Обоснование выбора оптимальных рас дрожжей для плодово-ягодного виноделия на основе их морфологических и физиологических характеристик

Жолудева, Мария Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Обоснование выбора оптимальных рас дрожжей для плодово-ягодного виноделия на основе их морфологических и физиологических характеристик
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Обоснование выбора оптимальных рас дрожжей для плодово-ягодного виноделия на основе их морфологических и физиологических характеристик"

На правах рукописи

ЖОЛУДЕВА МАРИЯ ВАЛЕРЬЕВНА

ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА ОПТИМАЛЬНЫХ РАС ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ ПЛОДОВО-ЯГОДНОГО ВИНОДЕЛИЯ НА ОСНОВЕ ИХ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК.

Специальность 03.00.04. - Биохимия Специальность 03.00.07. - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» Московского Государственного Университета пищевых производств (МГУПП) и в лаборатории ЗАО «Лейтран»

доктор биологических наук, профессор Грачева Ирина Михайловна

кандидат технических наук, доцент Мартыненко Николай Николаевич

доктор биологических наук, профессор Тихомирова Александра Стефановна

доктор биологических наук, профессор Чернов Иван Юрьевич

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский

институт пищевой биотехнологии РАСХН

Защита состоится: « » 2004 г. в часов

в ауд. 302 корпуса «А» на заседании Диссертационного Совета К 212.148.01 Московского Государственного Университета пищевых производств по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11.

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке МГУПП.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения просим направлять по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д.11, МГУПП, ученому секретарю Диссертационного Совета К 212.148.01

Автореферат разослан

Ученый секретарь

Диссертационного Совета, к.б.н., доц.

Генералова Т.Г.

Общая характеристика работы. Актуальность темы. По данным Департамента пищевой и перерабатывающей промышленности Минсельхозпрода РФ, объемы производства винодельческой продукции в Российской Федерации за последние годы колеблются, что связано с резким ухудшением материально-сырьевой базой всей виноградовинодельческой отрасли России. В результате политики. 80-х относительно производства и потребления алкоголя и последующих, не всегда удачных, экономических преобразований винодельческие предприятия страны в последние 10 лет оказались практически. без сырья. Поскольку с распадом СССР к России отошли лишь некоторые винодельческие регионы, площади виноградных насаждений по всей стране сократились на 65-70%.

Большинство винодельческих предприятий России находятся в критическом положении, связанном с нехваткой виноградного сырья и виноматериалов. Заводы вторичного виноделия России, ранее использовавшие для производства вин сырье, закупаемое в республиках бывшего СССР, в настоящее время обеспечены виноматериалами не более, чем на 15-20% из-за значительного сокращения площадей под виноградом.

Мощности винодельческих предприятий загружены лишь на 15-20% и значительная часть сырья поступает за счет импорта из зарубежья. На сегодняшний день доля виноградного вина, произведенного из отечественного винограда, не превышает 30-40%. Взамен качественных виноградных вин предприятия предпочитают выпускать более выгодные винные напитки [Ханунов Э.Р., 1999; Оганесянц Л А 2001; Смирнов К.В., 2002].

В тоже время РФ обладает надежной сырьевой базой для развития промышленного производства высококачественных плодовых и ягодных вин [Панасюк А.Л., 1992а].

Исследования последних лет подтвердили, что плодово-ягодные вина по своему лечебному действию не уступают лучшим красным виноградным винам благодаря высокому содержанию биологически активных веществ (витаминов, флавоноидов) [Меньшов В .А. и др., 1998; п^ш^п et.al., 1998; ^пшп к et.al., 2000]. Поэтому их потребление и производство во всем мире растет с каждым годом [Bradstock N.. 2003].

Особенностью сырьевой базы плодово-ягодного виноделия является то, что климатические и почвенные, условия- России позволяют выращивать самые разнообразные виды плодов и ягод. Главные районы выращивания плодовых культур - Северный Кавказ и Центрально-Черноземный район, где сконцентрировано более 60% площадей и валового производства плодов и ягод. Существенную роль играют также хозяйства некоторых областей Центрального и Поволжского районов. В этих четырех районах получают около 90% урожая, поступающего на переработку [Панасюк А.Л., 1992а].

яблочные вина «Предгорное» и «Яблоневый шяэдэ^ШМЗДЗДМММальные яблочные

I БИБЛИОТЕКА |

! ¿г^щ

вина с хересными тонами марки «Янтарное», наряду с внедрением новых технологических приемов, были созданы именно благодаря применению новейших рас дрожжей [Мехузла НА. и др., 1984; Панасюк А.Л., 1991].

Сейчас для производства плодово-ягодных вин в России и в других странах СНГ используется довольно ограниченный перечень рас дрожжей [Деменков А.П. и др., 1998], выделенных еще в конце 30-х годов и уже не отвечающих тем требованиям, которые предъявляют к ним современные технологии - скорость и полнота брожения, органолептические свойства и т.д.

Однако, в последние 20-30 лет поиск новых рас для плодово-ягодного виноделия практически не проводился, а за рубежом, за редким исключением (Польша, Германия), совершенно отсутствуют специализированные расы дрожжей для плодово-ягодного виноделия.

Поэтому, в настоящее время назрела необходимость поиска новых рас дрожжей для производства яблочных и ягодных вин. В этой связи особого внимания заслуживает работа, которая совсем недавно была проведена в этом направлении в Беларуси, где из различных ягод было выделено свыше 500 штаммов дрожжей рода 8асскаготусг$, для сбраживания плодово-ягодных соков [Колесник И.М. и др., 2004].

Производство плодово-ягодных вин должно стать одним из приоритетных направлений отечественного виноделия и все исследования в данной области являются важными и актуальными.

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы состоит в изучении физиолого-биохимических, молекулярных и технологических свойств 32 штаммов дрожжей рода 8асскаготусг$ различного происхождения с позиции их использования в отраслях бродильных производств (первичном и вторичном виноградном и плодово-ягодном виноделии, шампанском и спиртовом производстве, пивоварении и хлебопечении) и селекции новых наиболее перспективных рас для плодово-ягодного виноделия. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) Определение и описание морфологических и физиолого-биохимических характеристик дрожжевых штаммов, выделенных из ягодного и плодового сырья.

2) Определение видовой принадлежности исследуемых штаммов дрожжей на основе стандартных физиологических тестов (сбраживание Сахаров, ассимиляция).

3) Изучение термостабильности дрожжей с позиции их дальнейшего использования для получения препаратов активных сухих винных дрожжей (АСВД).

4) Видовая идентификация штаммов современными молекулярно-биологическими методами анализа генома (ПЦР-анализ и молекулярное кариотипирование) и установление генетического родства изучаемых штаммов дрожжей.

5) Проведение лабораторных испытаний по изучению динамики сбраживания плодово-ягодных субстратов новыми штаммами для плодово-ягодного виноделия.

6) Определение основных физико-химических характеристик получаемых виноматериалов.

7) Характеристика суммы метаболитов при анаэробном способе жизни дрожжей.

8) Отбор плодово-ягодных штаммов, отличающихся наибольшей скоростью и глубиной сбраживания субстрата и дающих наибольший процент выхода спирта с единицы сахара и наиболее разнообразную композицию ароматических соединений.

9) Проведение сравнительных производственных испытаний отобранных штаммов для плодово-ягодного виноделия.

Научная новизна:

1) Изучены морфологические и физиолого-биохимические характеристики изучаемых штаммов дрожжей. На основании стандартных физиологических тестов установлено, что все изучаемые дрожжевые штаммы принадлежат к одному биологическому виду 8асскаготусг$ сггехгъгае, хотя и отличаются между собой по ряду признаков, обозначенных в определителе как вариабельные.

2) Определены максимальные температуры роста дрожжевых штаммов и выяснено, что наиболее термостабильными являются плодово-ягодные культуры, что позволяет рекомендовать их к дальнейшему исследованию по получению препаратов АСВД.

4) Проведена дифференциация штаммов современными молекулярно-биологическими методами анализа генома с применением техники ПЦР-анализа, молекулярного кариотипирования и Саузерн-гибридизации. Показано, что пять культур, идентифицированных по физиологическим тестам как 5. сегехгъгаг, являются межвидовыми гибридами сегехгъгагх 5. иуагит.

5) Определена динамика сбраживания плодово-ягодных субстратов новыми штаммами, выделенными с плодов и ягод культур Западного региона Беларуси.

6) В полученных плодовых виноматериалах определены основные физико-химические показатели и установлено, что все виноматериалы, полученные с применением новых плодово-ягодных культур, соответствуют требованиям ГОСТ 51146-98 «Виноматериалы плодовые сброженные и сброженно-спиртованные. Технические условия». В виноматериалах проанализированы основные ароматические компоненты.

7) Отобраны штаммы, которые показали наибольшую скорость и глубину сбраживания субстратов при наибольшем выходе спирта с единицы сахара.

Практическая значимость работы:

1) В результате проведенных исследований изучены новые штаммы дрожжей для плодово-ягодного виноделия, их морфология, физиология, определена видовая принадлежность культур.

2) Освоен и предложен новый подход к идентификации дрожжевых культур, основанный на совмещении стандартных физиологических методов (первичная идентификация) и молекулярных методов анализа генома исследуемых культур.

3) Среди культур, идентифицированных ранее как 5. cerevisiae, обнаружены межвидовые гибриды 5. cerevisiaexиуатт.

4) На основании изучения динамики сбраживания плодово-ягодных субстратов, определения показателей выхода этанола с единицы сахара и других химико-аналитических показателей полученных виноматериалов отобраны 5 наиболее перспективных плодово-ягодных культур.

5) Проведено депонирование пяти отобранных плодово-ягодных штаммов во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). Штаммам присвоены следующие коллекционные номера: ДЧК-1 - ВКПМ Y-3096, ГМ-8 -ВКПМ Y-3097, ГВ-4 - ВКПМ Y-3098, ВЧР-3 - ВКПМ Y-3099, ГСЧ-1 - ВКПМ Y-3100.

6) Подана заявка на получение патента на штамм сегеъ1$1ае ВКПМ Y-3097 для производства вин из ягод малины.

7) Проведены заводские испытания плодово-ягодных культур дрожжей в филиале «Винзавода «Ключ жизни» ОАО «Бахус» г. Елец Липецкой области. Испытания показали, что исследуемые дрожжевые штаммы обеспечивают получение виноматериалов с более благоприятными органолептическими свойствами по сравнению с контролем. Виноматериалы отличались более насыщенным цветом, ярко выраженным сортовым ароматом и обладали гармоничным и мягким вкусом. Расы отличаются высокими технологическими показателями, позволяют интенсифицировать процесс брожения, обеспечивая получение высококачественных виноматериалов.

Расы рекомендованы для использования на предприятиях плодового виноделия. Результаты испытания подтверждены Актом из филиала «Винзавода «Ключ жизни» ОАО «Бахус» г. Елец Липецкой области.

Апробация работы: Основные положения работы докладывались на международных конференциях: Международной конференции молодых ученых «Молодые ученые - пищевым и перерабатывающим отраслям АПК (технологические аспекты производства)» (Москва, 2000 г.) и II Международной научно-практической конференции «Качество, безопасность и экология пищевых продуктов и производств. Прогресс в области агроиндустрии» (Ялта, 2001 г.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 5 статей в сборнике «Актуальные вопросы пищевой промышленности», в научно-производственных журналах «Виноделие и виноградарство», «Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья», в журнале «Микробиология». Проведено депонирование 5 штаммов дрожжей в ВКПМ, подана заявка на получение патента РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 180 источников, из них 84 иностранных источника и 7 приложений. Работа изложена на 210 страницах машинописного текста, включает 42 рисунка и 74 таблицы.

1. Обзор литературы.

В литературном обзоре рассматриваются основные изменения систематики дрожжей рода 5ассЪагошусе$ с момента первого упоминания в научной литературе термина «сахаромицеты» до сегодняшних дней и приводится современная классификация рода 8асскагошусе$, основанная на новой концепции генетического рода дрожжей. Рассматриваются наиболее перспективные молекулярно-биологические методы идентификации дрожжевых культур. Обобщены данные, касающиеся классификации плодово-ягодных вин и химического состава основных

видов сырья для производства яблочных и ягодных вин. Сделан обзор современного состояния производства плодово-ягодных вин в России, странах СНГ и за рубежом. Систематизированы литературные данные по производственным расам дрожжей, применяемым на сегодняшний день на предприятиях винодельческой промышленности для получения различных плодово-ягодных вин, указываются технологические особенности каждой расы и делается вывод о необходимости поиска новых рас дрожжей для сбраживания плодово-ягодных су сел.

Анализ литературных данных выявил проблемы, существующие в данной области знаний, и позволил сформулировать цель и задачи данного исследования.

2. Экспериментальная часть.

2.1. Объекты исследования.

Объектами исследования служили 32 штамма дрожжей рода Saccharomyces различного происхождения. Из них 13 штаммов выделены с поверхности винограда и с плодов и ягодных культур (малины, смородины черной, черники и черноплодной рябины) западного региона Беларуси и предоставлены для исследования кафедрой «Экология» Гродненского государственного университета (ГГУ). Остальные 19 штаммов дрожжей представляют собой культуры, наиболее часто используемые в различных отраслях бродильных производств (виноградном и плодово-ягодном виноделии; шампанском, спиртовом производстве, пивоварении и хлебопечении). Дрожжи получены из коллекций Украинского Института винограда и вина «Магарач», ВНИИ пищевой биотехнологии; кафедр «Биотехнология» Московского Государственного Университета пищевых производств и Российской Академии холода.

Выращивание чистых культур дрожжей осуществляли на пивном неохмеленном сусле с содержанием сухих веществ (СВ) 14%. Для приготовления питательных сред сусло разбавляли стерильной водой до содержания СВ 8%. Для молекулярной дифференциации штаммов дрожжи культивировали на полной YPD среде. Хранение культур осуществляли на скошенном солодовом сусло-агаре при температуре 6±1°С. Пересевы проводили 2 раза в год. Перед использованием в экспериментах по брожению для восстановления активности дрожжей проводили 23 раза пассаж на стерильном разбавленном солодовом сусле.

Для ПЦР-анализа в качестве контролей привлекали моноспоровые культуры S. cerevisiae CBS 1171, S. bayanus CBS 380, S.pastohanus CBS 1538, S. uvarum BKM Y-1146, S. paradoxus CBS 432 (CBS - Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, the Netherlands).

2.2. Материалы и методы исследования.

Способность дрожжей к сбраживанию Сахаров определяли с использованием трубок Дунбара. Сахара брали в количестве 2%, раффинозу - в количестве 4-6% [Бабьева И.П. и др., 1979].

Тесты по утилизации источников углерода, способности дрожжей использовать нитраты в качестве единственного источника азота в среде, на способность к росту среде с антибиотиком и на безвитаминной среде были поставлены на плотной питательной среде с применение многоточечного инокулятора.

Определение максимальной температуры роста исследуемых

штаммов проводили на плотной питательной среде, высевая культуры на чашки штрихом.

Выделение ДНК из клеток дрожжей осуществляли с использованием лизисного буфера [Naumov G.I. et.al., 1997]. Выделение хромосомной ДНК проводили по методике, описанной Д. Шварц и К. Кантор [Schwartz D.H. et. al, 1984] с применением энзиматического препарата Novozym 234 (Novo Industri A/S, Дания).

Амплификацию 5,8S-ITS-, NTS2-ETS- фрагментов рДНК и ПЦР с микросателлитным праймером (GTG)s осуществляли на ДНК - амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) в режимах, описанных в литературе [Наумов ПИ. и др., 2003; Nguen H.-V. et.al., 1997; Naumova E.S. et.al., 2003].

Продукты амплификации подвергали электрофорезу в 1 %-ном агарозном геле при 60-65В в 0,5хТВЕ в течение 2 часов.

Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) 5,8S-ITS-фрагмента рДНК осуществляли эндонуклеазами Нае III и Нра II («Fermentas», Литва). Рестрикцию ЫТЛ-ЕТБ-фрагмента рДНК осуществляли с помощью эндонуклеаз Alu I и Bsh NI («Fermentas», Литва).

Разделение фрагментов рестрикции осуществляли в 1,6%-ном агарозном геле при 55-60В в 0,5хТВЕ в течение 3 часов.

Для разделения хромосомной ДНК использовали аппарат CHEF-DRTM III («BioRad», США). Пульс электрофорез проводили при 200В в течение 24 часов: 15 часов при времени переключения полей 60 с и 9 часов при времени переключения полей 90 с (охлаждение до 14°С).

Перенос хромосомных ДНК на нитроцеллюлозную мембрану проводили Саузерн-блотом [Маниатис Т. и др., 1984]. В качестве зонда использовали ПЦР-фрагмент гена ARG4 длиной 3000 п.н. Метку вводили нерадиоактивным методом по «Boehringer Manneheim» (Germany) с использованием дигоксигена dig-11-dUTP [Naumov G.I. et. al., 1991]. Гибридизацию и проявление гибридизационных сигналов также проводили по инструкции фирмы «Boehringer Manneheim».

Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе «Vilber Lourmat» (Франция).

Филогенетические родственные связи изучаемых дрожжей-сахаромицетов и построение дендрограммы осуществляли по результатам ПЦР с микросателлитным праймером (GTG)s с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECON [Van de Peer Y. et. al., 1994].

Брожение проводили в сосудах с затворами Мейсля на субстратах: концентрате яблочного сусла (производитель - ОАО «Прогресс», г. Липецк) и плодово-ягодных соках (виноградном, малиновом, черничном, черносмородиновом, черноплоднорябиновом, яблочном),

Субстраты восстанавливали дистиллированной водой до кондиции свежего сока -содержания СВ 9% и редуцирующих веществ (РВ) - 7-8 г/100 см3, и подсахаривали до общего содержания сахара 16,0 г/100 см\

Концентрацию СВ измеряли с применением лабораторного рефрактометра марки РЛ, содержание РВ - по методу Бертрана [ГОСТ 12575-86]

В субстраты вносили азотистое питание дрожжей - аммоний сернокислый - из расчета 0,25 г/дм3. Температура брожения - 22-25°С.

Количество выделенного СО2 определяли весовым методом. Бродильную активность определяли по интенсивности выделения СО2 за интервалы времени.

Основные показатели соков и полученных виноматериалов определяли методами, принятыми на предприятиях винодельческой промышленности [Государственный контроль качества винодельческой продукции, 2003].

Подсчет числа клеток проводили под микроскопом с использованием счетной камеры Горяева-Тома [Саришвили Н.Г. и др., 2000].

Анализ ароматических веществ осуществляли методами газовой хроматографии -масс-спектрометрии (ГХ-МС) и газовой хроматографии -плазменно-ионизационным детектором (ГХ-ПИД).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по программе Excel 97 Microsoft Office.

2.3. Результаты исследований и их обсуждение.

2.3.1. Морфологические признаки штаммов.

В результате изучения морфологических признаков стандартными методами по определителю [Бабьева И.П. и др., 1979] для идентификации исследуемых дрожжевых штаммов до рода получены следующие результаты. Колонии дымчатые, матовые, точечные, тестообразные, гладкие. Клетки размером (4,2-4,8)х(3-5) мкм, почкование разностороннее, примитивный псевдомицелий, истинного мицелия не образуют. Аски с 1-4 круглыми спорами. Штрих сплошной с ровным краем. В жидкой среде образуют белый мягкий осадок и кольцо на поверхности. Относятся к роду Saccharomyces.

Морфологические свойства штаммов из коллекции ИВиВ «Магарач» были изучены ранее и описаны в литературе [Иванова Е.В. и др., 2000].

2.3.2. Видовая идентификация штаммов.

По определителю [Vaughan-Martini A. et.al., 1998] дрожжевые штаммы относятся к биологическому виду S. cerevisiae, если они обладают следующими признаками: 1) Сбраживают сахарозу и раффинозу; 2) Не сбраживают трегалозу; 3) Ассимилируют глюкозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, раффинозу, этанол; 4) Не ассимилируют рибозу, лизин, манит, этиламин; 5) Растут при 35°С; 6) Не растут на среде с 0,1% содержанием антибиотика и на среде, не содержащей витаминов.

Все культуры были проверены на способность к сбраживанию большего числа Сахаров - глюкозы, галактозы, мальтозы, мелибиозы, сахарозы, раффинозы и лактозы, которая выбирается в качестве отрицательного контроля в тестах по брожению для дрожжей рода Saccharomyces. Установлено, что все исследуемые штаммы активно сбраживают глюкозу, галактозу, мальтозу, сахарозу и раффинозу, не сбраживают лактозу. Шампанские штаммы Корнет и Харьковская-39 не сбраживают галактозу, виноградный штамм ВВ-1 - сбраживает, но очень слабо. Штаммы ВВ-1, ГСЧ-5, ГСЧ-8, ДЧК-1, Феодосия 1-19, 47-К, 985-Т, Испанская XII, Л-80-4 и 301 слабо сбраживают трегалозу.

Таблица 1. Способность изучаемых штаммов ассимилировать источники углерода, входящие в «пестрый ряд».

СВОЙСТВА ШТАММЫ АССИМИЛЯЦИЯ

я г» о к 2 й о г ез Ч г я (Л о «о а о и я п О г X «9 В. ев <•> О 5 й я 5 г 3 о ее а я -1 О-арабнноза я г» 1 £ я о а се к ее и я ^ о л ч я я п о 3 и а Н я о 5 Ю £ г я а 5 я я г* е 5 «о о в; 5 я г X в •е ■в я в. я 8 н X а X 5 г ч X с* о 2 2 0 1 1£ в X X н >1 «о а < X X а 5 а X ч X 3 X и я с. и

1 ВВ-1 + + + + + +

2 ВВ-2 + + + + + - - - + - + - - - -

3 ГВ-1 + + + + + +

4 ГВ-4 + + + + +

5 ГСЧ-1 + + + + + - - - + - С - - - -

6 ГСЧ-5 + + + + + +

7 ГСЧ-8 + + + + + +

8 ГСЧ-11 + + + + +

9 ГМ-8 + + + + + - - - + - - - - - -

10 ГМ-15 + + + + +

11 ГМ-17 + + + + + +

12 ДЧК-1 + + + + +

13 ВЧР-3 + + + + + +

14 Вишня-18 + + + + + - - - + с

15 Яблочная-7 + + + + +

16 Сидровая-101 + + + + +

17 Корнет + с + + +

18 Харькове кая-39 + + + + + +

19 Шампанская 11/12 + + + + + - - - + - + - - - -

20 Штейнберг-92 + + + + +

21 Феодосия 1-19 + + + + + +

22 Кокур-3 + + + + + - - - + с

23 47-К + + + + +

24 985-Т + + + + + + - - - + с

25 У-717 + + с + + + - - - + с - - - - С

26 Я + + + + + - - - + +

27 П-148 + + + + +

28 Испанская XII + + + + + - - - + с С - - - -

29 Л-80-4 + + + + - - - + с с - - - -

30 301 + + + + - - - + с с - - - -

31 261 + + + + + - - - + с с - - - -

32 125 + + + + + - - - + с с - - - -

СВОЙСТВА ШТАММЫ АССИМИЛЯЦИЯ РОСТ

г X X ч Этиламнн X X £ я гг О к 2 £ Глицерин н X а н X а О Рибит Сорбит 1 Маннит X а л ч 3 Инозит Этанол ь я X е 9 ц ь. о е г!» н я X в ■л 2 5 0 1 ■Л Глюктроновая к-та Молочная к-та Янтарная к-та Лимонная к-та н я е * Рост при 30°С Рост при 37°С Циклогексимид

1 ВВ-1 с + + -

2 ВВ-2 с + + + -

3 ГВ-1 с + + -

4 ГВ-4 с + + -

5 ГСЧ-1 с + + -

6 ГСЧ-5 с + + -

7 ГСЧ-8 с + + -

8 ГСЧ-11 с +' + -

9 ГМ-8 с + + -

10 ГМ-15 с с + + + + -

11 ГМ-17 с + + -

12 ДЧК-1 с + + -

13 ВЧР-3 с + + -

14 Вишня-] 8 + + -

15 Яблочная-7 + + + + -

16 Сидровая-101 + + -

17 Корнет + + +

18 Харьковская-39 + + -

19 Шампанская 11/12 + + +

20 Штейнберг-92 + + -

21 Феодосия 1-19 с + - - - + + -

22 Кокур-3 + с - • + + -

23 47-К + + -

24 985-Т + + + -

25 У-717 с + + -

26 Я + + +

27 П-148 + + -

28 Испанская XII с + + с - - + +

29 Л-80-4 + + -

30 301 + + -

31 261 + + -

32 125 + + -

Учет результатов по ассимиляционным тестам в первый раз проводился через 3-е суток, а затем еще через неделю. На средах с мальтозой и сахарозой показания снимались только через 3-е суток, поскольку позднее культуры, не усваивающие данные дисахариды, часто обнаруживают рост за счет избыточного выделения соседними колониями (при посеве множественным инокулятором) ферментов, гидролизующих эти сахара [Бабьева И.П. и др., 1979]. Иногда дрожжи медленно адаптируются к некоторым источникам углерода и поэтому окончательный просмотр чашек проводился еще через 3 недели. Данные, представленные в таблице 1, показывают, что по результатам ассимиляционных тестов большинство исследуемых штаммов попадают под стандартное описание вида еегеу1$(ав. Все штаммы ассимилируют глюкозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, раффинозу и этанол и не ассимилируют маннит. Культуры выросли при 35°С и ни один штамм не проявил способности расти на безвитаминной среде. Отличия между отдельными штаммами наблюдались по тем тестам, которые в определителе обозначаются как вариабельные: сбраживание галактозы и мелибиозы, ассимиляция галактозы, мелецитозы, а-метил^-глюкозида, глюкуроновой и янтарной кислот, рост при 37°С, поэтому отличия от стандартного описания по этим признакам не подвергает сомнению принадлежность штаммов к виду 5. еегеуЬзше.

Следующие штаммы проявляют свойства, отличающиеся от стандартного описания вида:

• Штамм ВВ-2 отличается от стандартного описания 5 cerevisiae способностью расти на среде с этиламином.

• Штаммы ГМ-15, ГМ-17, Вишня-18, Сндровая-101, Штейнберг-92, Кокур-3, 47-К, Испанская XII дают слабый рост на глицирине.

• Раса Шампанская 11/12 растет на среде с глицерином.

• Спиртовая раса Я выросла на среде с 0,1 % антибиотика.

• Спиртовые расы 985-Т и У-717 ассимилируют рибозу и лизин, причем у последней расы эти свойства выражены слабо.

• У всех без исключения белорусских штаммов нами обнаружена способность слабо ассимилировать лизин. Возможно, что способность дрожжей-сахаромицетов к ассимиляции лизина возникла вследствие спонтанной изменчивости биохимических признаков, и, вероятно, имеет место формированием экотипа.

2.3.3. Определение максимальных температур роста.

Серия экспериментов по определению максимальной температуры роста каждого штамма была поставлена на чашках Петри на твердой питательной среде (сусло-агаре) с содержанием сухих веществ 7%. Первый просмотр - предварительный -проводился через 3 дня после высева культур, второй - еще через 3-4 дня. Посев проводился прямым штрихом по трафарету, на каждую чашку помещалось по 5-6 культур. Диапазон температур - 28-53°С.

Максимальной температурой роста дрожжевых штаммов считается промежуточная между самой высокой, при которой рост не проявляется в течение 7 дней, и предыдущей более низкой температурой.

Таблица 2. Максимальная температура роста штаммов.

№ Штаммы Максимальная температура роста, °С № Штаммы Максимальная температура роста, °С

I ВВ-1 46-49 17 Корнет 35-37

2 ВВ-2 46-49 18 Харьковская-39 35-37

3 ГВ-1 46-49 19 Шампанская 11/12 35-37

4 ГВ-4 44-46 20 Штейнберг-92 46-49

5 ГСЧ-1 46-49 21 Феодосия 1-19 44-46

6 ГСЧ-5 46-49 22 Кокур-3 44-46

7 ГСЧ-8 44-46 23 47-К 44-46

8 ГСЧ-11 44-46 24 985-Т 49-53

9 ГМ-8 44-46 25 У-717 49-53

10 ГМ-15 44-46 26 Я 44-46

11 ГМ-17 46-49 27 П-148 46-49

12 ДЧК-1 44-46 28 Испанская XII 49-53

13 ВЧР-3 44-46 29 Л-80-4 44-46

14 Вишня-18 44-46 30 301 44-46

15 Яблочная-7 44-46 31 261 44-46

16 Сидровая-101 44-46 32 125 46-49

Исследуемые нами дрожжевые штаммы характеризуются следующими максимальными температурами роста:

• Шампанские штаммы Корнет, Харьковская-39, Шампанская 11/12 - 35-37°С.

• Плодово-ягодные штаммы ГСЧ-8, ГСЧ-11, ГМ-8, ГМ-15, ДЧК-1, ВЧР-3, Вишня-18, Яблочная-7, Сидровая-101, винные штаммы Феодосия 1-19, Кокур-3, 47-К, спиртовая раса Я, и хлебные Л-80-4, 301, 261 - 44-46°С.

• Плодово-ягодные штаммы ВВ-1, ВВ-2, ГВ-1, ГСЧ-1, ГСЧ-5, ГМ-17, шампанская раса Штейнберг-92, пивная П-148, хлебная раса 125 - 46-49°С.

• Спиртовые расы 985-Т, У-717 и пивная Испанская XII - 49-53°С.

2.3.4. Молекулярная дифференциация штаммов.

Была проведена амплификация 5.8S-ITS и NTS2-ETS фрагментов рДНК у 32 исследуемых штаммов и пяти видовых тестеров. У всех 37 штаммов размер 5.8S-ITS ПЦР - продукта был одинаков и составил примерно 850 п.н. Размер амплифицированного NTS2-ETS участка рДНК также оказался одинаковым у всех 37 изучаемых штаммов и составил примерно 1320 п.н. (Рисунки не приводятся). Полученные результаты свидетельствуют о принадлежности исследуемых дрожжей к комплексу Saccharomyces sensu stricto [Наумов Г.И. и др., 2003; Nguyen H.-V. et. al., 1997].

Продукты ПЦР анализировали с помощью ферментативного расщепления эндонуклеазами Hpall и НаеШ. По сходству рестрикционных профилей все изученные дрожжи были разбиты на 2 группы. В первую группу вошли тест-штамм S. cerevisiae CBS 1171, 10 белорусских штаммов (ВВ-1, ВВ-2, ГВ-1, ГВ-4, ГСЧ-1, ДЧК-1, ВЧР-3, ГМ-8, ГМ-15, ГМ-17) и 17 штаммов из других коллекции. Они

характеризуются наличием четырех НаеШ- фрагментов размером примерно 320, 230, 170 и 130 п.н. (Рис. 1а, дорожки 10-18) и двух HpaII-фрагментов размером примерно 730 и 120 п.н. (Рис. не приводится).

Три тест-штамма & pastohanus CBS 1538, S. bayanus CBS 380, S. uvarum BKM Y-1146 (Рис. la, дорожки 1,2,4 соответственно) имеют три НаеШ- фрагмента размером примерно 490, 230 и 130 п.н., а по HpaII-профилям рестрикции неотличимы от штаммов первой группы.

Ко второй группе исследуемых штаммов были отнесены три белорусских штамма (ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-П) штаммы Шампанская 11/12 и Л-80-4, обладающие уникальными НаеШ - профилями 5.8S-ITS участка рДНК (Рис. 1а, дорожки 5-9). Штаммы этой группы обладают идентичными паттернами с четырьмя фрагментами приблизительно равными 320, 230, 170 и 130 п.н., характерными тест-штамму S. cerevisiae CBS 1171, и одним дополнительным фрагментом длиной около 490 п.н. Наличие фрагмента такой длины обнаруживается у штаммов S. pastorianus CBS 1538, S. bayanus CBS 380, S. uvarum BKM Y-l 146 (Рис. la, дорожки 1,2,4). Hpall-профили этих пяти штаммов идентичны штаммам первой группы (Рис. не приводятся).

Амплифицированный NТS2-ЕТS-фрагмент рДНК анализировали рестриктазами Alul, BshNI (Рис. 16,1в). Ранее было показано [ Nguyen H.-V. et. al., 1997; 2000], что на основании рестрикции NTS2-ETS-parMeHTa рДНК с помощью данных эндонуклеаз можно различить виды-двойники S. cerevisiae, S. paradoxus и 5. uvarum. Дрожжи S. bayanus и S. pastorianus имеют идентичные профили. Тест-штаммы S. pastorianus CBS 1538 и S. bayanus CBS 380 характеризуются отсутствием BshNI-сайта, а при Alul-рестрикции имеют идентичные паттерны с четырьмя фрагментами приблизительно равными 470, 370, 240 и 170 п.н. (Рис. 16, 1в, дорожки 1,2). У тест-штамма S. uvarum BKM Y-1146 также наблюдается отсутствие BshNI-сайта, а Alul-профиль характеризуется тремя фрагментами размером около 620, 520 и 180 п.н. (Рис. 16, 1в, дорожка 4).

Все исследуемые штаммы по сходству рестрикционных профилей были разбиты на две группы. В первую группу вошли тест-штамм S. cerevisiae CBS 1171 и 27 исследуемых штаммов, имеющие стандартные ПДРФ-профили: по два AIuI-фрагмента длиной около 1150 и 170 п.н. и три BshNI-фрагмента приблизительно равных 740,420 и 220 п.н. (Рис. 16, 1 в, дорожки 3, 10-18).

Ко второй группе мы отнесли пять штаммов, обладающих уникальными профилями при BshNI- и Alul- рестрикции. Это три белорусских штамма (ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11) и штаммы Шампанская 11/12 и Л-80-4. Они отличаются наличием четырех Alul- фрагментов: трех, характерных для тест-штамма S. uvarum BKM Y-1146, длиной примерно 620, 520 и 180 п.н. и одним дополнительным фрагментом длиной примерно 1100 п.н. как при Alul- рестрикции штамма S. cerevisiae CBS 1171 (Рис. 16, дорожки 5-9). При BshNI-рестрикции штаммы этой группы имели идентичные паттерны с тремя фрагментами приблизительно равными 740, 420 и 220 п.н., характерные для тест-штамма S. cerevisiae CBS 1171 и одним фрагментом размером примерно 1300 п.н., характерным тест-штамму S. uvarum BKM Y-1146 (Рис.1 в, дорожки 5-9).

Таким образом, на основании рестриктазного анализа мы смогли дифференцировать исследуемые штаммы комплекса Saccharomyces sensu stricto.

/- Spastonanus CBS 1538,2- S bayanus CBS 380, 3- S cerevisiae CBS 1171, -/- S uvarum BKM Y-l 146, 5- ГСЧ-5, б- ГСЧ-8, 7- ГСЧ-11, 8- Л-80-4, P- Шампанская 11/12, /0- Корнет, /У- Штейнберг-92,12- Харьковская-39, 13- 301,14- 261, /5-125, /б- ГВ-1,17- ГВ-4, /5- ГСЧ-1, М - маркер молекулярных весов 100 bsp DNA Ladder («Fermentas», Литва)

Рис 1 Рестрикционный анализ амплифицированных 5,8 S-ITS и NTS2-ETS-фрагментов рДНК штаммов Saccharomyces sensu stricto с помощью эндонуклеаз Нае HI (a), AIuI (б) и BshNI (в)

Согласно проведенному ПДРФ-анализу 27 исследуемых штаммов относятся к виду S. cerevmae. Пять штаммов с уникальными НаеШ, AM и BshNI-рестрикционными профилями (ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11, Шампанская 11/12, Л-80-4) представляют собой гибриды S. cerevmaexS. uvarum.

На Рис 2 представлены молекулярные кариотипы изучаемых нами сахаромицетов. Идентификацию отдельных хромосомных полос проводили по кариотипу стандартного штамма S. cerevmae YNN 295, имеющего известные размеры и порядок хромосом (дорожка 1) Стандартный штамм YNN 295 при электрокариотипировании имеет 15 полос; две хромосомы VII и XV мигрируют в одном дуплете.

Известно, что для культурных штаммов дрожжей, в отличие от диких дрожжей S. cerevisiae, характерен значительный полиморфизм кариотипов, обусловленный хромосомными перестройками [Наумова Е.С. и др, 1993]. Результаты кариотипирования не подтвердили обнаруженный ранее полиморфизм хромосом исследуемых штаммов. Большинство изучаемых штаммов имеют гаплоидное число хромосом (п=16) и по своим кариотипам сходны со стандартом YNN 295 и типовой культурой S cerevisiae CBS 1171 (Рис. 2).

Рис.2. Молекулярные кариотипы изучаемых штаммов дрожжей / - YNN 295, 2-S uvarum BKM Y-1146, 3-S pastonanus CBS 1538, 4 - Шампанская 11/12, 5-ГСЧ-5,б-ГСЧ-8, 7-ГСЧ-11,5-ГСЧ-1,9-Л-80-4, /0-301, //-985-Т, 12 -У-717.

Один штамм, идентифицированный как гибрид 5 cerevmaex 5 тагит, по своим кариотипам существенно отличается от большинства штаммов и стандарта ТЫК

295. У него обнаружена одна хромосомная полоса, размером приблизительно 1070 т.п.н. (дорожка 4), характерная для штамма S. uvarum BKM Y-1146 и типовой культуры S. pastorianus CBS 1538, являющейся гибридным таксоном S. bayanusxS. cerevisiae (дорожки 2,3).

У остальных четырех гибридов ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11, Л-80-4 данная хромосома отсутствует (дорожки 5-7, 9 соответственно). В остальном кариотипы всех пяти гибридов были идентичны и сходны с кариотипами штамма S. uvarum BKM Y-l 146.

По результатам Саузерн - гибридизации у всех штаммов было обнаружено по одной гибридизационной полосе (Рис. не приводится). У гибрида Шампанская 11/12 гибридизаиионный сигнал расположен выше и соответствует VIII хромосоме ДНК штамма S. bayanus [Naumov G.I. et.al., 2000] размером примерно 700 т.п.н. У 31 штамма гибридизационная полоса расположена в районе VIII хромосомы стандартного штамма S. cerevisiae YNN 295. В эту группу входят четыре гибридных штамма ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11, Л-80-4.

2.3.5. Изучение динамики бродильной активности.

2.3.5.1. Определение скорости и глубины сбраживания субстратов.

1. Расы ВВ-1, ВВ-2, ГВ-1, ГВ-4. На Рис. 3-4 отображена динамика выделения углекислоты при сбраживании виноградного сока и яблочного сусла соответственно штаммами ВВ-1, ВВ-2, ГВ-1 и ГВ-4, выделенными с виноградных ягод. Результаты показывают, что виноградные штаммы обладают достаточно высокой энергией брожения и сбраживают виноградное сусло за 10-20 дней. Брожение на яблочном сусле проходило за более длительный период - 19-27 суток. При сбраживании виноградного сусла отмечается более высокое образование углекислоты за меньший период времени. Все 4 штамма характеризуются практически одинаковой бродильной активностью, т.к. в результате брожения количество образованного ими СО2 составляет 15,0 г/100 см3 для рас ВВ-1 и ГВ-1 и 15,05 г/100 см3 - для рас ВВ-2 и ГВ-4. Все четыре штамма обеспечивают энергичное забраживание субстрата. Наиболее активно проявил себя штамм ВВ-1. Он обеспечивал как энергичное забраживание субстрата, так и его быстрое дображивание. Весь процесс брожения с участием штамма ВВ-1 проходил за 10 суток. Несколько уступают ему штаммы ВВ-2 и ГВ-4, которые, хоть и начинают процесс брожения более энергично, уже на вторые сутки начинают отставать от расы ВВ-1 и полностью сбраживают субстрат за 11 суток. Штамм ГВ-1 отличается наименьшей бродильной активностью, позволившей завершить весь процесс брожения за 20 суток.

При сбраживании яблочного сусла наиболее энергичное его забраживание наблюдалось при использовании штамма ВВ-2, который на протяжении первых 5 суток обеспечивал наибольшее накопление углекислоты, однако дальнейшее сбраживание данного субстрата этот штамм проводил очень вяло, в результате чего длительность брожения на расе ВВ-2 составила 27 суток. Общее накопление СО2 при использовании этой расы было наибольшим и составило 15,05 г/100 см3. Напротив, штаммы ГВ-1 и ГВ-4, хотя и сбраживали яблочное сусло менее энергично, тем не менее процесс дображивания проводили гораздо быстрее, что позволило им накопить 15,0 г СО/100 см3 за 20 суток (ГВ-1) и 14,47 г СО/100 см3 за 19 суток (ГВ-4). Наименьшей бродильной активностью характеризовался штамм

ВВ-1, который выбраживал яблочное сусло в течение 24 суток с накоплением углекислоты в количестве 14,65 г/100 см3.

2. Расы ГСЧ-1, ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11. Данные, представленные на Рис. 5-6, показывают, что штаммы дрожжей, выделенные с ягод черной смородины, обладают достаточно высокой энергией брожения поскольку полностью сбраживают как черносмородиновое, так и яблочное сусло всего за 14-20 суток. При сбраживании черносмородинового сока изучаемыми штаммами отмечалось несколько более высокое образование СО2. Наиболее активно проявил себя штамм ГСЧ-1. Он обеспечивал как энергичное забраживание черносмородинового сока, так и его быстрое дображивание. Несколько уступает ему штамм ГСЧ-11, который начинал процесс брожения медленнее, но уже на 6-е сутки даже опережал штамм

ГСЧ-1 по интенсивности накопления СО2. Однако, процесс дображивания этот штамм проводил достаточно медленно, из-за чего весь процесс брожения с его участием проходил за 20 суток (у ГСЧ-1 - за 14 суток). Штамм ГСЧ-5 отличается более медленной, но ровной кинетикой брожения, позволившей завершить брожение на 17-е сутки. И, наконец, наименьшей бродильной способностью характеризуется штамм ГСЧ-8, который хотя и заканчивал процесс брожения на 17-е сутки, тем не менее, количество образованного им СО2 было наименьшим и составило 14,27 г/100 см3 сока, по сравнению с 14,92 г/100 см3 для штаммов ГСЧ-1 и ГСЧ-11 и 14,80 г/100 см3 для штамма ГСЧ-1.

При сбраживании яблочного сусла наиболее энергичное его забраживание наблюдается при использовании штамма ГСЧ-11, который в течение первых 10 суток обеспечивал наибольшее накопление СО2, однако, также как и в случае с черносмородиновым соком, дображивание этот штамм проводил очень вяло, в результате чего суммарное накопление СО2 при брожении на этой расе было наименьшим (13,30 г/100 см3). Напротив, штаммы ГСЧ-1 и ГСЧ-8, хотя и сбраживали яблочное сусло менее энергично, тем не менее процесс дображивания они проводили быстрее, что позволило им накопить 14,75 г С02 /100 см3 за 16 суток (ГСЧ-1) и 14,80 г СО2 /100 см3 за 15 суток (ГСЧ-8). Наименьшей бродильной активностью характеризуется штамм ГСЧ-5, который сбраживал сусло в течение 21

дня с накоплением 14,60 г СОг /100 см3.

3. Расы ГМ-8, ГМ-15, ГМ-17. Динамика выделения СО2 при сбраживании малинового сусла штаммами ГМ-8, ГМ-15 и ГМ-17 представлена на Рис. 7-8. Совершенно очевидно, что штаммы этой группы обладают более низкой энергией брожения, поскольку сбраживают как малиновый сок, так и яблочное сусло за 16-30 суток При сбраживании малинового сока исследуемыми штаммами отмечалось несколько более энергичное образование углекислоты. Наиболее энергичное забраживание малинового сусла наблюдается при использовании расы ГМ-17, которая первые 3 суток более интенсивно сбраживала субстрат, однако, процесс дображивания этот штамм проводил достаточно медленно, из-за чего весь процесс

процесс брожения с его участием проходил за 30 суток. За этот период накопление СО2 составило 15,17 г/100 см3. Вторым по длительности сбраживания малинового сока является штамм ГМ-15, который начинал процесс брожения чуть менее энергично, чем штамм ГМ-17, однако дображивание проводилось им намного интенсивнее, и весь процесс брожения был завершен за 19 суток. Тем не менее количество образованного им СО2 было наименьшим и составило 14,15 г/100 см3 малинового сусла. Штамм ГМ-8 характеризуется схожей с ним кинетикой брожения, позволившей, однако, завершить брожение на 16 сутки, накопив при этом 14, 35 г СО2/100 см3.

В процессе сбраживания яблочного сусла наиболее энергичное его забраживание наблюдается при использовании штамма ГМ-8, который на протяжении всего периода брожения обеспечивал наибольшее накопление углекислоты, составившее в результате 15,2 г СО2/ 100 см3 сусла за 21 день брожения. Несколько уступает ему штамм ГМ-15, который начинал процесс брожения практически одинаково со штаммом ГМ-8, но за тот же 21 день брожения характеризуется наименьшим накоплением углекислоты - 14,80 г/100 см3. И, наконец, дольше всего длилось брожение на расе ГМ-17, которая, также как и в случае с малиновым соком, заканчивала весь процесс брожения за 30 суток с накоплением углекислоты в количестве 14,95 г/100 см3.

4. Расы ДЧК-1, ВЧР-3, Яблочная-7. На Рис. 9-10 представлены данные по динамике сбраживания субстратов штаммами четвертой группы: ДЧК-1, ВЧР-3 и контрольной расой Яблочная-7. следует отметить, что все три расы сбраживали и плодово-ягодные соки (черничный, черноплоднорябиновый, яблочный) и яблочное сусло практически за одно и тоже время - за 19-22 суток Штамм ДЧК-1 обеспечивал как энергичное забраживание яблочного сусла, так и его быстрое дображивание. И, хотя брожение черничного сока характеризуется менее интенсивным выделением СО2, в результате применения расы ДЧК-1 на черничном соке удалось накопить 14,90 г СО2/100 см3 за 20 суток по сравнению с 14,62 г СО2/ 100 см3 за 19 суток на яблочном сусле.

Штамм ВЧР-3 наиболее энергично начинал брожение черноплоднорябинового сока. Он обеспечивал как энергичное забраживание сока, так и его наиболее глубокое и полное дображивание. Процесс брожения сока с участием расы ВЧР-3 заканчивался на 21 сутки. Количество образованного ею СО2 было наибольшим и составляло 15,07 г/100 см3 сока по сравнению с 13,18 г СО2 /100 см3 субстрата, накопленных штаммом за 22 день менее интенсивного брожения на яблочном сусле. Контрольная раса Яблочная-7 сбраживала яблочный сок за 20 суток с накоплением 15,15 г СО2/ 100 см3, яблочное сусло - за 21 день с накоплением 15,1 г СО2/100 см3.

Проведенные исследования показали, что продолжительность сбраживания субстратов сахаристостью 16,0 г/100 см3 исследуемыми штаммами дрожжей различна.

По скорости сбраживания плодово-ягодных соков штаммы ранжируются следующим образом (Таблица 4):

ВВ-1 (10 суток); ВВ-2 и ГВ-4 (11 суток); ГСЧ-1 (14 суток); ГМ-8 (16 суток); ГСЧ-5 и ГСЧ-8 (17 суток); ГМ-15 (19 суток); ГВ-1, ГСЧ-11, ДЧК-1 и Яблочная-7 (20 суток); ВЧР-3 (21 день); ГМ-17 (30 суток).

По скорости сбраживания яблочного сусла штаммы распределились следующим образом (Таблица 5):

ГСЧ-8 (15 суток); ГСЧ-1 и ГСЧ-И (16 суток); ГВ-4 и ДЧК-1 (19 суток); ГВ-1 (20 суток); ГСЧ-5, ГМ-8, ГМ-15, и Яблочная-7 (21 день); ВЧР-3 (22 дня); ВВ-1 (24 дня); ВВ-2 (27 суток); ГМ-17 (30 суток).

Таблица 3. Физико-химические характеристики виноматериалов, полученных при сбраживании плодово-ягодных соков сахаристостью 16,0 г/100 см3.

Штамм Длительность брожения, сутки Титруемая кислотность, г/дм3 рн Массовая концентрация остаточных Сахаров, г/100 см3 Остаточный Экстракт, г/дм3 Объемная доля этилового спирта, %об

ВВ-1 10 4,7 3,1 0,30 63,9 7,08

ВВ-2 11 4,0 3,1 0,074 64,8 9,16

ГВ-1 20 3,5 3,0 0,18 51,8 8,90

ГВ-4 11 3,3 3,0 0.24 46,7 8,60

ГСЧ-1 14 14,4 3,4 0,25 58,1 8,47

ГСЧ-5 17 16,8 3,2 0,28 57,5 9,06

ГСЧ-8 17 17,2 3,2 0,15 57,3 9,31

ГСЧ-11 20 13,7 3,6 0,24 57,9 9,22

ГМ-8 16 6,9 2,3 0,19 64,3 9,09

ГМ-15 19 5,8 2,8 0,5 69,7 9,03

ГМ-17 30 5,3 3,0 0,6 68,5 9,04

ДЧК-1 20 7,8 3,4 0,15 68,2 7,95

ВЧР-3 21 5,6 4,2 0,33 57,3 9,17

Яблочная-7 20 5,9 3,8 0,32 56,2 8,99

Таблица 4 Физико-химические характеристики виноматериалов, полученных при сбраживании яблочного сусла сахаристостью 16,0 г/100 см3

Штамм Длитель- Титруемая рн Массовая Остаточный Объемная

ность брожения. кислотность, г/дм3 концентрация остаточных экстракт, г/дмЗ доля этилового

сутки Сахаров, г/100 смэ спирта, % об.

ВВ-1 24 8,0 3,3 0,30 58,6 7,90

ВВ-2 27 7,8 3,2 0,14 59,3 7,83

ГВ-1 20 9,2 3,5 0,15 45,7 7,54

ГВ-4 19 7,6 3,2 0,28 40,5 9,21

ГСЧ-1 16 9,2 3,4 0,27 52,3 8,89

ГСЧ-5 21 9,2 3,4 0,26 51,6 7,84

ГСЧ-8 15 8,8 3,4 0,28 51,3 8,54

ГСЧ-11 16 7,8 3,5 0,24 52,0 8,07 .

ГМ-8 21 8,2 3,4 0,20 58,2 9,06

ГМ-15 21 9,3 3,5 0,16 65,4 8,05

ГМ-17 30 9,0 3,6 0,16 64,9 8,76

ДЧК-1 19 7,8 3,6 0,15 64,8 8,91

ВЧР-3 22 9,0 3,4 0,23 53,4 8,78

Яблочная-7 21 8,0 3,3 0,29 51,6 8,90

2.3.5.2. Накопление этанола.

Важной характеристикой процесса брожения, определяющей его эффективность, является количество образовавшегося спирта. Поэтому, для того чтобы объективно судить о сбраживающей способности исследуемых штаммов, в конце брожения в готовых виноматериалах определялось содержание спирта.

По количеству образованного спирта при сбраживании исследуемыми штаммами плодово-ягодных соков (Таблица 3) штаммы ранжируются следующим образом (в % об.):

ГСЧ-8 (9,31); ГСЧ-11 (9,22); ВЧР-3 (9,17); ВВ-2 (9,16); ГМ-8 (9,09); ГСЧ-5 (9,06); ГМ-17 (9,04); ГМ-15 (9,03); Яблочная-7 (8,99); ГВ-1 (8,90); ГВ-4 (8,60); ГСЧ-1 (8,47); ДЧК-1 (7,95); ВВ-1 (7,06);

а при сбраживании яблочного сусла (Таблица 4) следующим образом (в % об.): ГВ-4 (9,21); ГМ-8 (9,06); ДЧК-1 (8,91); Яблочная-7 (8,90); ГСЧ-1 (8,89); ВЧР-3 (8,78); ГМ-17 (8,76); ГСЧ-8 (8,54); ГСЧ-11 (8,07); ГМ-15 (8,05); ВВ-1 (7,90); ГСЧ-5 (7,84); ВВ-2 (7,83); ГВ-1 (7,54).

2.3.5.2. Накопление биомассы дрожжей.

Биохимические превращения во время брожения и накопление различных компонентов в конечных виноматериалах обычно осуществляется при интенсивном размножении клеток дрожжей. Динамика роста и размножения дрожжей при спиртовом брожении, в силу биохимического состава среды, своеобразных окислительно-восстановительных условий, влияния различных факторов, в том числе образующегося спирта, весьма характерна и постоянна. Дрожжи наиболее интенсивно размножаются в первые сутки, далее в последующие дни брожения интенсивность размножения затухает и главный процесс сбраживания углеводов протекает при весьма малом приросте биомассы дрожжей [Henick-Kling Th., 1988] . Такой общий порядок формирования биомассы дрожжей сохраняется при различных температурных режимах брожения и при различном количестве первоначально внесенных дрожжей [Parish M.E. et.al., 1987].

В наших исследованиях размножение культур проходило закономерным образом, т.к. может быть описано S - образными кривыми, выражающими зависимость числа клеток от продолжительности роста. При этом начальная стадия - лаг-фаза, когда внесенные в среду клетки только приспосабливаются к ней, но еще не размножаются, в описываемых нами опытах отмечена не была. Специально проведенные исследования показали, что у изучаемых штаммов продолжительность лаг-фазы составляет всего 2-3 часа. В условиях данного опыта первая проба снималась только через сутки после засева субстрата, когда все без исключения культуры уже находились на стадии экспоненциального роста (периода максимальной скорости деления клеток).

Следует отметить, что накопление биомассы клеток при сбраживании плодово-ягодных соков было гораздо выше, чем при сбраживании яблочного сусла. На соках выросло, в среднем, на 20-55 % больше клеток дрожжей, чем на сусле в зависимости от штамма. Исключение составляют два штамма - ДЧК-1 и ВЧР-3, накопившую большую биомассу при сбраживании яблочного сусла. На плодово-ягодных соках наибольшее количество биомассы накапливают два виноградных (ВВ-1 и ВВ-2) и два

малиновых (ГМ-15, ГМ-17) штамма, наименьшее - ВЧР-3. На яблочном сусле накопление наибольшего количества биомассы осуществляется теми же двумя виноградными штаммами (ВВ-1 и ВВ-2) и малиновым штаммом ГМ-17, наименьший прирост биомассы у штамма ГСЧ-1 и контрольной расы Яблочная-7.

На основании полученных результатов и с учетом таких важных технологических показателей как длительность полного сбраживания субстрата, количество образовавшегося спирта, соотношение желательных/нежелательных вторичных метаболитов, а также дегустационную оценку виноматериалов, наибольший интерес для получения яблочных вин имеют следующие штаммы:

1. Виноградный штамм ГВ-4, сбраживающий яблочное сусло быстрее всех виноградных рас - за 19 суток и накапливающий в процессе брожения 14,17 г СО2/ 100 см3 субстрата. Полученный на этой расе яблочный виноматериал характеризуется максимальным среди всех исследуемых штаммов содержанием спирта - 9,21 % об., превосходя по этому показателю контрольную расу Яблочная-7. Массовая концентрация остаточных Сахаров, титруемых кислот и остаточного экстракта соответствует требованиям ГОСТ 51146-98 для яблочных виноматериалов. Виноматериал, полученный с использованием расы ГВ-4, характеризуется наибольшим количеством вторичных метаболитов и наивысшей среди штаммов этой группы дегустационной оценкой.

2. Черносмородиновый штамм ГСЧ-1, сбраживающий яблочное сусло за 16 суток и обеспечивающий накопление 14,75 г СО2/ 100 см3 субстрата. Яблочный виноматериал, полученный на расе ГСЧ-1, содержит 8,89 % об. спирта, опережая по этому показателю все штаммы своей группы и всего лишь на 0,01% об. отставая от контрольной расы Яблочная-7. Физико-химические характеристики полученного виноматериала соответствуют требованиям ГОСТ 51146-98 для яблочных виноматериалов. Штамм ГСЧ-1 обеспечивает накопление большого количества желательных ароматических компонентов, и при этом образует меньшее среди штаммов своей группы количество ацетальдегида и высших спиртов, что способствовало получению им наивысшего дегустационного балла.

3. Малиновый штамм ГМ-8, сбраживающий сусло за 21 день и обеспечивающий накопление углекислоты в количестве 15,2 г СО2/ 100 см3 субстрата, а спирта в яблочном виноматериале - 9,06 % об. По количеству спирта штамм ГМ-8 опережает остальные два штамма своей группы и контрольную расу Яблочная-7, накапливающую 8,90 % об. виноматериал, полученный с использованием расы ГМ-8, получил при дегустации наивысший бал среди штаммов своей группы благодаря оптимальному сочетанию вторичных метаболитов (наименьшему количеству нежелательных компонентов), что благоприятно сказалось на его органолептических свойствах.

Для получения ягодных вин наибольший интерес представляют следующие штаммы: 1. Штамм ВВ-2 для сбраживания виноградных соков, обеспечивающий полное сбраживание виноградного сока за 11 суток и накапливающий при этом 15,05 г СО2/ 100 см3 субстрата. И хотя по скорости сбраживания виноградного сока штамм ВВ-2 на сутки уступает штамму ВВ-1, количество накапливаемого штаммом ВВ-2 спирта составляет 9,16 % об., что является лучшим результатом среди штаммов своей группы и одним из лучших результатов среди всех исследуемых культур, включая и контрольную расу Яблочная-7. Несмотря на то, что наивысшую органолептическую оценку получил виноматериал, полученный с применением расы ВВ-1, предпочтение

отдается штамму ВВ-2, хотя он немного уступает по количеству желательных вторичных метаболитов и дегустационной оценке, прочно удерживая за собой второе место.

2. Штамм ГСЧ-11 для сбраживания черносмородиновых соков, который хотя и отличается среди штаммов своей группы максимальной длительностью полного сбраживания субстрата (20 суток), превосходит их по накоплению углекислоты (14,92 г СО2/ 100 см3 субстрата) и желательных вторичных метаболитов. Штамм накапливает наименьшее количество нежелательных (фурфурола, высших спиртов) ароматических компонентов и 9,22 % об. спирта. Как показала дегустация наилучшими органолептическими показателями обладал виноматериал, полученный при использовании штамма ГСЧ-11.

3. Штамм ГМ-8 для сбраживания малиновых соков, обеспечивающий накопление 14,35 г СО2/ 100 см3 субстрата за 16 суток брожения. Виноматериал, полученный с использованием расы ГМ-8, отличается наибольшим среди штаммов этой группы содержанием спирта- 9,09 % об., опережая по этому показателю контрольную расу Яблочная-7, по физико-химическим показателям соответствует требованиям ГОСТ 51146-98 для малиновых виноматериалов, содержит наибольшее количество ароматических компонентов, что позволило ему получить наивысшую дегустационную оценку.

4. Штаммы ДЧК-1 и ВЧР-3 рекомендуются для получения черничного и черноплоднорябинового виноматериалов соответственно. И, хотя штамм ДЧК-1 накапливает больше спирта при сбраживании яблочного сусла, накопление вторичных метаболитов и дегустационная оценка виноматериалов значительно выше при сбраживании черничного сока. Все это позволяет рекомендовать вышеперечисленные штаммы для использования отечественным винодельческим заводам.

3. Выводы.

1. В результате описания основных морфологических характеристик исследуемых штаммов дрожжей определены средние размеры дрожжевых клеток - (4,2-4,8)*(3-5) мкм, отмечено разностороннее почкование, примитивный псевдомицелий (отсутствие истинного мицелия), способность образовывать аски с 1-4 круглыми аскоспорами. Выяснено, что в жидкой среде культуры образуют белый мягкий осадок и слабое кольцо на поверхности. На твердой среде штрих сплошной с ровными краями, размер гигантской колонии округлой формы - 20,030,0 мкм. На основании морфологических признаков относим исследуемые штаммы дрожжей к роду 8асскаготусе&.

2. Видовую принадлежность исследуемых штаммов дрожжей определяли на основании стандартных физиологических тестов по определителю [Уа^Иап-Магйш А. й. а1., 1998]. На основании способности к сбраживанию Сахаров и ассимиляции углеводов «пестрого ряда» новые белорусские штаммы отнесены к биологическому виду сегвутае. При этом у всех 13 штаммов наблюдаются некоторые отклонения от стандартного описания вида, т.к. они, хотя и слабо, но ассимилировали лизин, что, вероятно, говорит о формировании экотипа. Кроме того, имеются и индивидуальные отклонения. Так, штамм ВВ-2, выделенный с ягод винограда, способен использовать в качестве единственного источника

углерода а-метил-Б-глюкозид и этиламин; черносмородиновый

штамм ГСЧ-1 - а-метил-Б-глюкозид и сорбит; малиновые штаммы ГМ-15 и ГМ-17 - глицерин. Проведенная реидентификация остальных 19 культур подтвердила принадлежность плодово-ягодных, шампанских, спиртовых и хлебных рас дрожжей к биологическому виду свгегтав. Пивные штаммы П-148 и Испанская XII, идентифицированные ранее как 5. carlsbergensis, и винные штаммы 47-К, Феодосия 1-19, Кокур-3, идентифицированные как 5. vini, также отнесены к биологическому виду 5. cerevisiae.

3. Определены максимальные температуры роста исследуемых дрожжей и установлено, что наиболее термостабильными являются спиртовые расы 985-Т, У-

4. 717 и пивная раса Испанская XII - 49-53°С. В диапазоне температур 46-49°С находятся белорусские штаммы ВВ-1, ВВ-2, ГВ-1, ГСЧ-1, ГСЧ-5, ГМ-17, шампанская раса Штейнберг-92, пивная П-148 и хлебная 125. Самая низкая температура роста 35-37°С отмечается у шампанских рас Корнет, Харьковская-39, Шампанская 11/12. Максимальные температуры роста остальных 17 штаммов лежат в диапазоне 44-46°С. Следовательно, белорусские штаммы обладают достаточно высокой термостабильностью, поскольку максимальные температуры роста штаммов - 44-49°С - позволяют их дальнейшее использование для получения препаратов активных сухих винных дрожжей (АСВД).

5. На основании ПЦР-анализа подтверждены принадлежность изучаемых штаммов дрожжей к роду 5accharomyces. ПДРФ-анализ 5.88- и КТ82-БТ8- фрагментов рДНК и молекулярное кариотипирование с последующей Саузерн-гибридизацией хромосомной ДНК выявил наличие пяти межвидовых гибридов среди 32 штаммов. В результате штаммы ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11, Шампанская 11/12, Л-80-4 идентифицированы как межвидовые гибриды 5. cerevisiae*5. uvarum и подтверждена принадлежность остальных 27 дрожжевых штаммов к биологическому виду 5. cerevisiae. Бескорневое филогенетическое дерево, отражающее генетическое родство исследуемых дрожжей, построенное на основании результатов ПЦР с микросателлитным праймером (ОТО^, выявило наличие двух ярко выраженных групп относительно внешней группы 5. uvarum ВКМУ-1146.

6. Изучена динамика сбраживания яблочного сусла и плодово-ягодных соков сахаристостью 16,0 г/100 см3. В качестве контрольной выбрана раса Яблочная-7. Установлено, что исследуемые штаммы активно сбраживают оба субстрата, однако при брожении на специфических субстратах накапливают больше углекислоты за более короткий период. Яблочное сусло полностью сбраживается за период 15-30 суток, соки - за 10-30 суток.

7. В полученных виноматериалах методами, принятыми на предприятиях винодельческой промышленности, определялись следующие физико-химические показатели: содержание спирта, массовые концентрации остаточных Сахаров и остаточного экстракта, титруемые кислоты, активная кислотность, велся подсчет клеток дрожжей. В яблочных виноматериалах штаммы накапливают от 7,54% до 9,21 % об. спирта, в ягодных - 7,08-9,31% об. По содержанию остаточных Сахаров, остаточного экстракта и титруемых кислот виноматериалы

соответствуют требованиям ГОСТ 51146-98 «Виноматериалы плодовые сброженные и сброженно-спиртованные. Технические условия».

8. Проведенный анализ ароматических компонентов виноматериалов методами газовой хроматографии выявил, что их содержание, главным образом, зависит от расы дрожжей и используемого субстрата и слабо коррелирует с накоплением основных метаболитов и биомассы дрожжей.

9. На основании результатов длительности полного сбраживания субстратов, количества образовавшегося спирта с единицы субстрата, анализа физико-химических свойств виноматериалов, соотношения желательных/нежелательных

. вторичных метаболитов, а также дегустационной оценки виноматериалов наибольший интерес для получения яблочных вин имеют штаммы ГВ-4, ГСЧ-1 и ГМ-8, для получения виноградных вин - штамм ВВ-2, черносмородиновых -ГСЧ-11, малиновых - ГМ-8, черничных - ДЧК-1, черноплоднорябиновых - ВЧР-3.

10. Проведены сравнительные заводские испытания рас дрожжей ГВ-4 (ВКПМ Y-3098) и ГСЧ (ВКПМ Y-3100) для получения плодовых вин на ОАО «Бахус» филиал «Винзавод «Ключ жизни» (г.Елец, Липецкая область). Результаты испытаний показали, что данные расы отличаются высокими технологическими показателями, позволяют интенсифицировать процесс брожения, обеспечивают получение высококачественных виноматериалов, которые по органолептическим свойствам и дегустационной оценке превосходят виноматериалы, полученные с использованием контрольной заводской расы Яблочная-7, и, безусловно, могут быть рекомендованы для использования на предприятиях плодового виноделия.

4. Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1) Мартыненко Н.Н., Жолудева М.В. Получение активных сухих дрожжей для производства шампанского // Тезисы докладов Международной конференции молодых ученых «Молодые ученые - пищевым и перерабатывающим отраслям АПК (технологические аспекты производства)». - М.: МГУ 1111.- 2000. - С.75-77.

2) Мартыненко Н.Н., Жолудева М.В., Шипачев Е.С. Получение препаратов активных сухих шампанских дрожжей // Тезисы докладов II Международной научно-практической конференции «Качество, безопасность и экология пищевых продуктов и производств. Прогресс в агроиндустрии». 21-25 мая 2001г. Ялта. - М.: МГУ 1111 -ИВиВ «Магарач».- 2001. - С. 45-46.

3) Жолудева М В, Мартыненко Н Н., Колесник И.М., Кремлев Е.П. Исследования новых штаммов дрожжей для плодово-ягодного виноделия // В сб. «Актуальные вопросы пищевой промышленности».- М.: МГУПП.- 2003.- Вып. 1. - С. 67-69.

4) Мартыненко Н.Н., Жолудева М.В, Шипачев Е.С, Грачева И.М. Исследование новых культур дрожжей для вторичного виноделия // В сб. «Актуальные вопросы пищевой промышленности».- М.: МГУПП.- 2003.- Вып. 1. - С. 69-72.

5) Коновалова Е.Ю., Мартыненко Н.Н., Колесник И.М., Жолудева М.В. Штамм дрожжей Saccharomyces еегеу1$тв ВКПМ Y-3097 для производства вин из ягод малины. Заявка на получение патента РФ № 2003132293 от 5.11.03 г.

6) Мартыненко Н.Н., Жолудева М.В., Грачева И.М., Колесник И.М. Поиск перспективных штаммов дрожжей для плодово-ягодного виноделия в Западной

Беларуси. Характеристика культур, выделенных из винограда // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья.- 2003.- № 12.- С. 91-93.

7) Жолудева М.В., Колесник И.М., Мартыненко Н.Н., Грачева И.М. Сахаромицеты из ягод черной смородины Западной Беларуси. Исследование новых штаммов для плодово-ягодного виноделия // Виноделие и виноградарство.- 2004 г.- № 3.- С. 8-13.

8) Наумова Е.С., Жолудева MB., Мартыненко Н.Н., Наумов Г.И. Молекулярная характеристика и селекция плодово-ягодных винных дрожжей Saccharomyces II Микробиология.- 2004,- Т.73.- С. 845-852.

5. Список сокращений, использованных в автореферате:

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов; п.н. - пары нуклеотидов; ПЦР - полимеразная цепная реакция; РВ - редуцирующие вещества; СВ - сухие вещества; YPD - yeast peptone dextrose broth.

Summary.

Natural antioxidants present in berry and fruit wines have attracted considerable interest all over the world because of their potential nutritional and therapeutic effects. A large amount of different fruits and berries traditionally grow through all Russian territory allows to produce a wide range of berry and fruit wines. Due to the increasing of fruit wines production, it is necessary to select new yeast strains playing the leading part in final wine quality.

The morphological and physiology-biochemical peculiarities of 13 new strains belonging to the genus Saccharomyces that were selected from yeasts-habitats of grape, black currant, red raspberry, whortleberry in West Belarus were investigated.

We used standard physiological properties, traditionally used in yeast taxonomy, for identification of new West Belarus strains and reidentification of other 19 strains, isolated from various fermentation habitats (wine- and champagne-making, spirit-making, brewing, bread baking). The results of physiological tests show that all 32 Saccharomyces strains belong to one biological specie - S. cerevisiae. Remarkably, two brewing strains that were previously identified as S. carlsbergensis and three wine strains, previously identified as S. vini, belong to the 5. cerevisiae group.

On the basis of modern molecular methods for yeast identification - polymerase chain reaction (PCR) analysis and subsequent restriction analysis of the 5,8S-ITS and NTS2-ETS rDNA regions with endonucleases Hae III, Hpa II, Alu I, Bsh N1, molecular karyotyping and Southern hybridization - five 5. cerevisiaexS. uvarum hybrids are described among 32 strains. All hybrids demonstrate the presence of one additional specific restriction pattern about 490 bp by Hae III restriction of 5.8S-ITS rDNA region, three additional restriction patterns about 620, 520, 180 bp by Alu I and one additional restriction pattern about 1300 bp by Bsh N1 digestion ofNTS2-ETS rDNA region.

We used random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis with micro satellite primer (GTG)s for UPGMA dendrogram design. West Belarus isolates screened for their fermentation characteristics. Three strains were found to recommend for apple wine production and five strains - for berry wine production. These strains ferment substrates more intensive than commercial strain, produce higher amounts of CO2 and ethanol (8,89-9,22%), higher amounts of desirable and lower amounts of undesirable volatile compounds. Low residual sugars level (0,074-0,33 g/100 cm3)

observed in the wines demonstrates high fermentation activity of these strains. The strains produce wines with higher score among all strains used during sensory evaluation.

Типография ООО «Телер» 127299 Москва, ул. Космонавта Волкова, 12 Лицензия на полиграфическую деятельность ПД № 00595

Подписано в печать 20.05.2004 г. Формат 60x90 1/16. Тираж 100 экз. Б>\ша «Снегурочка» ) печ.л. Заказ №348

НЮ 19

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жолудева, Мария Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Дрожжи рода Saccharomyces Meyen ex Reess

1.1.1. Краткая история систематики дрожжей рода Saccharomyces

1.1.2. Виды-двойники в комплексе Saccharomyces sensu stricto

1.1.3. Генетическая концепция рода дрожжей Saccharomyces

1.1.4. Идентификация дрожжевых культур

1.2. Плодово-ягодные вина

1.2.1. Классификация плодово-ягодных вин

1.2.2. Характеристика основных видов сырья для плодово-ягодного виноделия

1.2.2.1. Яблоки

1.2.2.2. Черная смородина

1.2.2.3. Малина

1.2.2.4. Черника .!.

1.2.2.5. Черноплодная рябина .:.

1.2.3. Современные тенденции производства плодово-ягодных вин и их краткая характеристика

1.3. Дрожжи для плодово-ягодного виноделия

1.3.1. Основные расы дрожжей для производства яблочных вин

1.3.2. Основные расы дрожжей для производства ягодных вин

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.2.1. Физиологические тесты

2.2.2. Молекулярная дифференциация штаммов

2.2.3. Изучение динамики бродильной активности

2.2.4. Методы анализа ароматических веществ

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ

2.3.1. Физиологическое тестирование штаммов

2.3.1.1. Видовая идентификация штаммов

2.3.1.2. Определение максимальных температур роста штаммов

2.3.2. Молекулярно-биологическое тестирование штаммов

2.3.2.1. Молекулярная дифференциация штаммов

2.3.2.2. ПЦР с микросателлитным праймером (GTG)s

2.3.2.3. Молекулярное кариотипирование

2.3.3. Изучение динамики бродильной активности

2.3.3.1. Определение скорости и глубины сбраживания субстратов

2.3.3.2. Накопление этанола

2.3.3.3. Накопление биомассы дрожжей

2.3.3.4. Результаты газохроматографического анализа виноматериалов „

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Обоснование выбора оптимальных рас дрожжей для плодово-ягодного виноделия на основе их морфологических и физиологических характеристик"

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ. По данным Департамента пищевой и перерабатывающей промышленности Минсельхозпрода РФ, объемы производства винодельческой продукции в Российской Федерации за последние годы колеблются, что связано с резким ухудшением материально-сырьевой базой всей виноградовинодельческой отрасли России. В результате политики 80-х относительно производства и потребления алкоголя и последующих, не всегда удачных, экономических преобразований винодельческие предприятия страны в последние 10 лет оказались практически без сырья. Поскольку с распадом СССР к России отошли лишь некоторые винодельческие регионы, площади виноградных насаждений по всей стране сократились на 65-70%.

Мощности винодельческих предприятий загружены лишь на 15-20% и значительная часть сырья поступает за счет импорта из зарубежья. Па сегодняшний день доля виноградного вина, произведенного из отечественного винограда, не превышает 30-40%. Взамен качественных виноградных вин предприятия предпочитают выпускать более выгодные винные напитки [Ханунов Э.Р., 1999; Оганесянц Л.А, 2001; Смирнов К.В., 2002].

В тоже время РФ обладает надежной сырьевой базой для развития промышленного производства высококачественных плодовых вин [Панасюк А.Л., 1992а].

Исследования последних лет подтвердили, что плодово-ягодные вина по своему лечебному действию не уступают лучшим красным виноградным винам благодаря высокому содержанию биологически активных веществ (витаминов, флавоноидов) [Меньшов В.А. и др., 1998; Heinonen I.M. et.al., 1998; Vuorinen Н. et.ah, 2000]. Поэтому их потребление и производство во всем мире растет с каждым годом [Bradstock N., 2003].

Особенностью сырьевой базы плодово-ягодного виноделия является то, что климатические и почвенные условия России позволяют выращивать самые разнообразные виды плодов и ягод. Главные районы выращивания плодовых культур — Северный Кавказ и Центрально-Черноземный район, где сконцентрировано более 60% площадей и валового производства плодов и ягод. Существенную роль играют также хозяйства некоторых областей Центрального и Поволжского районов. В этих четырех районах получают около 90% урожая, поступающего на переработку [Панасюк А.Д., 1992а].

Для сбраживания различных плодово-ягодных соков рекомендуется использование соответствующих рас дрожжей, например, для черносмородинового сока - раса Черносмородиновая - 5 и 7, для яблочного -Яблочная - 7, Сидровая - 101 и т.д. Так, например, наиболее популярные марки советских плодово-ягодных вин — сухие яблочные вина «Предгорное» и «Яблоневый цвет», а также оригинальные яблочные вина с хересными тонами марки «Янтарное», наряду с внедрением новых технологических приемов, были созданы именно благодаря применению новейших рас дрожжей [МехузлаН.А. и др., 1984; Панасюк A.JL, 1991].

Сейчас для производства плодово-ягодных вин в России и в других странах СНГ используется довольно ограниченный перечень рас дрожжей [Деменков А.П. и др., 1998], выделенных еще в конце 30-х годов и уже не отвечающих тем требованиям, которые предъявляют к ним современные технологии -скорость и полнота брожения, органолептические свойства и т.д.

Однако, в последние 20-30 лет поиск новых рас для плодово-ягодного виноделия практически не проводился, а за рубежом, за редким исключением

Польша, Германия), совершенно отсутствуют специализированные расы дрожжей для плодово-ягодного виноделия.

Поэтому, в настоящее время назрела необходимость поиска новых рас дрожжей для производства яблочных и ягодных вин. В этой связи особого внимания заслуживает работа, которая совсем недавно была проведена в этом направлении в Беларуси, где из различных ягод было выделено свыше 500 штаммов дрожжей рода Saccharomyces, для сбраживания плодово-ягодных соков [Колесник И.М. и др., 2004].

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основная цель диссертационной работы состоит в изучении физиолого-биохимических, молекулярных и технологических свойств 32 штаммов дрожжей рода Saccharomyces различного происхождения с позиции их использования в отраслях бродильных производств (первичном и вторичном виноградном и плодово-ягодном виноделии, шампанском и спиртовом производстве, пивоварении и хлебопечении) и селекции новых наиболее перспективных рас для плодово-ягодного виноделия.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) Определение и описание морфологических и физиолого-биохимических характеристик дрожжевых штаммов, выделенных из плодового и ягодного сырья.

6) Определение основных физико-химических характеристик получаемых виноматериалов.

7) Характеристика суммы метаболитов при анаэробном способе жизни дрожжей.

9) Проведение сравнительных производственных испытаний отобранных штаммов для плодово-ягодного виноделия.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ:

1) Изучены морфологические и физиолого-биохимические характеристики изучаемых штаммов дрожжей. На основании стандартных физиологических тестов установлено, что все изучаемые дрожжевые штаммы принадлежат к одному биологическому виду Saccharomyces cerevisiae, хотя и отличаются между собой по ряду признаков, обозначенных в определителе как вариабельные.

4) Проведена дифференциация штаммов современными молекулярно-биологическими методами анализа генома с применением техники ПЦР-анализа, молекулярного кариотипирования и Саузерн-гибридизации. Показано, что пять культур, идентифицированных по физиологическим тестам как S. cerevisiae, являются межвидовыми гибридами S. cerevisiaex S. uvarum.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ:

3) Среди культур, идентифицированных ранее как S. cerevisiae, обнаружены межвидовые гибриды £ cerevisiaex S. uvarum.

5) Проведено депонирование пяти отобранных плодово-ягодных штаммов во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). Штаммам присвоены следующие коллекционные номера: ДЧК-1 — ВКПМ Y-3096, ГМ-8 - ВКПМ Y-3097, ГВ-4 - ВКПМ Y-3098, ВЧР-3 - ВКПМ Y-3099, ГСЧ-1-ВКПМУ-3100.

6) Подана заявка на получение патента на штамм S. cerevisiae ВКПМ Y-3097 для производства вин из ягод малины.

7) Проведены заводские испытания плодово-ягодных культур дрожжей в филиале «Винзавода «Ключ жизни» ОАО «Бахус» г. Елец Липецкой области. Испытания показали, что исследуемые дрожжевые штаммы обеспечивают получение виноматериалов с более благоприятными органолептическими свойствами по сравнению с контролем. Виноматериалы отличались более насыщенным Цветом, ярко выраженным сортовым ароматом и обладали гармоничным и мягким вкусом. Расы отличаются высокими технологическими показателями, позволяют интенсифицировать процесс брожения, обеспечивая получение высококачественных виноматериалов. Расы рекомендованы для использования на предприятиях плодового виноделия. Результаты испытания подтверждены Актом из филиала «Винзавода «Ключ жизни» ОАО «Бахус» г: Елец Липецкой области.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:

Основные положения работы докладывались на международных конференциях: Международной конференции молодых ученых «Молодые ученые - пищевым и перерабатывающим отраслям АПК (технологические аспекты производства)» (Москва, 2000 г.) и П Международной научно-практической конференции «Качество, безопасность и экология пищевых продуктов и производств. Прогресс в области агроиндустрии» (Ялта, 2001 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 5 статей в сборнике «Актуальные вопросы пищевой промышленности», в научно-производственных журналах «Виноделие и виноградарство», «Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья», в журнале «Микробиология». Проведено депонирование 5 штаммов дрожжей в ВКПМ, подана заявка на получение патента РФ. и

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Жолудева, Мария Валерьевна

1. в результате описания основных морфологических характеристик исследуемых штаммов дрожжей определены средние размеры дрожжевых клеток - (4,2-4,8)х(3-5) мкм, отмечено разностороннее почкование, примитивный псевдомицелий (отсутствие истинного

мицелия), способность образовывать аски с 1-4 круглыми аскоспорами.Выяснено, что в жидкой среде культуры образуют белый мягкий осадок и слабое кольцо на поверхности. На твердой среде штрих сплошной с ровными краями, размер гигантской колонии округлой формы - 20,0-30,0 мкм. На основании морфологических признаков относим исследуемые штаммы дрожжей к роду Saccharomyces.2. Видовую принадлежность исследуемых пггаммов дрожжей определяли на основании стандартных физиологических тестов по определителю [Vaughan-Martini А. et. al., 1998]. На основании способности к сбраживанию сахароз и ассимиляции углеводов «пестрого ряда» новые белорусские штаммы отнесены к биологическому виду S. cerevisiae. При этом у всех 13 штаммов наблюдаются некоторые отклонения от стандартного описания вида, т.к. они, хотя и слабо, но ассимилировали лизин, что, вероятно, говорргг о формировании экотипа. Кроме того, имеются и индивидуальные отклонения. Так, штамм ВВ-2, выделенный с ягод винограда, способен использовать в качестве единственного источника углерода а-метил-В-глюкозид и этиламин; черносмородиновый штамм ГСЧ-1 - а-метил-О-глюкозид и сорбит; малиновые штаммы ГМ-15 и ГМ-17 - глицерин. Проведенная реидентификация остальных 19 культур подтвердила принадлежность плодово-ягодных, шампанских, спиртовых и хлебных рас дрожжей к биологическому виду S. cerevisiae. Пивные штаммы П-148 и Испанская ХП, идентифицированные ранее как S. carlsbergensis, и винные штаммы

47-К, Феодосия 1-19, Кокур-3, идентифицированные как 5. v/w, также отнесены к биологическому виду S. cerevisiae.3. Определены максимальные температуры роста исследуемых дрожжей и установлено, что наиболее термостабильными являются спиртовые расы ГСЧ-1, ГСЧ-5, ГМ-17, шампанская раса Штейнберг-92, пивная П-148 и хлебная 125. Самая низкая температура роста 35-37*'С отмечается у шампанских рас Корнет, Харьковская-39, Шампанская 11/12.Максимальные температуры роста остальных 17 штаммов лежат в диапазоне 44-46*'С. Следовательно, белорусские штаммы обладают достаточно высокой термостабильностью, поскольку максимальные температуры роста штаммов - 44-49"'С - позволяют их дальнейшее использование для получения препаратов активных сухих винных дрожжей (АСВД).4. На основании ПЦР-анализа подтверждены принадлежность изучаемых штаммов дрожжей к роду Saccharomyces. ПДРФ-анализ 5.8S- и NTS2-

ETS- фрагментов рДНК и молекулярное кариотипирование с последующей Саузерн-гибридизацией хромосомной ДНК выявил наличие пяти межвидовых гибридов среди 32 штаммов. В результате штаммы ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11, Шампанская 11/12, Л-80-4 идентифицированы как межвидовые гибриды S. cerevisiaexS. uvarum и подтверждена принадлежность остальных 27 дрожжевых штаммов к биологическому виду S. cerevisiae. Бескорневое филогенетическое дерево, отражающее генетическое родство исследуемых дрожжей, построенное на основании результатов ПЦР с микросателлитным праймером (GTG)5, выявило наличие двух ярко выраженных групп относительно внешней группы S. uvarum ВКМ Y-1146.5. Изз^ена динамика сбраживания яблочного сусла и плодово-ягодных соков сахаристостью 16,0 г/100 см'. В качестве контрольной выбрана раса Яблочная-7. Установлено, что исследуемые штаммы активно сбраживают оба субстрата, однако при брожении на спещ1фических субстратах накапливают больше углекислоты за более короткий период.Яблочное сусло полностью сбраживается за период 15-30 суток, соки — за

10-30 суток.6.. В полученных виноматериалах методами, принятыми на предприятиях винодельческой промышленности, определялись следующие физико химические показатели: содержание спирта, массовые концентрации остаточных Сахаров и остаточного экстракта, титруемые кислоты, активная кислотность, велся подсчет клеток дрожжей. В яблочных виноматериалах штаммы накапливают от 7,54% до 9,21 % об. спирта, в ягодных - 7,08-9,31% об. По содержанию остаточных Сахаров, остаточного экстракта и титруемых кислот виноматериалы соответствуют требованиям ГОСТ 51146-98 «Виноматериалы плодовые сброженные и сброженно спиртованные. Технические условия».7. Проведенный анализ ароматических компонентов виноматериалов методами газовой хроматографии выявил, что их содержание , главным образом, зависит от расы дрожжей и используемого субстрата и слабо коррелирует с накоплением основных метаболитов и биомассы дрожжей.8. На основании результатов длительности полного сбраживания субстратов, количества образовавшегося спирта с единицы субстрата, анализа физико-химических свойств виноматериалов, соотношения желательных/нежелательных вторичных метаболитов, а также дегустационной оценки виноматериалов наибольший интерес для получения яблочных вин имеют штаммы ГВ-4, ГСЧ-1 и ГМ-8, для получения виноградных вин - штамм ВВ-2, черносмородиновых — ГСЧ 11, малиновых - ГМ-8, черничных - ДЧК-1, черноплоднорябиновых -

ВЧР-3.9. Проведены сравнительные заводские испытания рас дрожжей ГВ-4 (ВКПМ Y-3098) и ГСЧ (ВКПМ Y-3100) для получения плодовых вин на ОАО «Бахус» филиал «Винзавод «Ключ жизни» (г.Елец, Липецкая

область). Результаты испытаний показали, что данные расы отличаются высокими технологическими показателями, позволяют интенсифицировать процесс брожения, обеспечивают получение высококачественных виноматериалов, которые по органолептическим свойствам и дегустационной оценке превосходят виноматериалы, полученные с использованием кон1рольной заводской расы Яблочная-7, и, безусловно, могут быть рекомендованы для использования на предприятиях плодового виноделия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жолудева, Мария Валерьевна, Москва

1. ГОСТ 7208-92. Вина виноградные и виноматериалы виноградные обработанные. Общие технические условия.

2. ГОСТ 12280-75. Вина и виноматериалы, коньяки и коньячные спирты. Метод определения содержания альдегидов.

3. ГОСТ 13191-73. Вина, виноматериалы, коньяки и коньячные спирты, соки плодово-ягодные спиртованные. Методы определения содержания этилового спирта.

4. ГОСТ 13192-73. Вина, виноматериалы и коньяки. Метод определения Сахаров.

5. ГОСТ 14136-75. Вина и виноматериалы, коньяки и коньячные спирты, соки плодово-ягодные спиртованные. Метод определения относительной плотности.

6. ГОСТ 14251-75^ Вина и виноматериалы. Метод определения приведенного экстракта.

7. ГОСТ 14252-73. Вина и виноматериалы, соки плодово-ягодные спиртованные. Методы определения титруемых кислот.

8. ГОСТ 28616-90. Вина плодовые. Общие технические условия.

9. Берри Д. Биология дрожжей: Пер. с англ. - М.: Мир, 1985. - 96 с , ил.

10. З.Болотов ВМ. Новые способы получения антопиановых красителей из аронии черноплодной. // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья.- 1999-. № 8.- 53-56.

11. Булат А., Мироненко Н.В. Идентификащм грибов и анализ их генетической изменчивости методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с геноспецифичными и неспецифичными праймерами. // Генегика.- 1996.- Т.32, № 2.- 165-183.

12. Бурьян Н.И. Микробиология виноделия. — Ялта: ИВиВ «Магарач» Украинской академии наук, 1997. - 432 с.

13. Бурьян Н.И., Киипсовская А., Скорикова Т.К., Тюрина Л.В. Роль коллекционных чистых культур в втюделии. // Виноград и вино России.-1997.-№4.-С. 13-18.

14. Бускене Л. Основные биологические и хозяйственные признаки и свойства сортов малины. // Итоги и перспективы ягодоводства.- Минск, 1999. 27-31.

15. Вечер А.С., Василькевич СИ., Юрченко Л.А. Фенотипы дрожжей рода Saccharomyces, используемых в производстве плодово-ягодных вин Белоруссии. // Виноделие и виноградарство СССР.- 1976а.- № 6.-С. 27-28.

16. Вечер А.С, Юрченко Л.А. Сидры и яблочные игристые вина. (Химия и технология): М.: Пищевая промышленность, 19766. - 119 с.

17. Витковский В.Л. Плодовые растения мира. - СПб.: Изд-во «Лань», 2003. - 592 с.

18. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. - М.: Мир, 2002. - 94-98.

19. Годес Е.З., Мехузла Н.А., Панасюк А.Л. Плодово-ягодное виноделие в системе Госкомвинпрома РСФСР. // Виноделие и виноградарство СССР.-1982.-№5.-С.15-18.

20. Голомшток М.М., Шапиро Д.К. Сорта плодовых и ягодных культур Белоруссии как сырье для виноделия. // Виноделие и виноградарство СССР.- 1962.-№ 8.- 21-23.

21. Горун Е.Г. Переработка черноплодной рябггаы в консервной промышленности. - М.: ВНИИТЭИагропром, 1990. - 23 с.

22. Гудковский В.А. Антиокислительные (целебные) свойства плодов и ягод и прогрессивные методы их хранения. // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья.- 2001.- № 4.- 13-19.

23. Гулямова Н.Х., Мавлани М.И. Яблочное вино на новых местных расах дрожжей. // Виноделие и виноградарство СССР.- 1983- № 1.- 20-21.

24. Дрбоглав Е.С., Арутюнян Л.Г. Новые технологические приемы улучшения качества плодово-ягодных вин. - М.: Пищепромиздат, 1984. -35 с.

25. Иванова Е.В., Кишковская А., Бурьян Н.И., Пикарь Н.А., Зинькевич Э.Л. Сравнительная оценка морфологических свойств промышленных рас дрожжей из коллекции ИВиВ «Магарач». // Виноград и вино России.-2000.-№6.-С. 46-48.

26. Иванова Л.В. Домашнее виноделие. - Смоленск: Русич, 2000. - 416 с.

27. Красильников Н.А. Дрожжи. В кн.: Определитель низших растений (под ред. Л.И. Курсанова). - М., 1954.- Т.З.- 102-148.

28. Крючков В.И., Киричков А.Е. Производство столового плодово-ягодного вина в домашних условиях.- 1999.- Вып. 1.- 256-65.

29. Кудрявцев В.И. Систематика дрожжей. - М.: АН СССР, 1954.- 524 с.

30. Кудрявцев В.И. Kaiaie виды сахаромицетов наиболее пригодны в виноделии. // Виноделие и виноградарство СССР.- 1956.- № 4.- 17-18.

31. Кз^инов Е.П., Жидехина Т.В. Смородина. - Харьков: Фолио, 2003. - 255 с.

32. Литовченко А.М., Тюрин СТ. Справочник по плодово-ягодному виноделию. - Днепропетровск: Сич, 20026. - 510 с.

33. Мавлани М.В., Гулямова Н.Х., Кадьфов Ф.М., Максудов А.С. Штамм дрожжей Уз-Яс-1, используемый для сбраживания яблочного сока. // А.с. СССР№ 661015- 1977а.-БИ. № 17.

34. Мавлани М.В., Гулямова Н.Х., Кадыров Ф.М., Рахматуллаев Х.Р. Штамм дрожжей Уз-Яс-158, используемый для сбраживания яблочного сока при 30-32Х. // А.С. СССР № 661016.- 19776- БИ. № 17.

35. Маниатис Т. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ./ Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.- М.: Мир, 1984.-С. 344-350.

36. Макаров В.И., Конобеев С М . Получение вин и других продуктов из плодов и ягод в индивидуальных хозяйствах. - М.: Мир, 1996. - 350 с,

37. Мельникова В.А. Современные представления о физиологическом состоянии микроорганизмов и критериях его оценки / Микробиологические аспекты иммунобиотехнологии: Современное состояние, проблемы, перспективы. - М.: 1992. - С 11-16.

38. МеньшоБ В.А., Шишкина Л.Н. Проблема рациональной технологии приготовления плодовых вин на основе облепихи. // Виноград и вино России.- 1998.- № 5.- С 21- 24.

39. Мехузла Н.А., Панасюк А.Л. Плодово-ягодные вина, - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. - 240 с.

40. Могилевский Н.К. Плодовое и ягодное виноделие. - М.: Пищепромиздат, 1970.- 179 с. IS8

41. Мюллис Кэри Б. Необычная история о том, как родилась полимеразная цепная реакция. // В мире науки.- 1990.- № 6.- 26-34.

42. Настюков AM. Чистые культуры дрожжей в виноделии. - М.: «Вестник промышленности», 1976. - 420 с.

43. Наумов Г.И. Дифференциация генофонда культурных дрожжей Saccharomyces: восемь групп культиваров. // Доклад АН СССР.- 1989.-Т.306.-С. 1253-1256.

44. Наумов Г.И. Естественное разнообразие дрожжей - неисчерпаемый генофонд для фундаментальных и прикладных исследований. // Успехи современной биологии.-1997.- Вып. 2.- Т. 117- 185-195.

45. Наумов Г.И. Дивергентная популяция дрожжей Saccharomyces paradoxus на Гавайах: вид in statu nascendi. // Доклад АН.- 1999.- Т. 364, № 2.-С. 281-283.

46. Наумов Г.И. Новая разновидность Saccharomyces bayanus var. Uvarum comb, nov., установленная генетическим анализом. // Микробиология.-2000.- Т. 69, № 3.- 410-414.

47. Наумов Г.И., Наумова Е.С, Саришвили Н.Г., Хорошилова В.Г., Черников Г.В. Создание генетических линий шампанских штаммов Saccharomyces cerevisiae. II Доклады ВАСХНИЛ.- 1990.- № 5 - С 39-41.

48. Наумов Г.И., Газдиев Д.О., Наумова Е.С Обнарз^жение биологического вида Saccharomyces bayanus в Дальневосточной Азии. // Микробиология.-2003.- Т.72, № 6.- С 834-839.

49. Наумова Е.С, Наумов Г.И., Корхола М. Молекулярные кариотипы различных генетических линий дрожжей Saccharomyces cerevisiae. II Биотехнология.- 1993а.- № 4.- С 2-5.

50. Панасюк А.Л. Производство плодовых вин в России. // Виноград и вино России.- 1992а.-№ 1.- С 23-26.

51. Панасюк А.Л. О производстве яблочного бренди (кальвадоса) в России. // Виноград и вино России.- 19926.- № 6.- 12-14.

52. Парагульнов О.Д., Оганесянц Л.А. Новый способ производства плодово- ягодных вин. // Виноделие и виноградарство СССР.- 19846.- № 4.-С. 8-10.

53. Писарницкий А.Ф. Образование высших спиртов в яблочных винах. // Виноделие и виноградарство СССР.- 1971- № 3.- 24-25.

54. Попова Е.М. Использование ягод Севера. // Биохимия виноделия.- М.: Изд-во АН СССР, 1947а.- Сборник 1.- 182-196.

55. Попова Е.М. К вопросу о морфолого-физиологических особенностях Schizosaccharomyces Mosquensis (Moscovia). II Биохимия виноделия.- М.: Изд-во АН СССР, 19476.- Сборник 1.- 127-133.

56. Причко Т.Г., Скорикова Ю.Г. Сортоотбор яблок для сокового производства. // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья.-1995.-№1.-0.22-24.

57. Раз)^аев B.C. Биоинженерия виноделия. - М.: Пищепромиздат, 1985. - 24 с.

58. Родионова СВ. Домашнее виноделие. Делайте это правильно.- М.: Мир, 1998.-265 с.

59. Родопуло А.К. Биохимия виноделия. - М.: Пищевая промышленность, 1971.-373 с.

60. Саришвили Н.Г., Рейтблат Б.Б. Микробиологические основы технологии шампанизации вина. — М.: Пищевая промышленность, 2000. - 364 с.

61. Сарз^анян Ф.Г. Микрофлора основных бродильных производств Армянской ССР. - Ереван: Изд-во АН АрмССР, 1960. - 308 с.

62. Сборник технологических инструкций, правил и нормативных. материалов по винодельческой промышленности. (Мероприятия по улучшению качества вина). Под ред. д-ра техн. наук, проф. Г.Г. Валуйко. - М.: Агропромиздат, 1985.- 512 с.

63. Седов Е.Н. Яблоня. - Харьков: Фолио, 2002,-320 с.

64. Смирнов К.В. Виноградарство и виноделие - состояние, тенденции развития.7/ Виноделие и виноградарство.- 2002.- № 5.- 4-6.

65. Тюрина Л.В. Изучение дрожжевой флоры виноматериалов Закарпатской области УССР и отбор лучших рас // Труды ВНИИВиВ «Магарач».-1962.-Т. XI.-С. 44-62.

66. Федорычева Н.А. Биохимическая оценка сортов смородины в условиях Ульяновской области. // Сборник научных трудов Ульяновского НИИСХ. -2001.-Т. 15.-С. 68-73.

67. Ханунов Э.Р. Виноделие и виноградарство России в период рыночных- преобразований. // Пищевая промышленность.- 1999.- № 5.- 25.

68. Ховренко М.А. Применение чистых культур в виноделии. - Одесса, 1989.- 670 с.

69. Церевитинов Ф.В. Основы плодового и ягодного виноделия. - М.: Печатная СП. Яковлева, 1906. - 235 с.

70. Эбешвили Н.В., Беридзе Г.И., Мехузла Н.А., Писарницкий А.Ф. Влияние температуры брожения яблочного сока на легколетучие вешества сидра. // Виноделие и виноградарство СССР.- 1972- № 3.- 25-26.

71. Юрченко Л.А. Биохимия яблочного виноделия. — Минск: Наука и техника, 1983. - 167 с.

72. Amerine М.А., Kmikee R. Е. Microbiology of winemaking. // Ann. Rev. Microbiol.- 1968.- V. 22.- P. 323-358.

73. Antonelli A., Castellan L., Zambonelli C , Camacini A. Yeast influence on volatile composition of wines. // J. Agric. Food Chem.- 1999.- V. 47-P. 1139-1144.

74. Arx von J. A., Mirinda de R. L., Smith M. Т., Yarrow D. The genera of yeast and yeast-like fungi. // Stud. Micol.- 1977.- № 14.- P. 1-42.

75. Bradstock N. Cider, perry and fruit wines. // Fruit Proc- 2003.- № 3 - P. 178- 182.

76. Bowen J.F., Beech F.W. The distribution of yeasts on cider apples. // J. Appl. Bacteriol.- 1964.- V. 27, № 2.- P. 333-341.

77. Buchter-Weisbrod Н. Mineralstoffe pur die Himbeere. // Fluss. Obst.- 2001.- B. 68, №6.-8.320-321.

78. Caetano-AnoUes G., Bassam B. J., Gresshoff P.M. DNA amplification fingeфrinting using very short arbitrary oligonucleotide primers. // Bio. Technology.- 1991.- V.9.- P. 553-557.

79. Capshew B. Perry - the other cider. // Zymyrgy.- 2001.- № 6.- P. 36-39.

80. Carr J. G. Yeasts. In: Aroma and flavor in winemaking. - London: Mills & Boon Ltd., 1974.-P. 39-49. lOS.Dettweiler G., Berger R., Drawert F. Herstellung von Apfelsaft mit hoher Aromaqualitat.//Fluss.Obst.- 1992.-B. 59,№ 12-S. 722-726.

81. Fulleki Т., Pelayo E., Palabay R. Carboxylic acid composition of varietal juices from fi-esh and stored apples. // J. Agric. Food Chem.- 1995- V. 43, №7.-P. 598-607.

82. Gainvors A, Karam N., Lewuart C , Belerbi A. Use o^ Saccharomyces cerevisiae for the clarification of fruit juices. // Biotechnol. Lett.- 1994.- V. 16, №12-P . 1329-1334.

83. Gillian M, H., Fleet G. H. Growth of natural yeast flora during the fermentation of inoculated wines. // Appl. Environ. Microbiol.- 1985.- V. 50, № 3 - P . 727-28.

84. Gorgens M., Entrop A. Kalkulationen zum Heidelbeeranbau. // Obstbau.- 2000.- B. 25, № 12.- S. 668-672.

85. Heinonen I. M., Lehtonen P. J., Hopia A. L Antioxidant activity of berry and finit wines and liquors. // J. Agric. Food Chem.- 1998.- V. 46.- P. 25-31.

86. Henick-Kling Th. Yeast and bacterial control in winemaking. In: Modem methods of plant analysis. Vol. 6: Wine analysis. Ed. By H. F. Linskens and J. F. Jacbon, 1988.- P. 276-294.

87. Herrero M., Cuesta I., Garcia L., Diaz M. Changes in organic acids during malolactic fermentation at different temperatures in yeast-fermented apple juice. // J. Inst. Brew.- 1999a.- V. 105, № 3.- P. 191-195.

88. Herrero M., Garcia L., Diaz M. Organic acids in cider with simultaneous inoculation of yeast and malolactic bacteria: effect of different temperatures. // J. Inst. Brew.- 1999b.- V. 105, № 4.- P. 229-232.

89. Herrmann К. Uber die Gehalte der hauptsachlichen Pflanzenphenole im Obst. // Fluss. Obst- 1992.- B. 59, № 2.- S. 66-70.

90. Herrmann K. InhaltsstofFel der Apfel. // bid. Obst Gemuseverw.- 1998.- B. 83, №8.-8.234-241.

91. Herrmann K, Ubersicht uber die Aromastoffe von Apfeln. // bid. Obst Gemuseverw.- 1999.- B. 84, № 4 - S. 106-110.

92. International code of nomenclature of cultivated plants. Formulated and adopted by the International commission for the nomenclature of cultivated plants of the I.U.B.S. Regnum Vegetabile.- 1980.- V.104.- 32 p.

93. International code of botanical nomenclature. Adopted by the XIII Intern. Bot. Congr. Regnum Vegetabile.- 1983.- V.l l l . - 472 p.

94. Iversen C.K. Black currant nectar: effects of processing and storage on anthocyanin and ascorbic acid content. // J. Food Sci.- 1999.- V. 64, № 1. -P. 37-41.

95. James S. A., Collins M. D., Roberts I. N. Use of an rRNA internal transcribed spacer region to distinguish phylogenetically closely related species of the genera Zygosaccharomyces and Torulaspora. II Int. J. Syst. Bacreriol.- 1996.-V.46.-РЛ 89-194.

96. Joshi V.K., Sandhu D.K. Influence of juice content on quality of apple wine prepared from apple juice concentrate. // Res. Ind.- 1994.- V. 39, № 4.- P. 250-252.

97. Joshi V.K., Sandhu D.K. Quality evaluation of naturally fermented alcoholic beverages, microbiological examination of source of fermentation and ethanol productivity of the isolates. // Acta Aliment.- 2000.- V. 29, № 4.- P. 323-334.

98. Lea A.G. Saftzusammensetzung und die Einfluss auf die Cider-Qualitat. // Fluss. Obst. 1989.- B. 56, № 12.- S. 744-750.

99. Leguerinel I., Mafrat P., Cleret J., Bourgeois C. Yeast strains and kinetic aspects of the formation of flavor components in cider. // J. Inst. Brew.- 1989.-V. 95, №6.-P. 405-409.

100. Lehmann H. Aroniabeere imd ihre Verarbeitung. // Fluss. Obst.- 1990.- B. 57, № 11.-S. 746-752.

101. Leino M., Kallo H. Volatile compounds of blackcurrant juice and wine. // Z. f 1.ebensm. Unters. Forsch.- 1993.- V. 196.- P. 410-414.

102. Lopez M., Lavilla M., Riba M., Vendrell M. Comparison of volatile compounds in two season apples: Golden Delicious and Granny Smith. // J. Food Qual.- 1998.- V. 21.- P. 154-166.

103. Michel A , Bizeau C , Drilleau J.-F. Flore levurienne presente dans les cidreries de I'ouest de la France. // Sci. Aliment.- 1988.- V. 8.- P. 359-368.

104. Michel A., Bizeau C , Drilleau J.-F. Relations metaboluques entre levures impliquees dans la fermentation du cidre. // Belg. J. Food Chem. Biotechn.-1990.- V. 45, № 3.- P. 98-104.

105. Modi D.R., Garg S. K., Johri B.N. Comparative behavior of yeast strains for ethanolic fermentation of culled apple juice. // Indian J. Exp. Biol.. 1998.-V. 36, №7.-P. 728-731.

106. Mullis К. В., F. Ferre, Gibbs R, A. The polymerase chain reaction. - Boston: Birkhauser, 1994.

107. Naumov G. I. Genetic identification of biological species in the Saccharomyces sensu stricto complex. // J. Ind. Microbiol.- 1996.- V.17.-P. 295-302.

108. Naumov G. I., Naumova E. S., Azbukina Z. M., Korhola M., Gaillardin С Genetic and karyotypic identification of Saccharomyces yeasts from Far East Asia. // Crypt. Micol.- 1993.- V.14.- P. 85-93.

109. Naumov G. I., Naumova E. S., Sniegowski P. D. Differentiation of European and Far East Asian populations of Saccharomyces paradoxus by allozyme analysis. // Int. J. Syst. Bacteriol.- 1997b.- V. 47- P. 341-344.

110. Naumov G. I., Naumova E. S., Sniegowski P. D. Saccharomyces paradoxus and Saccharomyces cerevisiae are associated with exudates of North American oaks. // Can. J. Microbiol.- 1998.- V.44.- P. 1045-1050.

111. Naumov G. I., Masneuf I., Naumova E. S., Aigle M., Dubourdieu D. Association of Saccharomyces bayanus var. uvarum with some French wines: genetic analysis of yeast populations. // Res. Microbiol.- 2000b.- V. 151, № 8.-P. 683-691.

112. Naumov G. I., Naumova E. S., Aigle M., Masneuf I., Belarbi A. Genetic reidentification of the pectinolytic yeast strains SCPP as a Saccharomyces bayanus var. uvarum. II Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2001a.- V.55.-P. 108-111.

113. Naumov G. I., Nguyen H.-V., Naiunova E. S., Michel A., Aigle M., Gaillardin C. Genetic identification of Saccharomyces bayanus var. uvarum, a cider fermenting yeast. // Int. J. Food Microbiol- 2001b.- V. 65.- P. 163-171.

114. Naumova E. S., Naumov G. I., Molina F. I. Genetic variation among European strains of Saccharomyces paradoxus; results from DNA fingerprinting. // Syst. Appl. Microbiol.- 2000.- V.23.- P. 86-92.

115. Naumova E. S., Korshunova I. V., Jespersen L., Naumov G. I. Molecular genetic identification of Saccharomyces sensu stricto strains from African sorghum beer. // FEMS Yeast Res.- 2003.- V.3.- P. 177-184.

116. Nguyen H.-V., Caggia C , Giudia P., Rainieri S., Zambonelli C. Saccharomyces nvarum, a proper species within Saccharomyces sensu stricto. // FEMS Microbiol. Lett.- 2000a.- V. 192.- P. 191-196.

117. Parish M. E., D. E. Carroll. Fermentation characteristics of Saccharomyces cerevisiae isolates from Vitis rotundifolia grapes and musts. // Am. J. Enol. Vitic- 1987- V. 38,№ 1.-P.45-48.

118. Poll L. Influence of storage time and temperature on sensory quality of single-variety apple juice. // Lebens. Wissensch, Technol.- 1983b.- V. 16.-P. 215-219.

119. Rankine B.C. Progress in selection and utilization of pure yeast strains in winemaking. // Ann. Technol. Agric- 1978.- V. 27.- P. 189-200.

120. Reed G. and T. W. Nagodawithana. Technology of yeast usage in winemaking. // Am. J. Enol. Vitic- 1988.- V. 39, № 1- P. 83-90.

121. Ribereau-Gayon P. New developments in wine microbiology. // Am. J. Enol. Vitic- 1985.-V.36,№ 1.- P. 1-10.

122. Reininger M. Der Markt fiir Apfelwein in der Bimdesrepublik Deutschland. // Fluss. Obst- 1998.- B. 65, № 10.- S. 619-625.

123. Roemer K. Das Zuckermuster verschiedener Obstarten. T. 3. Ribes-Arten {Ribes rubrum, R. nigrum, Я grossularia u.a.) Johannisbeeren und Stachelbeeren. // Erwerbsobstbau.- 1990.- B. 32, № 1.- S. 7-12.

124. Rommel A., Wrolstad R.E., Heatherbell D.A. Blackberry juice and wine: processing and storage effects on antocyanin composition, color and appearance.//J.FoodSci.- 1992.- V.57,№2-P. 385-391.

125. Salih A., Drilleau J., Cavin F., Divies C , Bourgeois C. A survey of microbiological aspects of cider making. // J. bist. Brew.- 1998.- V. 94, № 1,-P. 5-8.

126. Schobinger U. Frucht- und Gemusesafte. - Stuttgart: Ulmer, 2001. - 651 s.

127. Skrede G. Evaluation of color quality of blackcurrant fruits grown for industrial juice and syrup production. // Norw. J. Agric. Sci.- 1987.- V.l, № 1.-P. 67-74.

128. Spanos G., Wrolstaol R. E., Phenolics of apple, pear and white grape juices and their changes with processing and storage. A review. // J. Agric. Food Chem.- 1992.- V. 40, № 7.- P. 1478-1487.

129. Sponholz W.R. Alcohols derived from sugars and other sources and fuUbodiedness of wines. Inr Modem methods of plant analysis. Vol. 6: Wine analysis. Ed. By H. F. Linskens and J. F. Jackson, 1988.- P. 147-152.

130. Tcorbanov В., Mitchev G., Lazarova G., Popov D. Studies on the secondary fermentation of low-alcohol sparkling apple wine. // Am. J. Enol. Vitic- 1993.-V. 44, №1.-P. 93-98.

131. Tibor D. Culture collections, safeguards against extinction. // Nat. Res. - 1991.-V. 27, №3.- P. 30-36.

132. Toldam-Andersen T.B., Hansen P. Growth and development in black currant (Ribes nigrum). Seasonable changes in sugars, organic acids, chlorophyll and antocyanins and their possible metabolic background. // J. Hortic. Sci.- 1997.-V.72,№1.-P. 155-169.

133. Valente P., Gouveia F. C , Lemos de G. A., Pimentel D., Elsas van J. D., Mendonca-Hagler L.C., Hagler A. N. PCR amplification for differentiation of Saccharomyces cultures. // FEMS Microb. Lett.- 1996.- V. 137- P. 253-256.

134. Vaughan-Martini A., Martini A. Saccharomyces Meyen ex Reess. In: The yeast, a taxonomic study ed. by Kurtzman C.P. & Fell J.W., 4* ed., 1988.-P. 358-371.

135. Viola R., Brennan R. M., Davies H. V., Sommerville L. L-ascorbic acid accumulation in berries of Ribes nigrum L. II J. Hortic. Sci.- 2000.- V. 75, № 4.-p. 409-412.

136. Vuorinen H., Maatta K, Torronen R. Content of the flavonols, myricetin, quercetin and kaempferol in Finnish berry wines. // J. Agric. Food Chem.-2000.- V.48, № 7.- P.2675-2680.

137. Vuuren van H.J.J. and Linda Van der Meer. Fingeфrinting of yeasts by protein electrophoresis. // Am. J. Enol. Vitic- 1987.- V. 38, № i.- p. 49-53.

138. Walt J.P. van Der. Saccharomyces Meyen emend Reess.- The yeast. A taxonomic study (Lodder J., ed.). 2"^ Ed. Amsterdam - London, 1970.-P. 555-718.

139. Welsh J., McClelland M. Fingeфrinting genomes using PCR with arbitrary primers.//Nucl. Acids Res.- 1990.-V. 18.-P. 7213-7218.

140. Williams A.A. Flavor research and the cider industry. // J. Inst. Brew.- 1974.- V. 80, №5-6.-P. 455-470.

141. Yarrow D. Genus 22. Saccharomyces Meyen ex Reess. The yeast: a taxonomic study // Ed. ICreger - van Riy N.Y.W. Amsterdam: Elsevier Sci. Publ, 1984-P. 379-395.

142. Yavas I., Rapp A. Gaschromatographisch - massenspektrometrische Untersuchungen der Aromastofife von Apfelweinen. // Fluss. Obst.- 1992.-B. 59, № 8.-S. 472-476.

Информация о работе

Жолудева, Мария Валерьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Обоснование выбора оптимальных рас дрожжей для плодово-ягодного виноделия на основе их морфологических и физиологических характеристик - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы