Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Наукове обгрунтування та розробка технологii отримання бiопрепарату для очищения грунту вiд нафтопродуктiв

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Наукове обгрунтування та розробка технологii отримання бiопрепарату для очищения грунту вiд нафтопродуктiв"

УКРАГНСЬКИЙ ДЕРЯАВНИЙ УН1ВЕРСИТЕТ ХАРЧОБИХ ТЕХНОЛОГ1Й

РГ* ОД

На правах рукопксу

УДК 631.3.02+631.401+632.122.2

СЕЛЕЗНЬОВА Мзр1анаа Ваподиыир1вна

НАУКОЗЕ ОЕГРУНТУВАННЯ ГА РОЗ РОБКА ТЕХНОЛОГИ ОТРИЦАНИЯ ВЮПРЕПАРАТУ ДЛЯ ОЧИЩЕНИЯ ГРУНТУ ВЩ КАвТОПРСЩУКТШ

Спец1аш>п1сть 03.00.23 - б1отехнодог1я

Автореферат диоертацП на эдобутм вченого ступени кандидата техп1чких паук

КиКв - 1994

ДисертаЦею е рукопис.

Робота виконана в Укра1нському Державному

Ун1верситет1 Харчових Технолог1й, м. Ки1в

Науков! кер!вники

- Кандидат техн!чних наук, доцент Стабнжова Олена Всеволод1вна

- Доктор б!олог1чних наук, зав!душий в!дд1лом

I ванов Володимир Миколайович.

0ф1ц1йн1 опоненти

Доктор б!олог1чних наук, член-кореспондент АН УкраИни Подгорський Валентин Степанович Кандидат б1олог!чних наук, науковий сп!вроб1тник Федорик Св1тлана Михайл1вна

Пров1дна орган1вац1я

1нститут б1оорган1чно'1 х!м11 1 нафтох!м11 АН Украши

Захист в!дбудеться 5' тп/> ^<.¿^1994 р, о годин! на

зас1даин! спец1ал1зовано! ради Д 01.16.01 при Укра1нському Державному Ун1верситет1 Харчових ТехнолоПй за адресою: 252017, м. Кул в, вул. Володимирсъка, 68 (ауд. А-311).

•3 дисертац!ею можна ознайомитися у б!бл1отец1 Укра1нського Державного Ун1верситету Харчових Технолог^.

Автореферат роз!сланий "¿3? 1994 р.

Вчений секретар спец1ал1зовано! вчено! ради, кандидат техн!чних наук, доцент

Семенова 0.I.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуадьн1сть теми. Останн1м часом проблема зиеншення св!тових запасов орган1чяо! речовини грунту та його деградацП, щр пов'язана з високов Щ1льн1сты населения, урбан1зац1ега та 1ндустр1ал1зац1бю, набула особливо! гостроти. Одними э прЮритетяих забрудшовач!в нав-колишнього середовица в нафта та нафтопродукти. ЕИдомо, що забруд-нення грунту та водоймищ нафтоп дуже вросло за декхлька останн1х ро-к!в. К1льк1сть викидхв нафти до навколишнього середовища в св1т1 зараз досягаб б ООО ООО т за р!к. Попадания !х до грунту в1дбувавтъся п!д час фонтанування нафтосвердловин, порушень при очищенн! бурових свердловин, аварпших викид1в у сховицах та резервуарах з мазутом 1 нефтепродуктами, а такод при пошкодженнях в трубопроводах. Присут-н!сть нафти та нафтопродукПв викликав спов1льнення розвитку, а при великих концентрац!ях - загибель живих орган1зм1в грунту.

Забруднення нафтога та нафтопродуктыж грунту обумовлюв необх!д-н1сть 1х оздоровления, тобто створення ефективно! та економ1чно ви-г1дно! технологи його очищения.

Мета 1 задач! доедгдження. Метоп досл!дження буди наукове обг-рунтування та розробка технологи отримання б1опрепарату для очищения грунПв, вабруднених вуглеводнями нафти.

Поставлена мета передбачала р!иепня сл!дуючих завдань:

- виб1р ыжроорган!зма-деструктора лк основи б!опрепарату для очищения нафтозабруднених груяНв;

- одернання б!одеградуших поверхнево-активних речовин (б!оПАР), як1 мають емульгуюч! та п1ноутворшоч1 властивост!;

- п!д01р адсорбенту для м!кробного компоненту та б1оПАР;

- досл1дження ефектиЕност! та властивостей б!опрепарату в лабораториях умовах;

- випробування б!опрепарату в польових умовах;

- розробка рекоыендац1й для виробництва та эастосування С1опрепара-ту.

Наукова новизна. Показана доц1льн1оть застосування для очищения грунту в1д х!ы1чних забрудкювач1в складних по ксмгааиц1шгому складу б!опрепарат1в, та розроблен1 науков1 основи створення таких кшпози-ц!й.

Зд1йснено пошук м1кроорган1зм1в-деструктор1в нафти, в1д!брано активний штам,. вивчен! його морфо-ф!з1олог1чн1, 61ох1м1чн1 власти-вост!, та проведен! його медико-б1олог!чн1 випробувшшя.

Запропоновано нову С1одеградуючу поверхнево-активну речовину, яка мае еиульгуюч! i П1Ноутворюш1 властивост1 га одночаоно в пожив-нов основою для роавитку MiKpoopraHiBMiB.

Запропоновано новий ноо!й для м!пробного компоненту та бЮПАР.

На аахиот виносяться так1 науков! положения:

- для очищения грунту Bifl вуглеводн!в нафти в доц1лыпм викориотання скдадних по композиц!иному складу б!опрепарат1в, що м!отять ы!кроб-ний компонент i 6ioHAP, адсорбован! на носП;

- як ы!кробний компонент öionpenapaiy можуть Сути викориотан! бак-•repii роду Bacillus, щр най01льш oxiÜKl до зм1ни умов навколишнього середовища;

- як ноо1й для какробного компоненту та б1оПАР у склад1 б!.опрепарату для очищения аабрудненого грунту доц1льно використовувати перл!т, який покращуе структуру грунту, регулюв його волог1сть та нешк1дли-вии для навколишнього середовишд;

- розроблений на основ! теоретичних та експерименгалышх досл!дженъ flionpenapai може бути викориотаний для очищения грунту в1д вугле-водн!в нафти.

Практична ц1шаотъ роботи обумовлена тш, щр отриман! CioHAP в ы1кробно! та росдинно! сировини, призначен! для викориотання в б!о-дог1чиому очищены! вабруднених rpyHiia. Створено б!опрепарат "Лео-тан" для очищения нафтовабруднених грунт!в, який складазгъся в в1-д!браного у результат! скрин!нгу активного деструктору вуглвводн1в нафти штама Bacillus megaterium 1BD, отриыаного еколог1чно-нешк1дли-вого 6ioIIAP BS-4 та ноо1я перл!ту. Встановлено, щр викориотання биопрепарату "Леотан" у вигляд! б!оп!ни для очищения грунту, вабрудна-ного нафтою, доэволяв вИлыпити отуп1нь деструкцП вуглеводн!в нафти в 3.4 раги, пор!вняно г простим эрошенням грунту бактер1йнов суспен-sien. Встановлено, що вастосуваяня "Лестану" для обробки р!вних грунт1в у вигляд! пульпи дозволило досягнути ступ1ю> очищения 91-95Z при середн1й швидкост! деградац!! нафти - 69-72 мг/л га добу, щр пе-ревкцувало у 7.5-8.0 pasie реаультати, огриман! бев викориотання б!-опрепарагу. Можливе С!олог1Чне очищения еабруднено! нафтопродуктами води га допомогов "Лестану", при цьому ступ1нь деградацП нафти досягав во та 87Х за 30 д16 для nplcHOi та ыорсько? води, в1дпов1дао. Встановлено, щр викориотання "Лестану" для б!оочищення оильновабруд-неного нафтою грунту, дозволило БбШшити стуШнь очищения грунту у 2.3 рази, пор!вняно а деградац!бв нафти в природних умовак м!крофло-

рою грунту.

Апробац1я робота. Матер1ааи диоертацП допов1дались на Респуб-л!канськ1й науково-техн1чн1й конференцП "Разработка и внедрение высокоэффективных ресурсосберегающих технологий, оборудования и новых видов пищевых продуктов в пищевой и перерабатывающей отрасли АПК" (Киев, 1991); М1жнародному cmmoeiyMi "Soil decontamination using: biological processes" (Франкфурт на Matoi, Имеччина, 1992); I З'!э-д1 Укра'1нського М1кроб1одог1чного товариства (Одеса, 1993). По результатам досл1джень опубликовано 3 друкован! прац! та 5 статтей подан! до друку.

Структура та обсяг робота. MaTepian дисергац1йно! роботи викла-дено в 7 роздхлах та склад аеться а вступу, огляду лхтератури, мате-р!ал!в та метод1з досл1джень, результатов та 1х обговорення, виснов-KiB, додаттв. Робота викладена на 153 сторшках, BMimys 27 таблиць та 20 ыалюнтв. Список л1тератури включав 188 найменувань, включаючи 98 Л1тературких джерел. заруб1жних автор1в. Додаток м!стить копП до-кумент!в, шр пгдтверджують практичне використання результат!в прац1.

Матер1ааи i методи досл!дження.

Сб'екти. В ро0от1 використаш. 1Ü3 штамп OaKTepifi роду Bacillus видхв в. Radius, В. cereus, В. circulars, В. coagulans, В. licheniformis, В. mzcerans, В. megaterim, В. polymyxa, В. pumilus, В. species, В. sphaericus, В. subtilis з колекцП в1,щйлу ан-Tn6iOTHKiB 1иституту м1кро51ологГх та Bipycojorix iM. Д. К. Заболот-ного АН Укра1ни. Головним об'ектом досл1джень був штам Bacillus megaterium 1BD, BigiCpamrii сп1вроб1тшкй!,я в1дд!лу технологи бхосинтеэу 1MB АН '/крайни а асощацП MiKpoopraHiaMiB, якг утилхзу-ють вуглеводн! нафти. Асоц1ац1я MiKpoopraHiEMiB була вид1лена з грунту на територП п1дпривмств газово1 та нафтопереробно'1 промисло-BocTi. Використовувалися також др1ждла Candida tropicalis К41 з колекцП 1MB АН Укра1ни.

Середовидр для культивування. БактерП роду Bacillus п1д чао експерименталъного скргапнгу вирощували на моральному середовищ1, яке мостить, г/л: сиру нафту - 2.8: Ш4Ш3 - 1.0; MgCl2 - 0.1; КН2РО4 - 3.0; К2НРО4 - 7.0; СаСОз - 1.0. Вивчення спектру утшиаацП вуглеводнхв культурою В. megaterium 1В0 проаодилося на описаному м1-неральному середовшц, яке в1др1зня£ося emictom вуглеводн1в. У екс-першент1 використано: гексадекан, толуол, бензол, нафтал1н, бензин, керосин i асфальтени в концентрацП 8 г/л. Вивчення динаьйки росту В. megaterium 1BD проводилося на минеральному середовиц1, яке Micra-ло IX глюкози, H-napamiHiB, дизельного палива, або сиро'1 нафти. Др1ждж1 Candida tropicalis К41 культивували на середовищ1 Р1ддер.

Способи культивування. Перюдичне вирошування бактер1й та др!ждж1в проводили в колбах на качалках (240 об/хв) при 30°С. Eiома-су Сактер1и, приэначену для створення б1опрепарату, отримували пер1одичним культивуванням в дабораторних ферментерах АНКУМ-2М з ро-бочим об'вмом 5 л або в щлотному ферментер! Б-1 з робочим' об'емом 70 л при 25-30°С, перем!шуванн1 800 об/хв.

М1кро61одог1чн1 методи доод1джеш>. К1.чьк1сть спор при первичному культивуваши и. megaterium 1BU вивначали еис!еом культурально! р1дини, що була попередньо ^нкубована при 70-75°С протягом 30 хв, на тверд! лшвидьн! середоЕкцз, i подальвшм п!драхунком колон хйс (Смирнов та iH., 1S83).

0бл1к к1лъкоот! кл1Т1ш В. megaterium 1BD в rpyHTi на доопдних д!лянках проводився по методу ЗЕЯПнцева Д.Г., при цьому грунтова оуспенз!я гидлягаяа обробц! на ультразвуковой установи УЗДН-1 протягом 3 хвилин при величши струму 0.4 А та частот! коливань 22 кГц.

Аналхэ 6ioi.iaoH. Концентрадш б1оыаси визначали ваговим методом (Перт, l9Vti). Для цього кулыуральну р1дину центрифугували, трич1 в1дш!вали та висушували до nocTiifflo'i ваги при 105°С. Оптичну 1д1льн1сть бактер1йно1 суспензП визначали на фотоелектроколориметр1 ФЭК-56 U в кювет1 з доежшгою оптичного шляху 3 мм при довжшп XBiini 540 тл.

<Ехзико-х1м1чн1 -методи доол1джень. В po6oTi визначалися головн1 характеристики носив, такг як насипна густина, posMip зерен, водо-поглинання, водоввдача, нафтопоглшальна MicTKicTb (ГОСТ 10832-83; ТУ 39-1473-90). М1кроструктура перл1ту i сорбенту "Жемчуг" та роз-мщення на 1х поверхн1 кл!тин 8. megaterium 1BD вивчалися за допомо-гою електронно! скануючо! м1кроскоп11.

EioHAP BS-4 i M-l досл1джували по х!м1чному складу: волоПсть визначали висушуванням до пост1ино'1 маси; аолыпсть - спалюванням в муфельн!й ni44i; загальний азот - методом К'едьдалю; азот ам1Нокис-лот - методом Попа та Ст1венса; BMicr неорганичного фосфору - методом {Иске 1 Субарова; калхй - методом ewiciifflo'i полуменево! фотомет-pi'i на анал1затор! р1дини ПАЖ-2 (Фертман та iH., 1975; Новаковская та 1н., 1980). Вм1ст цукру у меля с i та CioIIAP М-1 визначали на сахариметр!; сух! речовини - на рефрактометр!; редукован1 речовини -ебул1оскоп!чним методом; коло1дн1 речовини - методом Думанського А.А. та XapiHa С.Е. (силин та iH., 1977). Б!одеградування ПАР визна-чалося прискореним методом (ХПК), методом розведення (ВПК) та овдню-вадося по oniBBiAHomenHD БПКб/ХПК, шр виражалося в процентах (Лурье, 1984). Ам1нокислотний склад BS-4 вив чади на ам1нокислотному аналгза-TOpi AAA-339 (ЧРСР).

Були вивчен! сл!дуюч! поверхнево-активн1 властивосП бхоПАР: поверхневий натяг - методом В!льгельм1 (Измайлова та iH.); п1ноутво-рвюча эдатн1сть - методом Рос-Майлса (Тихомиров, 1983); емульгуюча здатнЮта - методом Cooper та Goldenberg (Cooper et al., 1987); в1д-мивання п1ску в!д нефти методом Qutnick (Qutnick et al., 1987). MiK-pocKoniDEaHHfl та фотографугання емульсИ сиро! нафти, утворено! га допомогою 610ПАР BS-4, зд!иснюваяося по методщ!, запропонован!й Аб-рамзоном А.А.

Випробування б!опрепарату. Дослхдження ефективност! эастосуван-ня б!опрепарату у вигляд! Oionimi проводилися на грунтових колонах э сугл1шистим грунтом, эабрудненим сироп нафтою. Процес очищения грунту эд1йснювався при К!мнатн1й температур! пер1одичним перем!шуванням грунту та нанесениям на II поверхню препарату у вигляд1 б1оп!ни протягом шести TWRHiB. Можлив1сть використанкя "Лестану" для обробки грунту у вигляд! пуль пи вивчали на качалках в колбах Шотта, при цьому склад пульпи був сл1дуючим г/л: грунт - 333, препарат "Лестан" -33, сира нафта - 0.67, дизедьне паливо - 1.98, NH4NO3 - 0.1, MgClg-0.01, КН2РО4 - 0.1. Процес очищения видбувався впродовж'35 дн!в при 30°С.

Випробування препарату в польових умовах в!дбувалося «а забруд-нених нафтол д!дянках суп!щаного грунту. Б!олог!чна обробка тривала ш!оть перших тижн1в , при цьому д!ляпка 1 зрошувалася бактер1йною оуспенз!ею В. megaterium 1BD; на поверхш» д!лянки 2 наносився 6ion-репарат "Леотан" в сухому вигляд! ( по 117 г на 1 м2 поверхн!); д1-

лянка 3 не оброблялася (контроль). На 10м2 nosepxni грунту кожну об-робку наносилося по 1.7Х1011 ± 1.1хЮу живих шйтин В. megaterium 1BD.

Анад1з вмЮту вуглеводШз. Виэначення млькост! вуглеводн!в в пробах грунту, води та культурально! pifiiom проводилося за допомогою 1нфрзчервоно1 спектрофотометр!! на анал!затор1 нафтопродукпв АН-1. Екстрагуваяня вугдеводн1в зд1йснювалося чотирихлористим вуглецем при к1мкатн!й темлератур!. При вивчеий утм1аац11 н-алкан1в використо-вували метод гагор1ди1шо! хроматограф! i. Екстрактл анал!зували иа газсрХдинному хроматограф! Chrom-Ъ, який м1стив колонку 3 м х 3 ш о полуменевим !он1зуючим детектором (iiociii - хроматон N-super, 0.160-0.200 мм SZ SE-30 на хроматон!). Як рухливз фаза Оув викорис-таний гел!й, нитрата газу - 30 мм/хв. Температура эб!льшувалася в1д 100°С до 230°С 3i швидк1стю 3°С за хвилину, теотература випарника була 240°С.

Математична обробка резудьтат!в повного факторного експерименту та статштична ойроЬка дашк проводуишся на 1ВМ-сум!сно!лу комп'юте-pi. Результата, щр подан! градцчно, були оброблен! на комп'ютер! па допомогою программ Grapher Bepci'i 1.75 ф1рми Golden Software, Inc. Еункц1ональн1 задежност! подан! у вигляд! пол1ном1в 2-4 ступен1, експонент та з допомого» куб!чного згладжуваяня.

Результати та "ix обговорення.

Головним компонентом б1опрепарату для очищения нафтозабруднених rpyHTiB в спец!аино вгд!бран1 м1кроорган!зми, цо адатаi васвоювати вуглеводн! нафти як едине джерело вуглецв та eHeprii. При пошуку ^кробного компоненту необх!дно враховувати, що в!д1бран! MiKpoopra-н!зш мають в1дпов1дати сл!дупчим вкмоггм:

- мати здатн1сть до активно! деструкцП вуглеводн1в нафти;

- бути типовими мешканцями грунту;

- не мати патогенност!;

- належати до аеробнкх або фа1сультативно-апаеробних MiKpoop-ган1зм1в;

- волод1ти здатп!стю переносити д!1 несприятливих б1отичних та аб!отичних фактор1в.

3 урахуванням цпх вимог були проведен! теоретичний та експерн-«ептальний скрин!нги м1кробного компоненту серед в1домих бакте-э1й-деструктор!в вуглеЕоднгв нафти. Анал!э л1тературн показав, щр je! BiflOMi бактерИ-деструктори належать до аеробних та факультатив-ю-алаеробних м-кроорган!эм!в. 3 них найб!льп типовими мешканцями 'рунту б бактерИ род1в Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacter, licrococcus, Nocardla i Achromobacter. Серед в!домих м!кроорган1эм1в юобливий 1нтерес викликають опороутворооч! аеробн! бактерП роду Bacillus, тому що вони характеризуються ст1йк!стп до несприятливих 'мов навколишнього середовища, високои життвздатн!стю та належать до

L-схратвгХв.

В вв'явку з цод, екопериыенталъний скрин!нг проводився серед бактер!й роду Bacillus. Biflöip проводили по сл!дупчим покааникам: накопичення б!омаси, емулъгування нафти та II споживання п!д чао росту MiKpoopraHisMiB на ы1неральному середовищ! в IX нафти як единого джерела вуглещ) га 15 д!б. Серед 103 штам!в бактер1й вид1лили дев'ять активних деструктор1в: В. subtilis BS, В, subtilis Dl,В. subtilis М, В. subUlis HID, В. subtilis 77ПК, В. species S4B, В. species 13Б, В. megaterium 1BD, В. licheniformis CIP5329 (Табл. t). Для подалыпих досл1джень Сув в1дЮраний штаы Bacillus megaterium 1BD.

Таблиця 1

Споживання Еугдеводн1в нафти найб1льш активними м1крооргая1змами-деструкторами роду Bacillus

N п/п М1кроорган1гм Концентрац1я вуглеводн1в через 15 д!б, мг/л Ступ1нь деструкцП, 7.

1 В. licheniformis

CIP 5329 1050 ± 89 54.3

2 В. megaterium 1BD 600 ± 49 73.9

3 В. species 24В 1700 ± 101 26.1

4 В. species 13В 700 ± 53 69.6

Б В. subtilis В2 1650 ± 96 28.3

6 В. subtilis Dl 575 ± 61 75.0

7 В. subtilis Ш> 750 ± 48 67.4

8 В. subtilis HID 1300 ± 84 43.5

9 В. subtilis 77DK 1800 ± 97 21.7

"Початковий вм1ст вуглеводн!в - 2300 ± 54 мг/л.

Штаы В. г^еаЬег1ит 1Вй характеризуемся широким спектром утил!аацП вуглеводн1в нафти (Мал. 1). Найкращий р1ст культура був гафхксований на середовипЦ. а насиченш вуглеводнем нормально! будови - гексадеканом, хороший р!ст - на середовипэх з ароматичними вугле-воднями, бензолом та толуолом. Спостерхгався також розвиток бактер1й на середовмцах г пол1цикл1чними (нафталан, асфальтени) вуглеводнями, як!, як правило, важно руйнуються м!кроорган1змами.

8 метоо вивчення ф1зиолог!чних характеристик В. megateгlum 1В0 проводили пер!одкчне культивування на мХнеральних середовищах а р1зшши джерелами вуглецевого живлення: глюкозою, н-параф!нами, дизелышм паливом 1 сирою нафтою. встановлено, що штам характеризуй

На<ртвл1н

Бевзив

Асфальте ни

Керосин

Бензол

Толуол

Гексадекап

Оптичпа щиьлить) оЭ 01Д

Мал. 1. РЮт В. те?аЬег1ит 1В0 на середовщах э р18ними вуглеводнями

еться найб1лыпиш питомою швидк1стп росту (0.058 год-1) 1 еко-ном!чнш коефЩ!битом (1.099 г/г) при кулътивуватЦ на середовищ! з н-параф1нами. Штам маз такой эдатн1сть до утворення емульгатору наф-ти, який вид1лябться в культуральну радину. Встановлено, що 1ндеко емульгування кудьтуралько! рхдики при ам1шуванн1 и з н-параф1наш (1:1) становив 421. Шд час пер1одичного культивування В. твраЬепит 1В0 спостер1гавться спороутворення, щр сприяе п1двищенно хиттвздат-поот1 бактер!й в природних умовах. Медкко-б1олог1чн1 досл1дження культури показали, щр вона б нетоксичною та пепатогенною. .

Узагалыгаючи результата досипджекь культури В. ое£аЬег1ит 1В0, ыожна зробити висновок про И непатогешИсть, здхбноот1 до утил18ац11 широкого спекру вуглеводн1в та до утворепкя б!оемульгато-ра. Таким чином, в!д1браний нами штам в1дпов1дае вишгам, як! псю-

0.5

1.5

2.5 3 3.5 4

1

О

тавлен1 до м1кробних компонент1в бд.одрепарат1в для очищения грунту в!д забрудненъ.

До складу биопрепарату для очищения грунту в доцхльним вводити поверхнево-активн! речовшш, як1 мояуть содюб1л!зуЕати вугдеводн1, вб!льшуючи IX б1олог1чиу достутйстъ, бути джерелом псашвних речовин для Ы1кроорган1зм1в-деструктор1в та повинн! руйнуватися природними м1кроорган1вмаш1. При розробщ технолог!! отримання 61оПАР, доц1льно використовувати як вих!дну сировину р1вн1 всходи хврчово! та мжро-61олоПчно1 проыисловостей. Тому для отримання 61оПАР були викорио-таи! М1кро0на та рослинна сировина.

БхоПАР, яку ми.умовно назвали ВЗ-4, була отршана за допомогою лужного г1дрод1зу активного мулу. 3 метою отримання ПАР э високою п1ноутворюючоа властиз1стю, було проведено ыатеыатичне планування експеримеиту а використанням матриц! ротатабедьного центрального композиц!иного плану та оптим!зац!в лужного г!дрол!зу за допомогоа методу крутого сходження (Максимов, 1380) (Табл. 2). Перев1рка зна-чущост! коеф!Ц1ЁИт1в р1вняння регресП показала, що процес лузшого г1дрол1зу активного мулу описувться р!внянням:

у - 12.7 - 2.6x1 - 1.5x3 - 1.9x1x3 , де Ха-20 годин.

Таблиця 2 Р1вн1 вар!ювання фактор1в

Фактори Кодове позна-чення х —1.682 (э!рчат! крепки) X —1 (шнш!й р!веш>) х - 0 (основний р!вень) х -+1 (верхи!й рхвень) х -+1.682 (з1рчат! крадкп)

Температура, °С XI 12 24 42 60 72

Трива-л!сть г!дрол!ау год х2 4 20 44 68 84

Концентра Щя КОН, % Хз 0 2 11 20 26

Було визначено оптиыалън! умови лузшого г1дрол1зу: температура - 21 - 28°С; тривалЮть г!дрол1ву - 20 годин та концентрац!я лугу КОН -5-72.

1шшл дяерелом природних ПАР, таких як аы1шжиодоти, б!лки,

пектинов! речовини та сапол!ни, б меляса. Вид1лення 01оПАР в меляс-ного розчину проводилбся за допомогоп флотацП. Отриману СЮПАР назвали М-1.

В зв'яэку з тим, що важливою характеристикою будь-яко! ПАР в II б1одеград1йн1сть, буди вивначен! БПК та ХПК для б!оПАР М-1 1 ВЗ-4 (Табл. 3). Результата досл!дженъ показали, що бхоПАР в б!олог1чно м'якими, тобто вони безпечн! для навколишнього середовища.

Таблиця 3

Ступ!нь придатност! ПАР для б!одеградацП

ПАР ХПК, мг 02 /г БПК5 , МГ 02 /г БПКз^/ХПК,

б!оПАР ВЗ-4 6ЮПАР М-1 183 ± 1.6 517 + 2.3 72 ± 2.2 . 223 ± 5.1 33 44

Обидв! б!оПАР в добрими субстратами для росту мжроорган1зм1в, в тому чиоп 1 для В. тезаЬегшш 1В0 (Мал. 2). Встановлено, що ВЗ-4 в джерелом азотного, фосфорного, кал!йного живлення 1 мжроеле-мент1в. М-1 м!стить в соб! м1кроелементи та вуглецэв1 сполуки, в тому числ1 сахарозу. Але перевага для використання в склад1 биопрепарату була в!ддана б1оПАР м1кробного походження ВЗ-4, яка здатна до Шноутворення, емульгування вуглеводн1в та в1дмивання п1ску в!д наф-ти. Одною з головних причин такого вибору було те, що б1оПАР з рос-линно1 сировини М-1 м1стить в значн1й 1«1лькост1 джерело вуглецевого живлення, сахарозу, 1 отримузться з меляси, яка в продуктом харчово! вартост!.

Слз.дуючим етапом розробки б!опрепарату був п!дб1р адсорбенту для м1кробного компоненту та С1оПАР. Шд час б!олоПчного очищения грунту м1кробний компонент б1спрепарат1в вступав до коккуренцИ з природною м1крофлорою грунту, 3 метою утворения переважних умов для розвитку м1кроорга!изма-деструктора в можливим викоркстовувати його попередкю ^шобШгацш на рхзних нос1ях. НеоСх1дн1сть в аммоб1л1за-цП таком обумовлена тим, що головн1 перетворення речозин в грунт! проводяться адсорбованими та адгезованими кл1тинами. При використан-н! м1кроорган1зм1в для очищения грунту практичний Стерео вишшкав метод адсорбц1йно1 1ммобз.л!зац!1, тому щр його характеризуе менша варт!сть та простота технолог! 1. При е'ибор! шшшого адсорбенту

Мал. 2. Р1ст култри 3. тедс^егЬт 18Э на середовшцах з бЬиАР: А - середовище з б!оПАР М-1; 2, 3, 4 - конценграпИ М-1: 2.5, 5, 7.5 г/л; Б — середовище з бЬПАР В5-4; 2, 3, 4, 5 - концентрацИ ББ-А: 2, 2.5, 5, 10 г/л; 1 - р!ст на минеральному середоэищ! (контроль).

треба иати на уваз!, щр нос!й не повинен бути сторонам для грунтового середовища та еколог1чно Сезпечним. Це одних важливим критер!би вибору в такол варт!сть ноо1я.

Для 1шоб!л1аац11 гел1тин В. пераЬеггил 1В0 були випробован1 таге! носП, як активоване вугглля, п!сок, перл!т ! сорбент "Кемчуг". Отриман! результати досл!джень показали, що на пуг1лл1, п!ску, пер-л!т! та сорбент! "Жемчуг" сорбувться вгд 67 до 98Х кл!т:ш. Але найк-ралЦ показники водопоглинання та водов!ддач1, що дуже важливо для жлттвдгялыюст! сорбованих бактер1й, маз перл1т, який тому був в!-д1браний як пос1й для м!кробного компоненту б1опрепарату. Цей ноо1Й в безпечниы для навкодишнього середовища, мае властюисть пол1пшува-ти структуру грунту та регулювати його волог1оть, добре адсорбув кл1тини В. ше^аЬег&м 1ВП та характеризуемся невеликою варт!стю.

Таким чином, в результат! проведение досл1джекь був створений б!опрепарат для очищения грунт1в, забруднених вуглеводнями нафти, якому ми надали назву "Лестан". Препарат складаеться з ы1кро6ного кошоненту В. те£айег1ит 1ВО, 6ЮПАР ВБ-4 та кос!я перл!ту.

В лабораторних умовах бул!1 вивчен! два исшив их способи засто-суваяня б!опрепарату: у вигляд! б!оп!ни та в сухому вигляд!. Випро-бування показали, щр використання б!опрепарату у в иг ляд! б!оп!ни дозволяв зб1лы11ити ступ!нь деструкцП вуглеводн1в нафти в 3.4 рази, пор!вняно з простш зроиенням грунту бактер!альноя суспенз!ев. Зас-тосування "Лестану" для обробки р!зних грунт!в у вигляд! пульпи доз-еолило досягнути ступен1 очищения 91-95Х при середн!й швидкост! дег-радацП нафти - 69-72 мг/л за добу, що перевшдув результати, отрима-н1 без використання б!опрепарату.

Однак лабораторн! дан! недостатн! для остаточно! оц!нки ефеге-тивност! ровробленого б1опрепарату, тому що при попадала! до грунто-вих екосиотем, м!кроорган!зми п1дпадають п1д вплив аб1огенних та б1огенних фактор1в, як1 немешшво повн!стю урахувати в лабораторних досшдах. У эв'яэку 8 цим, ми провели р!чн! польов! досиидження бЮпрепарату "Лестан".

Польовий експеримент моделював авар!йнии розлив нафти. Через 3 дн1 теля нафтового розливу була почата б1олог1чна обробка грунту, яка в!дбувалася впродовж ш!сти перших тиюйв ( один раз на тиждень), при цьому д!лянка N 1 зрошувалася бактер1альною суспенз!еп В. тераЬеПит на поверхню д!дянки N 2 наносився О!опрепарат "Лео-тан" в сухому вигляд! та д!лянка N 3 не оброблялась (контроль). Шд

ПоЬерхня Гли5ива3 ом ПдиНиоа 10 ом ГлиБина 16 см Гли5ива 20 см

14 34 58Зила 0 48 60 90 ТриЬалкгть оБробки, ôi5

ПоЬерхня ГлиБина3 см Глибива 10 сл ГлиБина 16 см Глибива 20 см

14 34 50 Зила 0 48 60 00 ТриЬал1сть öS робки, diS

По&ерхпя Глибипо 3 см ГлиБиаа 10 ел ГлиБина 16 сд ГлиЗипа 20 см

0 14 34 50 Зила 0 48 80 00 Три6ал1сть oSpoSicu. 8i5

Мал. S. Динан1ка зм1ни к1лькост1 вуглеводн!в в грунт!

досл!дши д1лянои: А - д!лянка 1; В - д!лянка 2; В - д!ляика 3; ВВ - вуглеводн!. "

чао очищения проводилось також пер1одичне п1дпушування грунту та поливания д1лянок 1 1 2 з метою його аерування та п1дтримування воло-гост1 61ля 15%.

Результата показали, цо перш1 14 д1б вадбувалося р!зке зменшен-ня концентрацП вуглеводн1в на контрольна дйшнц! та д1лянц1 N 2, що св1дчить про м1грац1ю 1 виларовування низькомолекулярних складо-вих сиро! нафти. Процес м1кробно! деструкцИ вуглеводн1в в!дбувався на протяз! 14-34 дхб в1д початку очищения та характеризувався се-редньою швидк1стю в 3 та 4 рази б1лыаою для досл1д1в з використанням бактер!алыю1 суспензИ 1 "Лестану", в1дпов1дно, пор!вняно з результатами природного самоочищения грунту в контрол1 (Мал. 3, 4; Табл. 4). Досл1д продовжувався дал1 в друПй половин! вересня, але процеси м1кробно! деструкцИ спов1льнились, щр пояснюеться зниженням темпе-ратури навколидшього середовища.

Таблиця 4

Характеристики процес1в деструкцИ вуглеводн1в в забрудненому нафтою грунИ на досл1дних польових д!лянках

Д1лянка Середня швидк1сть деструкцИ, мг/кг сухого грунту за добу Пер1од п1в-розпаду дн1в Максимальна стутнь оч1щення, % Р1ВНЯННЯ, що описуе експоненц1альну фазу деструкцП

Млянка N1 (обробка бактер. су-спенз1ею) перЮд 14-34 дн1 (серпень-вересень 1992 року)

351.1 30 35.1 У-ЕХР(-0.0233349 Х)х х26.1002

Млянка N2 (обробка "Лестанам") 416.3 32 47.5 У-ЕХР(-0.0216225 Х)х хЗЗ.2806

Шлянка N3 (контроль) 105.9 146 30.2 У-ЕХР(-0.00474971 Х)х х24.9871

Д1лянка N1 пер1од 0-48 дн1в (травень-червень 1993 року)

162.8 48 57.2 У-ЕХР("0.0144682 Х)х х15.6043

Д1лянка N2 290.2 33 73.3 У-ЕХР(-0.0210352 Х)х ><21.9154

ДШнка N3 214.1 86 29.0 У-ЕХР(-0.00810693 Х)х Х31.8766

Шсля зиыи був змгряний вм1ст вуглеводн1в нафти в грунП доел!дних дглянок. Результати показали, що всюди в!дбулооя збальшен-ня концентрацП вуглеводтв, щр пояснюеться весняним п1дняттям кап1дярно1 води а нафтою. Дал1 на протяг! 48 дн1в на вс!х досл!дних д1лянках спостерн'алосъ аначне зниження концентрацП вуглеводн1в в

Мал. 4. Динаьака вм1ни середньо! к!лъкост1 вуглеводн!в в грунтовому шар! 0-20 см: БВ - вуглеводн1.

грунт!. На контрольна д!лянц! вм!ст вуглеводн!в вменшився до зна-чень, отриманих восени, при цьому стуШнь очищения була 29*. На д!дянц! N 2 кр1ы процес!в ъйграцП та випаровування компоненйв наф-ти, вхдбувадася бактер1альна дестругаЦя вуглеводн!в, в результат! чого через 48 дн1в стуШнь очищения грунту досягла 73.3%. Процесн б!олог1чного очищения на д1лянц1 N 1 з!дбувалися| б!льа пов1льно та отуп!нь очищения через 48 дн1в Суда 57.25.

Для пер!од!в активно! деструкцП вуглеводн!в нафти в забрудне-ному грунт! були розрахован! так! покаэннгси, як середня швидкЮть деструкц!!, перюд гиврозпаду вуглеводнхв та максимальна сгугпкъ очищения (Табл. 4). 0триман1 реэулыати показуютъ, цо Ц* показники Оули максимальнкми на д1лянц!', де використовувався б1опрепарат "Лео-тан". Для остаточна! оц!нки ефектквност! практичного застосування

б!опрепарату "Лестан", необх!дко пор1вняти ревудьтати б!оочиотки нафтоэабруднених грунг!в, отриманI за допомогою в1домих в св!тов1й практиц! б1опрепарат!в та при викориотанн! "Лестану" (Табл. Б). Очевидно, ср "Лестан" мае ведику активнють, тому щр з його допомогою очищувться дуже сильно еабруднении грунт, при цьому досягавться ви-сока ступ1нь очищения та процео деструкцП характеризуемся найб!лъ-шоп середньою шидк1ств, щр вид!ляе запропонований нами О!опрепарат серед наведених в таблиц!.

При польових досддаеннях б!опрепарату "Лестан" була перев1рена життездатнЮть в природних умовах його м1кробного компоненту В. тв^ег!ит 1В0 (Табу. 6). Шдрахунок к!лькост! життеадатних юитин

Таблица 6

Еиттбздатн1сть В. тераЬегйхя 1В0 в грукт!

Доыйд Грунтовий шар, см К1льк!сть бактер1й (хЮ3 ) в 1 г пов1тряно сухого грунту

ДО ЗИМИ' п!сля вши

БактерП, адсорбован! на грунтово му матрикс! 0-10 10-20 280 ± 1.8 120 ±1.6 13 ± 0.110 1.3 ± 0.007

БактерП у склад! препарату "Лестан" в грунт! 0-10 10 - 20 1100 ± 15.0 10 ± 0.1 5.5 ± 0.007 9.0 ± 0.006

В. шееайег1т 1ВО до 1 п!сля экыового пер!оду на досд!дних дхдянках показав, вр к!дьк!сть бактер!й эменшилася П1сля гида: на д!лянц! N1, де анаходшшся несорбован! на носП багсгерП, в шарах грунту 0-10 см та 10-20 см - в 22 ! 92 рази, в1дпов!дно; на д!лянц1 N2, де викорис-товувадися адсорбован! на перд!Т1 6'актерП, в шарх грунту 0-10 си -в 200 раз!в, але на глибин1 10-20 см бактерП практично повн1отю виляли.

Таким чином, результатом проведение досл!джень е створення б1опрепарату "Лестан" для очищения грунту, забрудненого вугдеводнями нафти, я кий характериаубться вксокои активШстю, безпечний для навколишнього середовища та збер1гае здатнЮть до 0!оочищення в ы!шшвих грунтово-кл!матичних умовах.

На основ! проведения досл!джень розроблен! практичн! рекохеи-

Таблица 5

KopoTKi В1доыост1 про практичне використання в полъових умовах в1домих cnoco6ia б!олог1чного очищения in-situ грунту забрудненого вутлеЕоднями нзфти

Коротка характеристика способу очищения Забруднювач Глибина забруд-нення, си Початкова концентра-ц1я вугле-BOflHÍB, иг/кг сухого грунту К1нцева концентрй-Ц1Я вугле-в0дн1в, иг/кг сухого грунту Трива- л1сть очищения, ДН1В Ступi ш> очищения x Сер.шввдк!-сть деструк цП вуглево-дн1в,мг/КГ сухого грун ту за добу Л1тература

BionpenapaT Nogales Ы(320,розроблении ф1р>йоа Biodetox,\ вастосований у вигляд! QioniHH легк1 мазути 20 8000-9000 700 35 91-92 223 Schüssler, 1986; Неin, 1986

_ н _ ыазут 20 5800 270 35 95 158 . И .

Б1опрепарат з др1ждж1в роду Candida i cyMimi rpeSHíB та вичавк1в винограду сира нафта- 10 200 40 248 80 0.7 А. с.1158258 А СССР

БактерШа суспенз1я Pseudomonas putlda NRRL-B-1B117 i Ps.puti-da NRRL-B-13113 пентахлорфе-нол.диз.па-ливо,крезол, нафта н/в* н/в н/в 42 грунт вiЛЬНИИ в1д наф-ти н/в Пат.ЕПВ К 0270805

BionpenapaT,щр склада-еться э suimasoi м!кр. популяц!I,6ÍOÜAP,пожив. речовин,застосований у вигляд! суспензП для очищения in situ сира нафта 8 185 26 105 86 1.5 Ellis et al., 1990

BionpenapaT "Лестан" сира нафта 20 29929.8 7917.8 34 + 48 73.3 268

* Н/в - не в!дош.

дацП по виробництву та впровадженню б!опрепарату "Лестан". В додат-ку 1 наведен! рекомендацП по виготовленно "Лэстану", яй м1отять принципову технолог1чну схему отримання б!опрепарату та опио стад!й головних технсзлог1чних процес1в (Мал. 5). Схема опособ!в практичного вастосування "Лестану" для бхоочищення in situ нафтозабрудненого грунту демонотрув 3 можливих вар1анти, BiiCip яких залежить в1д характеру i в1д глибини эабруднення та в!д розташування забруднено! област1 грунту по в!дношенню до грунтово! води (Мал. 6).

"Лестан" був використаний для б!оочищення грунту на д1лянц! аварП конденсатопроводу у 8аплав1 ргчки Сула (село Лука Полтавсько! обл.); на територН, вабруднен1н п1чним паливом, в радгосШ "Троян-да" Ки1всько1 облаетi; на берегов1й смуз! та водн!й поверхн1 техн1ч-них ставк1в, аайруднених нефтепродуктами, Гнединц1вського заводу по переробц! газу га стабШаацП нафти.

Висновки

1. Скрин1нг микробного компоненту препарату для 01олог1чного очищения заОруднених нафтою грунт1в показав, щр штам В. megaterlum 1BD в активним деструктором вуглёводн1в нафти, типовим мешканцем грунту, непатогенним та спроможним утшпзувати широкий спектр вугле-водн1в, Екиочаичи н-параф1ни, арсматичн! та пол!цикл1чн1.ароматячн! вуглеводн!.

2. Ефективюм hocIsm м!кробного компоненту б!опрепарату в Шеок перлИовий спучений, я кий добре адсорбув Bacillus masaterium 1BD, покращув структуру грунту та регулюе його волог1сть, нешйдливий для навколишнього середовкща.

3. Розроблен1 нов1 еколоПчно нешк1длив1 6ioHAP BS-4 та М-1, придатн! для використаиня в б1олог1чному очищенн1 нафтозабруднених rpyiiTiB. ОптиыадьнХ умови проведения лужного Пдахтзу Шкробио! б!омаси з иетою отримання юноутворушого 6ioHAP BS-4: температура 21-28°С, тривап1сть - 20 годин, концентрация КОН 5-7Х.

4. BioHAF BS-4 та М-1 здатн! знижувати поверхневий натяг, е cl-ноутворшачами, належать до б!олог1чно м'яких ПАР. БЮПАР BS-4 ха-

ужасс&с?

Mai. 5. Принципова техиодог1чна схема отримазшя бз.опрепарату "Лестан": 1-чиста культура, 2-вегетативнии пос1вний матер!ал в колбах, 3-пос1вний апарат. 4-зм1шувач для приготування покивного середовишд, 5-36ip-шк н-парафШв, 6-фд.лир в1дпрацьованого повхтря, 7-вдивз-Дуальний Щльтр, 8-головний фпгьтр, 9-фермен-тер, 10-гмашувач для приготування поживного середовища, 11-гр1юча колона, 12-витримувач, 13-теплообмгнник, 14-зб1рник перл1ту, 15-зб1рник нейтрал1зату, 16-в1дст1йник, 17-нейтрал!затор, 18-гб1рник ортсфосфорно1 кислоти, 19-г1дрол1з-апарат, 20-зб1рвик лугу, 21-зб1рник шламу, 22-зм1шувач, 23-сушарка бараСанна, 24-шнэк для византаження сухого продукту, 25-насос.

К!аа. 6. Схема мсишших способ!в практичного викориогшгая бЮпрепара-ту "Лестан" для б!оочщешш in situ нафтозабрудненого грунту: А - обробка б1опеною; Б - обробка "Лестаном" в сухому вигляд1 а п1дпушуванням грунту та врошенням його водою; В -процео б1ообробки 8 використашшм колодяа!в та траншей; 1 -вона вабруднеиого грунту; 2 - незабруднений грунт; 3 - водо-носний шар грунту; 4 - грунтов! води; 5 - 01оочицення в б1ореактор1.

рактеризуетъся також вдатнЮтю до емульгування вуглеводн!в 1 в1дми-вання п1ску в!д нафти. ОСидв! 6ЮПАР в добримя субстратами для росту л1кроорган1зм!в-деструктор1в нафтових забруднень.

5. В результат! проведенпх досл!джень розроблен! наукове обг-рунтування та технолог!я отримання б!опрепарату "Лестан" для очищения грунт!в, забруднених вуглеводнями нафти. BionpenapaT "Лестан" жшэдавться о м!кробного компоненту Bacillus msgaterium 1BD, öioIIAP 3S-4 i Hocin п!ску перл!тового спученого. БЮпрепарат характеризуйся CTlüKioTD до зм!ни умов навколишнього середовища та до екстре-¿альних температур.

6. Б!опрепарат "Лестан", використаний в лабораториях умовах у зигляд! б!оп!ни, дозволяв зб1льшити ciyniHb деструкцП вуглеводн!в ифти в 3.4 рази, пор!вняко а простим зрошеяням грунту бактер!йною зуспенз!ею. Вккористання "Лестану" для.обробки р1зних грунт!в у виг-пяд! пульпи дозволяв досягти ступен! очищеняя 91-95Z при середн!й авидкост! деградацП нафти 69-72 мг/л за добу, що перевищув в Л5-В.0 раэ1в результата, отриман! без використання б!опрепарату.

7. Б!опрепарат "Лестан", застосований в польових умовах, харак-серизуеться вксокою активнЮто при його використанн! для очищения зильнозабрудненого нафтою грунту. Ступ!нь очищения грунту,. обробле-юго б!опрепаратом "Лестан", становить 73.ЗХ, щр на 44.ЗХ перевииуз тезультати природного самоочищения забрудненого грунту.

На тему дисертац!! опубл!ковая1 сл1дуюч! робота :

1. Стабникова Е.В., Московчеико М.В. Получение биологических ПАВ // Разработка и внедрение высокоэффективных ресурсосберегающих технологий, оборудования н новых видов.пищевых продуктов , в пищевой и перерабатывающей отрасли АПК: Тез. докл. Республ. научно-тех. ионф. 24-26 сентября 1991 г.- Киев, 1991.- С. 111.

2. Ktoscovchenko M.V., Stabnikova H.Y. Application of biosurfactants to bioremediatlon of contaminated soil // Soil decontamination

usine biological processes: Preprints of International Symposium B-9 December 1992.- Karlsruhe/Qeraany, 1992.- P. 359-365.

3. Московченко M.В., Стабникова Е.В., Иванов В.H., Панежда И.А. Использование биогенных поверхностно-активных веществ в микробиологической очистка почвы от углеводородов нефти // Микроб.журнал.- 1993.- 55, Ml.- С. 76-78.

4. Московченко М.В., Стабникова Е.В., Иванов В.Н. Оптимизация процесса гидролиза микробной биомассы с целью получения биогенного пеносбраэущего вещеотва // Пищевая промшленность.- 1994.- в печати.

5. Московченко Ы.В., Стабникова Е.В., Москаленко Н.В. Химический состав поверхностно-активных веществ // Микробирл. «урн.- 1934.в печати.

6. Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Дульгеров А.Н. Скрининг микробного компонента препарата для очистки нефтезагрязненных почв // Тез. докл. 1 3'1вду Укр. ы!кроб1ол. товариства 13-18 вересня 1993 р. / Шкробиол. журн.- 1994.- в печати.