Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимизация основных характеристик кондуктометрических ферментных сенсоров для анализа реальных образцов

ВАК РФ 03.00.20, Гельминтология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация основных характеристик кондуктометрических ферментных сенсоров для анализа реальных образцов"

^ НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

тсЛ ____________

ІНСТИТУТ вюхші! ш О.В.Палладша

АРХИПОВА Валентина Миколаївна

УДК 577.15.08 + 577.151.35 543.257.5

ПТИМІЗАЦІЯ ОСНОВНИХ ХАРАКТЕРИСТИК КОНДУКТОМЕТРИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ БІОСЕНСОРІВ ДЛЯ АНАЛІЗУ РЕАЛЬНИХ ЗРАЗКІВ

03.00.20 - біогехнологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ-1998

Д исертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі механізмів трансляції генетичної інформації Інсгит молекулярної біологи та генетики НАН України.

Науковий керівник - кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Солдаткін Олексій Петрович,

старший науковий співробітник Інституту молекулярної біолог генетики НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

ДМИТРЕНКО Микола Петрович,

керівник лабораторії біохімії Інституту екогігіени і токсиколі ім.Л.І.Медведя МОЗ України;

кандидат хімічних наук, старший науковий співробітник НІГМАТУЛЛШ Рінат Равільович

старший науковий співробітник відділу фізико-хімії мембран Інсти-г колоїдної хімії та хімії води імені А.В. Думанського НАН України.

Провідна установа - Інститут мікробіології і вірусології ім Д.К.Заболотного НАН У краї і відділ біохімії мкрорганізмів, м.Київ

Захист відбудеться « 50 » іЛС*1998 року о 14 голині на засідаї

спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім.О.В.Палладіна НАН Украї (252601, Київ-30, вул.Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біохімії ім.О.В.Палладі НАН України.

Автореферат розісланий «$£ » Огсісс/ 1998

року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук г/.. Кірсенко О.В

/б** ■Iі'

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Потреби сучасної медицини, екології та біотехнології вимагають зрения нових аналітичних систем, що мають високу специфічність та чутливість і разом з тим є іевими, простими у використанні та компактними. Розробка та впровадження таких систем гь змогу успішно сприяти діагностиці та лікуванню захворювань, вирішувати проблеми тролю та регуляції біотехнологічних процесів, а також моніторингу навколишнього гдовища. Серед таких систем велику увагу приділяють біосенсорам - приладам нового оління, які поєднують в собі біоселективний елемент з фізичним перетворювачем. Протягом інніх років промислове виробництво біосенсорів у світі зробило величезний стрибок. Так, Ю у 1993 році ринок біосенсорів складав 150 млн. доларів, то у 1997 р. він склав більш ніж 1 ід. [Weetal, 1996, Turner, 1998]. За прогнозами експертів до 2000 року очікується його іьщення до 2 млрд. доларів [Gibson, 1996].

Роботи, що були розпочаті в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України у іробітництві з кафедрою фізики напівпровідників радіофізичного факультету Київського іерситету ім. Тараса Шевченка показали, що при створенні ферментних сенсорів доцільним є ористання електрохімічних перетворювачів, оскільки за їх допомогою можна проводити аналіз ірвлених зразків, а в деяких випадках електрохімічні методи більш чутливі та прості за циційні. Оскільки чутливість аналізу, як правило, обмежується границею визначення фізичного етворювача, тому його вибір є надзвичайно важливим. Попередні роботи співробітників юго Інституту показали перспективність використання перетворювачів, виготовлених за нологією мікроелекгроніки, а саме pH-чутливих польових транзисторів [Солдаткин и др., 1993] ндукгометричних планарних електродів [Дзядевич и др., 1993], але широке використання їх на ктиці лімітується рядом недоліків. У деяких випадках це недостатньо висока стабільність ;енсорів на основі цих перетворювачів, але частіше за все - вузький лінійний діапазон центрацій речовин, що визначаються. Крім того, робочі характеристики наведених біосенсорів іачній мірі залежать від умов проведення аналізу, що потребує постійного врахування цього ; складанні протоколів вимірів.

Таким чином, актуальним для усунення вищевказаних недоліків та можливості практичного ористання розроблених раніше лабораторних прототипів біосенсорів є проведення детального лідження факторів, що покращують ефективність роботи як електронного перетворювача, так і ого біосенсора, опгимізуючи при цьому основні аналітичні характеристики його роботи.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота онувалась в рамках бюджетної теми Інституту молекулярної біології та генетики № 2.2 .4.22 ізробка наукових засад створення біосенсорів на основі кондуктометричних перетворювачів», курених проектів № 5.4/74 «Вивчення молекулярних аспектів рецепторних взаємодій у :лектронних системах» Управління фундаментальних досліджень та № 02.12/01962 «Розробка зенсорів нового покоління для аналізу та контролю біотехнологічних процесів» Департаменту

науково-прикладних програм Міністерства України з питань науки та технологій та Міжнародн КАТО-Ьіпіа^е гранта ENVIR.bG 950913

Мета і задачі дослідження. Головною метою роботи була оптимізація електрохімія) характеристик ферментних біосенсорів і створення на їх основі високоефективних і стабільї приладів для аналізу реальних зразків.

Виходячи з мети роботи, були поставлені такі задачі:

1. Всебічно дослідити вплив умов проведення експериментів, матеріалів, форми та розм електродів на характеристики кондуктометричних перетворювачів і розробити практи рекомендації щодо їх оптимального вибору для створення ферментних біосенсорів.

2. Провести порівняння робочих характеристик біосенсорів на основі кондукгометричі перетворювачів та рН-чутливих польових транзисторів для кількісного аналізу пеніциліну.

3. Провести оптимізацію характеристик раніше розробленого лабораторного прототі глюкозного кондуктометричного біосенсора та створити його вдосконалений варіант, дозволяє роботу з реальними рідинами.

4. Розробити практичні рекомендації та протоколи експериментального визначеі концентрацій глюкози в реальних зразках (кров і культуральні рідини) за допомог кондуктометричного біосенсора.

Наукова новизна одержанні печультатів. У роботі знайшло подальший розви моделювання електрохімічних процесів у комірці з кондуктометричними перетворювачами допомогою еквівалентних електричних схем, що описують ці процеси. Вперше запропоноваї ряд пріоритетності використання різних матеріалів для створення кондукгометричі перетворювачів Показано, що чутливість датчика не залежить від характеристичних розм: електродів та матеріалу непровідної підкладинки, а для створення ферментного біосенсора цілі придатні електроди з деяких неблагородних матеріалів.

Вперше розроблено лабораторний прототип ферментного сенсора для визначеі пеніциліну на основі кондуктометричних планарних електродів, і проведено порівняльний ан< його робочих характеристик з аналогічними параметрами сенсору на основі рН-чутли; польових транзисторів. Показано, що аналітичні характеристики обох датчиків подібні, ал технологічної точки зору планарні тонкоплівчасті електроди більш прості та дешеві, що робит: перспективнішими для масового виробництва і застосування на практиці.

Розроблено глюкозний кондукгометричний біосенсор з аналітичними характеристиками, дозволяють його використання для аналізу реальних зразків без попередньої обробки остані Вперше для кондуктометричних біосенсорів показано, що розширення лінійного діапазону до мМ глюкози можна досягти при використанні фериціаніду калію, як альтернативного кис окислювача. Іншим шляхом розширення динамічного діапазону роботи глюкозного біосенсої використання додаткових напівпроникних мембран, застосування яких до того ж покращує й

з

новні аналітичні характеристики, а саме чутливість і стабільність, а також зменшує вплив редовида на відгук сенсора.

Вперше було проведено аналіз концентрацій глюкози в реальних зразках (кров і культуральні дани) за допомогою розробленого кондуктометричного біосенсора та показано високий ступінь реляції з результатами, одержаними класичними методами.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Запропоновано декілька іяхів цілеспрямованої зміни аналітичних характеристик кондуктометричних ферментних зсенсорів, зокрема чутливості та динамічного діапазону вимірювань, та проведено їх детальний аліз.

Розроблено практичні рекомендації щодо оптимального вибору матеріалів, форми та змірів електродів при виготовлені кондуктометричних пленарних перетворювачів, які користовуються як основа ферментних біосенсорів.

Створено діючі лабораторні моделі ферментних біосенсорів на основі кондуктометричних анарних електродів і pH-чутливих польових транзисторів для визначення концентрацій ніциліну. Аналітичні характеристики розроблених сенсорів вказують на перспективність їх користання в біотехнологічних процесах для кількісного аналізу пеніциліну.

Створено аналітичні прилади на основі глюкозних кондуктометричних біосенсорів, які було ггосовано для аналізу концентрацій глюкози в крові щурів з Чорнобильскої зони відчуження, та льтуральних середовищах при контролі біотехнологічних процесів у лабораторній практиці зрощування клітин Klebsiella oxitoca) і промисловості (виробництво лужної протеази та юкоамілази). Розроблено протоколи експериментального визначення концентрацій глюкози в альних зразках за допомогою кондуктометричних біосенсорів.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота була виконана під керівництвом

5,н. Солдаткіна О.П. у відділі академіка НАНУ Єльської Г.В. Основні експериментальні зультати були отримані здобувачем особисто. Частина матеріалу була отримана у івробітницгві з к.б.н. Дзядевичем С.В., к.ф.-м.н. Шульгою О.А., з якими автор має спільні блікації. Експериментальні установки були виготовлені за допомогою Пацковського С.В.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на 7 іропейському Конгресі по біотехнології (Ніца, Франція, 1995), Міжнародній конференції NATO VW «New trends in biosensors development» (Ворзель, Україна, 1998).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 робіт, у тому числі б статей.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду гератури, опису матеріалів та методів дослідження, експериментальної частини, яка включає клад результатів роботи та їх обговорення (у 4 главах), висновків, списку літератури, який лючає 141 джерело, та 2 додатків. Робота викладена на 131 сторінці машинописного тексту і стить 58 рисунків та 8 таблиць.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

У роботі використовували реактиви: 3-глюкозооксидаза (ГОД) з Репісіїїіит vitale (К 1.1.3.4, виробництво Косарського спиртзаводу Черкаського виробничого об'єднання спиртов промисловості, Україна) з активністю 168 од.акт./мг., каталаза з печінки бика (КФ 1.11.1. виробництво фірми "Sigma", Франція) з активністю 19,9 од.акт./мг., пеніциліназа з Bacillus cere (КФ 3.5.2.6, виробництво фірми "Sigma", США) з активністю 2150 од.акт./мг; сироваткові альбумін бика (БСА) (виробництво фірми "Boehringer Mannheim", Франція), 20 % розчі глугарового альдегіду (ТА) (виробництво фірми "Merck", Німеччина), натрієва сі бензилпеніциліну (500000 од., виробництво Київського заводу медпрепаратів), фериціанід кал: Kj[Fe(CN)o] (виробництво фірми "Merck", Німеччина), глюкоза (виробництво фірми "Sigm; Франція), полімери для створення додаткових мембран: полівінілбутираль (ПВБ)

політетрагідрофуран (ПТГФ) (виробництво фірми "Aldrich Chem. Co.", США), нафіо перфторований іонообмінний полімер (5 % розчин в суміші аліфатичних спиртів що містить 10 води), (виробництво фірми "Aldrich Chem. Co.", США, продукт Jfe 27.470-4), співполім (4-вінілпіридину зі стиролом) - іонообмінний полімер (ПВКС) (виробництво фірми "Aldrich Chei Co.", США, продукт № 19.207-4). Як буферні системи використовували KH2P04-Na0H фір* "Merck" (Німеччина), тріс-НСІ фірми "Reanal (Угорщина) та універсальний буфер [Soldatkin et а 1994]. Інші реактиви, що використовувались в роботі, були вітчизняного та закордонно виробнищ-ва та мали кваліфікацію "ос. ч." та "х. ч.".

Кондукгометричні перетворювачі були виготовлені як на Україні: Київський радіозавод ВО «Кристал», так і за кордоном: Інститут мікроелектроніки м. Ньюшатель (Швейцарія) Інститут хемо- і біосенсорики м. Мюнстер (Німеччина). їх загальна конструкція та осное характеристики описано в роботі [Дзядевич и др., 1994].

pH-Чутливі польові транзистори було виготовлено в НДІ «Мікроприлад» (м.Київ, Україні їх конструкція та характеристики описано в роботі [Shul’ga et al., 1996].

Методики створення ферментних біоматриць на поверхні електродів та додаткових мембр, детально описано у роботах [Архипова и др., 1996, Архипова, 1998].

Схеми експериментальних установок для проведення імпедансних вимірів та досліджень використанням біосенсорів, а також методики проведення експериментів детально описано роботах [Дзядевич и др., 1994, Soldatkin et al, 1994, Архипова и др., 1996, Архипова, 1998].

Протоколи аналізу субстратів у реальних рідинах за допомогою біосенсорів описано роботах [Soldatkin et al., 1998, Сльська, 1997]. ■

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Дослідження роботи тоіікоплівчастих кондуктометричних перетворювачів У роботі в основному використовували кондукгометричні перетворювачі, зовнішній вигл яких представлено наРис. 1.

Рис.1. Зовнішній вигляд кондуктометричнаго перетворювача.

При нанесенні на його поверхню біоселективної мембрани датчик перетворюсгься в ндуктометричний біосенсор, який схематично представлено на Рис.2а, а фізико-хімічні процеси,

> протікають в електрохімічній комірці з ним, в загальному випадку моделюються вівалентною схемою, яку представлено на Рис. 26.

С конт

І С геом

С м-р

-чь-

к розч

С окясл С окисл

Zпoв —Д—1 1—П~

— ■ 1 Км

X пов

а)

б)

с. 2. Кондуктометргічний біосенсор (а) та еквівалентна схема, що моделює фізико-хімічні процеси в

комірці з ним (б).

Розглянемо цю еквівалентну схему.

Ланцюг а - С,мт - ємність контакіів та дротів, що здійснюють з’єднання з вимірювальною стемою. Звичайно її величина залежить від їх матеріалу та змінюється від 0,1 до 1 пФ.

Ланцюг б - Сге™ - геометрична ємність самих металевих гребінок перетворювача. Звичайно її тичина залежить від матеріалу гребінок, їх геометрії та розмірів і змінюється від 0,1 до 1 пФ.

Ланцюг в - електрохімічний імпеданс, що описує область поза мембраною. Він складається з ох однакових ємностей СЧТ1, що відповідають за межу розподілу мембрана/розчин, та опору ,м, що моделює провідність розчину поза мембраною.

Ланцюг г - електрохімічний імпеданс, що описує область всередині мембрани. Ві складається з двох однакових поверхневих імпедансів Znm, що відповідають за межу розподіг електрод/розчин, ДВОХ однакових ємностей СокнсЛ) ЩО моделюють процес окислення матеріал електродів, опору Б»,, що моделює провідність розчину всередині мембрани.

При роботі кондукгометричного ферментного біосенсора ланцюгами а, 6, і в иош знехтувати, і наша еквівалентна схема приймає більш простий вигляд [Дзядевич и др., 1994].

Було проведено математичне та експериментальне моделювання такого еквівалентної ланцюга, побудовані теоретичні імпедансні криві. Також були отримані реальні імледансні кри перетворювачів та еквівалентної електричної схеми. На основі порівняння теоретичних і експериментальних даних було доказано правильність запропонованої моделі та вибрані найбільї оптимальні умови проведення експериментів з кондуктометричними ферментними біосенсорам [Дзядевич и др., 1994].

Наступним етапом роботи було детальне вивчення залежності характеристик перетворювачі від типу матеріалу, розмірів та геометри електродів.

Досліджувався ряд структур із електродами, виготовленими з Аи, №, Сг, Си, К, Ті, АІ. І рис.З представлено залежності реальної частини адмітгансу електрохімічної комірки від частот струму при вимірах у бідисгильованій воді та 1 мМ розчині КС1 для електродів із Аи, №, Сг та Си однаковими геометрією та розмірами.

Рис. 3. Залежність реальної частини адміттансу від частоти струму для електродів із різні

Рис. 4. Залежність відгуку сенсору від концентрації КСІ для електродів, виготовлених з різних металів: 1 АІ, 2-Ti.3-Cr.4-Ni, 5-Аи, б-Си, 7-Рі.

Із рисунка добре видно, що адміттансні криві всіх структур мають подібну форму. П{ збільшенні провідності середовища відбувається збільшення загального адмітгансу системи т відповідно, збільшується його реальна частина - провідність. При цьому для всіх електродів фор» кривих та взаємне розташування зберігаються. Ь цього ряду випадають тільки Си-електроди, тол що на їх поверхні дуже швидко утворюється шар окислу, який призводить до появи Сюны та змін форми адміттансної кривої. Це також веде до зменшення чутливості датчика. Однак, на висом

м

100 101 102 ЮЗ 10* 10* 10«

Частота, Ґц

1Є-5 1Е-4 1Ё-3 0,01 0,1

Концентрація КС), М

матеріалів.

потах (від 50 кГц), коли електродними процесами можна знехтувати, реальні частини чіттансу всіх зразків подібні, що ще раз підтверджує положення про вибір високих частот для введення вимірів.

В подальших експериментах досліджувалась чутливість електродів з різних матеріалів до іни концентрації КС1, при цьому моделювалась зміна провідності під час ферментативної реакції ісА). З рисунку видно, що найбільшу чутливість до зміни концентрації КС1 мають електроди, готовлені із ЇЧ. Чутливість Аи-, Си-, №- електродів трохи менша, але подібна для всієї групи, ці як Сг-, Ті-, а особливо А1- електроди показують значно меншу (на порядок) чутливість. Це бить небажаним використання їх при створенні кондуктометричних ферментних біосенсорів. я виготовлення кондуктометричних ферментних біосенсорів необов’язково використовувати ше благородні метали (Аи та Р0, а цілком придатні більш дешеві матеріали (№, Си), тому що ретворювачі на основі цих металів в цілому мають аналітичні характеристики, аналогічні ретворювачам на основі благородних металів. Але у випадку використання мідних електродів обхідно враховувати фактор часу роботи датчиків, тому що відбувається дуже швидке ислення поверхні електроду, і, відповідно, зниження чутливості.

Наступним важливим моментом при розробці перетворювача є вибір матеріалу підкладинки. му було проведено дослідження датчиків і електродами, нанесеними на скло, ситал та оксид емнію. Було показано, що матеріал підкладинки не впливає в значній мірі на чутливість датчика зміни провідності середовища. Основною вимогою, яку необхідно пред’являти до матеріалу ;кладинки при виготовленні перетворювача, - він повинен бути непровідним. З технологічної чки зору найбільш зручно використовувати скло, яке, з одного боку, найбільш дешевий теріал, а з другого - найменш крихкий.

Наступною важливою задачею було проведення експериментів по дослідженню впливу змірів пальців гребінок та відстані між ними на чутливість датчиків. Вивчались дві трупи гчиків. Перша складалась з елеісгродів з характеристичними розмірами 20, 40 та 70 мкм та гивною чутливою поверхнею 2.25 мм2, друга - з 10, 5, 2 и 0.5 мкм електродів з поверхнею

> мм2. Для всіх зразків спостерігались подібні адміттансні криві.

На рис. 5 представлені залежності чутливості датчиків від концентрації солі в розчині для ектродів з різними характеристичними розмірами. Для обох груп електродів чітко видно нденцію зменшення чутливості датчиків зі зменшенням розмірів «пальців» гребінок та відстані ж ними, тобто, при мініатюризації сенсора не треба технологічно складного збільшення іькості пальців на електроді за рахунок зменшення їх розмірів, як це вважалось раніше, ініатюризацію можна проводити шляхом відносного зменшення як робочої поверхні електроду, к і характеристичних розмірів гребінок. Але, з іншого боку, не можна виготовляти електроди з ликими «пальцями» (хоча чутливість перетворювача може бути більшою), тому що в цьому падку критичною для чутливості сенсора є товщина мембрани. Основним при виборі розмірів

сенсора є співвідношення між товщиною мембрани, характеристичними розмірами електродів їх активною площиною.

0.01

10 мхм

1Є-3

1Е-6 1Е-5 1Є-4 1Е-3 0,01 0.1

Концентрація КСІ, М

1Е-6 1Є-5 1Є-4 1Є-І 0,01 0,1

Концентрація КСІ, М

(а)

(б)

Рис. 5. Залежність відгуку сенсору еід концентрації КСІ для електродів з різними характеристичні розмірами (а - перша група, б - друга група).

Розробка ферментних біосенсорів на основі кондуктометричних планарних ЕЛЕКТРОДІВ ТА РН-ЧУТЛИВИХ ПОЛЬОВИХ ТРАНЗИСТОРІВ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ПЕНІЦИЛІНУ ТА порівняння їх основних АНАЛІТИЧНИХ ХАРАКТЕРИСТИК Наступна задача, що стояла перед нами, - розробити ферментні сенсори на осн кондуктометричних перетворювачів та рН-чутливих польових транзисторів ДЛЯ КІЛЬКІСНІ аналізу пеніциліну та провести порівняння їх основних робочих характеристик.

В процесі реакції ферментативного гідролізу пеніциліну під дією пеніцилінази в мембр утворюються додаткові іони, які призводять до зміни як pH розчину, тах і його провідності, дозволяє використовувати для вимірів обидва типи перетворювачів [Архипова и др., 1996].

На рис. 6 представлені калібрувальні криві пеніцилінових біосенсорів на осн кондуктометричних планарних електродів (а) і рН-чутливих польових транзисторів (б), отримаї фосфатному буфері, pH 7, різної концентрації.

Можна бачити, що в обох випадках спостерігається такий ефект: з одного боку, збільшеї концентрації буферу призводить до розширення динамічного діапазону роботи датчика, щ< позитивним моментом, а з іншого боку, - до падіння величини відгуку, а відповідно чутливе сенсора, що є негативним моментом. При збільшенні концентрації буферу в 10 разів відбуваегі падіння амплітуди відгуку теж в 10 разів. Для кондуктометричного сенсора це пояснюєть головним чином, зростанням іонної сили розчину при збільшенні концентрації буферу [Архиго и др., 1996]. Відгук сенсора на основі рН-ПТ не залежить в такій мірі від іонної сили. В цьс

іпадку основним лімітуючим фактором є саме буферна ємність. Однак в обох випадках ми маємо зжливість підбирати необхідний діапазон робота сенсора, змінюючи буферну ємність зразку.

Концентрація пеніциліну, мМ Концентрація пеніциліну, мМ

(а) (б)

іс. 6. Калібрувальні криві пеніцшіиових біосенсорів па основі кондуктометричних електродів (а) і рН-чутливих польових транзисторів (б), отримані у фосфатному буфері, pH 7, різної концентрації.

Таким чином було показано, що основні аналітичні характеристики обох датчиків подібні, інсори характеризуються малим часом відгуку та високою операційною стабільністю. Але з їхнологічної точки зору планарні кондуктометричні електроди простіші та дешевші при і готовленій, що робить їх більш перспективними для створення біосенсорів.

Кондуктометричні біосенсори було використано для аналізу вмісту бензилпеніциліну в ;яких комерційних препаратах антибіотиків різних заводів-виробників. Результати експериментів іведеновтабл.1.

Таблиця 1.

!> П/П Субстрат Завод-виробник Відгук, мкСм Похибка, %

1 Натрієва сіль бензилпеніциліну Київський завод медпрепаратів 51,6+1,6 3,1

2 Калієва сіль бензилпеніциліну Саранський завод медпрепаратів 45,6+2,3 5,0

3 Натрієва сіль бензилпеніциліну Красноярський з-д медпрепаратів 51,6+2,1 4,1

4 Калієва сіль бензилпеніциліну Київський завод медпрепаратів 46,0+1,8 3,9

5 Натрієва сіль ампіциліну Київський завод медпрепаратів 18,0±1,6 8,8

б Новоцин Київський завод медпрепаратів 25,2±2,3 9,1

Як видно з таблиці (зразки 1-4), відгуки сенсора на одну і ту ж лікарську форму антибіотика ;алієва чи натрієва сіль) були однакові для препаратів різного походження, що свідчить про знаковий вміст антибіотика. Крім того, для оцінки селективності біосенсора були використані іші препарати антибіотиків пеніцилінового ряду (зразок 5, 6). Як можна бачити з таблиці, сенсор ї характеризується абсолютною селективністю. Відгуки на ампіцилін та новоцин складали 35 % 149 %, відповідно.

ОПТИМІЗАЦІЯ РОБОТИ ГЛЮКОЗНОГО КОНДУКТОМЕТРИЧНОГО БІОСЕНСОРА ТА ДОСЛІДЖЕННЯ ФАКТОРІВ, ЩО ПОКРАЩУЮТЬ ЙОГО АНАЛІТИЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ

В основі роботи кондукгометричного біосенсора для визначення глюкози лежить реєстрац зміни концентрації протонів, яка має місце в результаті диссоціації глюконової кислоти, яі утворюється в мембрані при окисленні глюкози за допомогою ГОД за схемою:

ГОД

(З-О-глюкоза + 02 + НгО--------> Б-глюконо-б-лактон + Н2О2

4

глюконова кислота

ІТ

глюконат-іон + Н

Раніше розроблений біосенсор [БЬиІ^а еі аі., 1993] мав область лінійної залежності величні відгуку сенсора від концентрації субстрату 0,1 - 1,5 мМ. Крім того, він характеризувався значно залежністю характеристик від факторів середовища: буферної ємності, іонної сили та pH, и ускладнювало проведення експериментів з реальними рідинами.

Вузький діапазон роботи глюкосенсора можна пояснити лімітуванням ферментативн реакції перетворення глюкози до глюконолактону за допомогою кисню - косубстрату цієї реакі [БоМаІкіп еі аі., 1995]. Було запропоновано такі шляхи розширення динамічного діапазону робот глюкосенсора: 1) збільшення концентрації кисню в зразках пробулькуванням останнього; коіммобілізація в ферментну мембрану додаткового ферменту каталази, яка розщеплює Н2Ог виділенням кисню; 3) використання Кз |Те(СМ)6] як альтернативного окислювача, 4) змії дифузійних характеристик ферментної мембрани за рахунок використання додаткових мембрг різної природи.

Перші два способи не принесли значних результатів. Так, в першому випадку ми отримаї розширення діапазону визначення глюкози до 10 мМ, однак, в аналітичній практи пробулькування киснем сильно ускладнює процедуру визначення глюкози. Коіммобілізація каталази показала незначне розширення динамічного діапазону сенсора, тому що фермент і продукує, а лише частково регенерує вже використаний раніше кисень [Дзядевич та ін., 1995].

Наступним етапом роботи було використання фериціаніду калія як альтернативного кисн окислювача. Використання фериціаніду призводить до збільшення ступеня закислення розчиї всередині ферментного шару (а відповідно до значного збільшення провідності), оскільї генерується три протони на одну молекулу глюкози замість одного як у випадку використані природного косубстрату кисню.

Принцип кондуктометрії складається з вимірювань загальної провідності зразка, і чутливіс-датчика зменшується при збільшені фонової провідності розчину. Таким чином вже П[ концентрації фериціаніду 40 мМ і вище, в умовах високочастотної кондуктометрії, і спостерігалося відгуку біосенсора на внесення глюкози. Тому необхідно було провести додатко

іідження умов, при яких міг би бути використаний фериціанід калію при визначенні глюкози опомогою кондуктометричного біосенсора.

На рис. 7 приведено адмітгансні криві для кондуктометричного глюкозного біосенсора в 5 фосфатному буфері (pH 7,4), що містив 150 мМ концентрацію фериціаніду калія до та після івлення у розчин 5 мМ глюкози. Ми можемо бачити 10-кратне збільшення адмітансу на ьких частотах та відсутність змін на високих частотах. Це можна пояснити електроактивними :тивостями самого фериціаніда калію. Тому подальші експерименти за участю фериціаніда водились на частоті струму 3 Гц.

Калібрувальні криві кондуктометричного глюкозного біосенсора у 10 мМ фосфатному ері, pH 7,4 за різних концентрацій фериціаніду представлено на рис. 8. Можна бачити, що при ористанні високих концентрацій фериціаніду калібрувальна крива досягає насичення при більш эких концентраціях глюкози. При 160 мМ концентрації фериціаніду динамічний діапазон оти сенсора розширюється до 20 мМ. Однак подальше збільшення концентрації фериціаніду не зводить до подальшого розширення динамічного діапазону біосенсора, але дещо збільшує з чутливість.

Частота, Гц

, 7. Адміттансні криві для кондуктометричного глюкозного біосенсора в 5 мМ фосфатному буфері (pH 7,4), що містив 150 мМ фериціанід калію до (1) та після (2) добавлення у розчин глюкози до концентрації 5 мМ.

, 8. Калібрувальні криві для глюкозного кондуктометричного біосенсоруу 10 мМ фосфатному буфері, pH 7.4, за різних концентрацій фериціаніду качію (1 - 80 мМ, 2 - 120 мМ, З - 140мМ, 4 - 150 мМ, 5 -160 мМ та б - 200 мМ).

Теоретичний аналіз різних фвико-хімічних факторів та їх впливу на вигляд калібрувальних вих глюкозного кондуктометричного біосенсора у присутності фериціаніда калію можна дставити таким чином (рис. 9). Можна виділити такі основні області концентрації глюкози та цеси, що відповідають за хід калібрувальних кривих в цих областях: (1) - біокаталітична щія, головним чином, визначається окисленням РАОН2 за допомогою кисню; (2) в умовах сневого дефіциту» реакція визначається окисленням БАОНг фериціанідом калія, що зводить до утворення додаткових протонів; (3) основний вклад в амплітуду відгуку біосенсора инае вносити зміна буферної ємності та pH всередині ферментного шару.

І II

III

Рис.9. Вплив різних фізико-хімічних факторів на виї калібрувальних кривих глюкозного кондуктометричн біосенсора у присутності фериціаніда ка (гіпотетичне уявлення).

Концентрація гаюкози

Таким чином, була показана можливість розширення динамічного діапазону роб кондукгометричного гшокосенсора до 20 мМ за рахунок використання фериціаніду калію альтернативного окислювача. Але залежність від буферної ємності залишається [ЛгуабеуісЬ И 1998], до того ж вимірювання необхідно проводити тільки на низьких частотах, що де ускладнює процедуру вимірювань, але дозволяє роботу в середовищах з великою іонною склок У подальшій роботі основну увагу було сконцентровано на використанні додатко; мембран різної природи, які наносяться зверху ферментативної мембрани для модифікації сенсс В цьому випадку створюється дифузійний бар’єр для проникнення в мембрану молекул глюкозі той час як розчинений кисень має змогу вільно проходити всередину мембрани.

На рис. 10 приведені калібрувальні криві звичайного глюкозного сенсора та сенсс модифікованих різними додатковими мембранами.

Використання 2 % ПВБ-мембрани дозволяє розширити динамічний діапазон роб датчика до 10 мМ з незначним зменшенням чутливості (крива 2). Модифікація сенсора би щільною додатковою 5 % ПВБ-мембраною не призводила до подальшого розшире динамічного діапазону роботи сенсора, але його чутливість значно падала. Для сенсор додатковою 10 % ПВБ-мембраною відгуків на додавання глюкози не спостерігалось взаг Подібні результати були також отримані для політетрагідрофуранових мембран. Використання

Рис. 10. Калібрувальні криві звичайного глюкози кондуктожтричного біосенсора (1) та сена модифікованих різними додатков мембранами: 2% ПВБ (2), ПТГФ (3), На/юп ( ПВКС (5), отримані в 5 мМ фосфатному буф pH 7,4.

о

з

6 9 12

Глюкоза, мМ

15

іТФ-мембрани дозволяє розширити динамічний діапазон роботи датчика до 15 мМ без гіршення чутливості (крива 3).

Використання додаткової нафіон-мембрани призводить до розширення динамічного іпазона роботи сенсора до 10 мМ, а також до значного збільшення величини відгуку сенсора зива 4). Ефект збільшення величини відгуку сенсора можна пояснити тим, що негативний заряд лімера перешкоджає проникненню всередину ферментної мембрани вільних негативно ряджених частинок буферу і, таким чином, блокує додатковий канал «полегшеної» дифузії отонів із мембрани, що призводить до збільшення провідності в мембрані.

Аналогічний ефект спостерігається при використанні додаткової позитивно зарядженної ІКС-мембрани (крива 5). Збільшення амплітуди відгуку в даному випадку поясняється тим, що и використанні ПВКС-мембран за рахунок позитивно заряджених функціональних груп гредині полімеру створюється дифузійний бар’єр для вільних протонів, тим самим блокуючи майну дифузію протонів із мембрани.

Амплітуда відгуку глюкозного біосенсора дуже залежить від умов проведення :перименту, а саме буферної ємності та іонної сили аналізованих розчинів. На рис. 11 едставлено залежність амплітуди відгуку сенсора від концентрації буферного розчину для корів з додатковими мембранами та без них,

Рис. 11, Залежність величини відгуку кондукто-з метричного глюкозного біосенсора без (1) та з

" додатковьши ПВКС (2), нафіон (3), ПГГФ (4) та

ПВБ (5) мембранами від концентрації буферного и' ' розчину. Вимірювання проводились в калій-

Концентрація буферу, мМ фосфатному буфері, pH 7,4, концентрація

глюкози -1 мМ.

З рисунку видно, що при використанні додаткової ПВКС-мембрани (крива 2) вплив буферної ності на величину відгуку сенсора залишається практично таким же, як і у сенсорів без цаткової мембрани. Пояснити це можна таким чином. З одного боку наносячи позитивно >яджений полімер зверху ферментної мембрани ми блокуємо канал звичайної дифузії протонів, і утворюються в мембрані. А з іншого боку позитивно заряджений полімер притягує до себе :ьні аніони із розчину (в тому числі і аніони буферу), в результаті чого їх концентрація біля мбрани збільшується, тим самим збільшуючи можливість їх проникнення всередину мембрани і іємодію з протонами, що призводить до збільшення каналу «полегшеної» дифузії. Враховуючи, і головним фактором залежності величини відгуку сенсора від буферної ємності є наявність іалу «полегшеної» дифузії, зрозуміло, що ефект впливу на відгук сенсора буферної ємності в эму випадку залишається.

5 і.о

І 0,2-

і

1

0,0

Коли використовується додаткова нафіон-мембрана, то глюкозний кондуктометричі біосенсор стає менш чутливим до зміни буферної ємності середовища (крива 3). Таке зменшеї впливу буферної ємності на відгук сенсора можна пояснити властивостями нафіон-поліме Тобто присутність нафіон-мембрани ефективно блокує транспорт негативно-заряджених частш буферу через мембрану, внаслідок чого блокується канал «полегшеної» дифузії протонів мембрани. Таким чином зменшується вплив буферної ємності середовища на величину відг сенсора.

При використанні додаткових ПВБ-мембрани (крива 5) та ПТГФ-мембрани (крива 4), вш буферної ємності середовища на величину відгуку глюкозного кондуктометричного біосенсі стає ще меншим. Де може бути пояснено бар’єрними властивостями гідрофобних полімері плівок для дифузії гідрофільних частинок буферу.

Також було вивчено вплив іонної сили розчину на величину відгуку сенсора [Дзядевич та: 1995, Архипова, 1998]. Показано, що при використанні додаткових мембран вплив іонної сили і величину відгуку дещо зменшується.

Порівняння операційної стабільності та відтворювальності роботи сенсору (з додаткові) мембранами та без) показало, що сенсори з додатковими нафіон та ПВКС мембрана демонструють кращі характеристики. Так, розкид величин відгуку на добавлення 1 мМ глюю для звичайного сенсора складав біля 10%. У випадку сенсора з додатковими мембранами розі зменшувався до 5 % та значно збільшувалась операційна стабільність.

Використання кондуктометричних бюсеисорів для аналізу реальних зразків Аналіз концентрацій глюкози в сироватці крові щурів

Як об’єкти дослідження брали сироватку крові щурів з Чорнобильскої зони відчужен Контрольні визначення глюкози в крові проводили по стандартній методиці з використані ферментного набору «Діаглюк» Львівського підприємства лікарських препаратів (м.Лы Україна) та за допомогою аналізатора «Ексан-Г» (Латвія).

Для визначення концентрацій глюкози біосенсорним методом використовували часті калібрувальної кривої до 1,5 мМ у модельному розчині, що відповідало 60 мМ глюкозі нерозведеній сироватці (розведення в 40 разів).

Ефективність проведення аналізів глюкози в сироватці крові за допомогою біосенсора б перевірена з використанням методу стандартних додавань. На рис. 12 приведені порівняльні кр для вимірювань, отриманих за допомогою біосенсору та набору «Діаглюк». З рисунку видно, ш випадку визначення концентрації глюкози за допомогою біосенсора ми маємо майже 10 узгодження даних (фактор лінійності 1,03, похибка визначення 3%) на відміну від визначені допомогою «Діаглюка» (фактор лінійності 0,88, похибка визначення 12%). Це свідчить і високий ступінь точності для вимірювань з використанням біосенсору. Екстраполяція ж кривоі вісь х дає значення концентрації глюкози в пробі (без штучного додавання глюкози).

На рис. 13 показано порівняльні результата аналізу глюкози в сироватці крові щурів, шані за допомогою трьох різних методів. З рисунку чітко видно кореляцію даних. Краще падання відмічається для результатів, отриманих за допомогою біосенсора та «Ексану-Г», що :е бути пов’язано з однаковими принципами формування відгуків. У випадку набору іглюк» (фотометричний метод) може мати місце вплив забарвлення зразків на результати гізів.

Сироватка-нпюкоза.мМ Номер проби

12. Порівняльні криві визначення глюкози в сироватці крові за допомогою кондуктометричного

біосенсору та ферментного набору чДіаглюк».

13. Порівняльні результати аналізів, отргишні за допомогою різних методів.

Кількісна оцінка кореляції даних, отриманих за допомогою трьох методів в 29 різних пробах зватки крові щурів показала високе співпадання результатів, отриманих за допомогою цуктометричного біосенсора та аналізатора «Ексан-Г» (коефіцієнт кореляції - 2,2 %).

Біосенсори демонстрували операційну стабільність протягом 48 годин роботи, що дозволяло вести 200-300 вимірів глюкози в реальних зразках на одному датчику.

Аналіз концентрацій глюкози в культуральних рідинах

Контроль і оптимізація процесів виробництва біологічно-активних препаратів вимагає їдкої та відтворюваної інформації про концентрацію субстратів та продуктів, а також про центрацію мікроорганізмів і їх фізіологічний стан (клітинна маса, поглинання С-дасерела пкоза), стан N-джерела (амоній та амінокислоти) тощо). Тому було проведено експерименти іастосуванню розробленого біосенсора для визначення концентрацій глюкози в культуральних інах.

Культуру клітин мікроорганізмів Klebsiella oxitoca вирощували в споживному середовищі LB вбавленням 40 мМ глюкози протягом доби при температурі 37°С при постійному гміщуванні та періодично відбирали проби для контролю рівню глюкози в середовищі, івняльні результати аналізів, отримані за допомогою двох методів вимірювання (біосенсорний їсичний фотометричний), представлено на рис. 14.

Рис. 14. Порівняльні результати ана.-концентрації глюкози при вирощуві культури клітин Klebsiella oxitoca. Кульп мікроорганізмів вирощували в споживи середовищі LB

На діаграмі видно хороше співпадання даних, отриманих різними методами, а таї динаміку зменшення концентрацій глюкози при рості культури клітин. Таким чином і біосенсор з успіхом можна використовувати для контролю вирощування культур в лаборатор практиці.

Розроблений біосенсор також було застосовано для аналізу інших культуральних рідш тому числі, в зразках промислового виробництва, отриманих на Ладижинському заводі «Ензі безпосередньо з ферментерів (табл. 2).

Таблиц.

№ п/п Зразок Джерело Концентрація, мМ Похибі

1 Лужна протеаза «Ензим», м.Ладижин 3,7±0,3 8,1

2 Глюкоамілаза «Ензим», м.Ладижин 30,0+1,5 5,С

3 Середовище Ігла Відділ генетики людини ІМБІГ 3,6+0,3 8,3

4 Середовище LB Відділ регуляторних механізмів клітини ІМБІГ 18,0±1,0 5,0

Біосенсори демонстрували операційну стабільність протягом 48 годин роботи, що дозвол провести 200-300 вимірів глюкози в реальних зразках на одному датчику.

ВИСНОВКИ

1. Проведено детальне вивчення впливу різних факторів на роботу кондукгометрич ферментних біосенсорів та оптимізовано їх основні аналітичні характеристики для ана. реальних зразків у медичній практиці і біотехнології.

2. Показано, що для виготовлення кондуктометричних перетворювачів не є обов’язк використання дорогих благородних металів і зменшення характеристичних розмірів електроді при цьому як підкладинку можна використовувати будь-який непровідний мате] мікроелектроніки, що дозволяє спростити технологію та зменшити вартість виробництва та перетворювачів.

3. Порівняння біосенсорів, створених на основі ферменту пеніцилінази та рН-чутли польових транзисторів і кондуктометричних планарних електродів показало, що вони маї схожі робочі характеристики, однак, з технологічної точки зору кондуктометричні біосенс

:тіші при виготовлені та в експлуатації, що робить їх більш перспективними для масового эбництва і практичного застосування.

4. Показано, що збільшення діапазону роботи кондуктометричного біосенсора до 20 мМ кози досягається при використанні фериціаніду калію як альтернативного кисню окислювача, ак в цьому випадку необхідно проводити виміри на низьких частотах змінного струму, що о ускладнює процедуру вимірювань, але дозволяє роботу в середовищах з високою буферною істю та іонною силою.

5. Застосування напівпроникних додаткових мембран при створенні глюкозного цуктометричного біосенсора вирішує проблему розширення його динамічного діапазону в вах високочастотної кондуктометрії та покращує основні аналітичні характеристики, а саме швість і стабільність, а також зменшує вплив факторів середовища на відгук.

6. Створені кондуктометричні біосенсори було використано для кількісного аналізу глюкози :альних зразках (кров щурів, культуральні рідини) та показано високий ступінь кореляції з 'льтатами, одержаними класичними методами. Запропоновано протоколи кількісного аналізу кози в біологічних рідинах за допомогою створеного приладу.

ПЕРЕЛІК РОБГГ, ЩО ОПУБЛІКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

:.В. Дзядевич, А.А. Шульга, С.В. Пацковский, В.Н. Архипова, А.П. Солдаткин, В И. Стриха. ’онкопленочный кондуктомепрический датчик для ферментных биосенсоров // Электрохимия -994.- Т. 30, № 8,- С.982-987.

S.V. Dzyadevich, A.A. Shul'ga, S.V. Patskovsky, V.N. Arkhipova, A.P. Soldatkin, V.I. Strikha. 'hin-films conductometric transducer for enzyme biosensor // Russian Journal of Electrochemistry (by nterperiodica, USA).- 1994,- V. 30, No 8,- P. 887-891,

IB Дзядевич, О.П. Солдаткін, В.М. Архипова, О.А. Шульга, Г.В. Єльська. ‘ондуктометричний ферментний глюкосенсор. Пошук шляхів поліпшення аналітичних арактеристик// Укр. біохімічний журнал - 1995 - Т. 67, № 6 - С. 53-59.

І.Н. Архипова, С.В. Дзядевич, А.П. Солдаткин, А.В. Ельская. Ферментные биосенсоры для іпределения пенициллина на основе кондуктометрических планарных электродов и рН-увствительных полевых транзисторов II Укр. биохимический окурит,- 1996. - Т. 68, № 1- С. 6-31.

1.Н. Архипоза. Влияние дополнительных положительно заряженных полимерных мембран на налитические характеристики кондуктометрических глюкозных биосенсоров // Биополимеры и летка - 1998,- Т. 14, № 3,- С, 242-245.

LP. Soldatkin, S.V. Dzyadevich, Y.I. Korpan, V.N. Arkhipova, G.A. Zhylyak, S.A. Piletsky, T.A. iergeeva, T.L. Panasyuk, A.V. El’skaya. Biosensors based on conductometric detection // Biopolymers nd Cell.- 1998,- V. 14, No 4,- P. 268-277.

6. S.V. Dzyadevich, V.N. Arkhipova, A.P. Soldatkin, A.V. El’skaya, A.A. Shul’ga, Glu< conductometric biosensor with potassium hexacyanoferrate(III) as an oxidizing agent // Anal} Chimica Acta - 1998,-V. 374/1- P. 11-18.

7. A.P. Soldatkin, S.V. Dzyadevich, A.A. Shul,ga, V.N. Arkhipova, G.A. Zhylyak, Y.I. Korpan, Strikha, A.V. El’skaya. Conductometric enzyme biosensors for determining of concentrations of s< substrates and inhibitors // Abstract Book of 7th European Congress on biotechnology, Nice, Fra 1995, February 19-23,-Paris: “Synelog”.- 1995 - V.I.- P.92.

8. S.V. Dzyadevich, V.N. Arkhipova, A.A. Shul’ga, A.P. Soldatkin. Glucose conductometric biosei with potasium ferricyanide as an oxidizing agent // Abstract Book of NATO ARW «New trend biosensor development», Kiev, Ukraine, 1998, July 6-9.- P.64.

9. AP. Soldatkin, Ya.I. Korpan, S.V. Dzyadevich, V.N. Arkhipova, N.V.Karpenko, M.Yu. Ales Application of enzyme field effect transistor for glucose analysis in blood serum // Abstract Boo! NATO ARW «New trends in biosensor development», Kiev, Ukraine, 1998, July 6-9,- P.72.

Архипова В.М. Оптимізація основних характеристик кондуктометричних фермент біосенсорів для аналізу реальних зразків. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальні 03.00.20 - біотехнологія,- Інститут біохімії ім. О.В.ПалладінаНАН України, Київ, 1998.

В дисертаційній роботі представлено результати по оптимізації основних характерне кондуктометричних ферментних біосенсорів та створенню високоефективних і стабільних сис для аналізу реальних зразків. Всебічно досліджено вплив умов проведення експеримеї матеріалів, форми та розмірів електродів на характеристики перетворювачів і розроб. практичні рекомендації щодо їх оптимального вибору. Проведено порівняння робо характеристик біосенсорів на основі кондуктометричних перетворювачів та рН-чутли польових транзисторів для кількісного аналізу пеніциліну. Запропоновано декілька шл цілеспрямованої зміни аналітичних характеристик кондуктометричних ферментних біосенсс зокрема чутливості та динамічного діапазону вимірювань, і проведено їх детальний аге Розроблено глюкозний кондуктометричний біосенсор для аналізу реальних зразків (кро культуральних рідин) без попередньої їх обробки.

Ключові слова: кондуктометричний ферментний біосенсор, імпедансна спектроскс глюкоза, пеніцилін, мембрана.

шпова В.И. Оптимизация основных характеристик кондуктометрических ферментных сенсоров для анализа реальных образцов. Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности )0.20 - биотехнология,- Институт биохимии им. А.В.Палладина НАН Украины, Киев, 1998.

В диссертационной работе представлены результаты по оптимизации основных актеристик кондуктометрических ферментных биосенсоров и созданию высокоэффективных и эильных систем для анализа реальных образцов. Всесторонне исследовано влияние условий «едения экспериментов, материалов, формы и размеров электродов на характеристики образователей и разработаны практические рекомендации для их оптимального выбора, эведено сравнение рабочих характеристик биосенсоров на основе кондуктометрических образователей и pH-чувствительных полевых транзисторов для количественного анализа ициллина. Предложено несколько путей целенаправленного изменения аналитических актеристик кондуктометрических ферментных биосенсоров, а именно чувствительности и амического диапазона измерений, и проведен их детальный анализ. Разработан глюкозный дуктометрический биосенсор для анализа реальных образцов (крови и культуральных исостей) без их предварительной обработки.

Ключевые слова: кондуктометрическнй ферментный биосенсор, импедансная

кгроскопия, глюкоза, пенициллин, мембрана.

[hipova V.N. Optimization of basic characteristics of conductometric enzyme biosensors for lysis of real samples. Manuscript

Thesis for degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Biology, speciality 03.00.20 - biotechnology.-r.Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1998.

The thesis contains the results on optimization of basic characteristics of conductometric enzyme ;ensors and creation of highly effective and stable systems for analysis of real samples. Influence of the erimental conditions, materials, forms and sizes of electrodes on characteristics of the transducers was oughly investigated, and practical recommendations for their optimal selection were developed, rking characteristics of biosensors based on conductometric transducers and pH-sensitive field-effect sistors for determination of penicillin were compared. Some ways of purposeful change of analytical •acteristics of conductometric biosensors such as sensitivity and dynamic range of measurements were rosed, and their detailed analysis was conducted. The glucose conductometric biosensor for analysis of samples (blood and cultural media) without treatment was developed.

Key words: conductometric enzyme biosensor, impedance spectroscopy, glucose, penicillin, nbrane.