Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Очистка и изучение физико-химических свойств флавинсодержащей аминоксидазы из печени

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Очистка и изучение физико-химических свойств флавинсодержащей аминоксидазы из печени"

РГС од

^Щ'ЮНМЬНАЙ ШД24ИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ИНСТИГЛ БИСШШИ

На правах рткешзса ГАСИАхЯН ЗАГНАН КАРЛЗНОЕШ

7ДЗ: 577.132. Г

ОЧНТГХА И ИЗУЧЕН® $ИЗЙКС-Ж.ШЧЕС1Ш: СЕОЙСТБ •^ЛАЗИНСОДЗЕШЕЙ АМИНСОКСИДАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИ

03.СО. 04 - БКСЗМИЯ SP.IT

дзссертагги на соискание учено.! сзепенз казегдзта биояогачесяазс наук

¿"резан

- 1393

Работа выполнена в лаборатории физической химии белков Института биохимии Национальной Академии наук Республики Армения (директор института - академик HAH РА Галоян A.A.) Научный руководитель: доктор биологических наук

профессор Налбандян Р.И. Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ведущая организация - Б&федръ биохимии Зооветеринарного института.

(Д 005.15.01) по защите диссертаций на соискание ученой стелен» доктора биологических наук при Институте биохимии HAH РА (375W4, Ереван, ул. П.Севака, 5/1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института бис химии HAK РА.

профессор Акопян Ж.И. доктор биологических наук, профессор Геворкян З.С.

1993 г.

в A1.QO час. на заседании специализированного совета

Автореферат - разослан

Учений секретарь специализированного совета докт.биол.наук, профессор^

А.А.Сиыонян

ОЕШ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Акгтапьяость тгрсбдемы. Биохкмяя клеточной пролиферация давно привлекает к себе большое число исследователей. Это связано с рядом обстоятельств. С одной сторона все увеличивающееся число раковых заболеваний на Земле дактует настоятельную необходимость изучения молекулярных механизмов, ответственных за траясфсрмапию нормальных клеток в раковые. Кая известно пря этом происходят ак-тззкая дролиферацяя трансформированных клеток. Здесь наиболее актуален поиск яакгс-то первичных агэнтсв, которые запускают молекулярной каскад такой трансформация длят лягябароэанля ах действия. С другой сторона, развитие интенсивных технолога:! з сельском хозяйстве, биотехнология кезоткых 2 рзстятвяъннх клеток, фармакологической промышленности, стимулируст поиск универсальных факторов роста, но уже с противоположной зелью, для их яслользсванзя з' зтзх процессах в качестве модуляторов роста.

Достаточно давно известно, что такжя уняверсалышмя факторами роста являются поляамины- природные поликатяовнне сседгнекгя широко распространеннее в живой природе. Концентрация этих соединений з клзткзх прямо коррелирует с их физиологическим состоянием. 3 покоящихся клетках пул подеамяноза очень низкий, тогда как а ак-тетяо пролзйернруших тканях их концентрация резко возрастает. Исходя кз откс сообраяеня& представляется крайне актуальным изучение метаболизма цоляамянов, ферментов, ответственных за биосзн-тез и катаболязгл этгз соединений, фактсроз, злляпщгх на ях'пндук-ш и т.д. Скорость лгшгаиругаам ферментом биосинтеза полиамиаоз' является орнитдн декарбсксялзза, которая катализирует превращение орнптлна в путресщя. После того, как фермент был счяцеа и хороао охарактеризован, то оказалось, что селективные иягябяторы фермента не снвгавт сугазрннй. пул полиамидов, снкжая существенно лхзь уровень путрзсцяна. Как з дальнейшем оказалось, помимо зтсго б~э-сянтетлческого путл существует такке другой путь образован:« по-лламгноз. Здесь ацетильные пролззоднне псляамгнов подвергаются окислительно^ дезцетялярованлэ, пркзовд к образовании свободных поляамяноз, которые заозь возлекаптся з дролягерационные пгоцгсс::. Оермент, ответственный за такуэ.конверсия - рлавпксодер^ащэя по— ллаудноокскдаза, до существу производит реутгддзапЕз дула полизми-

нов, проводя юс обновление. Однако, несмотря на его такую важную роль он по'существу не„изучен, так'как отсутствовали препаративные методы его получения. "Поскольку аналогичный фермент из растительных клеток достаточно изучен в задачу данной работы входило:

1. Разработка метода и получение препаративных количеств флавинсодержащей. полиамкяооке идазы из мщотных тканей.

2. Изучение его основных оптических и некоторых других физико-химических к молекужрзых свойств, изучение его иммунологических .характеристик, определение его субклеточной и органной локализация.

3. .Изучение свойств про.стетической группы фермента я выявление пргродщ. связг флав ян-балок.

Цель и задача госледованяя' Исходя из вышесказанного, целью настояцей расоты было получение препаративных количеств высоко-очищенной: флввиасодвртащей НАО, .изучение её,молекулярных свойств, анализ оптических и флуоресцентных характеристик белка. Помимо этого, задачей исследования являлось получение моноспецифических антител к-ферменту н с яз. помощью.определение субклеточной и органной локализации ПА.0. Кроме того, планировалось определение роли протеолкза на молекулярные, физико-химические и илунслогические свойства'фермента.

Нэтчпая новизна я практическая' знзчггость таЗрты 'В резуль- • тате проведенных исследований .удалось практически в течение 48 часов получить .в высоко очищенном состоянии в препаративных количествах флавкнсодершцуюЖО. яз печени крупного рогатого скота. При этом из.1 хс сырой ткани получалось примерно 15-20 мг элек-трофореткчески гомогенного препарата. Епервые ПАО из животных тканей была получена в " натдвной " форме . и имела спектр поглощения типичный дет флавопротеянов. При этом показано, что одна молекула белка содержит '.один мольФАЛа. Эксперименты по выявлению связи флавин-белок :с использованием диализа против насыщенного ' раствора'КБ-г. и инкубации кислотой выявили атишгчный характер связи флавин-белок. Подучены оптические спектры .препарата и изу-

: чено влЕяние различных факторов на' поглощение. флавиново2. группировки.'Показано, что в результате , старения .или .длительности процедуры очистки-происходит модификация флавиноаой простетической группы, что отчетливо проявляется в оптически: спектрах поглощения фермента. С другой стороны выявлено, что высокоочищенные пре-

парата проявляют значительно большую устойчивость.. Показано, что модифицированная флазякозая гтростететеская группа не возвращается в первоначальное состояние при действии окислителей яли восстановите лей. Таким образом, процесс не связан с окислением или восстановлением йлавиновой группы. Изучены также флуорвсдентнне свойства белка. В спектрах флуоресценции внявлена белковая флуоресценция при- 333 ны, связанная с присутствием в белке так называемых " гидрофобных " тршггофанов. С другой стороны, эксперимента по ту-пенйя трзптофановой флуоресценции с поаояъю стандартна туизтелей, я данные по огранзпеаному протеолязу тршсяйом позволяют предположить, что б белке имеется лспудяцзгя " тсмогенвнх " триптофанов. Выявлена также тирозяковая флуоресценция, которая з натизно?л белке маскирована. Показано, что фгазинозая флуоресценция характеризуется очень низким квантовым выходом. Изучено злияняе протеоллза на ряд свойств фермента. Показано, что в результате протволяза образуются два фрагмента с молекулярными ыассаыя равншя соответственно 4Э я 5-8 кДа, прячем флавиновэя простетачесхая группа связана с большим фрагментом. Бра этсм оказалось, что флуоресценция <5лавяновой простетяческой группы после протеоляза испытывает существенные изменения, позволяющие делать опредзленнне выводы относительно окру^внгя флазинз в натнзном ферменте. Результата протволяза также показала, что иммунологйчэскнз свойства фермента не изменяются при Зтих услоэиях. В частности показано, что больший протеолятаческий фрагмент сохраняет сзок антзгенные свойстза.

Получены моноспещйичэские антитела к ферменту ?. с'я помощью показана субклеточная я органная локализация фермента. Впервые показано, что фермент локализован лов з печени я имеет цято-зольнукз локализации. Изучены каталитические свойства фермента я показано, что наялутага субстрате?* для него является ацетилспер-

№ИДЯН.

Публикация л дт'об^ц'дя' ^рботн Основное содержание работы изложено з трзх лестных работах. Материалы работы докладыззггсь на I Республикански! молодежной конференции по физико-химической биология, посвяценной 70-летиэ Великого Октября (Ереван, 1С-87;.

? Дяссертаиая• состоит гз введения,

четырех глав, выводов а списка литература. Первая глаза диссертации, обзср литературы, посзяцзна анализу данннх. о рол? и 'Ь'нкци-ях полязуиноэ, ферментах мх метаболизма, типах глиноскспдзз г их свойствах. Вторая глаза диссертации посвящена ыатериала^ я г»"=гс-

лам исследования. В третьей главе приводятся результаты исследований. Б последней главе излагается обсузденяе результатов. Диссертация кзлонена на 81 странице машинописного текста, содержит 18 рисунков и. I. таблицу. Библиография включает 98 ссылок на работы зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ .РАБОТЫ

Методы кселедозалая

Содержание Оелка определяли со методу Лоург е сотр., а также по методу Скоуиса (^е-г^оп , 1930). Сульфгядрцльные группы определяли по методу Седлака д Ддкдсея Л, ¿< П., 1935). Содержание флавгна еггределялг спектрофотокетричвскл из молярного коэффЕгента' зкегянкшш пря 450 к?.?, пряндмая его равным 11000 М-1 (вт^гт. Т. ,1978), Гомогенность оелкозкх препаратов оцешза-ле по четырем критериям: по нзлкчкю единственной белковой полосы при электрофорезе-з 8% ПААГ, проведенному по методу Дзвкса Ца.-

1964), по симметричности единственного белкового пм:а при его гель-фкльтацнж через колонку с се$-адексом £ - 100 сверхтонкий, по единственной прецидятацконЕОй полосе при юлмунодяф&узии, проведенной по методу-Ухтерлокя (о«=1 АелГт.^ С., 1957) к наконец по спектральному индексу чистоты А^дд/^оО» который дocтiIгaя 7.5 ъ дальнейшем не языенялся.

Молекулярную кассу бедка определ.ош электрофоретически по методу Бебера и Осборна («'¿-¿гг-С., 05&о-ги >Л- , 1959, а также гель-фкльтрацкей. по. методу Ьндргаса (А^Хгг^» £ ,1965).

Ферментативную-активность определяли по образованию перекиси водорода, используя систему пероксидазэ-о-фенилендиамик, когда б'качестве субстратов использовали спермин, спермкдпн, апеткл спермидив я апетялпутрэспян кля прямым спектрофотометричееккм способом по изменению оптической плотности при 250 нм, когда в качестве субстрата лепользовалл бензиламин. Дегядрогеназную активность определяли,, используя в качестве доноров водорода ШЛЯ и НАЛрН. При этом одекивали изменение оптической плотности при 340 нм.

. Тушение флуоресценции оценивали по методу Штераа-Фольмера (ик-иг^й., р, . ,1978), используя в качестве тушителей К1 С*СI г акрялаши. Протеоляз белка проводили при температур6 37°С при

- 7 -

использовании трипсина при pH 7.4.

Для получения антител к ПАО использовали фермент электрофора-тячески гомогенный; в 8% ПЛАТ. Иммунизацию проводили по следующей схеме. 0.1 мг фермента в 0.5 мл-физиологического раствора смешивали с равным объемом полного адызванта Фрейда, полученную суспензию тщательно перемешивали и вводили кроликам подкожно. Далее проводили еще одну инъекцию через месяц с использованием такой же концентрация белка, но с неполным адъювантом Фрейда. Затем, через неделю вновь проводила инъекцию, но узэ без адызванта. Кровь брали через неделю после последней яньекцая а иммуноглобяновую фракцию подвергали частгчноЁ очистке по методу Лезя а Собера (U^ U., So Ui И ,1960). Об образований антатал судала по методу двойной яшунодяффузия в 1.2а агарозе.

Оптические спектры записывались на спектрофотометре типа ¿/¿•fe.-с Iii 150-20, используя прямоугольные кюветы с длиной оптического пути разной I см. Спектры возбуждения и флуоресценция записывали на спектрофлуоркметре МРР -44А, используя прямоугольные кюветы с длиноа оптического пути равной I см. Образш, применяемые для флуоресцентных исследований, имели оптическую плотность прн 280 нм не более 0.1

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве источника фермента яспользовали свелую зля замороженную печень крупного рогэтого скота. Печень (обычно I кг) пропускали через мясорубку я после этого проведали её"гомогенизацию з шестикратном объеме буфера (0.03 М калий-калий фосфатный буфер pH 7-.4, 0.25 М сахароза, Ю-4 М Э1ГА) в гомогенизаторе PT-I в течение I минуты. При этом для предотвращения подкясления раствора добавляли концентрированный раствор аммиака (2 М), поддеряя-вая при этом pH равным 7.3-7.4. После центрифугирования объем над-осадочного раствора доводили до 7 л. После этого к гомогенату дс-бавляля сухой сульфат акменяя, поддерживая при этом pH в районе 7.3-7.4 добавлением а :,::.< из к а. Центрифугированием собирали осадок, образующийся магкду насыщениями сульфата аммония 0.45-0.75. Полученный осадок растворяли в 0.01 М фосфатном буфере, содергзее:/ Ю--'!.! меркаптоэтанола и Ю"4 М ЭдПА. Суспензию ставили на диализ на есчь прстиз 40 кратного избытка вышеуказанного буфера иди rrso-

водили её обессолЕвание на колонке с биогелемТ-2. Диализат идя обессоленный препарат после центрифугирования наносили на колонку с ДЭАЬ целлюлозой (4.5x15 см), уравновешенной вшнеуказаннш буфером. После интенсивного промывания колонки этим буфером (промывные воды имелк поглощение при 280 им менее 0.05) проводили элюцто образна этим же буфером, который дополнительно содержал 0.3 К k'CC . Полученный элтоёт вновь подвергали дробном}' фракционированию сульфатом аммония, собирая фракиек мехду насыщениями' 0.45-0.70. Осадок растворяли в буфере, содержащем 0.03 М калий фосфат рН 7.3, 10 М ЭДТА и .10"® И меркаптоэтанол,. обессоливали на колонке с биогелем Р-2 я наносиЛЕ на колонку с ДЗАЭ целлюлозой, уравновешенной этим ке буфером (2.5x6 см>. После проливания'колонки пятью объемами этого же буфера проводил?; разбавленную элюцив белка вышеуказанным буфером, который дополнительно содержал 0.08 М ÜCL 'Эта стадия оказывалась очень принципиальной, поскольку позволяла избавляться от значительной доли гемовых. примесей, от которых в дальнейшем очень трудно отделять фермент. Злвдрозанную желтутэ фракцию, которая уне на этой стадии имела типичный флавиновый. спектр, с небольхими примесями гемовых белков наносили на колонку с сефа-дексом &AE-A-5G, уравновешенную элвдрутакм буфером. Здесь было целесообразно использование именно этого носителя, поскольку повторное использование ДЭАЭ целлюлозы приводило к резкому ухудшению спектральных характеристик белка. После интенсивной промывки колонки этим же буфером проводили элгошпо белка раствором, содержащим 0.03 М калий фосфатный буфер и 0.25 IvUct . Сконцентрированный таким образом белок наносили на колонку с сефадексом (г -IDO ■(•¡звгерхтонкяй). Отношение объема раствора фермента к объему носителя йргг этом "составляло не более 1:30. Вытекающее фракции анализировала спехтрофогокетрлче скя я собирали фракции с типичным фла-виновым спектром. Полученные фракции объединяли и при необходимости проводили повторную хроматографию на сефадексе . & АЕ-А-50. В результате этих операций получался электрофорегяческа гомогенный: белок со спектральным индексом чистоты А280/А450,равным 7.5. Йри этом препарат шел спектр, типичный для флавопротеянов (Рис. I). Описанная процедура позволяет получать 15-20 мг белка из. I кг сырой ткани. Препарат с такт- индексом чистоты достаточно устойчив и сохраняет свои спектральные и ферментативные характеристики при хранения при 4°С по крайней мере в течение одного месяца. Однако, как показал наш опыт рзботы с этим ферментом процедуру ■

0.36.

0.24

0.12

Л о®)

•рис. I Оптический спектр поглощения флавштсодеряа-дей пота-з:л".ноокскдззн гз печени быка ^д^/'чэО °-'о;1а

Концентрация белка 2.1 мг/мл

0.6 [■

0.2 -

350 450 130 '*нм>

спту-'гскг л тгб^тз ПлО - б О^ЛРС"

Препарат со двину»'оточен-/«?:/! А/¡¡¡^/¿¿Гл С-.т^е

-О испыт-зает сп.екттэ/п:нне :-:= •"'/я,

ранаЕ^х^ся а десттггзд!? 'лз-з'/нонсго сг>гчт

- ю -

очлстки надо проводить сколь.возможно быстро, поскольку при длительных процессах происходят резкое уменьшение выхода продукта и его спектральные характеристики в значительной степени ухудашются. Прл этом спектр флавопротеяна модифицируется:' происходят постепенное увеличение, полосы поглощения при 360 нм и в итоге препарат по- ' называет спектр, характеризуемый одним главный пиком при 280 нм с плечом в районе 450 нм. Эти изменения, подобны изменениям, наблюдаемым при старении препарата (Рис. 2).

Как указывалось также■другими авторами, происходит инактива» хгйя фврмайТй Срк его хроматографии на ДЭАЭ целлюлозах. Мы полагаем, что это связано с тем обстоятельством, что фермент, являясь амянооКСВДДОрЯ способен, взаимодействовать с аминоэтяльнымк группами цедагодозы,. которые являются псеадосубстратами для фермента. При этом проаеходйт его инактивация за счет образования радикальных продуктов еле по какому-то другому механизму. Отсутствие в литературе эффективной методики для очистки флавкнсодержащей ДАО из ли-ватных тканей вероятно связано с такими проблемами.

Спектр препарата, помимо максимумов, обусловленных наличием в белке флавЕЕОБОй простетической группы содержит также плечо при 330 ем, которое не типично для флавинов. Таким образом, мокно было полагать, что око обусловлено какой-лгбс другой группировкой, присутствующей в белке, либо какой-то модификацией флавяновой просте-ткческой группы. Были использованы различные подходы для идентификации компонента, ответственного за такие спектральные возмущения фяавянового спектра. Поскольку флавины весьма реакционоспособны и могут быть модифицированы разлячхтя агентами, предполагалось, что полоса при .330 нм есть результат модификации флавиновой группы в .сульфофлазка. Наши предположения были основаны на двух об- , стоятельствах: во-первых такие флавины были получены и детально изучены, и ю: спектральные свойства в некоторой степени были подобны свойствам ПАО, ,во-вторых, сульфофлавины образуются при дей-стези сульфитов, к так как в процессе очистки мы часто используем аммоний сернокислый, который мог содержать некоторые примеси сульфитов, то било возможно образование сульфофлавинов во время очистки. Поэтому ш разработали процедуру очистки без использования сульфата аммокия. Однако, как оказалось это не повлияло на полосу при 330 нм. К тому же добавление сульфита к очищенному препарату ве вызывает модификацию этой полосы.

Вторая версия образования полосы поглощения при 330 нм была

связана с тем, что з процессе очистки осразутатся стабильные фла--?>-г2не семихянснн, которые вносят вклад в .образование полосы поглощения при 3dû HiM. Однако, как оказалось, з случае ПАС эта полоса з?яд ля обусловлена -лшавяновыми семяхинонамя. Во-первых, флави-новые семяхинснн, г зависимости от pri находятся в "оивей" форме, полоса поглощения в районе прикзрао 650 нм или в "красной'' форме полса поглощения в районе 400 av. В наших условиях рН следсзало стада ть присутствия сик-зго семюсянона. Кроме того, в литерптурэ неизвестно стабильных с^махяноноз, которые бы не сгсдслялясь илк не восстанавливались ирг; дгйстзги соответствующих агентов. Хотя версия с флавянсаымя модификациями не был?, четко подтверждена, мы зполне попускаем, что доясся год 330 аа связана с молщжгапяямк флзвиновол группы фермента, поскольку постоянно появляются новые оообченяя о рззличякх модификациях флазлнов, с рззлэтнкми спектра льншли свойствами.

Нами был:! рассмотрены такхе другие версия, предполагаэшяе,. что полоса при 330 -нм обусловлена наличием а ферменте другого функционального кофактора. Такое предположение.вполне реально, т.к. известно, что фермент сильно яягибяруется кароонидышмя реагентам*. Это предполагает наличие s нем'некоего фактора, содержащего карбонильную группу. Наиболее известный из таких ксфакторон-зто пяр.чдоксальфосфзт. Вдобавок его оптический спектр содержит дза максимума прл 230 и 370 нм с плечом з районе J40 нм. Надо сказать; что плргпюксал&госфат, как пргдяодага.-ось язляется кофактором в медгеодеряащлх амкчосксядазах. И хотя эта зерсия до последних пор вызывала мколес-зо сяорсз, тем г-.е менее было интересно прозерить эту гипотезу ддя флавиновоЛ CAO. попытались выяснгть эта вопросы, сравнивая повед=нке'нвтздкого фермента я пяридоксэль Cooi'-эта при титрапяи меркаятозтанолсм. Прячем мвркэптоэтаао.: был вкбран в качестве згеата, который как бы то показано мо-дгГзширует полосу пстд-глзчая арч 330 я», ' снижая её интеясаанэсть. Как оказалось, тятрозание порядоксальФосфата меркэптоэтэнслем драэсдлт к умевхседо) пстоса пег .-о гения ара 370 км, а интенсивность шгеча пр;г 340 ш: наоборот возрастает. 3 случае яз т~ полоса та 330 нм несколько уменьшается, тогда как полоса при 37С, им остается неизменно.!. Кроме того ояридоксадьфосфат обладает тн-теас-<2".э1 флутоесдейд;«-:! пря 420 «v, котсру-о дам таю»* не удэлч зыявлть а фермате. Tavr.: образом пяридохсзльфссфат аз роль второго хофзкторэ в молекула *йлка скорее всего не годдтся. По vz-aX-

ней мере, еслг фермент cozevmr плрвдоксалыоосфа?, то он находится там в очень необычной модкфикапяк.

С некоторых пор в литературе начали появляться сообщения о новом кофакторе ппрролохянолцно хяноне, который присутствует в медьсодержащих аминооксидазах, и хотя впоследствии было показано, что это соединение образуется в процессе очистки, было интересно выяснять не образуется ли сэйДЕненве такого тяпе к в ГШ). Как указывалось Сабаткнв к сотр (Soù^i'uS ■ ,1933) это соединение об— • ладает интенскэной флуоресценцией в районе 370 нм пре длине в одни возбуждения 320-330 нм. №ьг попыталась проверять эту возможность, кзмгрях флуоресцентно ферменте. Однако нам ке удалось выявить таких полос возбуждения д флуоресценция. в молекуле ПАО. Хотя, принципиально не исключается возможность, что полоса npz. 330 нм является небелковой.примесью, не ршвющей фушеционадьного значение, в любом случаг очевяшо, что ъ ПАО присутствует какой-то карбо-йяльный кофактор, кягибирование которого подавляет активность фермента.

Спектр флуоресценции фермента характеризуется даукя максимумами при 333 ам, возбуждаемый при длине волны 230 нк (белковая флуореейешк.я) я при 530 нм, возоуждаешй при 450 m (£лавиновая флуоресценция) (Ряс.З). Такая коротковолновая флуоресценция наблюдается у белков, в которых триптофанозые остатка, малодоступны для молекул растворителя. Ееля в беМе имеется Солее одного трил-тофаяовего остатка, то они могут 'различаться между собой по своему расположению в белковой глобуле (болеедоступные и менее доступные к растворителя). Очень удобным способом выявления такой гетерогенности является тушение тряптофанозой флуореспенп>:^ различными нкзкомолекулярныет соединениями - тушителями. №ы использовал;: такой подход, применяя в качестве тушителей-KI, акриламип к СзСс . Идея заключается в ток, что. тувителъ, гася более поверх-ностккй триптофан. будет приводить к сдвигу флуоресценция в более коротковолновую область, которая будет обусловлена более гидрофобным триптофаном. С другой сторокк, такой подход позволяет оценить округе ние гриптофановых остатков (положительно и отрицательно заряженные группы, окружавдяе флуорофор). Наши результаты продемонстрировали, что при' тулении не происходит заметного сдвига максимума белковой флуоресценции, что можно интерпретировать слвдунЕьа! образом: либо в молекуле,ПАО присутствует лшь один трялтофановый остаток, либо имеющиеся триптофана одинаково дос-

- и -

330 390 л (hm) 4уо . оби ciü Jl(hm) Рис. 3 Спектр флуоресценци;: ПАО, А - белковая флуоресценция возбуждаемая прк длите волкы 280 нк, 5 - флзэиновзя флуорескенпкя, воэбуг^даехая при дд;:ке волны 450 нм

с

0.04 0112

Ркс. 4 Зависимость Итернв-Уолькета -ест тушенгя тристофаного.'! -тотооесиенпки ПАО акрялвкелдаг. (I) и KI '2}

тупны для молекул туиителя и следовательно одинаково достушш доя растворителя. С другой стороны, можно утверждать, что при действии тушителей не происходит - серьезных информационных изменений в белковой глобуле. Известно также, что в триптофансодержавдх Г-елнах флуоресценция тирозина обычно маскирована, в результате безизлу-чательного переноса энергии тирозин-триптофан. Однако в некоторых случаях удается выявить тирозиновую флуоресценция при туленми флуоресценции триптофана. Однако в случае ПАО при тушении триптофана тирозлновая эмиссия не наблюдается. Это такяе показатель того, что яри дгйстзяя тунателей не происходят информационных изменений в молекула бежа и эффективность переноса тирозин-триптофан не изменяется. С другой стороны, в экспериментах по денатурации ПАО мочевиной и гуанкдан глдрохлорлдоы было показано, что тркпто-фановая флуоресценция сдвигается в длинноволновую сторону, явле-нгг довольно тяпичкое, однако при этом выявляется тярозяновая флуоресценция в вида плеча при 305 ни. Таким образом, можно утверждать, что тирознновая флуорасценния з белке маскирована исклечк-теяьно за счет переноса энергия тирозин-триптофан, а не за счет разлгчий з квгнтознх выходах этих слуорофорсв.

С другой стороны эксперимента по тушению триптофанозоЗ. флуоресценции показала, что К1 и акраламлд тушат траптофановую флу-'оресценшга, тогда кчк С* Си нз сказывает на неё никакого блеяния. При этом акрилакЕД более эффективный тушитель, чем К1. Отсутствие тушения ионал'Л цезия ыогег быть интерпретировано качественно исхода из двух предпосылок. В одной случае предполагается, что белковая глобула дозольно компактна - я крупные коны, такие как цезий нз способны проникать внутрь белка. Другое предположение исходит из того, что имеет место экранизация остатков триптофана пололгтелгнэ зарягеннкмл группамз в белке, которые за счет электростатического отталк.зания не додускзхт сближения молекул ту-пчтелл с голе кулаки флуорофора. К1, в отличие от С С тушит флу-сргсденцга тргстофанз, хотя а не столь эффективно как а^ргдамад. Поскольку .¿они "2 ода таккг довольно кр'-*хнке, скорее всего неэффективность ц»згл ооуслсзленз скорее всего экранизацией тридтофаяо-. экх остатков положительна заряу.енази'. группами з белка, а не ком-пактамтго белксзой глобулы. Исходя из этих с-:о;ра.т,;н::й га попн-телчсь грсзодлть ту—энг.е пр.». различных рН. Поскольку балок дэгтаточно лаб^тен я сохраняет стабдлъног-ъ з достаточно узком ддйхззоэе ра. мы проводила-этг жсслгдозаахя при рЛ от 5.5 до 3.5

Как оказалось в этом диапазоне не происходят сколь-нибудь существенного изменения тушащих характеристик. Эффективное тушение белковой флуоресценции нейтральным тушителем акряламядом демонстрирует способность последнего легко пронядать внутрь белковой глобулх. Прямолинейная зависимость в графиках Штерна-Фольмера обычно указывает на существование в белке одинакового типа флуорофороз (одинаково доступных к молекулам растворителя ) (Рис.4). Если в белке существует несколько типов флуорофоров неодинаково доступных для растворителя, то график обычно отклоняется вниз. Графики также не отклоняются вверх, что свидетельствует с одной стороны, об отсутствии зляянкя туиятвлей на конформашяо белка, я с другой стороны, исключает наличие. слонного механизма тушения (дишетческое к статическое).

5'лавиновая флуореспенляя ПАО с максимумом при 528 та, возбуждаемая при длине волны 450 нм характеризуется очень низким кван-Тйвым выходом. Такая ф^ореспекшя обычно наблюдается у флзвопро-теинов с ковалентно связанной флавияовой цростетэтеской группой. Зто обычно бывает связано с тем, что в таких флавопротеинах связь флввин-белок образуется через атомы серы в аминокислотах цистенн или метионпн. Атош серы, как известно являются сильными тушяте-лями флуоресценция я обуславливают пт.зкуто флуоресценцию, а в некоторых случаях 1 её отсутствие в флавопротеинах с ковалентно связанным,: флавинамм.

Для выявления природы связи флавин-белок натгл были использованы два подхода. 3 первом случае, ш питалась отиепять флавиновую проетбтлчеснуга группу ¡:з белке, используя стандартную методику, пркменяемута для нековалентно связанных флсвтеов. С этой целью ш проводили лнтенскванй дзалкз (48 часов) препарата"иротяв насыщенного раствора КВг при рН 4.5. Б случае нгковалентных флавинов при этом происходят их отщепленае от белка. Однако нам не удалось ваявять сколь-нибудь существенного отЕелленкя кофактора от .белка. Во втором случае мы проводили инку бают белка пр« низкзх рН, методика, яспользуеузл для ковалентно. связаннх флавлнов. Как оказалось np>i низких рН 2-2.5 происходит'быстрое (в течение 30 минут) отщепление флавкнового кофермента. Зто в некоторой степени^противоречит данным полученным■на других ковалентно связзнных флавопро-теянах. 3 частности, в случае мятохокдряальной флавянеодержацей моновмяяоокевдазы, где флэвин присоединен к белку ковалентно через тиоэфирную связь не удается так легко отщепить фпавян от белка.

■ ■ - То -

Для этого трео/етсяпо, крайней мере несколько часов. Процесс отщепления флавина можно легко детектировать по увеличению : яла в и новой флуоресценции. При этом происходит также осаждение апобелка. ■ К сожаления такие жесткие условия отщепления не позволяют проводить обратную реконструкцию фермента различными флазкяами, для определения способности последних восстанавливать ферментативную активность.

Таким образом, данные по отщеплению флавина от белковой части ыо.тао интерпретировать следующим образом. С одной сторона, отсут-' ствие сколь-нибудь существенной экстракция при диализе против насыщенного раствора КВа.предполагает, что простетгческая группа связана с ферментом ковалеятной связь л. Это подтверждается в принципе и низким, квантовым выходом флавгновой флуоресценции, с фугой стороны, необычно легкое отщепление флавина от белка ставит под сомнение эту гипотезу. Таким образом имеет смысл предположить, что дряродэ сзязи флавин-селок имеет ряд особенностей; Для выявления участия различных фрагментов фермента в проявлении тех или ШОС свойств, мы изучали влияние протеолиза на свойства фермента. Для протеолиза белок в концентрация 0,2 мг/мл инкубировали с трехкратным молярным избытком трипсина .в течение 2 часов при рН 7,4 и при температуре 37°С. Затем полученные фрагменты разделяли на колонке с сегздексом Ст -75 л полученные фракции анализировали как при-дине волны 280 вы, так и при дане волны 450 нм. Отношение объема образца к объему колонки быто не менее 1:30. Результаты элтанонной диаграммы (Рис.5) демонстрируют, что при протеолизе в таких услоз;:лх образуются два фрагмента с молекулярными весам" соответственно около 49 я.5-8 кДа. При этом флазиновая простатическая группа оказывается связанной с фрагментом с большей моче-кулярнсй -массой. Оптическй спектр флазянсодерзащего фрагмента не претерпевает существенных изменений (плечо в районе 330 юл вновь не модифицируется)-. При проведении протеолиза мы надеялись, что нам уда стая зыязять новые полосы поглощения в белке,- связанные

пря 330 кл. Мы предполагали, что сложный спектр погло-сенгд Ф-Т23ЛНОВОЙ простетической группы не поззоляет полно'исследовать полосу при 330 ну. и считали, что ггоотеол.из мс^чт ггэ'.озести к разделений о т.к двух группировок. 1отя зам ;; не удалось выявить новых полос доглэдгнця, связанных с цргсутствяем з белке новой грост-тячеекод группы, тем не менее были обнаружены некоторые закономерности, представляйте определенный интерес.

¿о . шкер фракции

.5 Элли'.'оннэя д!озгрз?л/э ПАО после ограниченного протеодкзэ трипеиноу. Белок <0.2мг/м.1) был инкубирован с 3-крать:ыи коляряш гзбыткозг трйпейяа при 37°С и рН 7.4 в течение 2 часов !: сракик:: разделялись на колонке &-75. Фракпг:-: собиралась по 1.5 кя. Размер колонки 1.5x30.

—500 ' .550 60и Пий) Р:,с 6 Сравнение спектров флавиюво* йлуореснекши нативной ПАО йлаЕшеодепяаиего протео лит веского фрагмента ,2).

Ф

- le -

Спектральный индекс препарата несколько улучшается. При этом он от величины 7,5 уменьшается до величины 6,8. Кроме этого, несколько лучше проявляется тонкая структура в районе 280 нм. Некоторое уменьшение индекса свидетельствует о том, что в малом проте-"олптяческоы фрагменте содержатся ароматические аминокислоты, что было подтверждено такжё анализом белковой флуopeсценцаи. малого про-теолятичэсхого фрагмента.

Белковая флуоресценция большего протеолитического фрагмента такге испытывает некоторые язмевен&я, связанные с тем, что несколько уменьшается полоса, флуоресценции при 333 нм. Однако с другой сторояы, 'здесь также вэ наблвдас-тся сдвяга максимума эмиссии. Это наблюдение нам представляется интересным, поскольку означает, что с одной стороны из белка удаляется тряптофан(ы) аз области недоступной для растворителя, а с другой стороны доступность оставшихся тряптофанов остается неизменной.

После ограниченного протеоляза флавиновая флуоресценция испытывает более глубскяе изменения. Так, после протеоляза интенсивность флБЕяновой флуоресценция существенно возрастает, примерно в ■ три раза (Рис.6). Это, на первый взгляд, достаточно неожиданный результат, поскольку, еслд низкий квантовый выход флавзновой флуоресценции обусловлен ковалентной связью флавчн-белок, то протеоллз не долген оказывать такого влияния. Однако это прот:шоречяе можно объяснять иной природой связи флавии-белок. В частности, можно допустить, что связь с белком осуществляется не через цистедн или метлсЕИЯ, а через какую-то другую амляоклслоту. IIpii этом низкий квантовый выход обуслозлен не самой коЕалентной связью фдавзн-бе-лсн, а пространственной сбтаченностью флав-ша с какой-ллбо тушащей группировкой э белке. Этлыд группировками могут быть серусодержа-щле аминокислоты. Я можно допустить, что в результате протеоляза прелсходдт пространственное рззобщенле кля за счет конфориацдонных

в мзлекуле бе яка, или за счет того, что тулащая молекула отделяется оказывается в другом протеолзтическом фрагменте.

Протеоллз такзг преследовал цель изучения ipyriiz хзрактерлс-т::к белка. 3 частности, оказалось, что протеоллз не оказывает вля-я:ч:1= нз гл/уно.югдч5скле свойства фермента. Антигенные детэриякан-

5k33h3sstcs связанней с фрагментом, ¿веацям большую молекулярную массу, сто тзк^е доказывает, что, по-злдлмому, з процессе ог-рандчгнногз протеоляза не про-сходдт серьезных яонформационаых дз-t'^.-.ttur^ 5 iezKTBCii глобуле. Зто подтверждается тнк^е даннкмл об

отсутствии сдвигов в белковой флуоресценции в результате дротес-лиза.

Протеолиз тэкке не оказывал влияния на каталитические свойства фермента. Кроме того, поскольку трипсин является слецдфлчес-кой протеазой, то результата прстеолчза позволяет утверждать, что при таких условиях лжь одна пептидная связь (Ерглнян илл лизин) доступна дтся данной протеазы.

Поскольку нами были получены моноспедм&ические антитела к ферменту шело смысл с их помодьв исследовать внутриклеточную л органную локализацию НАО. Для этого методом дифференциального центрифугирования получались рззличк^е субклеточные фракции " ке-тодом иммунодифйузпи анализировались на наличие з ндх $эр?.:еа?а. Хотя по данным Ь ,1577) фермент локализован 5 перокс?со-

мах, наг/и было показано, что фермент тагее локализован з цитозоле. (Рис.7) Эти данные согласуется с данными, получении": (Ы. 1581). С другой стороны, поскольку в ядрах такке происходит аце-тилирование полкаминоз, мы полагала, что фермент будет таккг присутствовать в ядерной фракцкл, Однако при использовании такого подхода нам не удалось показать налячке ПАО в ядерной фракции. Возможно, что в ядрах метаболизм ацетилполиамяноз осуществляется несколько до иноку путл, кэпряыер с помощью деацетилазы. Не исключено, что ацетдльнне производные полпаминов транспортируется в цитоплазму л здесь подвергаются дальнеЗшеьу метаболизму.

Аналлз органораспределендя фермента с помощью моноспеддфи-ческзх антител выявил его локализацию в печени (Рис.Б). Прячем, в наших экспериментах тестировались почки, плаз!.:а, надпочечники, козг л се гезенка. 3 наших опытах мы походили из предположения, что в этих органах фермент таюке локализован в растворимой Фракции клеток..Полученные данные демонстрируют, что печень по елдч-мому является ключевым органом катаболизма полиакзнов (ацетильных производных). Это в принципе согласуется с да шаги других авторов, согласно которым, в разных органах катаболизм долиазинов осуществляется различиями типами ферментов. Так в плазме полизаны расщепляются медьсодержащей аметоокслдззо2, в мозгу катаболизм полдамжов осуществляется моноаминооксадэзо* ч, наконец, в печени этот процесс осуществляется флавкнсэдержавей растворимой пэлааминооксидазой, причем здесь не происходят катаболизм в обтачном сшсле этого слова, а реутилизация (обновление) пула полиакзнов.

©

©

Pi'.c. 7 Ans пуз субклеточной локализации.ПАО кетопож икуунодс^узг/ I-ыктозоль, 2-ядеркэя фракпкя, З-ьптохондрки, 4-якнрэсэуы.

О

ф

0

?кс. 8 Органоспегиткческэя локализация ПАО. ' йжукодг&^узгя знтуск-BopoTKi" к ПАО (центральный кружок; с гомогенетеук: 1-печзль, 2-пэчк;', 3-сеаезен?.а, 4- плзз:.-э, 5-г:адг;ЭЧ5Ч.-г/кг, б-.озг.

- 21 -

Таким образом, разработана эффективная процедура очистки флзвинсодержащей ПАО из печени крупного рогатого скота, которзя позволила проводить систематические исследования этого фермента. Были исследована в основном оптические свойства фермента, которые позволяли сделать некоторые интересные заключения. Иммунологические эксперименты заявили субклеточную и органную локализацию фермента. .

Естественно, что работа, нацеленная на получение вксокоочи-щенной ПАО,.фермента, который ранее не был практически исследован не может одновременно ответить на многие гознякавдие в процессе работы вопросы, такие как нплгчае и природа карбонильного фактора, характер связи флавин-белок, детальные структурные исследования этого фермента к механизм катализа.' Однако без осуществления реализованной в данной работе основной задача, сага постановка указанных вопросов была бы невозможной.

швода

I. Разработана эффективная процедура получения высокоочпцен-ной-флавинсодерЕащей ПАО из печени рунного рогатого скота в препаративных количествах. Препарат получен з злектрофоретически гомогенной форме, имеющей спектральный аддэкс чистоты, ^280^А50,

равный 7.5.

. 2. Определены содержание флазана, молекулярная тссэ, изо-электрическая точка, субъединичный состав, активность фермента по отношению к различным субстратам, а такта его оптические и антигенные свойства. Показано,.что наибольшую активность феравнт проявляет по отношению к ацетллспермидину.

3. Получены антитела к ферменту и-с их использованием изучены субклеточное и органное распределение, Фермент"в основном локализован в питозоле печени.

4. Изучены фяззко-химические и ферментативные характеристики двух фрагментов фермента, полученных с использованием ограниченного протеолцза фермента трипсином. Установлено, что флавиыозая простетическая группа связана с большим фрагментом..

5. Изучены люминесцентные свойства нативного фермента и фла~ вянсодержЕщего фрагмента. Показано, что. спектр флуоресценции содержит два основных максимума при 333 нм и 528 нм, обусловленных соответственно ароматическими аизноязслотами и флавиновой просте-

тической группой. С использованием метода тушения флуоресценции KI, С С и акриламидом показано, что популяцзя триптофановых остатков фермента язляется "гомогенной:". Эффективное тушение достигается при использовании KI я акриламида, в то время как С?С£ малоэффективен в качестве тушителя.

Выявлена такяа фдуорекмнддя тирозина, которая в нетканом белке ыэ скирована.

б. Изучение окстрагируемостя" флавина (КВт. и кислотой), а такие люминесцентных свойств фермента привело к выводу, что сзяз? флзвика с белковой частью» имеет по-вдд2ыо;ау атипичный для флаво-цротахков характэр.

СПИСОК FASOT, OE7bffiEOBinHdX ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гаспзрян Е.К., Налбандян P.M. Очистка флззянсодаржадей полз-е-ынооксядэзн из печени я лгминесцаяткыг свойства фермента. - Ьлахлмая, I9S0, т. 55, вып. 9-, с. 1632-1637.

2. Гаспгрлв В.К. Флуоресцентные свойства полиамкнооксгдазы из мгтохогдрл5 печени быка.. - Тезисы II Республиканской молодежной конференция по физико-химической биологзл, посвященная 70-летию Вздикого Октября.-Ереван, 1937, 13.

3- C-aspariaa V.K., Kaltandyan Я.К. Effect of copper or. the poly-a.~ir.e ozidg.se. - Abstracts of the Second International Symposium on the riarr.ecolcgicel effects of copper conplexes, little Доек, *Э6о, p.34-.

=но к печзт;

.S3 г-. феруэт б уу. 60x84 I/I6 1,0'печ.л.

Tnpes 100 бе

:TKO

= LC

ОСП .Apv. СБ! ул. Тэрьяна 74