Направленный транспорт оксистеринов-цитостатиков с помощью липопротеиназ низкой плотности

Иванов, Алексей Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Направленный транспорт оксистеринов-цитостатиков с помощью липопротеиназ низкой плотности
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Направленный транспорт оксистеринов-цитостатиков с помощью липопротеиназ низкой плотности"

■. ¿л V.» : \1 .(.'

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК У.пст-лтут биологической к медицинской хикки

На правам рукописи УДК 618-018:577. 161. 2. 011

ИВАНОВ Алексей Сергеевич

НАПРАВЛЕННЫЙ ТРАНСПОРТ ОКСИСТЕРПКОВ-Ц!1?ССТАТИКОЗ С ПСКСЖЬ» ЛИПОПРОТЕИКОЗ Ш12К0Й плотности

(03. 00. 04-биохиния)

Д к с с е р т а ц .1 На со'юкг^-по у:1:'с стелгп:' доктора бчолсггьч эскнх наук, я форнл научного доклада

Иосквз. - iC9Z г.

Работа выполнен! в Институте биологической хинии Российской Акадении медицинских наук

■ Научный консультант: академик Арчакоз А. II.

Официальные оппоненты: член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профгссор Репин Б.С.

Доктор медицинских Баук, профессор Горкин В.З.

Доктор биологических наук, профессор Нарголкс Л.Е.

Ведущая организация: Российский мадицинский университет

Защита состоится " ф ' 1992 г. в /О-часов

на заседании специализированного Ученого совета Д. 001. 10.01 ИЕКХ РАКИ ( 113332, Москва, ул. Погодинская, 10)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЙЕМХ РАИН гю адресу: 119832, Москва, Погодинская ул., д. 10

Диссертация разослана "¿¿О " "у / с— 1392 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук . ПАЕЛИХЛКА Л. В.

® Институт биологической и медицинской хин»!и раин

Содержание

Стр.

Содержание 1

Список используемых сокращений 2

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. 1. Актуальность проблекы 3

1. ?,. Цэль работы 4

1.3. Задачи исследования 4

1. 4. Положения, Бь;прс1шыч на защиту 5

t. 5. Научная новизна и практическая значимость работы 5

1. Б. Публикация результатов исследования Б

1. 7. Апробация работы 6

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Вещества к реактивы 7

2. 2. Биологические объекты 7

2.3. Методы исследования повреждения мембран 7

2.4. Методы приготовления липидных дисперсий 8

2.5. Методы исследования лкпопротеиноз и липидных дисперсий 9

2.G. Биологические испытания липидных препаратов 11

3. ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА К МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДНЫХ ДИСПЕРСИИ. СЕЛЕКТИВНО ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С ЛПНП.

3. 1. Диспергирование стерин-содержащих липидных скесей 12

3. 2. Оптимизация нейтрального ядра сложной лкпидной мицеллы. 14

3. 3. Математическая модель сложной липидной мицеллы 15

3.4. Встраивание оксихолестеринов в липидныв препараты 17

3. 5. Получение стабильных липидных препаратов 17

4. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИПОПРОТЕИНОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ С ЛИПИДНЫХ МОНОСЛОЕМ

4. 1. Влияние содержания холестерина в монослоэ 13

4. 2. Влияние поверхностного потенциала конослоя 19

5. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИПОПРОТЕИНОВ ГОПЗМЫ КРОВИ С ЛИПОСОМАМИ

5.1. Исследование методом электрофореза 20

5. 2. Исследование препаративно-аналитическими методами 21

5. 3. Исследование методом электронной микроскопии 22

5. 4. Исследование in vivo 22

6. ИССЛЕДОВАНИЕ ЕЗАИКОДЕЙСТВИЯ ЛИПОПРОТЕИНОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ СО СЛОЖНЫМИ ЛИПКДНЫМИ МИЦЕЛЛАМИ

6. 1. Исследование нетодом электрофореза 23

6. 2. Исследование методом гель-хрокатографии 25

7. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СТЕРИИ-СОДЕГЖАЩИХ ЛИПИДНЫХ ПРЕПАРАТОВ.

7. 1. Исследование на клеточных культурах in vitro 26

7. 2. Исследование взаимодействия с мембранами эритроцитов 29

7.3. Исследование на клеточных культурах in viro 29

7.4. Исследование на иммунокомпетенткых. клетках 31

7.5. Исследование на кроликах с гнперхолестеранениой 33

8. МЕТОДЫ, РАЗРАБОТАННЫЕ В ХОДЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. 34 3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ' 42 10.ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 45

11.СПИСОК ОСГЮВКЫХ" РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 45

Список используемых сокращений

лпнп - липопротеикы низкой плотности

лпвп - липопротеикы высокой плотности

лпонп - липопротеины очень низкой плотности

X - холестерин ч

ФЛ - фосфолялиды -

Х/ФЛ - мольное отношение холестерин/фосфолипида

ПААГ - полиакриланидный гель

тг - триглицериды

хт - холестан-3,5. В-триол

ФХ - фосфатидилхолян

уз - ультразвук

БАВ - биологкческх активные вещества

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Направленный транспорт гидрофобных

биологически активных веществ (БЛВ) с использованием липопротеинов низкой плотностл-"ГЗШНП) я качестсе природнъа: переносчиков является перспективный направлением научных исследований в области биохинин липопротеинов. Особенно актуальный является поиск возможных путей селективного введения БАВ с помощью липвдых препаратов в состав ЛПНП н изучение физико-химических свойств последних. Это обусловлено тем, что результат подобных исследований могут быть в дальнейшей использованы при разработке липидных препаратов медицинского назначения. В настоящее время разрабатывается 3 группы подобных препаратов (Archakov, 1989):

1) препараты для коррекции нарушений лкпидного-обмена на клеточном и мембранной уровне (например препараты для коррекции обмена холестерина с целью лечения атеросклероза и его осложнений):

2) препараты для репарации поврежденных клеточных мембран и восстановления их функции (например для профилактики и лечения заболеваний печени);

3) препараты для направленного транспорта гидрофобных ВАВ (таких как цитостатики и иммунодепрессанты) в клетки-мяшени с еысокой избирательностью и минимальным побочным деЕствием; в том числе цитостатическяе препараты. содержащие холестерин и его биологически активные оксипроизводные.

Как известно, ЛПНП плазмы крови играют ключевую роль в системе транспорта липидов в организме. Поэтому представляются актуальными работы по созданию липидных препаратов недгдинского назначения, моделирующих транспортные функции ЛПНП. Данные препараты, относящиеся к последней группе, иогут бить использованы в качестве носителей водонерастворимых биологически активных веществ (в тон числе холестерина и его оксипроизводных).

Известно, что ЛПНП связываются и поглощаются клетками организма с помощью апо-В рецепторов (Brown, Goldstein, 1936). В последнее время обнаружено, что в клетках некоторых типов опухолей наблюдается значительно более высокая активность рецяпторного механизма поглощения ЛПНП (Но et al., 3.97В; Gal et al., 1981). Этот факт отмечен например при остром мкзлсгекнзм лейкозе к опухолях натки. В, связи с этик ряд исследований (Vitols et al., 1984; Masguelier et al., 1936) посвящен попытка:! использовать ЛПНП з качество средства доставки цктостатиков в опухолевые клетки-нишенп (ряс.!). Е данных работах проязсоя::лось встраивание

цитостатиков в выделенные из плазны крози ЛПНП с последующим введением модифицированных ЛПНП в организм. Исследователям приходится решать ряд сложных проблем при реализации данной схемы: сложность процедур препаративного выделения ЛПНП в чистон виде и встраивания в них цитостатиков, низкая стабильность in vitro получеккых модифицгрованных ЛПНП, проблоны стерилизации препарата, реакции иммунной системы организма при введэнии белок-содержащего препарата к др. Т.о. поиск более простых путей использования ЛПНП для транспорта цитостатиков является актуальным.

лизосома

цитостатик -» ЛПНП-> аПО"в -.> опухолевой

рецептор *леткя

Рис. 1. Схема использования ЛПНП в качестве средства доставит; цитостатиков е опухолевые ¡'лвткл-кйшвни.

Нами был предложен другой вариант использования ЛПНП в качестве средства доставки - вводвние цигостатика в ЛПНП in vivo, осуществляемая с помочь» безбелкового липидного препарата, содержащего цитостаткк и способного избирательно взаимодействаЕать с ЛПНП непосредственно в плазме крови.

В связи с вышеизложенным становится ясной актуальность проведения работ по исследованию возможьых путей селективного взаимодействия стерян-содержащих липкдных препаратов с ЛПНП непосредственно в крови.

Цель .работы: Разработать пути направленного транспорта оксистеринов, обладающих цитостатическими свойствами, посредством их селективного Еведения в липопротеины низкой плотности.

Задачи исследования:

1. Исследовать взаимодействие липопротеинов плазмы крови с модельными липидныиа системами \пу.пк дные нокослои, липосомы, мицеллы) с целью поиска зозконных путей направленного транспорта оксистеринов и других гидрофобных цитостатиков с помощью липопротеинов нязкои плотности в качестве природного переносчика.

2. Разработать группу липидных препаратов, способных при помощи избирательного взахиодействия осуществлять направленный транспорт холестерина и его окисленных производных в липопротеины низкой плотности.

3. Разработать стабильный бездетергентный мицеллярный липкдкый препарат, моделирукгзнй стерин-транспортную функция ЛПНП.

4. Создать математическую модель сложной липидной мицеллы, являющейся основой бездетергентного мицеллярного липядного препарата, э. Исследовать цитостатические и мммукокодулирукэдаэ свойства с-херин-содержащих липидных препаратов.

Положения, сыкосиныэ из защиту.

1. Обнаружено, что введение высоких концентраций холестерина или его аналогов в состав лкплдных монослоев," липосом или мицелл приводит к появлению высокой селективности у.х взаимодействия с

•.ЛПНП, по сравнению с другими классами липопротеккоз.

2. Показана воз'козкность осуществления напрлв.ч&нкого транспорта .оксистеринов-цитистатиков путем селективного введения их в ЛШ1П с помощью стерик- содержащих липидных препаратов.

3. Создана стабильная бездеторгентная мицолляргтая форма липидного препарата, селоктнзно взаимодействующая с ЛПНП, на основе которой была разработана группа липидных препаратов, обладающих цитостатическимк и им.чукомодулирующими свойстваки.

Научная новизна и практическая значимость рабош. В работе впервые проведено систематическое исследование взанкодойствия липопро-теинов плазмы крови с липидныки монослоямк, лилоссма.чн и мицеллами с целью поиска возможных путей селективного введения гидрофобных цитостагиков в ЛПНП с помощью липидных препаратов. Показано, что введение высоких концентраций холестерина яля его аналогов в ■ состав липидных ионослоев. липосом и кицслл приводит к появлению высокой селективности их .ззаинодойстзия с ЛПНП, по сравнению с другими классами липопротеинов/ Разработана новая группа липидных препаратов (липосомы, мицэллы), которые способны селективно взаимодействовать с ЛПНП в плазмо крови и обладающие цитостатическики свойствами. Предложена катехатяческая модель, описывающая сложную трехкочпонентную липиднуп кицеллу, являющуюся основой нового бездгтергентиога ккцеллярнаго пгпидиого препарата. Предложен путь введения биологически активнж веществ з состав ЛПНП с гсомощаи лнлкдньп: препаратов, селективно взаимодействующих с лгош непосредственно з цельной плазхе кров« как in ritro, так и in vivo. Раара-бстая способ получения биэзегич ссии активных оксипраязвсдчъгх холестерина по С7 путей окисления холестерин?, на поверхности перфторуглеролно.З знульсии. Разработан ряд иэтедов анализа липидного состава и диагностики карупзигй липидного обмена на уризг.е липопротекпозз плазки крови к- клетсч!25х мембран.

Публикации результатов исследования. Результаты работы опубликованы в 61 печатной работе в журналах: Антибиотики, Биол. мембраны. Биофизика, Вюлл. зкел. биологии и кедицины, Вопросы мед. химии. Доклады АН СССР, Кардиология, Прикладная биохикия и микробиология. Фармация, Хин. -фарн. журнал. Biomedical Science, FEBS LETTERS,

"л

Nature. Отдельные части работы опубликованы_ в материалах Всесоюзных и Международных симпозиумов и конференций. Часть данных включена в книгу "Phosphatidylcholine (Polyenephosphatidylcholine /РРС): Effects on Cell Membrane and Transport of Cholesterol". -ed. A.I.Archakov, X.-J.Gundemnann. - wbn-Verlag Bingen/Rhein. -1989. Получено 5 авторских свидетельств на изобретение и 2 отраслевых рац. предложения.

Апробация работы. Результаты работы быки доложены или представлены и обсуждены на Всесоюзной конференции "Липида биологических ионбрак" (Ташкент, 1S30); Всесоюзном симпозиуме "Липосомы и их взаимодействие с клетками и тканями" (Москва, 1981); конференциях МОИП "Новые эксп. подходы к изучению работы биол. систем" (Москва, 1979) и "Бксл. системы в разных условиях" (Москва, 1980); Всесоюзной конференция "Сорбционные методы детоксикации в клинике" (Минск, 19S3) ; Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана внутренней среды человека" (Москва, 1985); Международной конференции "Internacional conference on preventive cardiology" (Moscow, 1985); Международном симпозиуме по гемосорбции (Киев, 1986); XXX Всесоюзной совещании по транспортный АТФазак "Ионный гомеостаз и влияние факторов внешней среды на жизнедеятельность клетки" (Иркутск, 1987); Всесоюзном симпозиуме "Химик белков и пептидов"- (Таллин, 1987); Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов (Алма-Ата, 1987) ; Международной конференции по фосфолипид-ным препаратам "Phosphatidylcholine". (Polyenephosphatidylcholine /РРС): Effect on cell menbranes and transport of cholesterol", FRG, cologne, 1988); Всесоюзном симпозиуме "Реконструкция, стабилизация и репарация биологических мембран" (Благовещенск, 1989); IV Всесоюзном съезде патофизиологов "Нарушение механизмов регуляции и их коррекция" (Кишинев, 1989); IX Советско-Индяйскок симпозиуме "IX Sov.-Indian Syap. on the chemistry of natural products" (Riga, 1989); X Симпозиуме биохинических обществ СССР-ГДР "Механизмы регуляции клеточной активности" (Ташкент, 1989); Всесоюзном совещании "Актуальные вопросы разработки к применения эмульсий перфторуглеродов" (Пущнно, 1SS0).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Вещества и рёапяипы. В работе использоват: дицетилфосфат. холэстсрин С X), 7-кетохолестерин (7-кето-Х). 25-гидроксихолестерин (25-ОН-Х), S-кстохслостанол, холестан-3/3, 5а, Gg-тркол. слеат холестерина, соевый фосфатидилхолин (ФХ), сфингонЕелпн ("Sigraa:l, США); соевым ФХ С "Rattenaann". ФРГ? ; яичрыЯ ФХ (заа. бак. пр., г. Харьков) ; этклогыЛ, изопроппловий, к^.пронивый, палькитгнозый зфиры холестз-рина, Hepes, Iris ( "Calbiochera", СПА) : тритон га-1333, тзин-SO, ТрИТОН Х-100 ("Serva", с-РГ) ; голотоксин А , ГОЛОГурИНЫ А, В и С, аненокотоксины КТХ и котру.диолкзин (ТИЕОХ ПВО АН СССР); наборы для анализа хслэстсрина, триглицеридсв, фос^олипидэо, обших липкдов, лац:«тина, сфк:1Госиел::!та, общего белка, контрольное сыворотки в калибраторы для биохимического э.втогпаякза (•"Eoeiiringor Mannheim", í-РГ) ; Ssphadcx G-50, Sephrose 4B-CL ( "Phansacia Pine Chanicals", Швеция). 7-пероксихолсстерин (7-OOH-X) был получен путем окисления холестерина кьхпородам на поверхности фторуглеродной эмульсии (ИЕанов и др., 1930). 7-гидрокскхолестеркк (7-ОН-Х) был получен из 7-ООН-Х ко методу íCunninghan, 1974). Другкэ вещества и реактивы были квалификация х. ч. или ос. ч.

2.2. Биологические объекты. Эритроциты кролгта получали из гепари-низированной крови 3-5 промывкой 0,9% исС1 к хранили при В°С в средз: ISO i;M w=C!, 0,1 мИ КС!, 10 кН глакозы, 1 МЕ/нл пенициллина, 5 кК Нерм-!.гЬ, рН 7,4. Эритроциты человека получали из донорской крови разбавленная 1:10 раствором NaCI (0,3%) с последующей отмывкой как описано для зрктрсцитоз кролика. Т-линфоциты человека получали таю?е кз донорсксЕ крови по методу (Петрова л др., 19S45. Италии зкеперкнзпталыих асцитных опухолей (лейкоз L3 210, гепатона Зайделя, опухоль Эрлкха) были получены из ВОНЦ АНН СССР. Экдогэляоииты человека зыде.чзли из пупочкой взны человека. по катоду (Antonov et. al., 1SR6). Культуры клеток китайского хомячка лккчи. Bll-dii FAK28 :: культура клеток Acholeplzsx.K laldlnwii были получены кз ККГ АКЯ СССР и ПЕИФХМ КЗ РСФСР соотзатстпзгно. Сыеоротка герое« челоэ^ка была получена из крови здорогых докаро:: с ссл--р:::о.и;:е:? обхъга X Í7G¿20 нг/дл, тригл::цер:;Д!)и (ТГ) l¿b±?.S мг/^ч ;; холегггзрипг1- ЛГ'ЗП ÍRtl2 мг/дл.

2, 3. испп^Совапи:г г.оир.гяЗ^ния кле.юочп': нггтбран. :<знесзн!.з

прочплаз:-;:>стч для ггоноз пр6зод:-,юсг. с понп™'л \етола

бислойь-oD: лкпг,7Н1СГ . кчибргч (ЕЯМ) :г исносзпектлвкь::; эиектро;-.СБ (Антоноз, Исаков ;; др., 197fí). ВЛИ фори!«раг>и::1 по изтелу (Мм11ег et al., 1964). Измерения транскембракного тока проксд::лк при

фиксации потенциала (Tien, 1985). В ряде экспериментов получаемые данные обрабатывалиь с помощью ЭВМ "EMG-666/Bn в режинэ "on-line". Для оценки проницаемости клеточных нембран для более хрупких молекул регистрировался выход из клеток вещестЕ. поглощающих з ультрафиолетовой части спектра (2S0 нм) (Аиисимов, Иванов и др., 1901), а также выход гемоглобина из эритроцитов. Для.ч определения 100% выхода гемоглобина производили полный лизис эритроцитов с помощью голотурина С (Иванов и др., 1S85). Определение гемолитической активности веществ и препаратов проводили на эритроцитах кролика в стандартных условиях. За одну гемолитическую единицу (Linder et al., 1977) принимал;, такое количество вещества (препарата), которое вызызало ЗОЙ-вык гемолиз в 1,0 мл 0,7;>ной суспензии эритроцитов кролика за 30 мин при 37°С.

2.4. Методы приготовления липидных дисперсий. Дмспаргкровав,;: липидое проводилось с помощью ультразвука (УЗ) ультразвуковом диспергатора "Sonic-ЗОО" ("Fisher", США) при кощьнссти от 2С0 до 300 Вт и частоте 30 кГц. Приготовление липосон для регистрации ионной проницаемости проводилось по методу (Banghani et al., 1965) в среде: 100 кМ KCl, 1мМ Hcpst-lrU, pH 7,4. Пер^д использованием суспензии липосок пропускали через ядерный фильтр (0,6 ш<м) и затем через ссфадекс G-50 (Иванов и др. , 1977). Содержание иоков К* в липосомах определяли по его выходу из липосом при действии голотурина А (Иванов и др., 1981). Приготовление липидных дисперсий, содержащих пальмитат холестерина, проводили по методу (Brecher et al., 1976). После высушивания липидов и добавления среда формирования схесь обрабатывали УЗ при температуре вьше фазового перехода зфхра I, центрифугировали при 12.ООО g 30 хин и фильтровали через фильтр N 54 ("Whatman", Англия). В ряда случаев в качестве эмульгатора был использован Triton WR 1339 (Иванов и др., 19S5). Полученав липосом с высскин содержанием холестерина проводили путек высушивания под вакуумом снеси Х/ФХ/дхцетилфосфат (2:1:0,09 по холям) к суспендирования в средо: 150 мМ MoCI, 10 Mil Irii-KCI, pH 7,4. После кщц<б!щиз (1 'Час, 37"°С) смесь обрабатывали УЗ (225 Вт) при 4°С, • Tjpn 2.0,00ftvg,"* 1 ..час и

пропускали через ■ ядерный - фильтр •' (0,2 tfkM). П]Ь-иготодСяеяие сложных липи'дкых - х ¡ш-ЭДя 'пр-одо ось- ■ и ¿.'си ее и х/срезь'Л .^ï/çuaehï'a х ( или триолеин) в разйгчных казыье:- роотяо'пвйилх. Сйесь т.:куЬ&вапи, суспендировали в среде:' 150 _мМ NoCl, 10 иИ Iris-HCl. pH 7,4, инкубировали СЗО мик, 37°С), обрабатывали УЗ (30 кин, 225Вт) при 55°С, центрифугировали (20. ООО g, 1 час) и пропускали через

ядерный фильтр (0,2 нкк) (Williams, Scanu, 1935]. Мицеллы, содержащие окисленные производные X, готовили аналогичный способон, заменяя X друг;:н стеринок. иилобклгзапяя липидного ноноспоя, проводилось путен вымачивания сорбента полихрок-I в этанола, занаценкя растворителя на зтаноль'мЯ раствор ляпидов и промытжи полной средой.

2. 5. НгтаЯы исследования лапопропеиноз г; nunvâsux диспгрсий. оеогснгатиакые методы анализа липилоз з зарзацте макроанализа проводилась на биохимическом анализаторе? :,CentrifiCheK-400" ; "Dakor", СЯТА). Общий и свободный 1 анализкрозалмсь по методу (Noel et al., ics3) л (Allain et al., 1p74), тркглкцеркдч - по методу (Биг-olo and David, 1973), fx - по кетогу ( Schrisa'ar et al., 13e3), сф:1нгомл?ллн - по mbto.ij (Blaton 3t al., 1953), холин-содорггащке фосфолиляды - по методу ( Ctabe at al., 1э81). Седикзнтацдзннмй анализ лкпопротзяноч и липклгах дисперсий проводили ло метода' ( Brewer and Bronzait, 1977) с ломояые центристу гирояанчя па ультрацентрифугэ с воздушным приводом "Airfuge" (ротор А-100) фирмы "Beckrcan" (CSA) при 160.000 g э течение 2,5 часов с последующий фракционирование): на фракционаторе "Airfuge Tube Fractionator" то" ф:;рны. S какдоЯ фраяцяк, последовательно отбираемой по вксотз ггробиркк, определяли монцс-нтрац'чэ холвстертп:?-и фосфо/шпндоз как опкеано эыпе. Прецкпятацзоизов разделениа липопротеичьэ проводилось по методу ( Bu:rstein et al-, 1970) с использованием реактива, содержащего фосфоркззсльфракозую кислоту и МпС!,. Препаратп'.'нов получения фракции ЛИТ"! сизороткк xposx человека п рооодчли с помор.-.-» ульграцс!лрифу»лровзнкя в растворе NcBr при г.'лстностч 1.019-1,033 ( Lir.dgre-т ^t al.r 1972). Посчзлукэдее удаление KeBr »? БидеяаппсЯ Фрахакя г.рокззодклосъ с ломоцью Д'илиз-а ч растворэ О, 9'/. NuCb S рг.бото был использован сп5:<1ротурбк.с~ьотркчзский метод анализа дисперсных сестру. позво-лакщкй определять средний размер частот, нассо-об-ьахнугэ :: чкелозур коицеятргцкт чхотчц ( Клетгч" я др. , 1077). Метод основан на пз:герожу к ;:атем&'. »-¡зехо? o5;jc.co?Ke спектра нутнсстм суспензии. Зазисыюст- п;:отност:1 от »кгггг serai casra. onKovieaeîcs

сл^ лумч".: :j!..par:'îb'.;Gii: .0 — /. ■ где D - ехтгч о ска к ;тпе"нсс;ть.

Л - KoacTfiîiva ,аля днгК'ого >.'п^.:трз.чь»-ого ».»тегарздл, Л - дя'пгь. г.кы сгата, а - зссиэ^лС cxcaovaav. Прг'нич:::!-?"'!- ;:зтоло cjeKvpi. уугтгостя ,кгя дксиерся." (лчг;с;ск:! :: иилз

подтверждена специальны»; контрольным л сраз«еч-:ч с

кетовом оптического смешения (лазерный "Colter

"Coultronics", Франция). Анализ методом спектра нутности проводился путей сзмерения оптической плотности дисперсий в диапазоне or 400 до 600 ни. Математическая обработкапроизводилапсь на ПЭВМ типа IBM-XT с помощью Бейсик-программы лаборатории БМФй ИЕФРМ АН СССР (Цзголев, Хлебцов, 1984). Качество липидов, используемых в работе, а также их окисление выходе экспоркнентол контролировалось по наличию продуктов окисления.' Лля количественной оценки использоЕался так называемый индекс окислёкности (Klein

et al., 1977): I. О. = D /D , где I.O. - индекс окислениости,

208

D и D - оптическио плотности раствора фосфолнпида в кетаноле при 233 и 208 ни соответственно. Поглощение при 233 ни указывает на наличие диенавых коныогатов (Stoffel et al-, 195S) . В ряде экспериментов для количественной определония продуктов нерекпсиого окислония липидов в образцах была ислользогапа рлаюция с тиобарбк-туровоП кислотой (Гаврилов, 1987) с последующий Ьаресчетон на количество малоноЕого диальдегида. Электронная микроскопия липидных препаратов была выполнена на сканирующем электронном микроскопе "Hitachi s-570" (Япония) в лаборатории электронной микроскопии НИИФХМ КЗ РСФСР. Электрофорез липопротеинов сыворотки крови проводили в 4-х слойном полиакрилаклдном геле (ПААГ) с предварительным окрашиваниен нативных образцов Суданом черным В (Маграчева, 1Э73). После проведения электрофореза гели сканировали при 595 нм. Данный метод был использован для исследования взаимодействия липопротеинов с холестерин-содержащими липосомами. Так как липосохы имеют большие размеры, то они не входят в 3%-й гель и остаются на старте. Их взаимодействие с лап'опротеинами может быть обнаругено либо по изменению злектрофоретической подвижности последних (в случае модификации липопротеинов), либо по их задержке на старте (в случав связывания с липосомами). Тонкослойная хроиатография окисленных производных холестерина (Saith et al., 1967) проводилась на пластинах "Silufol" ("Kavalier", Чехословакия) и пластинах "HPXLC" ("Mark", ФРГ). Гель-хрокатография яипопротвинов и ,лидидных дисперсий, проаодилась на сефарозе . 4B-CL (колонка '50x1,,6", Си, объем образца 0,2 мл, скорость протекания буфера 0,2 нл/мкн). Анадкз' -л'ииидов и других компонентов в получаеиых фракциях проводился хё-тодами • тонкослийкой хроматографии и биохимического автоанализа как ■ одиса};о . выще. Никрозлектрофорез липосом (Banghan, 1958) был использован для оценки поверхностного потенциала ноно- и бислоев по величине злектроккиетического потенциала ( (-потгмиап, не) : 1 » t-ti*v/c,

где т) - вязкость среды, V - электрофоретячоская подвижность частицы ( мкм-сок"'/В'С""1'. с ~ диэлектрическая постоянная среды. 2.6. Биологические испытания пипид:;их препаратов. Для оценки :шму~ нодепрессивного действия липидных препаратов была использована реакция розеткообразования Т-ликфсцитов человека с зрятроцитани барана (Петрова и др., 1984). Для каждого образца подсчитызалссь но кензэ 100 ллкфецитов и торможение розетксобразования (Т) расчитывалось п процентах по формуле: Т - (И^ - Ы) • 100 / Н^,, где М,. а N - количество розеток, приходящееся ка 100 лимфоцитов, в контроле и эксперименте соответственна. Противоопухолевое действие липкдных препаратов исследовалось па ряде зкеперимэнталыых опухолей. Лейкозный дтамм 1,1210 поддерх!ИЕалс.<: на мышах 03\/2, а эксперименты проводились к?, гибридах ВБг^ (Со1д3.п гЬ а1., 1965). В контрольных группах животные погибали на 12-14 день. Исследуемые препараты вводились животным через 24 часа после перезивки опухали. Определялась увеличение средней продолжительности жизни (ДТ): ЛТ - (Т - Т,,) • 100 / гдз Т и Т., - средняя

прояол-/яитэльность жизни животных в эксперимента я контроле соответственно. Штамм асцитной гепатомы Зайделя поддерживался па беспородных крысах. Контрольные группы животных погибали на 13-17 день. Испытания препаратов проводились по методу (^ап:^ еЬ а1., 1589). Противоопухолевое действие препаратов оценивалось такжо по увеличении средней продс.-мпгтельностп жизни. Эксперименты с культурой рндотелчалькых члеток человека проводились совместно с отделен клеточной биологин ВК.НЦ АПН СССР. Эндотелиоциты выделяли из пупочной чина человеке», по нетс>ду (Ап'Ьспо'/ н 1., 1986). В эксперименте ьспользсЕа.".?. первичную культуру клеток в состоянии конфлуентчогс монослоя. Действие препаратов оценивалось по числу жизнеспособных клеток посла ЗА-часоно? инкубации з процентам от контроля. Эксперименты с культурой клеток ЛсЪо1е.р1азта 1гЛс11а1гИ проводили соечсстхно с лабораторией клеточка культур ШГКМГ. МЗ РСФСР. к.чйточну» культуру ЕЬ'рзщквяли в модифицированной ерэде Эдварда. В эксперименте з культур?.л1_иую среду добавляли липидмые препараты а у.аиочпся ксэде-:тр?цис 1 ебст::: лиш; дос/нч. Дкнакику клеточного . рост? оценивал:: по светопоглогш'по при 040 им. Эксперименты с культурен клеток :<т:тс.:1с;:ого хэк.тчка линяч 517.-cii.i-РАР28 проводили совместно с Сечгорси эволюцчеч^о? пптогэронтологии Биологического факультета МГУ. Испытания прнпчр^топ проводили по )!етоду (Хохлов к др , 1390). Дейстзир препаратов на клеточный рост оценивали по копичеству и размеру клеточных ::слоний. Э:;сперименты

с культурой клеток эрлиха проводили совместно с лабораторией биоиспытаний ТИБОХ ДВО АН СССР. В работе использовали 7-дневную культуру. Действие препаратов оценивали по торможении включения 3К-тинидина в кислотонараствориму» фракцию клеток.

3. ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА И МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ ЯШШДНЫХ ДИСПЕРСИЙ, СЕЛЕКТИВНО ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С ЛПНП. 3.1. Диспергирование стерпи-содержащих липидпих смесей. Нами был исследован процесс УЗ диспергирования липидных снесек, содержащих высокие концектрацье стерика, для получения стерли-содержащих липосом а сложных липидных ккцелл. На рис.3.1 приведена зависимость среднего радиуса частиц от времони обработки липидкой эмульсии УЗ.

Средней радиус частиц (нм)

200

100

Рис. 3.1. Зависимость срэдкэгс радиуса стерин-содсрдащз;х частиц от времони обработка эмульсии ультразвуком.

1 - липосокы,

2 - сложные липкдные мицеллы. Кощкость ультразвука 223 Вт. Обьеи образца 30 нл.

Липидный состав (мол. %)

липид Липосомы Мицаллы

ФХ 50 40

X 50 40 ,

тг 0 20

О______ 60 120

Вромя (мин)

Видно, что средний радиус частиц стерин-содержащих эмульсий (липосон и мицелл) практически достигает минимальных разнеров за 20-30 мин УЗ обработки. Используеная моиьность УЗ (225 Вт) является оптимальной, так как при ее уменьшении значительно увеличивается как время, необходиное для диспергирования стерян- содержащей ляпвдной снеси, так и степень йкхсг.эния лкпидоь (рис. 3.2). Увеличение иоэдьности УЗ свыше 225 Вт даедсдят чсакже к повышенному окисл егайа липидов и коагуласг* образца асладствак нарушения температураого р'емй»на. %

На рис. 3.3 представлены данные об оэтгспоняи ФХ и X в мицеллярной суспенз»! г.ри обработке ■ УЗ. Как видно из рисунка, наблюдается заметное окисление как ФХ, так и X в процессе УЗ диспергирования стермн-содержащей мицеллярной суспензии. Введение

в состав липидных мицелл токоферола в качестве антиоксиданта позволило снизить до минимума окисление липидов.

Ъ ( мин)

120 -1-.--,-0.5

(°гз/П2ое'

О »

\ 1

\ \

о \ 2 \ V

■ 2 Ч

100 200

Мощность УЗ (Вт)

Ркс. 3.2. зависимость времени (1) диспергирования липидной смеси' (<И/Х - 1:1 по молями) к степени окисления фосфолипядов (2) от модности УЗ. 0.3 Температура образца:

0.5

0.4

300

0.2

от 4 до 10 С.

С=3 - 1

Е23

ум

2 3

0.0

0.3

Рис. 3.3. Окисление ФЛ и X ес врзия УЗ диспергирования икцел-ллрной эмульсин при различной концентрация токоферола.

1 - малоносый днальдег.чд, к - ккноль/я;

2 - диеносые коныогаты,

3 - окнслоп:ь;е произзодггыэ X, к - ати. ед.

Мощность УЗ - 225 Вт, 0.6 зремя днспергирозания 30 мин.

Мй

Концентрация токоферола (кг/мл) Вместо применения ау.тяокскдантэ. для уизльшзккя окчслакк.ч лип::да2 УЗ дтюпЕргярздгнчв стерин-содерж?пиг; зму-пьскй проводили в атхосфсре аргона, а таг-гев в ряде случасг испояьзовали дяспоргатор высокого давлояия "До::ср- 1

Т. о. (Тчто спределыы сп.'пиальгше условия ласпер^'-гросаизя

стерик- содержащих липидных смэсе"! ! 1 с;;:»ьрз.тура, моопость время УЗ дяспергярозаняя. окчслекио яяп:»£Ов) М* получения к*.к л.^посомалькы?1:, так'п миаэллярных сусленз;::?.

3.2. Оптимизация нейшфалъного ядра сложной липидной мицеллы.

Необходимо было рняшть вопрос о выборе нейтрального липида для формирования гидрофобного ядра сложной липидной мицеллы. Данная мицелла похожа по строению на липопротеин плазмы крови и может рассматриваться даже как его безбелковая модель (рис. 3.4).

Рис. 3.4. Схема строения липо-протеина плазмы крови (а) и сложной липидной мицеллы (б).

По аналогии с лкпосротеинами для формирования гидрофобного ядра ногут быть использованы эфиры X и/илк триглицериды. Известно, что взаимодействие некоторых видов липкдкых мицелл с клеточными мембранами может пржводить к повреждению, последних. Нами било показано, что эфиры X, введенные в состав плоских бислойных лкпидных менбран (ЕДЫ), приводят к увеличению ионной проницаемости БЛМ на 2-3 порядка (рис. 3.5, I).

G (Ом^-сн"2)

G (Ои_1-см"г)

v V

о V ° • V

о л

■«Г» о •

/ о -1

Г л - 2

/ • - 3 •

V ' ' - 4 Г

10 20 . 30 40 Эфир холестеря» (цол. %)

""■ 1 -

д « дХ

V jg —*— V

ч о

о — 1

д — 2

« — 3 .

V — 4

■ .......а.

0. 10 20 30 40

Эфир холестерина (кол. X)

Рис. 3.5. Зависимость гррродвности (G) БЛМ из фовфд!»д-итаойяна (I) или снеси фосфаткяг^ояи-н/хой^стерин Til) от содержания эфиров холестерина в мембраЗо-об^азуюдэн растворе.

Показаны средние значения из 10 измерений. Эфиры холестерина:

1 - капроновый; 2 - хзопропиловый; 3 - пальмитиновый; 4 - этиловый.

При этой данный эффект не зависит от содержания холестерина в БЛН (рис. 3.3, XI). Результаты, приведенные на рис.3.5, поставили под сомнение пригодность, эфиров холестерина для использования в качестве основного компонента для формирования нейтрального ядра сложной липидной мицеллы. Необходимо было проверить полученные нами мицеллы на возможное повреждающее действие на биомвкбраны. В качестве тест-объекта были использованы эритроциты кролика. На рис.3.S представлены данные о действии липидных ницелл, содержащих эфир холестерина (пальнитат холестерина) или триглицерид (триолом:). на проницаемость эрнтроцитарнътх мембран для яонсв К+ и гемоглобина (НЪ). Мицеллы, содержащие в caoei: ядре эфир олэстерпт, повреждали клеточную мембрану, что приводило к сыходу эк чоноз, так :! значительна белое крупны:: молекул гемоглобина, яцелл'л, содержащие тригпхцернд, на оказывали заметного повреждающего действия.

Выход яоноз К 5 Hb 1 7.5

100

¿к

> - К"7" 9 ~ НЬт/

. // у/

//'2

1 1 *

3 4

с—о—®

Рис. 2.6. Действие лппадных мицелл, содержащих паяьмитат X илк триоле.чн, на'проницаемость мембран эритроцитов кролика для ионов К+ и гемоглобина (Hb).

1, 2 - мшеллы с пальмитатон xonacTspima;

3, i - нкцеллы с трколеином.

0 2 4-5

Зрукя (часы)

'Г?, к к;: сбразск, из приведенных данкых бил сделан !:ьгаод, что в качестве гидрофобного компонента для получения сложных л::пкдных мицелл лучпе использовать' гряглгцерады, чек эфирн холестерина.

3. 3. Нотегагичесхая коЗепь слоянг.й паг.иау.сй :гл1.елпы.

Дли оп'.'клззацнг. ф;;змт<о-хтанческк.с сззйстз, состава ;; методов получения лктгдшх: препаратов кг. осньэе сложных лкпкд'гьп: ккцелл была. разработана ' математическая медел!-, елгеизаэщая данные иицгллы. 3 основу кадет: загю.дэш. структура сложно."; лппгдной му.целлы (гидрофобное, ядро, некрытое лкпидныя иснсслошО ; данные о геометрии молекул 4>Л, X ч нейтрального лкпида; эффективная площадь сечения нелег-улы С>Л или. х, находящейся в составе лппидного

монослоя при минянальнсм ■ поверхностной давлении. На рис.3. 7 показаны (I) основные элементы модели сложной липидной мицелль;. Математическое описании модели связывает размер мицеллы (радиус) с возможными вариантам» ее нолекулярного строения (содержание липидных компонентов б иол.%). В модель заложено предположение о гексагональной упакоьке лмпидных молекул в 'покрывающем кнцеллу монослое. Предусмотрено ограничение минимального "■ радиуса нкцеллы по пронЕкновенив молекулы води в зазор между тремя соседнкш; молекулами ФХ и/кли 7. прк Солывой кривизне лкпкцного монослоя. Для проведения расчетов с использ звание.1; данной модели была написана оригинальная компьютерная программа. С ее попогдью был:.' получены данные, которы? представлены ка рис. 3. 7 (II) в йкде трехко.мпоненткых нокзграмк. Эти кривые описывает теоретически возможные различные варианты липидного состава для мицелл с одинаковым размером. Точками на рисунке обозначены экспериментальнье даннив, получение прь экспериментальном подборе оптимального липидного состава стерин-содержащего кицелляркого препарата. Предсказания рагработаккоГ; математической нодялл довольно хорошо совпадают с экспериментальный;; результатам!;. Поэтому эта модель была использована в дальнейшем для оптимизация как состава, так и методов получения противоопухолевых М'лцеллярных препаратов, содержащих оксипроизводные X.

Холестерин(мол.х)

Рис. 3.7. Схема строения сложной липидной мицеллы {X), заложенная в математическую модель, и результаты расчетов'"дан!^. ноделй в виде трехкомпонентных нонограмм (II), связыйеющих ' липиаАгй состав мицелл с их размерами. 1 - область формирования липосом; г - область гетерогенных смесей; 3 - область формирования мицелл.

Кривыми показаны теоретически возможные варианты состава мицелл

3.4. Встраивание оксипроигзодных холестерина в липидпые препараты.

Нами быпа исследована возможность встраивания биологически активных оксяпроизводных X в стерин-содержаапг липидные препараты. На рис.3.3 показано встраивание ряда окскстеринов я сложкыо липидныэ мицеллы.

Стерин (мол. %) Встраивания (X)

Холестерин (мол. X)

Рас. 3.8. Встраивание бяологнчее- Рис. 3.9. Зависимость встраивания кк активных окскхолестердцов в оксихолестеркнов в сложныэ кн-

сложиые мицеллы. целлы от уровня холестерина.

1-Х; 3 - 7-кето-Х; а - холвстан-3. 5, 6-гриол;

2 - 5-квтозсолеставол; 4 - 7-ОН-Х; 6 - 25-ОН-Х.

Бидь-о, что практически все оксисгерины удается включить в состав

н:;целл 2 концентрациях, сравнимых с концентрацией X. При зток их

эстраивапив происходит независимо ' от уровня X з мицелле

(рис. З.Н). Ксключчняз составляет только 23-СН-Х, для которого

была отмечена конкуренция с X за встраквангв в кицаллы.

Исследование встраивания оксчпроизводкда X в состав стернн-

содзржаиего липосомального препарата показало, что данные

соединения ксгут быть введены в состав лкпесои в концентрациях до '

30 лол. % путем замещения част;; X.

3. 5. Получение счябильхь'х лидидних препаратов.

Была исследована стабильность мяцеллярноб и липосокальяой форм стерин-содержащих липи'дкых грепаргтоз ирг храиенхи при 4°С. Увепичзкиэ среднего радиуса частиц дкепэрекз свидетельствует об их агрегации :: зезмокно:: слиянии прк хранзнка. Еьгло обнаружено, что введение X в состав препаратов делает более стабильными. Как визко из рис. 3. 10 при концентрациях 7. вг 30 до 33 пол. У. стабильность липосомальной формы препарата (II) достигает 1

месяца, а мицеллярно! формы (X) - более 2 месяцев. Средний радиус частиц (нн)

200

100 -

Концентрация холестерина (мол. 'А)

Рис. 3.10. Зависимость среднего разкера частиц мицеллярного (1).и липосомального (IX) препарата от содержаниях в исходной липидной смеси и от времени хранения препарата при 4 С: 1-0 дней; 2-10 дней; 3-30 дней; 4 - 60 дней.

4. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИПОПРОТЕИНОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ С ЛИПИДНЫМ МОНОСЛОЕМ Удобной ноделыо для изучения взаимодействия лилопротеинов крови с искусственными лмидными системами является липидный монослой, состав которого легко изменяется и контролируется. Нами была разработана липиднал модельная система, представляющая собой липидный монослой, адсорбированный на поверхности гидрофобного сорбента. В состав ионослоя входили в различных соотношениях фосфатидилхолин, холестерин к компоненты, создающие поверхностный заряд (пальмитиновая кислота, дицетклфосфат, стеариланин). образцы сыворотки крови пропускались через колонку, содержащую сорбент с покрывающим его. ляпиднын монослоем, и анализировались на содержание ЛНП и ЛВП.

4.1. Влияние содержания холестерина в монослое.

Было исследована .взаимодействие- липопротеинов плазмы крови с липидным монослоен в зависимости от содержания в ном холестерина и заряженных компонентов. Полученные результаты показаны на рис. 4. 1. Можно видеть, что боаьшое значение во взаимодействии липопротеинов с монослоем играет содержание в нем холестерина.

Взаимодействие С %)

Рис. 4.1. Взаимодействие ЛПВП 11} и ЛПНП (2) с дипкдным монослоем в зависимости от содержания в нем холестерина.

Взаимодействие оценивалось по связыванию ляпопротоинов сыворотки при пропускании еэ через колонку с гидрофобным сорбентом. покрытым _ липидным иопослоем.

О 40

Концентрация X (иол%) При увеличении мольной доли X в монослое до 30 мол. % наблюдается значительное снижение связывания ЛПЗП, что соответствует данным о взаимодействии ЛПВП с липосомани (Gregoriadis, Davis, 1972). В тоже время наблюдается увеличение связывания ЛПНП. что становится особенно выражено при концентрациях X сбьлие 30 мол. %.

4. 2. Влияние поверхностного потенциала понослоя.

В межмембраннок взаимодействии важную роль играет поверхностный потенциал менбрак, создаваемый их заряженное: компонентами. Нами было исследовано взаимодойстзие липопротекков плазмы крози с липидным мопослоэк в зависимости от его поверхностного заряда. Поверхностный потенциал липкдногс монослоя £ыл оценен по величина ¡^-потенциала липосок, имеющих тот же лккдный состав, что и нонослой (рис. 4.2).

С-потенциал (мЗ! 25

-25

0 ■ 20 4 40 60 Концентрация . ( кол. У.)

Рис. 4.2 Зазясиность ^-потенциала липосон от концентрации б исхидной лияядкоЗ скеся заряд-образующего кокпон&кта.

Микрозяэктрс-форез проводили в ервде: ICO tóí сахарозы, 5 мМ трис-HCl, рЕ 7. 4. Температура 20°С. Заряд-обр аз тещи 5 компонент:

1 - стеарпяакси;

2 - пальккт-новая кислота;

3 - дицетнд^осфат.

Исследование связывания липопротеинов с липиднын мокослоем в зависимости от его всвзрхностного . потенциала (рис.4.3) показало, что злектростатическоо взаимодействие не играет существенной роли в избирательности этого процесса.

Взаимодействие (%) 100

Рис.4.3 Взаимодействие ЛПВЛ (1) и ЛПНП (2) с липкдиым коьослоем в зависимости от его {-потенциала. Условия как на рис. 4.1.

-30 -15 0 15

^-потенциал (мВ)

Так как липопротеим инеют суммарный отрицательный. заряд, то как и следовало ожидать, их связывание с липидным монослоем возрастает в случае положительного поверхностного потенциала и снижается при отрицательных значениях. Избирательность связывания отдельных классов липопротеинов при этом остается неизменной или уменьшается.

Таким образом, в модельных исследованиях на липидных монослоях было выяснено, что увеличение содержания в них холестерина приводит к появлению избирательности взаимодействия ЛПНП с монослоем за счет возрастания связывания ЛПНП и уменьшения связывания ЛПВП.

5. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИПОПРОТЕИНОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ С ХОЛЕСТЕРИН-СОДЕРЖАЩИМИ ЛИПОСОМАНИ 5.1. исследование кеводон электрофореза.'

С помощью метода электрофореза в ПААГ было показано, что как и

в случае с липидными монослояни взаимодействие липосон с . »

различными классами липопротеинов плазмы крови в значительной мерз зависит от уровня I в липосональном бислое. При увеличении содержания X в лнпосоках растет степень взаимодействия с ЛПНП и снижается с ЛПВП. что приводит к увеличению избирательности' взаимодействия с ЛПНП. Липосомы с максимально высоким содержанием X (Х/ФЛ « 1,6) практически селективно взаимодействуют с ЛПНП (рис.5.1). По площада пиков ЛПНП в электрофореграмках контрольного образца сыворотки и смеси сыворотки с липосомальпын препаратон было рассчитано, что с липосонами связывается до 90Х ЛПНП.

5Э5

в.С

о.о

^ ЛПНП

Ту-?»

2е

лпвл

Рис. 5.1. Электофоряграмны цельной сыворотки крови человека С А) и скеск сыЕсретки с Х-содержащими ллпосомами (Н). Липосокы (Х/ФЛ - 1,62) и сыворотку (1:1 по колям ФЛ) инкубировали при 37 С в течение 1 часа. Диск-■ элс'ггрофорез проводился з ПАЛГ как описано э раздела "Материалы л методы".

О 25 40 53 80 Сим) 5. 2. Исследование препаративио-анслиаичесхики иеподони.

Избирательное взаимодействие холестерин-содержащи:: липосон с ЛПНП было подтверждено и методами преципитации ЛШШ я ЛП0Н11 с последукщик биохимическим анализом (рис.5.2), а также методами седиментации (рис. 5.3).

Липиды (мг/ЮС мл)

300

200

а - 1 шп - 4 ЕЗ - 2 ЕЯ - 5 |]

Рис.5.2. Анализ липидов в сыворотке и фракциях лкпопротеиноэ до и после инкубации сыворотки с X-содержащикк лкпосоками. Условия как на рис. 5. 1. 1.- сыворотка

2 - сыворотка + липосокы

3 - фракция ЛПНП+ЛПОНП,

полученная из 1;

4 - фракция ЛПНП+ЛПОНП.

полученная из 2;

5 - фракция ЛПВП,

полученная из 1;

6 - фракция ЛПВП,

полученная из 2.

Общий X Свободный X

Дс (кг/дл)

180

-20

Рис. 5. 3. Распределение X пс фракциям при ультрацентрифугировании смеси сыворотки и Х-содержащих липосом.

дс - с" - с'. гдэ

С* 2 С* - концентрации X в 1-15 фракции снеси сыворотка -!- липосокы и контрольной сыворотки соответственно.

1 - зэк-с, флотации ЛШ'.П,

2 - зона Флотации ЛПВП.

Нбнер фракции

Из рис. 5.2 видно, что практически весь X и ФЛ липосонального препарата обнаруживаются во фракции ЛПНП+ЛПОНП, что говорит о взаимодействии липосом с данными липопротекнанм. На рис.5.3 показана дифференциальная кривая, отражающая изменение содержания X во фракциях, подученных при ультрацентрифугировании контрольной сыворотки и ее ornes с липосонами. Практически весь X лкпосом обнаруживается в зоне флотации ЛПНП. Так какч лилосоиы икоят удельную плотность болое иысокую чем ЛПНП, то этот факт свидетельствует о том, что лкпоссмы взаимодействуют с ЛПНП н образующийся комплекс кнсст удельную плотность близкую к плотности ЛПНП.

5.3. исследование мелодои электронной микроскопии.

На p»ic. S. 4 . показаны электронные фотографии частиц ЛПИП (А), Х-содержащего липосонального препарата (Б) _ и комплексов ЛПНП+липосомы (В). Образцы А и В были получены из зоны флотации ЛПНП (фракции 4-7) при ультрацентрифугировании сыворотки и ео снеси с липосомани как описано выше (см. рис. 5.3).

к " ' . "Г Г. Г

да. , .

Рис. 5. 4. Электронные микрофотографии.

А - частиц ЛПНП (фракции 4-7 контрольной сыворотки); Б - препарата Х-содержащих липосом;

В - комплексов, образовавшихся при взаимодействии ЛПНП х липосом (фракции 4-7, рхс. 5.3).

В экспериментальном образце, взяток из "зоны флотация ЛПНП, вхдны крупные комплексы с диаметром 1000-1500 ни (рис.5.4В). Данные комплексы являются, по-видинону, вторичными х представляют собо£ агрегаты, возникшие гз после взаимодействия Х-содержащих ляпосок с ЛПНП.

5.4. исследование in vivo.

Было исследовано взаимодействие Х-содержащего липосонального препарата с липопротехнами плазмы крови in viro. Кроликам вводили внутривенно стерильную суспензию липосом и анализировали содержание общего I и ФЛ в образцах сыворотки крови и фракциях липопротеинов (рис.5.5). Видно, что липиды Х-содержащих липосом обнаруживаются преимущественно во фракции ЛПНП.

Общий холестерин (кг/100 мл)

900 600 '300

600

Фосфолипкды (мг/100 нл)

ED- 1 ES3 — 2 ES3 — 3 га - 4

зоо •

0 2_______4 ____

Вреня (дни) ляпссон с липопротенн;

L....... 0 . 2 4 6

Время (дни)

Рис. 5.5. Взаимодействие Х-содержащих плазмы крови кроликов in vivo. Лкпосомы . Х/ФЛ- i, Е?) вводились внутривенно (500 мг общих лкпидов) в 1-й, 3-й к 5-й дни. 1 - сыворотка, 2 - ЛПВП, 3 - ЛПНП, 4 - ЛПОНП.

Полученный результат указывает на сохранение селективного

взаимодействия Х-содержащего липосонального препарата с ЛПНП в

эксперименте in vivo при внутривенном его введении.

Т. о. , как и в случае с липидным монослоен, увеличение содерга-

ния X в липиднои бислое липосом приводит к росту избирательного

взаимодействия Х-содержащего липосомального препарата с ЛПНП.

6. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИПОПРОТЕККОВ ПЛАЗМУ КРОВИ СО СЛССТГШИ ЛИПИДКЫМИ МИЦЕЯЛАКИ 6. 1. исследование иегяодои элгкаророреза. Кетодом гель-электрофореза было исследовано взаимодействие липопротеинов плазмы крови с препаратом Х-содержащих липидных мицелл (ряс. 6.1). Связывание (X)

100

-20

ш3 -1 rh

ЕПЗ - 2 É ñ 1 ■

Ф А 1 щ ц ■ й

N 4 1. щ .1. 1 •

* 0 14 N - 20 33

Рис. 6.1. Зависимость связывания ЛПНП (1) и ЛПВП (2) со сложными липидныии мицеллами от содержания в них X. Связьгаагаге мицелл с липопро-твкнани оценивали по изменению интенсивности окраски полос последних при электрофорезе в ПААГ.

(см. раздел Материалы я нетоды)

Холестерин (мол. X)

Из рисунка видно, что с увеличением содержания X в липиднон ионо-слое, покрызающен лиапдную мицеллу. связывание с ЛПНП растет к достигает более 30% прк максимальной концентрации X (33 мол. 32. Б тоже время связывание " нзцелл с ЛПВП практически остается неизненным л составляет менее 10%. Было проверено связывание липопротеинов плазии с мицеллами, содержащими биологически активные океилроязЕодюлв X (рис. 6.2).

Связывание (%)

1С0

Рис. 6.2. Связывание ЛПНП (1) к ЛПВП (2) со сложным;: лнпидныни мицеллами, содержащими: X - холестерин;

II - 7-кетохолестзркн;

III - 7-гидроксихолестерин;

IV - 25-гидрокскхолестерик. Концентрация стеринов в мицеллах - насыщающая.

Можно видеть, что высокая селективность связывания мицелл с ЛПНП сохраняется при замене X на эго оксипроизводные. Сохраняется также и зависимость связывания от концентрации стерина в мицелле, о чем свидетельствует высокая корреляция между данными параметрами (рис. 6.3).

Связывание (X)

100

"■ ■ ' 1 111 1

О/ н

/<ЭЫ г = 0.97

Рис. 6.3. Корреляция нежДУ связыванием сложных липидных мицелл с ЛПНП к концентрацией стеривов в мицеллах, г - коэффициент корреляции.

X - холестерин;

XI - 7-кетохолвстерин;

III - 7-гидроксххолестерин;

IV - 25-гидроксихолестерин.

Т. о. ,

Стерин (иол. X)

как в случае со стерин-содержащимя липкднынн монослояни и липосонзми, так и в случае со стерин-содержащими липидкыми ницеллани наблюдается высокая селективность связывания с ЛПНП.

б,2. исследование нетодон гель-хроматографии.

Взаимодействие с липопротеинани ппазнц крози я последующая судьба Х-содержащих икцолл были исследовары с помощью гель-хроматографии. На рис. 6.4 показано перераспределение холин-содержащих ФЛ (1) и ТГ (2) между мицеллами н лппопротеинани плазмы кров::. Наблюдается возрастание количества яшкдов в нкцеллах и значительное уменьшение в ЛПНП. что говорит о их взаимодействии с образованием комплексов. Анализ перераспределения X (3) и окси-стеринов (в качестве примера был взят 7-ОК-Х, кривая 4) показывает уменьшение количества стеринов в мицеллах и возрастание в ЛПНП.

ДС (мг/3 00 .мл)

! л\ Л—» -Х—^^Л—А—А- ,

I 1 1 ь.7 '■А* Л /Д д—д - 1 -/ А-А - 2

—1—.....^—«--■--■ "|-1

Номера фракций

Р".с. 5.4 Исследование' ззгимодействик липкдныл мицелл с липопро-текнакк плазмы кзтодо;; голь-хро;:атогдафЕи на сефарозе 4В-СЬ. ЛС( - кзизпеяпэ концентрации липида в 1-той фракции:

= с",4" С[ ~ с, • гдг с"1. С*, С( - концентрация липида

з о.-тсй фрикцк:: прк хроматографии су с пзкзга кицелл, сизоротки кров;:, гмгеи сыворотки к липкдных мицелл соответственно. X - кицеллы; II - ЛПКП.

1 - холин-содержащие ФЛ, 2 - ТГ, 3-Х, 4 - 7-ОЯ-Х. Перенос стеринов от ккцелл к. ЛПНП иокэт преходкть, пс-видимому, как з момент их4 взаимодействии, так и в белее поздние сроки при ззаикодействик комплексов мецелла-ЛПНП н свободных ЛПНП и/нлк в результате распада комплексов с образованием кодифицированных ЛПНП или ЛПКП-подобных частиц.

7. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СТЕРИН-С0ДЕРЖА1ЦИХ ЛИПИДНЫХ ПРЕПАРАТОВ. 7.1. исследование на клеточных культурах in vitro.

Было исследовано действие стерин-содержащих липидных мицелл на рост клеточных культур in rizro. На рис. 7.1 . показана кинетика роста прокаристическях клеток Acholeplasma laidla'sii (I) и эукариотических клеток китайского хомячка (II). Иицеллы, содержащие оксипроизводные X, эффективно подавляют рост, как тех, так и других клеток, в то время как Х-содержащие мицеллы действуют только на клетки микослазмы.

D (отн. ед. ) 106 клеток/чашку

Часы Дня

Рис. 7.1. Действие стерин-содержащих мицелл на рост культур клеток Acholeplasma laidlavii (I) и клеток китайского хонячка (II). 1 - контроль, г - Х-содержащие я 3 - 7-кетоХ-содержащие иицеллы.

Было исследовано действие стерин-содержащих препаратов на способность клеток китайского хомячка образовывать колонии. Результаты представлены в таблице1 1 и на рис. 7.2. Видно, что липосомальный препарат, содержащий X, снижает образование клеточных колоний в десять раз, в то время как лкпосомы, содержащие 7-кето-Х, полностью подавляет этот процесс." Контрольный препарат (липосомы из ФЛ) не оказывал влияния (табл.1). Результаты, представленные на рис. 7. 2,' указывают,' что Х-содержащий препарат не только снижает абсолютное количество образующихся клеточных колоний, но при этом оказывает различное действие на клетки с разной пролифератявной . активностью. Наблюдается подавление роста клеток с высокой пролифоративной активностью

Таблица 1.

Действие стерин-содержащихлипосомальных препаратов на образование колоний клетками китайского хомячка.

Препарат (состав) Количество колоний (% к контролю)

ФЛ (контроль) 100, О ± S, 4

Х/ФЛ Э, 9 ± 2, 2

7-кето-Х/ФЛ 0

Число клеток в колониях

0-63 64-127 128-191 192-255 >255

ZZ33-« - 1

//////*-1 ¡ш - 2

ШШШИг*

чнптшптпгппь-*

Рис. 7. 2. Действие X-содержащего липосомально-го препарата на распределение колоний клеток китайского хомячка по размерам.

Размер колоний оценивался по числу клеток в колонии. 1 - контроль; 2 - липосомы.

О 20 40 60

Количество колоний

(из них образуются большие колонии; число клеток в колонии >255). Некоторое увеличение количества клеток среднего класса (колонии с числом клеток 128-191) объясняется, по-видимому, переходок в этот класс части клеток из класса ">255" в результате снижения их пролифаративной активности под действием препарата. Количество колоний малого размера (0-63 и 64-127 клеток в колонии) остается неизменным, что указывает на отсутствие действия препарата ка рост клеток с низкой пролиферативной активностью. В приведенных результатах просматривается некоторая избирательность действия Х-содэржащего препарата в отношении быстро делящихся клеток, что может иметь отношение к возможной противоопухолевой активности подобного типа препаратов.

Известно, что некоторые окисленные производные X могут вызывать повреждения эндотелнальных клеток кровеносных сосудов (Taylor et al., 1979), 4Tö способствует^ развитию .атеросклеротических процессов. В связи с этим мы проверили действие разработанных нами мицелляркых препаратов, содержащих . оксипроизводные X, на рост первичной культуры эндотелиоцитов человека (рис.7.3). Выл

использован холестан-3, 5,6-триол (XT), как сакый активный из

окскхолестеринов в плане повреждения эндотелия сосудов (Henning

et al., 1987). Видно, что при добавлении XT в виде спиртового

раствора (препарат 4) происходит значительное повреждение

клеточного конослоя. При добавлении того же количэства стерина в

составе ницелл (препарат 3) повре:«сда»щее действие уменьшается и

практически полностью отсутствует при введении XT в составе

Х-содержащих мицелл (препарат 2).

Количество клеток в чашке 17. от контроля)

100 F р-1-! „ т ." rSn Рис. 7.3. Действие холестан-

3, 5, 6-тркола на рост эндотелн-

альных клеток человека ill vitro.

Препараты

Состав 1 -> 3 4 5

Мицеллы т + + - -

Этанол • - - - + +

Холестерин + + - - -

Хол. триол - + + -

1 2 3 4 5.

Т. о. , разработанные нами мицеллярные содержащие X и его оксипроизводные, не эндотелиоцитов.

Было также исследовано действие стеркн-содержащих ккцелляркых препаратов на рост опухолевых клеток Эрякха in vitro.

липидные препараты, вызывает повреждения

„ Н-тимидин (10 о-

икп. /НИН)

ES - А ¡ИЗ — В

12 3 4

6 7

Концентрация (кг/мл) препаратов

по общин липидам по стеринам (исключая 1 и 2)

Рис. 7.4 Влияние стерин-с о держащих ницеллярньц: прзпаратов на включение Н-тикядине. в клеткк Зрлиха.

1 - контроль;

2 - без стеокнов; 3-Х;

4 - 7-кето-Х;

5 - 6-кетохолестанол;

6 - 25-ОК-Х;

7 - 7-ОН-Х.

О, 01 0, 002

0, 1 0, 02

На рис. 7.-1 по казано влияние ницеллярных препаратов, содержащих X я его оке .шроиз водные па включение 3Н-тинидина в кислотонераство-рялуп фракцию клеток Эрлиха. Видно, что в концентрации 0,02 кг стерина/мл препараты, содержащие как X, так и его оксипроизводные практически полностью подавляют синтез нуклеиновых кислот в культуре опухолевых клеток Эрлиха.

7.2. исследование пзаимодейспзия с неибранани эритроцитов.

Была исследована стерин-транспортная и стердн-докорная функция полученных препаратов. В таблице 2 представлены данные о переносе X от липссоиального препарата х ¡¡ембранам эритроцитов (таблица 2). Полученные результаты указывают ка наличие- реального массо-пэреноса холестерина от липосск к клеточным мембранам.

Таблица 2.

Перенос холестерина от липосом к мембранам теней эритроцитов.

Образ ец Х/ФЛ

Тени эритроцитов (контроль) Тени эритроцитов после' инкубирования с липосомани Липосомы (контроль) Липосояы после инкубирования с тенями эритроцитов 0,78±0,05 1,15±0,08 1,62+0,05 1,10±0,07

Тени эритроцитов кролика инкубировались с липосомами (1:1 по молям ФЛ) при 37 С, 1 час.

Из этого следует, что стерин-содержащие препараты могут быть использованы не только для направленной транспорта X и его оксипроизводных к клеткам-мишонян путем селективного их введения в ЛПНП, но и для модификации стеринового состава менбран эритроцитов. В организме последние находятся в динамическом равновесии по стеринам с липопротеинани плазмы крови и могут выступать в качестве буфера биологически активных стеринов.

7.3. исследование на клеточных культурах in viro.

Противоопухолевая активность разработанных стерин-содержащих препаратов была исследована на культурах асциткых опухолей перевиваемых на экспериментальных животных. Одной из наиболее активной и трудно поддающейся терапии опухолей является мышиный лейкоз L1210. На рис. 7. 5 приведены результаты испытаний ницеллярных стерин-содержащих препаратов на данной опухоли. Для выявления эффективности липидных препаратов как средства доставки биологически активных стеринов к клеткам-мипенян в контрольных экспериментах были испытаны те же дозы стеринов в виде спиртовых растворов (рис. 7.5В). Только з-кетохолестанол показал занетную

Увеличение средней продолжительности жизни (X)

Рис. 7.5. Действие стерин-содер-жащих кицеллярных препаратов на продолжительность хазни ныл эй (ОВА/2) с опухолью Ы210. А - стерли-содержащие мицеллы В - спиртовой раствор стерина 1-Х;

2 - 6-кето-Х;

3 - 7-ОН-Х;

4 - 25-ОН-Х.

активность в спирту. Остальные стерины проявляли активность только в составе ницелляркых препаратов. Данный факт подтверждает ках заметную противоопухолевую активность стерин-содержащих кицеллярных препаратов, так и их эффективность в качестве средства доставки биологически активных стеркнов к клеткан-кишенки.

Необходимо отметить, что в отличиэ от хицеллярной формы препарата липосомапьная форма не оказыеала заметного действия на рост опухоли Ы210 (также как и Р388). Однако при испытании липосоиальных препаратов на гепатоме Зайделя была отмечена их противоопухолевая активность.

Выживаемость животных (%)

Дни

Рис. 7. 6. Действие стерли-содержащих липосо:;альйых препаратов на выживаемость крыс с экспериментальной опухольа - гепатона Зайдзля.

(I) 1 - контрольная группа животных; 2 - липосомы ех ФЛ; 3 .- Х-содержащий липосомальный препарат.

(II) 1 - контроль; 2 - Липосомальный препарат, содержащий 20-ОН-Х.

На ряс. 7. 6 показано действие Х-содержащего липосомального препарата на увеличение продолжительности жизни крыс с привитой опухолью Зайделя (I). Введение данного препарата (кривая 3) приводит к выживанию части животных (* 30%) вплоть до контрольного срока (30 дней). По-вядимону, данная экспериментальная опухоль является более лабильной, о чом говорит занетное действие (кривая 2) ляпосом из однсгс ФЛ (без X). При заменз в ллпосомальнок препарате X на его окисленный аналог (20-0Н-Х) также была отмечена противоопухолевая активность (II). При однократном введении препарата гибель животных отодвигается на несколько дней.

7. 4. исследование на инхунокемпетентных хлетхах.

Инмунодепрессианзя активность стерик-содержащих препаратов проверялась по их действию на реакцию резеткообразования между лимфоцитами человека и эритроцитами барана. На рлс.7.7 показано илгибируюшее действие ницеллярных липидньгх препаратов, содержащих

X И РЯД еГО ОКСИПрОЧЗ ЕОД!!ЫХ.

Ингкбирозание (2)

Рис. 7.7. Торможение реакциз; розеткообразоэания пицелляр-ными препаратами, содержащими : 1-Х,

2 - 7-кето-Х,

3 - 7-ОН-Х,

4 - 7-ООН-Х,

5 - 25-ОН-Х,

6 - 6-кетохолестанол,

7 - холестан 3, 5,6-триол.

1 2 3 7 *5 6 7

Минимальной активностью обладал Х-содержащий препарат, максимальной - препарат с холестан 3,5, 6-триолом (XT), однако действие последнего скорее всего не является специфическим и обусловлено, по-видимому, повреждением клеточных мембран, о чей свидетельствует появление большого числа эхиноцитов за счет превращения в них эритроцитов в присутствии XT.

Данный биологический тест позволяет проверить эффективность доставки цитостатика к клеткам-мишеням с помощью разработанного нами ницеллярного липидного препарата, так как по условиям проведения теста in vitro препарат добавляется непосредственно в

цельную кровь и только после периода инкубации кз образца выделяются лимфоциты для проведения реакция розоткообразования. Т. о. в экспериментальных образцах присутствовали Есе классы лкпопротекнов плазкы крови, что создавало возможность доставкк цитостаткка путем направлзнной транспорта с участием ЛПКП с последующий их захватом с помощью рсцепториого механизма клеткг.. Для проверки мы сравнили эффективность действия 7-ОН-Х в вида спиртового раствора и в составе стерин-содержащего кинеллярного препарата. Результаты приведены на рис. 7. з.

Кнгибирование С/.)

СШ - 1 т Рис. 7.8. Тормо::;енке реакць;

^ - 2 розеткообразования 7-ОН-Х.

1 - липидные кицелльт;

т 2 - спиртовой раствор.

. Концентрация 7-ОН-Х:

I - 0,5 мг/мл,

XI - 1,0 мг/мл.

При конечной концентрации 1 кг/мл 7-ОН-Х действует з 5-6 раз эффективнее в составе нкцелляркого препарата, чем в спирту СИ). При меньшей концентрации 7-ОН-Х (0,5 мг/мл) эффективность мицелл становится еще больше заметкой (I! по сравнению со спиртовым растЕорок (в 10-15 раз). Ка рис. 7. 9 показано действие 7-ОН-Х а 25-ОН-Х в составе мицелл, содержащих или несодерпащкх X.

Кнгибирование (%)

Рис. 7.9. Торможение реакцк;; розеткоосразования мицелляр-ными препарата;;«, содержа-щхки 7-ОН-Х и 25-0Н-Х.

1 - мицеллы без X;

2 - ккцелчы с X. Концентрация оксистеринсв:

0,5 мг/мл,

7-ОН-Х

25—ОН—X

Как и следовало ожидать, па действие мицелл с 7-ОН-Х прмсутстэие в ник X практически не влияет. Это легко объясняется тен, что замена X ira 7-ОН-Х в составе мицелл не приводит к изменения их связывания с ЛПНП (см. p¡:c. В. ?.). в то жа время 25-ОН-Х в атом плана не лзляется полной заканоГ: X - они конкурируют за встраивание в мицеллу (ск. рис.3.9) к селективность взаимодействия с ЛПНП к>:услл. содержащих только 25-ОН-Х, значительно лика (рис. 6. 2). Мо-чно предлолзга! ь, что инг.чбирукщий эффект ницелл, содержащих одновременно 23-ОН-Х и X, выло (ряс. 7.9) ккеинс по гр»гчннэ более высокой селективности связывании этих мицелл с ЛПНП, чем кпце-лл, содержащих только 25-ОН-Х.

Т.о. разработанные нами стерин-содержащие липидные препараты обладают выраженным лимукодэпресснвным дзйствием.

7.5. исследование на кроликах, с гиперхолестеринениеО.

Была исследована применимость разработанного стерин-содержацего липосомального препарата для транспорта к повышения эффективности ряда гипохолестеринемических средств, таких как тритерпеновые гликозиды. Цели данного исследования были: 1) преодолеть плохую растворимость в воде большинства из данных соединений за счет включения их в липядный препарат; 2) осуществить направленный транспорт гликозидов в ЛПНП in vivo с помощью Х-содержащего липосомального препарата, селективно взаимодействующего с ЛПНП. Ныли использованы ДЕа гликозида бетулина (рис.7.10).

В состав Х-содержащего липосонального препарата был введен гликозид в концентрации 7 мол%. В качестве контролен были использованы Х-содержащие липосокы без гликозида, липосомы из 4>Х, спиртовой раствор гликозида. Исследование проводилось на кроликах с экспериментальной гиперхолестеринемией (среднее значение содержания X в плазме крови « 700 мг/дл) полученной путей содержания животных на обогащенной X диете. Препараты стерилизовала путем фильтрации через фильтр О, 2 мкм и вводили животным (200 мг липида/кг массы животного) б 1, 3, 5 дни. Анализ содержания X в плазме крози проводили в 0 и 7 день. На рис. 7. 11 представлены полученные результаты. Наблюдается некоторое действие

сн2оя-

Рис. 7. 10. Моноглюкозиды бетулина, обладающие гипохолестеринемическими свойствами.

R = Н G1 R'= Gl Н

I II

Снижение уровня X в плазне (% от контроля)

60,-:---

Й.

Рис.7. 11. Гипсхолестерннемическое действие липидных препаратов.

1 - ФХ липосоны;

2 - Х/ФХ липосоны;

3 - спиртовок раствор X;

4 - спиртовой раствор IX;

5 - Х/ФХ/1 липосоны;

6 - Х/ФХ/1Х липосоны;

7 - ФХ/1 лкпосомы;

8 - ФХ/11 липосоны.

1 2 3 4 5 6 7 8

ФХ липосом (1), и крайне низкая активность как Х/ФХ липосон (2), так а спиртовых растворов гликозидов I и II (3. -1). Введение гликозидов в составе ФХ препарата С без X) оказалось также мало эффективный (7, 8). В случае введения этих соединений в составе Х-содержащего липосонального препарата (Б, 6) приводило к значительному уменьшению содержания X в плазне крови экспериментальных животных, что говорит о довольно высокой гипохолзстеринемической активности данной формы • препарата. Избирательная доставка гликозидов бетулина в ЛПНП приводит, по-видимому, к потенциировапию кх гипохолестеркнемическкх свойств. Т. о. Х-содержащие липидныэ препараты могут быть с успехом использованы для транспорта слабораствсримых в вода биологически активных соединений, и их избирательной доставки в ЛЛНП плазмы крови, что может иметь, по-видимому, важное значение для фармакоккнетики этих соединений.

В ходе выполнения работы по теке часто возникала необходимость кодификации существующих или разработки новых методов анализа липидов, липопротеинов, клеточных мембран и т. д. Е данной главе приведены краткие ¿ведения о разработанных методах исследования на молекулярном и мембранном уровне.,

Е.1. Определение сфингониелина в липопротеинах плазмы крови.

Был разработан простой способ определения сфингокпелина в липопротеинах плазмы крови С а. с. 1242826 от 8.10.84). 5 основе метода лежит способность некоторых белковых токскнсв морских анемон специфически взаимодействовать в эквинолярнок соотношении

8. МЕТОДЫ, РАЗРАБОТАННЫЕ В ХОДЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЦ.

со сфингомиелиион липопротаинов плазмы и эритрсцитарньгх мембран. На рис.8.1 показано ингибирующее действие сфингомиелина на гемолиз эритроцитов кролика гемолизином КТХ. 1д V (% Тб5о/мин)

Рис. 3.1. Ингибирсвание сфингомиелиион гемолиза эритроцитов кролика г 1 й суспензия) прт: действии токсина КТХ. V - начальная скорость гемолиза.

1д С Тяг/пл)

¡Зидно, что гемолиз эритроцитов мо:::гт бить использован е качестве индикатора при титрспании сфннгоииел!:па лкпопротеинов плазмы крови белкой-гемолиз ином. Образец сыворотки крозн, содержащей сфинго-миелин, титруется раствором гемолизина в пробирках ил;: з ячейках планшета для иммунологических реакций. Концентрация сфингсмиелина в пробе (С , моль/л) определяется по формуле:

V • 10 / м

V ,

где С - концентрация раствора гемоли-ь

зина (г/л), V - объем раствора гемолизина (л), пошедший на титрование, М - молекулярный вес гемолизина, - объем пробы.

а. 2. Получение биологически активных охсипроигводных X по С7.

Был разработан способ получения биологически активных оксипроизводных X по С7. X был введен в состав-липидного монослоя, покрывающего частицы перфторуглеродной (ПФУ) эмульсии. X окислялся на поверхности частиц ПФУ эмульсии кислородон, растворенным в ПФУ фазе. Окисление происходит с высокой избирательностью по С7. Продуктом реакции является 7-пероксихолестерин (7-00Н-Х). Высокая степень' селективности окисления X по С7 обусловлена, по-видимому, его пространственный расположением на поверхности ПФУ (рис. 8.2). Продукт реакции (7-00Н-Х) был выделен из реакционной смеси с помощью экстракции и колоночной хроматографии. Выход продукта составляет 30%. Другие оксипроизводные X по С7 (7-ОН-Х, 7-кето-Х) были пслучэпы как показано на рис. 8.2. С помощью данного метода было наработано достаточное количество оксипроизводных X для проведения испытаний липидных препаратов ал Г1ГО.

Х»Д9СТ»РКМ

НО МлвН

оон

t°

НО'4-^^ I-

рис. 8.2. Схема окисления X на поверхности ПФУ.

Модель нолехули X построена, походом компьютерной молекулярной графики (програнка PCMODEL 4.0). Стрелкой показано кэсто окисления X по С7.

8. 3. Анализ гетерогенности содержания X в мембранах эритроцитов.

При разработке данного натода был использован Х-специфичный модификатор биомембран - тритерпековый гликозид голотуряк А. Было показано, что его активность зависит от содержания X в мембранах (Иванов A.C. и др.. 1931), что позволило использовать голотурия А в качестве специфического зонда на содержанке X в мембранах эритроцитов (а. с. 1373262 от 8.10.87). Метод получения эрктрограки по содержанию X в мембранах заключается ь 'гатровакии суспензкк эритроцитов раствором голотурина А с непрерывной регястоацией

Кол-во эритроцитов (%)

0.5 1.0- 1.5

0.5. 1.0

Х/ФЛ (моль/моль)

'/ФЛ (коль/¡толь)

Рис.8.3. Эрнтрограммы содержания X в эритроцитах кроликов. I - нормальный кролик; II - кролик с гкперхолзст&ринемией; III - снесь эритроцитов от I и II.

выхода ионов £+ из клеток. Дифференциальная форма полученной кривей титрования представляет собой искомую эритрограмму. На рис.8.3 показаны типичные эритрограмны для крови кроликов. Метод имеет высокую разрешающую способность, что подтверждается бимодальной формой эритрограмны для снест: эритроцитов, полученных от двух раз;гых кроликов.

С. -1. Лкалпз хоягстърира хембран эри.процияоз.

Особенность разработанного метода { отрасл. рац. предл. N 0-2384 ст 13. 11.34) заключается г подготовке рестяоримсго в воде образца, который может быть проанализирован с помощью стандартного фермзктатипкого набора для определения X сыворотки кропи. Для этого л я пилы нритрецптзрнч",: мембран экстрагируют с.*; спесью Фолча, кысукхзаыгс.'; под гакууком к растворяются л с;;?см тритоне л-100 ч Я-метоксмэтгпола (7:2). Далее подготовлонны'З такик образом ооразец ;:о;:;от быть проанализирован фэрмелтаткзг-ык методом.

2.-1. Пгпсд анализа ¿ос.ролипиаа; ^ле.пэ^.и\'Х чекбра.:!.

Принцип разработанного метода (отЪасл. /ратд. предл. II 0-2511 07 14. 06. 85) - экстракция л:;пидоэ клеточки:: мембран смесью Фолча, Бысуаикакпе, растворение остатка е хперофэрнз проведение реакции с реактивом ферротиоцнаната амкоинл с последующей фотомэтру^.Ч окраиенной хлороформной фазы в красной области спектра. По сравнению со стандартными методами данный метод нэ требует сжигания образца для перевода органического фосфора в неорганический.

8.5. Новый мембранолитический препарат

При анализе биологической активности различных производных X было обнаружено, что некоторые сульфатированные производные X обладают способностью вызывать гемолиз эритроцитов, при этом другие клетки крови оставались целыми. Было получено новое соединение (А.С.1385569 от 24.10.85) - 3-натрийсульфат холестан-

3, 5, 6-тркола (рис.3.4), обладающее высокой менбранолктической активностью.

Рис.8.4. 3-натрийсульфат холестан-3,5,6-триола - сульфатированное оксипроизводноэ X с недетергентным гемолитическим действием.

Данный гемолитик, являющийся синтетическим аналогом биологически активных сульфатов стеринов морских организмов, был успешно применен в анализе белых клеток крови с понощью гематологического счетчика "Р5-4". Работа выполнена совместно с ТКЕОХ ДВО ЛИ СССР.

8. 6. Получение фасфолипидного коситсля холсстсриг.а.

Был разработан способ получения фосфолнпндяого носителя холестерина (Пол. рещ. на изобр. 1! 40725/14). Данный прзпарах представляет собой липосомальную форму стерин-содержащего липидного препарата на основе высог-сононаськцэкного «X. Препарат обладает повышешы;-! сродством к ЛПНП к ¡:э;гсет быть использован дчя переноса I; доставки X и его окисленных аналогов к пореферийкык клеткам к органам.

3.-7. Анализ размера частиц липидных дисперсий по спекяру мутности.

Спектротурбидиметрический метод анализа дисперсных систем (Клакин и др., 1977) был адаптирован для определения среднаго размера частиц, массо-объемкой и числовой кошдекграцкг; частиц липидкых дисперсий. Метод основан на измерении спектра мутности суспензии и последующей математической обработка с похощьо персонального компьютера. Зависимость оптической плотности (В) от длины волны света (X) описывается выражением: С = Л • А"", где А - константа для данного спектрального интервала, п - волновой экспонент. Нани были исследованы границы применимости метода спектра мутности для анализа лппидны:: дисперсий.

Относительная ошибка опрзделения радиуса (%)

Радкус ( им! Метод crsxTj

иутчост-'s

- G

\ 1

0 / 01 о p

о о °b о / о/°

120

Раях.ус (;.м! Мьтод оптического сиешзнкя

Средняя мутность эмульсии (ск"1)

Рис.8.5. Определение границ применимости метода спектра нуткости для анализа лкпкдных дисперсий (I) к лго сравнение с кэтс-дог оптического смещения (IX).

Измерения спектров проводились в диапазоне от- 400 до SCO v,n.

На рис. S. 5 (I) показана зависимость относительной ошибки определения методом спектра мутности среднего радиуса Х-содерлащих сложных липидных мицелл от величины сродней нутностн ницеллярной эмульсии. 3 качестве контроля был использован метод оптического смешения (лазерный анализатор "Colter Н4", "Coultronics", Франция). Сравнение двух методов анализа дисперсий показало высокую корреляцию рззультатов параллельных измерений (рис. S. 5, II). Спектротурбндиметрический метод анализа дисперсных састап не тр&бует использования специального дорогостоящего лазерного анализатора, и обладает одкун преимуществам по сравнении с ?1Этодон оптического смешения: он ке чувствителен к налкчкя небольшого числа крупнчх частиц ( е тол число пыли) в дисперс:::;.

8.3. Статистический анализ санных о содержании X з липопиотемнау: плазмы крови экспериментальных кроликов.

Был проведен математический анализ данных о содержании X в плазме крови как контрольных кроликов, так к с экспериментальной гиперхолэсторинемией (Ivanov A.S. et al., 1991). С привлечением

Холестерин плазмы (г/л) Холестерин плазмы (г/л)

Рис.8.6. Гистограммы распределения кроликов в популяции по содержанию X в плазме крози.

N - .-число животных в каждой кпассэ. Контрольная группа (I) состояла йз -102 животных, остальные кролики содержались на атерогенной диетэ э течение (II) 1 нес. (232 кролика), (III) 2 мес. (350 кроликов), (IV) 3 мес. (319 кроликов).

большого статистического материала (1053 животных) были получаны гистограммы распределения животных в популяции по содержали» X в плазме крови (рис. 8. 6). Ныло показано, что популяция состоит кз ряда субпопуляций. Так как гистограммы распределения мнеют полимодальных характер, то применение обычных статистических методов может привести к получению значительных оакбок. Пыл сделан ряд практических рекомендаций для комплектования групп животных для экспериментов: 1) кроликов с уровнен X плазмы 0,1 - 0,3 г/л (контрольные группы), 2) кроликов с X плазмы 2,0 - 5,0 к 7,0 -10,0 г/л (группы с экспериментальной гипврхолестеринамкей), что соответствует отдельным субпопуляциян.-

5. 9. Способ диагиосаики гипгрхолестеринсиии.

Способ диагностики глпорхолестеркнемик (а. с. 149472С, 2.03.87) был разработан для проведения скриичнга населения с цельк выявления лиц, подверженных развитию атеросхлгроза (группа риска) и больных атеросклерозом. В настоящее врекк обнаружить повьпдэпхоз содержание X в крови можно только проведением количественного анализа на X. Однако для предварительного скрининга населения такой анализ является избыточным, так. как ::а первом г-тапа необходимо выяснить не точное значение X з крозк, а лишь диапазон, в который попадает эта величина: норма (<200 иг./дл), группа ркска (200-250 иг/дл), патология (>250 иг/дл). Способ основан на проведении реакции X з пробе крови с Х-специфичным геколктккон. По отсутствию или наличию гемолиза регистрируется результат анализа. На рис.8. 7 приведены кривые гемолиза проб крози человека с различной концентрацией X в плазке при добавлен:::: одной к тс.Ч же концентрации (200 мкг/мл) голотурина А.

'/. гемолиза образца крови

100 -

Ряс. В. 7

т^плптт г.

Кинетика гекил::за образцов крови челова:;?. в присутствии голотурсна А. Концентрация X в плазме кроз:: (кг/100 мл):

1 - 13?. (норка) ;

2 - 220 (группа рис::а) ;

3 - 273 (гцпгрхолостяркне:«!.':; ;

4 - 305 ( ГЕнзрхслесг'ерккэмка).

3 6

Время (мин)

Для выявления гиперхолестеринемии по верхней границе норны (200 нг/100 мл) в данном случав необходимо взять контрольное время 3 минуты. Б качестве геиолитически активного вещества могут быть использованы соединения из классов тритерпеновых гликозидов, стероидных гликозидов, полиеновых антибиотиков.

8.1С. Кодифицированный нгтод анализа свободного холестерина липопсопсинов плаэпы кропи.

Ныла проведена модификация . химического метода анализа свободного X з сыворотке крови. С цепью увеличения точности и воспроизводимости метода используемый для отделения эфироз X от свободного стероядгай глякозид дигнтонин был закенэн ка

триторпсзиосый гликезпц голотокс;:н Aj.

3.11. ¡íefnod ьоСепировация гиперпхиглицериаскии у хролихеи.

Среди различных типов -ДЕСляпопротеидспя* (габолазр.ний с нарушением ляпиднэго обмена) существуат вариант нарушения обкат трнглкцеридэв (тип IV) с высоким и:: содержанием з плазме крови (глпертригл.'шеридекия) я нормальными цифрами содержания X. В эксперименте на животных такой тип гипертриглицеркде.чии как правило получить не удается. При испытаниях высокоиенасыщенных ФЛ из различных источников и разноГ; степени очистки нами было обнаружено, что липосокальный препарат, приготовленный из соевого фосфатидилхолина фирмы "Sigma" (дешевый препарат с невысокой степенью очистки), вызывал значительное увеличение концентрации ТГ в плазме крови кроликов при его внутривенном введении (таблица 3). Как видно из таблицы другие биохимггееские показатели крови практически остаются неизменными.

Таблица 3.

Биохинические показатели плазмы крови кроликов при введении ни липосомального препарата из соевого ФХ фирмы "Sigma".

1 ----- Показатель Контроль Опыт

Общий белок (г/дл) 4. 9 ± 0, 2 4, 4 ± 0, 1

Альбумин (г/дл) 3, 0 ± 0, 1 2,7 ± 0, 1

p6s¡5tíl.X (мг/дл) 43 ± 7 61 ± 9

ТГ (нг/дл) Б5 ± 6 312 ± 30

-лет С Е/л) IS i 5 18 ± 5

АПТ (Е/л) 51 ± 8 45 ± 7

ЛЯГ. . (Е/л) 94 ± 12 135 ± 10

'ИФ - (Е/л) ■ 7А ± ¿2 54 ± 5

Данный, аффект обусловлен, по-вядиипму, присутстэием в препарате ФХ гликолипядов, однако точное выяснение причин требует специальных исследований, которые чэ входили в на наши задачи.

8.12. Метод моделирования гиперхолестеринении у кроликов.

Как правило экспериментальную гиперхолестеринзмию у кроликов получают при моделировании атеросклероза с помощь» длительного (до 3 мес. ) содержания живот1ьпс на атсрогенной диете (е корм добавляется X до 1 г в сутки). Однако в ряде случаев (например для испытания гекосорбентоа) требуется только кровь с васокг:;; содержанием X, а не полная картина атеросклероза. Нами был разработан простой к быстрый ( 1 недели) способ коделиропакик гиперхолестеринемии у кроликов путем 3-х внутривенных зведоккй Х-содержащего липидного препарата. Содержание X в плазме крови животных возрастает на 6-й день в 3 - 4 раза к удержкБаотсл кз. этом уровне несколько дней.

9. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С целью поиска возможных путей направленного транспорта гидрофобных цитостатиков при участии ЛПНП в качестве переносчика проведены исследования взаимодействия липопротеинов плазмы крови с липидными монослоями, липосомами и ккцеллаки. Обнаружено, что введение высоких концентраций х или его аналогов в состав липидных монослоев, липосом или мицелл приводит к появлению высокой селективности их взаимодействия с ЛПНП, по сравнению с другими классами липопротеинов. Этот результат был получен с помощью различных методов (хроматография, электрофорез, седиментация, ультрацинтркфугирование, ферментативный анализ и др. ) на всех трех типах л)1пидных систем, что говорит, по-видимому, о едино:: механизме взаимодействия ЛПНП с любым объектом, покрытыл лкпидным нонослоем, содержащим X. Известно, что ь л!:пкд!£ых системах прг? высоких концентрациях X происходит сегрегация лит:д1Я-п: кояпс:тектов с образованием кластеров X. Именно наличие кластеров X в липидкоч монослое является, по-видимому, решавщкк фактором, опрс.цел.тзщкм селективное взаимодействие с ней ЛПНП. Кожно предаолагатх-.. '.го з ЛПНП за это взаимодействие отвечает аг;о-В белок. Проверке-. этого предположения требует специальных исследований к яаляэчся на но); взгляд перспективный направлением научных работ в облает:: блок,,/.::;, липопротэкнов крови.

Было обнаружено, что при частично;; или полной я а

ляпкяной системе на одно из следующих окс'шроизволных X: 7-кетс-Х, 7-СН-Х, 25-ОН-Х, селективное взаимодействие с ЛйПП сохргч.лгтся. Т. о. нами был обнаружен простой путь селективного введения оксистеркнов-цитостатиков в ЛПНП с помощью стерин-содержащих лкпкдных препаратов, селективно взаимодействующих с ЛПНП.

На основе полученных результатов била разработана новая группа лилидн'-пг препаратов медицинского назначения (липосомальная и мицеллярная формы), которые способны селективно взаимодействавать с ЛП'ЛП в плазме крови и вводить а них X и его окисленных производных. Проведены работы по оптимизации состава и методов получения лабораторных образцов данных липидкых препаратов. В табл.чцо 4 прлзодшм физлко-хямнчэскио свойства оптимизированных лабораторных образцов стерик-соясржащих липидкых препаратов.

Таблица 4.

Физико-хгшкческио свойства стерин-содержащих липидкых пропаратов.

СВОЙСТВА лнпосомы МИЦЕЛЛЫ

Состав ( оснол:п.:е компоненты) Фссфолклачь! Холестерин Трзглицоркди Эфиры холестерина + + + + + - + +

Транспортируемые биологически активные вещества (ЕАВ) Холестерин Оксистгрины Холестерин Окскстерины

Другие БАВ, которые могут быть введены з препарат Гидрофильные БАВ Гидрофобные БАВ Иембранотропные БАВ + + + +

Размер частиц (диаметр, нм) 100 - 300 40 - 80

Обьен внутренней водной фазы (л/моль липлда) 0, 8 ± 0, 1 -

Максимальная концентрация (мг общих лкпидов/мл) 60 200

Взаимодействие с липопро-теинами плазмы крови (%) ЛПВП ЛЙНП ЛПОНП 10 89 8 5 92 0

Основными липидпыма компонентами являются ФЛ и X (для липосон), а для нкцелл ещя.нейтральный липид (ТГ и/илл зфиры X). Были получены варианты препаратор., содержащие X и эго оксапроизводные, л обпаратадио цитостатическм, лннунодепрессквиым и..противоопухолевым дойстЕ'гом. Показано, что эти препараты могут моделировать стсрчн-транспортнул функцх» ЛПЯП я практически они могут быть использован« для транспорта любых кекбранотропных, гидрофильных (в ферме липосок) и г:1дрофоб:!ых (г; фермо мицелл) биологически

активных- веществ (БАВ). Размер частиц мицелляркого препарата значительно меньше чем липосомального, что позволяет легко проводить его стерилизацию с помощь» мембранной фяльтрацкк. Мицеллярный препарат может быть получен з еыгокоП концентрацш» (до 200 кг липида/кл), что обеспечивает высокую удельную биологическую активность транспортируемых БАВ. Как видно таблицы, о бс

препарата имеют выраженную способность избирательно связываться с ЛПНП (липосоны - 88%, мицеллы - 92?,).

Получены лабораторные образцы цлтостатичоских лкпосомальких :s ницеллярньнс форм препаратов, содержащих оксиг.рокзводныо 1. Проведены биологические испытания зткх образцов в различны;-: экспериментах in vitro и in vivo. Показана уиачктелыгая ць'тостзтичоскек активность на культура:." клеток, протиэиопухиловая активность на экспериментальных поревизазмьк аецктньк опухолях, а также икиунод^прессишше действие на лимфоцитах челог.зка. Подтверждена эффективность стерка-содср^вдю: препарате*'з качестве средства достаЕК'л оксистсркнов к клэтхак-иишеняк.

Разработана математическая модель. опг:сиаа:эдая сложную трехкокпонентную липид;;уй кицеллу, которая яеляотся ссиогаГ; косого бездэтергекгного кицеллярного стср;п:-содер;.«.ацего яяпкдного препарата. Данная недель позволяет предсказать оптимальный ссствь иицолл с заданными фкзяко-хиккче-склкн свойствами. С ое понещъю был.: оптимизированы свойства а метод получения стерни-содержащего мицелляркого ллпцдкого препарата с мккунодепроссинмх г; цитостатическим дейстзкек.

Необходимо отметить, что шщелляркаь форма разработанною препарате, с точки зрения коллоидной химии представляет собой по структуре сяожкуа л:1Плдку:г ницзллу. Данная мицелла остается стабильной е ьэдной фазе в отсутствии дэтергэктоэ, что обусловлено составом лигсядногс иснослзя, покрывающего ео г;:чрофс5иое ядро. Па способности перекосить серкны эти ичцеяяы успеияо кодзлирЗ'ВТ стзркн-транспортную функцию ЛПНП. Подобш.!» б«здег'=-ргсктгае лньидкые м&целлы Moryv быть взл^-ы ^а ociiciy лрк разрыбот.'.г липидных препаратов различного назначения.

Предложен путь ввадскоия БАВ в состав ЛПНП с l¡c;;o¡j,b:o ияпкдных препаратов, селективно взаимодействующих с ЛПНП. Оспгвкые ог\ичл предложенного способа.:

а) введение транспортируемы:: БАВ е. сссчас стерин-ссдсркащэгс лкпидного препарата (липосомы или сядеадеэ ш;:п:дкые пицвяпи) » получение первичной лекарственной фор^ы;

б) внутривенное введение липидного препарата, содержащего БАВ;

в) самосборка конечной лекарственной формы непосредственно в крови путей избирательного взаимодействия частиц липидного препарата с

- ЛПНП с образованием комплекса ЛПНП + БАВ;•

г) доставка БАВ .с помощью ЛПНП в периферийные органы и ткани по рецепторному пути с участием апо-В специфических рецепторов клеточных мембран.

Возможность реализации этого пути на примере доставки X и его биологически активных охстшроизсодных была проверена и подтверждена з данной работе как в экспериментах in vitro, так и in vivo.

Разработан ряд хетодсв анализа .г: диагностик;-: изр липидного обмен?. на уровне липопротелнэз пгазмы кров:-: :: клетсчны..-: мембран: определение сфянгоммслшп з лупопротяин?.^: плазмы кроен; анализ гетерогенности содержания X в мэнбранах эрнтроцптоп; кстод анализа фосфолнпидоэ клсточкп: мембран; кемсрано;:,:тиЧЕСКиГ;

препарат; способ получения фссфслипидпого носителя холестерина; метод анализа размера частиц липидных дисперсий по спектру мутнссти; статистический анализ данных о содержании X в липопротеинах плазмы крови кроликов; способ диагностики гиперхолестерлкемии ; метод анализа .свободного холестерина липопротеинов плазмы крови. Данные методы могут быть успешно использованы как для целей экспериментальной биологии, так и для практической медицины.

Разработан способ получения биологически активных оксипроизводных X по С7. X, находящийся в составе липидного монослоя, покрывающего частицы перфторуглеродноЯ (ПФУ) эмульсии, окислялся кислородом, растворенным в ПФУ фазе. Показано, что окисление происходит с высокой избирательностью по С7 с образованием в качестве продукта 7-ООН-Х. Высокая селективность окисления X обусловлена его пространственным расположением на поверх'-:ос!и ПФУ. Из 7-оон-Х были получены другие оксипроизводные X по С7 С7-0Н-Х. 7-кето-Х) и использованы для приготовления стерян-со^тЙ;ржЕяях препаратов.

1С. 0«£ЙаНЫ2' StSÔSbl

• ■. - -

1. Разребо^н путь " MnjjaajferSHtftT» . Транспорта оксистеринов-цитосхггТикоз ' к пйриферйСнйя! сргатгам а тканям с помощью с т ер ин-содержащих липидных препаратов,' селективно

взаикодействуюыих с липопротеинами низкой плотности.

2. Показано, что чен выше содержание холестерина в лкпикнок конослое, лигсоссме клк слокной липедкой клцаллз, тек Быпе юс сродство к ЛПНП ллазхы крови.

3. Предложена катекатическая модель,, позволяющая предсказать оптккзлькый состав бездеторгэкткого мицеллярного лкпидиого препарата с заданными физико-химическим;; свойства:!!!.'

При помощи данной модели были оптимизированы свойства к метод получения стерин-содержащего кицеллярного липидного препарата, обладающего цитостаткческпнг и иккунодопрассквиыхк свойствами.

4. Создана группа липидных препаратов гюдйцкнского назначения, селективно взаимодействующая с ЛПНП. Получены' .лабораторное образцы липосомальной и кицсллярной йорк этих препаратов, содержащие оксипроиззодкые холестерина г: обладающие цитостатичаскки и икнуиодэпрессиЕнык действием.

5. В ходе проведения исследований были разработаны: ивтод анализа сфингокиелкна липопротеинов плазмы крови. кетод анализа гетерогенности содержании X в мембранах эритроцитов, метод диагностики гиперхолестерккэкни, метод получения фосфолипидкого носителя холестерина, методы быстрого моделирования гипер-хслестеринемик и гкпертриглицеридокии; проведэн пипуляциокныХ статистический анализ данных о содержанки X в липопротэингж плазмы кровк кроликов.

6. Разработан метод получения биологически активных оксипроиз водных холестерина по С путе.ч ?го селективкогс-окисления кислородом на поверхности фтэруглзродноК зхульпии.

11. СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУКПИКОВлНТ?1Х ПО гГ£МП Л^ССееТАЦКИ

1. Иванов A.C., Путвинсккй A.B., .Антонов В-Ф. , Вль^икироз Ю. А. Увеличение протонной проницаемости липосои пр:г пгрзквснон фэго-оккелэник лкпидов // Биофизика - 1977 - Т. 22. - - С. £21-624.

2. Иванов A.C., Петров В. В. , Антонов В. 4*. >!г*учэн;:;> сопряженного транспорта конов Ю*. С17 II * и ОН" в суспензии липосок. // Биофизика. - 1978. - Т. 23. - N 2. - С. 233-256.

3. Петров В. В. , Нольнар А./.., Иванов A.C., Пр«дзэд::теяев Д. А. , Антонов В. i>. Появление одиночных каналов kojihoS- прсгодхиостт: кемэдпфлцлрованньп: б::Ь);ойнь:х мекбранах при 'гпг-.яс-ратурч- ф'13 0й0Г0 перехода // Докл. АН СССР - 1378 - Т. 233 - И 5. - С. Iiis-1247.

4. Y.Antonov, E.Korepanova, V.Zoubarev, A.Molnar, V.Petrov,

A.Ivanov. Interaction of polymyxin В mediated by detergent with bilayer lipid membranes. VI International Biophysics Congress. 1978, Kyoto, Japan, V-lO-(Cl), 218.

5. Петров В. В. , Иванов A.C., Хадкевнч А. Н. , Мирский В.М. , Антонов

B. Ф. Механизм действия жирных кислот на ионную проницаемость .лкпидных н биологических мембран // В сб. : Тезисы докл. конф.

"Ляпиды биологических мембран" - Тапкент -1980 - С.200-201.

6. Antonov V.F., Pctrov V.V., Kolnar A.A., Ivanov A.S., Predvaditelev D.i.. The appearance of single-ion channels in unmodified lipid bilayer membranes at the phase transition temperature // Nature. - 1SS0. - V.223. - P. 585-536.

7. Петров В. S. , Зубарев В. С. , ХорепаноЕа Е. А. , Мольнар А. А. ,

, Иванов A.C., Предводителев Д. А. . Антонов В. Ф. Свойства бислойкых мембран, сформированных из синтоткческнх фосфолипидсв и их аналогов // Фармация. - 1980. - Я 1. - С. 19-26.

8. Иванов A.C., Мольнар A.A., Петров В. В. , Попов A.M., Анисимов H.H. Дейстзиэ тритерпеновых гликозидов на проницаемость липосо-малъкых и эритроцнтарных мембран // В сб. : "Липосомы л их взаимодействие с клетками и тканями" И.. Наука, 1981, 115-123.

9. Мольнар A.A., Петров В. В. , Иванов A.C., Предводителев Д. А. , Антонов В. Ф. Анионселективные каналы в мембранах из заряженных фосфолипидов // Доклады МОИП - М. : Наука - 1981 - С.22-25.

10. Анисимов М. М. , Иванов A.C., Попов A.M., Киселева М. И., Себко И. Г., Коротких Л. Я. , Антонов A.C., Стоник В. А. , Антонов В. Ф. Влияние тритерпеновых гликозидов к полиеновых антибиотиков на проницаеность клеточных мембран для К+ и УФ-поглощах>щих веществ // Прикл. биохимия и микробиология - 1981 - N6 - С. 890-895.

11. Ронм А. Р. , Иванов A.C. Транспорт ионов и осмотические эффекты в липосомах при действии нигерицина и трибутилолова. // Докл. МОИП - К. : Наука. - 19S1 - С. 55-57.

12. Попов A.M., Анисимов М. М. , Иванов А. С, Корепанова Е. А., Антонов В. О. Особенности мембранной активности некоторых тритерпеновых гликозидов // Антибиотики. - 1982. - Т. 5. - N 4. - С. 36-40.

13. Липке Л., Петров В. В. , Иванов A.C., Предзодчтелев Д. А. , Антонов В.Ф. Влияние pH среды на ионную проводимость бислойных липи-дных нембран // Локл. МОИП. - М. : Наука.- 1382 - С. 32-34.

14. Петров Е. В. , Хаткевич А. Н. , Мирскмй В.М. , Иванов A.C., Мольнар А. А. Влияние жирных кислот на проницаемость биологических и модельных мембран // Докл. МОИП. - М. : Наука - 1982 - С. 29-32.

15. Торховская Т.И. , Иванов A.C., Халилов Э. К. , Благосклоноз A.C., Карганян Г. С. , Ключникова К. И. Липидно-белксвый состав липопро-текдов больных ишенической болезнью сердца после гемосорбции // В сб. : "Сорбц. нотоды детоксикации" - Минск - 2.983 - С. 78-79.

1Б. Торховская Т.К., Халилов Э.И. , Иванов A.C., Шинг'арей К. В. , Ключникова X. К., Омар J!. ж., Перепелица В. ¡I. , Лопухин Ю. к. Характеристика дпслкпопротеидемий у больных переферкческкм атеросклерозом. // Вопросы мед. химии. - 1983. - IIG. - С. Е9-93.

17. Еассерман А. Н. , Карват Р. , Иванов А. С. , Нольнар А. А. , Корепг-нова Е.А. . Антонов В. Ф. Эфиры холестерина увеличивают проницав- • мость лецитиновых бислойных мембран // Биофизика. - 1983. -Т. 28. - N4. - С. (543—646.

18. Дудаев В. А. , Парфенов A.C., Иванов A.C., Торховская Т. Я., Халилов Э. И. , Нечаева В. К. , Шингерей Я. В. , Омар Л. К. Влияние нарушений липидного сбнена на реологические свойства кров;: у больных ишенической болезнью сердца // Кардиология. - 1983. -Т. 23. - N3. - С. 37-42.

19. Торховская Т.К., Иванов A.C., Халилов Э. И. , Лопухин Ю. Н. Динамика содержания липопротеинов плазмы у больных периферическим и коронарным атеросклерозом под влияниен геносорбции. // Казанский нед.журнал. - 13S3. Т. 64. - N 2. С. 92-95.

20. Козловская Э.П. , Изанов A.C., Мсльнар A.A., Монастырная H.H., Еляков Г. Б. , Халилов Э.К. Ионные каналы в кембранах, индуцированные гемолизином из актинии Radianthus macrodactylus // Доклады АН СССР. - 1984. - Т. 277. -Кб. -. С. .1491-1493.

21. Иванов A.C., Захарова Т.е., Форткнская Е. С. Способ автоматизированного ферментативного определения холестерина ненбран эритроцитов // Отрасл. (ИЗ РСФСР) рац. предл. - N 0-2384 - 16.11.84.

22. Монастырная K.M., Козловская З.П. , Иванов A.C., Нольнар A.A., Еляков Г. Б. Способ определения сфингониелина // A.C.1242326 -8.10.84.

23. Дудаев В. А., Горин В. 3. . Торховская Т.И., Иванов A.C. Взаимоотношение между содержанием липидое, фибриногена и уровнен гормонов в кроаи больных с зсрошгсесканк формами кшокической

' болезни сердца // Кардиология. - 13С4. - Т. 5. N8. - С. S5-89.

24. Иванов A.C., Карват Р. Г. , Колькар A.A., Халилов Э.К. Зфир холестерина увеличивает проницаемость мембран зрктроцитог // Биофизика. - 1985. - Т. 30. Вып. 2. - С. 2С9-272.

25. Захарова Т. С. , Заяц Н. , Изанов А. С. ' Взаимодействие мембран эритроцитов с фосфолипид-холестерииоБыки дисперсиями различного состава //' В сб. : "Цитохрои Р-450 и охрана внутренней среди

• человека" - Пущина. - 1985. - С. 103-104.

26. Иванов A.C., Захарова Т. С. способ определения, фосфолипкдов зрптроцитарных мембран с реактивом аммония феррстиоцианата // Отраслевое (КЗ РСССР) рац. предложение. - N 0-2511. - 14. 06. 85

27. Lcpukhin YU., Torkhovskajа Т., Xvanov я., Khalilov Е., fortinskaja Е. [iEC?r.;osorbtion influence on the blood plasEn .lipoprotein sysfct-n. Intern.ccnf. on preventive cardiology // Horcnu. - 1983. - 0376.

23. Стосак В. Д., Яакарьеза Т.П., Горпкова H.A., Иванов A.C. З-кчгркисульфат холестак-З. 5, С-триола, обладающей мзибраислитч-ческой активностью // A.C. 13S55C9. - 24.10.b5.

2S. Иванов A.C., Халилоп Э.К. , Соловьева Э. Ф. , Столик В. А. , Лальцов И.И., Елякоп Г. S. Определзние содержания свободного холестерина в сызоротко крови человека с использованчек голо-токсина ai // Вопроси мед. химии. - 1986. - n5. - С. 132-134.

30. НалииаЙко Т.. С. , Андрианова II. П. , Маркин С. С. , Иванов A.C. Эн-теросорбцня в лечении гиперхолссторинении // Тезисы VII международного симпозиума по гемосорбцпя. - Киев - 1986 - С. 104.

31. Корепанова Е. А. , Иванов A.C., Сидоров Е. П. , Ли B.C., Антонов 3. О. Роль холестерина в регуляции проницаемости мембран эритроцитов и липосом // В сб. : "Физико-химические аспекты атеросклероза". - М. - 1986. - С. 21-27.

32. Иванов А. С. , Мольнар А. А. , Захарова Т. С., Халилов Э. М. , Стоник 3. А., Еляков Г. Б. Способ зритрографии // A.C. 1373262 - 8.10.87

33. Иванов A.C., ¡(ольнар A.A., Козловская Э.П. , Монастырная М. М. Действие токсина из P.adianthus macrcdactylus на проницаемость биологических и модельных мембран // Биологические менбранн. -1987. - Т. 4. - N3. - С. 243-248.

34. Иванов A.C., Мольнар A.A., Монастырная М. М. , Халилов Э.М. , Козловская 3. II. , Еляков Г. Б. Липид-слецифичкые цитолизины морских актиний - кодификаторы биологических мембран // В сб. : "Ионный гонеостаз и влияние . факторов, внешней среды на жизнедеятельность клетки". 31ркутск, - М. - 1987. - С. 91.

35. Иванов A.C., Захарова Т.е., Халилов Э.М. , Торховская Т. И. , Бачманова Г. II. , Маркин С. С. , Арчаков А. И., Лопухин H.H. Способ получения фссфолипидного носителя холестерина // Пол.реп. на изобретение. - II 40725/14.

ЗБ. Халилов З.М. , Захарова Т.е., Иванов A.C. Перснос холестерина между мембранами липосок и эритроцитов // В сб. : Доклады Всесоюзного симп. по биохимии липидов. - Алма-Ата. - 1987. - С. 101.

37. Лысов В. А., Разумов В.Е. , Редчиц Е. Г., Некировский Л. Н. , Иванов A.C., Савенков М. П. , Доев А. И. Роль холестерина мембран эритроцитов в нарушении их структурно-функционального состояния у больных ишемической болезнью сердца // Кардиологии. - 1987. -Т. 27. - N1. - С. 86-88.

38. Иванов A.C., Захарова Т. С., Одинокова Л. Э. , Уварова К. К. Гиполипидемкческие свойства глккозидов бэтулика // Хим. -фар::, журнал. - 1987. - Т. 21. - N9. - Cr 1091-1094.

33. Дудаев В. А. , Аббуд А., Иванов A.C. Влияние поликенасьпцешых жирных кислот на функциональные свойства тромбоцитов к перекксное окисление липидов у больных ишемической болезнью сердца // Кардиология. - 1987. - Т. 27. - N6. - С. 79-83.

40. Монастырная М. Л., Козловская Э. П. , Халилов Э. ¿4. , Иванов А. С. Нетридиолизин - природный модификатор биологических я модельных мембран // В сб. : "Химия белков и пептидов". Таллин. - 1937.

41. Иванов A.C., Мольнар A.A., Козловская Э.П., Монастырная К. К., Халилов Э. М., Еляков Г. Б. Действие токсина из R. macrodactylus на проницаемость мембран лепосом. Зависимость от pH и позерхно-. сткого потенциала // Биол.мембраны - 1988 - Т. 5 - N1 - С. 33-37.

42. Иванов A.C., Захарова Т.е., Халилов з.к. Перенос холестерина нежду ненбранами липосон и эритроцитов // Биологичаские мембраны. - 1988. - Т. 5. . - N4. - С. 439-443.

43. ïvanov A.S., Bariozov А.T. Simulation of the LDL cholesterol-donating function of phospholipids // "Phosphatidylcholine (polyenephosphatidylcholine/PPC): effects on cell membranes and transport of cholesterolPPC Workshop, Cologne, - Cologne. -1988. - P. 7.

44. Иванов A.C., Нольнар A.A., Халилов Э. К., Сергйенно В. И. Способ диагностики гиперхролестеринекии // A.C. 1494720. - 2. 03. 87. .

45. Монастырная И. И. , Козловская З.П. , Иванов A.C., Нольнар A.A.. Халилов Э.М. , Еляков Г. Б. Действие кетридпогсизкна из морской актинии Hetridium senile на биологические :i модельные мехбраны // Биологические кенбраны. - 1988. - Т. 5. - - N 8. - С. 830-835.

46. Ivanov A.S., Zakharova T.S., Beriozov А.Т., Khalilov E.M., Torkhovskaya T.I., Archakov A.I. Cholesterol-donating Phospholipid Vesicles and Micelles // In: "Phosphatidylcholine (Poly-enephosphatidylcholine/PPC): Effects on Cell Membrane and Transport of Cholesterol". - ed. A.I.Archakov, K.-J.Gundermann. - wbn-Verlag Bingen/Rhein. - 1989. - P. 37-97.

47. Torkhovskaya T.I., Khalilov E.H., Kalinan A.M., Fortinskaya E.S., Ivanov A.S., Archakov A.I. Cholesterol-accepting Properties of Phospholipid Preparations Simulating HDL Function// In: "Phosphatidylcholine (Polyenephosphatidylcholine/PPC): Effects on Cell Henbrane and Transport of Cholesterol" - ed. A.I.Archakov, K.-J.Gundermann - wbn-Verlag Bingen/Rhein - 1989 P.99-:109

48. Иванов A.C., НерязоЕ Л. Т. . Захарова Т.е. Модификация липо-протеинов низкой плотности как путь доставки гидрофобных веществ к биологическим мембранам /./ В сб. : "Реконструкция, стабилизация л репарация биологических мембран". Благовещенск. - 1989. - С. 14.

49. Иванов A.C., Нольнар A.A., Березов А. Т. , Халилов Э.М. Модификация проницаемости биологических мембран зфирами холестерина // В сб. : "Нарушение механизмов регуляции и их коррекция", - Кишинев. - 1989. - С. 528.

50. Торховская Т.И., Халилов Э. М. , Калиман А. М. , Фортинская Е. С. , Эчкалов А. П., Иванов А. С. , Аношкина И. Н. Активация фосфатидил-холином мембрано-репарирующих свойств липопротеинов высокой плотности // В сб. : "Нарушение механизмов регуляции и их коррекция" - Кишинев. - 1989. - С. 559.

51. Зчкалов А.П., Захарова Т.С., Березов А. Т.. Иванов A.C., Халилов Э.Н. Влияние холестерин-содержащих липосон на везикуляцию мембран теней эритроцитов кролика // 3 сб. : Тезисы 17 Всесоюзного съезда патофизиологов "Нарушение механизмов регуляции и их коррекция" - Кишинев. - 1989. - С. 568.

52. Kalinin V.l., Gorshkova I.A., Gorshkov в.A., Stonik V.A., Ivanov A.S. Psolusosides from holothurian Psolus fabricii // "IX Sov.-indian Syinp. on the chemistry of natural products". -Riga. - 19S9, - ?. 98-9Э.

53. Хохлов А.Н. , Прохоров Л. Ю. , Захарова Т.С., Иванов А.С., Халилов Э.К. , Арчаков А. И. Влияние липосон, содержащих холестерин или 7-кетохолестерин. на способность культивируемых клеток к образованию колоний // Бюллетень экспериментальной биологик и медицины. - 1989. - N 9. - С. 348-349.

54. Иванов А. С. , Березов А. Т. , Эчкалов А. П. , Халилов Э. К. , Арчаков А. И. Исследование взаимодействия фосфолипкдньп: мицелл с лнпопротекнами плагкы крови // В сб. : Тезисы X Симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР "Механизмы регуляции клеточной активности". - Ташкент. - 1989. - С. 97.

55. Иванов А. С. , Образцов В. В.. Ивков В. Г. . Еерезов А. Т. Окислительная модификация холестерина на поверхности фторуглеродной энульсии // В сб.: "Актуальные вопросы

•разработки и применения эмульсии перфторуглеродов". - Пущкно. -1990. - С. 12-13.

56. Khalilov Е.М., Beriozov А.Т., Ivanov A.S. , Archakov A.I. Interaction of lipid micelles with plasaa lipoproteins // Abstr. of 20th Meeting of FEBS. - Budapest - 1990. - P-Mo 527 - P.110.

57. Beriozov A.T., Ivanov A.S., Ivkov V.G., Obraztsov V.V., Khalilov- E.M. , Archakov A.I. Cholesterol oxidation on fluorocarbon emulsion surface leads to the formation of 7-peroxycholesterol // FEBS LETTERS. - 1990. - V.26S. - N 1,2. - P.72-74.

58. Березов А. Т. , Иванов А. С. , Эчкалов А. П. , Захарова Т.е., Халилов Э.М., Арчаков А. И. Взаимодействие липкдных мицелл с лнпопротекнами сыворотки крови // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1990. - N 8. - С. 153-155.

59. Березов А. Т., Иванов А. С., Ивков В. Г., Образцов В. В., Халилов Э. н., Арчаков А. И. Появление биологически активных веществ при окислении холестерина на поверхности фторуглеродных эмульсий // Бгалл. эксп. биологии и медицины. - 1990. - N 9. - С. 2857285.

60. Ivanov A.S., Torkhovskaya T.I.-, Khalilov E.M., Archakov A.I-. Diet-induced hypercholesterolemia in rabbit' // Biomedical Science - 1991. - v.2. - P.285-288.

61. A.N.Khokhlov, L.Yu.Prokhorov, A.S.Ivanov," • A.I.Archakov Effects of cholesterol- or 7-ketocholesterol-containing liposomes on colony-forming ability of cultured cells //FEBS LETTERS - 1991. - v.290. - HI,2. - P.171-172.

Информация о работе

Иванов, Алексей Сергеевич
доктора биологических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы