Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нейроиммуноэндокринные взаимодействия в гипоталамусе и их роль в адаптивных реакциях организма

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Нейроиммуноэндокринные взаимодействия в гипоталамусе и их роль в адаптивных реакциях организма"

На правах рукописи

РГб од

2 7 ЛЕН ?000

I

ГРИНЕВ ИЧ ВАЛЕРИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

Нейроиммуноэндокринные взаимодействия в гипоталамусе и их роль в адаптивных реакциях организма

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва, 2000

Работа выполнена в Российском государственном медицинском университете

Научные консультанты:

академик РАМН, профессор, доктор медицинских наук О.В. Волкова академик РАМН, профессор, доктор биологических наук И.Г. Акмаев

Официальные оппоненты:

И.Н.Боголепова - профессор, доктор медицинских наук Т.К.Дубовая - профессор, доктор медицинских наук

Н.Е.Кушлинскии - член-корреспондент РАМН, профессор, доктор медицинских наук

Ведущее учреждение: Московский государственный университет им. М.ВЛомоносова

Защита диссертации состоится «_»_2000г в _часов на

заседании диссертационного совета Д 084.14.04 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117869, г. Москва, ул. Островитянова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Университета (117869, г. Москва, ул. Островитянова, 1).

Автореферат разослан «_»_2000г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор /А.И. Щеголев/

др., 1999], моделируемого главным образом путем введения бактериального эндотоксина - липополисахарида (ЛПС). При этом происходит активация всех звеньев ГГАС и существенная модификация в ней механизмов прямых и обратных связей. Ключевым и неразрешенным вопросом остается значение центральных нейрогормонов ГГАС - КРГ и совместно с ним синтезирующегося вазопрессина (ВГТ) при остром воспалении, а также их чувствительность к действию циркулирующих глкжокортикостероидов, уровень которых резко н продолжительно повышен в крови.

Хроническое воспаление и ГТАС гораздо менее исследованы и представлены в весьма ограниченном числе работ, выполненных на моделях аутоиммунных заболеваний, таких как вызванный адъювантом артрит и системная красная волчанка [Harbuz et al., 1992, 1993; Brady et al., 1994; Shanks et al., 1997; Sakic et al,, 1999]. Здесь имеется множество пробелов, среди которых наиболее важным мы считаем изучение принципиальной возможности создания новой экспериментальной модели хронического воспаления, используя длительное введение бактериального эндотоксина. К настоящему времени нет сведений о роли цитокинов и глюкокортикоидов в характерных изменениях экспрессии генов центральных нейрогормонов ГТАС при хроническом воспалении. И, наконец, остается неизвестным, каким образом в этих условиях ГГАС будет реагировать на новый острый иммунный сдвиг.

Помимо ГТАС несомненное адаптивное значение при воспалении должна играть и ГТНС, центральными структурами которой являются крупноклеточные нейросекреторные ядра гипоталамуса [Боголепова, 1968; Sawchenko, Swanson, 1984]. Нейроны этих ядер синтезируют нонапептидные нейрогормоны - окситоцин и ВП, которые выделяются в общий кровоток из задней доли гипофиза. ВП, как адаптивный гормон очень широкого спектра действия, может оказывать иммунотропные, вазотропные и метаболические эффекты при воспалении. Однако основной точкой приложения ВП является

почка. Действуя на нее, вазопрессин может определять компенсацию потерь воды, обусловленных симптомами воспаления.

Невзирая на несомненную значимость ГГНС (системного ВП) при воспалении, литературные данные по этому вопросу скудны [Шуе51, ЬаПатше, 1995; РаггоИ а а1., 1997; Бас1оип е1 а1., 1998; Уе11ис<а, Рагго«, 1998]. Обобщая их можно лишь заключить, что при различных путях введения и дозировках ЛПС представителям разных отрядов млекопитающих не отмечается существенной активации экспрессии гена ВП и его стойкого, значимого повышения в крови. Об эффектах ВП на почку в этих условиях неизвестно ничего.

На наш взгляд, ключевыми моментами в осмыслении значения системного ВП при воспалении является комплексное изучение процессов транскрипции, трансляции ВП и его выделения в кровь при оценке колебаний осмолярности плазмы и процесса миграции мРНК ВП по аксонам крупноклеточного нейрона. При этом необходима и оценка способности крупноклеточных нейронов отвечать на осмотические стимулы при воспалении. И, наконец, было бы целесообразно оценить рецепторную чувствительность почки к системному ВП и факторы, которые могут ее изменять в условиях воспалительной реакции.

1.2. Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы - изучение центральных звеньев гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и гилоталамо-гипофизарной

нейросекреторной систем при остром и хроническом воспалении. В этой связи были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать эффекты острого и длительного введения бактериального эндотоксина ЛПС на экспрессию генов гормонов и рецепторов в гипоталамусе, гипофизе и надпочечниках, уровни глюкокортикоидных рецепторов в гипоталамусе, а также внутриорганную экспрессию цитокинов.

2. Исследовать эти параметры в ответ на новый иммунный сдвиг (острое введение ЛПС) или нейрогенньш стресс (иммобилизация) на фоне длительного введения ЛПС.

3. Сравнить состояние ГГАС на длительное введение ЛПС с другой моделью хронического (аутоиммунного) воспаления, вызванного введением адъюванта, оценив при этом реакцию ГГАС и синтез цитокинов в ответ на введение нового антигена - ЛПС.

4. Изучить транскрипцию гена ВП, уровни и транспорт матричной РНК (мРНК) ВП в крупноклеточных нейронах гипоталамуса, а также выделение ВП в кровь при воспалении на фоне острой (введение 900мМ ЫаС1) и хронической (солевая нагрузка 2% КаС1 и водная депривация 60ч) осмотической стимуляции.

5. Оценить экспрессию и биологическую активность рецепторов ВП в собирательных трубочках почки при остром введении ЛПС в связи с локальной экспрессией цитокинов и апоптозом.

6. Исследовать экспрессию центральных гормонов ГГАС (КРГ и ВП в мелкоклеточных нейронах гипоталамуса) в условиях хронической осмотической стимуляции в ответ на иммунный (ЛПС) и нейрогенньш (иммобилизация) стрессоры.

1.3. Научная новизна исследования

На основании экспериментальных данных обнаружено несколько новых физиологических феноменов в нейроэндокринной и иммунной системах, сопутствующих острому и хроническому воспалению. Так, впервые: - создана новая экспериментальная модель хронического воспаления (длительное введение ЛПС в нарастающих дозировках), вызывающая в ГГАС сходные с другими моделями изменения в экспрессии генов гормонов и их рецепторов;

- показано нарастание количества «открытых» биологически-активных рецепторов к глюкокортикоидным гормонам в мелкоклеточной части наравентрикулярного ядра гипоталамуса при остром воспалении (однократное введение ЛПС) и его снижение до контрольных величин при хроническом, что определяет регуляцию экспрессии гена кортиколиберина в этих условиях;

- обнаружено, что экспрессия генов центральных нейрогормонов ГТАС при хроническом воспалении не зависит напрямую от локального (головной мозг) или периферического (селезенка) синтеза цитокинов, интерлейкина-1 и 6, в то время как активация синтеза АКТГ в гипофизе коррелирует с нарастанием локальной продукции интерлейкина-1 (но не интерлейкина-6);

- описано, что при хроническом артрите, вызванном введением адъюванта, инъекция нового антигена - ЛПС, резко повышает экспрессию с одной стороны генов гормонов ГГАС, а с другой - генов, кодирующих синтез цитокинов (интерлейкин-1 и 6), что наиболее выражено в паравентрикулярном ядре гипоталамуса и мозге в целом;

- описано снижение уровней мРНК вазопрессина в крупноклеточном нейроне гипоталамуса после введения ЛПС, что определяется перемещением мРНК по аксонам в заднюю долю гипофиза;

- показано, что острая и хроническая осмотическая стимуляция потенцирует активацию транскрипции гена ВП и его выделения в кровоток при остром воспалении;

- обнаружено, что при остром воспалении в почке происходит снижение уровней мРНК рецептора ВП и связывания с рецепторами их агониста, что сопровождается нарастанием синтеза в мозговом веществе почки цитокинов;

- показано, что в условиях длительной осмотической стимуляции (водная

депривация) синтез центральных нейрогормонов ГТАС - кортиколиберина и

1

коэкспрессирующегося с ним вазопрессина выражено не изменяется под действием нейрогенного (иммобилизация) и «иммунного» (введение ЛПС) стрессоров.

1.4. Теоретическая и практическая значимость

Работа представляет собой теоретический базис для внедрения новых диагностических и терапевтических подходов в клинике. Так, обнаруженный феномен гиперчувствительности компонентов нейроэндокринной и иммунной систем к новому антигену на фоне хронического воспаления может быть использован с целью профилактики, диагностики и терапии у пациентов с хроническими аутоиммунными заболеваниями. Накопленные данные о состоянии ГТНС и почки в условиях острого воспаления могут быть полезны для коррекции нарушений водно-солевого баланса при эндотоксемическом шоке и других близких состояниях у человека.

1.5. Реализация результатов исследования

Полученные сведения о характере взаимодействий основных регулирующих систем организма применяются в курсе обучения студентов и в программе научных семинаров Российского государственного медицинского университета.

1.6. Апробация работы

По теме диссертации опубликована 39 научных работ в центральных отечественных журналах («Доклады РАН», «Успехи физиологических наук», «Морфология», «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», «Журнал эволюционной физиологии и биохимии») и зарубежных журналах («Brain Research", "Molecular Brain Research", "Neuroscience", "Biogenic Amines", "Endocrinology"), а также в сборниках по материалам всероссийских и международных конференций.

Результаты работы были доложены, обсуждены и одобрены на международной конференции «Выживание человека: резервные возможности и нетрадиционная медицина» (Москва, 1993), 2-й международной

нейрогистологической конференции, посвященной памяти чл-кор. АН СССР Н.Г.Колосова ("Колосовские чтения-94") (Санкт-Петербург, 1994), международном симпозиуме «Физиологические и биохимические основы деятельности мозга» (Санкт-Петербург, 1994), 4-й и 5-й всероссийских конференциях "Нейроэндокринология -1995 и 2000" (Санкт-Петербург, 1995, 2000), 18-ой международной конференции общества сравнительных эндокринологов Европы (Франция, Руан, 1996), 39-м международном симпозиуме общества гистохимиков (Германия, Йена, 1997), семинарах по физиологии эндокринной системы в национальных институтах здоровья США (1997-2000), 29-й конференции общества нейронаук (США, Майями, 1999), международном симпозиуме по психонейроэндокринологии (Новосибирск,

1999), всероссийской конференции «Нейроиммунопатология" (Москва, 1999), конференции фонда Александра фон Гумбольдта (Германия, Дюссельдорф,

2000), симпозиуме по нейроэндокринологии в рамках Павловских Чтений (Санкт-Петербург, 2000), съезде анатомов, гистологов, эмбриологов России (Ульяновск, 2000), всероссийской конференции «Актуальные вопросы морфологии» (Москва, 2000), международной конференции общества эндокринологов (Канада, Торонто, 2000), всемирном конгрессе по клеточной и молекулярной биологии (Германия, Иена, 2000).

1.7. Объем и структура работы

Диссертация написана в традиционной манере. Она изложена на 235 страницах машинописного текста, включает такие разделы как ведение, обзор литературы и собственные исследования. Последние включают главы: план экспериментальных исследований, материал и методы, полученные результаты и их обсуждение. Далее следуют выводы и библиографический список использованной литературы, насчитывающий 230 источников, подавляющее большинство которых - работы последнего десятилетия. Текст иллюстрирован

64 рисунками (схемы, графики, авторадиограммы, электронограммы, микрофотографии и их монтажи).

1.8. Основные положения, выносимые на защиту

- Длительное введение бактериального эндотоксина в нарастающих дозировках воспроизводит иные модели хронического воспаления по состоянию ГГАС, что характеризуется угнетением синтеза кортиколиберина, его рецептора и нарастанием экспрессии вазопрессина в мелкоклеточных нейронах гипоталамуса, а также повышенным синтезом АКТГ в аденогипофизе и кортикостерона в надпочечниках.

- Для хронического воспалительного (аутоиммунном) заболевания (артрит, вызванный введением адъюванта) характерно нарастание чувствительности мелкоклеточных нейронов гипоталамуса к действию нового антигена. Эта реакция сопровождается повышенной продукцией цитокинов как в головном мозге, так и в периферических органах.

- При остром (но не хроническом) воспалении, вызванном инъекцией бактериального эндотоксина ЛИС, происходит парадоксальное угнетение активности крупноклеточных нейронов гипоталамуса: при неизменности транскрипции гена вазопрессина в этих нейронах происходит снижение уровней матричной РЖ и тенденция к снижению уровнен вазопрессина в системном кровотоке.

- Осмотическая стимуляция крупноклеточных нейронов гипоталамуса на фоне острого воспаления потенцирует активацию синтеза и выделения ВП, степень которого превышает контрольные уровни, независимо от изменений в осмолярности плазмы.

- При остром воспалении происходит снижение чувствительности почки к системному вазопрессину, что проявляется в резком подавлении синтеза рецептора вазопрессина и связывания его агониста. Параллельно в мозговом

веществе почки происходит нарастание синтеза цитокинов, интерлейкина-1 и 6 и около 10% клеток собирательных трубочек имеют признаки апоптоза. - В условиях длительной стимуляции ГГНС (водная депривация) происходит подавление синтеза центральных нейрогормонов ГГАС - кортиколиберина и вазопрессина в мелкоклеточных нейронах гипоталамуса и их реакции на нейрогенный и иммунный стрессоры.

2. Материал и методы исследования

2.1. План экспериментальных исследований

2.1.1. ГГАС при воспалении

2.1.1.1. Однократное и длительное введение бактериального эндотоксина - липополисахарида (ЛПС)

Эксперименты проводились на крысах самцах линии Wistar весом 250300 г.

Экспериментальные группы:

1. Контроль (п=7). Крысы получали и/п инъекции стерильного физ. р-ра (300 мкл);

2. Однократное введение ЛПС (п=6). Использовали ЛПС, полученный из культуры Esherichia coli (Серотип 0111:В4, №L-3012, лот №36Н4130, Sigma, США), 250 мкг на 100 г, и/п. Крысы были забиты через 6 ч;

3. Однократная иммобилизация. Крыс помещали в иммобилизационные цилиндры на 1 час, и после освобождения забивали через 3 ч;

4. Длительное введение ЛПС (п=9). Крысы получали ежедневные инъекции ЛПС в течение 13 дней. Дабы избежать привыкания к эндотоксину его дозу увеличивали каждые два дня: 25, 50, 100, 150 и 200 мкг на 100 г. В последний, 13-й, день эксперимента животные получали ЛПС (250 мкг на 100 г, и/п) и были забиты через 24 ч;

5. Дополнительная инъекция ЛПС у крыс с длительным его введением (п=7). Крысы, получавшие инъекции ЛПС в течение 13 дней (см. группу 4), получали на 14-й день новую инъекцию ЛПС (250 мкт на 100 г) и были забиты через 6 ч;

6. Иммобилизация крыс с хроническим введением ЛПС (п=6). Крыс, получавших ЛПС в течение 13 дней (см. группу 4), на 14-й день подвергали иммобилизации (см. группу 3) и забивали через 3 ч после освобождения из цилиндров.

2.1.1.2. Хронический артрит, вызванный введением адъюванта Эксперименты проводились на крысах-самцах линии Piebald-Viral-Glaxo весом 180-200г.

Экспериментальные группы:

1. Контроль (п=8). Крысы под легким галотановым наркозом получали внутрикожную инъекцию парафинового масла (100 мкл) и были забиты через 14 дней;

2. Хронический артрит (п=8). Крысы получали инъекцию (100 мкл) суспензию (10 мг в мл) убитых подогреванием Mycobacterium butyricum (адъювант) на парафиновом масле и были забиты через 14 дней;

3. Однократное введение ЛПС (п=8) (250 мкг, и/п);

4. Однократное введение ЛПС на фоне хронической фазы артрита (п=8). Крысы, подвергнутые инъекции адъюванта, спустя 14 дней получали инъекцию ЛПС (250 мкг, и/п) и были забиты через 6 ч.

2.1.2. ГГНС при воспалении

2.1.2.1. Эффекты ЛПС на базальную активность ГГНС

Эксперименты проводились на крысах самцах линии Wistar весом 250300 г.

Экспериментальные группы: 1. Контроль (п=6). Крысы получали и/п инъекции физ р-ра (300 мкл).

2. Однократное введение ЛПС (250 мкг на 100 г). Крысы были забиты через 3 (п=6), 6 (п=6), 12 (п=5) и 18 (п=5) ч.

2.1.2.2. Острая осмотическая стимуляция на фоне воспалення

Экспериментальные группы:

1. Контроль (п=б). Крысы получали и/п изотонический (290 мМ) р-р ЫаС1 (2% от веса);

2. Ведение гипертонического р-ра (п=10). Крысы получали и/п 900 гпМ р-р №01 (2% от веса). Крыс забивали через 15 мин (п=5) и 30 мин (п=5);

3. Однократное введение ЛПС (250 мкг на 100 г, и/п). Крыс забивали через 3 ч (п=6) и 6 ч (п=6);

4. Введение гипертонического раствора у крыс с предварительным введением ЛПС. Через 3 и 6 ч после инъекции ЛПС крысы получали инъекцию 900 мМ ИаС1 и были забиты через 15 мин (п=11) и 30 мин (п=12).

2.1.2.3. Воспаление при хронической осмотической стимуляции

2.1.2.3.1. Солевая нагрузка

Экспериментальные группы:

1. Интактный контроль (п=7): крысы получали обычную воду для питья;

2. Солевая нагрузка (п=6): животные пили 2% р-р ЫаС1 6 дней;

3. На 6 день солевой нагрузки крысы получали и/п инъекцию ЛПС (250 мкг на 100 г, и/п) и были забиты через 3 (п=6) и 6 (п=6) ч.

2.1.2.3.2. Водная депривацня

Эксперименты проводились на крысах самцах линии Бргацие Бо\у1еу весом 280-300 г.

Экспериментальные группы:

1. Интактный контроль (п=5);

2. Водная депривация 60 ч (п=6);

2.2.2. In situ гибридизация с нерадиоактнвной меткой.

Метод был использован с целью идентификации структур, содержащих мРНК ВП в задней доле гипофиза при воспалении. Синтетическая олигопроба (Университет Фридриха Шиллера, Иена; Германия), состояла из 20 нуклеотидов, 5 из которых были помечены бромодиоксиуридином. Гибридизация проводилась на полутонких (0.5 мкм) срезах гипофиза, которые освобождали от эпона и наносили пробу (1 мкг анти-мРНК в 1 мкл) в гибридизационном буфере. Инкубировали 2 часа, затем промывали стекла в фосфатном буфере и далее выявляли бромодиоксиуридин с помощью моноклональных антител по стандартной ПАП методике [Jirikowski et al., 1990].

2.2.3. Иммунная гистохимия

В задней доле гипофиза на полутонких срезах выявляли ВП, используя поликлональные анти-крысиные антитела. Помимо этого с помощью антител к ВП, меченых коллоидным золотом, ВП выявляли на ультратонких срезах гипофиза.

Для количественной оценки биологически-активных рецепторов к глюкокортикоидам в гипоталамусе иммуногистохимическую реакцию проводили на криостатных срезах, используя поликлональные антитела к рецептору глюкокортикоидов (II тип), меченые S-35 [Grinevich et al., 2000].

2.2.4. Связывание радиолиганда рецептора ВП почкой

Метод использован для оценки количества биологически-активных рецепторов ВП в почке при воспалении. Криостатные срезы почки преинкубировали в буфере с добавлением апротинина, баситрасина и альбумина бычьей сыворотки, затем наносили трейсер, представляющий собой антагонист рецептора ВП 2-го типа (d(CH2)5[D-Ile\lle4,Tyr-NH29]AVP), меченый [1251] в концентрации 3x105 кюри в микролитре.

2.2.5. Выявление фрагментации ДНК (мечение З'-концов)

Метод использовался для выявления в почке клеток, содержащих фрагментацию ДНК (один из признаков апоптоза). На лишенные эпона срезы наносился буфер, содержащий терминальную трансферазу и бромодиоксиуридин ("кит" компании Boeliringer). После инкубации на срезы наносили моноклональные антитела к бромодиоксиуридину, а затем проявляли по стандартной ПАП методике [Aschoff et al., 1997, 1998].

2.2.6. Определение концентраций гормонов и цитокинов в крови

Уровни в плазме крови ВП, АКТГ и кортикостерона радиоиммунологически, используя соответствующие "киты"; ИЛ-1 и ИЛ-6 - с помощью иммуноферментного анализа.

3. Результаты собственных исследований и их обсуждение

3.1. ГГАС при воспалении

3.1.1. Острое и хроническое введение ЛПС

Вес животных и надпочечников. Длительное введение ЛПС приводит к снижению динамики роста (день 13 - день 1 эксперимента) крыс: 11.0 ± 2.0 г о сравнении с 32.9 ±4.1 г в контроле, Р<0.01. В этой группе вес надпочечников был достоверно выше, чем в контроле (соответственно 21.1 ± 0.7 и 18.0 ± 1.1 мг, Р<0.05). Эти данные отражают тот факт, что животные в ходе длительного введения ЛПС находились в состоянии хронического стресса и косвенно свидетельствуют против привыкания к эндотоксину.

мРНК КРГ и его рецептора в ПВЯ. Однократная инъекция ЛПС, также как и иммобилизация, вызывают существенное увеличение уровней мРНК КРГ в мелкоклеточной части ПВЯ (Рис. 2, 3).

Дополнительная инъекция ЛПС у группы с длительным введением ЛПС приводит к нарастанию мРНК КРГ на 150% (Р<0.01), т.е. до уровней у

3. Однократное введение ЛПС (250 мкг на 100 г, и/п). Крысы были забиты через 3 ч (п=6) и 6 ч (п=6);

4. Однократная иммобилизация. Крыс помешали в цилиндры и забивали через 1 ч (п=4) и 3 ч (п=5) после освобождения;

5. Однократное введение ЛПС на фоне водной депривации. Спустя 60 ч после начала водной депривации крысы получали однократную инъекцию ЛПС (250 мкг на 100 г, и/п) и забивались через 3 (п=5) и 6 (п=5) часов после инъекции;

6. Иммобилизация на фоне водной депривации. Спустя 60 ч после начала водной депривации крысы подвергались часовой иммобилизации и были забиты спустя 1 (п=5) и 3 (п=4) ч после освобождения.

Во всех экспериментах крыс забивали декапитацией с помощью гильотины, кровь гепаринизпровали, центрифугировали и плазму хранили при -80С для дальнейшего определения концентраций натрия и гормонов. Сразу после декапитации определяли вес животного и надпочечников. Головной мозг, гипофиз и внутренние органы (надпочечники, селезенка, почки и печень) быстро замораживали на сухом льду в заливочной среде Tissue Teck и хранили при -80С. Часть гипофизов и почек заливали в эпон. Из замороженных органов изготавливали на криостате срезы толщиной 12 мкм, монтировали на стекла, покрытые поли-Ь-лизином, и хранили при -80С для дальнейшей радиоактивной гибридизации, радиоактивной иммуногистохимии или связывания радиолигандов. Эпоновые блоки резали на ультратоме для дальнейшей нерадиоактивной in situ гибридизации или иммунной гистохимии.

2.2. Методы

2.2.1. In situ гибридизация с радиоактивной меткой

Метод был использован для количественной оценки уровней транскрипции (гетеронуклеарной РЖ - гнРЖ) и экспрессии (мРЖ) генов нейрогормонов: КРГ, ВП, их рецепторов, предшественника АКТГ - ПОМК, и

фермента стероидогенеза в надпочечниках - lip гидроксилазы, а также цитокинов (интерлейкин-ф и 6) в органах ГГАС, селезенке, печени и почках.

Гибридизационные рибопробы синтезировались с фрагментов генов указанных пептидов, клонированных в плазмиды. Приготовление рибопроб производилось по стандартной методике, включающей линеаризацию плазмид, проведение in vitro транскрипции, преципитация пробы с транспортной РНК дрожжей, центрифугирование, высушивание и растворение осадка [Grinevich et al., 1997].

Гибридизация проводилась согласно обычному протоколу [Grinevich et al., 1997]: стекла с криостатньши срезами (12 мкм) органов размораживали, постфиксировали в 4% параформальдегиде, ацетилировали в 0.25% уксусном ангидриде, обезвоживали в спиртах и хлороформе и высушивали. После этого на срезы наносили гибридизационный буфер, содержащий 2x106 кюри в микролитре пробы, меченой S-35, и инкубировали 12 часов при 55С. После инкубации неспецифическое связывание удалялось путем длительной промывки в стандартном цитратном солевом буфере нисходящих концентраций с добавлением формамида и рибонуклеазы А.

Гибридизация с мРНК ПОМК в гипофизе и lip гидроксилазы в надпочечниках проводилась с использованием синтетических олигопроб по стандартной методике [Harbuz, Lightman, 1989; Li, Grinevich et al, 1995].

Для оценки гибридизашюнных сигналов (т.е. восстановленных гранул серебра) срезы экспонировали либо с высокочувствительной рентгеновской пленкой ВЮМАХ MR в кассетах, либо покрывали фотоэмульсией (Kodak, IBI, New Heaven, СТ, USA). После проявления пленок или эмульсии оптическую плотность сигнала оценивали с помощью анализатора изображений (Imaging Research, Ontario, Canada). Статистический анализ проводился с помощью комплексного пакета программ ANOVA, включающего тест Fisher'a.

животных, получавших ЛПС однократно. Иммобилизация крыс этой группы вызывает увеличение уровней мРНК КРГ только на 54%. (Рис. 1,2).

Данные четко отражают подавление синтеза КРГ у животных с

ф

х а. 2

М Ё

I—| базапьные уровни

ш лпс

■ иммобилизация

контроль

ЛПС 13 дней

контроль

ЛПС 13 дней

Рис. 2. Экспрессия мРНК КРГ и КРГ-Р в мелкоклеточной части ПВЯ гипоталамуса крыс, подвергнутых длительному введению ЛПС. * Р<0.01 в сравнении с общим контролем, # Р<0.01- с соотносимым контролем, @ Р<0 01 - с группой крыс, длительно получавших ЛПС

длительным введением ЛПС. Наряду с этим нейрогенный стресс (иммобилизация) активирует его синтез в значительно меньшей степени, чем «иммунный» (новая инъекция ЛПС).

У контрольных животных в базальном состоянии экспрессия КРГ-Р в мелкоклеточной части ПВЯ была очень низкой (Рис. 2). Однократное введение

ДЛИТЕЛЬНОЕ КОНТРОЛЬ ВВЕДЕНИЕ ЛПС

Рис. 3. Экспрессия мРНК КРГ в мелкоклеточной части паравентрикулярного ядра гипоталамуса после длительного введения ЛПС. Микрофотографии сделаны со стекол, покрытых фотоэмульсией после проведения авторадиографической т situ гибридизации с мРНК КРГ.

ЛПС и иммобилизация приводили к значительному нарастанию уровней мРНК КРГ-Р (соответственно 585% и 547%, Р<0.01). В группе с длительным введением ЛПС уровни мРНК КРГ-Р достоверно от контроля не отличались. Новая инъекция ЛПС и иммобилизация Повышали уровни мРНК КРГ-Р. Однако степень нарастания мечения была гораздо ниже, чем у животных однократно получавших ЛПС или подвергнутых иммобилизации (Рис. 2).

Таким образом, экспрессия КРГ и его рецептора находятся в динамическом равновесии - однократная инъекция ЛПС вызывает активацию синтеза КРГ и КРГ-Р, а угнетение уровней мРНК КРГ при длительном введении ЛПС - снижение уровней мРНК его рецептора. Существует предположение об ингибирующей роли КРГ-Р в синтезе КРГ при стрессе [Neumann, 1997]. Поэтому отсутствие нарастания синтеза КРГ-Р после дополнительной инъекции ЛПС (в меньшей степени после иммобилизации) у животных с длительным введением ЛПС может объяснить активацию синтеза КРГ в этих условиях.

мРНК мелкоклеточного ВП в ПВЯ. Однократная инъекция ЛПС и иммобилизация приводят к существенному нарастанию оптической плотности метки мРНК ВП в мелкоклеточных нейронах ПВЯ (соответственно до 201% и 199%, Р<0.001) (Рис. 4). У животных с длительным введением ЛПС плотность метки существенно превышает таковую в контроле (на 118%, Р<0.01). Дополнительная инъекция ЛПС этим животным не оказывает эффекта на плотность метки мРНК ВП. Напротив, иммобилизация приводит к ее значимому нарастанию на 64% (Р<0.001). Эти данные свидетельствуют о различиях в регуляции экспрессии двух генов - КРГ и ВП в одном и том же мелкоклеточном нейроне. Помимо того, что при хроническом воспалении мелкоклеточный ВП выступает на первый план как центральный нейрогормон ГГАС, его реакция на иммобилизацию и нейрогенный стрессы практически противоположна КРГ.

Глюкокортикоидные рецепторы в ПВЯ Однократная инъекция ЛПС вызывает выраженное нарастание плотности метки по сравнению с

контрольными уровнями (153%, Р<0.01), что свидетельствует об увеличении числа несвязанных, биологически активных рецепторов. Не исключено, что при этом состоянии глюкокортикоиды замыкают контур отрицательной обратной связи, предотвращая запредельную активацию КРГ нейрона. У животных двух других групп статистически достоверных различий обнаружено не было.

мРНК ПОМК и КРГ-Р в передней доле гипофиза Инъекция ЛПС (но не иммобилизация) приводит к достоверному увеличению плотности метки мРНК ПОМК по сравнению с контролем (30%, Р<0.05). При этом отмечается снижение плотности метки мРНК КРГ-Р (51%, Р<0.01). Длительное введение

1500

Ш о юоо Ш Е ^ о

то з: ^ п: и ш а> о

ЕЕ о

I I базальные уровни ■ иммобилизация

контроль

ЛПС 13 дней

Рис. 4. Экспрессия мРНК ВП в мелкоклеточной части ПВЯ гипоталамуса крыс, подвергнутых длительному введению ЛПС. * Р<0.01 в сравнении с общим контролем, # Р<0.01- с соотносимым контролем, @ Р<0.01 - с группой крыс, длительно получавших ЛПС.

ЛПС, как и однократное, приводит к нарастанию мРНК ПОМК (30%, Р<0.05), а новая инъекция вызывает еще большее нарастание оптической плотности метки (на 34% выше, чем у группы, длительно получавшей ЛПС, Р<0.01).

мРНК 11Р гидроксилазы в надпочечниках. Меченая мРНК 11Р гидроксилазы (цитохром Р450, СУР 11) диффузно распределялась в пучковой и сетчатой зонах коры надпочечников. Плотность метки нарастает после инъекции ЛПС до 130% (Р0.01), а на 14 день после введения ЛПС интенсивность мечения была еще выше - 160%, Р<0.001.

Таким образом, в условиях длительного введения ЛПС на всех уровнях ГТАС происходят изменения, сходные с таковыми при других моделях хронического воспаления, как то: подавление синтеза КРГ, нарастание коэкспресии в КРГ нейронах ВП, активация синтеза АКТГ и кортикостерона [Ы^итап, 1992].

Экспрессия цитокинов

мРНК гштерлейкина-1 Р ибв мозге, гипофизе и селезенке

В селезенке инъекция ЛПС вызывает увеличение мРНК ИЛ-1(5 и ИЛ-6 в 6 и 7 раз, соответственно. В группе с длительным введением ЛПС отмечена сходная интенсивность мечения мРНК обоих цитокинов, однако, новая инъекция ЛПС этим животным картины не изменяет.

В гипофизе введение ЛПС приводит к увеличению плотности метки мРНК ИЛ-1р на 335%, а ИЛ-6 - на 242% (Р<0.01). У крыс с введением ЛПС в течение 14 дней уровень мечения мРНК ИЛ-1Р был аналогичным, а новая инъекция ЛПС не изменяла этого параметра. При этом мРНК ИЛ-6 выявить не удалось.

В головном мозге инъекция ЛПС вызывает появление интенсивного мечения мРНК обоих цитокинов в области циркумвентрикулярных органов и сосудистых сплетениях боковых желудочков, однако, у животных с длительным введением ЛПС плотность метки мРНК ИЛ-1Р была как минимум

в 3 раза ниже, а после новой инъекции ЛПС этим крысам изменений в плотности сигнала не происходило. Так, в субфорникальном органе после однократной инъекция ЛПС увеличивается плотность метки с 0 до 13.4 у. е., в то время как длительное введение ЛПС и дополнительная инъекция ЛРС этим животным вызывают увеличение плотности мечения только на 29% и 34%, соответственно. При этом мРНК ИЛ-6 у крыс визуализовать не удалось.

Анализируя полученные данные об экспрессии генов цитокинов можно заключить, что не только при остром [Гриневич и др., 1999], но и при хроническом воспалении ИЛ-1Р способен паракринно активировать синтез ПОМК и тем самым стимулировать продукцию глюкокортикоидов. При этом его значение на гипоталамическом уровне представляется сомнительным. Интересно, что в отличие от ИЛ-1р, ИЛ-6 вообще не экспрессировался локально в головном мозге и гипофизе при длительном введении ЛПС. Последнее отражает специфику регуляции ГГАС разными цитокинами в данной экспериментальной модели.

3.1.2. Артрит, вызванный введением адыованта

Гипоташиический уровень

Через 14 дней после введения адъюванта происходит выраженное снижение интенсивности мечения мРНК КРГ на 45%, (Р<0.01). Если инъекция ЛПС контрольным животным вызывает нарастание плотности метки на 35%, (Р<0.01), то введение ЛПС на фоне хронического артрита приводит к очень выраженному нарастанию плотности мечения на 57% (Р<0.01), достигая уровней, не отличимых от контрольных (ЛПС) (Рис. 5). Нарастание оптической плотности транскрипта мРНК мелкоклеточного ВП составляет 300%, а инъекция ЛПС крысам этой группы приводит к дальнейшему нарастанию уровней мРНК ВП в мелкоклеточных нейронах на 50%.

Уровни мРНК ПОМК в гипофизе и АКТГ в крови

У животных с хроническим артритом уровни мРНК ПОМК в аденогипофизе были повышены на 33% (Р<0.05). Инъекция ЛИС этим крысам вызывала еще большее нарастание (30% Р<0.02) уровней мРНК ПОМК.

В базальных уровнях АКТГ на 14 день эксперимента значимых изменений выявить не удалось. Инъекция этим животным ЛПС вызывает нарастание концентрации АКТГ, на 200% превышающей эту величину в контроле (ЛПС 6ч), Р<0.05.

Тканевая экспрессия цитокииов и их уровни в системном кровотоке Через 14 дней после введения адъюванта во всех изученных органах было

□ Б

Контроль АА

Рмс. 5. Экспрессия мРНК КРГ в мелкоклеточной част» ПВЯ гипоталамуса после инъекции ЛПС на фоне хронического артрита (АА).

* Р<0.0! - в сравнении с контролем (физ. р-р), @ Р<0 0! - с группой хронического артрита.

обнаружено некоторое нарастание оптической плотности мРНК ИЛ-1(3 и №

Ь

о

К

е

70

50

30

£ 10

Сь.

>• О

л 200 &

о х

о с: г

« 150

в-к

• 100

К

53

5 Я

СХ

50

Гипофиз

□ в

ЛПС

1

К

АА

Печень

□ ь

^ ЛПС # !

мао

2 юо

с

О 60

К

я 20

Ж §

а.

> п

^ 10П

Й

с; с

80

60

^ 40

К

я

X ю о

сх >>

20

Надпочечники г—1 #

□ Б

Щ ЛПС

1

к

АА

Селезенка

□ в

ЕЯ ЛПС

X

к

АА

К

АА

Рис. 6. Экспрессия мРНК ИЛ-1 после инъекции ЛПС крысам с хронически?, артритом, вызванным ведением адьюванта (АА). К - контроль, Б - базальньк уровни. * РсО.О! - в сравнении с общим контролем, # Р<0 01 - с соотносимы\ контролем (ЛПС).

(Рис. 6). Инъекция ЛПС животным с артритом приводит к существенному нарастанию уровней мРНК ИЛ-1 в головном мозге (Рис. 7). Так, уровень оптической плотности сигнала мРНК ИЛ-1Р в субфорникальном органе и локально в паравентрикулярном ядре нарастал соответственно в 2.6 и 6 раз по сравнению с контролем (ЛПС) (Р<0.01).

Как показал гистологический анализ срезов мозга, метка мРНК ИЛ-1 содержится в микроглиоцитах. Уровни мРНК ИЛ-6 в головном мозге были одинаковы у контрольных крыс и животных с артритом.

Нарастание уровней мРНК обоих цитокинов после инъекции ЛПС крысам с артритом обнаружено и во всех периферических органах за исключением селезенки, в которой отмечено даже некоторое снижение плотности метки (рис. 6).

Инъекция ЛПС сама по себе вызывала очень выраженное нарастание концентраций цитокинов в кропи. ИЛ-1Р повышался с 5.76+1.49 (контроль) до

СВ

ЛПС6Ч АА 14д + ЛПС 6ч

сфо сс n ; - г; . ~

' ' * „ * - - -

- .' ^ пвя

■ ■■"."... "Я

Рис. 7. Рентгенограммы транскрпптов мРНК интерлейкпна-ip в головном мозге после инъекции ЛПС на фоне хронического артрита (АА). Изображения с рентгеновских пленок после проведения in situ гибридизации. ПВЯ -паравентрикулярное ядро, СВ - срединное возвышение нейрогипофиза, СС -сосудистые сплетения боковых желудочков, СФО - субфорникальный орган.

Нг*

1074±55.42 пг/мл, а ИЛ-6 - с недетектируемого уровня (<40) в контроле 7050±439.11 пг/мл. При этом введение ЛПС крысам с артитом приводил достоверному (Р0.0001) двукратному нарастанию концентраций об< цитокинов (по сравнению с соотносимым контролем - ЛПС). Учиты обнаруженное нами снижение уровней мРНК обоих цитокинов в селезенк резкое их нарастание в печени, можно предполагать, что именно печень слу; основным источником циркулирующих цитокинов при данном состоянии.

Таким образом, в условиях хронического воспаления, вызванн введением адъюванта, новый антиген (ЛПС) провоцирует гиперпродукг центральных нейрогормонов ГГАС, определяющим фактором которой слу «гиперэкспрессия» цитокинов в головном мозге и периферических тканях.

3.2. ГГНС при воспалении

3.2.1. Временная динамика секреции и сннт ' крупноклеточного ВП после однократного введения ЛПС

Инъекция ЛПС приводит к недостоверному снижению концентраций в крови через 6 и 12 ч без изменении содержания N3. Отличий в оптичес плотности сигнала первичного транскрипта (гнРНК) ни в крупноклеточ части ПВЯ, ни в СОЯ не выявлено, а уровни мРНК ВП достоверно (2 Р<0.01) снижаются в обоих ядрах через 6 и 12 ч (Рис. 8).

При этом во всех экспериментальных группах ЛПС вызывает увеличь плотности мечения мРНК ВП в задней доле гипофиза. Использов; «холодной метки» на полутонких срезах гипофиза позволило выя: морфологический субстрат локализации мРНК: мРНК ВП, также ка нммунореактнвный ВП содержатся в терминальных расширениях аксонов ( Герринга) крупноклеточных нейронов гипоталамуса. Присутствие ВП в р увеличенных после инъекции ЛПС телах Герринга (но не в питуици подтверждено и на электронно-микроскопическом уровне. Гиган расширенные терминали аксонов крупноклеточных нейронов в задней ,

гипофиза могут свидетельствовать о блокаде выведения ВП в системный кровоток под действием ЛПС.

Сравнительно недавно описанная миграция мРНК по аксонам

80

70

60 -

£ 50 -

40

30

—*— гетеронукле арная РНК вазопрессина ■■*■■■ матричная РНК вазопрессина

контроль ЛПС 3ч ЛПС 6ч ЛПС 12ч

Контроль ЛПС Зч ЛПС 6ч ЛПС 12ч

CL X

-

РЛ*

•- ! «И-

х о_

Рис. 8. Экспрессия гнРНК и мРНК ВП в крупноклеточной части ПВЯ после инъекции ЛПС. *Р<0.01 по сравнению с контролем. Внизу представлены авторалиограммы рентгеновских пленок после проведения in situ гибридизации.

крупноклеточных нейронов [ЛпкошзЫ е! а1., 1990] отчасти объясняет сниже содержания мРНК ВП в перикарионах крупноклеточных нейронов при ост воспалении. Другой причиной этого нового феномена может быть сниже стабильности под действием факторов воспаления.

3.2.2. Острая осмотическая стимуляция на фоне воспаления

Введение 900 мМ гипертонического р-ра (ГТР) №С1 через 3 ч пс инъекции ЛПС приводило к 5-кратному нарастанию концентраций ВП в пла через 15 мин (Р<0.01) и 3-кратному через 30 мин (НД) по сравненш контролем (ГТР). Различии в концентрации 1Ча между этими групп обнаружено не было (Рис. 9). Оптическая плотность мечения гнРНК ВП в С и ПВЯ значительно нарастала через 15 и 30 мин после инъекции в сравнен! соотносимым контролем (ГТР 15 и 30 мин). Это увеличение составл соответственно в СОЯ и ПВЯ 128% (Р<0.01) и 155% (Р<0.001) через 15 мг > 158% (Р<0.01) и 168% (Р<0.01) через 30 мин. Близкая ситуация отмечалас

через 6 ч после инъекции ЛПС: 2- кратное повышение концентрации ВП ч< -1 15 мин, которая возвращалась к базальному уровню через 30 мин, отсутст

значимых различий концентраций № и существенное нарастание оптичес плотности гнРНК ВП. Это нарастание составляло 129% в СОЯ и 155% в Г (Р<0.01) через 15 мин и 188% и 180% (Р<0.01) через 30 мин по сравнени сопоставимым контролем (ГТР). При этом уровни мРНК ВП в СОЯ и Г были достоверно снижены.

3.2.3. Реакция ГГНС на введение ЛПС при длнтелы осмотической стимуляции (солевая нагрузка и вод! депривация).

Инъекция ЛПС на фоне солевой нагрузки через 3 ч вызьп достоверный 4-кратный подъем уровня ВП, а через 6 ч уровень ВП превы контрольный (солевая нагрузка) вдвое. При этом различий в концентрации 1

как в задней доле гипофиза значительно повышено (41%, Р<0.001). Аналогичная ситуация наблюдалась и при водной депрнвации. Так, инъекция ЛПС животным, лишенным воды, вызывала через 3 ч небольшое увеличение концентрации ВП в плазме, которое через 6 ч становилось 2-кратным (Р<0.0001). При этом концентрация в плазме Иа у животных этих групп не различалась.

Ни инъекции ЛПС, ни иммобилизация не приводили к существенным изменениям в уровнях гнРНК ВП в СОЯ и ПВЯ, в то время как содержание мРНК ВП снижалось через б ч после инъекции ЛПС. Параллельно, в задней доле гипофиза происходило нарастание плотности сигнала (Р<0.05).Таким образом, как острая, так и длительная, осмотическая стимуляция животных с воспалением приводила к значительной активации выделения ВП в системный кровоток, которое превышало уровни в соотносимых контролях. При этом введение гипертонического раствора вызывало и активацию транскрипции гена ВП. При длительной стимуляции эта транскрипция изначально находилась на высоком уровне, поэтому изменений, вызванных введением ЛПС, выявить не удалось. Подобная потенциация синтеза и выделения ВП может быть объяснена содружественными эффектами проявлений воспаления (цитокинемия, гипотензия, эндотоксемия) и осмотического стимула, сходящимися на крупноклеточный нейрон (Рис. 10).

3.2.4. Медуллярный аппарат почки

Экспрессия и биологическая активность рецепторов вазопрессииа

После инъекции ЛПС отмечалось значительное, 4-кратное (Р<0.001) уменьшение оптической плотности сигнала мРНК рецептора ВП (ВП-Р2) через 3 и 6 часов и 2-кратное - через 12ч (Р<0.01). Инъекция ЛПС на фоне солевой нагрузки через 3 ч и 6 ч приводила соответственно к 4-х и 2-х кратному снижению плотности метки по сравнению с соотносимым контролем (солевая нагрузка), Р<0.001. (Рис. 11,12).

Использование связывания агониста ВП-Р2 показало, что инъекция Л вызывает существенное снижение оптической плотности метки, что мо>

а я

5 ¡5

й з

к *

Ч 8

2 г

§ I

О V®. £

-г е

§1

Си к

зд «о

о &

с. р §

Рч И 5 |

о.

—Контроль * Солев ая нагрузка

о э • 1а

Время после инъекции ЛПС (ч)

Контроль Солевая нагрузка

Время после инъекции ЛПС (ч) #

Контроль ' Солевая нагрузка

Время после инъекции ЛПС (ч)

Рис. 11. Экспрессия мРНК рецептора ВП, ИЛ-1 и ИЛ-6 в почке после инъекции ЛПС на фоне солевой нагрузки. * Р<0.01 - в сравнении с интактным контролем, А Р<0.01 - с группой, подвергнутой солевой нагрузке, @ Р<0.01 - между контролем и солевой нагрузкой.

соотносимых группах выявлено не было. В силу того, что базатьные уровни гнРНК ВП в этих условиях были высоки, потенцирующий эффект ЛПС на ее

ос

ГГ го о. н г <и гг

X

о

Контроль ЛПС Зч ЛПС Бч

О мин

15 мин

30 мин

ГИПЕРТОНИЧЕСКИМ РАСТВОР ЫаС!

го о. н х ш =Г X

о

180-,

170-

160

150

140-

130-

О мин 15 мин 30 мин

ГИПЕРТОНИЧЕСКИЙ РАСТВОР ЫаС!

Рнс. 9. Концентрации ВП и № в крови крыс, получивших инъекцию гипертонического раствора ЫаС1 после введения ЛПС. * Р<0 0] - в сравнении с соотносимым контролем (11Р 15 мин).

уровни обнаружен не был. Наряду с этим, через 6 ч после инъекции Л содержание мРНК ВП в пернкарионах было достоверно снижено, в то вр(

Осмотическая стимуляция

ЩгнРНК ВП [Т] мрнквп

ВП

И

Острое воспаление (ЛПС)

ЦИТОКННЫ

Осмотическая

стимуляция +

воспаление

ЦКТОКННЫ

Рис. 10. Реакши пшоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы на острое воспаление.

Сокращения: гнРНК - гетеронуклеарная РНК (уровень транскрипции) вазопрессина (ВП), мРНК - матричная РНК ВП (уровень трансляции), СОЯ и ПВЯ - супраоптическое и паравентрикулярное ядра, ЗДГ - задняя доля гипофиза.

этражать как уменьшение обшего числа рецепторов, так и подавление способности к снизыванию оставшихся.

Впутрипачечная экспрессия цитокипоа

Инъекция ЛПС приводит к появлению специфического сигнала в почке. 3 случае обоих цитокинов метка выявлялась главным образом в мозговом

г.* I V Г- ^-к-.,££<х>, •

\ ■ Т; г г

.... »

У

со

О С сц

т со

О □

С

«г*.«'5" ■ 1 *

■- ч »л <■*- -

.V

. • .йо д . ... ,

! -5 V тл'ч.- >

1 "У« 4

ВП-Р2

ИЛ-1 бета

ИЛ-6

Рис. 12. Авторадиограммы рентгеновских пленок транскриптов мРНК рецептора ВП, интерлейкина-1 и 6 в почке после инъекции ЛПС.

веществе с избирательной локализацией в мозговом веществе (об/ собирательных трубочек). Оптическая плотность гибридизационной м мРНК ИЛ-1(3 была максимальной через 6 ч, а мРНК ИЛ-6 - через 3 ч. При динамика нарастания синтеза цитокинов находилась в обратной зависимо« уровнями мРНК ВП-Р2 (Рис. 11, 12). Поэтому возможно, что ИЛ-1 и I могут быть основными факторами, определяющими чувствительность поч системному ВП при воспалении.

Фрагментация ДНК в почке после введения ЛПС Через 6 часов после введения ЛПС было обнаружено окрашивание небольшой части клеток (не более 10%) эпителия собирательных труб< Учитывая, с одной стороны, небольшое количество клеток с призна апоптоза в собирательных трубочках, а с другой - очень выраженное сниж синтеза рецептора ВП, мы исключаем взаимозависимость этих двух процес

< 3.3. Реакция ГГАС на введение ЛПС в условиях хроннчес

I

осмотической стимуляции (водная депривация)

•I мРНККРГвПВЯ

У животных, подвергнутых водной депривации, оптическая гшотг сигнала мРНК снижалась в 4 раза по сравнению с контролем (рис. Введение ЛПС и иммобилизация вызывали достоверное нарастание плоти сигнала соответственно в 3.5 (Р<0.008), 3.6 (Р<0.005) и 2.9 (Р<0.05) раз. Од это увеличение не достигало контрольных величин. мРНК мелкоклеточного ВП в ПВЯ

Оптическая плотность гранул серебра над мелкоклеточными нейро ПВЯ (мРНК ВП) была аналогичной в контроле и у животных, лишенных в При этом введение ЛПС (6ч) и иммобилизация (Зч) крыс, подвергнутых во депривации, вызывали только двукратное увеличение плотности сигнала, п как у животных с нормальным питьевым режимом это нарастание I соответственно 5 и 3.6 - кратным.

мРНК ПОМК в перстней Оолс гипофиза

Водная дспривация вызывает заметное нарастание уровней мРНК ПОМК в передней доле гипофиза (44%, Р<0.05). При этом инъекция ЛПС контрольным крысам приводила к увеличению плотности сигнала на 12% (Зч) и 43% (6ч). Введение ЛПС (6ч) на фоне водной депривации еще более увеличивает уровни мРНК ПОМК. Это увеличение составляет 74% по сравнению с контрольной группой и 25% - с группой лишенных воды крыс.

Как и следовало ожидать, хроническая осмотическая стимуляция приводила к подавлению синтеза КРГ [Young, 1986; Aguilera et al., 1993].

(D >

_ л

PL h

m x

Q.

r

CD O

Q.

>

O

aj

T

s l-c o

50

40

30

20

10

КОНТРОЛЬ

I I Контроль Ш ЛПС Зч Ш ЛПС 6ч

ESS Иммобилизация 1ч Иммобилизация Зч

1

т

I

ВОДНАЯ ДЕПРИВАЦИЯ

Рис. 13. Экспрессия мРНК КРГ в мелкоклеточной части ПВЯ у животных, подвергнутых водной депривации. *Р<0 01 - по сравнению с общим контролем, Р<0.01 - с группой лишенных воды животных, # Р<0.01 - с соотносимыми контролями (ЛПС и иммобилизация).

Однако при этом не наблюдалось нарастания коэкспрессии ВП мелкоклеточном нейроне, подобно моделям хронического воспаления и, б( того, синтез обоих нейрогормонов не был заметно стимулирован нейрогеш или иммунным стрессором. Наряду с этим, уровни мРНК ПОМК б повышены в базальном состоянии и инъекция ЛПС на фоне водной деприва еще более стимулировала синтез ПОМК, Учитывая снижение активнс центральных гипоталамических нейронов становится вероятной { системного ВП в регуляции гипофизарно-адренокортикальной оси. предположение также базируется на выявленном нами пике системного В крови (см. раздел 3.2.3) после инъекции ЛПС животным, лишенным воды, положительно коррелировало с нарастанием синтеза ПОМК в аденогипос] (Рис. 14).

Обобщая весь представленный материал следует отметить, традиционные представления о регуляции функций основных адаптив нейроэндокрннных систем организма - ГГАС и ГТНС существе расширяются новыми сведениями о роли иммунной системы, «цитокинового» компонента. При этом взаимоотношения центральных зве! нейроэндокринной системы - нейросекреторных нейронов гипоталамуса I органов-мишеней значительно изменяются под влиянием цитокинов [Грин« и др., 1999, 2000]. Наиболее отчетливо эффекты цитокинов проявляются воспалении, когда становятся зримыми динамические связи, отражаю существование единой регуляторной системы организма нейроиммуноэндокринной.

Ярким примером этих связей служит описанная содружественная реа! нейронов ГГАС и продукции цитокинов в головном мозге и перифериче< органах в ответ на введение антигена (ЛПС) животным с хроничес аутоиммунным заболеванием (артрит). Механизмы этого явления пока не я< Можно лишь предполагать, что в условиях хронического воспаления нарас рецепторная чувствительность клеток макрофагально-мононуклеарного ]

(макрофаги, микроглия, клетки Куп(|)ера и другие), которые первыми встречаются с антигеном и презентрируют его лимфоцитам. Возможно, именно это определяет усиленную продукцию цитокинов и вызываемую ими гиперстимуляцию синтеза центральных нейрогормонов ГТАС и АКТГ.

Бесспорным примером взаимовлияний иммунной и нейроэндокринной систем служит состояние ГГНС при воспалении. Сохранение воды является важнейшей и эволюционно древнейшей функцией, которую обеспечивает у млекопитающих гормон ГГНС - ВП, синтезируемый крупноклеточными нейронами. Поскольку воспаление всегда сопровождается потерями жидкости, активация синтеза и выделения ВП должны быть закономерной компенсаторной реакцией.

Однако тщательное и комплексное изучение процессов транскрипции и трансляции гена крупноклеточного ВП и выделения этого нейрогормона в системный кровоток позволили выявить неожиданную, совершенно парадоксальную картину. Так, было показано, что при воспалении содержание ВП в крови имело тенденцию к снижению, транскрипция гена ВП в фупноклеточном нейроне не изменялась, а уровни мессенжер-РНК в герикарионе уменьшались. Таким образом, ожидаемой активации фупноклеточного нейрона в этих условиях не происходило и, более того, /ровни мРНК ВП в нем снижались. Учитывая экспрессию в крупноклеточном leiipoHe рецепторов эндогенного антагониста интерлешиша-1 [Van Dam et al., [998], цитокины могут быть ведущими агентами в описанном явлении.

В заключение хотелось бы подчеркнуть, что полученные в шссертационной работе данные свидетельствуют о реальности существования ¡диной нейроиммуноэндокринной системы и приближают к пониманию механизмов ее функционирования и роли в адаптивных реакциях организма.

ГГНС ГГАС

Крупноклеточные Мелкоклаточныв

нейроны нейроны

[*]гнРНКВП 71Л мРНККРГ

Е

мРНК ВП

мРНК ВП

Норма

здг

ВП

Длительная осмотическая стимуляция

АКТГ

Острое воспаление (ППС)

ВП

Осмотическая

стимуляция ♦

воспаление

вп

Рис. 14. Взаимоотношения между птоталамо-птофизарно-неиросекреторнсн (11 НС) и гипоталамо-гипофизарно-адреналовой (ГТАС) системами при длительно! осмотической стимуляции и воспалении.

Сокращения: АКТГ - адренокортикотропный гормон, гнРНК - гетеронуклеарна. РНК вазопрессина (ВП), ЗДГ - задняя доля гипофиза, мРНК - матричная РНК ВП КРГ - кортикотропин-рнлизинг гормон, ПДГ - передняя доля гипофиза, ПВЯ паравентрикулярное ядро (к - крупноклеточная, м - мелкоклеточная части), СВ ■ срединное возвышение нейрогипофиза.

4. Выводы

1. Реакция ГГАС на острое воспаление, вызванное введением бактериального эндотоксина ЛГ1С (250 мкг на 100 г, и/п), характеризуется активацией всех звеньев этой системы, включая синтез кортиколиберина и вазопресспна в мелкоклеточных нейронах паравентрикулярного ядра гипоталамуса. При этом в них происходит нарастание количества биологически активных глюкокортикоидных рецепторов. Последнее свидетельствует об усилении механизмов отрицательной обратной связи, что предотвращает запредельную активацию мелкоклеточного нейрона при остром воспалении.

2. При хроническом воспалении, вызванном длительным (13 дней) введением ЛПС в нарастающих дозировках (25-250 мкг на 100 г, и/п), происходит парадоксальное подавление синтеза кортиколиберина и нарастание синтеза вазопресспна в мелкоклеточном нейроне гипоталамуса. Таким образом, мелкоклеточный вазопрессин становится основным центральным агентом в регуляции гипофизарно-адренокортикалыюй оси при хроническом воспалении. В этом случае происходит процесс активной утилизации в мелкоклеточно.м нейроне глюкокортикоидных рецепторов, что может быть причиной угнетения синтеза кортиколиберина.

3. Как при остром, так и при хроническом воспалении обнаружен паратлелизм в экспрессии генов кортиколиберина и его рецептора в мелкоклеточном нейроне паравентрикулярного ядра гипоталамуса, что позволяет предполагать существование внутриклеточного механизма саморегуляции этого нейрона.

4. Активация ГГАС при остром воспалении сопровождается нарастанием внутрисистемной экспрессии генов цитокинов - интерлейкина-ф и 6. При хроническом воспалении изменения в мелкоклеточных нейронах гипоталамуса не коррелируют с экспрессией цитокинов; активация гипофизарно-адренокортикальной оси в этих условиях возможно определяется локальными эффектами интерлейкина-1(3, уровень синтеза которого в гипофизе соответствует острому воспалению. Значение интерлейкина-6 в регуляции

ГГАС, вероятно, определяется его участием в регуляции этой системы то; при остром воспалении, т.к. при хроническом этот цитокин не экспрессиру ни в мозге, ни в гипофизе.

5. При хроническом введении ЛПС реакция ГТАС на нейрогенный ст] (иммобилизация, 1 ч) заметно снижена по сравнению с контролем, в то вр как новая, дополнительная инъекция ЛПС (спустя 24 ч после послед: введения, 250 мкг на 100 г, и/п) вызывает гиперактивацию экспрес кортиколиберина.

6. При хроническом артрите, вызванном введением адъюванта, обнару феномен пшерчувствительности ГТАС и иммунной системы (по крайней м ее «цитокинового компонента») к новому антигену. Так, инъекция J животным с хроническим артритом вызывает резкое нарастание экспре( генов кортиколиберина и вазопрессина в мелкоклеточных нейр< гипоталамуса, уровней АКТГ в крови и продукции цитокинов в ГТА периферических органах.

7. При остром воспалении (инъекция ЛПС), когда необходимо поддерж; водно-солевого баланса, не происходит ожидаемой активации крупноютето1 вазопрессинергической системы гипоталамуса. Это проявляется неизменности транскрипции гена вазопрессина (уровни первич! транскрипта), снижении содержания его матричной РНК и тенденци снижению его выделения в системный кровоток. Снижение уровней матри1 РНК в перикарионах крупноклеточных нейронов может бьггь связано миграцией в гигантски расширенные терминали аксонов задней доли гипоф

8. Острая (гипертонический р-р NaCl) и хроническая (солевая нагруз: водная депривация) осмотическая стимуляция при остром воспалении вызы потенциашно синтеза и выделения вазопрессина в общин кровоток, незавш от изменений осмолярности плазмы и, несмотря на снижение уро матричной РНК вазопрессина. Последнее отражает новый, «не осмотичеа механизм активации крупноклеточного нейрона в условиях воспаления.

9. В органе-мишени системного вазопрессина - почке, после инъекции ЛПС угнетается синтез рецептора вазопрессина и снижается связывание его агониста. Таким образом, при остром воспалении происходит снижение чувствительности почки к вазопрессину, которое не определяется, как обычно, колебаниями его уровней в системном кровотоке, а, скорее, зависит от локальных эффектов цитокннов.

10. Длительная осмотическая стимуляция (водная депривация), приводящая к активации синтеза крупноклеточного вазопрессина, сопровождается угнетением синтеза кортиколиберина и неизменностью транскрипции гена вазопрессина в мелкоклеточном нейроне паравентрикулярного ядра гипоталамуса. Инъекция ЛПС или иммобилизация вызывают нарастание синтеза обоих нейрогормонов в гораздо меньшей степени, чем в контроле. Учитывая положительную корреляцию между продукцией АКТГ в аденогипофизе и уровнями вазопрессина в крови, мы полагаем, что системный [крупноклеточный) вазопрессин является фактором регуляции гипофизарно-адренокортнкальной оси в этих условиях.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

I. Гриневич В.В., Данилова О.А., Черниговская Е.В., Поленов А.Л. Выявление <ортиколиберина в нейросекреторных клетках гомориположительных юполнительных центров гипоталамуса крыс // Бюл. экспер. биол. мед. 1993. Т. 116, №7. С. 13-15.

I. Grinevich V., Krasnovskaya I., Danilova О. Functional significance of the iccessory "gomory-positive" hypothalamic centers in stress // Proc. 1st intern, conf. 'Human survival: reserve capability" Moscow. 1993, P. 59-62. S. Гриневич BJB., Воропалова Л.С., Красновская И.А. Исследование юполнительных групп нонапептидергических центров гипоталамуса на ипофизэктомию у крыс // Морфология. 1994. Т.106, №4-6. С.38-46.

4. Гриневич В.В., Пеллетье Ж., Поленов A.JL Экспрессия г кортиколиберина (КРГ) и соматостатнна (ССТ) в добавочных крупноклеточ] (нонапептидергических) ядрах гипоталамуса крыс // Докл. РАН. 1996. Т. 351 2. С. 268-270.

5. Гриневич В.В., Поленов АЛ. Эволюция нонапептидергичес нейросекреторных центров гипоталамуса у позвоночных животных // Ж; эвол. биохим. физиол. 1996. Т.30, №2. С.270-292.

6. Li S., Grinevich V.V., Foumier A., Pelletier G. Effects of pituitary aden} cyclase-activating polypeptide (PACAP) on gonadotropin-releasing hormone somatostatin gene expression in the rat brain // Mol. Brain Res. 1996. V.41. P. 162.

7. Grinevich V., Polenov A. and Pelletier G. Accessory magnocel

neuroendocrine nuclei in the diencephalon of vertebrates (immunohistochemical

in situ hybridization studies) II An. L'Endocrinologie. 1996. V.l. P. 33.

i 8. Гриневич В.В. Крупноклеточный гипоталамус (главные и добавочные т

1

эволюционный, молекулярно-биологический и морфофункцнональный асп< \ // Усп. физиол. наук. 1997. Т.28, №4. С.242-260.

9. Гриневич В.В. Роль нового гнпоталамического пептида РАСАР в регул) эндокринных функций //Усп. физиол. наук. 1997. Т. 28. № 1. С. 47-52.

10. Гриневич В.В., Ишунина Т.А., Язева Г.Г. Роль окситоцина и вазоггресси регуляции размножения млекопитающих // Морфология. 1997. Т.110, №2. С 27.

11. Grinevich V., Fournier A., Pelletier G. Effects of pituitary adenylate eye activating polypeptide (PACAP) on corticotropin-releasing hormone (CRH) expression in the rat hypothalamic paraventricular nucleus // Brain Res. 1997. V. P. 190-196

12. Grinevich V.V., Akmayev I.G. An accessory magnocellular nucleus, ani commissural nucleus, in the rat hypothalamus: immunohistochemical, tract-tracii