Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Наследование стерильности при комбинированном действии хемостерилянтов и высокой температуры на мельничную огневку Ephestia kuehniella

ВАК РФ 03.00.09, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Наследование стерильности при комбинированном действии хемостерилянтов и высокой температуры на мельничную огневку Ephestia kuehniella"



^Р На правах рукописи

\ ШЕВЧЕНКО Александр Олегович

НАСЛЕДОВАНИЕ СТЕРИЛЬНОСТИ ПРИ КОМБИНИРОВАННОМ ДЕЙСТВИИ ХЕМОСТЕРИЛЯНТОВ И ВЫСОКОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ НА МЕЛЬНИЧНУЮ ОГНЕВКУ ЕРНЕЭШ КиЕНШЕНА.

Специальность: 03.00.09 - энтомология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург, 1998 г.

Работа выполнена в Донецком государственном университете

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Усова З.В., доктор биологических наук Анисимов А.И.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Булыгинская М.А., кандидат биологических наук Бондаренко Л.В.

Ведущая организация: Биологический научно-исследовател! ский институт Санкт-Петербургского государственного униве[ ситета.

Защита диссертации состоится 19 ноября 1998 г. в^ часов на заседании диссертационного совета Д 020.01.01 пр Всероссийском научно-исследовательском институте защит растений РАСХН по адресу: 189620, Санкт-Петербург-Пушки! 6, шоссе Подбельского, д.З.

С диссертационной работой можно ознакомиться библиотеке Всероссийского научно-исследовательског института защиты растений.

Автореферат разослан "/9 " октября 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Г.А.Наседкина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Мельничная огневка (Ephestia kuehniella Zell., Pyralidae) является широко распостраненным вредителем пищевых запасов. Использование в борьбе с ней традиционного для нашего сельского хозяйства химического метода защиты затруднено. Велика вероятность попадания инсектицида или продуктов его разложения в пищу человека. Кроме того, в закрытых помещениях гораздо сложнее уберечь работающих в них людей от негативного действия химических препаратов. Оптимальный метод борьбы с E.kuehniella должен совмещать в себе высокую экологическую безопасность и способность длительное время сдерживать численность вредителя на стабильно низком уровне. Этим требованиям вполне соответствует генетический метод, разработка которого для борьбы с мельничной огневкой ведется уже около 10-ти лет в Польше и Чехии (Росада,1988; Maree,1991; Maree et.al.,1996) и предполагает выпуск стерилизованных или мутантных насекомых в природные популяции вредителя.

Исследования последних лет (Anisimov, et.al., 1989; Anisimov,1993, 1998; Anisimov, Sbvedov, 1996; Анйсимов, 1997) показали, что наиболее сильное подавление популяции вредных "чешуекрылых в течении нескольких поколений может быть достигнуто путем выпуска "частично стерилизованных насекомых, облученных радиацией в ' оптимальных дозах. Однако, в первом поколении эффективность генетической борьбы существенно снижается по сравнению с полной стерилизацией, особенно в случае выпуска насекомых без разделения полов.

Работы по созданию генетического метода борьбы, проведенные на мельничной огневке за последнее десятилетие, создают необходимые предпосылки для дальнейшей более глубокой разработки метода частичной стерилизации этого объекта: ■ Одним из возможных направлений этой работы являются исследования разных агентов, индуцирующих стерильность, в частности, алкилирующих соединений, применение которых в отличии от радиации не требует дорогостоящего и труднодоступного оборудования для облучения. Другое направление связано с тем, что частота индуцированных генетических повреждений может быть модифицирована дополнительным действием экстремальной температуры. Этот эффект был изучен на Drosophila melanogaster при индукции мутаций радиацией и хемостерилянтами (Тихомирова, 1964, 1974; Анисимов,. 1976). Воздействие температуры увеличивает частоту индуцированных мутаций в сперматозоидах и оказывает серьезный повреждающий эффект на ооциты. Это создает возможность для снижения негативного эффекта выпуска самок и сохранения или повышения частоты наследственных изменений в гаметах самцов, положительно влияющих на эффективность генетической борьбы.

Цель и задачи работы. Целью работы является научное обснование эффективного и реалистичного' варианта генетического метода борьбы с мельничной огневкой путем частичной стерилизации насекомых хемостерилянтами при дополнительном действии повышенной температуры. • • Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить действие повышенных температур, разных доз хемостерилянтов и их комбинаций на основные показатели репродуктивного потенциала (половую активность, плодовитость, выживаемость, соотношение полов) у обработанных самок и самцов, а также у потомков от обработанных самцов.

2. Разработать метод и оценить конкурентоспособность обработанных самцов мельничной огневки и их потомков

3. Подобрать оптимальное сочетание температуры и дозы хемостерилянта, при котором стерильность самок будет максимальной, а конкурентоспособность обработанных самцов и их потомков затрагивается в минимальной степени.

4. Оценить потенциальную эффект,ивно^ы выпускаг в природную популяцию насекомых, подвергнутых комбуниррр^Й!^ и повышенной температуры. •-. -. ' -■ •

Научная новизна работы. .Впервыв.-снаг.-.мельничной: огневке проведено комплексное исследование действи^хёмо.^.еРйЙянт.ОВ (тиотэфа и диматифа ) с дополнительным действием экстремальной' "температуры на основные показатели репродуктивного потенциала у обработанных самцов и самок, а также у их потомков Применена методика индивидуальных скрещиваний в родительском и первом дочернем поколении, что позволило выдвинуть ряд предположений о механизмах действия хемостерилянтов и температуры в сравнении с ионизирующей радиацией. Отмечен уникальный эффект - температурное воздействие на интактных самцов вызывало снижение в 2-3 раза плодовитости самок в их потомстве Р1. Отработана методика оценки конкурентоспособности самцов мельничной огневки, прошедших обработку хемостерилянтами и повышенной температурой.

Практическая ценность исследования. Подобрано оптимальное соотношение дозы хемостерилянта и температуры, при которых практически не снижается конкурентоспособность обработанных самцов Е.киеИпгёИа и их потомков , а эффекты наследования стерильности (НС) проявляются сильнее, чем в случае применения только стерилянтов. С помощью компьютерных экспериментов показано, что дополнительное действие температуры после обработки хемостерилянтами может обеспечивать существенное снижение численности популяций вредителя при относительно низкой норме выпуска

частично стерилизованных самцов к природным (9:1). Воздействие повышенной температуры на обработанных стерилянтом насекомых вызывает значительное снижение репродуктивного потенциала стерилизованных самок и увеличивает сдвиг в соотношении полов F1 в сторону самцов, что открывает возможность для выпусков частично стерилизованных насекомых без разделения полов. Это позволит не затрачивать средства на системы автоматического разделения полов у мельничной огневки и делает использование метода выпуска частично стерилизованных насекомых более реальным в практическом отношении.

Апробация работы. Основные научные положения и выводы диссертации были представлены на семинарах и конференциях в Донецком Государственном Университете (1993,1994), на XXIX Всесоюзной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" в Новосибирске (1991г.). Диссертация обсуждена на заседании кафедры зоологии и Ученом Совете биологического факультета Донецкого госуниверситета. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Содержание работы.

Обзор литературы. Литературный^обзор\"^^ посвящен

генетическим методам борьбы с вредителям^ Особое

место в нем уделено вопросам, ^связанным ^с-индукцией НС у бабочек, цитогенетическои основе этого явления,:а>также перспективами использования НС в качестве генетического метода'борьбы'с чешуекрылыми. Опираясь на имеющиеся в литературе сведения о недостаточной эффективности существующих вариантов генетической борьбы у Е. kuehniella, проведенные исследования были сориентированы на вариант выпуска частично стерилизованных насекомых без разделения полов, что может дать экономию средств при практической реализации генетического метода.

Материалы и методы. В опытах использовали бабочек мельничной огнёвки Ephestia kuehniella Zell.(Lepidoptera: Pyralidae), которых разводили в лабораторных условиях. В качестве питательной среды для личинок была использована смесь муки и отрубей с добавлением аскорбиновой кислоты. Развитие яиц и гусениц происходило при температуре 25-26°С, влажности 1516% при полной темноте. При индивидуальном разведении бабочек содержали попарно в малых чашках Петри (диаметр 4,5 см), где самки после копуляции откладывали яйца. После завершения яйцекладки бабочек удаляли и производили подсчет яиц под бинокуляром. Малые чашки Петри с яйцами переносили в большие чашки Петри, содержащие питательную среду, где происходило развитие личинок.

В опытах использовали имаго бабочек на 1-2 сутки после вылета из куколок. Воздействие на бабочек повышенной температуры проводили в суховоздушном термостате (ТС-80) со строго фиксируемым значением температуры воздуха в нем: 35°С, 36°С, 37'С, 38°С, 39°С и 40°С (±0.1 °С). В качестве хемостерилянтов для обработки мельничной огневки были выбраны диматиф (диэтиленимид амидотиофосфорной кислоты) и тиотэф (триэтилендиамид амидотиофосфорной кислоты). Для стерилизации бабочек первого дня вылета помещали на стеклянную поверхность, обработанную 0.1%, 0.2%, 0.3% и 0.5%-ным водным раствором диматифа или тиотэфа с добавлением детского мыла в качестве "прилипателя" (Булыгинская, Градинарова, 1974). После обработки бабочек (повышенной температурой и/или хемостерилянтами) их скрещивали индивидуально с интактными особями противоположного пола из лабораторной популяции. Полученные от этих скрещиваний яйцекладки после подсчета яиц переносили на питательную среду. Самок после откладки яиц вскрывали под бинокуляром и определяли наличие сперматофора в совокупительной сумке. После вылета имаго из куколок учитывали выживаемость, соотношение полов и другие показатели репродуктивного ' г потенциала. Имаго Р1 индивидуально отсаживали для спаривания 'впалые-чашки",' ^иУ: ■Петри: с особями противоположного пола из лабореторйо^^попупя^^^.^для ^'анализа наследования повреждений, индуцированных 5 при:Г обработке. В У* - дальнейшем учитывали выживаемость и соотношение полов.в;п6кол"енйи;Р2г;

'".•'' Для определения конкурентоспособности обработанных-.Ьамцоё^ и их-потомков помещали в отдельные чашки Петри соответственно по одному необработанному самцу, одной девственной самке и одному самцу, подвергнутому обработке (или самцу от обработанных родителей). Учитывая тот факт, что копуляция у мельничной огневки достаточна продолжительна, визуально отмечали спаривание самки с обработанным или интактным самцом (различие самцов осуществляли по нарушению опушения у обработанного самца). Затем отмечали случай повторного призыва или его отсутствия у самки после копуляции (в течение 2-4 дней). В случае наличия повторного призыва в чашку подсаживали девственного необработанного самца и опять следили за поведением самки, определяя с каким самцом она вступит в копуляцию.

Оценку эффективности выпуска обработанных насекомых в природную популяцию мы производили, используя компьютерную программу "Яез1есот" разработанную Анисимовым А.И. и Шведовым А.Н. (Ап1з'|тоу, 1993; АпЫтоу, БИуесЗоу, 1996; АпЫтоу, 1997). Для доказательства достоверности различий между сравниваемыми величинами использовали метод Стьюдента (ТсШ) и непараметрический критерий знаков (Урбах, 1964).

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Изменение половой активности мельничной огневки при воздействии

различных факторов.

3.1.1. Влияние повышенной температуры.

Сохранение у обработанных насекомых нормальной половой активности является важным показателем для эффективного применения генетического метода борьбы. Отсутствие сперматофора в совокупительной сумке самки свидетельствует о том, что данная особь не копулировала. Это является критерием непроявления половой активности одного или обоих партнеров при спаривании. Другим выжным показателем является способность самцов стимулировать откладку яиц самками после копуляции. Мы учитывали оба критерия, обозначая не копулировавшие пары Бр", а копулировавшие пары, но не отложившие яиц -

Воздействие на бабочек температуры 38°С и 39°С сказывается на половой а:™.:": :сст;; с^.^Ол, по икааывая при этом негативного влияния на самцов. При воздействии повышенной температуры на самок мы обнаружили эффект; связанный с увеличением доли самок, вступивших в копуляцию, но полностью теряющих способность откладывать яйца (8р+пары). В контроле такие пары у мельничной огневки встречаются редко, не чаще 1% (табл.1).

Тенденция к снижению способности самками откладывать яйца наблюдается уже при воздействии 35°С и последовательно возрастает с увеличением значения температурного воздействия. При температуре 39°С снижение способности самок откладывать яйца доходит до 43%. Начиная с воздействия 38°С и выше наблюдается достоверное отличие от контроля во всех вариантах.

Как видно из таблицы 1, отмеченный эффект снижения способности откладывать яйца после воздействия на мельничную огневку повышенной температуры позволяет допускать возможность подбора условий, при которых воздействие повышенной температуры на самок, в отличие от самцов, может сделать их гораздо более стерильными.

Позитивные (с точки зрения практического использования метода генетической борьбы)' эффекты воздействия повышенной температуры на самок максимально проявляются при 38-39°С. - .Поэтому они и были выбраны для изучения комбинированного воздействия стерилянтов и температуры на мельничной огневке. Вызванные воздействием повышенной температуры эффекты, описанные для обработанных насекомых, не наследуются их потомками Р1. Следовательно, в родительском поколении они имеют, скорее всего, не генетическую, а физиологическую природу.

Таблица 1. Частота полностью стерильных пар при воздействии повышенной температуры на самок и самцов мельничной огнёвки.

Число Полностью стерильные пары (без яйцекладок)

. ГС Пол пар Всего Бр'пары пары

- число %±Ш число % ±т

Контроль(22°С) 109 8 7 6.4±2.35 1 1.0±0.95

35°С самки 19 3 1 5.3±5.14 2 11.117.21

36°С самки 18 5 3 16.7±8.79 2 13.318.0

37'С самки 18 6 3 16.7±8.79 3 20.019.42

38°С самки 18 7 4 22.2±9.80 3 21.419.67

Э9°С самки 19 11 5 26.3±10.10 6 42.9111.35

35-37°С самки 55 14 7 12.7 ±4.49 7 14.615.10

38-39"С самки 37 18 9 24.3±7.15 9 32.118.82

35°С самцы 9 0 0 0+10.00 0 0+10.00

36°С самцы 8 0 0 0+11.11 0 0+11.11

37'С самцы 10 0 0 0+9.09 0 0+9.09

38°С самцы 15 2 0 0+6.25 • - • 2 13.318.77 ■

39°С самцы 13 3 1 7.717.39 ■ -2-.. 16.7110.35

40°С самцы 14 8 7 50.0±13.36 . ■■•• Т-": 14.319.36

35-37°С самцы 27 0 0 0+3.57 '" 0 ' 0+3.57

за-жс самцы 28 5 1 3.6±3.52 4 14.816.88

4-

Примечание: Бр~- не копулировавшие пары; Бр - копулировавшие пары без яйцекладок; * - % из числа копулировавших пар.

3.1.2.Влияние диматифа и тиотзфа в сочетании с повышенной температурой на половую активность самок и самцов.

При всех исследованных дозах стерилянтов (кроме концентрации 0.5%) в родительском поколении не выявлено существенного влияния воздействия одного диматифа или тиотэфа на снижение половой активности обработанных самцов. При воздействии на самцов стерилянтов в концентрации 0.5% частота Бр" пар достоверно возрастает по сравнению с контролем (р<0,01). Дополнительное действие повышенной температуры 37°С и 38°С (в течение 3 и 4 часов) после обработки препаратом не изменяет показатель половой активности, по сравнению с воздействием одного стерилянта.

При воздействии всех концентраций стерилянта в сочетании с температурой отмечается снижение стимуляции яйцекладки у интакгных самок после копу-

ляции с обработанными самцами. При использовании концентраций 0.3% и 0.5% доля пар достоверно превышает контроль (р<0.05).

С целью изучения возможности одновременного выпуска самок и самцов после комбинированного воздействия диматифа (0.2% и 0.3%) и температуры, был поставлен ряд опытов по обработке самок. При концентрации стерилянта 0.2% доля самок, не откладывавших яйца после копуляции, составила 15.6%, а при концентрации 0.3% такие самки встречались уже с частотой 23.5%(р<0.001).

При тестировании потомства Р1 от обработанных самцов была выявлена до-зовая зависимость снижения половой активности самцов Р1 от дозы стерилянта. У самок Р1 снижение половой активности, даже в виде тенденции не отмечено.

Во многих вариантах опытов (как при воздействии только стерилянта, так и при его комбинации с температурным воздействием) наблюдается достоверное увеличение частоты Бр пар как в случае тестирования самцов Р), так и при тестировании самок Р,. Причем, у самцов увеличение доли Бр пар отмечается уже при концентрации 0.1%. Важной особенностью наследования повреждений, приводящих к отсутствию пйнргпяп™ у """ул'/рс":;:!:;;;; Е^Сс-юл, иолнеи,я их большая частота", в И)" по!сравнёнию с частотой пар с отсутствием яйцекладки в родительском (обработанном) поколении. Такое наследование повреждений характер. но для явлениЯ;НС у бабочек и свидетельствует, на наш взгляд, о генетической природе нарушений,'которые приводят к отсутствию яйцекладки у самок после копуляции.

3.2 Зависимость плодовитости и выживаемости от воздействия стерилизующих факторов.

3.2.1. Влияние воздействия повышенной температуры.

Обнаружено, что воздействие повышенной температуры как на самок, так и на самцов вызывает снижение среднего количества откладываемых яиц. Причем, это изменение существенно зависит от условий температурного воздействия и пола насекомых.

При воздействии температуры 39°С плодовитость самок снижается резко (более чем в 3 раза по сравнению с контролем). Резкое снижение плодовитости ин-тактных самок отмечается и после копуляции с самцами, обработанными температурой 38°С и выше. По сравнению с контролем у таких самок плодовитость снижалась в 2-3 раза. При воздействии на самцов температуры 40°С, плодовитость самок, копулировавших с ними снижалась более чем в 7 раз.

Самые удивительные эффекты изменения плодовитости мы обнаружили у потомков Р1 от подвергнутых температурному воздействию самцов (табл.2). При

температурном воздействии 37°С самки Р1 демонстрируют в 2 раза меньшую плодовитость, чем в контроле. У самцов примерно с той же частотой проявляются нарушения стимуляции самок к яйцекладке. Подобных явлений, в первую очередь, следовало ожидать в потомстве самок, подвергнутых температурному воздействию. Известно, например, что определенные участки ооцита дрозофилы (в частности полярная чашечка) предетерминирована на образование гонады в этом месте (Альбертс и др., 1994).

Известно, что сама по себе температура не является сильным мутагенным фактором. Вероятно, в этом случае температурное воздействие способствует

Таблица 2. Плодовитость и выживаемость преимагинальных стадий у потомков Р1 от самцов и самок мельничной огневки, обработанных повышенной температурой.

Родительское Пол И Число Число Плодовитость Вылетело имаго Р2

поколение пар яиц

Пол t°C число яиц ±т число %±т

сздми 11 766 70±9.0 723 94.4±0.83

- - --.у-. •• 13. v 1038' 80±15.3 985 94.9±0.68

'•36° самки ■' '9' 575 64±13.1 525 91.3±1.18

самцы ' 11 842 77±16.7 744 88.4±1.11

37° самки 8 348 43±18.7 311 89.4±1.65

самцы 9 426 47±10.3 379 89.0±1.52

38° самки 9 405 45±10.3 348 85.9±1.73

самцы 11 274 2515.6 226 82.5±2.30

39° самки 7 98 14±2.8 62 63.3±4.87

самцы 8 218 27±7.0 165 75.7±2.91

40° самки 8 151 19±5.2 123 81.5±3.16

сяадцы 9 154 17±3.5 110 71.4±3.64

самки 37° самки 14 1138 81±6.97 986 86.6±1.01

самцы 14 1124 80±6.99 959 85.3±1.06

38° самки 16 1431 89±4.58 1174 82.0±1.01

самцы 16 1286 80±5.58 1075 83.6±1.03

39° самки 15 928 62±6.3 742 79.9±1.31

самцы 16 926 58±6.84 689 74.9±1.43

Контроль 102 8825 87±4.77 7949 90.1 ±0.32

реализации потенциальных повреждений, спонтанно возникающих в сперматозоидах. Если это так, то здесь мы сталкиваемся с каким-то совершенно неизвестным и неизученным феноменом, характерным для сперматозоидов чешуекрылых.

С практической точки зрения это может иметь большое позитивное значение, если этот эффект не сопряжен с потерей конкурентоспособности самцов Р1. В любом случае, снижение плодовитости самок Р1 после воздействия повышенной температуры является позитивным для генетической борьбы фактом.

Эффекты воздействия повышенной температуры сказываются и на выживаемости потомков lF^. При воздействии температуры 36°С на самок она снижается примерно на 25% и сохраняется на этом уровне при воздействии температур 37°С и 38"С, а при 39°С снижается уже на 45%. При воздействии температуры на самцов 40%-ное снижение выживаемости потомков Р1 отмечается уже при 38°С.

Если повышение гибели потомков от обработанных температурой самок можно объяснить нарушением неядерных структур ооцита, важных для развития эмбриона, то снижение выживаемости потомков самцов, подвергавшихся действию высоких температур, при параллельном снижении плодовитости осемененных ими гяил» ГлССгчити нарушениями оОъяснить сложнее. Для этого

' при', воздействии повышенной температуры на самцов;^йарушает,ся не. только;>обще.е.;количество образующихся и переносимых сперматозоидов,, но и, их. качественный состав (уменьшается доля эупиренных сперматозоедов). На уменьшение общего количества сперматозоидов самка реагирует снижением плодовитости. Но, несмотря на это откладывает и некоторую часть неоплодотворенных яиц вследствие снижения числа эупиренных сперматозоидов. Можно предположить, что самка "не отличает" модифицированные температурой и не способные к оплодотворению апиренные сперматозоиды от эупиренных. Это объяснение представляется возможным, но маловероятным, так как у чешуекрылых вылупляющиеся из куколки самцы уже имеют сформированные пулы сперматозоидов.

Второе объяснение отмеченных нами эффектов снижения плодовитости самок, копулировавших с обработанными температурой самцами, основано на предположении индукции наследственных повреждений сперматозоидов, вызванных воздействии температуры. Возможно, аналогичные изменения и вызывают снижение плодовитости у потомков Р1 после температурной обработки самцов. Интересно, что в этом случае потомки Р2 от обработанных температурой самцов выживают намного хуже, чем при обработке самок, но эти различия не велики и недостоверны. Вероятно, здесь проявляется еще одна группа генетических изменений, фиксация которых как в сперматозоидах, так и в ооцитах провоцируется воздействием только высоких температур (>38°С).

3.2.2. Действие хемостерилянтов и их комбинаций с повышенной температурой.

При воздействии диматифа и тиотефа на самцов значительное снижение плодовитости самок, копулировавших с ними, отмечается только при самой высокой из испытанных концентраций стерилянтов - 0.5% (табл.3).

Таблица 3. Плодовитость и выживаемость преимагинальных стадий (Р1) у мельничной огневки после обработки диматифом и температурой._

Условия обработки* Пол Число пар Число яиц Плодовитость Вылетело имаго

число яиц ±т число %±т

0.1% самцы 11 686 62±18.9 393 57.3±1.89

0.1%х38°х3ч. самцы 12 857 ' 71 ±18.6 669 78.1±1.41

0.1%х38°х4ч. 9 497 55±14.9 241 48.5±2.24

0.1%х39°х3ч. 14 658 47±15.9 291 44.2+1.94

0.1%х39°х4ч. 17 765 45±13.9 344 44.9±1.80

0.2% самцы 11 333 30±10.8 127 38.1±2.66

. 0.2%х38°х3ч. самцы В 458 57.ttS.0i. ; . '.83.8i1.72

. 0.2%х38°х4ч. 11 387 35±.15:-7'г-.,-~ ,30.8+2.35."

0.2%х39°х3ч. 11 541 79±15.9:_ ■^.127- •.. 23.5±1.82 .

0.2%х39°х4ч. 11 230 34.4±3.13

0.3% самцы 31 1972 64+7.3 ; " 1116 56.6±1.12

0.3%х38° хЗч. самцы 15 712 43±10.7 244 34.3±1.78

0.3%х38° х4ч. 7 102 15±4.9 23 22.6+4.14

0.3%х39° хЗч. 9 311 35±14.5 115 36.9+2.74

0.3%х39<> х4ч. 16 402 25+7.4 81 20.2+2.0

0.5%. самцы 29 812 28+4.8 150 18.5+1.36

0.5%х38° хЗч. самцы 8 364 46±22.4 127 34.9+2.5

0.5%х38° х4ч. 6 128 21+8.8 16 12.5±2.9

0.5%х39° хЗч. 12 371 31+9.7 86 23.2±2.19

0,5%х39° х4ч. 14 520 37±15.5 63 12.1±1.43

0.2%х38° хЗч. самки 17 1000 59+7.1 660 66.0±1.50

0.2%х39° хЗч. 15 669 45±7.9 115 17.2±1.46

0.3%х38° хЗч. самки 18 1072 60±7.8 363 33.9±1.45

0.3%х39° хЗч. 16 563 35±8.1 99 17.6+1.60

Контроль 102 8825 87±4.8 7949 90.1±0.32

Примечания: * -здесь и далее условия обработки обозначены следующим образом - К% х 1°С х Т ч., где К - концентрация сгерилята в %, ГС - температура, Т -экспозиция температурного воздействия в часах.

Плодовитость после такого воздействия снижается примерно в 3 раза. При меньших концентрациях снижение плодовитости также наблюдается (при концентрациях 0.2% и 0.3% - достоверное, р<0.05). Достоверное снижение плодовитости наблюдается также при комплексном воздействии диматифа и повышенной температуры на самцов мельничной огневки. Однако это снижение, в среднем, эквивалентно снижению плодовитости при воздействии только одной повышенной температуры. Этот факт представляется особенно интересным с научной точки зрения в варианте опытов с концентрацией стерилянта 0.5%. В данном случае эффект совместного действия повышенной температуры и диматифа вызывает меньшее снижение плодовитости, чем ожидается при аддитивном эффекте воздействия хемостерилянта или повышенной температуры.

При концентрации стерилянта 0.1% воздействие диматифа и тиотэфа вызывает наследственные повреждения, снижающие выживаемость (табл. 3). При воздействии диматифа в концентрации 0.5% это снижение выживаемости весьма значительно (на 80% по сравнению с контролем). В целом, для показателя выживаемости можно отметить те же закономерности, что и в отношении плодовитости. Ксмплс::г;;ос »¿¿«сйчвие; стерилянта ;И повышенной температурь! меньше ожидаемой суммы возДей&1§йя"этйх"Дв^'ф"а1а6р6в'раздельно: •

При комбинированном воздействйи-диматифа и'повь1шенньй температуры на самок мельничной огнёвки самое значительное (в-5-раз по сравнению с контролем) снижение выживаемости потоШоз-Ш-6тмечается при температуре 39"С. Следовательно, воздействие температуры в комплексе с обработкой хемостери-лянтом может усиливать повреждающие эффекты хемостерилянтов на самок и по признаку выживаемости. Это чрезвычайно важно для практического применения генетического метода борьбы с мельничной огнёвкой.

В таблице 4 представлены результаты оценки плодовитости самок и самцов Р, от самцов, подвергнутых комбинированному воздействию повышенной температуры и диматифа, и выживаемости их потомства Р2. Как после обработки только диматифом, в различных концентрациях (0.1-5-0.5%), так и во всех опытах с комбинированным воздействием плодовитость потомков р1 высоко достоверно ниже, чем в контроле.

Из таблицы 4 видно, что бабочки Р< (как самцы, так и самки) наследуют определенный уровень генетических изменений, приводящих к снижению выживаемости их потомков Р2. Однако выживаемость потомков Р2 чаще всего (кроме концентрации стериянта 0.3%) выше, чем в поколении Р1 без последующего воздействия повышенной температуры. Это не характерно для явления НС. В то же время, в подавляющем большинстве опытов с комплексным воздействием выживаемость потомков Р2 гораздо ниже, чем у их родителей Р1 (потомков обработанных бабочек).

Таблица 4. Плодовитость самцов и самок Р1, полученных от самцов мельничной огневки, обработанных тиотэфом и температурой, и выживаемость лреимагинальных стадий их потомков Р2.

■ ■ Условия Пол Число Число Плодовитость F^\ Вылетело имаго Р2

обработки* пар яиц число яиц±т число %1ГП

1 2 3 4 5 6 7

0.1% самцы 9 333 37±16.8 204 61.312.67

0.1%х38">х3ч. самцы 9 174 1919.7 77 44.313.71

0.1%х38°х4ч. 10 259 2619.4 62 23.912.65

0.1%х39°х3ч. 11 229 2119.4 53 23.112.79

0.1%х39°х4ч. 6 150 25+18.3 34 22.713.42

0.2% самцы 9 240 27110.3 116 48.313.23

0.2%х38°х3ч. самцы 12 361 30110.1 75 20.812.14

0.2%х38°х4ч. 12 189 1617.5 62 32.813.42

0.2%х39°х3ч. 15 284 1918.1 52 18.312.29

0.2%х39°х4ч. / ' 9"" ' '158 " -■■ 18±8.3 - 23 14.612.81

0.3% самцы ''"23 ' 345 48.111.86

0.3%х38°х3ч. самцы ''••'• 245 •• ~ 57 23.312.70

0.3%х38°х4ч. ' • е";' •-,53- ' ' ;:>"-" 913.9 10 18.915.37

0.3%х33°х3ч. 0- ■■ ■ '108 " - ' 2419.1 29 15.412.63

0.3%х39°х4ч. 8 156 20112.0 38 24.413.44

0.5%. самцы 18 360 2014.9 94 26.112.31

0.5%х38°х3ч. самцы 8 80 1013.4 12 15.013.99

0.5%х38°х4ч. 5 91 1819.7 10 10.913.28

0.5%х39°х3ч. 4 151 38119.7 13 8.612.28

0.5%х39°х4ч. 12 221 1818.5 32 14.512.37

0.1% самки 11 708 64114.9 579 81.811.45

0.1%х38°х3ч. самки 10 458 46119.9 230 50.212.34

0.1%х38°х4ч. 8 190 24112.4 52 27.413.23

0.1%х39°х3ч. 14 323 2317.4 62 19.212.19

0.1%х39°х4ч. 6 102 1716.5 8 7.812.66

0.2%

0.2%х38°х3ч. самки 10 301 30112.0 127 42.212.85

0.2%х38°х4ч. 11 309 2819.2 86 27.812.55

0.2%х39°х3ч. 12 210 1816.9 33 15.712.51

Продолжение табл.4.

1 2 3 4 5 6 7

0.2%х39°х4ч. 8 156 20±8.3 30 19.213.16

0.3% самки 24 630 2614.8 236 37.511.93

0.3%х38°х3ч. самки 13 300 23±8.6 46 15.312.08

0.3%х38°х4ч. в 206 2б±9.3 26 12.612.31

0.3%х39°х3ч. 10 346 35:113.6 72 . 20.812.18

0.3%х39°х4ч. 8 167 21±9.7 27 16.212.85

0.5%. самки 22 ' 279 14±3.0 67 24.012.56

0.5%х38°х3ч. самки 11 237 22111.1 59 24.912.81

0.5%х38"х4ч. 7 118 17±7.2 24 20.313.71

0.5%х39°х3ч. 7 88 1314.5 11 12.513.53

0.5%х39°х4ч. 17 294 17±6.7 56 19.112.29

Контроль (22°С) 101 8825 871:4.8 7949 90.110.32

3.3. Соотношение полов.

3 3 1 йг^шсппи^ юммирагуры.

- Одним из характерных признаков явления НС у чешуекрылых являете;! сдвиг в ... соотношении полов в сторону увеличения доли самцов в потомстве :обр_аботан-. ; ных самцов родительского поколения. Поэтому при оценке зффейгй&гости - ... использования комбинированного воздействия хемостерилянта и повышенной температуры необходимо было изучить и этот показатель репродуктивности потенциала, Результаты этого изучения представлены в таблице 15. Из таблицы видно наличие изменения соотношения полов (в пользу самцов) в потомстве самцов мельничной огнёвки, обработанных повышенной температурой (начиная с температуры 36°С). Как видно из таблицы 5 при воздействии температуры 35-38°С на самок соотношение полов остается близким к контрольному значению. Следует отметить, что соотношение полов у мельничной огнёвки и в норме (без обработки) немного сдвинуто в сторону преобладания самцов (до 52%). Это достоверно отличается от соотношения 1:1 (т.е. от 50%). При воздействии на самок температуры 39°С в их потомстве наблюдается преобладание самцов (табл. 15). Увеличение доли самцов является в этом случае достоверным (р<0.05). При воздействии температуры 38-39°С на самцов, в их потомстве отмечается на 10% (в среднем) больше самцов, чем в контроле. Однако нарушения, приводящие к сдвигу в соотношении полов в Р, не наследуются. Природа таких нарушений нам не ясна.

Таблица 5. Доля самцов Р1 в потомстве самок и самцов мельничной огневки, подвергнутых воздействию повышенной температуры.

Число Вылетело имаго

ГС Пол пар Всего из них самцов

число %±т

контроль 101 7949 4149 52.2±0.56

35° самки 16 1118 572 51.2±1.49

36° 12 602 319 52.9±2.03

37° 12 580 310 53.5+2.07

38° 11 507 264 52.1+2.22

39° 8 195 120 61.5+3.48

35°+38° самки 51 4076 2807 52.2+0.94

35° самцы 9 636 335 52.7+1.98

36° 8 426 255 59.9±2.37

37° .... •1Р-.- • 449, . .. ,. . 308 68.6+2.19

38° .. г- -г..;- ¡■•15 :. 234 .:- ' : 145 . 62.0+3.17

39° ; .■С./.О:,'" 12,- >.•:< 138 56.8±3.18

40° .... ...,, ■,.'7 ■ • 21 15 71.4+9.86

35°+38° - 39 : 1352 846 62.6±1.32

3.3.2 Изменение в соотношении полов у мельничной огнёвки, вызванное воздействием стерилянта в сочетании с повышенной

температурой

Нами были проведены эксперименты по исследованию сдвига в соотношении полов в результате комплексного воздействия хемостерилянта и повышенной температуры на бабочек мельничной огнёвки. Результаты этих экспериментов представлены в таблице 6.

При воздействии диматифа даже в минимальной концентрации (0.1%) наблюдается увеличение доли самцов Р1 по сравнению с контролем (табл.6). Увеличение доли самцов последовательно возрастает с увеличением дозы воздействия (концентрации стерилянта). Обработка бабочек температурой после воздействия стерилянта практически не изменяет значения соотношения полов по сравнению с результатами воздействия только диматифа (табл.6). Те же закономерности нами отмечены и в опытах с применением тиотэфа. Однако дозовая зависимость при действии тиотэфа без температуры выражена в этих

Таблица б.Соотношение полов в потомстве от самцов и самок мельничной огневки, обработанных диматифом и повышенной температурой.

Число Вылетело имаго

Условия обработки Пол пар Всего из них самцов

число %±т

0.1% самцы 8 393 232 59.03+2.48

0.1%х38°х3ч. самцы 11 669 367 54.9Ц.92

0.1%х38°х4ч. а 341 149 ■ 61.8±3.13

0.1%х39°х3ч. 11 391 177 60.8±2.86

0.1%х39°х4ч. 10 344 217 63.1±2.60

0.1%х(38°-39°)х(3-4)ч. 40 1545 910 58.9+1.25

0.2% самцы 6 127 77 60.6+4.34

0.2%х38°х3ч. самцы 7 384 236 61.5+2.48

0.2%х38°х4ч. 7 119 84 70.6±4.18

0.2%х39°х3ч. 6 127 68 53.514.43

0.2%х39°х4ч. 8 79 47 59.5±5.52

0.2%х(38°-39°)х(3-4)ч. 28 709 435 61.4±1.83

0.3% самцы 25 1116 625 56.0±1.49

л оо/.^о Ч^ОМЦЫ Ш-г - 244- . 159 . 65.2+3.05

0.3%х38?х4ч. .23 18 . 78.318.60.

0.3%х39°х3ч. ..&..:-.., .•••115.. - 79 - .68.7+4.32 ■

0.3%х39°х4ч. 9 ■ . 81- - .. 44 54.315.53

0.3х(38°-39°)х(3-4)ч. 30 V .. 463 - •. 300 64.812.22

0.5%. самцы 17 150 97 64.7+3.90

0.5%х38°х3ч. самцы 5 127 75 59.114.36

0.5%х38°х4ч. 4 16 10 62.5112.10

0.5%х39°х3ч. 7 86 47 54.715.37

0.5%х39°х4ч. 5 63 38 60.3+6.16

0.5%х(38°-39°)х(3-4)ч. 21 292 170 58.2+2.89

0.2%х38°х3ч. самки 14 660 340 51.511.95

0.2%х39°х3ч. 6 115 77 67.014.39

0.2%х(38°-39°)х3ч. 20 775 417 53.811.79

0.3%х38°х3ч. самки 11 363 213 58.712.58

0.3%х39<>х3ч. 5 99 56 56.6+4.98

0.3%х(38°-39°)х3ч. 16 462 269 58.212.29

Контроль (22°С) 362 21761 11459 52.7+0.34

опытах слабее. Дозовая зависимость явно выражена при анализе суммированных по отдельным вариантам данных.

Говорить о модифицирующем воздействии повышенной температуры на сдвиг в соотношении полов мельничной огнёвки мы не можем. В опытах не обнаружено достоверного отличия в величине сдвига соотношения полов между вариантами обработки только тиотэфом и комплексной обработкой.

В значительной степени генетические нарушения, вызывающие сдвиг в соотношении полов, наследуются потомками Р2. Это подтверждает анализ соотношения полов в потомстве бабочек р1 от обработанных родителей.

3.4. Оценка конкурентоспособности самцов мельничной огнёвки.

Одним из наиболее значимых для практического применения генетического метода борьбы и наиболее сложных в плане количественной оценки является признак конкурентоспособности самцов. Для оценки этого признака мы использовали определенные поведенческие особенности мельничной огнёвки в процессе спаривания, а именно, специфическую "призывную" позу самки (разведенные крылья и приподнятое брюшко) и длительное продолжение копуляции. Мы провели ряд прямых наблюдений по описанной выше методике, в которых обработанный той или иной комбинацией стерЛлянта и повышенной температуры самец конкурировал за самку с необработанным самцом. В подобных экспериментах оценивалась и конкурентоспособность самцов Р1 от обработанных родителей. Достоверное снижение конкурентоспособности обработанных самцов (первыми вступивших в копуляцию) отмечается только после обработки их тиотэфом в концентрации 0.5% и воздействием повышенной температурой 39°С в течение 4-х часов (максимально сильное воздействие). Для всех остальных случаев тестирования достоверного отличие конкурентоспособности обработанных в различных комбинациях самцов от необработанных выявить не удалось (табл. 7). Следовательно, обработка умеренными концентрациями хемостерилянта 0.1%-0.3% (как диматифа, так и тиотэфа) в комплексе с воздействием температуры если и будет снижать конкурентоспособность самцов мельничной огнёвки, то незначительно.

У самцсз Р1 от обработанных родителей достоверное снижение конкурентоспособности наблюдается после обработки их родителей как диматифом, так и тиотэфом в концентрации 0.5%. В остальных вариантах обработки отмечается незначительная тенденция к снижению конкурентоспособности.

В целом, тот факт, что обработанные умеренными концентрациями (0.1-0.3%) стерилянта в сочетании с воздействием повышенной температуры самцы мельничной огнёвки сохраняют конкурентоспособность, которая значительно не отличается от конкурентоспособности необработанных самцов. Это является

значительным положительным фактором для практического применения комбинированной обработки.

Таблица 7. Показатели конкурентоспособности самцов мельничной огнёвки после обработки комбинированным воздействием стерилянта и высокой температуры.

Условия Число Пары, в которых первым копулировал обработанный самец

обработай пар Всего Повторный призыв самки Повторная копуляция самки

число %±т число %* ±т число %* ±т

контроль 25 25 7 28.0t8.98 2 8.0±0.8

После обработки тиотэфом и повышенной температурой

0.1%х38°х3ч. 26 15 57.7i9.69 8 53.3±12.8Э 4 26.7111.42

0.2%х39°х3ч. 27 11 40.7t9.46 6 54.5±15.01 3 27.3±13.43

0.2%.х38°х4ч 26 12 46.2±9.78 5 41.7±14.23 2 1б.7±10.77

0.5%х39°х4ч. 29 3 10.3±5.64 2 66.7±27.21 2 66.7±27.21

Пссг.о ^СраСи! ки диматифом и повышенной температурой.•-..,.

0.1%х38°х3ч. 19 9 47.4±11.56 ¿(-Ч33.3±15:7'^' ' - "2 , : ,Ч*22.2±ТЗЖ

0.2%х39°х3ч. 18 7 38.9±11.49 Г,-.42..'9±18.7!" '•...14.3il3.23 '

0.2%.х38°х4ч 15 8 53.3±12.88 •3' -• •'37-.5£17:121 ' ; -'25.0t15.31

0.5%х39°х4ч. 17 7 41.2Ы1.94 '-•Б7'г1И8.71:Г '"'■3 -V >>42.9118.71

Примечания: *- % из числа пар, а которых первым копулировал обработанный самец.

3.5. Моделирование выпусков мельничной огневки, обработанной хемостерилянтами и повышенной температурой.

С помощью компьютерной программы "Нез1есот" было проведено моделирование эффектов выпуска самцов, обработанных диматифом и тиотэфом с воздействием повышенной температуры 38°С и 39°С в четырех комбинациях (0.1%х38°сх3ч.; 0.2%х39°сх3ч.; 0.2%х38°Сх4ч.; 0.5%хЗЭ°Сх4ч.). Кроме того, был промоделирован вариант выпуска бабочек мельничной огнёвки после комплексной обработки без разделения полов (0.2%х39°СхЗч.). В качестве результатов моделирования учитывалось прогйозируемое число имаго в первой и второй генерациях и число личинок в третьей генерации бабочек в природной популяции после однократного выпуска обработанных насекомых в четырех разных соотношениях природных и выпускаемых насекомых 1:1; 1:9; 1:30; 1:100 (табл.8).

Как показал компьютерный эксперимент, с точки зрения практического использования, наиболее эффективным является комплексное воздействие уме-

Таблица 8. Снижение численности (в % по отношению к контролю) популяции мельничной огневки при однократном выпуске самцов и самок, обработанных диматифом и повышенной температурой.

Поколение после выпуска* Отношение выпускаемых насекомых к природным Условия обработки выпускаемых насекомых

0.1%х38°х3 0.2%х39°х3 0.2%х39°х3 0.2%х38°х4 0.5%х39°х4

Ь 1:1 16.97 37.87 31.26 43.82 43.26

1:9 30.54 75.66 52.49 78.89 84.55

1:30 32.84 82.90 28.91 84.82 82.25

1:100 33.84 85.34 -68.38 86.78 94.84

1:1 65.02 48.61 44.26 56.40 46.37

1:9 96.01 93.09 87.81 95.46 90.21

1:30 98.46 98.80 95.74 99.22 97.71

1:100 99.04 99.81 76.87 99.85 .99.61

Рз 1:1 67.17 . 48.72 • 44Й8 vo'

1:9 97.28 93.22 88';Ö4-^ :: 90.26

1:30 99.23 98.87 95.99 - '•V-97:75 '

1:100 99.62 99.84 98.53''.' 1 -^09.89 '99.63

Примечания: * - для Р1 и Я2 указано снижение численности имаго, для РЗ

снижение численности личинок.

ренной (0.2%) концентрации хемосгерилянтов и повышенной температуры (39°С в течение 3 часов или 38°С в течение 4 часов), и обработке в этих сочетаниях эффективность однократного выпуска в природную популяцию для поколения РЗ может достигать 99.9%. Эффективность однократного выпуска усиливается от поколения к поколению, что является характерной особенностью метода наследуемой стерильности.

При выпуске обработанных бабочек без предварительного разделения попов эффективность однократного выпуска хотя и несколько ниже в поколении Я1, но достаточно высока по сравнению с полной стерилизацией. В поколениях Р2 и РЗ она сильно возрастает и приближается к эффективности выпуска только самцов.

При удачном подборе температурного воздействия можно достичь большого снижения репродуктивного потенциала обработанных самок, сохраняя конкурентоспособность самцов. Кроме того, путем моделирования можно найти оптимальное соотношение выпускаемых и природных насекомых. Это позволит повысить эффективность выпуска в природную популяцию обработанных

насекомых без предварительного разделения полов, что значительно упростит практическое применение метода. В целом, можно отметить, что все промоделированные варианты обработки в различных комбинациях температуры и хемостерилянта являются высокоэффективными с точки зрения практического применения. Даже однократный выпуск в природную популяцию бабочек мельничной огнёвки, обработанных комплексным воздействием позволит поддерживать численность вредителя на значительно низком уровне в трёх и, возможно, большем числе поколений.

Выводы.

1. Трёх-четырёхчасовое воздействие температуры 38°С и выше на самцов мельничной огнёвки снижает плодовитость самок, способность самцов стимулировать яйцекладку, увеличивает долю насекомых, не вступающих в копуляцию, снижает выживаемость потомков обработанных бабочек. При обработке самок эти эффекты отмечаются даже при температуре 36°С. Повреждения, вызванные воздействием повышенной-температуры„частично, наследуются потомками обработанных самцов й их плодовитости, сравнимого с родительским поко^Ьнием.Ч^^^х^'-^'^^»^:"-.": ••..-••

2. Воздействие диматифа и;/шотэфа вызывает повреждения приводящие к зависимому от дозы снушению; подовой активности и плодовитости обработанных насекомых, а также выживаемости их потомков Я1, у которых наблюдается сдвиг соотношения полов в сторону самцов. Индуцированные в половых клетках повреждения наследуются и приводят к снижению половой активности и плодовитости потомков Я1, а также снижению выживаемости Р2. Наследуемые эффекты по плодовитости и выживаемости сравнимы, а по половой активности превосходят наблюдаемые у обработанных самцов.

3. Комбинированное воздействие хемостерилянтов и повышенной температуры усугубляет проявление дефектов "наследования стерильности" и приводит к более значительному сдвигу соотношения полов Р1 в сторону самцов. Оно модифицирует характер проявления индуцированных в сперматозоидах наследственных изменений. Плодовитость Р1 уменьшается в меньшей, а выживаемость Р2 в большей степени, чем можно ожидать при независимом влиянии отдельных воздействий.

4. Выявлены параметры обработки мельничной огнёвки (хемостерилянта в концентрации 0.1%-0.3% и повышенной температуры 38-39°С), при которых практически не снижается конкурентоспособность обработанных самцов и их потомков Р1.

5. Обработка самцов перед выпуском умеренными (0.2-0.3%) концентрациями хе-мостерилянта в комбинации с высокой температурой (38-39°С, 3-4 часа) потенциально более эффективна, чем использование более высоких концентраций и открывает возможность для выпусков частично стерилизованных насекомых без разделения полов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Шевченко А.О. Индукция и наследование стерильности после облучения самцов яблонной плодожорки (1а5реугеэ1а ротопеНа I..) одинаковой дозой у- и X-лучей // Мат. XXIX Всесоюзной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", Биология.- Новосибирск.-1991,- с.8-14.

2. Усова З.В., Рева М.А., Шевченко А.О. Сравнительное изучение наследования стерильности при воздействии гамма- и ренгеновски^и лучей на яблонную плодожорку.. II Тез. докл. ву-зовской научной конф. по итогам научно-исследовательской работы: естест-венные дисциплины, дйнецк, апрель 1993 г.Донецк, ДонГУ,-1993.-с.82г83.-..■ ::■.•.'■•>.,•. -■,Л .,' «'

3. Шевченко А.О. Воздейстйзрпоаьйш^ репродуктивные функции мельничной огневкиЙ.'С'б.•$аВбтДон$ТИ АН Украины",- 1993.- с.93.

4. Шевченко А.О. Определение-порогового .значения температурного шока для мельничной огневки // Тез.- дохл-. 1\^ЙсеукраинЪкой студенческой конференции "Охрана окружающей среды " и "• рациональное использование природных ресурсов." 19-21 апреля 1994 г.-Донецк,-1994.-с. 188.

5. Усова З.В., Рева М.А., Шевченко А.О. Изучение воздействия хемостерилянтов в сочетании с повышенной температурой на мельничную огневку // Мат. X Всеукраинской конференции студентов и аспирантов (апрель 1996 г.)- Донецк. -1996,- с.85-89.

Соискатель / / /■*///Шевченко А.О.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шевченко, Александр Олегович, Санкт-Петербург

ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

На правах рукописи ШЕВЧЕНКО Александр Олегович

НАСЛЕДОВАНИЕ СТЕРИЛЬНОСТИ ПРИ КОМБИНИРОВАННОМ ДЕЙСТВИИ ХЕМОСТЕРИЛЯНТОВ И ВЫСОКОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ НА МЕЛЬНИЧНУЮ ОГНЕВКУ ЕРНЕБЛА КиЕНМЕИА.

Специальность: 03.00.09 - энтомология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н., профессор Усова З.В., д.б.н. Анисимов А.И.

Санкт-Петербург 1998 г.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...................................................................3

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................8

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ БОРЬБЫ С ВРЕДНЫМИ НАСЕКОМЫМИ

1.1. Метод стерилизации................................................8

1.1.1. Хемостерилизация...............................................11

1.1.2. Лучевая стерилизация...........................................16

1.2. Индуцированная наследуемая стерильность.............17

1.2.1. Цитогенетические механизмы

наследования стерильности...............................................19

1.2.2. Индуцирующие агенты........................ .................23

1.2.2.1 .Наследуемая стерильность,

индуцированная хемостерилянтами................................25

1.2.2.2. Генетические повреждения при

действии экстремальной температуры.............................26

1.2.3. Стадии развития насекомых, используемые

для индукции НС...........................................................28

1.2.4. Конкурентоспособность стерилизованных насекомых.........................................................................29

1.3. Автоматическое разделение полов.............................34

1.4. Математическое моделирование выпусков насекомых с измененной наследственностью.......................36

2. Материалы и методы..................................................38

2.1. Методы воздействия на бабочек повышенной температурой и хемостерилянтами...................................38

2.2. Схема скрещиваний..................................................40

2.3. Учет показателей репродуктивного потенциала у обработанных насекомых и их потомков............................40

2.4. Определение конкурентоспособности самцов..............43

2.5. Методы оценки эффективности выпуска

обработанных бабочек мельничной огневки в

природную популяцию...............................................................44

3. Результаты исследований и обсуждение........................45

3.1. Изменение половой активности мельничной огневки

при воздействии различных факторов..............................45

3.1.1. Влияние на половую активность бабочек воздействия повышенной температуры...............................45

3.1.2. Влияние диматифа и тиотэфа в сочетании с повышенной температурой на половую активность

самок и самцов.................................................................50

3.2. Зависимость плодовитости и выживаемости от воздействия стерилизующих факторов...............................60

3.2.1. Зависимость плодовитости и выживаемости от воздействия повышенной температуры...............................60

3.2.2. Плодовитость и выживаемость насекомых при воздействии хемостерилянтов и действии повышенной температуры...................................................................64

3.3. Соотношение полов....................................................74

3.3.1. Изменение в соотношении полов мельничной огнёвки, вызванное воздействием повышенной

температуры.....................................................................74

3.3.2 Изменение в соотношении полов у мельничной

огнёвки, вызванное воздействием стерилянта в

сочетании с повышенной температурой.................................76

3.4. Оценка конкурентоспособности самцов мельничной огнёвки.............................................................................83

3.5. Моделирование выпусков мельничной огневки, обработанных хемостерилянтами и повышенной температурой....................................................... ............87

ВЫВОДЫ...........................................................................92

Список литературы..............................................................94

ВВЕДЕНИЕ

Мельничная огневка (Ephestia kuehniella Zell., Pyralidae) является широко распостраненным вредителем пищевых запасов. Это затрудняет использование в борьбе с ней традиционного для сельского хозяйства химического метода защиты. Проведение обработок инсектицидами в зернохранилищах и на продовольственных складах существенно отличается от использования химических препаратов в полевых условиях. Во-первых, резко возрастает вероятность попадания инсектицида или продуктов его разложения в пищу человека, т.к. обрабатывается не вегетирующее растение в поле, а уже собранное зерно или даже готовый продукт (мука и другие продукты помола). Во-вторых, в закрытых помещениях гораздо сложнее уберечь работающих в них людей от негативного действия химических препаратов.

Мельничная огневка наносит не только количественный ущерб, поедая зерно и муку. Мертвые имаго, которые сами не питаются, загрязняют продукт, что приводит к снижению качества муки. Для сохранения качества необходимо использовать против мельничной огневки метод борьбы, который обеспечит стабильно низкую численность вредителя в течении времени, необходимого для реализации складируемого продукта. Применение химического препарата дает возможность в короткий срок сбить высокую численность вредителя и тем самым предотвратить количественные потери, но снижения качества продукции в этом случае не избежать. Инсектицид, как агент химического метода, действует на популяцию вредителя в течении нескольких дней. Между обработками насекомые предоставлены сами себе, что приводит к ускоренному росту численности на освободившейся кормовой базе за счет выживших особей и интервенции вредителя извне. Рост численности делает необходимым повторное применение инсектицида. В складируемом продукте накапливаются мертвые насекомые, число которых возрастает после каждой обработки. Это требует дополнительных затрат на очистку продукта и снижает его качество.

Анализируя ситуацию, можно согласится с утверждением наших коллег из Польши, которые считают, что ни один из применяемых ныне методов снижения численности мельничной огневки не является полностью удовлетворительным (Роса-да,1988). Оптимальный метод борьбы с Е.киеЬп1еПа должен совмещать в себе высокую экологическую безопасность и способность длительное время сдерживать численность вредителя на стабильно низком уровне. Этим требованиям вполне соответствует генетический метод борьбы. Агентом этого метода являются стерилизованные или мутантные насекомые, принадлежащие к виду, с которым ведется борьба. Они постоянно находятся в популяции вредителя и действуют непрерывно, копулируя с природными особями. Это приводит к полной или частично гибели их потомства, как правило на эмбриональной стадии развития. В случае, когда часть потомства от скрещивания выпущенных особей с природным насекомым выживает, мутации, детерминирующие гибель эмбрионов, наследуется в следующем поколении. Этот механизм обеспечивает стабильно низкую численность вредителя в ряду последовательных поколений. Гибель вредителя на эмбриональной стадии развития, которую обеспечивает генетический метод, позволяет избежать потерь как количественных, которые наносят гусеницы мельничной огневки, так и качественных, которые связаны с накоплением мертвых насекомых в продукте.

Имеющийся успешный опыт применения генетического метода в борьбе с вредными чешуекрылыми свидетельствует о том, что при реализации метода в изолированных популяциях он дает максимальный эффект. Это служит дополнительным доводом в пользу применения против Е.киеИп1еМа именно генетического метода, т.к. выпуск мутантных особей предполагается проводить на мельницах и продовольственных складах, т.е. в замкнутом пространстве, где популяцию вредителя можно считать почти изолированной.

Все изложенное выше показывает сколь актуальна и перспективна разработка генетического метода борьбы с

мельничной огневкой, которая ведется уже около 10-ти лет в Польше и Чехии (Росада,1988; Maree, 1991; Maree et.al.,1996).

Исследования последних лет (Anisimov, et.al., 1989; Anisimov,1993, 1998; Anisimov, Shvedov, 1996; Анисимов, 1997) показали, что наиболее сильное подавление популяций вредных чешуекрылых в течении нескольких поколений может быть достигнуто путем выпуска частично стерилизованных насекомых, облученных радиацией в оптимальных дозах. Однако, в первом поколении эффективность генетической борьбы существенно снижается по сравнению с полной сте-рилизацией, особенно в случае выпуска насекомых без разделения полов.

Работы по созданию генетического метода борьбы, проведенные на мельничной огневке за последнее десятилетие, создают необходимые предпосылки для дальнейшей более глубокой разработки метода частичной стерилизации этого объекта. Одним из возможных направлений этой работы являются исследования разных агентов, индуцирующих стерильность, в частности, алкилирующих соединений, применение которых в отличии от радиации не требует дорогостоящего и труднодоступного оборудования для облучения. Другое направление связано с тем, что частота индуцированных генетических повреждений может быть модифицирована дополнительным действием экстремальной температуры. Этот эффект был изучен на Drosophiia melanogaster при индукции мутаций радиацией и химическими мутагенами (Тихомирова, 1964,1974; Анисимов, 1976). Воздействие температуры увеличивает частоту индуцированных мутаций в сперматозоидах и оказывает серьезный повреждающий эффект на ооциты. Это создает возможность для снижения негативного эффекта выпуска самок и сохранения или повышения частоты наследственных изменений в гаметах самцов, положительно влияющих на эффективность генетической борьбы.

Цель и задачи работы. Целью работы является научное обенование эффективного и реалистичного варианта генетического метода борьбы с мельничной огневкой путем

частичной стерилизации насекомых хемостерилянтами при дополнительном действии повышенной температуры.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить действие повышенных температур, разных доз хемостерилянтов и их комбинаций на основные показатели репродуктивного потенциала (половую активность, плодовитость, выживаемость, соотношение полов) у обработанных самок и самцов, а также у потомков от обработанных самцов.

2. Разработать метод и оценить конкурентоспособность обработанных самцов мельничной огневки и их потомков Р1.

3. Подобрать оптимальное сочетание температуры и дозы хемостерилянта, при котором стерильность самок будет максимальной, а конкурентоспособность обработанных самцов и их сыновей затрагивается в минимальной степени.

4. Оценить потенциальную эффективность выпуска в природную популяцию насекомых, подвергнутых комбинированному воздействию хемостерилянта и повышенной температуры.

Научная новизна работы. Впервые на мельничной огневке проведено комплексное исследование действия хемостерилянтов (тиотэфа и диматифа) с дополнительным действием экстремальной температуры на основные показатели репродуктивного потенциала у обработанных самцов и самок, а также у их потомков Р1. Применена методика индивидуальных скрещиваний в родительском и первом дочернем поколении, что позволило выдвинуть ряд предположений о механизмах действия хемостерилянтов и температуры в сравнении с ионизирующей радиацией. Отмечен уникальный эффект температурное воздействие на интактных самцов вызывало снижение в 2-3 раза плодовитости самок в их потомстве Р1. Отработана методика оценки конкурентоспособности самцов мельничной огневки, прошедших обработку хемостерилянтами и повышенной температурой.

Практическая ценность исследования. Подобрано оптимальное соотношение дозы хемостерилянта и температуры, при которых конкурентоспособность обработанных самцов

Е.киеИгиеПа и их потомков Р1 затрагивается незначительно, а эффекты наследования стерильности (НС) проявляются сильнее, чем в случае применения только стерилянтов. С помощью компьютерных экспериментов показано, что дополнительное действие температуры после обработки хемостерилянтами может обеспечивать существенное снижение численности популяций вредителя при относительно низкой норме выпуска частично стерилизованных самцов к природным (9:1). Воздействие повышенной температуры на обработанных стерилянтом насекомых вызывает значительное снижение репродуктивного потенциала стерилизованных самок и увеличивает сдвиг в соотношении полов в сторону самцов, что открывает возможность для выпусков частично стерилизованных насекомых без разделения полов. Это позволит не затрачивать средства на системы автоматического разделения полов у мельничной огневки и делает использование метода выпуска частично стерилизованных насекомых более реальным в практическом отношении.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ БОРЬБЫ С ВРЕДНЫМИ НАСЕКОМЫМИ

1.1. Метод стерилизации.

Метод половой стерилизации является наиболее распространенным вариантом генетического метода, который не только апробирован в научных экспериментах, но и доведен до широкого применения на практике. Пример искоренения мясной мухи на Североамериканском континенте стал уже хрестоматийным (Snow, 1988). Кроме этого можно отметить значительные успехи в подавлении численности или искоренении природных популяций средиземноморской плодовой мухи в США и Аргентине (Mclnnis et al., 1994; Escobar et al., 1998), карибской плодовой мухи во Флориде (Holler, Horris, 1993), хлопковой моли в Аризоне и Калифорнии (LaChance, Klassen, 1991), яблонной плодожорки в Канаде (Calkins et al., 1998), цитрусовой мухи в Китае (Huasong et al., 1998).

Метод стерилизации насекомых (Sterile Insect Technique -SIT) основан на индукции большого числа доминантных летальных мутаций (ДЛМ) в половых клетках насекомых. Для индукции ДЛМ используют ионизирующие излучения или хемостерилянты (в основном алкилирующие соединения). Стерилизованных особей выпускают в природную популяцию, где они спариваются с нормальными насекомыми. Потомство от этих пар гибнет как правило на эмбриональной стадии развития в результате реализации ДЛМ. Эффективность метода во многом зависит от способности стерилизованных насекомых спариваться. Они должны обладать нормальной половой активностью и успешно конкурировать с природными особями. Часто полностью стерилизующие дозы облучения или хемостерилянтов угнетают жизненные функции организма, снижают половую активность и способность отыскивать особей противоположного пола в природных условиях, т.е. снижают конкурентоспособность (Анисимов,1985; Knip-ling, 1982). Снижение половой активности выпускаемых насекомых существенно увеличивает стоимость метода стерили-

зации, так как возрастают нормы выпуска стерилизованных насекомых. Их число должно в сотни, а иногда и в тысячи раз превышать число природных особей. В ряде случаев эта проблема решается за счет оптимизации методов массового разведения. Кроме того учитывается стоимость потерь от данного вида вредителя и затраты на традиционные методы защиты, необходимые для снижения численности. Примером рентабельного применения SIT может служить программа борьбы с яблонной плодожоркой, которая реализована в Британской Колумбии. Стоимость биоматериала в рассчете на 1 га на 20% дешевле |

г

обработок инсектицидами (Dyck, Gardiner, 1992). Аналогичная си-/ туация сложилась в борьбе с хлопковой молью и хлопковой совкой в Калифорнии (Сметник, Булыгинская, 1970). Создание рентабельных методов массового разведения и до настоящего времени является одним из важных направлений в разработке и применении SIT (Orozco, Sosa, 1998; Prasad, 1998).

Однако не для каждого объекта можно создать достаточно дешевую систему массового разведения. Другой путь решения проблемы - повышение конкурентоспособности выпускаемых насекомых за счет снижения доз облучения или стерилянта. Выпускаемые насекомые уже не будут полностью стерильны, но зато повысится их половая активность. При этом встает необходимость разделения обрабатываемых особей по полу, т.к. выпускать в природу предполагается только самцов. Выпуск частично фертильных самок повысит репродуктивный потенциал природной популяции вредителя и существенно снизит эффективность метода. Описанию систем автоматического разделения полов у насекомых посвящена обширная литература. Однако, из всего предложенного многообразия теоретических разработок до практического применения доведены только отдельные варианты на единичных видах вредителей. Это - средиземноморская плодовая муха (Kerremans et al., 1991; Hendrichs, Franz, 1992), мельничная огневка (Maree et al., 1996).

Отсутствие систем автоматического разделения полов у большинства видов насекомых и невозможность в целом ряде случаев снизить затраты на массовое разведение заставляет

исследователей искать третий путь повышения рентабельности метода. Это может быть сочетание разных вариантов генетического метода с методом стерилизации. В часности, использование для облучения насекомых, которые уже несут мутации, снижающие их репродуктивный потенциал, но не затрагивающие половой активности носителей (транслокации, рецессивные сцепленные с полом летальные мутации - РСПЛМ). При этом для достижения'полной стерильности нужны дозы в 2-3 раза ни- К же стерилизующих (Steffens, 1983;Ани�