Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые пути регуляции функциональной активности лизилоксидазы человека

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Новые пути регуляции функциональной активности лизилоксидазы человека"

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи Оккельман Ирина Александровна

03.01.03 - Молекулярная биология

НОВЫЕ ПУТИ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИЗИЛОКСИДАЗЫ ЧЕЛОВЕКА

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005533127 19 СЕНШ

Москва-2013

005533127

Работа выполнена в Группе кросс-сшивающих ферментов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Научный руководитель:

кандидат химических наук Пестов Николай Борисович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Бабаков Алексей Владимирович

кандидат химических наук Пахомов Алексей Александрович

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Защита состоится «Я » октября 2013 г. в 10-00 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

I ^

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждении науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Автореферат разослан «5"» сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор физ.-мат. наук ---Олейников В.А.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Взаимодействия белков лежат в основе выполняемых ими функций. Совокупность всех биологически значимых белковых взаимодействий в рамках целого протеома носит название интерактом. На сегодняшний день все больше внимания уделяется исследованиям как глобальных интерактомов различных организмов, так и интерактомов отдельных белков. Составление карт взаимодействий между биомолекулами (например, белками) позволяет систематизировать и расставить отдельные фрагменты гигантской «интерактомной мозаики» на свои места и прогнозировать возможные пути функционирования и регуляции биологических процессов. Использование подобного подхода имеет ценность не только для фундаментальных биологических исследований, но и важно для разработки новых подходов в медицине. В наши дни для решения этой задачи используют высокопоточные методы анализа взаимодействий биомолекул в клетках и организмах. Однако, именно в силу гигантского объема информации, получаемой с помощью высокопоточных поисковых методов, их применение порождает массу «ошибок» и «пробелов» в составляемых интерактомных схемах. Поэтому интерактомные исследования, осуществляемые небольшими коллективами, обычно посвященные отдельному объекту, часто дают более достоверные результаты о молекулярных взаимодействиях и их роли в функционировании организмов.

Наиболее ярким примером приложения интерактомного подхода являются исследования этиологии онкологических заболеваний. В настоящее время считается, что канцерогенез - это сложный, многоэтапный процесс, одним из движущих факторов которого является взаимодействие опухоли и ее окружения, а также изменение характеристик клеточных интерактомов. Особый интерес в этом плане представляют собой белки, непосредственно вовлеченные в процессы метастазирования и прогрессии опухоли, в частности, семейство лизилоксидаз (1ЛХ, ЬОХЫ, ЬОХЬ2, ЬОХЬЗ, ЬОХЬ4). Все представители семейства лизилоксидаз характеризуются высокой консервативностью аминокислотной последовательности каталитического домена и проявляют схожую субстратную специфичность. Эти белки секретируются различными типами клеток во внеклеточное пространство, где они участвуют в посттрансляционной модификации коллагена и эластина, формируя тем самым структуру внеклеточного матрикса. В то же время ряд представителей семейства лизилоксидаз (ЬОХ и ЬОХЬ2) найдены в ядрах клеток, где они участвуют в регуляции экспрессии генов, например, гена кадгерина Е, репрессия которого приводит к изменению клетками фенотипа с эпителиального на мезенхимальный, характеризующийся большей миграционной активностью. Несмотря на успешность

функциональных исследований, остаются непонятыми молекулярные механизмы этих процессов и конкретная роль лизилоксидаз в них. Поэтому составление интерактомнон карты белковых взаимодействий с участием лизилоксидаз позволило бы проанализировать возможные механизмы работы этих белков, а также установить роль внеклеточной и внутриклеточной функциональной активности лизилоксидаз в прогрессии опухолей.

Так как лизилоксидазы непосредственно участвуют в метастатической прогрессии опухолей и являются потенциальной мишенью для терапии онкологических заболеваний, остро встает вопрос о возможности специфического воздействия на ферментативную активность этих ферментов in vivo. Необходимо отметить, что до сих пор не созданы лекарственные препараты, ингибирующие активность этих ферментов, пригодные для применения в медицинской практике. Известные на сегодняшний день ингибиторы лизилоксидаз обладают высокой токсичностью и неспецифичностью действия по отношению к лизилоксидазам и не пригодны для медицинских целей. В то же время полное ингибирование лизилоксидазной активности нежелательно, так как эти белки крайне необходимы для нормального функционирования тканей. Поэтому наиболее перспективным направлением исследований является поиск возможных альтернативных путей регулирования / моделирования активности лизилоксидаз.

Научная новнзна и практическая ценность работы. В данной работе с использованием различных поисковых методов (например, «молекулярный фишинг», двугибридный дрожжевой скрининг) определен ряд новых, до этого момента неизвестных белков-партнеров лизилоксидазы человека. Хотя подобные работы уже проводились рядом авторов [Fogelgren et al, 2005; Polgar et al, 2007], до сих пор круг известных белков-партнеров лизилоксидаз очень узок и ограничен, в основном, данными о внеклеточных интеракторах этого белка. Данное исследование не только выявило ряд новых потенциальных внутриядерных интеракторов лизилоксидазы человека, но и позволило выдвинуть гипотезу, объясняющую механизм регуляции лизилоксидаза-зависимой репрессии гена кадгерина Е. По результатам работы также была составлена карта фрагмента глобального интерактома с участием лизилоксидаз.

В данной работе был осуществлен не только поиск новых интеракторов лизилоксидазы, позволяющий предположить новые пути регуляции ее функциональной активности в организме, но также предложен уникальный метод модуляции каталитической активности лизилоксидазы, основанный на применении изотопного эффекта. Этот метод может быть использован как новый инструмент для исследований функциональной активности лизилоксидаз.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлся поиск новых путей регуляции функциональной активности лизилоксидазы человека с помощью различных подходов н методов. В связи с этим предполагалось решить следующие задачи:

1. Получить продуценты рекомбинантной лизилоксидазы на основе различных систем экспрессии белков и, по возможности, выделить каталитически активную лизилоксидазу.

2. Охарактеризовать локализацию каталитического домена лизилоксидазы в различных тканях, а также в культурах различных клеточных линий, в том числе в первичной культуре.

3. С помощью дрожжевой двугибридной системы произвести поиск белок-белковых взаимодействий каталитического домена лизилоксидазы в организме человека.

4. Подтвердить взаимодействия, идентифицированные в дрожжевой двугибридной системе, с помощью альтернативных методов - связывания in vitro, колокалнзации в клетке и других.

5. Произвести поиск новых интеракторов лизилоксидазы методом «молекулярного фишинга» с последующей идентификацией белков при помощи масс-спектрометрии. Подтвердить детектированные взаимодействия независимыми методами.

6. Измерить изотопный эффект сайт-специфичного дейтерирования нативных субстратов лизилоксидазы и протестировать возможность регуляции лизилоксидазной активности при помощи данного подхода.

7. Исследовать особенности внутриклеточной локализации предполагаемого онкосупрессора ТТС4.

Аппобация работы. Основные результаты работы были представлены на международных конференциях "Cancer Proteomics, 2009" (Дублин, Ирландия), "The 25Ih Anniversary Symposium of the Protein Society" (Бостон, США, 2011) и "15th Amine Oxidase Congress, AOC 2012" (Тулуза, Франция), а также на "Х-ых чтениях, посвященных памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова", (Москва-Пущино, Россия, 2011), «Белки и пептиды» (Казань, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ - 2 статьи в реферируемых научных журналах и 7 в сборниках тезисов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав основной части (литературный обзор, результаты и обсуждение, экспериментальная часть), выводов, приложения и списка литературы, включающего 265 источников. Работа содержит 43 рисунка и 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Изотопный эффект сайт-специфического дейтерирования лизина на каталитическую активность лизилоксидазы

Разработка новых методов ингибирования и регуляции активности лизилоксидазы in vivo является очень важной для выяснения роли лизилоксидазы в различных физиологических процессах и, возможно, средством для коррекции таких патологических процессов как фиброз и метастатическая прогрессия опухолей. На сегодняшний день для ингибирования ферментативной активности LOX применяют агенты, способные связывать медь, антитела и низкомолекулярные ингибиторы, такие как BAPN и его производные. Все из вышеперечисленных ингибиторов имеют серьезные недостатки. В то же время полное ингибирование лизилоксидазной активности может быть нежелательным, так как помимо участия лизилоксидазы в образовании преметастатической ниши - «среды обитания» для вновь формирующихся метастазов, LOX необходима для поддержания правильной структуры сосудов, кожи, костей, хрящевой ткани, а в молодом организме необходима для правильного роста и закладки тканей. Поэтому наилучшим способом корректировки нежелательной активности лизилоксидазы является не ингибирование, а модуляция работы. Такую возможность может дать применение кинетического изотопного эффекта (КИЭ). Известно, что в некоторых случаях дейтерирование лекарственных препаратов может улучшить их фармакодинамические свойства. Исходя из этих соображений, было решено измерить кинетический изотопный эффект на активность лизилоксидазы с использованием дейтерированных субстратов LOX.

В качестве дейтерированного субстрата LOX мы использовали 6,6-02-лизин и его пептидные производные, любезно синтезированные Шманаем В.В. и A.JI. Хурским (Институт Физической Органической Химии Национальной академии наук Республики Беларусь). Использование производных лизина с заменой атомов водорода на дейтерий только при шестом атоме углерода было неслучайным, так как замена атомов водорода в других положениях может привести к нежелательным последствиям. Например, водородные атомы при пятом атоме углерода вовлечены в процесс образования гидроксилизина в составе коллагена в реакции, катализируемой лизилгидроксилазой. В то же время, отщепление одного из атомов водорода в шестом положении является неотъемлемой стадией в реакции окислительного дезаминирования.

Лизилоксидаза, использованная для этих исследований, была получена из аорты барана путем экстракции растворами мочевины, с последующей ионообменной хроматографией, высаливанием сульфатом аммония и гель-фильтрацией. Так как для определения активности лизилоксидаз необходимо проводить измерения с контрольными образцами в присутствии

4

специфического ингибитора LOX BAPN, крайне важным было получить препарат лизилоксидазы без загрязнения другими аминоксидазами (особенно SSAO, для которой BAPN является одновременно слабым субстратом и конкурентным ингибитором). Поэтому полученный препарат лизилоксидазы перед использованием в эксперименте тестировали на присутствие активности SSAO в беренил-чувствительной реакции окисления специфического субстрата SSAO - метиламина. Так как LOX не чувствительна к действию беренила, специфического ингибитора SSAO, такой метод мониторинга на присутствие SSAO в препарате можно использовать на каждой из стадий выделения лизилоксидазы. Таким образом, нам удалось получить препарат, обладающий лизилоксидазной активностью и свободный от примесей SSAO. Присутствие в препарате лизилоксидазы было проверено методом иммуноблотинга (рис. 1) с использованием моноклональных мышиных антител к каталитическому домену лизилоксидазы (любезно предоставлены A.J. Giaccia),

л в

17k Da —

Рис. I. Иммупоб.ютинг рекомбинантной мышиной mLOX, полученной о Е.соН (А) и LOX, выделенной из аорты барана (В). Рекомбинантная mLOX выделена из клеток Е. coli (штамм SG13009) и подвергнута рефолдингу для получения растворимого белка. Белки препаратов LOX были разделены электрофорезом в ПЛАТ, перенесены на PVDF мембрану с последующим инкубированием с мышиными моноклональными антителами к LOX и визуализацией при помощи хемилюминесцентного субстрата пероксидазы хрена. Электрофоретическая подвижность ниже теоретической в случае рекомбинантной мышиной лизилоксидазы объясняется присутствием N-концевого пептида MRGSHHHHHHGS.

Для мониторинга окислительной реакции, катализируемой лизилоксидазой, мы

использовали флуорометрический анализ, основанный на измерении стехиометрического

образования Н2О2 в реакции окислительного дезаминирования субстратов LOX. Для

характеристики КИЭ необходимо и достаточно измерить эффект дейтерирования на

максимальную скорость (Vmax) - DV, а также на отношение Vmax/Km - DVK (последнее

соответствует отношению скоростей окисления нормального и дейтерированного

субстратов при бесконечно малой концентрации субстрата). Оказалось, что DVK для 6D2-

лизина равен 4.35+0.22 (п=4) при 37°С. Интересно, что гораздо меньшее влияние оказывается

на DV, для лизина это значение близко к 1 (1.34±0.3) (рис. 2А). Это означает, что при очень

больших концентрациях субстрата действие изотопного эффекта нивелируется. Такие

результаты можно объяснить следующими соображениями относительно механизма

ферментативной реакции: реакционный цикл LOX и других медь-зависимых аминоксидаз

подчиняется механизму типа «пинг-понг» и включает в себя стадию удаления атома

5

водорода, как одну из скорость-лимитирующих стадий. Вместе с этим существует другая скорость-лимитирующая стадия - окисление хинонимина молекулярным кислородом. Поэтому низкие показатели "V свидетельствуют о сильном влиянии стадии окислительной полуреакции на суммарную скорость реакции. Это также подтверждает тот факт, что при постановке LOX-катализируемой реакции в условиях гипоксии (данные не приведены) показатели DVK тоже приближаются к единице. При этом даже при низких концентрациях субстрата фактором, определяющим скорость реакции, будет концентрация кислорода, и изотопный эффект будет мал.

КИЭ может быть использован для уменьшения активности лизилоксидазы без полного ее блокирования. Однако, чтобы действительно оценить практическое значение изотопного эффекта, оказываемого на отношение величин V„,„,/Km необходимо проводить эксперименты, приближенные к условиям in vivo. Это может быть достигнуто использованием сайт-специфически дейтерированных белков и пептидов. В случае высокомолекулярных субстратов образование и диссоциация фермент-субстратного комплекса может в значительной степени лимитировать реакцию и маскировать изотопный эффект. По этой причине, очень важно измерить КИЭ на полипептидных субстратах. Уровень аутокаталитического окисления у лизилоксидазы невысок, так как этот фермент содержит низкий уровень аминокислотных остатков лизина в своей последовательности proLOX (так всего 6 остатков Lys приходится на 417 аминокислотных остатков последовательности proLOX человека). Учитывая эти факторы, мы получили типичный пептидный фрагмент последовательности коллагена, содержащий один дейтерированный остаток лизина. Скорость его окисления была измерена в диапазоне концентраций от 0.1 до 0.8 мМ и показано, что UVK для этого 6,6-D2-Lys-co;iep>Kaiuero пептида равен 3.1 при 37°С (рис. 2В).

А В

Рис. 2. А. Изотопный эффект дейтерирования субстрата на окисление свободного лизина лизилоксидазой. В. Изотопный зффект дейтерирования субстрата на окисление 1,у$~содержащего пептида Ас-11СаС0ЕКССССС-1УН2 лизилоксидазой из аорты барана. Квадратами обозначен немеченый лизин, треугольниками дейтерированный лизин (6,6-П2-Ьу$) (значения трех повторных измерении). °УК определяли по соотношению наклонов прямых зависимости, а °У - по соотношению пересечении с осью у. В случае экспериментов с использованием лизинового субстрата четыре независимых препарата ЬОХ из аорты барана дани следующие значения °УК=4.35+0.22 и °У=1.34±0.3 (среднее ± стандартное отклонение). Для Ьуь-содержащего пептида -3.1.

Таким образом, разработан новый способ регуляции лизилоксидазной активности, который может оказаться полезным для исследований роли окисления белковых субстратов лизилоксидазой в экспериментах на животных и клеточных моделях. В то же время перспективы применения его для медицинских целей сомнительны в виду чрезвычайно высокой стоимости дейтерированного лизина.

2. Исследование локализации эндогенной лизилоксидазы в различных клеточных линиях, тканях и первичной культуре фибробластов

Аминокислотная последовательность полноразмерной лизилоксидазы (ppLOX) представляет собой совокупность трех структурно-функциональных регионов: сигнального пептида, пропептидного домена (LOPP), и каталитического домена (mLOX), отделенного от последовательности LOPP последовательностью сайта протеолитической деградации (DDR). Обычно новосинтезированный белок секретируется во внеклеточное пространство и локализуется на соединительнотканных волокнах, однако некоторые исследования свидетельствуют о ядерной локализации этого белка в некоторых типах клеток, например, в гладкомышечных клетках и фибробластах. Мы решили изучить, насколько широко распространена ядерная локализация LOX. Для этого мы проанализировали локализацию лизилоксидазы в имеющихся в нашем распоряжении клеточных линиях и сравнили ее с локализацией LOX в некоторых доступных для нас тканевых образцах. Мы наблюдали преимущественно ядерную локализацию и в меньшей степени цитоплазматическую локализацию эндогенной лизилоксидазы во всех исследованных нами препаратах различных клеточных линий (рис. 3). При этом эндогенный белок был локализован в ядрах в виде точечных структур, вне области расположения ядрышек.

Так как современные клеточные культуры являются иммортализованными клеточными линиями, претерпевшими многократное культивирование, и по многим своим характеристикам часто отличаются от нормальных (неиммортализованных) клеток и первичных клеточных культур, мы решили также проанализировать локализацию эндогенной лизилоксидазы в клетках первичной культуры и в некоторых доступных тканевых препаратах человека. Для исследования поведения LOX в первичной культуре мы использовали фибробласты, полученные из эмбриона курицы (рис. 4). Клетки культивировали в течение нескольких недель и подвергали иммуноцитохимическому анализу с использованием антител к лизилоксидазе. Для первичной клеточной культуры фибробластов также была характерна ядерная локализация LOX в клетке в точечных структурах. В то же время в этих клетках мы наблюдали более интенсивное, чем в случае иммортализованной культуры фибробластов мыши, окрашивание цитозоля, напоминающее

структуры секреторных везикул и, вероятно, связанное с повышенной продукцией и секрецией ЬОХ. Однако, в целом локализация лизилоксидазы в первичной и иммортализованных клеточных линиях была аналогичной, что позволяет использовать иммортализованные клеточные культуры для исследования ядерной ЬОХ.

МИН' N' У? •

М1"1-7 1 Л 549 £: £ _

Рис. 3. Липли < клеточной локализации лизилоксидазы в различных линиях клеток: мышиных фибробластов ШНЗТЗ, НеЬа (аденокарцинома человека, эпителиальная морфология), А549 (клеточная линия немелкоклеточнои карциномы легкого человека), МС1'-7 (клеточная линия рака молочной железы человека, эпителиальная морфология). Зеленая и красная флуоресценция соответствует лшилоксидазе, меченной антителами к эпитопу каталитического домена 10Х, синяя флуоресценция соответствует окраске ядер клеток ОАР1. Масштаб Юмкм.

|>АР1 ;иП11()\ апШ)о<1у гнег£е

л-

Рис. 4. Анализ локализации эндогенной лизилоксидазы в клетках первичной культуры эмбриона курицы.

Зеленая флуоресценция соответствует лизилоксидазе, меченной антитечами к эпитопу каталитического домена ЬОХ, синяя флуоресценция соответствует окраске клеточных ядер ОАР1. Масштаб Юмкм.

Однако мы не наблюдали ядерной локализации лизилоксидазы при анализе тканевых образцов, даже в случае клеток с выраженной фибробластоподобной морфологией (как в образцах соскоба эндометрия матки, взятого у пациентки с дисплазией эндометрия (рис. 5), в сравнении с эндометрием здорового пациента (рис. 6). В тканях с хорошо выраженным внеклеточным матриксом, как, например, в случае трахеи эмбриона курицы, мы наблюдали исключительно внеклеточную локализацию лизилоксидазы вдоль соединительнотканных волокон (рис. 7). Таким образом, в клеточной культуре т VIIго мы наблюдали нехарактерную для тканевых препаратов ядерную локализацию лизилоксидазы. Возможно, что ту или иную локализацию ЬОХ определяет не только природа клеток, но и структура внеклеточного матрикса. Однако не исключено, что существуют и другие объяснения этого явления.

Рис. 5. Анализ локализации эндогенной лизилоксидазы в клетках эндометрия матки при диаиазии эндометрия. Для окрашивания парафинового среза ткани использовали антитела к каталитическому домену 1,ОХ. На препарате видны клетки с характерной для фибробластов морфологией, в которых локализация эпитонов лизилоксидазы соответствует цитотазматическому компартменту клетки, а не ядерному.

DAPI antil.OX merged

•

•

о •

IMPI anliLOX merged

Рис. 6. Анализ локализации эндогенной лизилоксидазы в клетках эндометрия матки (норма). Два увеличения. В препарате видны отдельные клетки округлой формы с сегментированным ядром, в которых локатзация эндогенной лизилоксидазы соответствует цитоплазматическому компартменту. Масштаб 10 мкм.

Рис. 7. Иммунофлуоресцентный гистохимический анализ локализации эндогенной лизилоксидазы в образцах трахеи эмбриона курицы. Красная флуоресценция соответствует распределению лизилоксидазы вдоль волокон внекчеточного матрикса. Синяя флуоресценция окраска DAPI ядер клеток.

Мы также исследовали локализацию клеточной лизилоксидазы в препарате крови человека. Мазки крови, фиксированные в холодном метаноле (-20°С), окрашивали по стандартной методике антителами к каталитическому домену лизилоксидазы (чтобы убедиться в специфичности антител, этот эксперимент был воспроизведен с несколькими различными антителами: как с коммерческими, так и с полученными в нашей лаборатории). Результат представлен на рис. 8. Положительное окрашивание антителами к LOX наблюдали только у тромбоцитов (В) и сегментоядерных лейкоцитов (А).

Рис. 8. Локализация лизилоксидазы в клетках крови человека. А - сегментоядерные лейкоциты, В -тромбоциты. Зеленая флуоресценция соответствует локализации ЮХ, синяя флуоресценция окраска ОАР1 ядер клеток. Масштаб 10 мкм.

Отметим, что присутствие ЬОХ в тромбоцитах нами показано впервые, в то же время функция лизилоксидазы в тромбоцитах остается неясной.

3. Исследование интерактома лизилоксидазы

Для интерактомных исследований лизилоксидазы человека был применен спектр методологических подходов, позволивший представить наиболее полную картину взаимодействий лизилоксидазы. Мы не ограничились применением только одного способа поиска белковых взаимодействий и подтвердили у некоторых интеракторов способность взаимодействовать с каталитическим доменом лизилоксидазы с помощью альтернативных методов.

3.1. Поиск белков интеракторов лизилоксидазы методом «молекулярного фишинга».

Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа - новая субстратная мишень лизилоксидазы

В качестве материала для получения белковых экстрактов использовали следующие ткани: печень, головной мозг, почки и семенники крыс породы \VISTAR в возрасте от 0,5 до 1 года. Органы гомогенизировали с добавлением ингибиторов протеаз, гомогенат подвергали процедуре центрифугирования и фильтрации для разделения водорастворимой и нерастворимой фракции. Водонерастворимую фракцию препарата подвергали последовательно дополнительной экстракции растворами неионных детергентов и мочевины. Полученные тканевые экстракты последовательно пропускали через три тандемные колонки с иммобилизованными рекомбинантными белками: Рт-субъединицей Х,К-АТФазы (контрольный белок), пропептидным доменом лизилоксидазы (ЬОРР) и ее каталитическим доменом (тЬОХ). После инкубации с тканевыми экстрактами систему последовательно промывали от неспецифически связанных белков, чередуя растворы на

10

основе PBS, содержащие 1 М мочевину, с растворами, содержащими неионный детергент Triton XI00. После промывания проводили элюцию прочно связанных белков. Элюцию осуществляли с каждой отдельной колонки последовательно буферными растворами, содержащими как мочевину, так и мочевину с имидазолом. Полученные элюаты концентрировали ультрафильтрацией и анализировали методом электрофореза в 13.5% ПААГ. Специфические связанные белки анализировали при помощи масс-спектрометрии. В препарате, элюированном 4М мочевиной, нам удалось детектировать глицеральдегидфосфатдегидрогеназу (GAPDH) (полоса, соответствующая 36-37 кДа на рис. 9) в качестве возможного интерактора каталитического домена LOX.

Рис. 9. Схема эксперимента по «молекулярному фишипгу» белков-партнеров лтилоксидаш ui тканей крысы. Па рисунке также представлен результат мектрофоретического разделения белков одной из фракций полученных элюцией раствором состава 4 М мочевина/PBS рН 7.4. LOPP пропептид лизилоксидазы, (1т -контрольный белок.

Так как нам не удалось подтвердить взаимодействие GAPDH/mLOX in vitro методом пулл-даун, мы предположили, что это взаимодействие слабое или требует особых условий. Такое взаимодействие может подразумевать и то, что GAPDH служит субстратом в реакции, катализируемой лизилоксидазой. Аминокислотная последовательность GAPDH богата аминокислотными остатками лизина, например, входящими в состав сигнала ядерной локализации GAPDH. Модификации этих лизинов важны для регуляции транспорта белка между цитоплазмой и ядром клетки, что влияет на процессы транскрипции, репликации, транспорта РНК и апоптоза, осуществляемые при участии GAPDH. Для тестирования этой гипотезы мы разработали новый метод определения лизилоксидазной активности, который можно успешно применять для исследования субстратных характеристик крупных белковых молекул, основанный на поляризации флуоресценции зонда с активной карбонильной группой (рис. 10).

Получение белковых экстрактов из тканей и инкубация их с рекомбинантными белками-наживками, иммобилизованными на смоле.

250klXi

l.iuklb --

45U>a

Идентификация образца методом масс-спектрометрии как GAPDH

Дополнительные исследования взаимодействия LOX/GAPDH

20,0 10,0 0,0

no GAPDH

20

Рис. 10. Зависимость поляризации флуоресценции от количества препарата LOX, используемого в реакции. Перед измерением поляризации флуоресценции препарат LOX инкубировали в течение 30 мин с GAPDH. Для определения вкчада лизилоксидазной активности во включение флуоресцентной метки в молекулы GAPDH ту же процедуру проводили в присутствии ингибитора BAPN. В качестве контроля использовали препарат LOX, инкубированный без GAPDH.

3.2. Поиск новых белковых партнеров зрелой формы лизилоксидазы человека в системе дрожжевого двугибридного срининга.

Другим подходом, использованным для поиска новых интеракторов mLOX, был метод двугибридного дрожжевого скрининга. В качестве «наживки» использовали каталитический домен LOX человека, как наиболее консервативный структурный элемент всех изоферментов семейства лизилоксидаз. Скрининг проводили с использованием нормализованной универсальной библиотеки кДНК человека (Clontech). Было идентифицировано около 300 клонов, у которых наблюдался положительный рост на селективной среде, дефицитной по аденину и гистидину. Наиболее перспективные интеракторы были подвергнуты дополнительной проверке на способность активировать промотор а-галактозидазы в штамме АН 109. После отсева всех ложноположительных клонов был составлен список наиболее интересных интеракторов лизилоксидазы (Таб.1). Анализ литературы и известных интерактомных баз данных (PIPs, BioGrid, String) позволил составить фрагмент карты взаимодействий лизилоксидазы (рис. 11). Некоторые из новых интеракторов являются ядерными резидентами (например MDC1, p66fi, 2G4). Исследование функционального значения этих взаимодействий может прояснить роль внутриядерной лизилоксидазы. В то же время не меньший интерес представляет собой взаимодействие LOX с белком SOS2, являющимся одним из важных компонентов Ras-опосредованных сигнальных путей. Как известно, LOX является онкосупрессором Ras-трансформированных опухолей, т.е. роль LOX в канцерогенезе становится противоречивой и поэтому особенно интересной. Наши дальнейшие исследования мы сосредоточили на изучении взаимодействия mLOX/рббр и его функций в клетке.

Интерактор Номер Gene Bank Кол-во клонов Амипокислотпые координаты Функциональный домен белка вовлеченный во взаимодействие с ЬОХ Функция шггеракгора Роль в оикогеиезе

S0S2 (Son of sevenless 2) AAI43368.1 1 1169-1248 Богатый пролииом регион (содержит 5НЗ-связывающий домен) Катализирует реакцию обмена ГДФ на ГТФ в ГТФазе RAS Изменения в продукции белка не оказывают влияния на нормальное развитие у мышей; неизвестная роль в прогрессии рака.

рббр NP_065750.1 1 334-593 СЯ2-домеи, содержащий последовательность цинковых пальцев Компонент нуклеосом- ремоделирующего комплекса Mi2/NuRD; репрессия транскрипции Не известно

MDCl (medialor of DNA damage checkpoint 1) AAI52557.1 3 1974-2089 Часть тандема 1ВЯСТ доменов Ранний ответ на повреждение Д1Ж Повышение экспрессии белка наблюдается при раке шейки матки, понижетше экспрессии приводит к остановке роста опухоли т vivo и in vitro\ потенциальный терапевтический агент при лечении рака пищевода.

EBP1 (ErbB3-binding proteinl)p48np42 изоформы (продукты альтернативного сплайсинга) NP 006182.2 AAD00646.1 2 238-373/ 184-318 1ЮАС2 -связывающий регион Передача ростовых регуляторных сигналов; р48 подавляет апоптоз; р42 ингибирует клеточную пролиферацию и способствует дифференцировке клеток Онкоген: р48 способствует росту клеток и инвазии в случаях глиобластомы человека, повышенная продукция белка при раке молочной железы; Онкосупрессор: р42

МЕМ01 изоформы 1/2 NP_057039.1 1 13-145 Неизвестная доменная структура, некоторые аминокислотные остатки вовлечены во взаимодействие с фосфорилированным по Туг 1227 ЕгЬВ2 медиатор ЕгЬВ2-опосрсдованной подвижности клеток Онкоген: повышена экспрессия при инвазивном раке молочной железы и высоко ннвазивной адснокарциноме поджелудочной железы

angiotensin И receptor-associated protein (AGTRAP) изоформы c,d,e (продукты альтернатиного сплайсинга) NP 001035285.1 NP 001035286.1 NP_001035287.1 2 10-111 (для изоформы с) Неизвестная доменная структура Неизвестная функция Не известно

Complement component C4A (Rodgers blood group) and C4B (Chido blood group) CAQ10919.1 CAI41869.1 3 1511-1744 1511-1570 а.а,- часть А-макроглобулинового рсценторного региона; 1588-1742 а.а. - ШИ/С345С домен Компонент классического пути системы комплемента Не известно

Таб. 1. Белки-интеракторы каталитического домена лизилоксидазы, выявленные в дрожжевом двугибридном скрининге.

Рис. И. Фрагмент интерактома лизилоксидазы человека, реконструированный с использованием баз данных по взаимодействию белков и результатам проведенных нами экспериментов. Обозначения: стрелками показана ферментативная активность по отношению к субстрату, линиями показаны взаимодействия белков (красный -результаты двугибридного скрининга, синий - результаты коиммунопреципитации, розовый - результат «молекулярного фишинга», совмещенного с масс-спектрометрией, черный взаимодействие подтверждено несколькими независимыми методами, зеленый данные известные только для ЮХЬ2 изоформы); голубым цветом отмечены белки, детектированные в результате проведенных экспериментов, розовым компоненты комплекса КИ2ЛЯиЯО.

3.3. Картирование доменов репрессора транскрипции p66fi, вовлеченных во взаимодействие с каталитическим доменом лизилоксидазы

Для подтверждения возможности белка р66|3 взаимодействовать с mLOX in vitro мы использовали пулл-даун. В качестве «белка-наживки» использовали рекомбинантную mLOX, иммобилизованную на Ni-NTA. На первом этапе эксперимента мы подобрали оптимальные условия получения клеточных экстрактов с использованием различных лизирующих буферных систем, таких как RIPA, основанную на использовании смеси анионных детергентов додецилсульфата и дезоксихолата с неионным нонидетом-40; и CATZ, основанную на использовании цвитерионного детергента CHAPS и катионного детергента бромида гексадецилтриметиламмония. В обоих случаях мы наблюдали одинаковую эффективность экстракции GFPp66p (соответствует полосе с подвижностью 92 кДа, в отличие от GFP - 27 кДа), оверэкспрессированного в клетках НЕК293Т (рис. 12А). Однако при постановке пулл-дауна с экстрактами, полученными с использованием CATZ и RIPA, мы наблюдали значительную разницу в эффективности формирования комплекса GFPp66p/mLOX in vitro (рис. 12В). Поэтому при постановке пул-дауна с различными фрагментами последовательности рббр мы целенаправленно использовали систему лизирующего раствора CATZ для получения клеточных экстрактов.

Выравнивание аминокислотных последовательностей рббр различных организмов выявляет в первичной структуре белка два высококонсервативных участка (домены CR1 и CR2), обладающих различной функциональной активностью. При этом в составе CR2 домена присутствует аминокислотный мотив цинковых пальцев GATA-типа, вероятно, вовлеченных в белок-белковые взаимодействия [Brackertz et al, 2006]. Чтобы определить роль структурно-функциональных доменов рббр в формировании белкового комплекса рббр/mLOX, мы воспроизвели эксперимент по пулл-дауну с использованием клеточных экстрактов, содержащих GFP-меченные домены рббр: GFPCR1 (1-338 а.о.) и GFPCR2 (339-593 а.о), -продуцированные в клетках НЕК293Т (рис. 12С). В результате проведенного эксперимента оказалось, что СИ2-домен рббр, также как и полноразмерный рббр способен формировать комплекс с рекомбинантной mLOX, иммобилизованной на Ni-NTA. В то же время CR1-домен рббр такой активностью не обладает (рис. 12D). Таким образом, мы впервые продемонстрировали новую способность CR2 функционального домена рббр -взаимодействие с каталитическим доменом лизилоксидазы. Предположительно, способность рббр формировать комплекс с LOX важна для инкорпорации лизилоксидазы в состав нуклеосом-ремоделируюшего комплекса Mi2/NuRD и в регуляции взаимодействия LOX с гистонами.

----- «kn.-

- 2ШН 72kl>a-

i.n- <;htki CFPCRI <;Ki>pMbru

ГрМЬгп <;FK~R1 GFFCRI r.fr

T'klta— Siuyi—

Рис. 12. Подтверждение взаимодействия LOX и рббр. А. Оценка эффективности экстракции экзогенных GFP и GFPp66p из клеток линии НЕК293Т с использованием лизисных растворов CATZ и R1PA. В. Полноразмерный p66[i способен связываться с каталитическим доменом лизилоксидазы in vitro. Наибольшая эффективность взаимодействия наблюдается в присутствии буферного раствора СА TZ. С. Иммунохимический анализ лизатов НЕК293Т, экспрессирующихразличные конструкции белка рббр. Детекцию экзогенных белковых продуктов осуществляли с помощью антител к OFP (в разведение 1:5000). D. Полноразмерный рббр, а также его CR2-doMen содержащий фрагмент способны образовывать белковые комплексы с рекомбинантной лизилоксидазой in vitro. Детекцию белков осуществляли антитезами к GFP (1:5000).

3.4. Анализ локализации эндогенных рббр и LOX в клетках млекопитающих.

Исследование локализации LOX и рббр в клетках при совместной экспрессии

Для характеристики взаимодействия рббр/LOX мы провели исследование их локализации в культивируемых клетках. Для этой цели был проведен иммуноцитохимический анализ локализации этих белков в клетках линии MCF7 (рис. 13). Как видно на рисунке и рббр, и LOX колокализуются в ядре в похожих точечных образованиях, избегая области расположения ядрышек (на фотографии соответствуют пустотам). В то же время оба белка одинаково локализуются и в делящихся клетках в несвязанном с хромосомами состоянии. Подобное поведение белков также может служить дополнительным свидетельством в пользу существования их взаимодействия внутри клетки.

А Ъ IOX С рМ|! D merged

р ПЛ1М 1 LOX и PMg П merged

Рис. 13. Исследование локализации эндогенных LOX (В, F) и рбб-Р (С, G) в клетках линии MCF7. Клетки были фиксированы формальдегидом: детекцию эндогенных белков проводили с использованием специфических антител к LOX (В, F) и к рбб/1 (С, G). А, Е окраска DAPI. D, Н наложение изображений В и С, F и G. В нижней части рисунка (Е-Н) представлены изображения двух делящихся клеток. Масштаб Юмкм.

В то же время способность локализоваться в точечных структурах в ядрах клеток сохраняется и у оверпродуцированного ОРРрббр (рис.14). Вероятно, что в ядрах клеток существуют некие локусы, способствующие скоплению ОРРрббр и формированию им телец. Возможно, что в них могут формироваться функционально активные белковые комплексы, отвечающие за нуклеосомный ремоделинг и репрессию генов, например, нуклеосом-ремоделирующий комплекс М12/МиКХ), компонентом которого является белок рббр.

Va,

WM

Рис. 14. Исследование локализации GFPp66/l (вверху) и GFP (внизу) при их оверпродукции в клетках мышиных фибропластов NIH3T3. Живые клетки фотографировали через 18 часов после трансфекции. Масштаб 10 мкм.

Экзогенный домен mLOX (в отличие от эндогенной лизилоксидазы) не может транспортироваться в ядро и накапливается в цитозоле клетки, что вполне объяснимо, так как у него отсутствует свой собственный сигнал ядерной локализации. Чтобы объяснить способность каталитического домена лизилоксидазы проникать в ядро, мы решили проверить, как присутствие оверпродуцированного рббр влияет на локализацию оверпродуцированной mLOX in vivo.

А <;н'рббр ** KFPLOX Т v ПКТЦО м f

1) с;и* кт.ох лт к ■щ

Рис. 15. Исследование локализации СРРрббр и МРРЬОХ при их совместной продукции в клетках линии НеЬа. Клетки линии Не1м котрансфецировали тазмидами, кодирующими ОРРрббр и Ш 'РЮХ (А - С) или 01Р и ЯРРЮХ (отрицательный контроль, £> - Р). Локализацию флуоресцентных белков анализировали через 8 часов после трансфекции. Н присутствии оверэкспрессированного рбб/З, ЬОХ переносится в ядра, где локализуется в точечных структурах вместе с рббр Масштаб 10 мкм.

Для этой цели клетки линии HeLa трансфецировали плазмидами, кодирующими RFPLOX и GFPp66p, и анализировали локализацию обоих белков in vivo через 8 часов после трансфекции. Как видно на рис. 15, в отсутствие GFPpóóp RFPLOX локализуется внеядерно в цитоплазматической фракции. В то же время совместная экспрессия GFPpóóp и RFPLOX приводит к появлению ядерной лизилоксидазы, сосредоточенной в тельцах неизвестной природы, совпадающих по локализации с тельцами GFPpóóp. Подобная локализация экзогенного белка напоминает поведение эндогенной лизилоксидазы, которая также имеет точечный характер ядерной локализации.

Неспособность оверэкспрессированной лизилоксидазы накапливаться в ядре можно объяснить как отсутствием у нее своего собственного сигнала ядерной локализации, так и недостатком свободных сайтов связывания экзогенной лизилоксидазы. Вероятно, экзогенный рббР, как ядерный интерактор лизилоксидазы, создает дополнительные сайты связывания LOX и способствует ее локализации в ядре. Более того, возможно, рббр напрямую вовлечен в транслокацию лизилоксидазы из цитозоля в ядро клетки.

Необычную картину наблюдали при коэкспрессии GFP рббр с ppLOX (полноразмерная молекула лизилоксидазы, содержащая сигнальный пептид для внеклеточной секреции, пропептидный домен и каталитический домен). В этом случае происходила аномальная локализация рббр в цитоплазматическом компартменте (рис. 16), причем в строгой колокализации с лизилоксидазой. Такое поведение строго ядерного белка, вероятно, объясняется его заякореванием на внутриклеточных мембранах за счет взаимодействия с оверэкспрессированной, содержащей сигнальный пептид лизилоксидазой (так как из-за большого количества экзогенной лизилоксидазы собственные протеолитические системы клетки не справляются с отщеплением сигнального пептида).

GFPp66-p ppLOX уР mcrgc *

<;ы' ppl.OX mcrgc , *

Рис. 16. Исследование локализации вРРрббр и рр!.ОХ при их совместной оверэкепрессии в клетках линии НеЬа. ОКРрббр колокализуется с препроферментом лизилоксидазы (ррЬОХ) в цитозоле. Такая локализация белка сильно отличается от характерной для него ядерной локализации. В отличие от ОУРрббр белок (з¥Р не меняет характерного для него равномерного распределения внутри клетки при его совместной продукции с ррЮХ. Масштаб 10 мкм.

Таким образом, нам удалось продемонстрировать взаимодействие рббр/LOX in vivo и показать, каким образом лизилоксидаза способна проникать в клеточное ядро.

Опираясь на полученные нами результаты, а также на литературные сведения, мы предложили следующую гипотезу о возможной функциональной активности взаимодействия рббр/LOX в клетке. Как известно, белок репрессор транскрипции рббр является постоянным компонентом нуклеосом-ремоделирующего комплекса Mi-2/NuRD, осуществляющего репрессию генов, в частности, вовлеченного в репрессию гена белка клеточной адгезии кадгерина-Е. Mi-2/NuRD связывается с хроматином благодаря способности одного из компонентов этого комплекса - белка MBD2 распознавать и связывать метилированные CpG-островки. В то же время рббр за счет своего CR2 функционального домена участвует в связывании гистонов НЗ и Н4. Таким образом, происходит одновременная «фиксация» нуклеосом-ремоделирующего комплекса как на ДНК, так и на гистоновых корах. Так как NuRD не способен связываться с метилированным НЗК4, для сборки репрессорного комплекса необходимо деметилирование этого гистона. В настоящее время показана способность лизилоксидаз (по крайней мере, LOXL2) окислять триметилированный по остатку лизина 4 гистон НЗ [Herranz et al 2012]. Так как мы показали, что рббр за счет своего CR2 функционального домена участвует в формировании комплекса с каталитическим доменом лизилоксидазы и определяет ее ядерный транспорт и локализацию в ядерных структурах, мы предположили, что это взаимодействие вовлечено в лизилоксидаза-опосредованное деметилирование НЗК4, способствующее сборке Mi2/NuRD репрессорного комплекса на нужных сайтах хроматина.

3.5. Исследование ядерного транспорта белка ТТС4 в клетке В рамках интерактомных исследований часть работы мы посвятили изучению ядерного транспорта белка ТТС4 (tetratricopeptide repeat domain protein 4). Этот белок является потенциальным онкосупрессором, вовлеченным в трансформацию меланоцитов, но в целом изучен слабо. Для нас особый интерес представляет его взаимодействие с хампином, который может быть ассоциирован с фактором RASSF1C и ГТФазой Ras. В свою очередь, взаимодействие Ras, этого важнейшего сигнального белка, - через SOS2 - с LOX (рис. 11) может быть объяснением «парадоксальной» онкосупрессорной активности LOX в ras-трансформированных клетках.

Сверхпродуцированный белок ТТС4 локализуется исключительно в цитоплазме клетки, вне клеточных ядер. Однако такая локализация эндогенного белка не характерна для эндогенного ТТС4, обладающего либо строго ядерной локализацией, или локализующегося одновременно в цитоплазме и ядре. Поведение сверхпродуцированного белка можно

объяснить либо нехваткой нативных белковых партнеров ТТС4, в норме взаимодействующих с ним и определяющих его транспорт в ядро из цитоплазмы, либо неспособностью системы ядерного транспорта белков «справляться» с обилием сверхпродуцированного ТТС4 в клетке. В асинхронной культуре клеток эндогенный ТТС4, идентифицированный специфическими антителами, имел различный характер локализации: от строгой локализации в ядрах клеток до диффузного распределения по всей клетке. Мы предположили, что характер локализации эндогенного белка зависит от стадии клеточного цикла. Для подтверждения этой гипотезы нами был поставлен эксперимент по синхронизации клеток с последующим иммуцитонохимическим анализом локализации ТТС4 (данные не приведены). Клетки в той или иной стадии клеточного цикла фиксировали и подвергали иммуноцитохимин с использованием поликлональных кроличьих антител к ТТС4, полученных ранее в нашей лаборатории. Иммуноцитохимический анализ показал, что в Go фазе ТТС4 обладает ядерно-цитоплазматической локализацией. При индукции клеточного цикла ТТС4 из цитоплазмы постепенно транслоцируется в ядро и в Gi фазеимеет наиболее выраженный ядерный характер локализации. Позднее, уже в G2 фазе, белок снова начинает появляться в цитоплазме. Таким образом, ТТС4 имеет динамический характер локализации, зависящий от стадии клеточного цикла.

Существует несколько возможных объяснений появлению цитоплазматического ТТС4 в G2 фазе: блокада ядерного транспорта этого белка, взаимодействие его с цитоплазматнческим партнером или деградация ядерного пула ТТС4. Мы предположили, что данный феномен может возникать преимущественно благодаря ядерному экспорту белка ТТС4, так как его динамика в клетке сильно напоминает поведение ядерных белков, имеющих сигнал ядерного экспорта. Ориентируясь на данные анализа присутствия возможных NES в последовательности ТТС4 и учитывая структурные особенности белка, мы создали конструкции, кодирующие четыре перекрывающихся фрагмента последовательности белка ТТС4 мыши находящихся в одной рамке считывания с флуоресцентными белками: два участка, содержащих последовательность TPR-мотива (1185, 79-386), последовательность TPR-мотива (79-185) и С-концевую последовательность ТТС4 (185-386). Клетки линии НЕК293Т трансфецировали одной из конструкций, кодирующей фрагмент последовательности ТТС4, и через 18 часов анализировали локализацию флуоресцентного продукта in vivo. Как видно на рис. 17, только фрагмент 1-185 обладал характерной для полноразмерного ТТС4 цитоплазматической внеядерной локализацией, не зависящей от положения флуоресцентного белка с N- (конструкция GFP1-185) или с С-конца (конструкция 1-185RFP) последовательности. В то же время для всех других фрагментов, в том числе и содержащих TPR-мотив, было характерно равномерное

20

распределение между ядром и цитоплазмой. Такое поведение описано для белков СИР и КРР, не обладающих высокой молекулярной массой и не имеющих сигналов ядерного экспорта, способных свободно проникать через ядерные поры. Так как ТРР-мотив (79-185) никак не влиял на ядерное распределение ОРР79-185 и ОРР79-386 в клетке, мы предположили, что возможный сигнал ядерного экспорта содержит последовательность 1-79 ТТС4.

Мы предположили, что белок ТТС4 способен транспортироваться в ядро в комплексе с его ядерным белком-партнером хампином (гомолог МЭЫ ОгохоркИа те\сто%а$1ег\ ранее идентифицированным в нашей лаборатории [Огштеу е! а1., 2007]. Чтобы проверить это предположение, мы трансфецировали клетки фибробластов мыши конструкцией ТТС4ИРР совместно с конструкцией, кодирующей хампин, содержащий на С-конце белковой молекулы вРР, и проводили анализ локализации белков в живых клетках (рис. 18). Нами было показано, что при совместной экспрессии ТТС4 с хампином происходит накопление ТТС4 в ядрах клеток и его локализация в точечных структурах. В отличие от хампина, другой ядерный белок - ЭЫМТ1 - при совместной с ТТС4 продукцией не влиял на клеточную локализацию последнего.

1Я

■■■г ■

, '

• 1 « • - ) $

Рис. 17. Картирование фрагмента белка ТТС4, отвечающего за ядерный экспорт белка. Клетки линии НЕК293Т трансфецировали плазмидными конструкциями, кодирующими различные участки полипептидной цепи ТТС4 в рамке с (Л'Р (вГР1-185, СГР79-185. в1-Р79-386, 6кР185-386) или ИГР (1(РР1-185). Через 18 часов наблюдали флуоресценцию белков в живых клетках. Характерную для полноразмерного ТТС4 локализацию проявляют только белки СРР1-185 и 1-185Г'ЯР.

GFPDNMT 1 é> TTC4RFP - ^ *

GFPhampin' TTC4RFP

Рис. 18. Исследование ядерного транспорта белка TTC4RFP в присутствии оверпродуцированных ядерных белков GFPDNMT1 и GFPhampin. Клетки фибробластов трансфецировали плазмидньши конструкциями TTC4RFP и GFPhampin или GFPDNMT1. Через 18 часов после траисфекции анализированi локализацию оверпродуцнрованиого бежа ТТС4 in vivo. При совместной продукции ТТС4 и DNMT1 белок ТТС4 не транспортируется в ядро и локализуется строго в цитоплазме клеток. При кожепрессии ТТС4 и хампина белок ТТС4 транспортируется из цитоплазмы в ядро, где происходит его накопление в точечных структурах. Масштаб 50 мкм.

ВЫВОДЫ

1. Получены бактериальные и дрожжевые продуценты рекомбинантного каталитического домена лизилоксидазы. Использование дрожжевого продуцента позволяет получить препарат растворимой лизилоксидазы. Оптимизирован процесс рефолдинга денатурированного очищенного каталитического домена лизилоксидазы, продуцированного в Е. coli.

2. Впервые измерен кинетический изотопный эффект с использованием нативных субстратов лизилоксидазы: лизина и лизин-содержащего пептида.

3. Проанализирована локализация эндогенной лизилоксидазы в различных клеточных культурах и тканях. Показано, что в культивируемых клетках лизилоксидаза имеет преимущественно ядерную локализацию, в то время как в тканях наблюдается либо внеклеточная, либо цитозольная локализация. Лизилоксидаза впервые детектирована в зрелых тромбоцитах и лимфоцитах.

4. С использованием различных методологических подходов (дрожжевой двугибридной системы и «молекулярного фишинга») детектированы неизвестные ранее партнеры лизилоксидазы. Показано, что глицеральдегидфосфатдегидрогеназа - новый субстрат лизилоксидазы. Ядерные резиденты MDC1, p66ß и 2G4 являются возможными внутриядерными интеракторами лизилоксидазы. С использованием полученных результатов и литературных данных составлена интерактомная карта лизилоксидазы.

5. Независимыми методами показано взаимодействие p66ß/LOX in vivo и in vitro. Данное взаимодействие осуществляется СЯ2-доменом белка p66ß и каталитическим доменом лизилоксидазы. Белок p66ß определяет локализацию зрелой формы лизилоксидазы в ядре.

6. Исследована зависимость локализации белка ТТС4 от стадии клеточного цикла. Фрагмент белка с координатами 1-185 а.о. содержит предполагаемый сигнал ядерного экспорта белка ТТС4. Совместная продукция белка ТТС4 и хампина приводит к транспорту ТТС4 в ядро и его колокализации с белком хампином.

Список сокращений:

LOX - лизилоксидаза

mLOX - зрелая форма лизилоксидазы

ppLOX - полноразмерная лизилоксидаза, включающая сигнальный пептид и пропептидный домен

LOPP - пропептидный домен лизилоксидазы LOXL - лизилоксидаза-подобные белки SSAO -семикарбазид-чувствительная аминоксидаза GAPDH - глицеральдегидфосфатдешдрогеназа ТТС4 - tetratricopeptide repeat domain protein 4 RFP - красный флуоресцентный белок GFP - зеленый флуоресцентный белок

Результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Dmitriev R.I., Okkelman I.A.. Shakhparonov M.I., Abdulin R.A., Pestov N.B. (2009) Nuclear transport of protein TTC4 depends on the cell cycle. Cell Tissue Res. 336: 521-527.

2. Pestov N.B., Okkelman I.A.. Shmanai V.V., Hurski A.L., Giaccia A.J., Shchepinov M.S. (2011) Control of lysyl oxidase activity through site-specific deuteration of lysine. Bioorg. Med. Chem. Lett., 21: 255-258.

Тезисы конференций:

1. Pestov N., Dmitriev R., Okkelman I.. Shakhparonov M. (2008) Hampin/MSLl regulates nuclear transport of putative tumor suppressor TTC4. Mol. Biol. Cell, 19 (suppl), abstract #2779/B493. (The 48th Annual Meeting of The American Society for Cell Biology, Dec 13-17, 2008, San Francisco, USA).

2. Okkelman I.A.. Pestov N.B. (2009) Identification of new proteins that interact with lysyl oxidase. (The IInd Cancer Proteomics Conference, June 8-11, 2009, Dublin, Ireland).

3. Okkelman I.A.. Pestov N.B., Fedotova A.S. (2010) Differential intracellular localization of lysyl oxidase in vitro and in vivo. FASEB J. 2010, 24: 816.1 (Experimental Biology Annual Meeting, April 24 - 28, 2010, Anaheim/ОС, USA).

4. Okkelman I.A., Pestov N.B. (2011) GAPDH is a putative intracellular lysyl oxidase interactor. Protein Sci. 20: Suppl. 1, 166 (The 25th Anniversary Symposium of the Protein Society, July 23-27, 2011, Boston, USA).

5. Оккельман И.А. (2011) Поиск белков-партнеров лизилоксидазы в системе двугмбридного скрининга. (Научная конференция но биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова», 14-17 ноября, Москва -Пущино).

6. Okkelman I.A.. Pestov N.B. (2012) Transcription repressor рббр is putative intranuclear lysyl oxidase interactor. (15,h Congress on Amine oxidases, July 15-18, 2012, Toulouse, France).

7. Pestov N.B., Okkelman I.A. (2012) Tissue-specificity of р-aminopropionitrile oxidase in the rat. (15th Congress on Amine oxidases, July 15-18, 2012, Toulouse, France).

?

Заказ №516. Подписано в печать 30.08.2013 год. Тираж 91 шт. ИП «Тихонов», тел.: 8 (495) 777-53-28 www.jpcom.ru e-mail: info@jpcom.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Оккельман, Ирина Александровна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

им. академиков М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РАН

04201361844 НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

УДК 577.152.361

ОККЕЛЬМАН ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

НОВЫЕ ПУТИ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИЗИЛОКСИДАЗЫ ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.01.03 - «молекулярная биология» '

1

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ кандидат химических наук Пестов Н.Б.

Москва-2013

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 6

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 8

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9

Лизилоксидазы — медь-зависимые аминоксидазы, выполняющие разнообразные функции в

организме 9

1.1 .Семейство генов лизилоксидаз. Анализ аминокислотной последовательности лизилоксидаз 10

1.2.Каталитическая активность лизилоксидаз 15

1.2.1 .Структура медь-связывающего сайта лизилоксидаз. Формирование ЬТ(2-кофактора 16

1.2.2.Пути ингибирования лизилоксидазной активности 20

1.3.Тканевая специфичность изоформ лизилоксидаз млекопитающих и экспрессия лизилоксидаз на разных этапах онтогенеза 23

1.4. Роль лизилоксидаз в формирование структуры внеклеточного матрикса 26

1.5. Внутриклеточная локализация лизилоксидаз и связанная с ней функциональная активность лизилоксидаз 30 1.5.1 .Внутриклеточная локализация ЬОХ и ее функциональная активность 30 1.5.2.Внутриклеточная локализация ЬОХЬ2 и ее функциональная активность 35 1 .б.Роль лизилоксидаз в развитии раковых заболеваний 3 8 ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 44

2.1. Филогенетический анализ белков семейства лизилоксидаз 44

2.1.1. Филогенетический анализ лизилоксидаз беспозвоночных животных 44

2.1.2.Филогенетический анализ лизилоксидаз вторичноротых животных 48

2.2.Получение рекомбинантной лизилоксидазы в различных системах продуцентов 56 2.2.1 .Получение растворимой рекомбинантной лизилоксидазы в бактериальной системе 56 2.2.2.Получение рекомбинантной лизилоксидазы в дрожжевой системе продуцента 60 2.3 .Получение поликлональных антител к каталитическому домену лизилоксидазы 62

2.4. Контроль каталитической активности лизилоксидазы с помощью сайт-специфически дейтерированного лизина 65

2.5.Исследование локализации эндогенной лизилоксидазы в различных клеточных линиях, тканях и первичной культуре фибробластов 70

2.6.Поиск белков интеракторов лизилоксидазы методом «молекулярного фишинга». Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа - новая субстратная мишень лизилоксидазы 74

2.7.Поиск новых белковых партнеров зрелой формы лизилоксидазы человека в системе дрожжевого двугибридного скрининга 79

2.8.Картирование доменов репрессора транскрипции рббр, вовлеченных во взаимодействие с каталитическим доменом лизилоксидазы 82

2.9.Анализ локализации эндогенных рббр и ЬОХ в клетках млекопитающих. Исследование локализации лизилоксидазы и рббр в клетках при совместной экспрессии 86

2.10.Гипотеза о функциональной роли комплекса рббр/ЬОХ в клетке 89 2.11 .Составление карты фрагмента интерактома клетки, включающее новые взаимодействия лизилоксидазы 91 2.12.Исследование ядерного транспортного белка ТТС4 в клетке 96 ГЛАВА.З. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 102

3.1.Материалы 102

3.2.Получение плазмидных конструкций, использованных в работе 104 3.3 .Методы исследования 105 ВЫВОДЫ 124 БЛАГОДАРНОСТИ 125 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 126 ПРИЛОЖЕНИЕ 140

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток

п.о. - пары оснований (нуклеотидных)

АТФ - аденозин-5'-трифосфат

АТФаза - аденозинтрифосфатаза

дНТФ — смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов

ДТТ - дитиотреитол

ИФА - иммуноферментный анализ

ИГПТ - изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид

кДНК - комплементарная ДНК (полученная обратной транскрипцией с мРНК)

СПК - сыворотка плода коровы

BAPN -Р-аминопропионитрил

BSA - бычий сывороточный альбумин

ВМР-1 - bone morphogenetic protein 1, протеаза участвующая в активации LOX и LOXL1

BrdU — бромдезоксиуридин

DAPI - 4',6-диамидино-б-фенилиндол

DMEM - Dulbecco's modified Eagle's medium, модифицированная Дульбекко среда Игла CDH1 - кадгерин Е

CHAPS - 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфонат

EDTA - этилендиаминтетраацетат

ЕМТ - эпителиально-мезенхимальная трансформация

GAPDH - глицеральдегидфосфатдегидрогеназа

GFP - зеленый флуоресцентный белок

HEPES - Ы-(1^'-гидроксиэтил)пиперазинэтансульфоновая кислота

KLH - keyhole limpet hemocyanin, металлопротеин из гемолимфы моллюска Megathura

crenulata

FAK — киназа фокальной адгезии

LOPP - пропептидный домен LOX изоформы лизилоксидаз LOX - (lysyl oxidase) лизилоксидаза

L0XL1,2,3,4 - lysyl oxidase-like protein 1,2,3,4, лизилоксидаза-подобный белок 1,2,3,4

LTQ — (lysine tyrosylquinone) лизин-тирозил хиноновый кофактор лизилоксидаз

MEMO - mediator of ErbB2-driven cell motility

MMP — металлопротеиназы

mLOX - зрелая форма LOX

мРНК - матричная РНК

ppLOX - препроформа LOX, представляющая собой последовательность каталитического домена лизилоксиды с пропептидным участком и сигнальным пептидом NES - сигнал ядерного экспорта

RAS - V-HA-RAS Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog

RFP - красный флуоресцентный белок

PBS - фосфатно-солевой буферный раствор

SOS2 - Son of sevenless, Drosophila, homolog 2

Src - V-SRC avian sarcoma (SCHMIDT-RUPPIN A-2) viral oncogene

SRCR - scavenger receptor cysteine-rich, домен SRCR (скавенджер-рецептор богатый цистеином)

SSAO - от англ. semicarbazide-sensitive amine oxidase, семикарбазид-чувствительная аминоксидаза

ТСЕР — трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид ТТС4 - tetratricopeptide repeat protein 4 Tris - трис(гидроксиметил)аминометан

ВВЕДЕНИЕ

Взаимодействия между белками лежат в основе выполняемых ими функций, поэтому исследования, направленные на определение белок-белковых взаимодействий, часто играют ключевую роль в поиске путей регуляции функциональной активности белков и белковых комплексов. Совокупность всех биологически значимых белковых взаимодействий в рамках целого протеома носит название интерактом. В широком смысле понятие интерактом также включает в себя совокупность взаимодействий белок-РНК и белок-ДНК, которые также являются важными в регуляции метаболизма. На сегодняшний день все больше внимания уделяется исследованиям как глобальных интерактомов различных организмов, так и интерактомов отдельных белков. Составление карт взаимодействий между биомолекулами (например, белками) позволяет систематизировать и расставить отдельные фрагменты гигантской «интерактомной мозаики» на свои места и прогнозировать возможные пути функционирования и регуляции биологических процессов. Использование подобного подхода имеет ценность не только для фундаментальных биологических исследований, но важно и для развития новых методов диагностики и лечения различных заболеваний. В наши дни для решения этой задачи используют высокопоточные методы анализа взаимодействий биомолекул in vivo и in vitro. Однако, именно в силу гигантского объема информации, получаемой с помощью высокопоточных поисковых методов, их применение оставляет массу «ошибок» и «пробелов» в составляемых интерактомных схемах. Поэтому интерактомные исследования, осуществляемые небольшими коллективами, обычно посвященные отдельному объекту, часто дают более достоверные результаты о молекулярных взаимодействиях и их роли в функционировании организмов.

Если говорить о практическом применении интерактомного подхода для целей медицины, то наиболее ярким примером может служить исследование этиологии и патогенеза онкологических заболеваний. Так, последние исследования в онкологии привели к пересмотру взглядов на причины возникновения и прогрессии опухолей. Если раньше наибольшее внимание уделяли только генетическим особенностям опухолевых клеток, то теперь становится понятным, что формирование и рост онкообразований — это сложный, многоэтапный процесс, одним из движущих факторов которого является взаимодействие опухоли и ее окружения, а также изменение характеристик клеточных интерактомов. Пристальное внимание в этой области исследований в последнее время уделяют белкам, вовлеченным в процессы метастазирования и прогрессии опухоли, особенно семейству лизилоксидаз (LOX, LOXL1, LOXL2, LOXL3, LOXL4) (1). Все представители семейства лизилоксидаз характеризуются высокой консервативностью

аминокислотной последовательности каталитического домена и проявляют похожую субстратную ферментативную активность. Эти белки секретируются различными типами клеток во внеклеточное пространство, где они участвуют в посттрансляционной модификации коллагена и эластина, формируя тем самым структуру внеклеточного матрикса (2). В то же время ряд представителей семейства лизилоксидаз (по крайней мере, LOX и LOXL2) обнаружены в ядрах клеток, где они участвуют в регуляции экспрессии генов, например, гена CDH1 (ген кадгерина Е), чья репрессия приводит к изменению клетками фенотипа с эпителиального на мезенхимальный, характеризующийся большей миграционной активностью клеток (3). Несмотря на успешность функциональных исследований, остаются непонятыми молекулярные механизмы этих процессов и конкретная роль лизилоксидаз в них. С этой точки зрения составление интерактомной карты белковых взаимодействий с участием лизилоксидаз позволило бы проанализировать возможные механизмы работы этих белков, а также установить вклад внеклеточной и внутриклеточной функциональной активности лизилоксидаз в процессы прогрессии опухолей.

Так как лизилоксидазы непосредственно участвуют в метастатической прогрессии опухолей и являются потенциальной мишенью для терапии онкологических заболеваний, остро встает вопрос о возможности специфического воздействия на активность этих ферментов in vivo. Необходимо отметить, что до сих пор не созданы лекарственные препараты, ингибирующие активность этих ферментов, пригодные для применения в медицинской практике. Известные на сегодняшний день ингибиторы лизилоксидаз обладают высокой токсичностью и неспецифичностью действия по отношению к лизилоксидазам и не пригодны для медицинских целей. Кроме того, полное ингибирование лизилоксидазной активности не желательно, так как эти белки крайне необходимы для нормального функционирования тканей. Поэтому наиболее перспективным направлением исследований является поиск возможных альтернативных путей регуляции или модуляции активности лизилоксидаз.

В данной работе с использованием различных поисковых методов (например «молекулярный фишинг» и двугибридный дрожжевой скрининг) определен ряд новых, до этого момента неизвестных белков-партнеров лизилоксидазы человека. Несмотря на то, что подобные работы уже проводились рядом авторов (4, 5), в них не было показано такого широкого спектра белков-партнеров лизилоксидазы. Кроме того, все эти исследования касались исключительно внеклеточной функциональной активности этого белка. Данное исследование не только выявило ряд новых потенциальных внутриядерных интеракторов лизилоксидазы человека, но и позволило выдвинуть

гипотезу, объясняющую механизм регуляции лизилоксидаза-зависимой репрессии гена кадгерина Е. По результатам работы также была составлена карта фрагмента глобального интерактома с участием лизилоксидаз.

Помимо этого, в данной работе был осуществлен не только поиск новых интеракторов лизилоксидазы, позволяющий предположить новые пути регуляции ее функциональной активности в организме, но и предложен уникальный метод модуляции каталитической активности лизилоксидазы, основанный на применении изотопного эффекта. Этот метод может быть использован как новый инструмент для исследований функциональной активности лизилоксидаз.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью данного исследования явился поиск новых путей регуляции функциональной активности лизилоксидазы человека с помощью различных методов и подходов. В связи с этим предполагалось решить следующие задачи:

1. Получить продуценты рекомбинантной лизилоксидазы на основе различных систем экспрессии белков и, по возможности, выделить каталитически активную лизилоксидазу.

2. Охарактеризовать локализацию каталитического домена лизилоксидазы в различных тканях, а также в культурах различных клеточных линий, в том числе в первичной культуре.

3. С помощью дрожжевой двугибридной системы произвести поиск новых белок-белковых взаимодействий каталитического домена лизилоксидазы человека.

4. Подтвердить взаимодействия, идентифицированные в дрожжевой двугибридной системе, с помощью альтернативных методов - связывания in vitro, колокализации в клетке и других.

5. Произвести поиск новых интеракторов лизилоксидазы методом «молекулярного фишинга» («molecular fishing») с последующей идентификацией белков методом масс-спектром етрии. Подтвердить детектированные взаимодействия независимыми методами.

6. Измерить изотопный эффект сайт-специфичного дейтерирования нативных субстратов лизилоксидазы и протестировать возможность регуляции лизилоксидазной активности при помощи данного подхода.

7. Исследовать особенности внутриклеточной локализации предполагаемого онкосупрессора ТТС4.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ЛИЗИЛОКСИДАЗЫ - МЕДЬ-ЗАВИСИМЫЕ АМИНОКСИДАЗЫ, ВЫПОЛНЯЮЩИЕ РАЗНООБРАЗНЫЕ ФУНКЦИИ В ОРГАНИЗМЕ

Среди многообразных аминоксидаз выделяют особую группу медь-зависимых аминоксидаз. Медь-зависимые аминоксидазы принадлежат семейству хинон-содержащих белков и осуществляют реакцию дезаминирования первичных аминов до альдегидов. Для них характерно то, что они содержат в своем составе один из двух кофакторов: TPQ (2,4,5-trihydroxyphenylalanyl quinone) или LTQ (lysine tyrosylquinone) и медь (II). Другая черта - то, что ферментативный катализ происходит по механизму типа «пинг-понг» (б, 7). Медные аминоксидазы широко распространены в природе: у бактерий, животных и растений. В бактериях медные аминоксидазы участвуют в метаболизме первичных аминов, в более высокоразвитых организмах - их роль четко не определена, однако они вовлечены в сложные процессы клеточной адгезии, миграции, а также выполняют ряд структурных функций (8). Среди всех медь-зависимых аминоксидаз особо выделяется семейство эволюционно высококонсервативных белков, детектированных только в царстве Животные.

В настоящее время все больше внимания уделяется исследованию функциональной активности представителей семейства лизилоксидаз в связи с их ключевой ролью в развитии различных заболеваний человека. Среди них можно привести глаукому или эксфолиативный синдром, связанную с активностью LOXL1 (Р), латиризм и фиброзы (10, 11), а также такие заболевания как синдром Менкеса и синдром Элерса-Данлоса (IX и V типов) (12). Однако, несомненно, наибольший интерес представляют собой исследования роли лизилоксидаз в метастатической прогрессии опухолей.

Лизилоксидазы — семейство медь зависимых аминоксидаз, способных катализировать реакцию окисления первичных аминных субстратов до альдегидов. Первой среди лизилоксидаз млекопитающих была идентифицирована лизилоксидаза LOX, поэтому на сегодняшний день ей посвящено большинство исследований, и она является наиболее охарактеризованной. Также у млекопитающих были описаны еще четыре белка, относящихся к этому семейству, так называемые лизилоксидаза-подобные белки (LOX-like proteins, далее LOXL): LOXL1, LOXL2, LOXL3 и LOXL4. Далее мы будем вести речь преимущественно о лизилоксидазах млекопитающих, поэтому под этими терминами будем понимать именно их (13).

1.1. Семейство генов лизилоксидаз. Анализ аминокислотной последовательности

лизилоксидаз

Все изоформы лизилоксидаз млекопитающих кодируются пятью отдельными генами. Для некоторых изоформ также известны разные варианты - продукты альтернативного сплайсинга.

Как уже было сказано выше, первой идентифицированной изоформой лизилоксидаз была LOX. Ген LOX человека длиной 15 т.п.о. расположен на 5 хромосоме (5q23.3-31.2) и состоит из 7 экзонов, кодирующих 417 аминокислотных остатков белка. Инициация транскрипции может проходить с одного основного и четырех дополнительных сайтов инициации. Первый экзон состоит из 273 п.о. 5'нетранслируемого региона (ведя отсчет от основного сайта инициации транскрипции) и 631 п.о. транслируемой последовательности, кодирующей приблизительно половину аминокислотной последовательности белка, включая: сигнальный пептид, пропептид (LOPP) и 60 аминокислот каталитического домена. Седьмой экзон кодирует только 2 С-концевых аминокислоты белка и содержит 3800 п.о. З'нетранслируемого региона. Экзоны 2-6 варьируют по длине от 96 до 157 п.о., а интроны от 331 п.о. до 3500 п.о. (14). З'нетранслируемый регион содержит неканонические сайты полиаденилирования, которые вносят гетерогенность в транскрипты с мРНК (15).

Эксперименты по транскрипции и трансляции LOX in vitro показали, что первоначально образуется предшественник массой 47 кДа, который впоследствии подвергается удалению сигнального пептида и N-гликозилированию в области пропептидного домена (LOPP) с образованием предшественника 50 кДа (proLOX). После секреции во внеклеточное пространство из неактивной proLOX путем сайт-специфического протеолиза прои