Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нуклеотидные последовательности Linaria dalmatica (L.) P. Mill, приобретенные в результате горизонтального переноса

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Нуклеотидные последовательности Linaria dalmatica (L.) P. Mill, приобретенные в результате горизонтального переноса"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи„

ПАВЛОВА Ольга Андреевна

НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ LINARIA DALMATICA (L.) P. MILL, ПРИОБРЕТЕННЫЕ В РЕЗУЛЬТАТЕ - ГОРИЗОНТАЛЬНОГО ПЕРЕНОСА.

03.02.07 Генетика

005059528

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2013

005059528

Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном университете на кафедре генетики и биотехнологии в лаборатории генной и клеточной инженерии растений

Научный руководитель:........................................доктор биологических наук,

профессор Лутова Людмила Алексеевна

Официальные оппоненты:....................................доктор биологических наук,

заведующий лабораторией Борисов Алексей Юрьевич, Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН

.....................................................................доктор биологических паук,

профессор Ермилова Елена Викторовна, Санкт-Петербургский государственный университет

Ведущая организация: .............................. Государственное научное

учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений РАСХН.

Защита состоится 2013 г. в ^ часов на заседании совета

Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского Государственного университета.

Автореферат разослан •• 20131

.у ' /

Ученый секретарь _____

Диссертационного совета ^ Л.А.Ма#.

Доктор биологических наук > Г

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время вопросы эволюционного происхождения и родства организмов становятся все более актуальными. Установление вертикальных связей (от родителей к потомкам) не представляется сложным. Однако, помимо вертикальных связей существуют еще и горизонтальные (латеральные). Горизонтальный перенос генов (РПГ) - явление передачи генетической информации между организмами, которые не соотносятся как родитель и потомок. Способностью к латеральной передаче обладают многие организмы, например: бактерии, вирусы и некоторые виды грибов. Активный перенос генов может происходить в симбиотических, паразитарных или ассоциативных системах, где осуществляется физический контакт клеток. У прокариотов латеральный обмен широко распространен и является одним из механизмов комбинативной изменчивости. В царстве эукариотов в силу более сложной организации генетического аппарата горизонтальные переносы редки. ГПГ может происходить как между близкородственными, так и между филогенетически отдалёнными видами, например, между агробактериями и высшими растениями.

Агробактерии способны передавать и встраивать в геном растительной клетки фрагмент своей плазмиды. Передаваемый участок называется Т-ДНК (от англ. «transferred DNA») и клТДНК (клеточная Т-ДНК) - Т-ДНК в составе генома растения. Агробактерии являются патогенными по отношению к растениям, и в природе в зависимости от штамма вызывают заболевания «корончатый галл» или «бородатый корень». За развитие заболевания отвечают гены, входящие в состав переносимой Т-ДНК. Опухоли (корончатый галл или бородатые корни) формируются на прикорневой шейке растения. Важно отметить, что в природе агроинфекция не приводит к закреплению Т-ДНК и к ее передаче половому потомству. Однако, было показано, что в геномах некоторых видов растений родов Nicoliana и Linaria, не подвергавшихся агроинфекции, содержатся последовательности, гомологичные Т-ДНК Agrobacterhim rhtogenes. (White et al., 1983, Matveeva et al., 2012). Было показано, что актов трансформации в эволюции рода Nicotiana было несколько (Suzuki et al., 2002). Последовательности, входящие в состав клТ-ДНК Nicotiana glauca и Linaria vulgaris, детально изучены, определено, что у данных видов Т-ДНК организована в виде повтора из двух копий и содержит гомологичные гены синтеза опинов. Некоторые из генов в составе клТ-ДНК Nicotiana glauca функционально активны (Aoki, Syono, 1994, Meyer А. etal, 1995). У нескольких исследованных видов Nicotiana и L. vulgaris наиболее консервативным является ген rolC (Intrieri, Buiatti, 2001; Suzuki et al., 2002, Matveeva et al., 2012). Эти факты говорят о том, что при становлении данных родов происходили неоднократные акты агротрансформации, и агробактериальные последовательности закрепились в геномах и были подхвачены в ходе эволюции. Изучение клТ-ДНК в геноме растений представляет собой фундаментальный интерес, поскольку поможет понять не только некоторые аспекты растительно-микробного взаимодействия, но и выяснить происхождение отдельных генов, организмов или видов, а также понять общие закономерности совместного эволюционирования организмов.

С практической точки зрения изучение горизонтального переноса генов между агробактериями и растениями также представляет несомненный интерес. Факт обнаружение новых примеров ГПГ (т.е. «природно-трансгенных» организмов) может быть востребован в качестве контраргумента при критике генно-модифицированных культур, используемых в современном сельском хозяйстве, медицине, ветеринарии.

Степень разработанности проблемы. До недавнего времени примеры горизонтального переноса генов между агробактериями и высшими растениями были известны для некоторых видов Nicotiana и для Linaria vulgaris. Последовательности клТ-ДНК детально изучены. Для части генов клТ-ДНК у видов Nicotiana показана экспрессия. Выявлено, что в эволюции рода Nicotiana было несколько независимых актов интеграции Т-ДНК. В пределах рода Linaria распространенность данного явления

еще не изучена. Представленное исследование посвящено изучению последовательности клТ-ДНК у вида L. dalmatica.

Цель н задачи работы. Целью работы является - изучение агробактериальных нуклеотидных последовательностей, обнаруженных у Linaria dalmatica (L.) P. Mill. В работе были поставлены следующие задачи:

/. Характеристика нуклеотидных последовательностей (roi-генов и гена опин-синтазы), в составе вставки клТ-ДНК L. dalmatica.

2. Создание генетических конструкций с геном LdrolC для последующего изучения его функции.

3. Определение структуры вставки клТ-ДНК у L. dalmatica.

4. Идентификация точки инсерции клТ-ДНК в геноме L "dalmatica.

5. Поиск новых примеров горизонтального переноса в природе между агробактериями и высшими растениями.

Научная новизна диссертационной работы. В ходе выполнения работы впервые были описаны полноразмерные последовательности генов, входящих в клТ-ДНК L. dalmatica: гены, гомологичные rW-генам Agrobacterium rhizogenes и гену микимопин-синтазы. Идентифицирована точка интеграции клТ-ДНК в геном растения.'Определена структура вставки. Проведен массовый скрининг видов двудольных растений на наличие Т-ДНК-подобных последовательностей. Созданы генетические конструкции для изучения функций гена LdrolC.

Теоретическая и практическая ценность. Показано, что в эволюции растений горизонтальный перенос генов протекал неоднократно. Установлено, что у разных видов район интеграции совпадает. Этот факт указывает на то, что акт переноса Т-ДНК эволюционно более раннее событие, чем расхождение видов. В составе клТ-ДНК выявлены консервативные последовательности, дошедшие до наших дней без изменений, что может указывать на их значимость для растения. Полученные в работе генетические конструкции для трансформации растений могут быть использованы на практике широким кругом исследователей.

Результаты данной работы могут быть использованы в материалах курсов лекций «Генетика развития растений», «Симбиогенетика», «Экологическая генетика», читаемых на кафедре генетики и биотехнологии СПбГУ. Методические подходы, примененные в работе, могут быть использованы в курсе инструментального практикума по «Генной инженерии».

Основные положения, выносимые на защиту. Для вновь описного примера горизонтального переноса генов между агробактериями и растениям у L. dalmatica изучены нуклеотидные последовательности генов, входящих в Т-ДНК: LdrolC, Lc/rol В, £dORF13-l, ¿¿ORF13-2, ¿¿ORF14 и Ldmis. Показано, что вставка клТ-ДНК организована в виде прямого повтора. Определен район интеграции клТ-ДНК в геноме L. dalmatica, который имеет сходство с Ty3-gypsy-Iike транспозоном и соответствует месту интеграции у вида L. vulgaris.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов высокая. По результатам работы были сделаны сообщения на российских и зарубежных конференциях: 33rd Annual International Crown Gall (Agrobacterium) Conférence, December 1-2, 2012, Hiram, Ohio, USA., II(X) Международной Ботанической Конференции молодых ученых в Санкт-Петербурге 11 - 16 ноября 2012 года., «Достижения и перспективы развития биотехнологии» г. Саранск, 3-5 октября 2012 г., XVIII Congress of the Fédération of European Societies of Plant Biology (FESPB) Book of Abstracts 4-9 July 2010 Valencia, Spain, Adaptation to Climate Change in the Baltic Sea Région: Contributions from Plant and Microbial Biotechnology July 12-17, 2010 Mikkeli, Finland., "III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз - Россия 2010",Нижний Новгород, 24-29 мая 2010г. The International Conférence "Plant Genetics, Genomics, and Biotechnology, Novosibirsk, June7-

10, 2010, Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, 5 съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 21-28 июня 2009 г., Пятый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 16-20 марта 2009 г., V Съезд Общества Биотехнологов России. Москва, 2-4 декабря 2008 г., Международная научная школа-конференция молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях», Москва, 8-12 декабря 2008 г., 12-я Международная Пущинская школа-конференция для молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 10-14 ноября 2008 г., The international scientific conference «S.P.Kostychev and modern agricultural microbiology» Yalta, Ukraine, October 8-12, 2007, 11-ая Международная Пущинская школа-конференция для молодых ученых «Биология -наука XXI века», Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 г.,«Современная биотехнология -защите окружающей среды», Пущино, 11-13 сентября 2006 г., Пущино, Международная конференция «Генетика в России и мире», посвященная 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва, 28 июня - 2 июля 2006 г., 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного РАН, Пущино, 17-21 апреля 2006, 4-й съезд общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Пущино, 6-7 декабря 2006 г.

По результатам работы опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ.

1.1 Растительный материал.

Linaria dalmatica (L.) P. Mill, семена были приобретены в компании «Secret Seeds» (Великобритания). Вегетативный материал L. dalmatica собран на территории Краснодарского края с индивидуальных растений. Вегетативный материал 90 видов двудольных растений собран на территории Ленинградской области и Краснодарского края. Семена Nicotiana tabacum L. были любезно предоставлены Институтом табака и махорки и табачных изделий г. Краснодара. Асептические растения Linaria vulgaris предоставлены Матвеевой Т.В.

1.2. Бактериальный материал.

Культуры Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium tumefaciens (штамм 8196, штамм С58 из коллекции Freie Universität Berlin, Берлин, Германия) были любезно предоставлены проф. Т. Schmulling

Культура Agrobacterium tumefaciens (штамм ЕНА105 из коллекции University of Washington, Сиэттл, США) была любезно предоставлена проф. Е. Nester.

Компетентные клетки Escherichia coli DH5a

1.3. Вектора.

pJET 1.2 («Thermo Fisher Scientific, Inc.», Уолтем, США), pENTR-DA"OPO («Life Technologies», США), pB7WG2D,l (VIB, UGent, Бельгия)

1.4. Питательные среды.

Растения культивировали на среде Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962). Среда Луриа-Бертрани (LB) (Sambrook, Russell, 2001) использовалась для культивирования бактерий. Антибиотики для отбора трансформантов: ампициллин («Синтез», Россия) для селекции бактерий, содержащих вектор pJET1.2, канамицин («Синтез», Россия) и спектиномицин («Sigma», США) для селекции бактерий, содержащих вектор pENTR-D/TOPO.

2. Молекулярно-биологические процедуры. Для выделения ДНК использовали стандартные методики Деллапорта (Dellaporta, et al., 1983), Мюррея (Murray, Thompson, 1980), Дрейпера (Дрейпер и др., 1991). Метод ПЦР в реальном времени применяли для оценки качества растительной ДНК (моноплекс) и для выявления последовательностей, гомологичных агробактериальным генам гоГВ, то/С, ORF13, ORF14,ími/ и tmr (ipt)

al., 2012). Поскольку, вид L. dalmatica является близкородственным виду L.vulgaris Mill., что было показано на основании анализа нуклеотидных последовательностей молекулярных маркеров, используемых в филогении: ITS, AGT1 и rpl32-trnLUAG, trnS-trnG (Blanco-Pastor et al., 2012), мы предположили, что структура вставки клТ-ДНК L. dalmatica может быть схожей со структурой вставки L. vulgaris. Эксперимент был спланирован следующим образом. На основании последовательностей, депонированных в базу данных GenBank (асс. No EU735069.2), были сконструированы праймеры, позволяющие нарабатывать фрагмент, содержащий точку соединения двух

копий клТ-ДНК. Праймеры располагались следующим образом: "тит'днк прямой (mis3a) гомологичен правому краю вставки и направлен наружу, а обратный (orf2) отжигается на левый край и также «смотрит» наружу. На схеме (рис. 11) праймеры обозначены стрелками.

Граница вставок

Рис. №11. Схема организации вставки клТ-ДНК /,. dalmatica.

В случае организации вставки в виде тандемного повтора с использованием данных праймеров будет нарабатываться ПЦР-продукт, содержащий точку соединения вставок. Если вставка в геноме одна, или их несколько, но они организованы иначе (повтор инвертирован или тандемный, но несовершенный), то синтеза ПЦР-продукта не будет.

При проведении ПЦР-анализа нами было показано, что на матрице L. dalmatica нарабатывается ампликон размером около 900 п.и. Размер ПЦР-продукта L.dalmatica соответствует таковому же у ¿.vulgaris. На рис. № 12 представлена электрофореграмма.

Рис. №12 Электрофореграмма: № 1 маркер молекулярного веса, №2 - ПЦР продукт на матрице L. vulgaris. №3 - ПЦР продукт на матрице /.. dalmatica.

Нами было установлено, что у L. dalmatica клТ-ДНК организована в виде прямого тандемного повтора. Организация клТ-ДНК у L. dalmatica и у L. vulgaris совпадает. Схожая организация вставки может указывать на то, что привнесение и закрепление клТ-ДНК в пределах рода Linaria состоялось в геном общего предка для этих двух видов льнянок.

4. Определение точки инеерции клТ-ДНК в геноме L. dalmatica.

На предыдущем этапе работы нами было выявлено, что клТ-ДНК у L. dalmatica организована так же. как у L. vulgaris. Ранее нашей исследовательской группой была секвенирована область, захватывающая правую границу клТ-ДНК и растительную ДНК, примыкающую к сайту интеграции у вида L. vulgaris (Matveeva et al., 2012). Фрагмент растительной ДНК демонстрирует сходство с ТуЗ-gypsy-like транспозоном. Также было показано, что правая граница существует в двух вариантах: полноразмерном и укороченном - с делецией в приграничной части клТ-ДНК (Matveeva et al., 2012). Структура места стыковки клТ-ДНК с растительной ДНК отражена на схеме (Рис. 13). Мы решили определить точку интеграции клТ-ДНК в геноме L. dalmatica и сравнить ее с точкой интеграции в геноме L. vulgaris.

На основании последовательности (асс. No EU735069.2) из базы данных GenBank, были сконструированы праймеры. позволяющие нарабатывать фрагмент, содержащий

В противоположность этому в работах Сузуки показано, что в эволюции рода Nicotiana было несколько независимых актов трансформации и закрепления клТ-ДНК. Также авторы показали, что акты трансформации были осуществлены разными штаммами агробактерий (Suzuki et al., 2002).

>чка "расхождения видов

Antlirhinum Chaenorhinum L.clialepertsiií Lspailea I., multioauiis l. Qhatbe/ísis L Joppensis L hmbva L iaxiflora L wanonis 1. ñava L atbifrom L Iriphyíia L venlticosa L peloponnesisca i. me/eti L genislifoüa L. ¡¡¿¡¡¡¡¡¡¡¡Я

17,5 ■ ■i.. 15,а 120 ' i—'—■— 10.0 -,-1-г—г— 7.5 5.0 2.5

MIOCENE | PÜOCENC OUATERNAftY

Рис. № 15. Филогенетическое древо рода Linaria, (модифицировано по Blanco-Pastor et al., 2012)

На сегодняшний день в литературе активно обсуждается роль агробактериальных последовательностей, привнесенных в геном растений. Кратко остановимся на гипотезах, объясняющих этот феномен. 1. «Фитормональная гипотеза». 2. «Опиновая гипотеза». 3. «Иммунная гипотеза».

Согласно «фитогормональной» гипотезе в определенный момент времени в ходе эволюции скачкообразное изменение гормонального баланса растений (связанное с захватом Т-ДНК и ее передачей в половых поколениях) привело к повышению адаптационного потенциала трансформированных растений. Такой сценарий мог разворачиваться, например, при резком изменении водного баланса или при обеднении почв, а также при переходе в другие экологические ниши. «Иммунная гипотеза» объясняет феномен закрепления Т-ДНК тем, что растение уже имеющее вставку, устойчиво к агроинфекции родственными штаммами, т.е. формируется своеобразный механизм защиты от множественной трансформации. «Опиновая гипотеза» связана не с го/-генами, а с геном синтеза опинов. Растение, трансформированное определенным штаммом, нарабатывает и выделяет в ризосферу определенный тип опинов. Таким способом растение может контролировать и изменять состав ризосферы, привлекая определенных бактерий и подавляя других. В данном случае можно говорить о начальных этапах симбиотического взаимодействия на генетическом уровне. Фактически, бактерия, колонизовавшая растение, сама оказывается колонизованной растением.

Вставка клТ-ДНК сыграла определенную роль в эволюции Т-ДНК-содержащих растений. Доказательством этому могут послужить некоторые факты. Показано, что клТ-ДНК закрепилась у разных родов растений (Nicotiana и Linaria) (White et al., 1983; Matveeva et al., 2012). Причем, у видов табака показано несколько независимых актов переноса (Suzuki et al., 2002). Доказательством значимости вставки является тот факт, что к настоящему времени в пределах Т-ДНК-содержащих видов не найдено индивидуумов без вставки (Matveeva et al, 2012, Павлова и др., 2012 (тезисы конференции). Скорость накопления мутаций в последовательностях клТ-ДНК не

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В рамках данной работы, которая является частью большого исследования, посвященного изучению горизонтального переноса генов между агробактериями и растениями, были охарактеризованы последовательности клТ-ДНК, обнаруженных в геноме L. dalmatica.

Мы определили нуклеотидные последовательности генов, входящих в состав клТ-ДНК L. dalmatica-. Ld/o/B, Ldro/C, LdORF13-l, LdORF13-2, LdORF14 п \Amis. Анализ нуклеотидной последовательности in silico показал, что у генов LdORF13-l, LdORF13-2, LdORF14 I drolB и Ldmis рамки считывания прерываются дополнительными стоп-кодонами, содержат делеции и точковые замены, что сьидс1ельствовать о том, что функциональные белковые продукты не могут образовываться.

Для гена Ldro/C показано, что его рамка считывания сохранилась интактной. Данный факт может говорить о его потенциальной функциональности. Важно отметить, что ген rolC является самым консервативным у всех изученных видов Nicotiana и Linaria. Можно предположить, этот ген оказался одним из ключевых для закрепления Т-ДНК у растений. Мы показали, что его регуляторные мотивы (мотив Козак) отличаются от канонических. Для изучения функций этого гена (и его возможной роли) нами были созданы генетические конструкции для трансформации растений, каждая их которых несет один из вариантов гена («real» «strong») под контролем конститутивного промотора и репортерный ген зеленого флуоресцентного белка. В дальнейшем эти конструкции могут быть использованы для трансформации растений.

Мы определили структуру вставки клТ-ДНК: копий не менее двух и они организованы в виде тандемного повтора. Присутствие двух копий, по-видимому, обусловлено механизмами интеграции.

Мы установили локализацию клТ-ДНК в растительном геноме, а также показали совпадение сайтов интеграции у разных видов (L. dalmatica и L. vulgaris). Данный факт указывает на то, что клТ-ДНК была подхвачена их общим предком. В пользу этих утверждений свидетельствуют и те факты, что уровень сходства нуклеотидных последовательностей онкогенов и гена синтеза опинов выше между льнянками (£. dalmatica и L. vulgaris) и чем между льнянками и соответствующими последовательностями у табака и агробактерий.

Для оценки распространенности ГПГ между агробактериями и высшими растениями нами был проведен скрининг 90 в отношении мотивов, гомологичных генам то/С, то/В, ORF13, ORF14 A. rhizogenes и tms, tmr (ipt) A. tumefaciens. Среди проанализированных 90 видов новых примеров ГПГ не обнаружено. Всего нашей группой проанализировано более 200 видов двудольных растений на наличие в их геномах последовательностей, гомологичных агробактериальным онкогенам и среди всех изученных только у некоторых льнянок обнаружены искомые последовательности (Matveeva et al., 2012). Явление ГПГ редко встречается в природе (помимо льнянок, известны примеры только у некоторых видов табака (White et al., 1983). Однако, не смотря на редкость, горизонтальный перенос играл (и, возможно, играет до сих пор) важную роль в эволюции растений, поскольку акты переноса зарегистированы и встечаются у филогенетически отдаленных видов..

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что последовательность клТ-ДНК L. dalmatica содержит последовательности генов LdrolC, ¿rfrolB, /.¿/ORF13-1, /.c/ORF13-2, WORF14 и Ldmis.

2. Созданы генетические конструкции для изучения функции гена LdrolC.

3. Установлено, что вставка клТ-ДНК вида L. dalmatica огранизована в виде прямого тандемного повтора.

4. Определена точка интеграции клТ-ДНК в геноме L. dalmalica, район интеграции имеет сходство с Ty3-gypsy-like транспозоном и совпадает с районом интеграции у вида L. vulgaris.

5. Осуществлен поиск новых примеров горизонтального переноса генов между агробактериями и высшими растениями. Среди изученных в рамках работы 90 видов не выявлено новых примеров ГПГ

Список публикаций по теме диссертации:

■ 'статьи:..................................

1. Матвеева Т В., Павлова O.A., Иваницкий К.И., Лутова Л.А. Горизонтальный перенос генов от агробактерий к растениям рода Nicotiana: эволюционные предпосылки и последствия. Вестник Санкт-Петербургского университета. Серия 3: Биология, 2009, №4. С. 58-65.

2. Матвеева Т.В., Павлова O.A., Богомаз Д.И., Демкович Е.А., Лутова Л.А. Молекулярные маркеры для видоидентификации и филогенетики растений. Экологическая генетика, 2011, Т.IX, вып.1. -С.32-43

3. Matveeva T.V., Bogomaz D.I., Pavlova O.A., Nester E.W., Lutova L.A. Horizontal gene transfer from Agrobaclerium to the plant Linaria in nature. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2012 Dec;25(l 2): 1542-51.

4. Павлова O.A., Матвеева T.B., Лутова Л.А. йо/-гены Agrobaclerium rhizogenes. Экологическая генетика, — 2013. — Т. XI. — Вып. 1. — С. 59-68.

тезисы конференций:

1. Павлова O.II. (Павлова O.A.), Пигичка Т.Ю, Матвеева Т В., Лутова Л.А. Сравнительная характеристика регенерационной способности у Nicotiana rustica и Nicotiana langsdorjfii. Материалы Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 400-летию Института общей генетики им. Н И. Вавилова РАН, Москва, 2006. с. 147.

2. Пигичка Т.Ю, Павлова O.II. (Павлова O.A.), Матвеева Т В., Лутова Л.А. Характеристика способности Nicotiana langsdorffii к регенерации и трансформации invitro. 10-я Путинская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного РАН, сборник тезисов, Пущино, 2006. с.389.

3. Павлова O.A., Матвеева ТВ., Лутова Л.А. Характеристика способности к агротрансформации Nicotiana rustica. Материалы конференции «Современная биотехнология - защите окружающей среды», электронная публикация, Пущино, 2006.

4. Матвеева Т В., Пигичка Т.Ю., Павлова O.A., Лутова Л.А. Характеристика Nicotiana langsdorffii и Nicotiana rustica по способности к трансформации штаммами агробактерий дикого типа. Материалы четвертого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Пущино, 2006, с. 155-156.

5. Павлова O.A., Матвеева Т В., Лутова Л.А. Поиск примеров горизонтального переноса генов от агробактерий к древесным формам растений. 11-я международная Путинская школа-конференция молодых ученых, сборник тезисов, Пущино, 2007, с. 212.

6. Павлова O.A., Матвеева Т.В. Характеристика способности Nicotiana suaveolens к регенерации и агротрансформации in vitro.. Сборник тезисов 12-й Международной Путинской школы-конференции для молодых ученых «Биология - наука XXI века» 10-14 ноября 2008 года, Пушино, 2008. с.217

7. Павлова O.A., Матвеева Т.В., Лутова Л.А. Характеристика способности Nicotiana gossei к регенерации и агротрансформации in vitro. Сборник тезисов Международной научной школы-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях», Москва, 8-12 декабря 2008 года.

8. Матвеева Т.В., Богомаз Д.И.. Павлова О.Л. Иваницкий К.И., Лутова Л.А. Горизонтальный перенос генов от агробактерий в эволюции растений сем. Solanaceae и Scrophulariaceae. Материалы конгресса. Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва 16-20 марта 2009 г.. с. 281

9. Павлова О.А.. Матвеева Т.В., Лутова Л.А. Характеристика способности представителей рода Linaria к агротрансформации. Сборник тезисов Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, 5 съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, часть I, Москва, 21-28 июня 2009 г., с. 553.

Ю.Матвеева ТВ., Богомаз Д.И., Павлова О.А., Иваницкий К.И. Горизонтальный перенос генов от агробактерий к растениям: экологический аспект. Сборник тезисов Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, 5 съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, часть II, Москва, 21-28 июня 2009 г., с. 213.

11. Павлова О.А., Матвеева Т.В., Лутова Л.А. Характеристика представителей рода Nicotiana по способностям к регенерации и трансформации. // Сборник тезисов "III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз - Россия 2010", Нижний Новгород, 24-29 мая 2010 г., с.108

12. Pavlova О.А., Matveeva T.V. and Lutova L.A. Study of the regenerative ability of plants of the genera, which were found sequences homologous to the T-DNA of agrobacteria. // Abstract Book: Adaptation to Climate Change in the Baltic Sea Region: Contributions from Plant and Microbial Biotechnology July 1217, 2010 Mikkeli, Finland., P.67.

13. Matveeva T.V., Bogomaz D.I., Pavlova O.A., Nester E.W., Lutova L.A. Sequences, homologous to T-DNA of agrobacterium in plant genomes //Plant Genetics, Genomics, and Biotechnology". Novosibirsk, 2010. P. 27

14. Matveeva T.; Bogomaz D., Pavlova O., Lutova L. Horizontal gene transfer from Agrobacterium to plant during their evolution // Abstracts of XVII Congress of FES PB Valencia, Spain, 2010, P. 195

15. Andreeva E., Matveeva T., Bogomaz D., Pavlova O., Lutova L. Genetic engineering approaches for silencing of plant genes of different evolution origins // Abstracts of XVI1 Congress of FESPB Valencia, Spain, 2010, p. 163-164.

16. Павлова O.A., МатвееваТ.В., Богомаз Д.И., Лутова Л.А. Linaria dalmatica{L.) Mill. Содержит Т-ДНК подобные последовательности агробактерий. // Сборник тезисов «Достижения и перспективы развития биотехнологии» г. Саранск, 3-5 октября 2012 г., с. 80.

17. Павлова О.А., Матвеева Т.В., Лутова Л.А. Новый молекулярный маркер для филогенетических исследований рода Linaria. // Сборник тезисов 11(Х) Международной Ботанической Конференции молодых ученых в Санкт-Петербурге 11-16 ноября 2012 года, с. 20-21.

18. Matveeva T.V., Bogomaz D.I., Pavlova О.А., Nester E.W., Lutova L.A. Linaria vulgaris L. contains T-DNA Genes of Agrobacterium rhizogenes. // Abstracts of 33th International Crown Gall Conference, Decemder 1-2, 2012, Hiram College, Hiram, OH, USA.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлова, Ольга Андреевна, Санкт-Петербург

со о

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

t

На правах рукописи

Павлова Ольга Андреевна

НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ LINARIA DALMATICA (L.) P. MILL, ПРИОБРЕТЕННЫЕ В РЕЗУЛЬТАТЕ ГОРИЗОНТАЛЬНОГО ПЕРЕНОСА.

Специальность: 03.02.07 Генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

<0 со

Ю

со й

^ ^ Научный руководитель:

^^ доктор биологических наук, профессор Лутова Людмила Алексеевна

ті-

Санкт-Петербург 2013

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы..........................................................14

1. Горизонтальный перенос генов, определение, эволюционный аспект. ..14

2. Горизонтальный перенос генов в царстве прокариотов......................15

3. Горизонтальный перенос генов у эукариотов.................................20

3.1. Горизонтальный перенос у протистов.......................................21

3.2. Горизонтальный перенос у грибов.............................................22

3.3. Горизонтальный перенос у насекомых и нематод..........................23

3.4. Горизонтальный перенос у позвоночных....................................24

3.5. Горизонтальный перенос у растений..........................................25

4. Горизонтальный перенос генов между агробактериями и высшими растениями..............................................................................28

4.1. Механизмы взаимодействия агробактерий и растений..................28

4.2. Структурная организация Т-ДНК и у/>-области агробактерий, механизмы переноса Т-ДНК в растительные клетки...........................31

4.2.1. у/г-область.......................................................................35

4.2.2. Т-нить.............................................................................36

4.2.3. Интерация Т-ДНК в геном хозяина........................................37

4.2.4. Гены, входящие в состав Т-ДНК................................................41

4.3. Примеры ГПГ между агробактериями и растениями....................53

4.4. Исследования, посвященные горизонтальному переносу генов, проводимые на кафедре генетики и биотехнологии СПбГУ...................60

5. Заключение..........................................................................64

Глава И. Материалы и методы....................................................67

1. Материалы........................................................................... 67

1.1 Растительный материал.........................................................67

1.2. Условия выращивания растений.............................................67

1.3. Условия хранения растительного материала.............................68

1.4. Бактериальный материал......................................................68

1.5. Питательные среды..............................................................68

1.6. Вектора.............................................................................69

2. Методы................................................................................70

2.1. Выделение ДНК...................................................................70

2.2. ПЦР.................................................................................70

2.2.1. ПЦР в режиме реального времени: моноплекс..........................70

2.2.2. ПЦР в режиме реального времени: мультиплекс.......................70

2.2.3. Классические варианты ПЦР................................................73

2.3. Электрофоретические разделение, подготовка образца к клонированию........................................................................76

2.4. Клонирование..................................................................77

2.5. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование)......................................................................77

2.6. Интернет-ресурсы, используемые в работе..............................77

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ и ОБСУЖДЕНИЯ.................................................79

1. Характеристика нуклеотидных последовательностей в составе клТ-ДНК сіаітшіса.....................................................................................80

2. Создание генетических конструкций для изучения функциональности консервативных последовательностей клТ-ДНК Ь.сіаїтаїіса................90

3. Определение структуры вставки клТ-ДНК в геноме Ь. йаїтсііїса..........................................................................................93

4. Определение точки инсерции клТ-ДНК в геноме Ь. сіаітшіса............95

5. Поиск новых примеров горизонтального переноса генов между агробактериями и высшими растениям............................................101

Заключение..............................................................................107

Список сокращений.................................................................109

Глава V. Выводы...................................................................110

Литература.............................................................................111

Приложение №1......................................................................150

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время вопросы эволюционного происхождения и родства организмов становятся все более актуальными. Установление вертикальных связей (от родителей к потомкам) не представляется сложным. Однако, помимо вертикальных связей существуют еще и горизонтальные (латеральные). Горизонтальный перенос генов (ГПГ) - явление передачи генетической информации между организмами, которые не соотносятся как родитель и потомок. Способностью к латеральной передаче обладают многие организмы, например: бактерии, вирусы и некоторые виды грибов. Активный перенос генов может происходить в симбиотических, паразитарных или ассоциативных системах, где осуществляется физический контакт клеток. ГПГ может происходить как между близкородственными, так и между филогенетически отдалёнными видами. У прокариотов латеральный обмен широко распространен и является одним из механизмов комбинативной изменчивости. В царстве эукариотов в силу более сложной организации генетического аппарата горизонтальные переносы редки. ГПГ может происходить как между близкородственными, так и между филогенетически отдалёнными видами, например, между агробактериями и высшими рас гениями.

Агробактерии способны передавать и встраивать в геном растительной клетки фрагмент своей плазмиды. Передаваемый участок называется Т-ДНК (от англ. «transferred DNA») и клТДНК (клеточная Т-ДНК) - Т-ДНК в составе генома растения. Агробактерии являются патогенными бактериями по отношению к растениям. В природе вызывают заболевания «корончатый галл» пли «бородатый корень» в зависимости от штамма. За развитие заболевания отвечают гены, входящие в состав переносимой Т-ДНК. Опухоли (корончатый галл или бородатые корни) формируются на прикорневой шейке растения. Важно отметить, что в природе агроинфекция

не приводит к закреплению Т-ДНК и к ее передаче половому потомству. Однако было показано, что в геномах некоторых видов растений родов Nicotiana и Linaria, не подвергавшихся агроинфекции, содержатся последовательности, гомологичные Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes. (White et al., 1983, Matvecva et al., 2012). Было показано, что актов трансформации в эволюции рода Nicotiana было несколько (Suzuki et al., 2002). Последовательности, входящие в состав клТ-ДЫК Nicotiana glauca и Linaria vulgaris, детально изучены, показано, что у данных видов Т-ДНК организована в виде повтора из двух копий и содержит гомологичные гены синтеза огшнов, некоторые из генов в составе клТ-ДНК Nicotiana glauca функционально активны (Aoki, Syono, 1994, Meyer A. et al, 1995). У нескольких исследованных видов Nicotiana и L. vulgaris наиболее консервативным является ген rolC (Intrieri, Buiatti, 2001; Suzuki et al., 2002, Matveeva et al., 2012). Эти факты говорят о том, что при становлении данных родов происходили неоднократные акты агротрансформации, и агробактериальные последовательности не только закрепились в геномах, но и были подхвачены в ходе эволюции. Изучение клТ-ДНК в геноме растений представляет собой фундаментальный интерес, поскольку поможет понять не только некоторые аспекты растительно-микробного взаимодействия, но и выяснить происхождение отдельных генов, организмов или видов, а также понять общие закономерности совместного эволюционирования организмов.

С практической точки зрения изучение горизонтального переноса генов между агробактериями и растениями также представляет несомненный интерес. Факт обнаружение новых примеров ГПГ (т.е. «природно-трансгенных» организмов) может быть востребован в качестве контраргумента при критике генно-модифицированных культур, используемых в современном сельском хозяйстве, медицине, ветеринарии. Степень разработанности проблемы.

До недавнего времени примеры горизонтального переноса генов между агробактериями и высшими растениями были известны для некоторых видов Nicotiana и для Linaria vulgaris. Последовательности клТ-ДНК детально изучены. Для части генов клТ-ДНК у видов Nicotiana показана экспрессия. Выявлено, что в эволюции рода Nicotiana было несколько независимых актов интеграции Т-ДНК. В пределах рода Linaria распространенность данного явления еще не изучена. Представленное исследование посвящено изучению последовательности клТ-ДНК у вида L. dalmatica.

Цель и задачи работы: Целью работы является - изучение агробактериальных нуклеотидных последовательностей, обнаруженных у Linaria dalmatica (L.) P. Mill. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Характеристика нуклеотидных последовательностей (го/-генов и гена опин-синтазы), в составе вставки клТ-ДНК L. dalmatica.

2. Создание генетических конструкций с геном LdrolC для последующего изучения его функции.

3. Определение структуры вставки клТ-ДНК у L. dalmatica.

4. Идентификация точки инсерции клТ-ДНК в геноме L. dalmatica.

5. Поиск новых примеров горизонтального переноса в природе между агробактериями и высшими растениями.

Основные положения, выносимые на защиту:

Для вновь описного примера горизонтального переноса генов между агробактериями и растениям у L. dalmatica изучены нуклеотидные последовательности генов, входящих в Т-ДНК: LdrolC, Lc/rolB, L¿/ORF13-l, ¿¿/ORF13-2, UORF14 и Ldmis. Показано, что вставка клТ-ДНК организована в виде прямого повтора. Определен район интеграции клТ-

ДНК в геноме L. dalmatica, который имеет сходство с Ty3-gypsy-Iike транспозоном и соответствует месту интеграции у вида L. vulgaris.

Научная новизна диссертационной работы.

В ходе выполнения работы впервые были описаны полноразмерные последовательности генов, входящих в клТ-ДНК L. dalmatica: гены, гомологичные /-«/-генам Agrobacterium rhizogenes и гену микимопин-синтазы. Идентифицирована точка интеграции клТ-ДНК в геном растения. Определена структура вставки. Проведен массовый скрининг видов двудольных растений на наличие Т-ДНК-подобных последовательностей. Созданы генетические конструкции для изучения функций гена LdrolC.

Теоретическая и практическая ценность.

Показано, что в эволюции растений горизонтальный перенос генов протекал не однократно. Установлено, что у разных видов район интеграции совпадает. Этот факт указывает на то, что акт переноса Т-ДНК эволюционно более раннее событие, чем расхождение видов. В составе клТ-ДНК выявлены консервативные последовательности, дошедшие до наших дней без изменений, что может указывать на их значимость для растения. Полученные в работе генетические конструкции для трансформации растений могут быть использованы на практике широким кругом исследователей при работе с трансгенными растениями.

Результаты данной работы могут быть использованы в материалах курсов лекций «Генетика развития растений», «Симбиогенетика», «Экологическая генетика», читаемых на кафедре генетики и биотехнологии СПбГУ. Методические подходы, использованные в работе, могут быть использованы в курсе инструментального практикума по «Генной инженерии».

Степень достоверности и апробация результатов.

Степень достоверности результатов высокая. По результатам работы были сделаны сообщения на российских и зарубежных конференциях: 33rd Annual International Crown Gall (Agrobacterium) Conference, December 1-2, 2012, Hiram, Ohio, USA., II(X) Международной Ботанической Конференции молодых ученых в Санкт-Петербурге 11 - 16 ноября 2012 года., «Достижения и перспективы развития биотехнологии» г. Саранск, 3-5 октября 2012 г., XVIII Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB) Book of Abstracts 4-9 July 2010 Valencia, Spain, Adaptation to Climate Change in the Baltic Sea Region: Contributions from Plant and Microbial Biotechnology July 12-17, 2010 Mikkeli, Finland., "Ill Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз - Россия 2010",Нижний Новгород, 24-29 мая 2010г. The International Conference "Plant Genetics, Genomics, and Biotechnology, Novosibirsk, June7-10, 2010, Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, 5 съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 21-28 июня 2009 г., Пятый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 16-20 марта 2009 г., V Съезд Общества Биотехнологов России. Москва, 2-4 декабря 2008 г., Международная научная школа-конференция молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и 1ехнологиях», Москва, 8-12 декабря 2008 г., 12-я Международная Путинская школа-конференция для молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 10-14 ноября 2008 г., The international scientific conference «S.P.Kostychev and modern agricultural microbiology» Yalta, Ukraine, October 8-12, 2007, 11-ая Международная Пущинская школа-конференция для молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 г.,«Современная биотехнология - защите окружающей среды», Пущино, 11-13 сентября 2006 г., Пущино, Международная конференция «Генетика в России и мире», посвященная 40-

jicTiiio Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва, 28 июня - 2 июля 2006 г., 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного РАН, Пущино, 17-21 апреля 2006, 4-й съезд общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Пущино, 6-7 декабря 2006 г.

По результатам работы опубликованы статьи в рецензируемых журналах.

Список публикаций по теме диссертации;

статьи:

1. Матвеева Т.В., Павлова O.A., Иваницкий К.И., Лутова Л.А. Горизонтальный перенос генов от агробактерий к растениям рода Nicotiana: эволюционные предпосылки и последствия. Вестник Санкт-Петербургского университета. Серия 3: Биология, 2009, №4. С. 58-65.

2. Матвеева Т.В., Павлова O.A., Богомаз Д.И., Демкович Е.А., Лутова Л.А. Молекулярные маркеры для видоидентификации и филогенетики растений. Экологическая генетика, 2011, T.IX, вып.1. - С.32-43

3. Matveeva T.V., Bogomaz D.I., Pavlova O.A., Nester E.W., Lutova L.A. Horizontal gene transfer from Agrobcicterium to the plant Linaria in nature. Molecular Plant-Microbe Interactions. - 2012. - V. 25. - I. 12. - P. 1542-1551.

4. Павлова O.A., Матвеева T.B., Лутова Л.А. /?о/-гены Agrobacterium rhizogenes. Экологическая генетика, - 2013. - Т. XI. - Вып. 1. - С. 59-68.

5. Павлова O.A., Матвеева Т.В., Лутова Л.А. Linaria dalmatica содержит фрагмент Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes. Экологическая генетика, 2013, в печати.

тезисы конференций:

1. Павлова О.И. (Павлова O.A.), Пигичка Т.Ю, Матвеева Т.В., Лутова Л.А. Сравнительная характеристика регенерационной способности у Nicotiana rustica и Nicotiana langsdorffú. Материалы Международной конференции

«Генетика в России и мире», посвященной 400-летию Института общей генетики им. Ы.И. Вавилова РАН, Москва, 2006. с. 147.

2. Пигичка T.IO, Павлова О.И. (Павлова O.A.), Матвеева Т.В., Лутова Л.А. Характеристика способности Nicoíiana langsdorffú к регенерации и трансформации invitro. 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного РАН, сборник тезисов, Пущино, 2006. с.389.

3. Павлова O.A.. Матвеева Т.В., Лутова Л.А. Характеристика способности к агротрансформации Nicoíiana rustica. Материалы конференции «Современная биотехнология - защите окружающей среды», электронная публикация, Пущино, 2006.

4. Матвеева Т.В., Пигичка Т.Ю., Павлова O.A., Лутова Л.А. Характеристика Nicoíiana langsdorffii и Nicoíiana rustica по способности к трансформации штаммами агробактерий дикого типа. Материалы четвертого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Пущино, 2006, с. 155-156.

5. Павлова O.A., Матвеева Т.В., Лутова Л.А. Поиск примеров горизонтального переноса генов от агробактерий к древесным формам растений. 11-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, сборник тезисов, Пущино, 2007, с. 212.

6. Павлова O.A., Матвеева Т.В. Характеристика способности Nicoíiana suaveolens к регенерации и агротрансформации in vitro.. Сборник тезисов 12-й Международной Пущинской школы-конференции для молодых ученых «Биология - наука XXI века» 10 - 14 ноября 2008 года, Пущино, 2008. с.217

7. Павлова O.A., Матвеева Т.В., Лутова Л.А. Характеристика способности Nicoíiana gossei к регенерации и агротрансформации in vitro. Сборник тезисов Международной научной школы-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях», Москва, 8-12 декабря 2008 года.

8. Матвеева Т.В., Богомаз Д.И., Павлова O.A. Иваницкий К.И., Лутова Л.А. Горизонтальный перенос генов от агробактерий в эволюции растений сем.

Solanacecie л Scrophiilariciceae. Материалы конгресса. Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва 16-20 марта 2009 г., с. 281

9. Павлова О.А., Матвеева Т.В., Лутова JI.A. Характеристика способности представителей рода Linaria к агротрансформации. Сборник тезисов Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, 5 съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, часть I, Москва, 21-28 июня 2009 г., с. 553.

Ю.Матвеева Т.В., Богомаз Д.И., Павлова О.А., Иваницкий К.И. Горизонтальный перенос генов от агробактерий к растениям: экологический аспект. Сборник тезисов Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, 5 съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, часть И, Москва, 21-28 июня 2009 г., с. 213.

П.Павлова О.А., Матвеева Т.В., Лутова Л.А. Характеристика представителей рода Nicotiana по способностям к регенерации и трансформации. // Сборник тезисов "III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биол