Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обнаружение порина в межмитохондриальных контактах в суспензии митохондрий сердца

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Обнаружение порина в межмитохондриальных контактах в суспензии митохондрий сердца"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛВДИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ т. М.В.ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи УДК 577.152.361

' ' Ь од .

КОНСТАНТИНОВА Светлана Алексеевна

ОБНАРУЖИВ ПОИЕА 3 МЕШШОХОНДРИАЛЬШХ КОНТАКТАХ В СУСПЕНЗИИ МЙТОХОВДРШ СЕРДЦА (03.00.04 - ШОХИМШ)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учекой степени кандидат биологических наук

' Москва-1994

Работа выполнена в институте Фнзико-дшической Биологии ем А.Н.Белозерского Московского Государственного Университета ш. Ы.В.Ломоносова.

■ Научшз руководители: академик РАН В.П.Скулачев

доктор биологических наук ' - . Д.Б.Зоров

I

V

Официальные доктор биологических наук,

оппонента: профессор

В.С.Ченцов

кандидат биологических наук • В.Л.Габай

Ведущая организация: Медико-генетический научный центр РАМН

Защита состоится " & " Ц-ЮМ(■§ 1894 года в ^ ' ^^ часов на заседание специализированного совета Д.053.05.32 при Московском государственном университете то адресу: 119899, г. Москва, Ленинские гори. Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " ^" 1994 года.

Ученый секретарь чспециализированного совета доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ i.I Обоснование и актуальность проблемы PaEse в раде работ было показано, что в скелетной и гердечной мускулатуре крыс /Л.2;Бакеева и др., 1977,- 1982/, а- также в сперматозоидах вытянутые митохондрии образуют cjoshjb сеть, охватыващую почти весь объем клетки. Ври этом коэдеше части глстсхоздргй длотз стыкованы друг с другом и образуют два типа контактов. В одном иг которых на ультратонких срезах удэета видеть четыре штохоЕдргальные мембраны, например, в сперматозоидах (Д.Б.Зоров и др., 1990). Другой тип контактов предстэвлжт собой электропноплотную зону в местах сближения митохондрн! (диски диаметром 0,1-1 мкм), в которой внешние мембраны двух мзгохондрэй тесно примыкают друг к другу, а ыежмембранное пространство заполнено ОСМИОфИЛЬНЫМ веществом (L.E.Bakeeva et al., 1983; A.A Amchsnkova et al., 1988). Вопрос о функциональной рола митохондаального ретикулума, а также роет межмитоховдриальных контактов в значительной степени остается открытым. Высказано предашюлзние (В.П. Скулачев, 1969,- skulachev, 1972), согласно которому ретскулум эбеспечивает быструю доставку энергии в форме электрического ютещиала к местам es потребления в клетке от источников субстратов жисления (например - жировых капель). Тем самым, можно Оию -бы, 1реодолеть ограничения дшйузиозного барьера, который не позволяет Юеспечить быстрый траЕспсрт АТФ на большие расстояния в масштабе ¡лотки. В этой связи, В.П.Скулачев приписал китохондриалшог сети ¡оль проводящего "электрического кабеля", в рамках такой гипотезы ¡ешгтохондриэльЕые контакты должны обеспечивать элелзргческул роводшлость, которая объединяет стыкованные митохондрии з единую рсводящую сеть. В ряде работ (А.А.Амчегкоза и др., 193. I9S8; .к.Amchsnkova et ai., is88) было .экспериментально доказано

существование такой проводимости на примере митохондриальных кластеров кардиомшцитов. Механизм этой проводимости остается не исслгдованш.

1.2 Цель и задачи исследования В широком плане згдача настоящей работы сводилась к попытке получить информации о молекулярном механизме, регулирующем проницаемость меямнтохондриальшх контактов. Молекулярный мехашзм, обеспечиващий • электрическую проводимость, остается неизвестным. Сложность состоит в том, что в зоне тесного сближения митохоидрий долаен организоваться цроводяшй канал, шунтируюазй четыре митохондриальные мембраны. Известно, что конная проводаость через' внешнюю кизохоедщзльеув" мембрану обеспечивается хорошо изученным белком - порином, который специфически концентрируется в участках контактов внешней и внутренней митохондриальных мембран. По данным М.Г.Тнховой е соавторов (М.Г.Тихова и др., 1988), меаштохондрпальные контакты нарушается в условиях, цри которых происходит разрушение контактов нзвду внешей и внутренней ыитохондаиальными мембранами (при набухании ыенмзыбранного пространства). Эти наблюдения, а также рад других соображений позволили В.П.Скулачеву предположить, что порин присутствует не только в меамембранных контактах в рамках одной митохондрии, но и в контактах между дзумя стыкованными митохондршш. Конкретная цель настоящей работы состояла в том, чтобы обнаружить порин в зонах меамитохондриальных контактов. Для этого была использованы моноклональные антитела к и-кощевому участку трала. Кроме того, во второй части работы, чтобы продемонстрировать тесное взаимодействие горина с внутренней митохондриажьной мембраной, была сделана попытка обнаружить фракции порша прочно связанного с внутренней мзмбраной. Работу проводили на суспензии изолированных митохондрий сердца, а также на

субмитохондриальшх частицах (СМЧ), полученных из МЕТолидрий сердца.

1.з Научная новизна работы С влаощыэ злектрснноа микроскопии с использованием белка А, связанного с коловдным золотом, изучено взаимодействие моеоклонзльеых антятел к я-концезому фрагменту порина со свегеЕыделенными нетаксированными штохондршиз из сердца 1фысы. Установлено, что антитела Ее связывается с оствной масссй митохондрий. В то не время удалось наблюдать их взаимодействие с отдельна® ыитоховдлиягз. Бри этом на поверхности мембраны антитела группируются в кластеры трех типов: 1) одномерные нитевидные, 2) мелкие кластеры неправильной формы и з) крупные, гогрывзодие значительную часть поверхности митохондрий. В | зонах меЕмитохоЕДриальЕых контактов обнаружено связывание антител в влде нитевидных или мелких кластеров. Показано, что нитевидные кластеры антител обычно локализованы на границе нейду двумя отсеками одной и той же митохондрии, имеющей разную конфигурацию крист. Сделано заключение, что я-концевой фрагмент порина локализован на внутренней поверхности внешней мембраны митохондрий. Бзаишдействия с антителами происходит в местах повреждений внешней мембраны, которые более вероятны в зонах стыковки двух митохондрий или двух митопластов, окруженных общей внешней мембраной. Обнаружено связывание порина с мембранами очищенных СМЧ и сделано заключение о существовании фракции лоринэ, прочно связанной с внутренней мембраной митохондрий.

1.4 Теоретическое и практическое значение диссертации Полученные результаты подтверзцапт гипотезу В.П.Скулачева о присутствии шрина в меаыитохондриальных контактах. Она открывают новое направление исследований, связанное с изучением ¡¡¿элекулярных механизмов взаимодействия митохоздриальных дамбран. Разработан новый

з

метод, позволяющий идентифицировать повреждения во внешней мембране митохондрий, основанный на использовании антител к л-концевому участку тягана. Эти данные могут быть использованы при чтении курсов лекций по цитологии и биоэнергетике.

1.5 Апробация работы Основное содержание работы доложено на научных семинарах в институте Физико-Хшической Биологии им. А.Н'.Белозерского (1983, 1990, 1991 гг) и в Ныъ Иорском государственном институте здоровья (Олбани, птет НыьИорк, США, 1993 г), на международной конференции '2-0 РАСЕ'91", Лондон, 1991 г. - - ■

1.6 Публикации По материалам диссертации опубликовано 3 работы

1.7 Структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, • обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа изложена на ¡№ страницах машинописного текста,

включая сЗ. таблицы, рисунков, фотографий. Список

цитируемой литературы включает наименований.

II .МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение лжохондрий из сгубщ крысы. у Митохондрии были выделены из сердца крыс линии "Виста?" по стандартной методике. Аликвотн для иммунозлектронномикроскопических исследований брали из суспензии митохондрий (30 мг/мл), хранящихся во льду в среде следупцего состава: 70 мМ сахароза, 230 мМ маннит, о,з* бычий сывороточный альбумин (БСА), 5 мМ нерее-КОН (рн 7.4). Ияхинобмт.

а. Электрофорез и элекщхтеренос белков на нитроцеллюлозу. Восемь типов, монсжлональных антител к и-концевому участку порина "Рогл.п

зил,", использованные в работе, были любезно предоставлены проф. Ф.

Р. тиннззом (Max-Plank-Institut fur experimentelle Medizin, Abteilung Itnmunechemie, Göttinnen) . ДЛЯ Проверки .Перекрестной реакции данных антител с порином митохоедрей сердца 1срысы бкл применен иммуноблот. Белки разделяли по методу Лзишш (Laenmii и,к.., 1970) в пластинах полиакриламидного геля, приготовленных с линейикм градиентом концентраций аяриламида 7,5%-25* (míiií-protein ii ceil, "Bio- Rad"). При этом 200 мкл (5 мг белка/мл) смеси белков митохондрий наносили на 0,75 мм l-луночный гель ("Bio-Rad"). Элекгрфорез проводили при постоянном токе 6 о ma в теченЕВ 45 мин и затем разделенные белки переносили с геля на нитроцеллюлозу ("eío-Rad") в камере для переноса (Mini-Trans-Blot cell, "Bio- Rad"), При постоянном токе зоо ma в течение I ч is мин.

Для предотвращения не специфического связывания антител с белками, нитроцеллюлозу шчубировали при 32°, постоянно перемешивая, сначала зо мин в s% растворе БСА, а затем 20 мин в 3t растворе обезшренного сухого молока, приготовленных в фосфзтно - солевом буфере (ФСБ), содержащем: 137 ыМ Nací, 2,7 мМ kci, ю iäi фосфатный буфер рн 7,4. После этого нитроцеллюлозу двавда промывали в 0.1% БСА-ФСБ.

б. Инкубирование с лоноклональныяи ашшаелаш. Все последующие ступени эксперимента бшш выполнены щи комнатной температуре, при постоянном перемешивании..

Нитроцеллюлозу инкубировали с антителами в течение I ч в и«ультискрш - аппарате ("Bio-Rad"). В качестве негативного контроля использовали очищенные мышиные ige ("Sigma") в тех ев концентрациях, что и монокленальные igG. Несвязанное антитела удаляли путем трехкратного отмызания нитроцеллюлозы в растворе о,is БСА-ФБС, содержащем зоо мЫ îfeci.

с. Связывание белка А-пероксидазы с nevGumumi ашшелаш. Для

визуализации первичных антител применяли белок А, конъюгированный с

пероксидазой хрена (-sigma") в разведении 1:1000 в o,i% ЕСА-ФСБ.

Пооле-инкубаши в течёниь I ч и отмывания в o.iv БСА-ФСБ (зхю мш),

пероксидазную реакции проводили в течение 5 мин з го мл следующего

раствора: о,об% 4-хлор-i-нафтол, 2с% ызтанол, в КБ с конечной * \ добавкой во шел зо» н2о2. Затем нитроцеллюлозу ополаскивали в воде и

высушивали на воздухе.

Обуайсаш хдодокбрцЗ аиштелаха к к-кокиевояц фрагменту поугмш с последующ яечениел белках. Л, коную&яобанныл с золотая Все последующие ступени эксперимента проводила в хорошо увлажненной камэре, чтобы предупредить подсыхание препарата и тем самым предотвратить неспецифтаеское связывание антител.

В начале свежевыдзленЕые митохондрии разводили (i:2o) в ФБС, содержащем 1* БСА, затем 5-ю мкл митохондриальной суспензии наносили es 300 меш электронномикроскопические сетки (ем grade, "Poliscience, Inc.", Warrington, PA), предварительно покрытые формваром н углеродом, с которых был снят статический заряд в тлеющем разряде. Спустя 2 мин, избыток суспензии удаляли и образцы инкубировал! с юноклональными антителами N4, предварительно разведенные в iv БСА-ФСБ (конечная концентрация 1."мг/мл) в течение зо мин. Еесвязавшиеся антитела удаляли путей двух промывок (но I мин каждая) в растворе it БСА-ФСБ и образцы инкубировали в течение 20 мин с комплексом -белка А и золота (20 нм. »sigma»), разведенным (1:20) в 1* БСА-ФСБ. Свободный белок А был отмыт дважды 1% БСА-ФСБ. Образцы негативно окрашивали в 2% растворе иолибдата аммония в течение 2 шн, полностью удаляли краситель и высушивали на воздухе.

для одавки на специфического связывания igs с митохондриями параллельно в эксперименте использовали очищенные мышиные igG

б

("Sigma"), В ТОЙ Же Концентрации, ЧТО И ИЫМуННЫв IgG.

Электронная ликроскопия. Фотографирование ультратонких срезов и негативноокрашзныЕ препаратов проводили на фотопленке Kodak 4489

("Eastman-Kodak", Rochester, NY), ИСПОЛЬЗУЯ ЭЛвКТрОПНЫВ МИКРОСКОПЫ Philips ЕМ301 И ЕМ420-Т ("Philips Electronic Instrument, Inc.", Mahwah, NJ) С УСКО рЯВДИМ напряжением 80-100 kB.

Пол\1чекие сублатохондриалъных частиц. Субкитохондриальные

частицы (СМЧ) получали из сердца быка по методу Хансена и Смита

(Hansen v., Smith A.b., 1964).

Мвцлещый электрофорез проводили по методу О'Фаррзлла (j'Farreii р.н., 1975) с некоторыми модификациями. Анализируемую пробу, содержащую 500 мкг белка, вносили в лизис-буфере (9,5 М мочевина, 2%-шЯ. тритон Х-100, 9£-ннй раствор амфолинов, pi 3-10, 5^-ный раствор 2-меркаптоэтанола) с анодного конца геля для-изоэлектрофокусирования. Изоэлектрофокусирование проводили в 4-Я-ном полиакриламидном геле, содержащем 9,5 М мочевину, 2Я»-шй тритон Х-100 и 2%-ные ам|олины (смесь амфолинов, pi 5-8 и 3,5-10, в соотношении 4:1). Решим изоэлектрофокусирования: . 4 ч при 800 В, затем 2 ч при 1000 В. Полученные гели использовали в качестве стартовой зоны для фракционирования белков во втором направлении. Перед фракционированием гели первого направления вымачивали в переводном буфере, содержащем 5 М мочевину и 2,3%-ный ns-Na, в течение 10-20 мин при комнатной температуре. Фракционирование во втором направлении осуществляли по методу Лэкали.

Мшохондуиалъкый порт выделяли по методу Де Пинто и и соавторов (De Pinto V., Prezioso G., Palmieri F., 1987).

Iii.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ Было установлено, что антитела не взаимодействуют с шлактными

V

митохондриями. Связывание происходит с очень небольшой частью общего

количества митохондрий, находящихся в суспензии. Поэтому в основу методики был положен систематический скрининг препаратов митохондрай, сорбированных на гидрофобной подложке, отбор отдельна митохондрий, связывающих антитела,- и затем.классификация кластеров, которые образуют антитела на поверхности митохондрий по форме и по размерам. 'V

Опыты проводились на митохондриях сердца крысы. Изучение связывания антител к порину с митохондриями проводилось с помощью электронной микроскопии негативно окрашенных препаратов,

I г -?^ь?Рэструктура_митдхондрий. Д0_и_госла _обработга_§Етателаш Суспевзия свежевыделенных штохоцлрий содержала три морфологически различных популяции: ортодоксальные с матриксом средней электронной плотности и хорошо выраженными кристами, светлые набухшие ипохондрии (количество последних в суспензии невелико), а также мелкие конденсированные с электроннонлотным матриксом. В суспензии наблюдались пары контактирующих митохондрий. После инкубации с антителами в ФСБ, содержащем 10мМ фосфата, морфология митохондрий значительно изменяется: поверхность и грашцы штсхондрий становятся неровными, размеры их увеличиваются. В этом случае также удается идентифицировать несколько морфологически различных гжюв митохондрий. Першй тип - набухшие митохондрии с плотно упакованными кристами. Второй - митохондрии с большими растояниямн между кристами, имеющие большие полости в межмембравлом пространстве и мелкие темные митохондрии. Четкой корреляции между связыванием антител с митохондриями и описаиными выше типами ультраструктуры обнаружить не удается. Кроме того, в условиях нашего эксперимента относительно часто удается наблюдать митохондрии состоящие из двух отсеков с различной ультраструктурой крист (первого и второго типов). Предположительно, это два митопласта,

в

окруженных одной общей ензшнзй мембраной. Именно в таких редко встречающихся случаях, происходит специфическое сзязываза антител с митохондрия® в виде нитевидных кластеров. Миюзсоэдрии с гетерогенной ультраструктурой крист могут иметь различную форм;7; Овальные митохондрии, шещие один когаартмент с плотно упакованными, а другой с "рыхлыми" кристамп; объем этих' компартментов одинаковый. Грушевидные митохондрии - увеличен кошартмент с "рыхлыми" кристами и, наконец, грушевидк^з митохондрии с увеличении компартментом плотно упвкованных крист. ¡божественную индукцию неоднородностей ультраструктуры крист в составе одной митохондрии, нам удалось наблюдать в других условиях - при мягкой фжсациа суспензии митохондрий 0.2% глутаровым альдегида.

2. Особенности взаимодействия антител к к-концевоу> участку поркна с нефиксированными митохондриями.

Особенность этих экспериментов состоит в том, что связывание антител происходит с относительно малым процентом митохондрий, находящихся в суспензии. Всего было проведено 50 опытов, в 30 из них удалось наблюдать связывание антител с митохондриями, доля митохонрий, связывающих антитела колеблется между 5-105 от опыта к опыту. Нами обнаружена обратная коррелляция между количеством интактных митохондрий в суспензии и количеством митохондрий, с которыми связываются антитела. Доля интактных митохондрий определялась в параллельных опытах по скорости восстановления цитохрома с в присутствии сукцината и цианида. Бало показано, что антитела, как правило, эффективно взаимодействуют с митохондриями в тех случаях, когда степень интактности не прившала 50-70г.

Для оценки специфичности связывания использованных нами антител с порином, находящимся в составе мембран митохондрий, было проведено сопоставление связывания этих антител со связыванием

МЫШИНЫХ нвяыыунных иммуноглобулинов (IgG, Sigjia) С аНТИГвНОМ (порином) на одних и тех же препаратах митохондрий в одинаковых условиях.

Статистическая обработка данных по Стьаденту была проведена на 43 примерах в опыте (при обработке митохондрий мсноклональными

антителами) и на 27 примерах в контроле (предобработке неиммунныш ' >

мышиными igG). В обоих случаях определялось соотношение удельного связывания золота с митохондриями и с фоном. Таким' путем, была доказана специфичность -связывания антител (к порину) с митохондрия®. Коэфициент Стьюдента р«0,0001.

В настоящее время локализация N-концевого участка порина относительно внешней поверхности мембраны окончательно не установлена. В том случае, если бы м-кокец порина находился на внешней поверхности внешней мембраны, мы должны были бы наблюдать эффективное связывание антител с внешней поверхностью основной массы митохондрий. Однако наш эксперимент показал, что связывание порина с митохондрияш событие относительно редкое. На основании этих результатов сделан вывод о том, что ы-конец порина не экспонирован в цитолазму.

3. Кластеризация антител на поверхности митохондрий,-. классификация кластеров

Приведенные выше результаты говорят ~о том, что для взаимодействия порина с антителами, должны быть созданы совершенно специфике газе условия. Чтобы составить себе представление о том, какие факторы определяют взаимодействие между порином и антителами, нами был проведен систематический анализ полученных результатов. С одной стороны он включал классификацию кластеров, образованных антителами £а поверхности митохондрий по форме, с другой была установлена связь расположения кластеров различной формы с

ю

конфигурацией митохондрий, связывающих шрин и ультраструктурой митохондриальных крист. Такой анализ позволил указать наиболее вероятные условия, цри'которых в интактвых митохондриях н-концевой участок порина . может взаимодействовать с соответствующими-антителами.

Оказалось возможным выделить несколько характерных типов

с

кластеров, которые образуют антитела при связывании с митохондриалъным порином. Кластеры, хак правило, имеют резко очерченные границы, среди которых можно выделить три основных типа: I) нитеобразные кластеры; г) мелкие автономные кластеры; 3) крупные кластеры, в ряде случаев тяготеющие к краевым зонам высокого связывания антител с порином.

"Краевые" кластеры иногда наблюдаются мевду двумя

близкорасположенными митохондриями, в некоторых случаях обе

митохондрии вытянуты вдоль одной оси, которая почти перпендикулярна

касательной к линии контакта двух митохондрий. Зто позволяет

говорить о том, что "паевые" кластеры могут возникать при разрыве

контакта стыкованных митохондрий. Больше "краевые" кластеры,

расположенные на поверхности митохондриальных мембран, образуются,

очевидно, в результате больших повреждений внешней мембраны, через

которые "антитела попадают в межембранное пространство и при этом

эффективно взаимодействуют с п-концевнм участком порина. Другая

группа больших кластеров, так же как и нитевидные мелкие кластеры, \ • тяготеет к границам, разделяющим компартменгы митохондрий с разной

ульграструктурой крист.

4. Связывание антител в зонах тесного сближения митохондрий.

При анализе данных оказалось удобшм выделить две' группы межмитохондриальных контактов, которые отличаются но характеру связывания с антителами. Контакты, которые характеризуются

относительно большой протяженностью зон слипания митохондрий, и контакты с малой протяженностью зон взаимодействия. В первом случае наблюдаются одномерные структуры, аналогичные нитчатым кнастерам антител на поверхности митохондрий. • Во втором, в зоне контакта. ■ обычно наблюдаются более широкие вытянутые кластеры антител. Важным является то обстоятельство, что во многих случаях связывание антител е зонах контактов часто не сопровождается существенным их -связыванием с остальной поверхностью митэхоцдрзй. В таких случаях можно говорить о том, что в зоне контактов могут создаваться совершенно специфические условия, обзепзчшзаише избирательную доступность антител к порину в этих участках мембран. В нескольких случаях удалось наблюдать двунитчатую структуру в зонах контактов. В тех случаях, когда участок контакта короткий ширина зон, образуемых антителами в зоне контакта составляет 60-80нм. Необходимо иметь в виду то обстоятельство, что только незначительная доля, наблюдаемых в поле микроскопа меямитохондриальных контактов, ссецифчески взаимодействует с антителами. Это означает, что само по себе слипание митохондрий не является достаточным условием для связывания антител с митохондриальным порином, очевидно, необходим дополнительный механический фактор, который нарушает интактность внешней мембраны митохондрий и этим обеспечивает связывание антител с митохондриальным порином в этих участках.

Широкие зоны связывания антител (второй тип связывания) в зоне сближения митохондрий, чаще всего наблюдаются в ситуации, когда митохондрии сильно вытянуты вдоль направления перпендикулярного, по отношению к линии контакта. -

IV. ОБСУЖДЕНИЕ

Как отмечалось выше, связывание антител с митохондриями проводилось в фосфатно - солевом буфере. Известно, что в таких

средах (в ходе обработки митохондрий антителами) происходит увеличение объема (набухание)гатохондрий, цри котором могут возникать повреждения внешней мембраны, и резко изменяться ультраструктура крист. Проведенный анализ, полученных результатов", позволил еыявить несколько типов кластеров, образованных антителами на поверхности митохондрий. Параллельно наш была установлена связь между Еекоторши типами кластеризации антител и особенностями улыраструктуры крист соответствующих митохондрий.

То обстоятельство, что большая часть митохондрий в суспензии не связывает антитала к ы-концевсму участку порина, свидетельствует о том, что процесс взаимодействия антител с порином_ требует дополнительного специфического воздействия, повреждающего внешнюю мембрану митохондрий. Наиболее продуктивным оказалось допушение, согласно которому антитела к ы-концевому участку порина ез связываются с мембраной илтактных митохондрий, а их взаимодействие с порином становится возможным при нарушении, или структурных перестройках внешней мембраны. При этом фактором, вызывающим такяе нарушения, должно являться локальное механическое растяжение внешней мембраны вследствие неравномерных и несинхронных изменений конформации крист в рамках одной' штохоед£йи или растяжения зоеы контакта двух митохондрий. . -

Характерной особенностью митохондрий является значительная изменчивость их морфологической организации • в пределах общего структурного плана. Изменениям подвержены' такие параметры, как общий объем митохондрий, соотношение объемов матрикса и межкристного пространства, форма, ориентация и число крист.

Гетерогенность популяции митохондрий очевидно является дополнительным фактором, который определяет резкие различия в характере кластеризации антител на поверхности внешних

митохондриальннх мембран и того, что с антителами взаимодействуют не все митохондрии, а лишь небольшая их часть.

Оказалось удобным начать анализ с выяснения природа образования ЕитевидЕых кластеров.

Нитевидные кластеры пересекают значительную часть поверхности митохоЕДрии, образуя одну или в некоторых случаях две правильные, параллельные нити, расположенные, ■ как правило, перпендикулярно длинной оси митохондрии. В ряде случаев мелкие кластеры образуют широкую цепочку, пересекающую митохондрию в форме толстой нити. Рассматривая особенности конфигурации митохондрий и ультра структуры матрикса тех митохондрий, в которых наблвдазтся образование нитей, удается составить достаточно четкое представление о тех событиях, в результате которых осуществляется столь геометрически правильная "посадка" антител на поверхность мембран. Анализ показал, что такая специфичность может достигаться в процессе неравномерного набухания матрикса митохондрий, протекающего в условиях контакта митохондрий с антителами.

Оказалось, что митохондрии, содержащие нитевидные кластеры имеют весьма необычную, неоднородную структуру крист. Возникновение такой морфологической неравномерности может быть связано с набуханием одного из двух митопластов митохондрий, окруженных одной внешней мембраной. В этом случае образуются митохондрии грушевидной формы, в которых отчетливо наблюдается различие в ультраструктуре 1фист между широкой и узкой частями митохондрий. Обнаружить такие состояния внутренней мембраны митохондрий с различной конфигурацией крист удалось благодаря специфике проведения эксперимента, в ходе которого отбор материала проводился из очеиь большого массива препаратов митохондрий.

Можно видеть, что положение нитевидных кластеров антител,

связанных с порином четко коррелирует с границами, которые разделяв? зоны матрикса с различной морфологией крист (в рамках одной митохондрии). Существование эффекта неравномерного набухания митохондрий з фосфатных средах . было зарегистрировано нами в независимых опытах при изучении срезов митохондрий.

Полученные, даиные говорят о том, что антитела к н-концевому участку перина не СЕЯзывазтся с мембраной интактных митохондрий; их взаимодействие с порином становится возможным только при нарушении или структурных перестройках внешней мембраны.

В зонах слипания двух митохондрий, также как и на поверхности отдельных митохондрий часто наблюдается нитевидная конфигурация кластеров антител к поржу (двумерные кластеры).

" Анализ пелучеиных данных по связывании антител с порином на отдельных митохондриях показал, что необходимым фактором, который контролирует этот процесс является .механическое растяжение, зызывапцее разрыв внешней и внутренней мембран 'митохондрий. Очевидно, что сходный механизм образования нитей должен реализоваться также и в зонах сближения двух митохондрий.

В пользу этого говорят три группы фактов: I) в тех случаях, когда наблюдается связывание порина в зоне сближения митохондрий, обе ш одна из митохоедснй растянуты в направлении перпендикулярном по отношению к направлению линии контакта; 2) в случаях, когда площадь контакта большая к митохондрии растянуты слабо, тогда в зоне сближения, как правило, наблюдаются одномерные нитеподобные контакты. 3) В случаях, когда степень растянутости контактирующих митохондрий высока и соответственно протяженность контакта невелика, то в зоне слипания наблюдаются относительно широкие кластеры антител. Такая корреляция позволяет полагать, что связывание порина в строго определенном участке система из двух митохондрий возникает .при

образовании мелких коротко живущих дефектов во внепшей м°мбране, вследствие механического растяжения контакта, нарушающего интактность внешней мембрана.

Таким образом, связывание порина в строго определенных участках системы из двух митохондрий может возникать в результате образования коротко живущих дефектов во внешней мембране, в условиях, когда в момент растяжения нарушается интактность внешней ызмбраны и антитела получают возможность контактировать с пориком.

Источником сил, вызывающи механическое растяжение контактов двух сцепленных митохондрий в условиях эксперимента, очевидно, латается гидродинамическое давление водных потоков, возникающих в ходе промывок препаратов. В зтой связи существенно указать, что поверхность полимера, на котором сорбированы митохондрии, покрыта гидрофобным углеродом, и сорбция происходит за счет слипания подложки с гидрофобной митохондриальной мембраной. Форма некоторых больших кластеров, связанных с зоной сближения двух митохондрий, позволяет думать, что они образуются в результате разрывов контактов двух митохондрий, при которых сильно повреждается внешняя мембрана.

По-видимому, можно говорить о двух типах повреждений внешней мембраны митохондрий, которые индуцируют процесс взаимодействия антител с мемОрано евлз энным юрином. Локальные повреждения, индуцирующие мелкие и нитевидные кластеры, и 1фупные долгояивущие повреждения (разрывы) внешней мембраны, в результате которых образуются большие кластеры. Этот тип кластеров может возникать при разрывах двух слипшихся митохондрий.

При образовании нитевидных кластеров источником сил должно являться гидростатическое дазление. Легко показать, что в зонах неравномерного набухания матрикса, на внешнюю мембрану действует сила, перпендикулярная к ее поверхности, которая может вызывать

разрыв контактов между внешней з внутренней мембранами.

Связывание порина с мембранам субштохоядриальвых частиц Во второй части работы был очишзн и охарактеризован порин, выделенный из митохондрий сердца быка, показаны'его каналоформерше свойства. Полученные данные свидетельствуют о том, что пориновый канал может иметь различные уровни проводимости (от 0,2 до 7 не), что указывает на возможность тонкого регулирования его активности. С помощью двумерного электрофореза разработан способ идентификации порина в сложных белковых смесях, установлено присутствие порина в СМЧ (после двухкратной ультразвуковой дезинтеграции и переосаадения) из митохондрий сердца.

Очищенный препарат порина при двумерном электрофорезе проявляется в виде нескольких компонентов с молекулярной массой 32-34 кДа и значениями р1 7,1; 6,9; 6,7; 6,5. Описанный ранее порш митохондрий печени имеет молекулярную массу 30-33 кДа и такие включает несколько компонентов, различающихся по величине р1. Сходство состава препарата порина штоховдрий сердца и печени говорит в пользу того, что наблюдаемая множественность форм порина не является артефактом, связанным с выделением этого препарата. Множественность уровней проводимости, которые наблюдаются при встраивании порина в бислойную фосфолипидную мембрану, возможно связана с тожественностью форм порина, которые выявляются при изоэлектрофокусировании очищенного препарата.

Использование коэлектрсфореза позволило разработать методику определения положения порина на двумерных электрофореграммах в сложных белковых смесях суммарных экстрактов митохондрий, что дало возможность использовать метод двумерного электрофореза для идентификации порина в субмитохондриальных частицах. Обнаружение порина в мембранах СМЧ показало, что в митохондриях сержа часть

порина южет Сыть прочно ассоциирована с внутренней мембраной митохондрий.

ВЫВОДЫ

1. С помощью электронной микроскопии негыивЕоокрашеннх препаратов кефиксировашх «¿итохондрий удалось показать присутствие порпна в участках тесного сближения митохондрий.'

2. Показано, что и - концевой участок порина не экспонирован на внешнюю сторону внешней мембраны митохондрий.

3. Показано, что связывание антител с n - концевым участком порпна иитоховдриальных глембран может происходить в местах нарушения иатактности внешней митохондриальной мембраны.

4. Установлено, что связывание антител с и - концевым участком порина происходит преимущественно в зонах границ, разделяющих два отсека одной и той се митохондрии, имепщх разную улътраструктуру крист. Цри этом' на поверхности митохондрий образуются кластеры антител нитевидного строения.

5. Полученные данные позволяют использовать антитела к ы-концевоцу участку порина в качестве зовда для выявления дефектов во "внешних мембранах митохондрий.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Константинова С.А., Зоров Д.Б., Ковалев Л.И., Шишикин С.С. Изучение свойств ыитохондриального порина из сердца быка. Биохимия. Т. 56. N.II. С. 2042-2050. 1991.

2.Konstantinova S.A, Kovalev L.I., Zorov D.B., Sbishkin S.S., Skulachev V.P. 2-D PAGE of polypeptides from bovine heart nitochondria. Evidence for the tight binding of porin with inner mitochondrial membrane. Proceedings of the International Meeting on Two-Dimensional Electrophoresis. Edited by M.J.Dunn. London. UK. P. 274-275. 1951.