Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обусловленные эпилепсией изменения ГАМК рецепторов гиппокампа: молекулярно-биологические исследования одиночных нейронов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рихтер, Татьяна Яковлевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. РОЛЬ ГАМКА-РЕЦЕПТОРОВ В ЭПИЛЕПСИИ

ТЕМПОРАЛЬНОЙ ЗОНЫ (обзор литературы).

1.1. Строение ГАМКд-рецепторов.

1.1.1. Сайты связывания агонистов ГАМ Кд-рецепторов.

1.1.2. Сайты связывания бензодиазепинов, барбитуратов, пикротоксина и стероидов.

1.1.3. Молекулярная структура субъединиц ГАМ Кд-рецепторов.

1.1.4. Хромосомная локализация генов ГАМКд-рецептора.

1.1.5. Многообразие комплекса ГАМКд-ионных каналов.

1.1.6. Фармакологические свойства субъединиц ГАМКд-рецептора

1.2. Хронические эпилептогенные изменения на клеточном уровне в лимбической системе.

1.2.1. Анатомические изменения в лимбической системе при ЭТЗ

1.2.2. Изменения в ГАМКд-рецепторах из гиппокампа животных, больных ЭТЗ.

1.2.3. Изменения ГАМ Кд-рецепторов, очевидные в синаптических реакциях.

1.2.4. Изменения в транскрипции субъединиц ГАМКд-рецепторов

1.2.5. Функция ГАМКд-рецепторов в эпилептических ЗФ-нейронах человека: корреляция с моделями животных.

1.2.6. Прочие изменения в эпилептическом гиппокампе.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Подготовка экспериментальных животных.

2.2. Выделение РНК.

2.3. РНК-и слот-блот анализ.

2.4. Синтез радиоактивных меток для РНК- и слот-блотов.

2.5. Выделение одиночных нейронов.

2.6. Электрофизиологические эксперименты: вольтаж-кламп рекординг.

2.7. Полимеразно-цепная реакция на одиночных нейронах.

2.8. Антисенс-РНК амплификация.

2.9. Окрашивание срезов.

2.10. Материалы.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 3. СВЯЗАННЫЕ С ЭТЗ ИЗМЕНЕНИЯ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЕ ГАМКА-РЕЦЕПТОРОВ В ОТДЕЛЬНЫХ ЗОНАХ МОЗГА ЭПИЛЕПТИЧЕСКИХ ЖИВОТНЫХ.

3.1. Результаты окрашивания по Тимму гиппокампа контрольных и эпилептических животных.

3.2. Анализ изменений в экспрессии мРНК отдельных субъединиц ГАМКд-рецептора на тканевом уровне.

3.3. Изменения в экспрессии мРНК субъединиц ГАМКд-рецептора в одиночных нейронах у эпилептических животных.

3.3.1. Связанные с ЭТЗ изменения в молекулярной структуре ГАМКд-рецепторов в зоне Fascia Dentata гиппокампа хронически эпилептических животных.

3.3.2. Изменения в молекулярной структуре ГАМКд-рецепторов в зоне Fascia Dentata гиппокампа в латентном периоде ЭТЗ.

3.3.3. Изменения в экспрессии мРНК декарбоксилаз глутаминовой кислоты в гранулярных клетках из зубчатой фасции эпилептических животных.

3.3.4. Связанные с эпилепсией изменения в молекулярной структуре

ГАМКд рецепторов в зонах СА1 и САЗ гиппокампа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Обусловленные эпилепсией изменения ГАМК рецепторов гиппокампа: молекулярно-биологические исследования одиночных нейронов"

Актуальность проблемы. Эпилепсия поражает около 1-2 % населения, причем эпилепсия темпоральной зоны (ЭТЗ) является наиболее распространенной формой (Annegers, J.F., 1993; Engel, J., 1996). До 60% пациентов с ЭТЗ устойчивы к терапии антиконвульсионными медикаментами. Многие из этих пациентов получают хирургическое лечение с удалением эпилептического фокуса, который обычно представлен частью темпоральной зоны головного мозга, включающей гиппокамп (ГК). Резекция ГК успешна во многих случаях, обеспечивая полное отсутствие судорог не менее чем у 80% пациентов по крайней мере на один год (McLachlan, R.S. et al.,1997).

Типичной патологией в ГК пациентов с ЭТЗ является склероз темпоральной зоны, для которого характерна нейродегенерация в зонах Аммонова рога СА1, САЗ и СА4 (Babb, T.L. et al., 1991; Babb, T.L. and Pretorius, J.K., 1993). Другие зоны ГК (CA2, Fascia Dentata, Subiculum) обычно не подвержены склерозу. Кроме того, в ГК пациентов с ЭТЗ происходит разрастание аксонов гранулярных клеток во внутренний молекулярный слой Fascia Dentata (FD) ( Sutula, Т. et al., 1989: Houser, C.R. eta!., 1990).

Эти анатомические и физиологические черты также присущи многим экспериментальным моделям ЭТЗ, включая электростимулирование (киндлинг), каинатную и пилокарпиновую модели (Turski, W.A. et al., 1983, 1989; Tauck, D.L. and Nadler, J.V., 1985; Mello, L.E.A.M. et al., 1993; ; White, G. and Gurley, D.A., 1995 Coulter, D.A. et al., 1996; Gibbs, J.W. et al., 1997; Shumate, M.D. et al., 1997).

Считается, что Fascia Dentata в нормальном мозгу служит "воротами", контролирующими количество возбуждения, которое достигает остальной гиппокамп. Одним из факторов, способствующих эпилептогенезу, может быть повреждение этих "ворот", и вместо контроля над уровнем возбуждения FD может, напротив, амплифицировать его, приводя к лимбическим судорогам. Потеря субпопуляций клеток ГК вместе с анормальным аксональным ростом может приводить к возникновению патологического синаптического цикла в эпилептическом ГК, вызывая повышенную возбудимость, нарушая таким образом баланс между возбуждением и торможением, что, в свою очередь, является субстратом для возникновения эпилептических судорог (Buckmaster, P.S. and Dudek, F.E., 1997). Сдвиг в этом балансе может быть результатом не только синаптической реорганизации, но и изменений в тормозной эффективности сохранившихся FD-нейронов вследствие изменившихся свойств ГАМКд-рецепторов.

Одним из основных проводников синаптического торможения в головном мозге являются ГАМКд-рецепторы (ГАМКдР). Нарушение функции ГАМКдР характерно для некоторых форм эпилепсии (De Deyn, P. et al., 1990; Tasker, J. and Dudek, F., 1991; Olsen, R. and Avoli, M., 1997). Связанные с эпилепсией изменения функции ГАМКдР были описаны в гранулярных клетках FD из мозга больных.с ЭТЗ и крыс, у которых эпилепсия была вызвана пилокарпином (nnnO-Kpbicbi)[Gibbs, J.W. et al., 1997; Shumate, M.D. et al., 1998]. Эти изменения включают ГАМК-эффективность, чувствительность ГАМК-тока к блокаде цинком и модуляцию бензодиазепинами.

Менее изученными остаются изменения молекулярной композиции постсинаптических ГАМКдР в сохранившихся нейронах ГК. Остается также открытым вопрос, являются ли изменения структуры и функции ГАМКдР причиной или следствием развития эпилепсии. Изменения функции ГАМКдР могут быть следствием изменения их субъединичной композиции, что может приводить к пониженной эффективности антиэпилептических лекарств, действующих на ГАМКдР. Знание молекулярной композиции "эпилептических" ГАМКдР в различных типах нейронов ГК может привести к созданию новых лекарственных средств, которые будут специфически нацелены на типы рецепторов, доминирующих в эпилептических нейронах.

Цель работы. Изучить корреляцию экспрессии мРНК субъединиц ГАМКд-рецепторов гиппокампа с их функцией до и после развития ЭТЗ на примере распространенной экспериментальной модели, в которой хроническое заболевание вызывается инъекцией пилокарпина взрослым крысам.

Задачи исследования:

1) Изучить регионально специфичные изменения в экспрессии мРНК двух важнейших субъединиц ГАМКд-рецепторов а1 и у2 на тканевом уровне как в лимбическом судорожном очаге, так и в зонах, охваченных вторичной генерализацией судорог - энторинапьном и периринальном кортексе и таламусе ПИЛО-животных.

2) Исследовать экспрессию мРНК различных субъединиц ГАМКд-рецепторов в одиночных нейронах из различных зон (FD, СА1, САЗ) гиппокампа крыс, хронически больных ЭТЗ, вызванной пилокарпином.

3) Изучить экспрессию мРНК различных субъединиц ГАМКдР в одиночных нейронах из FD, СА1 и САЗ зон гиппокампа крыс в латентный период - после вызванного пилокарпином Status epilepticus до начала проявления хронической стадии заболевания ЭТЗ.

4) Проанализировать корреляцию экспрессии мРНК субъединиц ГАМКдР гиппокампа с их функцией у крыс, хронически больных ЭТЗ, а также у крыс в латентный период ЭТЗ.

Научная новизна. Впервые с помощью ДНК- и слот-блотов ткани из специфических участков мозга показано, что у хронически больных эпилепсией животных происходит изменение экспрессии мРНК субъединиц а1 и у2 ГАМКд-рецепторов в различных зонах головного мозга, и эти изменения не ограничиваются лимбической системой, а также охватывают таламические и кортикальные области. Масштабные изменения экспрессии субъединиц ГАМКд-рецепторов могут вносить вклад в усиление вторичной генерализации судорог, наблюдаемых у ПИЛО-животных.

Впервые на базе комбинации электрофизиологических (метод пэтч-клампа отдельных нейронов) и молекулярно-биологических (полимеразно-цепная реакция и линейная антисенс-РНК амплификация одиночных нейронов) методов показано, что в гранулярных нейронах из FD гиппокампа хронически больных эпилепсией крыс понижается экспрессия мРНК субъединиц а1 и (31 ГАМКд-рецептора, в то время как экспрессия мРНК субъединиц а4, (33, 8 и 8 возрастает. Эти изменения в экспрессии мРНК коррелируют с изменениями функции ГАМКдР, а именно с пониженной модуляцией золпидемом и повышенной чувствительностью к блокаде цинком.

Впервые с помощью метода аРНК амплификации также показано, что в нейронах СА1 ПИЛО-крыс понижена экспрессия мРНК а5-субъединицы, а в нейронах из САЗ повышена экспрессия мРНК (31-субъединицы.

Впервые показано, что ассоциированные с эпилепсией изменения в FD возникают на самой ранней, латентной стадии заболевания (в течение 24 часов после вызванного инъекцией пилокарпина Status epilepticus) и предшествуют началу хронических спонтанных судорог. Эти данные позволяют предположить, что связанные с эпилепсией изменения функции ГАМКдР могут быть следствием изменений в композиции субъединиц, которые происходят до начала спонтанных судорог. Таким образом, изменение композиции субъединиц ГАМКдР может являться составной частью механизма эпилептогенеза.

Практическая значимость. Полученные данные имеют большое значение для лечения эпилепсии. В настоящее время для ее терапии применяются лекарства, разработанные и апробированные на нормальном мозге, в котором судороги были вызваны в ходе эксперимента. Во многих случаях лечение такими средствами не является достаточно эффективным, и больным хирургически удаляют эпилептический очаг. Изменения в молекулярной композиции и функции хронически эпилептических ГАМКд-рецепторов могут влиять на эффективность действия лекарств. Выяснение структуры эпилептических ГАМКдР позволит более целенаправленно использовать имеющиеся лекарственные средства, а также создать новые, которые будут действовать непосредственно на эпилептические ГАМКд-рецепторы. Кроме того, наши данные указывают на возможность предотвращения развития эпилепсии с помощью генной терапии, нацеленной на регуляцию экспрессии субъединиц ГАМКдР.

Внедрение результатов. Основные положения диссертации использованы в лекциях и на практических занятиях на кафедрах нервных болезней, нормальной физиологии человека и биохимии Саратовского государственного медицинского университета, на кафедре биохимии и биофизики Саратовского государственного университета. Результаты работы представляют большой теоретический и практический интерес для невропатологов и нейрохирургов, так как они могут позволить более направленно использовать имеющиеся лечебные препараты у больных эпилепсией, а также создать новые, которые будут действовать непосредственно на эпилептические рецепторы.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на 25, 27, 28 и 29 Конгрессах общества по нейронаукам (Сан-Диего, США, 1995; Новый Орлеан, США, 1997; Лос-Анджелес, США, 1998; Майами, США, 1999), ежегодных конгрессах Американского общества по эпилепсии (Бостон, США, 1997; Сан-Диего, США, 1998), проблемной комиссии по неврологии СГМУ (Саратов, 1998), межкафедральных научных конференциях кафедр нормальной физиологии человека и биохимии СГМУ (Саратов, 1997, 1998, 1999),.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Специфические изменения в экспрессии мРНК двух важнейших субъединиц ГАМКд-рецепторов - а1 и у2 происходят у ПИЛО-животных как в лимбическом судорожном очаге, так и в зонах, охваченных вторичной генерализацией судорог - энторинальном и периринапьном кортексе и тапамусе .

2) Обусловленные ЭТЗ изменения в экспрессии мРНК субъединиц ГАМКдР a1, a4, (31, (33, 8 и е наблюдаются в одиночных гранулярных нейронах зоны FD хронически больных крыс.

3) Измененная экспрессия мРНК субъединиц ГАМКдР а5 (зона СА1) и pi (зона САЗ) отмечается в одиночных пирамидальных нейронах Аммонова рога крыс, хронически больных ЭТЗ.

4) Изменения в экспрессии мРНК субъединиц ГАМКдР а1, a3, J31, рЗ, 5 и s происходят в одиночных гранулярных нейронах зубчатой фасции крыс в латентный период (после Status epilepticus до начала проявления заболевания ЭТЗ) и наблюдается их сходство с таковыми у крыс, хронически больных ЭТЗ.

5) Изменения функции эпилептических ГАМКдР является следствием сдвигов в экспрессии субъединиц мРНК в гранулярных нейронах зоны FD как у крыс, хронически больных ЭТЗ, так и находящихся в латентном периоде ЭТЗ, указывающие на снижение количества ГАМКдР типа Б31.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, главы собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 132 страницах машинописи, иллюстрирована 21 рисунком и включает 7 таблиц. Список использованной литературы включает 209 наименований.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Рихтер, Татьяна Яковлевна

ВЫВОДЫ

1. Дифференцированные регионально специфичные изменения в экспрессии мРНК двух важнейших субъединиц ГАМКд-рецепторов а1 и у2, исследованные на тканевом уровне, имеют место не только в лимбическом судорожном очаге, но и в зонах, охваченных вторичной генерализацией судорог - энторинальном и периринальном кортексе и таламусе.

2. В одиночных гранулярных нейронах из зоны Fascia Dentata гиппокампа крыс, хронически больных вызванной пилокарпином ЭТЗ, понижена экспрессия мРНК субъединиц а1 и р1 ГАМКд-рецептора, в то время как экспрессия мРНК субъединиц а4, рз, 8 и s увеличена.

3. В одиночных пирамидальных нейронах из зоны СА1 гиппокампа хронически больных ЭТЗ ПИЛО-крыс понижена экспрессия мРНК а5-субъединицы ГАМКдР.

3. В одиночных пирамидальных нейронах из зоны САЗ гиппокампа хронически больных ЭТЗ крыс повышена экспрессия мРНК р1-субъединицы и понижена экспрессия субъединицы 8 ГАМКдР.

4. Ассоциированные с эпилепсией изменения в экспрессии мРНК субъединиц ГАМКдР в зубчатой фасции гиппокампа возникают на самой ранней, латентной стадии заболевания - в течение 24 часов после вызванного инъекцией пилокарпина Status epilepticus - и предшествуют началу хронических спонтанных судорог. Экспрессия мРНК субъединиц ГАМКдР а1 и pi снижается, а экспрессия мРНК субъединиц аЗ, РЗ, 8 и г возрастает в гранулярных нейронах зоны FD гиппокампа крыс в латентный период.

5. Изменения в экспрессии субъединичной мРНК в гранулярных нейронах зоны FD гиппокампа коррелируют с изменениями функции ГАМКдР у крыс, хронически больных ЭТЗ, а также у крыс латентного периода. Связанные с ЭТЗ изменения функции ГАМКдР могут быть следствием сдвигов в композиции субъединиц, которые происходят до начала спонтанных судорог. Эти изменения в функции и экспрессии мРНК указывают на снижение количества ГАМКдР типа Б31 у крыс уже 24 часа после вызванного инъекцией пилокарпина Status epilepticus, и сохраняются у крыс, хронически больных ЭТЗ. Таким образом, изменение композиции субъединиц ГАМКдР может являться составной частью механизма эпилептогенеза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ с помощью ДНК- и слот-блотов ткани из специфических участков мозга показал, что у хронически больных эпилепсией животных происходит изменение экспрессии мРНК субъединиц а1 и у2 ГАМКд-рецепторов в различных зонах головного мозга, и эти изменения не ограничиваются лимбической системой. Резко выраженное снижение экспрессии а1 и у2 мРНК наблюдалось в ЭРК эпилептических животных, что однако может быть следствием вызванных ЭТЗ повреждений, очевидных в ЭРК некоторых ПИЛО-животных. Драматическое снижение экспрессии а1-мРНК наблюдалось в ПРК ПИЛО-крыс. Изменения в экспрессии у2-мРНК в этой зоне не достигли статистической значимости. При диссекции этой области в ней не было заметно видимых повреждений. Более того, специфическое снижение экспрессии а1-мРНК (без изменений в уровне у2-мРНК) предполагает, что это является характерным региональным сдвигом в экспрессии этой субъединицы в ПРК, что вряд ли может быть следствием вызванной эпилепсией нейродегенерации. Снижение экспрессии а1-мРНК было найдено в ВБ-зоне ПИЛО-животных. В лимбической системе изменения в экспрессии обеих а1 и у2 мРНК были очевидны. В зоне СА1 гиппокампа уровень экспрессии обеих а1 и у2 мРНК был ниже контроля. В другой зоне гиппокампа, зубчатой фасции, была понижена экспрессия у2-мРНК.

Генерализованные тоническо-клонические судороги (ГТКС), наблюдаемые у ПИЛО-животных, изначально имеют лимбический фокус, а затем распространяются в неокортекс и таламус, активируя сперва энторинапьный и периринальный участки кортекса (Cavalheiro, Е.А. et al., 1991) - критические структуры для генерализации судорог (Garant D.S. et al., 1993, Halonen Т. et al., 1994, Kelly M.E., Mclntyre D.C., 1996). Несмотря на роль ЭРК и ПРК в распространении фокальных лимбических судорог из гиппокампа и вклад неокортекса и таламуса в экспрессию вторично генерализованных тонических-клонических судорог, до настоящего времени изменениям в этих структурах в экспериментальных моделях ЭТЗ уделялось недостаточное внимание. Различная степень нейродегенерации в этих областях была отмечена в экспериментальных моделях ЭТЗ животных. В ПИЛО - модели ЭТЗ потеря нейронов и глиозис были описаны в ЭРК (Du, F. et al., 1995), гиппокампе (Mello L.E.A.M. et al., 1993, Obenaus A. et al., 1993; Liu Z. et al., 1994, Houser C.R., Esclapez M., 1996), таламусе, ПРК и неокортексе (Turski L. et al., 1983). Однако другие потенциально эпилептогенные изменения, включая дифференциальную регуляцию экспрессии субъединиц ГАМКд-рецепторов в результате заболевания эпилепсией, как правило изучались только в субрегионах гиппокампа различных моделей ЭТЗ: электростимулирование (Kokaia М. et al., 1994; Kamphuis W. et al., 1995;), каинатная модель (Schwarzer С. et al., 1997, Tsunashima K. et al., 1997) и пилокарпиновая модель (Houser C.R. et al., 1995, Houser C.R., Esclapez M., 1996, Rice A. et al., 1996). Ассоциированные с эпилепсией изменения функции ГАМКд-рецепторов также были охарактеризованы в гиппокампе как ПИЛО-животных, так и больных ЭТЗ (Gibbs J.W. et al., 1997, Shumate M.D. et al., 1998). Эти функциональные изменения предположительно являются следствием сдвигов в субъединичной композиции ГАМКд-рецепторов в эпилептических нейронах.

Описанные нами изменения в экспрессии мРНК субъединиц ГАМКд-рецепторов происходят не только в гиппокампе, но также и в таламической и кортикальной областях у ПИЛО-крыс, предполагая тем самым, что изменения в композиции ГАМКд-рецепторов могут иметь место не только в лимбическом судорожном очаге, но также и в других регионах мозга, последовательно охватываемых ГТКС. В этой связи было примечательно снижение экспрессии а1-мРНК в ПРК-зоне мозга, критической для вторичной генерализации судорог (Kelly М.Е., Mclntyre D.C., 1996), и в таламусе, который вместе с неокортексом обязательно активируется и вовлекается в экспрессию ГТКС (Gale К., 1992, Moshe S.L. et al., 1995). Наши данные предполагают, что изменения свойств нейронов у хронически больных ЭТЗ животных, присущие для эпилептического фокуса, им не ограничиваются. Масштабные изменения экспрессии субъединиц ГАМКд-рецепторов могут вносить вклад в усиление вторичной генерализации судорог, наблюдаемых у ПИЛО-животных.

Использование в анализе гетерогенных клеточных типов может приводить к определенной вариабельности результатов между исследованиями на уровне ткани и на одиночных нейронах. Известно, что экспрессии мРНК ГАМКд-рецепторов варьирует между различными типами нейронов, а также присутствует в клетках глии (Bureau, М. et al., 1995; Fraser, D. et al., 1995; Schwarzer, C. et al., 1997). В связи с этим нами уделено основное внимание изучению индивидуальных нейронов определенного клеточного типа - гранулярных клеток зубчатой фасции и пирамидальных клеток зон СА1 и САЗ гиппокампа.

Эпилепсия темпоральной зоны является наиболее распространенным судорожным заболеванием. Для нее характерно задержанное по времени развитие спонтанных судорог после травмы прежде нормального мозга. Нарушенная тормозная нейротрансмиттерная функция в гиппокампе способствует гипервозбудимости, порождающей ЭТЗ, но лежащие в основе этого молекулярные механизмы неизвестны. Сочетая электрофизиологические эксперименты и антисенс-амплификацию мРНК одиночных клеток, нам удалось продемонстрировать, что экспрессия мРНК субъединиц ГАМКд-рецепторов существенно изменена в нейронах из зубчатой фасции, зон СА1 и САЗ гиппокампа эпилептических животных.

Нами показано значительное снижение экспрессии мРНК а5-субъединицы ГАМКд-рецептора в одиночных эпилептических нейронах из зоны СА1. Аналогичное снижение экспрессии мРНК этой субъединицы было продемонстрировано в работах по in situ гибридизации на тканевом уровне (Houser C.R., Esclapez М., 1996; Rice A. et al., 1996). В зоне САЗ мы впервые наблюдали резкое увеличение экспрессии мРНК субъединицы р1, сопровождающееся значительным понижением экспрессии мРНК субъединицы с ГАМКд-рецептора.

Нам также удалось установить, что в гранулярных нейронах из зубчатой фасции хронически эпилептических животных понижена экспрессия мРНК субъединиц а1 и [31, в то же время экспрессия мРНК субъединиц а4, рз, 5 и е повышена в этих нейронах. Изменения в экспрессии генов коррелируют со сдвигами в функции ГАМКд-рецепторов, включая пониженную модуляцию золпидемом и возросшую чувствительность к блокаде цинком. Изменения в экспрессии и функции ГАМКд-рецепторов происходят очень быстро (уже 24 часа после вызванного инъекцией пилокарпина Status epilepticus) и значительно опережают начало спонтанных судорог, то есть предшествуют началу эпилепсии, означая, что описываемые нами анормальные экспрессия и функция ГАМКд-рецепторов играют существенную роль в процессе эпилептогенеза.

Во многих моделях животных ЭТЗ, и, возможно, у человека, существует длительный латентный период между эпилептогенным повреждением мозга (Status Epilepticus в моделях животных, комплексная фебрильная судорога, травма головы, ишемический эпизод и др. - у человека) и последующим развитием периодических спонтанных лимбических судорог, состоянием, которое затем сохраняется на протяжении жизни животного или пациента с ЭТЗ.

Очевидно, для того, чтобы функциональные сдвиги способствовали такому "задержанному" и сохраняющемуся затем на протяжении жизни эпилептическому состоянию, они должны быть устойчивыми и продолжительными. Также утверждалось, что развитие изменений должно тоже быть замедленным для того, чтобы способствовать развитию эпилепсии, то есть что механизм должен развиваться с такой же задержкой, как и проявление судорожного заболевания. Последний аргумент представляется спорным. Считалось, что реорганизация нейрональной сети (разрастание аксонов гранулярных клеток ЗФ) выполняет это условие задержки, и поэтому является основным кандидатом на роль механизма в ЭТЗ (Wuarin J.P., Dudek F.E., 1996).

Однако, не у всех пациентов с ЭТЗ наблюдается аксональная реорганизация, а у животных, инъецированных пилокарпином или каинатом, развиваются спонтанные повторяющиеся судороги и в отсутствие разрастания аксонов гранулярных клеток ЗФ, когда им вводили ингибиторы синтеза протеаз (Longo В.М., Mello L.E.A.M., 1997).

Поэтому, хотя реорганизация иннервации гранулярных клеток ЗФ вносит свой важный вклад, она не является ни необходимым, ни достаточным механизмом, чтобы полностью объяснять возникновение ЭТЗ во всех случаях.

Нам представляется, что другие факторы, в частности изменения в тормозной функции в зонах ЗФ, САЗ и СА1 также являются важными вкладчиками в индукцию ЭТЗ, возможно в сочетании с иннервационной реорганизацией. Из наших исследований очевидно, что многие аспекты изменений в постсинаптических ГАМКд-рецепторах в гранулярных клетках ЗФ проявляются в начале скрытого периода, предшествуя развитию спонтанных судорог (Shumate M.D. et al., 1997, 19986; Brooks-Kayal A. et al., 1998a, 19986), и сохраняются на всю жизнь организма (Gibbs J.W. et al., 1997), удовлетворяя таким образом временным требованиям для эпилептогенного механизма в ЭТЗ. Наша гипотеза состоит в том, что эти изменения в тормозной функции создают условия для развития спонтанной судорожной активности. В одних случаях эти изменения, в сочетании с иннервационной реорганизацией и потерей отдельных популяций нейронов гиппокампа, ассоциированных с эпилептогенной травмой, могут быть достаточными для возникновения ЭТЗ. В других случаях, эти изменения в ГАМКд-рецепторах предоставляют плодородную почву, на которой в лимбической системе другие эпилептогенные механизмы могут развиваться и создавать нарастающий цикл судорог, вызывающих новые судороги, и, наконец, ЭТЗ.

В соответствии с работами Buhl Е.Н. et al. (1996) на электростимулированных животных, нам представляется, что повышенная чувствительность к ионам цинка ГАМКд-рецепторов ЗФ-нейронов, может быть функционально важной для развития патологической активности.

Цинк колокализован с глутаматом в везикулах в окончаниях аксонов гранулярных клеток ЗФ, и может высвобождаться в высоких концентрациях при стимуляции (более 100-300 цМ; Assaf S.Y., Chung Y., 1984; Howell G.A. et al., 1984). В норме аксоны ЗФ-нейронов не иннервируют гранулярные клетки ЗФ. При ЭТЗ, аксоны ЗФ-нейронов разрастаются и образуют густую иннервацию во внутренний молекулярный слой зубчатой фасции (Mello L.E.A.M. et al., 1993; Tauck D.L., Nadler J.V., 1985; Okazaki M.M. et al., 1995; Sutula T. et al., 1989). Как постоянное последствие острого эпизода Status Epilepticus, возникает сочетание повышенной чувствительности к. цинку ГАМКд-рецепторов гранулярных клеток ЗФ, которые находятся в непосредственной близости разросшихся аксонов ЗФ-нейронов, обеспечивающих механизм высвобождения цинка во внутренний молекулярный слой зубчатой фасции, отсутствующий в нормальном мозге.

По нашей гипотезе, эти совпадающие события подготавливают почву для катастрофического провала в торможении во время наступления судорог в зубчатой фасции. В норме зубчатая фасция сильно фильтрует поступающий сигнал посредством комбинации свойств самих гранулярных клеток ЗФ и других мощных ингибиторных механизмов, присутствующих в зубчатой фасции (Lothman E.W. et al., 1991; Heinemann U. et al., 1992). Однако, после выше описанных событий, инициированных как долговременное последствие эпизода Status Epilepticus, эта воротная функция может быть динамически нарушена (схематически изображено на рис.21). Повторяющаяся активация зубчатой фасции (которая может иметь место во время начала судороги) может приводить к мобилизации и высвобождению ионов цинка, содержащихся в окончаниях аксонов гранулярных клеток ЗФ (Assaf S.Y.,

ЭПИЛЕПСИЯ новые зксоны

Перф.путь

Вход ( Пйрф. путь // Zn'' ^ > . щ J га^

11

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рихтер, Татьяна Яковлевна, Саратов

1. Annegers, J.F., The epidemiology of epilepsy. 1.: Wyllie, E. (Ed.), The Treatment of Epilepsy: Principles and Practice, Lea & Febiger, Philadelphia, 1993., 157-164.

2. Assaf, S.Y., Chung, S.H. Release of endogenous Zn2+ from brain tissue during activity. Nature., 1984, 308(5961 ):734-736.

3. Babb, T.L., Kupfer, W.R., Pretorius, J.K., Crandall, P.H., Levesque, M.F.,. Synaptic reorganization by mossy fibers in human fascia dentata. Neuroscience 1991, 42:351-363.

4. Babb, T.L., Pretorius, J.K., Kupfer, W.R., Crandall, P.H. Glutamate decarboxylase-immunoreactive neurons are preserved in human epileptic hippocampus. J. Neurosci., 1989,. 9(7):2562-2574.

5. Babb, T.L., and Pretorius, J.K. Pathologic substrates of epilepsy. In: Wyllie, E. (Ed.), The Treatment of Epilepsy: Principles and Practice, Lea & Febiger, Philadelphia., 1993, 55-75.

6. Bateson, A.N., Lasham, A., Darlison, M.G. Gamma-aminobutyric acid-A receptor heterogeneity is increased by alternative splicing of a novel beta-subunit gene transcript. J. Neurochem. ., 1991, 56:1437-1440.

7. Beck, H., Steffens, R., Heinemann, U., Elger, C.E. Properties of voltage-activated Ca2+ currents in acutely isolated human hippocampal granule cells. J. Neurophysiol. ., 1997, 77(3): 1526-1537.

8. Bekenstein, J.W., Lothman, E.W. Dormancy of inhibitory interneurons in a model of temporal lobe epilepsy. Science., 1993, 259(5091 ):97-100.

9. Ben-Ari, Y. Limbic seizure and brain damage produced by kainic acid: mechanisms and relevance to human temporal lobe epilepsy. Neuroscience., 1985, 14(2):375-403.

10. Benke, D., Honer, M., Michel, C., Mohler, H. GABAa receptor subtypes differentiated by their y-subunit variants: prevalence, pharmacology and subunit architecture. Neuropharmacology., 1996,35:1413-1423.

11. Bovolin, P., Santi, M.R., Memo, M., Costa, E., Grayson, D.R. Distinct developmental patterns of expression of rat a1, a5, y2s, and y2L y-aminobutyric acidA receptor subunit mRNAs in vivo and in vitro. J. Neurochem. ., 1992, 59:62-72.

12. Brooks-Kayal, A.R., Shumate, M.D., Jin, H., Rikhter, T.Y., Coulter, D.A., Selective changes in single cell GABA(A) receptor subunit expression and function in temporal lobe epilepsy. Nat. Med., 1998, 4(10):1166-72.

13. Brooks-Kayal, A., Shumate, M.D., Hong Jin, Rikhter, T.Y., Coulter, D.A., Rapid and sustained changes in GABAa receptor expression and function in epileptic dentate granule cells. Soc. Neurosci., 1998, Abstr. 24:2137.

14. Buckmaster, P.S., and Dudek, F.E. Network properties of the dentate gyrus in epileptic rats with hilar neuron loss and granule cell axon reorganization. J. Neurophysiol. 1997, 77:2685-2696.

15. Buhl, E.H., Otis, T.S., Mody, I. Zinc-induced collapse of augmented inhibition by GABA in a temporal lobe epilepsy model. Science, 1996, 271:369-373.

16. Bureau, M., Laschet, J., Bureau-Heeren, M., Hennuy, В., Minet, A., Wins, P., Grisar, T. Astroglial cells express large amounts of GABAA receptor proteins in mature brain. J. Neurochem. ., 1995, 65(5):2006-2015.

17. Bureau, M., and Olsen, R.W. Multiple distinct subunits of the y-aminobutyric acid-A receptor protein show different ligand-binding affinities. Mol. Pharmacol., 1990, 37:497-502.

18. Bureau, M., and Olsen, R.W. GABAa receptor subtypes: ligand binding heterogeneity demonstrated by photoaffinity labeling and autoradiography. J. Neurochem., 1993, 61(4):1479-1491.

19. Burgard, E.C., Tietz, E.I., Neelands, T.R., Macdonald, R.L. Properties of recombinant gamma-aminobutyric acid A receptor isoforms containing the alpha 5 subunit subtype. Mol. Pharmacol., 1996, 50(1):119-127.

20. Burt, D.R. and Kamatchi, G.L. GABAa receptor subtypes: from pharmacology to molecular biology. The FASEB J., 1991, 5:2916-2923.

21. Cao, Y., Wilcox, K.S., Martin, C.E., Rachinsky, T.L., Eberwine, J., Dichter, M.A. Presence of mRNA for glutamic acid decarboxylase in both excitatory and inhibitory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93:9844-9.

22. Cavalheiro, E.A., Leite, J.P., Bortolotto, Z.A., Turski, W.A., Ikonomidou, C., Turski, L. Long-term effects of pilocarpine in rats: structural damage of the brain triggers kindling and spontaneous recurrent seizures. Epilepsia., 1991, 32:778-782.

23. Cavazos, J.E., Golarai, G., Sutula, T.P. Mossy fiber synaptic reorganization induced by kindling: time course of development, progression, and permanence. J. Neurosci., 1991, 11(9):2795-2803.

24. Chang, Y., Wang, R., Barot, S., Weiss, D.S. Stoichiometry of a recombinant GABAa receptor. J. Neurosci., 1996, 16:5415-5424.

25. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem., 1987, 162:156-159.

26. Church, G.M., Gilbert, W. Genomic sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81:1991-1995.

27. Clark, M., Massenburg, G., Weiss, S., Post, R. Analysis of hippocampal GABAa receptors system in kindled rats by autoradiographic and in situ hybridization techniques: contingent tolerance to carbamazepine. Mol. Brain res., 1994, 26:309-319.

28. Coulter, D.A., Rafiq, A., Shumate, M., Gong, Q.Z., DeLorenzo, R.J., Lyeth, B.G. Brain injury-induced enhanced limbic epileptogenesis: anatomical and physiological parallels to an animal model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res., 1996, 26:81-91.

29. Coulter, D.A. Chronic epileptogenic cellular alterations in the limbic system following Status Epilepticus. Epilepsia, 1998, In Press.

30. Cronin, J., Obenaus, A., Houser, C.R., Dud.ek, F.E. Electrophysiology of dentate granule cells after kainate-induced synaptic reorganization of the mossy fibers. Brain Res., 1992, 573(2):305-310.

31. Cutting, G.R., Lu, L., O'Hara, B.F. et al. Cloning of the gamma-aminobutyric acid (GABA) rhol cDNA: a GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1991, 88:2673-2677.

32. Davies, P.A., Hanna, M.C., Hales, T.G., Kirkness, E.F. Insensitivity to anaesthetic agents conferred by a class of GABAa receptor subunit. Nature., 1997, 385:820-823.

33. DeLorey, T.M., Olsen, R.W. y-aminobutyric acidA receptor structure and function. J. Biol. Chem., 1992, 267:16747-16750.

34. Deng, L., Ransom, R.W., Olsen, R.W. 3H.Muscimol photolabels the y-aminobutyric acid receptor binding site on a peptide subunit distinct from that labeled with benzodiazepine. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1986, 138:1308-1314.

35. Donnelly, J.L., MacDonald, R.L. Loreclezole enhances apparent desensitization of recombinant GABAA receptor currents. Neuropharmacology., 1996, 35(9-10):1233-1241.

36. Draguhn, A., Verdorn, T.A., Ewert, M., Seeburg, P.H., Sakmann, B. Functional and molecular distinction between recombinant rat GABAA receptor subtypes by Zn2+. Neuron., 1990, 5(6):781-788.

37. Du, F., Eid, Т., Lothman, E.W., Kohler, CM Schwarcz, R. Preferential neuronal loss in layer 111 of the medial entorhinal cortex in rat models of temporal lobe epilepsy. J. Neurosci., 1995, 15:6301-6313.

38. Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. Analysis of gene expression in single live neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89:3010-3014.

39. Engel, J. Jr. Introduction to temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. , 1996, 26:141-150.

40. Esclapez, M., Hirsch, J.C., Khazipov, R., Ben-Ari, Y., Bernard, C. Operative GABAergic inhibition in hippocampal CA1 pyramidal neurons in experimental epilepsy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94(22): 121511 12156.

41. Faas, G.C., Vreugdenhil, M., Wadman, W.J. Calcium currents in pyramidal CA1 neurons in vitro after kindling epileptogenesis in the hippocampus of the rat. Neuroscience, 1996, 75(1 ):57-67.

42. Fisher, J.L., Macdonald, R.L. The role of an alpha subtype M2-M3 His in regulating inhibition of GABAA receptor current by zinc and other divalent cations. J. Neurosci., 1998, 18(8):2944-2953.

43. Franck, J.E., Kunkel, D.D., Baskin, D.G., Schwartzkroin, P.A. Inhibition in kainate-lesioned hyperexcitable hippocampi: physiologic, autoradiographic, and immunocytochemical observations. J. Neurosci. ., 1988, 8(6):1991-2002.

44. Franck, J.E., Pokorny, J., Kunkel, D.D., Schwartzkroin, P.A. Physiologic and morphologic characteristics of granule cell circuitry in human epileptic hippocampus. Epilepsia, 1995, 36(6):543-558.

45. Fraser, D.D., Duffy, S., Angelides, K.J., Perez-Velazquez, J.L., Kettenmann, H., MacVicar, B.A. GABAA/benzodiazepine receptors in acutely isolated hippocampal astrocytes. J. Neurosci., 1995, 15(4):2720-2732.

46. Fritschy, J.M., and Mohler, H. GABAa receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. J. Сотр. Neurol., 1995, 359:154-194.

47. Fritschy, J.M., Paysan, J., Enna, A., Mohler, H. Switch in the expression of rat GABAA-receptor subtypes during postnatal development: an immunohistochemical study. J. Neurosci., 1994, 14:5302-5324.

48. Fuchs, K., Adamiker, D., Sieghart, W. Identification of a2- and a3-subunits of the GABAA-benzodiazepine receptor complex purified from the brain of young rats. FEBS Lett., 1990, 261:52-54.

49. Gale, K. Subcortical structures and pathways involved in convulsive seizure generation. J. Clin. Neurophys., 1992, 9:264-277.

50. Garant, D.S., Xu, S.G., Sperber, E.F., Moshe, S.L. The influence of thalamic GABA transmission on the susceptibility of adult rats to flurothyl induced seizures. Epilepsy Res., 1993, 15:185-192.

51. Gibbs, J.W. Ill, Shumate, M.D., Coulter, D.A. Differential epilepsy-associated alterations in postsynaptic GABAa receptor function in dentate granule and CA1 neurons. J. Neurophysiol., 1997, 77:1924-1938.

52. Gibbs ,J.W. 3rd, Zhang, Y.F., Kao, C.Q., Holloway, K.L., Oh, K.S., Coulter, D.A. Characterization of GABAA receptor function in human temporal cortical neurons. J. Neurophysiol., 1996, 75{4):1458-1471.

53. Glatt, K., Glatt, H., Lalande, M. Structure and organization of GABRB3 and GABRA5. Genomics, 1997, 41(1 ):63-69.

54. Grigorenko, E.V., Yeh, H.H. Expression profiling of GABAA receptor beta-subunits in the rat retina. Vis. Neurosci., 1994, 11(2):379-387.

55. Halonen, Т., Tortorella, A., Zrebeet, H., Gale, K. Posterior piriform and perirhinal cortex relay seizures evoked from the area tempestas: role of excitatory and inhibitory amino acid receptors. Brain Res., 1994, 652:145148.

56. Haug, M.S. Heavy metals in the brain. Berlin: Springer-Verlag, 1973.

57. Hedblom, E., Kirkness, E.F. A novel class of GABAa receptor subunit in tissues of the reproductive system. J. Biol. Chem., 1997, 272:15346-5350.

58. Heinemann, U., Beck, H., Dreier, J.P., Ficker, E., Stabel, J., Zhang, C.L. The dentate gyrus as a regulated gate for the propagation of epilepti form activity. Epilepsy Res. Suppl., 1992, 7:273-280.

59. Houser, C.R. Granule cell dispersion in the dentate gyrus of humans with temporal lobe epilepsy. Brain Res., 1990, 535:195-204.

60. Houser, C.R., Miyashiro, J.E., Swartz, B.E., Walsh, G.O., Rich, J.R., Delgado-Escueta, A.V. Altered patterns of dynorphin immunoreactivity suggest mossy fiber reorganization in human hippocampal epilepsy. J. Neurosci., 1990, 10(1):267-282.

61. Houser, C.R. Morphological changes in the dentate gyrus in human temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. Suppl., 1992, 7:223-234.

62. Houser, C.R., Esclapez, M., Fritschy, J.M., Mohler, H. Decreased expression of the a5 subunit of the GABAa receptor in a model of temporal lobe epilepsy. Society for Neuroscience, 1995, 21:1475.

63. Houser, C.R., and Esclapez, M. Vulnerability and plasticity of the GABA system in the pilocarpine model of spontaneous recurrent seizures. Epilepsy Res., 1996, 26:207-218.

64. Howell, G.A., Welch, M.G., Frederickson, C.J. Stimulation-induced uptake and release of zinc in hippocampal slices. Nature, 1984, 308(5961 ):736-738.

65. Huh, K.h., DeLorey, T.M., Endo, S., Olsen, R.W. Characterization of structural and functional subtypes of GABAa receptors with antibodies to the P3 subunit. Soc. Neurosci. Abst., 1992, 18:263.

66. Isokawa-Akesson, M., Wilson, C.L., Babb, T.L. Inhibition in synchronously firing human hippocampal neurons. Epilepsy Res., 1989, 3(3):236-247.

67. Johnston, G.A.R. Multiplicity of GABA receptors. In: Benzodiazepines/GABA receptors and chloridechannels: structural and functional properties: isoguvacine, ed. R.W. Olsen, J.C. Venter, pp.57-71. New York: Alan R. Liss, 1986.

68. Kamphuis, W., De Rijk, T.C., Lopes da Silva, F.H. Expression of GABAa receptor subunit mRNAs in hippocampal pyramidal and granular neurons in the kindling model of epileptogenesis: an in situ hybridization study. Mol. Brain Res., 1995, 31:33-47.

69. Kato, K. Novel GABAa receptor a subunit is expressed only in cerebellar granule cells. J. Mol. Biol., 1990, 214:619-624.

70. Kelly, M.E., and Mclntyre, D.C. Perirhinal cortex involvement in limbic kindled seizures. Epilepsy Res., 1996, 26:233-243.

71. King, R.G., Nielsen, M., Stauber, G.B., Olsen, R.W. Convulsant/barbiturate activities on the soluble GABA/benzodiazepine receptor complex. Eur. J. Biochem., 1987, 169:555-562.

72. Knoflach, F., Rhyner, Т., Vilia, M. et al. The уЗ-subunit of the GABAa-receptor confers sensitivity to benzodiazepine receptor ligands. FEBS Lett., 1991, 293:191-194.

73. Kofuji, P., Wang, J.В., Moss, S.J. et al. Generation of two forms of the y-aminobutyric acidA receptor y2-subunit in mice by alternative splicing. J. Neurochem., 1991, 56:713-715.

74. Kohr, G., and Mody, I. Endogenous intracellular calcium buffering and the activation/inactivation of HVA calcium currents in rat dentate gyrus granule cells. J. Gen. Physiol., 1991, 98(5):941-967.

75. Kohr, G., and Mody, I. Kindling increases N-methyl-D-aspartate potency at single N-methyl-D-aspartate channels in dentate gyrus granule cells. Neuroscience, 1994, 62(4):975-981.

76. Korpi, E.R., Kleingoor, CM Kettenmann, H., Seeburg, P.H. Benzodiazepine-induced motor impairment linked to point mutation in cerebellar GABAA receptor. Nature, 1993, 361(6410):356-359.

77. Kraus, J.E., Yeh, G.C., Bonhaus, D.W., Nadler, J.V., McNamara, J.O. Kindling induces the long-lasting expression of. a novel population of NMDA receptors in hippocampal region CA3. J. Neurosci., 1994, 14(7):4196-4205.

78. Laurie, D.J., Seeburg, P.H., Wisden, W. The distribution of 13 GABAa receptor subunit mRNAs in the rat brain. II. Olfactory bulb and cerebellum. J. Neurosci., 1992, 12:1063-1076.

79. Laurie, D.J., Wisden, W., Seeburg, P.H. • The distribution of thirteen GABAa receptor subunit mRNAs in the rat brain. III. Embryonic and postnatal development. J. Neurosci., 1992, 12:4151-4172.

80. Levitan, E.S., Blair, L.A.C., Dionne, V.E., Barnard, E.A. Biophysical and pharmacological properties of cloned GABAa receptor subunits expressed in Xenopus oocytes. Neuron, 1988, 1:773-781.

81. Liu, Z., Nagao, Т., Desjardins, G.C., Gloor, P., Avoli, M. Quantitative evaluation of neuronal loss in the dorsal hippocampus in rats with long-term pilocarpine seizures. Epilepsy Res., 1994, 17:237-247.

82. Longo, B.M., Mello, L.E. Blockade of pilocarpine- or kainate-induced mossy fiber sprouting by cycloheximide does not prevent subsequent epileptogenesis in rats. Neurosci. Lett., 1997, 226(3): 163-166.

83. Lothman, E.W., Bertram, E.H., Stringer, J.L. Functional anatomy of hippocampal seizures. Prog. Neurobiol., 1991, 37:1-82.

84. Luddens, H., Korpi, E.R., Seeburg, P.H. GABAA/benzodiazepine receptor heterogeneity: neurophysiological implications. Neuropharmacology, 1995, 34:245-254.

85. Luddens, H., Pritchett, D.B., Kohler, M. et al. Cerebellar GABAA receptor selective for a behaviorial alcohol antagonist. Nature, 1990, 346:648-651.

86. Macdonald, R.L., and Olsen, R.W. GABAa receptor channels. Annu. Rev. Neurosci., 1994, 17:569-602.

87. Macdonald, R.L., Twyman, R.E. Kinetic properties and regulation of GABAa receptor channels. In: Ion channels, ed. T. Narahashi, 4:315-343. New York: Plenum, 1992.

88. Mangan, P.S., Rempe, D.A., Lothman, E.W. Changes in inhibitory neurotransmission in the CA1 region and dentate gyrus in a chronic model of temporal lobe epilepsy. J. Neurophysiol., 1995, 74(2):829-40.

89. McKernan, R.M., and Whiting, P.J. Which gabaa-receptor subtypes really occur in the brain? Trends Neurosci., 1996, 19:139-143.

90. Meier, C.L., Dudek, F.E. Spontaneous and stimulation-induced synchronized burst afterdischarges in the isolated CA1 of kainate-treated rats. J. Neurophysiol., 1996, 76(4):2231-2239.

91. Meldrum, B.S. GABAergic mechanisms in the pathogenesis and treatment of epilepsy. Br. J. Clin. Pharmacol., 1989, 27 Suppl. 1:3S-11S.

92. Mello, L.E.A.M., Cavalheiro, E.A., Tan, A.M., Kupfer, W.R., Pretorius, J.K., Babb, T.L., Finch, D.M. Circuit mechanisms of seizures in thepilocarpine model of chronic epilepsy: cell loss and mossy fiber sprouting. Epilepsia, 1993, 34:985-995.

93. Mody, I. Ion channels in epilepsy. Int. Rev. Neurobiol., 1998, 42:199226.

94. Mody, I., Heinemann, U. NMDA receptors of dentate gyrus granule cells participate in synaptic transmission following kindling. Nature, 1987, 326(6114):701-704.

95. Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T.S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci., 1994, 17(12):517-525.

96. Mohler, H., Battersby, M.K., Richards, J.G. Benzodiazepine receptor protein identified and visualized in brain tissue by a photoaffinity label. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77:1666-1670.

97. Mohler, H., Knoflach, F., Paysan, J., Motejlek, K., Benke, D., Luscher, В., Fritschy, J.M. Heterogeneity of GABAA-receptors: cell-specific expression, pharmacology, and regulation. Neurochem. Res,, 1995, 20:631-636.

98. Mohler, H., and Okada, T. Benzodiazepine receptors: demonstration in the central nervous system. Science, 1977, 198:849-851.

99. Moshe, S.L., Garant, D.S., Sperber E.F., Veliskova, J., Kubova, H., Brown, L.L. Ontogeny and topography of seizure regulation by the substantia nigra. Brain Dev., 1995, 17 Suppl., 61-72.

100. Nadler, J.V., Perry, B.W., Cotman, C.W. Intraventricular kainic acid preferentially destroys hippocampal pyramidal cells. Nature, 1978, 271 (5646): 676-677.

101. Nadler, J.V., Thompson, M.A., McNamara, J.O. Kindling reduces sensitivity of CA3 hippocampal pyramidal cells to competitive NMDA receptor antagonists. Neuropharmacology, 1994, 33(2):147-153.

102. Nusser, Z., Sieghart, W., Somogyi, P. Segregation of different GABAA receptors to synaptic and extrasynaptic membranes of cerebellar granule cells. J. Neurosci., 1998, 18(5):1693-1703.

103. Obenaus, A., Esclapez, M., Houser, C.R. Loss of glutamate decarboxylase mRNA-containing neurons in the rat dentate gyrus following pilocarpine-induced seizures. J. Neurosci., 1993, 13:4470-4485.

104. Ogurusu, T. and Shingai, R. Cloning of a putative gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor subunit rho 3 cDNA. Biochim. Biophys. Acta, 1996, 1305:15-18.

105. Oh, K.S., Lee, C.J., Gibbs, J.W., Coulter, D.A. Postnatal development of GABAA receptor function in somatosensory thalamus and cortex: whole-cell voltage-clamp recordings in acutely isolated rat neurons. J. Neurosci., 1995, 15(2):1341-1351.

106. Okazaki, M.M., Evenson, D.A., Nadler, J.V. Hippocampal mossy fiber sprouting and synapse formation after status epilepticus in rats: visualization after retrograde transport of biocytin. J. Сотр. Neurol., 1995, 352(4):515-534.

107. Oliver, M.W., Miller, J.J. Alterations of inhibitory processes in the dentate gyrus following kindling-induced epilepsy. Exp. Brain Res., 1985, 57(3):443-447.

108. Olsen, R.W. GABA-benzodiazepine-barbiturate receptor interactions. J. Neurochem., 1981, 37:1-13.

109. Olsen, R.W. The y-aminobutyric acid/benzodiazepine/barbiturate receptor chloride ion channel complex of mammalian brain. In: Synaptic function, ed. G.M. Edelman, W.A. Gall, W.M. Cowan, pp.257-271. Neuroscience Research Foundation/Wiley, 1987.

110. Olsen, R.W., Yang, J., King, R.G., et al. Barbiturate and benzodiazepine modulation of GABA receptor binding and function. Life Sci., 1986, 39:19691976.

111. Olsen, R.W., and Tobin, A.J. Molecular Biology of GABAa receptors. The FASEB J., 1990, 4:1469-1480.

112. Olsen, R., and Avoli, M. GABA and epileptogenesis. Epilepsia, 1997, 38:399-407.

113. Park, D., and deBlas, A.L. Peptide subunits of y-aminobutyric acidA/benzodiazepine receptors from bovine cerebral cortex. J. Neurochem., 1991, 56:1972-1979.

114. Poulter, M.O., Barker, J.L., O'Carrol, A.M., Lolait, S.J., Mahan, L.C. Differential and transient expression of GABAa receptor a-subunit mRNAs in the developing rat CNS. J. Neurosci., 1992, 12:2888-2900.

115. Prince, D.A. Physiological mechanisms of focal epileptogenesis. Epilepsia, 1985, 26 Suppl. 1:S3-14.

116. Pritchett, D.B., Luddens, H., Seeburg, P.H. Type I and type II GABAA-benzodiazepine receptors produced in transfected cells. Science, 1989, 245(4924): 1389-1392.

117. Pritchett, D.B., and Seeburg, P.H. Gamma-aminobutyric acidA receptor a5-subunit creates novel type II benzodiazepine receptor pharmacology. J. Neurochem., 1990, 54:1802-1804.

118. Pritchett, D.B., Seeburg, P.H. gamma-Aminobutyric acid type A receptor point mutation increases the affinity of compounds for the benzodiazepine site. Proc .Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88(4):1421-1425.

119. Pritchett, D.B., Sontheimer, H., Shivers, B.D. et al. Importance of a novel GABAa receptor subunit for benzodiazepine pharmacology. Nature, 1989, 338: 582-585.

120. Puia, G., Vicini, S., Seeburg, P.H., Costa, E. Influence of recombinant gamma-aminobutyric acid-A receptor subunit composition on the action of allosteric modulators of gamma-aminobutyric acid-gated CI- currents.

121. Mol. Pharmacol., 1991, 39(6):691-696.

122. Racine, R.J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seuzure. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol., 1972, 32:281-294.

123. Ribak, C.E., Bradurne, R.M., Harris, A.B. A preferential loss of GABAergic, symmetric synapses in epileptic foci: a quantitative ultrastructural analysis of monkey neocortex. J. Neurosci., 1982, 2(12):1725-1735.

124. Russek, S.J., and Farb, D.H. Mapping of the beta 2 subunit gene (GABRB2) to microdissected human chromosome 5q34-q35 defines a gene cluster for the most abundant GABAA receptor isoform. Genomics, 1994, 23(3):528-533.

125. Rutecki, P.A. and Yang, Y. Ictal Epileptiform activity in the CA3 region of hippocampal slices produced by pilocarpine. J. Neurophys., 1998, 79:30193029.

126. Sakmann, В., Hamill, O.P., Bormann, J. Patch-clamp measurements of elementary chloride currents activated by putative inhibitory transmitters GABA and glycine in mammalian spinal neurons. J. Neural Transmission Suppl., 1983, 18:83-95.

127. Saxena, N.C., and Macdonald, R.L. Assembly of GABAA receptor subunits: role of the delta subunit. J. Neurosci., 1994, 14(11 Pt 2):7077-7086.

128. Saxena, N.C., and Macdonald, R.L. Properties of putative cerebellar gamma-aminobutyric acid A receptor isoforms. Mol. Pharmacol., 1996, 49(3):567-579.

129. Schofield, P.R., Darlison, M.G., Fujita, N. et al. Sequence and functional expression of the GABA-A receptor shows a ligand-gated receptor superfamily. Nature, 1987,328:221-227.

130. Schwarzer, C., and Sperk, G. Hippocampal granule cells express glutamic acid decarboxylase-67 after limbic seizures in the rat. Neuroscience, 1995, 69(3):705-709.

131. Schwarzer, C., Tsunashima, K., Wanzenbock, C., Fuchs, K., Sieghart, W., Sperk, G. GABAa receptor subunits in the rat hippocampus II: altered distribution in kainic acid-induced temporal lobe epilepsy. Neuroscience, 1997, 80:1001-1017.

132. Shivers, B.D., Killisch, I., Sprengel, S.R. Two novel GABAa receptor subunits exist in distinct neuronal subpopulations. Neuron, 1989, 3:327-337.

133. Shumate, M.D., Lin, D.D., Rikhter, T.Y., Gibbs, J.W. Ill, Coulter, D.A. Dentate granule cell GABAa receptors in epileptic animals revert to earlier developmental stages. Epilepsia Suppl., 1997, V38 (S8) S9.

134. Shumate, M.D., Lin, D.D., Gibbs, J.W. Ill, Holloway, K.L., Coulter, D.A., GABAa receptor function in epileptic human dentate granule cells: comparison to epileptic and control rat. Epilepsy Res., 1998, 32:114-128.

135. Shumate, M.D., Rikhter, T.Y., Lin, D.D., Gibbs III, J.W., Coulter D.A., Epilepsy-associated alterations in dentate granule cell GABAa receptors precede the onset of spontaneous seizures. Epilepsia, 1998, 39 (S6) S61.

136. Sieghart, W. Structure and pharmacology of gamma-aminobutyric acidA receptor subtypes. Pharmacol. Rev., 1995, 47(2):.181-234.

137. Sieghart, W., and Drexler, G. Irreversible binding of 3H.flunitrazepam to different proteins in various brain regions. J. Neurochem., 1983, 41:47-55.

138. Sigel, E., and Barnard, E.A. A y-aminobutyric acid/benzodiazepine receptor complex from bovine cerebral cortex. Improved purification with preservation of regulatory sites and their interactions. J. Biol. Chem., 1984, 259:7219-7223.

139. Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Mohler, H., Malherbe, P. The effect of subunit composition of rat brain GABAA receptors on channel function. Neuron, 1990, 5(5):703-711.

140. Sigel, E., Baur, R., Kellenberger, S., Malherbe, P. Point mutations affecting antagonist affinity and agonist dependent gating of GABAA receptor channels. EMBO J., 1992, 11(6):2017-2023.

141. Sigel, E., Stephenson, F.A., Mamalaki, C., Barnard, E.A. A y-aminobutyric acid/benzodiazepine receptor complex of bovine cerebral cortex:

142. Purification and partial characterization. J. Biol. Chem., 1983, 258: 69656971.

143. Sloviter, R.S. "Epileptic" brain damage in rats induced by sustained electrical stimulation of the perforant path. I. Acute electrophysiological and light microscopic studies. Brain Res. Bull., 1983, 10(5):675-97.

144. Sloviter, R.S. Decreased hippocampal inhibition and a selective loss of interneurons in experimental epilepsy. Science, 1987, 235(4784):73-76.

145. Sloviter, R.S. Possible functional consequences of synaptic reorganization in the dentate gyrus of kainate-treated rats. Neurosci. Lett., 1992, 137(1 ):91-96.

146. Sloviter, R.S. The functional organization of the hippocampal dentate gyrus and its relevance to the pathogenesis of temporal lobe epilepsy. Annals of Neurology, 1994, 35:640-654.

147. Sloviter, R.S. Hippocampal pathology and pathophysiology in temporal lobe epilepsy. Neurologia, 1996, 11 Suppl. 4:29-32.

148. Soltesz, I., Smetters, D.K., Mody, I. Tonic inhibition originates from synapses close to the soma. Neuron, 1995, 14(6):1273-1283.

149. Sommer, В., Poustka, A., Spurr, N.K., Seeburg, P.H. The murine GABAA receptor delta-subunit gene: structure and assignment to human chromosome 1. DNA Cell Biol., 1990, 9(8):561-568.

150. Squires, R.F., and Braestrup,. Benzodiazepine receptors in rat brain. Nature, 1977,266:732-734.

151. Squires, R.F., Casida, J.E., Richardson, M., Saederup, E. 35S.t-Butyl bicyclophosphorothionate binds with high affinity to brain-specific sites coupled to y-aminobutyric acid-A and ion recognition sites. Mol. Pharmacol., 1983, 23:326-336.

152. Sperk, G., Schwarzer, C., Tsunashima,. k., Fuchs, K., Sieghart, W. GABAa receptor subunits in the rat hippocampus I: Immunohistochemical distribution of 13 subunits. Neuroscience, 1997, 80:987-1000.

153. Stauber, G.B., Ransom, R.W., Dilber, A.I., Olsen, R.W. The y-aminobutyric acid-benzodiazepine receptor protein from rat brain: large-scale purification and preparation of antibodies. Eur. J. Biochem., 1987, 167:125133.

154. Sutula, Т., Cascino, G., Cavazos, J., Parada, I., Ramirez, L. Mossy fiber synaptic reorganization in the epileptic human temporal lobe. Ann. Neurol., 1989, 26:321-330.

155. Tasker, J. and Dudek, F. Electrophysiology of GABA-mediated synaptic transmission and possible roles in epilepsy. Neurochem. Res., 1991, 16:251262.

156. Tauck, D.L., and Nadler, J.V. Evidence of functional mossy fiber sprouting in hippocampal formation of kainic acid-treated rats. J. Neurosci., 1985, 5:1016-1022.

157. Tia, S., Wang, J.F., Kotchabhakdi, N., Vicini, S. Developmental changes of inhibitory synaptic currents in cerebellar granule neurons: role of GABA(A) receptor alpha 6 subunit. J. Neurosci., 1996, 16(11):3630-3640.

158. Ticku, M.K. Drug modulation of GABAA-mediated transmission. Semin. Neurosci., 1991, 3:211-218.

159. Ticku, M.K., Ban, M., Olsen, R.W. Binding of 3H.a-dihydropicrotoxinin, а С synaptic antagonist, to rat membranes. Mol. Pharmacol., 1978, 14:391402.

160. Titulaer, M.N., Ghijsen, W.E., Kamphuis, W., De Rijk, T.C., Lopes da Silva, F.H. Opposite changes in GABAA receptor function in the CA1-3 area and fascia dentata of kindled rat hippocampus. J. Neurochem., 1995, 64(6):2615-2621.

161. Tonder, N., Kragh, J., Finsen, B.R., Bolwig, T.G., Zimmer, J. Kindling induces transient changes in neuronal expression of somatostatin, neuropeptide Y, and calbindin in adult rat hippocampus and fascia dentata. Epilepsia, 1994, 35(6):1299-1308.

162. Tretter, V., Ehya, N., Fuchs, K., Sieghart, W. Stoichiometry and assembly of a recombinant GABAa receptor subtype. J. Neurosci., 1997, 17:2728-2737.

163. Tsunashima, K., Schwarzer, C., Kirchmair, E., Sieghart, W., Sperk, G. GABAa receptor subunits in the rat hippocampus III: altered messenger RNA expression in kainic acid-induced epilepsy. Neuroscience, 1997, 80:10191032.

164. Turski, W.A., Cavalheiro, E.A., Schwarz, M., Czuczwar, S.J., Kleinrok, Z., Turski, L. Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study. Behavioural Brain Res., 1983, 9:315-335.

165. Turski, L., Ikonomidou, C., Turski, W.A., Bortolotto, Z.A., Cavalheiro, E.A. Review: cholinergic mechanisms and epileptogenesis. The seizures induced by pilocarpine: a novel experimental model of intractable epilepsy. Synapse, 1989,3:154-171.

166. Twyman, R.E., Macdonald, R.L. Antiepileptic drug regulation of GABAa receptor channels. In: GABA mechanisms in epilepsy, ed. G. Tunnicliff, BU Raess, Chapter 4, pp.89-104. New York: Wiley Liss, 1991.

167. Tyndale, R.F., Hales, T.G., Olsen, R.W., Tobin, A.J. Distinctive patterns of GABAA receptor subunit mRNAs in 13 cell lines. J. Neurosc., 1994, 14(9):5417-5428.

168. Vreugdenhil, M., Wadman, W.J. Kindling-induced long-lasting enhancement of calcium current in hippocampal CA1 area of the rat: relation to calcium-dependent inactivation. Neuroscience, 1994, 59(1):105-114.

169. White, G., and Gurley, D.A. a subunits influence Zn block of y2 containing GABAa receptor currents. Neuroreport, 1995, 6:461-464.

170. White, H.S., Wolf, H.H., Woodhead, J.H., Kupferberg, H.J. The National Institutes of Health Anticonvulsant Drug Development Program: screening for efficacy. Adv. Neurol., 1998, 76:29-39.

171. Whiting, P.J., Herb, A., Wieland, A. et al. Cloning, pharmacological characteristics and expression pattern of the rat GABAa receptor a4 subunit. FEBS Lett., 1991, 289:227-230.

172. Wieland, H.A., Luddens, H., Seeburg, P.H. A single histidine in GABAA receptors is essential for benzodiazepine agonist binding. J. Biol. Chem., 1992, 267(3):1426-1429.

173. Williamson, C.L., Engel, J. Jr. Electrical stimulation of the human epileptic limbic cortex. In: O. Devinsky, A. Bekic, M. Dogali, Eds, Electrical and Magnetic Stimulation of the Brain and Spinal Cord, Raven Press, New York, 1993, pp. 103-113.

174. Wisden, W., Herb, A., Wieland, H. et al. Cloning, pharmacological characteristics and expression pattern of the rat GABAa receptor a4 subunit. FEBS Lett., 1991, 289:227-230.

175. Wisden, W., Korpi, E.R., Bahn, S. The cerebellum: a model system for studying GABAA receptor diversity. Neuropharmacology, 1996, 35(9-10):1139-1160.

176. Wisden, W., Laurie, D.J., Monyer, H., Seeburg, P.H. The distribution of 13 GABAa receptor subunit mRNAs in the rat brain. I. Telencephalon, diencephalon, mesencephalon. J. Neurosci., 1992, 12:1040-1062.

177. Wolf, H.K., Spanle, M., Muller, M.B., Elger, C.E., Shramm, J., Wiestler, O.D. Hippocampal loss of the GABAa receptor a1 subunit in patients with chronic pharmacoresistant epilepsies. Acta Neuropathol., 1994, 88:313-319.

178. Wooltorton, J.R., McDonald, B.J., Moss, S.J., Smart, T.G. Identification of a Zn2+ binding site on the murine GABAA receptor complex: dependence on the second transmembrane domain of beta subunits. J. Physiol. (Lond), 1997, 505 ( Pt 3):633-640.

179. Wuarin, J.P., and Dudek, F.E. Electrographic seizures and new recurrent excitatory circuits in the dentate gyrus of hippocampal slices from kainate-treated epileptic rats. J. Neurosci., 1996, 16(14):4438-4448.

180. Ymer, S., Draguhn, W., Wisden, P. et al. Structural and functional characterization of the y1 subunit of GABAa benzodiazepine receptors. EMBO J., 1990, 9:3261-3267.

181. Ymer, S., Schofield, P.R., Draghun, A., Werner, P., Kohler, M., Seeburg, P.H. GABAa receptor beta subunit heterogeneity: functional expression of cloned cDNAs. EMBO J., 1989, 8:1665-1670.

182. Zhang, Y.-F., Coulter, D.A. Epilepsy-associated enhanced zinc sensitivity of dentate granule cell mlPSCs: potential role of endogenously released zinc. Soc. Neurosci. Abstr., 1997, 23:2426.

183. ЮССКт»»,? ГОСУДА^-. : >:»uiJlf,-/-OfI