Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новый метод создания нормализованных библиотек КДНК с использованием дуплекс-специфической нуклеазы камчатского краба

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жулидов, Павел Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Экспрессия генов в эукариотической клетке.

1.2 подходы к поиску дифференциально экспрессирующихся генов и определению характерных профилей экспрессии.

1.3 подходы к поиску редких генов и крупномасштабные проекты по секвенированию.

1.4 подходы к созданию нормализован! 1ых библиотек.

1.5 описание кинетики процесса реассоциации нуклеиновых кислот в растворе.

1.6 Способы отделения одноцепочечной фракции нормализованных молекул к ДНК.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1 ДСН.

2.2 проверка пригодности ДСН для изоляции оц- ДНК из смеси нуклеиновых кислот.

2.3 Создание нормализованных библиотек кДНК.

2.4 модельный эксперимент-создание нормализованной библиотеки КДНК из скелетной мышцы человека.

2.5 проверка воспроизводимости метода- создание нормализованных библиотек из КДНК различных тканей человека.

2.6 создание нормализованной библиотеки КДНК из нейронов АРЕУ51А са1лроим1са.

2.7 Создание нормализованных библиотек для направленного клонирования.

2.8 Направленное удаление определенных последовательностей.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новый метод создания нормализованных библиотек КДНК с использованием дуплекс-специфической нуклеазы камчатского краба"

Одним из самых значительных достижений науки XX века стала расшифровка генома человека, и научное сообщество оказалось перед лицом новых глобальных проектов. В настоящее время значительные силы тратятся на секвенирование геномов животных, растений и микроорганизмов. Однако создание каталога генов и карты их расположения на хромосомах не раскрывает принципов функционирования генома. Даже вопрос о количестве генов человека до сих пор остается открытым.

Среди основных направлений современных масштабных исследований функционирования генома можно назвать проекты по выявлению всех экспрессиругащихся в организме последовательностей (EST, от английского expressed sequence tag); исследования профилей экспрессии генов и проекты, посвященные экспрессионному клонированию, когда в ходе функционального скрининга экспрессируемых библиотек кДНК идентифицируют гены, отвественные за определенный клеточный фенотип (в частности гены-мишени для лекарственных препаратов).

Все указанные типы проектов сталкиваются со значительными трудностями, связанными с гетерогенностью популяций мРНК, экспрессирующихся в клетке и большими различиями в уровне представленности различных типов мРНК. Эффективным решением проблем, связанных с необходимостью анализа чрезвычайно большого количества клонов для исчерпывающего изучения библиотеки является нормализация библиотеки кДНК (выравнивание уровня представленности различных генов в библиотеке).

Несмотря на то, что за последние 15 лет был разработан целый ряд методов создания нормализованных библиотек кДНК, все они имеют существенные недостатки. Основная цель данной работы состояла в разработке нового метода нормализации библиотек кДНК, который лишен недостатков уже существующих методов, сочетает в себе простоту и эффективность и может быть применен при решении самых разнообразных задач.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Жулидов, Павел Александрович

выводы

Показана возможность изоляции одноцепочечной ДНК из смеси с двуцепочечной ДНК и гетеродуплексами ДНК/РНК при помощи дуплекс-специфической нуклеазы из гепатопанкреаса камчатского краба. Показана высокая специфичность ДСН по отношению к дц- ДНК.

Предложен новый метод, позволяющий создавать библиотеки кДНК обогащенные полноразмерными последовательностями с приблизительно равной представленностью всех видов транскриптов. В серии модельных экспериментов показана высокая эффективность и хорошая воспроизводимость метода. С использованием предложенного метода создана нормализованная библиотека кДНК из гигантских метацеребральных клеток Ар1у$1а саН/огтса. Анализ результатов секвенирования полученной библиотеки кДНК подтвердил высокую эффективность разработанного метода.

Разработана модификация метода, позволяющая существенно упростить поиск новых генов путем функционального скрининга с помощью удаления известных нуклеотидных последовательностей из анализируемых библиотек кДНК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жулидов, Павел Александрович, Москва

1. Akowitz A, Manuelidis L. A novel cDNA/PCR strategy for efficient cloning of small amounts of undefined RNA. Gene, 1989; 81: 295-306.

2. Antequera F, Bird A. Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proc Natl AcadSci USA., 1993; 90: 11995-11999.

3. Ayoubi ТА, Van De Ven WJ. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEBJ., 1996; 10:453-460.

4. Bals R, Jany Identification of disease genes by expression profiling. Eur Respir J, 2001; 18: 882-889.

5. Balzer HJ, Baumlein H. An improved gene expression screen. Nucleic Acids Res., 1994; 22: 2853-2854.

6. Belyavsky A, Vinogradova T, Rajewsky K. PCR-based cDNA library construction: general cDNA libraries at the level of a few cells. Nucleic Acids Res., 1989; 17: 29192932.

7. Bertioli D, Schlichter U, Adams M, Burrows P, Steinbis H, Antoniw J. An analysis of differential display shows a strong bias towards high copy number mRNAs. Nucleic Acids Res., 1995;23:4520-4523.

8. Bishop JO, Morton JG, Rosbash M, Richardson M Three abundance classes in HeLa cell messenger RNA. Nature, 1974; 250: 199-204.

9. Bonaldo MF, Lennon G, and Soares MB. Normalization and subtraction: Two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res., 1996; 6: 791-806.

10. Britten RJ, Kohne DE. Repeated sequences in DNA. Hundreds of thousands of copies of DNA sequences have been incorporated into the genomes of higher organisms. Science, 1968; 161:529-540.

11. Caetano AR, Johnson RK, Pomp D. Generation and sequence characterization of a normalized cDNA library from swine ovarian follicles. Mamm Genome, 2003; 14: 65-70.

12. Chenchik A, Zhu YY, Diatchenko L, Li R, Hill J, Siebert PD. Generation and use of high-quality cDNA from small amounts of total RNA by SMART PCR. In Gene cloning and analysis by RT-PCR. BioTechniques Books, MA; 305-319.

13. Davidson E, Britten R. Regulation of gene expression: possible role of repetitive sequences. Science, 1979; 204: 1052-1059.

14. Draper MP, August PR, Connolly T, Packard B, Call KM. Efficient cloning of full-lengthcDNAs based on cDNA size fractionation. Genomics, 2002; 79: 603-607.

15. Duguid J. R., Rohwer R. G. and Seed B. Isolation of cDNAs of scrapie-modulated RNAsby subtractive hybridization of a cDNA library. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988; 85:5738-5742.

16. Edery I, Chu LL, Sonenberg N, Pelletier J. An efficient strategy to isolate full-length cDNAs based on an mRNA cap retention procedure (CAPture). Mol Cell Biol., 1995; 15: 3363-3371.

17. Engler-Blum G, Meier M, Frank J, Muller G. Reduction of background problems in nonradioactive Northern and Southern blot analysis enables higher sensitivity then 32P-based hybridizations. Anal. Biochem, 1993; 44: 235-244.

18. Fields C, Adams MD, White O, Venter JC. How many genes in the human genome? Nat Genet., 1994; 7: 345-346.

19. Franz O, Bruchhaus II, Roeder T. Verification of differential gene transcription using virtual northern blotting. Nucleic Acid. Res, 1999; 27, e3.

20. Galau GA, Klein WH, Britten RJ, Davidson EH. Significance of rare m RNA sequences in liver. Arch. Biochem. Biophys., 1977; 179: 584-599.

21. Hampsey M. Molecular genetics of the RNA polymerase II general trancriptional machinery. Microbiol Mol Biol Rev 1998; 62: 465-503.

22. Harrington CA, Rosenow C, Retief J. "Monitoring gene expression using DNA microarrays" Curr Opin Microbiol., 2000; 3: 285-291.

23. Kato K. RNA fingerprinting by molecular indexing. Nucleic Acids Res., 1996; 24: 394395.

24. Kato S, Sekine S, Oh SW, Kim NS, Umezawa Y, Abe N, Yokoyama-Kobayashi M, Aoki

25. T. Construction of a human full-length cDNA bank. Gene, 1994; 150: 243-250.

26. Kim AS. Clinical impact of gene expression profiling on oncology diagnosis, prognosis,and treatment. Comb Chem High Throughput Screen., 2004; 7: 183-206.

27. Ko MS. An 'equalized cDNA library' by the reassociation of short double-strandedcDNAs. Nucleic Acids Res., 1990; 18: 5705-5711.

28. Kohne D, Levison S and Byers M. Room temperature method for increasing the rate of DNA reassociation by many thousandfold: the phenol emulsion reassociation technique. Biochemistry, 1977; 16: 5329.

29. Madden SL, Wang CJ, Landes G. Serial analysis of gene expression: from gene discovery to target identification. Drug Discov Today 2000; 5: 415-425

30. Roses AD. Pharmacogenetics and the practice of medicine. Nature, 2000; 405: 857-865. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. N. Y., Cold Spring Harbor, 1989.

31. Sargent T, Dawid IB. Differencial gene expression in the gastrula of Xenopus laevis. Science, 1983; 222:135-139.

32. Sasaki YF, Dai Ayusawa and Michio Oishi "Construction of a normalized cDNA library by introduction of a semi-solid mRNA-cDNA hybridization system" Nucleic Acids Res., 1994; 22:987-992.

33. Shagin DA, Lukyanov KA, Vagner LL, Matz MV. Regulation of average length of complex PCR product. Nucleic Acids Res., 1999; 27(18): e23.

34. Snider BJ, Morrison-Bogorad M. Brain non-adenylated mRNAs. Brain Res Rev. 1992; 17: 263-282.

35. Soares M, Bonaldo M, Jelene P, Su L, Lawton L, and Efstratiadis A. Construction and characterization of a normalized cDNA library. Proc. Natl. Acad. Sci., 1994; 91: 92289232.

36. Spiess AN, Ivell R. "A highly efficient method for long-chain cDNA synthesis using trehalose and betaine" Anal Biochem., 2002,301: 168-174.

37. Suzuki H, Yaoi T, Kawai J, Hara A, Kuwajima G, Wantanabe S. Restriction landmark cDNA scanning (RLCS): a novel cDNA display system using two-dimensional gel electrophoresis. Nucleic Acids Res., 1996; 24: 289-294.

38. Suzuki Y, Yoshitomo-Nakagawa K, Maruyama K, Suyama A, Sugano S. Construction and characterization of a full length-enriched and a 5'-end-enriched cDNA library. Gene, 1997; 200: 149-156.

39. Tanaka T, Ogiwara A, Uchiyama I, Takagi T, Yazaki Y, and Nakamura Y. Construction of a normalized directionally cloned cDNA library from adult heart and analysis of 3040 clones by partial sequencing. Genomics, 1996; 35: 231-235.

40. Timberlake WE. Developmental gene regulation in Aspergillus nidulans. Dev. Biol., 1980; 78: 497-500.

41. Timblin C, Battley J, Kuehl WH. Application of PCR technology to subtractive cDNA cloning: identification of genes expressed specifically in murine plasmacytoma cells. Nucl. Acids Res., 1990; 18: 1587-1593.

42. Travis GH and Sutcliffe JG. Phenol emulsion-enchanced DNA-driven subtractive cDNAcloning: Isolation of low-abundance monkey cortex-specific mRNA. Proc. Natl. Acad.

43. Sci. USA, 1988; 85: 1696-1700. /.

44. Urmenyi TP, Bonaldo MF, Soares MB, Rondinelli E. Construction of a normalized cDNA library for the Trypanosoma cruzi genome project. J Eukaryot Microbiol., 1999; 46: 542544.

45. Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW. Serial analysis of gene expression. Science, 1995; 270: 484-487.

46. Wang Z, Brown DD. A gene expression screen. Proc.Natl. Acad. USA, 1991; 88: 1150511509.

47. Warrington JA, Archana N, Mamatha M, Tsyganskaya M. Comparision of human adult and fetal expression and identification of 535 hosekeeping/maintenance genes. Physiol Genomics, 2000; 2: 143-147.

48. Weissman SM. Molecular genetic techniques for mapping the human genome. Mol Biol Med., 1987; 4: 133-143.

49. Welsh J, Chada K, Dalai SS, Cheng R, Ralph D, McClelland M. Arbitrarily primed PCR fingerprinting of RNA. Nucleic Acids Res., 1992; 20: 4965-4970.