований. Выявлен ценный исходный материал с повышенным содержанием белка и отдельных незаменимых аминокислот. Предложен новый подход для подбора родительских пар при создании генотипов с улучшенным качеством белков и возможным увеличением выхода белка с единицы площади.

Показана возможность применения белковых и ДНК маркеров для филогенетических исследований проса посевного и выявления высокобелковых форм. При разработке новых селекционных технологий предложен комплексный подход для отбора генотипов проса на основе электрофоретического анализа запасных белков и их идентификации с помощью полимеразной реакции (ПЦР). Создан и передан на Государственное сортоиспытание новый высокобелковый сорт проса Вельсовское.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва 2002), на V съезде общества физиологов растений России и на международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), на научно-практической конференции молодых ученых и аспирантов «Биологические основы современной агрономии» (Орел, 2004), на научно-методической конференции «Физиологические аспекты продуктивности растений» (Орел, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах и состоит из введения, 5 глав, общих выводов, практической значимости и рекомендаций, библиографического списка использованной литературы, включающего 182 наименований, в том числе 30 на иностранных языках. Диссертация иллюстрирована 16 таблицами и 21 рисунками. Приложений - 5.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Конов, Сергей Александрович

ВЫВОДЫ

1. Установлено высокое варьирование морфофизиологических показателей у сортов и полуизогенных линий и менее выраженная изменчивость по содержанию и составу белка в зерне проса.

2. Морфофизиологические показатели различных морфотипов проса тесно связанны с продуктивностью растений, но отрицательно коррелируют с содержанием белка в зерне (г=-0,22.-0,73), поэтому высокобелковые мутантные формы не обеспечивают высокий сбор белка.

3. Погодные условия оказывают меньшее влияние на общее содержание белка в отличие от качественных показателей, сумма НАК; вместе с тем, отмечено влияние генотипа на аминокислотный состав белка.

4. Выявлены различия между сортами и полуизогенными линиями проса с маркерными генами по содержанию белка и его аминокислотному составу, установлено влияние маркерных генов на содержание отдельных аминокислот.

5. Характерной особенностью запасных белков проса посевного является высокое содержание незаменимой аминокислоты лейцина, которая положительно коррелирует с содержанием глутаминовой кислоты, аланина, серина, и отрицательно с дефицитными НАК: треонин, метионин, лизин, триптофан.

6. На основе соотношения двух блоков аминокислот, выявлено 6 групп генотипов, что позволяет оценить исходный материал для селекции. Если генотипы относятся к одной из выделенных групп, то в результате гибридизации между ними маловероятно получение новых форм, отличающихся от родительских форм по аминокислотному составу белка.

7. В результате сравнительного анализа электрофоретических спектров запасных белков проса посевного установлена незначительная изменчивость альбуминов, отмечен полиморфизм в глобулиновой и проламиновой фракциях, что позволяет проводить идентификацию генотипов.

8. Выделено 4 группы генотипов, отличающихся по спектрам запасных белков различных фракций, максимальные различия характерны для мутантных форм с маркерными генами и лептодермальной тонкопленчатой линии.

9. С помощью анализа ДНК наряду с морфофизиологическими и биохимическими различиями выявлен полиморфизм просовидных культур и генотипов проса (Panicum miliaceum L.), выделены основные ПЦР локусы, идентифицированы мутантные гены тр и sd для использования в разработке новых селекционных технологий, направленных на изменение и качественное улучшение белков.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Выявлены доноры и генетические источники повышенного содержания белка и отдельных аминокислот в зерне проса, дано их паспортное описание.

2. Перспективным решением проблемы увеличения сбора белка является привлечение в гибридизацию высокобелковых мутантных форм проса, а также использование в производстве высокопродуктивного сорта Вельсовское и линии ХМ2137.

3. Для изменения и улучшения качества белка, на основе группировки сортов и линий по аминокислотному составу, целесообразно использовать в скрещиваниях генотипы, относящиеся к группе С с могарообразным типом метелки и высоким содержанием «проламиновых» аминокислот, и линии группы G с повышенным содержанием дефицитных НАК.

4. Показана возможность идентификации сортов и линий проса по электрофоретическим спектрам белка и амплифицированной ДНК и применение данных методов для анализа генетических коллекций и выявления ценных межродовых и внутривидовых гибридов, в результате чего возможно существенно повысить эффективность селекционно-генетических исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Конов, Сергей Александрович, Орел

1. Агафонов Н.П., Ярош Н.П. Морфологическая и биохимическая оценка коллекции проса в условиях орошения // Бюл. ВИР.Вып.18,- Л., 1971.- С.33-37.

2. Агафонов Н.П. Мировая коллекция проса как исходный материал для селекции на качество зерна//Селекция и семеноводство проса /Под ред. И.Н. Елагина: Науч. труды ВАСХНИЛ. М., 1976. - С. 24-33.

3. Агафонов Н.П., Курцева А.Ф. Изучение мировой коллекции проса./ Методические указания / Под ред. Г.Е. Шмараева.- Л.: ВИР, 1988. -30 с.

4. Алешин А.Ф., Ильин В.А. Изучение сортов проса в условиях орашения. //Селекция проса на качество зерна и устойчивочть к болезням. М., 1979.-С.131-134.

5. Анализ и регистрация линий, сортов и гибридов кукурузы по зеину методом электрофореза. Методические указания и каталог белковых формул (под ред В.Г. Конарева) Санкт-Петербург, ВИР, 1998. 49с.

6. Аристархова М.Л.; Курцева А.Ф.; Ростова Н.С. Факторный анализ морфологических и хозяйственных признаков проса // НТБ ВИР. Т. 150. Л.,1985.- С. 53-57.

7. Арнольд Б.М. Просо (Panicum miliacium L.) // Труды Саратовской с.-х. опытной станции. Вып. 7. Саратов, 1916 - С.9-29

8. Арнольд Б.М. Селекция проса. (Из работ Селекционного Отдела Саратовской обл.с.-х. ст.с 1912 по 1917г.) -Саратов, 1918.- 55 с.

9. Белковый комплекс зернобобовых культур и пути повышения его качества // Павловская Н.Е., Шумилин П.И., Задорин А.Д., Правдюк З.Н., Шалимова О.А. -Орел, 2003. -216с.

10. Бугрий О.В. Характер наследования и связи с хозяйственно полезными признаками компонентного состава гордеина в популяциях ярового ячменя: Автореф. дисс на соиск. уч. степ. канд. биол. наук. -М.,1989. 20 с

11. Вавилов Н.И. Полевые культуры Юго-Востока. Петроград, 1922. -230 с.

12. Вавилов Н.И. Центры происхождения культурных растений // Тр. по прикл. бот., ген. и сел. Т.16, № 2. -Л., 1926. -С.14-103.

13. Вавилов Н.И. Избранные труды T.V.- М.-Л.: Наука, 1965.- С.40-94.

14. Вареница Е.Т. Чумиза, биология, селекция и агротехника. —М.; ГОСИЗДАТ, 1958.-190с.

15. Введенская И.О., Вахуан Д.А., Курцева А.Ф., Дой К. Оценка генетического разнообразия проса обыкновеенного (Panicum miliaceum L.) на основе использования ДНК маркеров // С.-х. биология. 2002. -№5. -С. 56-64.

16. Володин В.И., Голубов А.А., Тимофеев A.M., Яньков И.И. Исследование субъединичного состава альбумина в качестве маркеров белковости // НТБ ВНИИЗБК. №36. -Орел, 1987. -С.8-11.

17. Гауровиц Ф. Химия и функция белков.-М.: Мир,1965.-530с. с илл.

18. Гончаров Н.П. Генетические коллекции пшеницы: длина вегетационного периода. //Генетические коллекции растений.Вып. 1.- Новосибирск, 1993 С 54-81.

19. Горбачева С.Н. Изменчивость фракционного состава белка селекционных образцов проса // Вклад молодых ученых Украины в интенсификацию с.-х. производства. Ч. 1. -Харьков, 1987, -С. 48^19.

20. Горбачева С.Н. Особенности наследования количественных признаков проса // Методы интенсификации селекционного процесса. -Одесса, 1990. -С. 24-25.

21. Горбачева С.Н. Создание исходного материала для селекции проса на повышенное содержание белка и незаменимых аминокислот в условиях восточной лесостепи Украины: Автореф. дисс. на соиск.уч.степ.канд. с.-х. наук. Харьков, 1994. - 17 с.

22. Горлачева О.В. Создание исходного материала для селекции проса на продуктивность и качество зерна в условиях восточной Лесостепи украины: Автореф. дисс. на соиск.уч.степ канд. с.-х. наук. -Харьков, 2004. -20 с.

23. Гостимский С.А. Кокаева З.Г., Боброва В.К. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений // Генетика. -Т.35, №11. -1999. С.1538-1549.

24. Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию.- М.: МСХРФ, 2004. С. 18-19.

25. Григорьев Н.Г., Шманенков Н.А. Возрастные изменения аминокислотного состава тела бройлеров // Труды ВНИИФБ.- Боровск, 1965. -С.24-30.

26. Деренжи П. Свойства зерна, используемого в хлебопечении. // Хлебопродукты. -2001.-№ 3. -С. 13-15.

27. Дженсен Г. Белки семян зерновых и масличных культур.-М.: Колос, 1977. -З12.с.

28. Долби А., Кейджемпенг Г., Девис И., Мерфи Дж. Биосинтез белка у зерновых культур. // Белки семян зерновых и масличных культур. -М.: Колос, 1977-312с.

29. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. -М.: Колос, 1979. -416с.

30. Егоров И., Шарипов Б., Вельцовская Л. Тонкопленчатое просо в комбикормах для цыплят-бройлеров //Птицеводство.-№4. -1994. -С.16-18.

31. Елагин И.Н. Агротехника проса. М.: Россельхозиздат, 1981. - 160с.

32. Ермаков А.И., Арасимович В.В. Ярош Н.П. и др. Методы биохимического исследования растений./Изд.З.е, перераб. и доп. Л.: Агропромиздат, 1987.-430 е., ил.

33. Еськова Л.И.; Рязанова Г.И.; Бекк Э.Г. Биохимическая характеристика исходного материала кормового проса в условиях сухой степи // Селекц. -генет. исслед. при выведении новых сортов полевых культур для Сев. Казахстана. А.-Ата, 1987, -С.108-116.

34. Жученко А.А. Роль генетической инженерии в адаптивной системе селекции растений // С.-х. биология. -№1.- 2003. -С.3-33.

35. Зайцев B.C., Хавкин Э.Е. Идентификация генотипов растений с помощью ПЦР-анализа рассеянных повторяющихся последовательностей R173 Н Доклады РАСХН. -2001. -№2. -С.3-5.

36. Закладный Г.А., Володин В.И., Масалова В.И. Сравнительное изучение химического состава линий проса // Научные труды. Т.З. -Орел, 1971. -С.431-443.

37. Золотухин Е.Н., Унгенфухт И.П., Тихонов Н.П., Алешин А.Ф., Коробков С.Д. Основные направления и методы селекции проса // Аграрная наука -производству / Тез. докл. науч.-практич. конфер. (Самар. НИИСХ, 15-16 июня 1993 г.). Безенчук, 1993. - С.90-91.

38. Золотухин Е.Н., Унгенфухт И.П., Тихонов Н.П., Алешин А.Ф., Ханыгин

39. Золотухин Е.Н. Тихонов Н.П., Лизнева Л.Н., Тугушева Х.И., Черкашина

40. B.К. Новые направления и пути их реализации в селекции проса посевного // Стратегия адаптивной селекции полевых культур в связи с глобальным изменением климата. -Саратов, 2004. -С.113-115.

41. Зотиков В.И. Научное обеспечение производства крупяных культур // Научное обеспечение производства зерна России. -М. -Зерноград, 2004.1. C.150-160.

42. Изучение мировой коллекции проса: Метод, указ. ВИР -Л., 1986. -30с.

43. Ильин В.А., Тихонов Н.П. Идентификация генов устойчивости проса к головне // Физиолого-генетические основы интенсификации селекционного процесса: Тез. докл. Всесоюзной конференции (Саратов, 4—6 июля 1983). 4.2. -Саратов, 1984. -С. 73-74.

44. Ильин В.А.; Унгенфухт И.П.; Золотухин Е.Н.; Кожемякина Ю.Я. Результаты селекции полевых культур и новые методы создания исход, материала // Методы и результаты селекции проса. Саратов, 1989 - С. 60-64

45. Ильин В.А. Селекция проса на высокую продуктивность //Селекция зерновых и крупяных культур / Сб. науч. тр. НИИСХ Юго-Востока Саратов, 1991. -С.73-95.

46. Ильин В.А. Избранные труды. Т.2. -Саратов, 1994. 95с.

47. Казарцева А.Т., Шеуджен А.Х., Нещадим Н.Н. Эколого-генетические и агрохимические основы повышения качества зерна. -Майкоп, 2004. -160с.

48. Каталог мировой коллекции ВИР. Вып. 261: Образцы проса с характеристикой содержания белка и лизина в зерне. Л., 1979. - 44с.

49. Каталог мировой коллекции ВИР. Вып. 265: Характеристика образцов проса по качеству зерна. Л., 1979. - 65с.

50. Каталог мировой коллекции ВИР. Вып. 474: Просо. (Характеристика позднеспелых образцов по качеству зерна). Л., 1988. - 57с.

51. Каталог мировой коллекции ВИР. Вып. 480: Просо. (Биологические, технологические, биохимические признаки образцов). — Л., 1989. 56с.

52. Каталог мировой коллекции ВИР. Вып. 528: Просо. (Образцы с характеристикой биологических, технологических свойств, содержания белка и лизина).-Л., 1990.-47с.

53. Каталог мировой коллекции ВИР. Вып. 596: Технологические, хозяйственно-биологические и биохимические свойства проса в условиях Тамбовской области. Л., 1991. - 49с.

54. Каталог мировой коллекции ВИР. Вып. 641: Характеристика образцов проса Закавказья. Л., 1993. - 40с.

55. Каталог мировой коллекции ВИР. Вып. 678: Характеристика исходного материала по комплексу признаков и свойств для селекции проса. — Л., 1995.-42с.

56. Коваль С.Ф. Изогенные и аллоплазматические линии, их создание и использование // Использование изогенных линий в селекционно-генетических экспериментах: Тез. докл. -Новосибирск, 1990. -С.4-7.

57. Коваль С.Ф. Некоторые проблемы генетических коллекций растений // Генетические коллекции растений. Вып.1. -Новосибирск, 1993. -С6-38.

58. Коваль С.Ф. Шаманин В.В. Растение в опыте.-М., 1999. -240с.

59. Козьмина Е.П. Влияние района произрастания на содержание белка в пшене и ядрице /Инфор. бюл. Госкомиссии по сортоиспытанию с.-х. культур. Вып. №7.-М., 1955. -С.15-19.

60. Конарев А.В. Использование молекулярных маркеров в работе с генетическими ресурсами растений // С.-х. биология. -1998. -№5. -С.3-24.

61. Конарев В.Г., Павлов А.Н., Шаяхметов, Колесник Т.Н. Растворимые белки зерновки в процессе ее развития // Физиология растений. -1974. -Т.21, вып.5.-С.931-938.

62. Конарев В.Г. Проблема пищевой и кормовой ценности растительных белков // Растительные белки и их биосинтез.- М.: Наука, 1975. -С.5—30.

63. Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры- М.: Колос, 1983. -320с.

64. Коновалов Ю.Б. и др. Практикум по селекции и семеноводству полевых культур.- М.: Агропромиздат, 1987, С. 242-250.

65. Константинов С.И. Изучение наследования и изменчивости биологических и хозяйственно-ценных признаков у гибридов проса: Автореф. дисс.на соиск.уч. степ. канд. с.-х. наук. Харьков, 1967. -23с.

66. Константинов С.И., Линник В.Н. Использование химических мутагенов в селекции проса // Химический мутагенез и содание сортов интенсивного типа. -М., 1977. -С.92-98.

67. Константинов С.И., Думачева Л.П., Горбачева С.Н. Селекция на увеличение содержания белка и триптофана в зерне проса И Совершенствование селекции, семеноводства и технологии возделывания проса / Сб. науч тр. ВНИИЗБК. -Орел, 1985.-С.26-30с.

68. Константинов С.И., Думачева Л.П., Горбачева С.Н. Создание исходного материала с повышенным содержанием белка и триптофана в зерне проса // Селекция и семеноводство. Киев. -1985. -Т.58. -С.39-41.

69. Константинов С.И., Григоращенко Л.В. Изменчивость ценных признаков у проса и их корреляционная зависимость II Селекция и сем-во .-.1987.- №4-С.22-24.

70. Корнилов А.А. Просо: биология, селекция, семеноводство, агротехника. -М.: Сельхозгиз, 1957. -240с.

71. Корнилов А.А. Просо. М., 1960. -247с.

72. Красави В.Д. Идентификация проса сорного и проса посевного. -Оренбург, 2002. -28с.

73. Красави В.Д. Просо сорное и его взаимоотношение с просом посевным. -Оренбург, 2002. -201с.

74. Кретович В.Л. Биохимия растений. -М.: Высшая школа, 1971. -585с.

75. Курцева А.Ф. Биологическая и технологическая характеристика эколого-географических групп проса в различных условиях выращивания. Автореф. дисс. на соиск. уч. степ.канд. с.-х. наук. Л., 1981. - 24 с.

76. Линник В.Н., Константинов С.И., Шапина Л.Я. Создание ценного материала проса методом экспериментального мутагенеза // 4—й съезд генетиков и селекционеров Украины. -Одесса, 1981: Тез. докл. Ч.1.- Киев, 1981. -С.55-56.

77. Лысов В.Н., Плотников Н.Я. Просо. //Руководство по апробации сельскохозяйственных культур. T.II: Крупяные и зернобобовые культуры. -М.: ГИСХЛ, 1949. -С.9-60.

78. Лысов В.Н. Агроботаническая классификация обыкновенного (посевного) проса (Panicum miliaceum L.) // Зерновые к-ры -Л.: ВИР, 1952. С.112-127.

79. Лысов В.Н. Просо. Л.; 1968. - 224 с.

80. Лысов В.Н. Исходный материал в селекции проса// Селекция и семеноводство проса/Науч. тр. ВАСХНИЛ. -М., 1973. -С.14-23.

81. Лысов В.Н. Мировая коллекция — источник выведения устойчивых к болезням сортов проса // Селекция проса на качество зерна и устойчивость к болезням. -М., 1979. -С.11-20.

82. Мазер К., Джинкс Дж. Биометрическая генетика. -М.: Мир, 1985.- 344с.

83. Медведев A.M. О проблеммах увеличения производства и повышения качества продовольственного и кормового зерна // Научное обеспечение производства зерна России.- М.: Зерноград, 2004.-С.27-35.

84. Мерц Э. Новые данные об улучшении белков кукурузы // Биосинтез белка у зерновых культур / Белки семян зерновых и масличных культур.-М.: Колос, 1977 .-С. 139-147.

85. Могутова О.Б. Влияние генетипической среды на формообразовательные процессы в популяциях ячменя, несущие гены ЬУ8:Автореф. дисс.на со-иск.уч.степ. канд. биол . наук. Немчиновка, Москов.обл., 1990. -22с.

86. Молекулярно—биологические аспекты прикладной ботаники, генетики и селекции. /Конарев В .Г., Гаврилюк И.П., Губарева Н.К. и др. -М., 1993, 160с.

87. Мунк Л. Белки семян ячменя // Белки семян зерновых и масличных культур. М.: Колос, 1977. -С.148-167.

88. Мурзамадиева М.А. Просо.- Алма-Ата: Кайнар, 1971. -78с.

89. Мури И.К. Биохимия проса // Биохимия культурных растений. Т.1.- М.-Л., 1958. -С.512-588.

90. Нецветаев В.П., Шмидер В., Демина В.И., Гордеин, пивоваренные свойства и продуктивность ярового ячменя // Физиолого -генетические, основы интенсификации селекционного процесесса. 4.2. -Саратов, 1984. -С.44—45.

91. Нецветаев В.П. Теоретические основы использования белкового полиморфизма для оптимизиции селекционного процесса: Автореф. дисс. на со-иск.уч.степ.докт.с.-х. наук. -С.-П., 2000. -49с.

92. Новикова Н.Е. Физиологическое обоснование роли морфотипа растения в формировании урожайности сортов гороха: Автореф. дисс. на со-иск.уч.степ.докт.с.-х. наук. -Орел., 2002. -46с.

93. Новожилова О.А., Арефьева Л.П., Семихов В.Ф., Вахромеев В.И., Прусаков А.Н. Предпроламины злаков: характеристика и природа фракции // Изв. РАН. Сер. биол. -1993. -№ 2.-С.209-218.

94. Образцов А.С. Потенциальная продуктивность культурных растений -М.: ФГНУ Росинформагротех, 2001. -504с., с илл.

95. Официальный бюллетень Госкоммиссии РФ. М., -1998 -С.200-216.

96. Пенева Т.И., Мартыненко Н.М. Полиморфизм секалина и его использование в изучении генофонда культурной ржи // Тр. по прикл. бот., ген. и сел. Т. 114. -Л., 1987.-С.48-61.

97. Пенева Т.И., Конарев В.Г., Кобылянский В.Д., Лапиков Н.С. Анализ полиморфизма по спектрам секалина в процессе становления сорта озимой ржи Ильмень // С.-х. биология. 1998. -№1. -С.55-61.

98. ЮО.Плешков Б.П. Биохимия сельскохозяйственных растений /Изд.3-е, доп. и перераб. М.: Колос, 1975. -497с.

99. Подвезько В.В. Оценка сортового разнообразия проса в условиях Полтавской области: Автореф. дисс. на соиск.уч. степ.канд. с.-х. наук. Л., 1978. -20с.

100. Подвезько В.В., Курцева А.Ф., Подвезько Е.С. Образцы проса, перспективные для селекции сортов на качество зерна // Науч.-техн. бюл. ВИР. Т. 182. -1988. -С.67-70.

101. Покровский А.А. Роль биохимии в развитии науки о питании. -М.: Наука, 1974.- 125с.

102. Покровский А.А. О биологической и пищевой ценности продуктов // Вопросы питания. -1975. -№3. -С.25^10.

103. Поморцев А.А., Бугрий О.В., Нецветаев В.П., Вовчук С.В., Малиновский

104. B.А., Левицкий А.П., Созинов А.А. Сопряженность аллельных вариантов гордеинкодирующих локусов с некоторыми показателями качества зерна ячменя. // Генетика. -1988. -Т.24, №11. -С.1986-1991.

105. Попов И.В. К изучению проса Panicum miliaceum L. // Вестник опытного дела средне-черноземных областей. -1924. -С.84-93.

106. Попов И.В. Определитель и описание сортов проса (Panicum miliaceum L.) // Руководство к аппробации селекционных сортов важнейших полевых культур Р.С.Ф.С.Р.: Кукуруза. Просо. Ячмень. Клевер. Вып.Ш. -Л., 1929.1. C.95-124.

107. Портянко В.Ф. Биохимия проса // Биохимия культурых растений. -Изд. 2-е. -Т.1.- М.-Л., 1958. -С.561-563.

108. Применение электрофореза белков в первичном семеноводстве зерновых культур, (под ред В.Г. Конарева и В.Г. Еникеева). Санкт-Петербург, ВИР, 1993.-42с.

109. Ю.Прусаков А.Н. Адаптивное значение проламинов в эволюции злаков и при интродукции растений: Автореф. дисс. на соиск.уч.степ.канд. биолог, наук. -М., 2005. -18с.

110. Ш.Пыльнева Е.В. Хозяйственно-биологическая характеристика тетраплоид-ных форм ячменя и некоторые приемы повышения их семенной продуктивности: Автореф. дисс. на соиск.уч.степ.канд. с.-х. наук. М., 1989. - 19 с.

111. Рахимбаев И.Р. Аминокислотный состав белков проса Казахстана // Прикл. биохимия и микробиология. -1967. -Т.З. -Вып.1. -С. 17-20.

112. ПЗ.Рахимбаев И.Р. Исследование биохимических и технологических свойств проса Казахстана: Автореф. дисс.на соиск. уч.степ. канд. биол. наук.1. М.,1967.-27с.

113. Романенко Г.А., Тютюнников А.И., Гончаров П.Л. Кормовые растения России. -М., 1999. -370с.

114. Романов В.А. Агротехника проса. -М.: Сельхозгиз, 1946. -36с.

115. Пб.Романова Ю.А., Губарева Н.К., Конарев А.В., Митрофанова и др.

116. Исследование коллекции вида пшеницы Triticum spelta L. по полиморфизму глиадинов.//Генетика 2001 - Т.37. - №9. - С. 1258-1265.

117. Семихов В.Ф., Гильзин В.М., Калистратова О.А., Арефьева Л.П. Аминокислотный состав и электрофоретические особенности белков различных частей зерновки ржи // Бюл. Гл. ботан. сада. -1977. -Вып. 106. -С.58-62

118. Семихов В.Ф. Исследование аминокислотного и фракционного состава белка семян трибы Panicae R. BR. в связи с систематикой и филогенией // Бюл. МОИП. Отд. Биол. -1984. -Т.89. -Вып.2. -1984 -С.105-114.

119. Семихов В.Ф. Об адаптивной роли проламинов в эволюции и распространении семейства злаков // Журн. общ. биол. -1990. -Т. 51, № 3. -С.673-681.

120. Семихов В.Ф., Новожилова О.А., Арефьева Л.П. Основные направления изменений в аминокислотном составе семян однодольных в процессе эволюции // Изв. РАН. Сер. биол. -1998. -№ 5. -С.566-579.

121. Семихов В.Ф., Арефьева Л.П., Новожилова О.А., Прусаков А.Н., Тимощенко А.С. Адаптивные типы проламинов, специализированных белков семян злаков (POACEAE BARNH.) // Известия АН. Сер.биологическая. -2000. -№ 3. -С.303-321.

122. Сидоренко B.C. Использование новых методов в селекции проса // Сб. статей Всероссийской научно-практической конференции /Современное состояние и перспективы развития селекции и семеноводства с.х. культур в

123. РФ.- Пенза.- Вып. 2.,Ч. 1. 1998.- С.90-93.

124. Сидоренко B.C., Гуринович С.О. Мутантные морфотипы проса (Panicum miliacium L.): Материалы научно практической конференции / Пути повышения эффективности сельскохозяйственной науки. -Орел: Орел ГАУ, 2003.- 426с. (С.333-340)

125. Созинов А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. -М., 1985. -272с.

126. Соколов О.А., Керимова Н.Г., Семенов В.И., Семихов В.Ф. Характер включения азота удобрений в белки вегетативных органов растении // Химия в сельском хозяйстве. -1985. -№ 3. -С.20-25.

127. Соломатина Л.Г., Филонова Л.Р., Остапенко М.И. Химический состав и физико-химические свойства просяного масла // Лекарственные растения Алтайского края. -Барнаул, -1987, -С.102-104.

128. Стрельченко П.П., Малашев Л.Л. Молекулярные маркеры в изучении структуры генофондов культурных растений // Генетические ресурсы культурных растений: Международная научно—практическая конференция -С.-П., 2001. -С.169-171.

129. Стрельченко П.П., Ковалева О.Н., Окуно К. Молекулярно—генетический подход к анализу дифференциации и географического распространения культурного ячменя // С.-х. биология. 2002. -№3. -С. 41-56.

130. Сулимова Г.Е. Полиморфизм длин рестриктазных фрагментов ДНК у сельскохозяйственных животных: методы изучения и перспективы использования // Успехи современной генетики. -1993. Вып. 5. -С.3-35.

131. Тарарина В.В. Морфологические особенности сортов яровой пшеницы разных лет селекции в центральном районе Нечерноземной зоны РСФСР: Автореф.дисс.на соиск.уч.степ. д-ра с.-х. наук. -М., 1989. -22с.

132. Томмэ М.Ф., Мартыненко Р.В. Аминокислотный состав кормов. -М.: Колос, 1972. -288с.

133. Хавкин Э.Е. Молекулярные маркеры в растениеводстве // С.-х. биология.-1997. -№5. -С.3-21.

134. Хаджинов М.И. Селекция самоопыляющихся культур. -М., 1969. -20с.

135. Ходырев Н.Г. Гибридизация в селекции проса на урожайность и качество зерна.//Селекция и семеноводство проса/Науч. тр.ВАСХНИЛ. М., 1976. -С. 106-110.

136. Цвелев Н.Н. Заметки о злаках флоры СССР, 5 // Новости систиматики растений. Т.5. -Л.: Наука, 1968. -С. 15-30.

137. Чернявская З.С. Могарообразное просо //Селекция и семеноводство зерновых культур: Сб. науч. работ за 1946-1950гг. / Под ред. В.Я. Юрьева.-М.: Сельхозгиз, 1953. -С. 100-105.

138. Чмелева З.В., Курцева А.Ф. Коллекция проса как исходный материал для селекции на качество зерна // Тр. по прикл. бот., ген. и сел. -Л., 1980. -Т.69, Вып.1. -С.70-75.

139. Шакирова Г.И. Пигментный, аминокислотный и химический состав зеленой массы кормового проса в зависимости от сортовых особенностей // Сб. науч. тр. Татар. НИИСХ. -Казань, 1987. -Т.15. -С.32-37.

140. Юдина Э.В. Агроклиматические условия возделывания проса на европейской территории СССР. //Бюл. ВИР. -Л., 1978. -Вып.7. -С.34-38.

141. Юлиано Б. Исследование качества и количества белка в зерне риса // Биосинтез белка у зерновых культур. -М.: Колос, 1977. -С.117-129.

142. Якименко А.Ф. Просо. М.: Россельхозиздат, 1975. -146с.

143. Ямалеева А.А., Ямалеев A.M., Агафонов Н.П. Устойчивость проса к пыльной головне по данным электрофоретического и иммунохимического анализа белков семян // Экологические аспекты гомеостаза в биогеоценозе,1. Л. 1986. —C.l 31—139.

144. Ямалеева А.А., Агафонов Н.П. Характеристика различных эколого-географических групп проса по электрофоретическим спектрам проламинов // НТБ ВИР. -Вып.219. -С.-П., 1992. -С.68-73.

145. Ярош Н.П. Количественный и качественный состав белка и крахмала в зерне различных эколого-географических групп проса // Тр. по прикл. бот., ген. и сел. Т.37. -Л., 1965. -С.50-56.

146. Ярош Н.П., Агафонов Н.П. Качество белков и их содержание в зерне сортового разнообразия проса и просовидных культур // Бюл. ВИР. Вып.59. -Л., 1976. -С.8-14.

147. Ярош Н.П. О возможности повышения качества зерна сортов крупяных культур // Тр. по прикл. бот., ген. и сел. Т.59, Вып.З. -Л., 1977. -С.69-79.

148. Ярош Н.П., Курцева А.Ф. Измечивость биохимических показателей качества зерна проса в зависимости от генотипа и условий выращивания в разных зонах // Бюл. ВИР. Вып. 149. Биохимия сельскохозяйственных растений. -Л., 1985. -С.23-29.

149. Яшовский И.В. Генетические основы селекции проса (Panicum miliaceum L). Автореф. дисс.на соиск.уч. степ, доктора с.-х. наук. -Харьков, 1975. -50с.

150. Яшовский И.В. Генетика проса // Генетика культурных растений: кукуруза, рис, просо, овес. -Л., 1988. -С.211-226.

151. Яшовский И.В. Селекция и семеноводство проса. М.: Агропромиздат, 1987. -268с.

152. Barthels D., Thompson R.D. Synthesis of mRHA coding abudent endospermprotein during wheat grain development // Plant Sci. -1986. -V. 46. № 2- P. 117125.

153. Barua U.M., Chalmers K.J., Hakett C.A. et al. Identification of RAPD markers linked to a Rhynchosporium secalis resistence lokus in barley using near-isogenic lines and bulked segregant analysis //Heredity.- 1993.- V.71.- P.177-184

154. Bough M., Colosi J.C., Cavers P.B. The major weedy biotypes of proso millet panicum miliaceum in Canada// Can. J. Bot. -1986.- V.64, -P. 1188-1198.

155. Chandna M., Matta K.N. Characteristics of pearl millet protein fractions// J Biol Chem.-1990. -V.29. -P.3395-3399.

156. Colosi J.C., Schaal B.A. Wild proso millet (Panicum miliaceum) is genetically variable and distinct from crop varieties of proso millet// WeedSc.-1997.-Vol.45, N4. -P.509-518.

157. FAO /WHO. Energy and protein requirements. Report of a Joint FAO/WHO ad Hoc Expert Committee, WHO Techn. Rep. Ser. No. 522.- Geneva, 1973.- P.64-65

158. FAO Structure and characteristics of the world millet economy / Comm.on commodity problems.Intergov.group on grains,24.sess.-Rome,6-9 Nov. -2000 -15p.

159. Frey K.J. // Pflanzenzucht. 1977. -B.78. H.3. -S.185-215.

160. Hatliger E., Schelz H. Grass Weeds VI. -Basel, 1981. -400 p.

161. Higgins T.J.V. Synthesis and regulation of major proteins in seed//Ann. Rev. Plant Physiol. -1984. -V. 35.- P. 191-221.

162. Johnson V.A. et al. Breeding for high protein condent and quality in wheat // New App. To Breding for Improved Plant Protein, 1969.

163. Kumar A.; Chawdhury R.K.; Kapoor R.L.; Dahiya O.S. Identification of pearl millet hybrids and their parental lines using seed and seedling characters,chemical tests and gel electrophoresis // Seed Sc.Technol.- 1995- Vol.23,N 1 P. 21-32

164. Kumar K.K.; Parameswaran K.P. Characterisation of storage protein from selected varieties of foxtail millet (Setaria italica (L) Beauv // J.Sc.Food Agr.-19981. Vol.77,N4.-P. 535-542

165. Laemmli U.K. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4//Nature. -1970. -V. 227. N 5259.- P. 680-685.

166. Lee M. DNA markers and plant breeding programs.//Adv. Agron.- 1995.- 55: 265-344.

167. Lorenz K., Dilsaver W. Reological propertis and food aplication of Pro so Millet Flouzs.// Cereal Chemistry- 1980.-V.57 №1- P.21-24.

168. Martin G.B., Williams J.G.K., TanksleyS.D. Rapid identification of markers linked to Pseudomonas resistance gene in tomato by using random primers and nearisogenic lines//Proc. Natl Acad. Sci. USA. -1991.- V. 88. -P. 2336-2340.

169. Miller S.D., Whitson T. Identification and control of wild proso millet. //Univ. Wyo. Bull. -1986. -P. -853.

170. Mosse J.; Baudet J.; Huet J.-C. Relationships between amino acid composition and nitrogen of foxtail (Italian) millet (Setaria italica) grain of different varieties // J. Sc. Food Agr.- 1989.- T. 46, N 4.- P. 383-392

171. Gaut B.S., Clegg M.T. Nucleotide Polymorphism in the Adhl Locus of Pearl Millet (Pennisetum glaucurn) (Poaceae) // Genetics. 1993. -V.135. -P.1091-1097

172. Parvathy Parameswaran K., Thayumanavan B. Homologies between prolamin of different minor millets. Plant Foods Human Nutr 1995- V.48- P. 119-126.

173. Ramachandra G., Virupaksha Т.К., Shadaksharswamy M. Comparison of the protein fractions of finger millet. Phytochemistry -1978- V.ll- P.1487-1490.

174. Reeves C.D., Krishnan N.B., Okita T.W. Gene expression in development wheat endosperm. Accumulation of gliadin and ADP-glucose pyrophosphorylase messenger RNAs and polypeptides // Plant Physiol. -1986. -V. 82. № l.-P. 34-40.

175. Sanchez de la Ног M.P., Davila JJL, Loarce V.t Ferrer E. Simple sequence repeat primers used in poly-merase chain reaction amplification to study genetic diversity in barley // Genome.- 1996.- V. 39. -P. 112-117.

176. Scholz H., Mikolas V. The weedy representatives of proso millet (Panicum miliaceum) in Central Europe.- Thaiszia, Kosice 1:1991- P.31—41.

177. Sidorenko V., Bobkov S. Influence of mutant genes on productivity of millet (Panicum miliaceum L). Vortrage fur Pflanzenzuchtung. Poster abstracts of Mendel Centenaty Congress.- Brno, ChechRepublic-2000-H .47.-P.71

178. Siles M.M.; Baltensperger D.D.; Nelson L.A.; Marcon A.; Frickel G.E. Registrations of five genetic marker stocks of foxtail millet // Crop Sc.- 2001.-Vol.41,N 6. P. 2011-2012

179. Smith J.S.C. Plant breeder's rights in the USA; changing approaches and appropriate technologies in support of germplasm enhancement.// Plant Varieties and Seeds- 1992.-H 5.- P.183-199.

180. Tulach I. Biochemicka sledovani nasich odrud prosa.// Rostl. Vyroba, 1959-R.5. №8. -S 1159-1166.

181. Warwick S.I. Isozyme variation in proso millet. //J. Heredit- 1987- 78- P.210-212.

182. Weber K., Osborne M. The reliability of molecular weight determination by Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis // J. Biol. Chem.- 1969. -Vol. 244.- P. 4406-4412.

183. Weising K., Nybom H., Wolff K. e.a. DNA fingerprinting in plants and fungi // CRC Press, 1995. -P.105-127.

184. Yang X., Qurios C. Identification and classification of celery cultivarus with RAPD markers // Theor. Appl. Genet. -1993. -V.86.- P.205-212.