Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Направленный ангиогенез с использованием клеточных технологий в сочетании с лазерным туннелированием при хронической ишемии конечностей в эксперименте

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Направленный ангиогенез с использованием клеточных технологий в сочетании с лазерным туннелированием при хронической ишемии конечностей в эксперименте"

Новрузов Руслан Байрам оглы

НАПРАВЛЕННЫЙ АНГИОГЕНЕЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В СОЧЕТАНИИ С ЛАЗЕРНЫМ ТУННЕЛИРОВАНИЕМ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТЕЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 14.01.26 - сердечно-сосудистая хирургия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика E.H. Мешалкина» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Ларионов Петр Михайлович доктор медицинских наук, профессор Чернявский Александр Михайлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Мичурина Светлана Викторовна

(НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, г. Новосибирск, главный научный сотрудник Лаборатории функциональной морфологии лимфатической системы)

доктор медицинских наук, профессор Сафонов Виталий Алексеевич (НУЗ «Дорожная клиническая больница на станции Новосибирск-Главный» ОАО «Российские железные дороги», заведующий отделением хирургического лечения сложных нарушений сердечного ритма кардиологического центра)

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Барнаул)

Защита состоится 29 мая 2012 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.062.05, созданного на базе Новосибирского государственного медицинского университета (630091, Новосибирск, Красный проспект, д. 52; тел.: 383-229-10-83)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского государственного медицинского университета (630091, Новосибирск, Красный проспект, д. 52).

Автореферат разослан « _» апреля 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета

A.B. Волков

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА _2012

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Идея клеточной трансплантации для лечения хронической ишемии нижних конечностей (ХИНК) (прежде всего атеросклеротического и диабетического генеза) успешно реализуется последние 5 лет (Cho H-J et al., 2003). Эти исследования стали предпосылкой для продолжения работ по изучению неоваскуляризации с использованием «клеточных технологий». Разработке этой лечебной тактики способствовало развитие современных представлений о молекулярных и клеточных механизмах регуляции роста и ремоделирования кровеносных сосудов. Большое внимание в этом аспекте уделяется теоретическим и практическим разработкам использования клеток мононуклеарной фракции костного мозга (МНФ КМ). Это объясняется их уникальным свойством - пластичностью, т.е. способностью дифференцироваться в клетки практически всех мезенхимальных тканей. Проведен ряд исследований, в которых доказана возможность клеток костного мозга и других источников дифференцироваться в клетки других типов (нейроны головного и спинного мозга, гепатоциты, клеточные популяции поджелудочной железы, в том числе продуцирующие инсулин, эндотелиоциты, миобласты, остеоциты, хондроциты, эпителиоциты и др.), (Деев Р.В. и др., 2005; Волков А.В. и др., 2005; Chen J. et al., 2001; Arvidsson A. et al., 2002; Riess P. et al., 2002; Aliotta J. M. et al., 2007).

Существует значительная группа больных, для которых выбор традиционных методов прямой реваскуляризации ограничен. Невозможность выполнения прямой реваскуляризации обусловлена не только возрастом и общим состоянием больных, сопутствующей патологией, но и многоэтажностью атеросклеротического поражения артерий, дистальными окклюзия ми.

Несмотря на мощный арсенал современных фармакологических средств и хирургических методик, проблема лечения вышеуказанного контингента больных далека от решения. Хотя прямая реваскуляризация была, есть и будет в ближайшем будущем приоритетным методом лечения хронической ишемии нижних конечностей, наряду с ней одним из альтернативных путей лечения является использование непрямых методик стимуляции неоангиогенеза в поражённых конечностях, позволяющих избежать ампутации. Эти методы

направлены на улучшение трофики конечности, и как следствие этого -увеличение объёма микроциркуляторного русла.

Таким образом, методы, направленные на стимуляцию ангиогенеза и васкуляризации и улучшающие трофику поражённых конечностей, в итоге могут стать методом выбора в лечении пациентов с дистальными неоперабельными поражениями сосудистого русла нижних конечностей. Решение перечисленных вопросов определяет актуальность настоящего исследования.

Цель исследования. Изучить структурно-клеточные и функциональные изменения при клеточно-опосредованном и лазерно-индуцированном ангиогенезе в условиях хронической ишемии конечностей крыс.

Задачи исследования

1. Дать морфо-функциональную оценку клеточно-опосредованного неоангиогенеза тканей бедра при имплантации мононуклеарной фракции клеток костного мозга.

2. Оценить морфо-функциональные изменения мышечных тканей в местах имплантации мононуклеарных клеток костного мозга в лазерные каналы.

3. Выявить особенности распределения мононуклеарных клеток при их имплантации в лазерные каналы и при инъекционном методе их введения в следующие постимплантационные периоды (6, 12 и 24 часа).

4. Сопоставить структурно-клеточные и функциональные изменения, полученные при использовании лазерного туннелирования в сочетании с инъекцией костномозговых клеток и изолированной имплантации мононуклеарных клеток.

Научная новизна исследования. Впервые разработана в экспериментальных условиях методика имплантации костномозговых мононуклеарных клеток в лазерные каналы. Проведен анализ непосредственных результатов и дана комплексная морфо-функциональная оценка неоангиогенеза после комбинированного лазерно-индуцированного и клеточно-опосредованного неоангиогенеза на модели хронической ишемии конечностей крыс. Оценены отдаленные результаты комбинированного применения имплантации костномозговых мононуклеарных клеток в сочетании с лазерным туннелированием мышц конечностей. Проанализирована динамика изменения

тканевого кровотока и степени ишемии конечностей при сочетанном применении лазерно-индуцированного и клеточно-опосредованного неоангиогенеза. Впервые при комплексной морфо-функциональной оценке проведен анализ ангиогенного потенциала методики лазерного туннелирования и имплантации костномозговых клеток и обоснована значимость данной методики в сердечно-сосудистой хирургии.

Практическая значимость. Разработана в эксперименте методика имплантации костномозговых мононуклеарных клеточных культур и использовании полупроводникового лазера. Результаты работы позволяют сделать новый шаг по освоению метода лечения пациентов с хронической ишемией конечностей. Полученные в процессе экспериментального исследования результаты вносят существенный вклад в понимание роли эндотелиальных клеток-предшественников костномозгового происхождения в процессах васкуляризации ишемизированных областей скелетной мускулатуры, позволяют усовершенствовать метод непрямой реваскуляризации конечностей.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Комбинация клеточно-опосредованного и лазер-индуцированного ангиогенеза обладает более выраженным ангиогенным потенциалом против изолированной имплантации мононуклеарных клеток костного мозга на модели ишемии конечностей.

2. Комбинированная морфо-функциональная оценка с использованием методов иммуногистохимического определения капиллярной сети на основе окрашивания СД31+ и лазерной доплеровской флуометрии адекватно отражает состояние микроциркуляторного русла.

Апробация материалов диссертации. Основные материалы исследования доложены на VI научных чтениях, посвященных памяти академика РАМН Е.Н.Мешальсина, с международным участием (Новосибирск, 2008), на VII Международной конференции "Гемореология и микроциркуляция" (Ярославль, 2009), на заседании ученого совета Новосибирского научно-исследовательского института патологии кровообращения имени академика E.H. Мешалкина (Новосибирск, 2009), на заседании Ученого совета Новосибирского государственного медицинского университета (Новосибирск, 2012).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных научных работ, из них 3 статьи - в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых для публикаций результатов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста и содержит 4 таблицы и 17рисунков, работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы результатов собственного исследования, заключения и обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Список использованной литературы содержит перечень 177 работ отечественных и зарубежных авторов.

Личный вклад автора. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на 84 крысах, инбредных самцах линии Wistar, одного возраста, массой 250-300 г. При проведении экспериментов руководствовались рекомендациями, изложенными в Приказе № 755 МЗ СССР от 12.08.1977 г. Все экспериментальные работы выполнены с соблюдением правил биоэтики, утвержденных Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных целей. Для отработки модели ишемии и изучения топографоанатомического строения структур задней конечности у крыс проведено исследования на 5-ти животных.

Методика забора и получения мононуклеарных костномозговых клеток и разделение её на фракции производили в условиях операционной. У крыс выполнялась диссекция конечностей, выделялись бедренные кости, срезались эпифизы. При помощи иглы промывали содержимое костномозгового канала 0,9 % раствором NaCl в объеме 50 мл. Аспират костного мозга помещали в стерильную пробирку с двумя объемами физиологического раствора (ФР) и гепарином, из расчета 20 ед. гепарина на 1 мл аспирата. Разведенный ФР костный мозг наслаивался на раствор фиколл-урографина с плотностью 1,077 г/мл и центрифугировался при 400 g в течение 40 мин при температуре 22 °С. Далее собиралось интерфазное кольцо. После двукратной отмывки питательным

раствором КРМ1-1640 определялась жизнеспособность клеток полученной МНФ. При окрашивании трипановым синим жизнеспособность суспензии превышала 96 %.

При разделении прилипающей и неприлипающей МНФ использовалось физиологическое свойство клеток адгезироваться к той или иной поверхности. Для этого полученная суспензия клеток МНФ КМ ресуспендировалась в питательной среде КРМ1-1640 без добавок и высаживалась в культуральные флаконы площадью 25 см2 из расчета 105 клеток на 1 см2. Далее следовала 30-минутная инкубация в С02-инкубаторе в атмосфере 5 % углекислоты при 37 °С. Затем жидкую фазу переносили в новые пробирки и оставшиеся в суспензии клетки отмывались от питательной среды ФР, ресуспендировались в концентрации 5x106 кл/мл в ФР и переносились в шприцы для имплантации.

Диагностика клеточного материала. Перед имплантаций клеточного материала проводилась его качественная и количественная оценка. Клетки подсчитывались в 100 больших квадратах. Результаты подсчета в больших квадратах суммировались и производились вычисления кол-ва клеток в 1 мкл. МФ по формуле х = (а *4000 *Ь) /1600, где х - кол-во клеток в 1 мкл. МФ, а - кол-во клеток в 100 больших квадратах, Ь - разведение МФ, 1600- кол-во малых квадратов, 4000 - множитель, приводящий результат к объему 1 мкл, исходя из объема малого квадрата (1/4000).

Для определения клеточного состава использовался метод иммунофлюоресцентной микроскопии. В суспензии клеток, коньюгированных с флюоресцентно-мечеными антителами, подсчитывался процент позитивных клеток в 100 больших квадратах.

Методика создания модели хронической ишемии конечностей. Под эфирным наркозом осуществлялся доступ к бедренной артерии. Учитывая особенности кровоснабжения задних конечностей крыс, выполнялась перевязка бедренной артерии, артерии сафена, подколенной артерии, краниальных и каудальных болыиеберцовых артерий.

С целью оценки пролиферативных свойств имплантируемых клеток была создана серия экспериментальных животных, которым вводилась суспензия мононуклеарной фракции костномозговых клеток меченных

5-бромдезоксиуридином (ВгБи). ВгБи является аналогом тимидина способным включаться в ДНК в процессе репликации. Животные выводились из эксперимента через 6, 12 и 24 часа. По 5 животных на каждый исследуемый часовой промежуток.

Согласно поставленным задачам, все животные были разделены на 3 группы, в качестве внутреннего контроля в каждой группе использовалась контрлатеральная (неоперированная) конечность (табл. 1).

Таблица 1

Распределение животных по экспериментальным группам

\ 1-я группа -изолированная внутримышечная имплантация мононукпеарных костномозговых клеток (п = 21) 2-я группа -имплантация клеточной культуры с лазерным туннелированием (п = 22) 3-я группа (контроль)-перевязка артерий без последующих манипуляций (п = 21)

Моделирование ишемии задней конечности с последующей стимуляцией ангиогенеза на 28-е сутки

5-е сутки после стимуляции ангиогенеза 5 животных 5 животных 5 животных

15-е сутки после стимуляции ангиогенеза 5 животных 5 животных 5 животных

25-е сутки после стимуляции ангиогенеза 5 животных 6 животных 5 животных

35-е сутки после стимуляции ангиогенеза 6 животных 6 животных 6 животных

Наблюдение, кожная термометрия, ЛД флуометрия, морфологические и морфометрические методы

На 28 сутки после создания "модели" ишемии конечностей - животным первой группы внутримышечно инъекционно вводили культуру костномозговых сепарированных мононукпеарных клеток в объеме 0,1 мл на 1 вкол, по 2 инъекции с медиальной и латеральной сторон. Животным второй группы введению клеток

предшествовала лазерная туннелизация мышц ишемизированной конечности. В эксперименте использовался полупроводниковый лазер: Модель JIC-1,56 мкм-«ИРЭ-Полюс» в непрерывном режиме с длиной волны 1,56 мкм и мощностью в 8 Вт, использование этих показателей сопровождается наименьшей глубиной повреждения, отсутствием явления обжига на тканях при сохранении достаточной производительности. Через кварцевый световод диаметром 600 мкм перпендикулярно поверхности ткани подводилось лазерное туннелирование.

Методика оценки хоуминга мононуклеарной клеточной фракции. Экспериментальной группе внутримышечно инъецировали 5-бромдеоксиуридин (BrdU) для мечения пролиферирующих клеток. В данном методе аналог тимидина BrdU встраивается во вновь синтезированную ДНК клеток на S-стадии клеточного цикла (стадии синтеза ДНК). Встроившийся BrdU окрашивается анти-BrdU антителами, меченными флюорохромами. Инкубация с BrdU позволяет анализировать активно пролиферирующие (в противоположность не-пролиферирующим) клеточные фракции.

Для иммуногистохимического анализа делали поперечные срезы мышечной ткани толщиной 10 мкм при -20 °С в криостате фирмы Leica. Иммуногистохимическое окрашивание включало следующие этапы: фиксация срезов и блокирование в нормальной сыворотке для предотвращения неспецифического связывания антител, инкубация с первичными антителами к исследуемому белку, инкубация с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой.

Методика морфологической оценки зон непрямой реваскуляризации.

После выведения животных из эксперимента, для исследования плотности микроциркуляции в области воздействия лазерного излучения и инъекции костномозговых клеток, препарировались участки мышечной ткани области бедра и голени. Материал фиксировался в 10 % растворе нейтрального формалина (не менее 24 часов), далее следовала отмывка в проточной воде 4 часа, образцы проводились через криопротекторную смесь, состоящую из раствора сахарозы восходящей концентрации 5 %, 10 %, 15 %, 20 %. Готовились криостатные срезы толщиной 10 мкм, выполняемые перпендикулярно оси лазерного канала и хода инъекционной иглы, далее следовала иммуногистохимическая окраска

первичными анти CD 31 антителами с вторичной флюоресцентной меткой. Производился подсчет количества сосудов на выделяемой площади мышечной ткани в месте воздействия. Для морфологического анализа использовался программно-аппаратный комплекс для анализа изображений на базе микроскопа «Axioskop FL-40», камера «AxioCam MRc», программный пакет «AxioVision 3.1».

Исследование мнкроциркуляторного кровотока конечностей методом лазерной доплеровской флоуметрии проводили на наркотизированных животных. Первоначально исследование микроциркуляции проводилось через 4 недели после моделирования ишемии. Повторное определение мнкроциркуляторного кровотока проводилось на 25-е и 35-е сутки после непрямой реваскуляризаци. Применяли лазерный анализатор капиллярного кровотока (ЛАКК-01, НПП «Лазма», Россия). Измерение кровотока проводили на голени правой и левой конечностей. Измерения проводили на длинах волн излучения 0,63 мкм, время записи ЛДФ-граммы составляло 3 минуты. Вычисление амплитудно-частотного спектра колебаний перфузии осуществляли с помощью прилагаемого к анализатору ЛАКК-01 программного обеспечения. При анализе допплерограмм оценивали динамику среднего значения показателя микроциркуляции - М, среднеквадратического отклонения - 8, коэффициента вариации - Kv. В работе рассматривались три частотных диапазона, в которых осуществляется модуляция стенки сосуда (Kvemmo H.D. et al., 1999). Медленные колебания (зона LF-ритма) определялись активностью собственных компонентов мнкроциркуляторного русла. Быстрые колебания (зона HF-ритма) совпадали с дыхательными ритмами и зависели от колебаний венозного кровотока в связи с изменением давления в грудной клетке в фазы вдоха и выдоха. Кардиоритмьг (зона CF-ритма) совпадают с пульсовыми колебаниями кровотока. Так как на практике не всегда удобно использовать абсолютные величины амплитуд колебаний в выделяемом спектре частот, в исследованиях оценивалось соотношение AmaxHF и A^CF к A^LF, а также индекс эффективности микроциркуляции (ИЭМ) (Козлов В.И., 2000).

Статистические методы исследования проводилась средствами интегрированной статистической системы Origin 7.0. for Windows, аппаратное обеспечение Pentium 4, 2500 Мгц, используемое программное обеспечение: ОС Microsoft Windows ХР, Microsoft Office ХР Pro. Для статистической обработки

результатов исследования использовали альтернативный анализ, метод вариационной статистики: вычисление средней арифметической (М) и ее ошибки (м), метод оценки достоверности различий между группами по критерию Стьюдента (t) с определением показателя статистической достоверности (р < 0,05) и в программе Origin по критерию ANOVA (при р < 0,05 различия рассматривались как статистически достоверные).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первые сутки после операции животные были адинамичны. Визуально отмечался цианоз кожных покровов. Двигательная функция оперированной конечности восстанавливалась на 3-4 сутки. Кожная температура на 3 сутки в симметричных точках бедра была достоверно ниже (р < 0,05) контрольной конечности и составляла 23,61 °С ± 0,76 °С и 32,78 °С ± 0,31 °С. В норме кожная температура у крыс составляет 32,8 - 33,4 °С (Диверт В.Э., 2003). В трех случаях наблюдалась гангрена дисталъных фаланг конечностей у 1 животного первой группы и 2-х животных второй группы.

Эффективность созданной ишемии оценивали спустя 28 суток. Морфометрическое исследование гистологических препаратов показало оживленную реакцию со стороны соединительнотканных элементов мышц, снижение удельной площади мышечной ткани с одновременным увеличением удельной площади эндомизия и перимизия, разрастание плотных коллагеновых волокон на фоне рыхлой соединительной ткани. Выявлены участки фрагментации миофибрилл. Наряду с неизмененными мышечными волокнами обнаруживаются в разной степени атрофированные участки, отмечаются очаговые нарушения четкости поперечной исчерченности сегментарного характера.

Оценка хоуминга МНФ КМ методом включения BrDU в ядра. Выведение животных производилось через 6 часов, 12 и 24 часа, с последующей окраской и морфометрией. Процентное соотношение BrDU-позитивных клеток от их общего количества до введения составил 9,8 % in vitro. Что характеризует количество клеток, находящихся в S-фазе.

По данным гистологии, на всех образцах на протяжении всего эксперимента наблюдались крупные клеточные скопления в зонах инъекции. Отмечено, что уже на препаратах 6-ти часового забора отмечена локализация BrDU-позитивных

клеток в капиллярах мышечной ткани. При рассмотрении образцов препарата 24 часового забора выявлено наличие позитивных клеток на удалении от непосредственной зоны введения в интерсцитиальном пространстве мышечной ткани. При оценке результатов флуоресцентной микроскопии выявлено снижение процентного соотношения позитивных клеток с 9,4 % (материал 6-и часового забора) до 8,8 % и 7,1 % соответственно. По нашему мнению, снижение процентного соотношения объясняется миграцией имплантируемых клеток по лимфатической и кровеносной системам. Полученные результаты указывают на сохранение общей массы имплантируемых клеток в зоне ишемии.

При гистологическом исследовании препаратов на 5-е сутки после введения сепарированной мононуклеарной фракции определена сохранная жизнеспособность имплантируемых клеток. Отмечены скопления клеточных конгломератов в зоне инъекции, сгруппированные вдоль раневого канала, образованного вколом иглы, состоящих из имплантируемых клеток. Наряду с этим на единичных препаратах отмечены зоны асептического воспаления, состоящие из элементов детрита, скопления нейтрофилов и наличия полинуклеарных клеток. Уже на 15-е сутки на препаратах в группе с использованием изолированной имплантации костномозговых клеток, так и в группе с комбинированной реваскуляризацией отмечено появление прекапилляров различного диаметра, определялись разрозненные скопления "сосудистых почек". Отмечалось образование капиллярных трубочек. При анализе результатов морфометрии на 15-е сутки после проведения непрямой реваскуляризаци в исследуемых группах отмечается положительная динамика в увеличении плотности капиллярного русла. Показатели удельной плотности микроциркуляторного русла при использовании изолированной имплантации МНФ КМК и при использовании комбинированной методики достоверно не различаются при 537,03 ± 39,31 капилляров/ед.пл. и 536,51 ±29,32 капилляров/ед.пл. соответственно.

Однако уже на 25-е сутки проведения вариантов непрямой реваскуляризации морфометрический анализ показал значительное увеличение микроциркуляторного русла в этих исследуемых группах. Проведенный анализ морфометрических показаний удельной плотности капиллярной сети на 25-е

сутки показал достоверное (р < 0,05) значительное увеличение плотности капиллярной сети в мышечной ткани животных I и II групп по сравнению с контрольной группой. Плотность капиллярной сети составила соответственно 726,55 ± 24,62 капилляров/ед. пл. и 887,99 ±31,4 капилляров/ед. пл., в то время как у животных контрольной группы этот показатель составил 495,47 ± 18,09 капиляров/ед. пл. При проведении обзорной микроскопии на поздних сроках (через 35 суток) после проведения лазерной реваскуляризации в сочетании с имплантацией стволовых клеток определялись участки склеротической и рубцовой ткани с различной степенью неоваскуляризации на границе с рубцовой зоной, а также непосредственно в зоне рубца. Выявлено присутствие как тонкостенных, так толстостенных капилляров синусоидного типа различного диаметра, заполненных эритроцитами, также наряду с этим определялись разрозненные скопления "сосудистых почек". Плотность капиллярной сети на 35-е сутки после непрямой реваскуляризации в группе с изолированным использованием клеток составило 758,33 ± 40,84 капилляров/ед. пл. и в группе лазерного туннелирования в сочетании с клеточной имплантацией 935,79 ± 32,19 капиляров/ед. пл., что достоверно выше (р<0,05) в сравнении с контрольной группой животных 465,74 ± 28,15 капшшяров/ед. пл. (рис.1).

Для сравнения суммарное количество капилляров поперечнополосатой мускулатуры задней группы мышц бедра интактного животного составило

543,9±16,12 капилляров/ед. пл. Сходные морфологические признаки были обнаружены после

использования высокоинтенсивного лазерного излучения на миокард собак (Евдокимов C.B. 1996) и ишемизированные мышцы бедра крыс. Где к 30-м суткам наряду с капиллярами регистрировалось появление артериол и венул малого калибра, с увеличением мелких сосудов в миокарде и бедренных мышцах в 1,8 и 1,6 раз соответственно

ср .значение 15 сут ср.значение 25 сут ср.значение 35 еут

Рис. 1. Сравнение удельной плотности капилляров

(Голованева Е.С., Попов Г.К., 2003). Следует отметить, что численное значение суммарного количества капилляров, в нашем исследовании, в группе с лазерным туннелированием и имплантацией стволовых клеток превысил аналогичный показатель группы с изолированным использованием стволовых клеток на 23 %. Приведенная динамика роста удельной плотности капилляров показывает, что, уже начиная с 15 суток, происходит резкое увеличение удельной плотности капиллярной сети, однако достоверных различий в изолированной имплантации МНФ и применения сочетанной методики не выявлено. Начиная с 25 и на 35-е сутки, отслеживается тенденция увеличения плотности капилляров в обеих исследуемых группах, однако при использовании методики с комбинированной реваскуляризацией отмечается достоверно значимое отличие по удельной плотности микроциркуляторного русла в сравнении с использованием изолированной имплантации костномозговых мононуклеарных клеток.

Исследование микроциркуляции в голени правой конечности контрольной группы на 35-е сутки выявило приближение показателя микроциркуляции к значению у левой, не ишемизированной конечности. В голени правой конечности, по сравнению с левой, отмечается увеличение (на 56,1 %) показателя, характеризующего модуляцию кровотока в микроциркуляторном русле и индекса эффективности микроциркуляции (на 31,5%). Это повышение обусловлено повышением вазомоторной активности микрососудов, о чем свидетельствует увеличение соотношения AmraLF/M - на 85,7 % и A^LF - на 88,7 %, а также увеличение вклада пассивного (дыхательного) механизма регуляции капиллярного кровотока, зависящего от колебаний венозного кровотока в связи с изменением давления в грудной клетке в фазы вдоха и выдоха (увеличивается AmaxHF - на 84,9%). Все эти изменения в михроциркуляции происходят на фоне уменьшения вклада кардиального механизма регуляции капиллярного кровотока: уменьшено соотношение AraaxCF/AmaxLF - на 42,3 %, Am„CF/6 - на 39,4 %.

При исследовании гемоциркуляции в голени правой конечности через 35 суток в условиях изолированного введения мононуклеарной фракции костномозговых клеток, как и в группе без коррекции, выявлено приближение показателя микроциркуляции к значению у левой, не ишемизированной конечности. При этом основной вклад в микроциркуляцию ишемизированной

конечности делает пассивный (кардиальный) механизм регуляции капиллярного кровотока: по сравнению с левой конечностью увеличивается АгаохСР/ АтахЬР - в 2,7 раза и АтахСР - на 88,2 %. По сравнению с группой без коррекции, в группе с коррекцией МНФ КМК выявлено снижение миогенной активности вазомоторов (уменьшается соотношение А^ЬР/М - на 46,2 %), увеличение вклада кардиального механизма регуляции капиллярного кровотока: увеличивается А^СР/А^и - в 2,1 раза.

При исследовании гемоциркуляции в голени правой конечности на 35-е сутки эксперимента в условиях комбинированного использования мононуклеарных клеток костномозгового происхождения и воздействия лазерным излучением показатель микроциркуляции не имеет достоверных отличий от значений у левой конечности. По сравнению с контрлатеральной конечностью выявлено уменьшение вклада кардиального и дыхательного механизмов регуляции капиллярного кровотока: уменьшены соотношения АгаахСР/АтахЬР - на 60,8 %, АпцщСР/З - на 42,9% и Ат^НР/Ат^ЬР - на 29 %. При этом по сравнению с группой без коррекции, в группе с коррекцией МНФ КМК и лазерным излучением выявлено увеличение значения микроциркуляции, происходящее на фоне снижения миогенной активности вазомоторов (уменьшается соотношение АтахЬР/М - на 46,2 %).

ВЫВОДЫ

1. Морфо-функционапьный анализ ишемизированных конечностей, показал: запустевание сосудов микроциркуляторного русла, развитие периваскулярного и межмышечного склероза, уменьшение численной плотности С031 позитивных сосудов, а так же уменьшение показателей кровотока: снижение индекса эффективности микроциркуляции и снижение показателей перфузии тканей.

2. Для клеточно-опосредованного ангиогенеза при имплантации мононуклеарной фракции костного мозга было характерным формирование сосудов микроциркуляторного русла с гиперхромным эндотелием, присутствием умеренного количества мононуклеарных клеток в местах имплантации, увеличение численной плотности СБ31 позитивных сосудов, а так же умеренным увеличением показателей кровотока по результатам лазерной допплеровской

флоуметрии.

3. Комбинированный клеточно-опосредованный и лазерно-индуцированный ангиогенез морфологически проявляется формированием значительного количества хаотично ориентированных сосудов с гиперхромным эндотелием и элементами ангиоматоза, формированием сосудов синусоидного типа, присутствием значительного количества мононуклеарных клеток, достоверным увеличением численной плотности CD31 позитивных сосудов, а также увеличением индекса эффективности микроциркуляции и показателей перфузии ткани.

4. Процентное соотношение имплантируемых BrdU-позитивных и негативных мононуклеарных клеток костного мозга остается неизменным в зонах инъекции как при имплантации клеток иглой, так и при введении клеток в лазерные каналы в изучаемые сроки - 6,12 и 24 часа.

5. Сопоставление результатов комбинированного лазерно-индуцированного и клеточно-опосредованного ангиогенеза против изолированной инъекции мононуклеарных клеток костного мозга проявляется достоверно значимым увеличением сосудов CD 31+ микроциркуляторно русла, а также функциональных показателей лазерной допплеровской флоуметрии, выявлен эффект улучшения микроциркуляции, наиболее выраженный функционированием активного механизма модуляции тканевого кровотока.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Для улучшения перфузии конечностей следует применять комбинированный метод имплантация костномозговых мононуклеарных клеток костного мозга в сформированные лазерные каналы, так как при этом способе наблюдается наибольшая степень неоваскуляризации.

2. Мы рекомендуем методику непрямой комбинированной реваскуляризации конечностей с использованием мононуклеарной фракции костномозговых клеток и лазерного туннелирования для дальнейшего изучения эффективности методов непрямой реваскуляризаци.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ларионов П.М., Чернявский A.M., Асташов В.В., Новрузов Р.Б., Казаков О.В., Субботин Д.В., Сергеевичев Д.С., Зайцев Г.С., Русакова Я.Л.,

Субботина O.A. Стимуляция неоваскулогенеза при ишемии нижних конечностей // Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: Биология и клиническая медицина.- 2009. -Том 7. -Выпуск 3. - С. 72-77.

2. Ларионов П.М., Чернявский A.M., Новрузов Р.Б., Лушникова Е.Л., Субботин Д.В., Сергеевичев Д.С., Кузнецова И.В., Караськов A.M., Непомнящих Л.М. Стимуляция ангиогенеза внутримышечной имплантацией клеток мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга при ишемии конечностей крысы // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2010. -№4.-С. 211-216.

3. P. M. Larionov, A. M. Chemyavskii, R.B. Novruzov, Е. L. Lushnikova, D. V. Subbotin, D. S. Sergeevichev, I. V. Kuznetsova, A.M. Karas'kov, L. M. Nepomnyashchikh. Stimulation of angiogenesis in rat ischemic limbby intramuscular implantation of mononuclear fraction cells from autologous bone marrow // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. -2011. -Vol. 150. -N.4. -P.530-534.

4. Ларионов П.М., Чернявский A.M., Асташов В.В., Новрузов P.E., Казаков О.В., Субботин Д.В., Сергеевичев Д.С., Русакова Я.Л. Морфо-функциональная оценка направленного ангиогенеза с использованием сепарированной мононуклеарной фракции костного мозга при ишемии нижних конечностей // Актуальные вопросы современной патологии : сборник научных трудов Всероссийской Юбилейной научно-практической конф. патологоанатомов с международным участием к ЮОлетию проф. П.Г. Подзолкова. Красноярск. -2008. - С. 240-243.

5. Новрузов Р.Б., Ларионов П.М., Казаков О.В., Асташов В.В. Исследование перфузии в условиях направленного ангиогенеза. // Гемореология и микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику) : материалы IIV Международной научной конференции. Ярославль, 2008. - С. 37.

6. Ларионов П.М., Новрузов Р.Б., Субботин Д.В., Сергеевичев Д.С., Казаков О.В., Асташов В.В. Стимуляция ангиогенеза при хронической ишемии нижних конечностей // Гемореология и микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику) : материалы IIV Международной научной конференции. Ярославль, 2008. - С. 38.

7. Сергеевичев Д.С., Субботин Д.В., Новрузов Р.Б., Субботина O.A., Ларионов П.М. Исследование различных фракций костного мозга для стимуляции неоангиогенеза // Новые технологии в сердечно-сосудистой хирургии и интервенционной кардиологии : Шестые научные чтения, посвященные памяти акад. РАМН ЕН. Мешалкина. Новосибирск, 2008. - С. 152.

8. Ларионов П.М., Чернявский A.M., Новрузов Р.Б., Субботин Д.В., Сергеевичев Д.С., Субботина O.A., Казаков О.В. Изучение хоуминга клеток, имплантируемых в зону ишемии нижних конечностей // Новые технологии в сердечно-сосудистой хирургии и интервенционной кардиологии : Шестые научные чтения, посвященные памяти акад. РАМН ЕН. Мешалкина. Новосибирск. -2008.-С. 153.

9. Новрузов Р.Б., Сергеевичев Д.С., Чернявский A.M., Ларионов П.М., Субботин Д.В., Караськов A.M., Русакова Я.Л., Казаков О.В. Морфологическая оценка непрямой реваскуляизации нижних конечностей в эксперименте // Семнадцатый Всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов. Москва. -2011. -Том 12. -№ 6. - С.261.

Отпечатано в типографии Новосибирского государственного Технического университета 630092, г. Новосибирск, пр. К. Маркса, 20, тел./факс: (383) 346-08-57 формат 60x84 1\16, объем 1.25 пл., тираж 100 экз. заказ № 402 подписано в печать 28.04.12 г.

/

1 2 - 1 279 9

5 /?

2011307345

2011307345

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Новрузов, Руслан Байрам оглы

СПИСОК ТЕРМИНОЛОГИЧЕСКИХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1 Современный взгляд на проблему хронической ишемии нижних конечностей.

1.2 Патоморфологические аспекты развития атеросклероза.

1.3 Основные направления хирургического и консервативного лечения хронической ишемии нижних конечностей.

1.4 Современные подходы в лечении хронической ишемии нижних конечностей.

1.5 Роль стволовых клеток в ангиогенезе.

1.6 Предшественники эндотелиальных клеток.

1.7 Молекулярные маркеры эндотелиальных клеток.

1.8 Ангиогенные факторы роста как предшественники ангиогенеза.

1.9 Лазеры в сердечно-сосудистой хирургии.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Общее описание проведенного исследования.

2.2. Методика выполнения модели хронической ишемии нижних конечностей.

2.3. Методика проведения экспериментальных исследований.

2.4. Исследование микроциркуляторного кровотока нижних конечностей методом лазерной доплеровской флоуметрии.

2.5. Методика морфологической оценки зон непрямой реваскуляризации

2.6. Методика оценки хоуминга мононуклеарной клеточной фракции методом включения 5-бромдезоксиуридина (ВгРЦ) в ядра.

2.7. Протокол окрашивания и инкубации клеток с ВгсЮ.

2.8. Методика забора и получения мононуклеарных костномозговых клеток и разделение её на фракции.

2.9. Диагностика клеточного материала.

2.10. Методика морфологической оценки экспериментальной ишемии.

2.11. Статистические методы исследования.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Верификация экспериментальной "модели" хронической ишемии нижних конечностей.

3.2 Результаты лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ).

3.3 Результаты исследования прироста величины перфузии ишемизированной конечности по данным ЛД флуометрии.

3.4 Оценка хоуминга мононуклеарной клеточной фракции методом включения 5-бромдезоксиуридина (ВгБи) в ядра.

3.5 Индукция неоангиогенеза в ишемизированной конечности.

3.6 Сравнительный морфологический анализ результатов непрямой реваскуляризации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Направленный ангиогенез с использованием клеточных технологий в сочетании с лазерным туннелированием при хронической ишемии конечностей в эксперименте"

Актуальность проблемы: Идея клеточной трансплантации для лечения хронической ишемии нижних конечностей (ХИНК) (прежде всего атеросклеротического и диабетического генеза) успешно реализуется последние 5 лет (Cho H-J et al., 2003). Эти исследования стали предпосылкой для продолжения работ по изучению неоваскуляризации с использованием «клеточных технологий». Разработке этой лечебной тактики способствовало развитие современных представлений о молекулярных и клеточных механизмах регуляции роста и ремоделирования кровеносных сосудов. Большое внимание в этом аспекте уделяется теоретическим и практическим разработкам использования клеток мононуклеарной фракции костного мозга (МНФ КМ). Это объясняется их уникальным свойством - пластичностью, т.е. способностью дифференцироваться в клетки практически всех мезенхимальных тканей. Проведен ряд исследований, в которых доказана возможность клеток костного мозга и других источников дифференцироваться в клетки других типов (нейроны головного и спинного мозга, гепатоциты, клеточные популяции поджелудочной железы, в том числе продуцирующие инсулин, эндотелиоциты, миобласты, остеоциты, хондроциты, эпителиоциты и др.), (Деев Р.В. и др., 2005; Волков А.В. и др., 2005; Chen J. et al., 2001; Arvidsson A. et al., 2002; Riess P. et al., 2002; Aliotta J. M. et al., 2007).

Хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей, по данным А.В. Покровского, страдает более 3% населения.

При этом количество больных с тяжелой ишемией пораженной конечности достаточно велико - 600-800 человек на 1 млн. жителей. Считается, что даже на фоне самого современного лечения около 25% больных с критической ишемией потребуется высокая ампутация, при которой смертность достигает

10-40%. Поскольку при критической ишемии особенно часто имеется дистальная форма поражения артериального русла, перспективы 5 традиционного хирургического вмешательства (эндартерэктомия, шунтирование), а также рентгенэндоваскулярной дезоблитерации сосудов у таких больных весьма ограниченны. И именно это и определяет стратегию лечения - восстановление кровотока в дистальных отделах пораженных конечностей.

Существует значительная группа больных, для которых выбор традиционных методов прямой реваскуляризации ограничен. Невозможность выполнения прямой реваскуляризации обусловлена не только возрастом и общим состоянием больных, сопутствующей патологией, но и многоэтажностью атеросклеротического поражения артерий, дистальными окклюзиями.

Несмотря на мощный арсенал современных фармакологических средств и хирургических методик, проблема лечения вышеуказанного контингента больных далека от решения. Хотя прямая реваскуляризация была, есть и будет в ближайшем будущем приоритетным методом лечения хронической ишемии нижних конечностей, наряду с ней одним из альтернативных путей лечения является использование непрямых методик стимуляции неоангиогенеза в поражённых конечностях, позволяющих избежать ампутации. Эти методы направлены на улучшение трофики конечности, и как следствие этого - увеличение объёма микроциркуляторного русла.

Таким образом, несмотря на мощный арсенал современных фармакологических средств и хирургических методик, проблема лечения вышеуказанного контингента больных далека от решения. Использование лазерных технологий для выполнения процедуры непрямой реваскуляризации нижних конечностей, широко распространено в настоящее время. Клинические и морфологические данные к настоящему времени показали, что для проведения процедуры лазерной реваскуляризации могут использоваться разные виды лазерных источников.

Именно эти предпосылки определили развитие альтернативных методов реваскуляризации нижних конечностей.

Решение перечисленных вопросов определяет актуальность настоящего исследования.

Цель исследования:

Изучить структурно-клеточные и функциональные изменения при клеточно-опосредованном и лазерно-индуцированном ангиогенезе в условиях хронической ишемии конечностей крыс.

Задачи исследования:

1. Дать морфо-функциональную оценку клеточно-опосредованного неоангиогенеза тканей бедра при имплантации мононуклеарной фракции клеток костного мозга.

2. Оценить морфо-функциональные изменения мышечных тканей в местах имплантации мононуклеарных клеток костного мозга в лазерные каналы.

3. Выявить особенности распределения мононуклеарных клеток при их имплантации в лазерные каналы и при инъекционном методе их введения в следующие постимплантационные периоды (6,12 и 24 часа).

4. Сопоставить структурно-клеточные и функциональные изменения, полученные при использовании лазерного туннелирования в сочетании с инъекцией костномозговых клеток и изолированной имплантации мононуклеарных клеток.

Научная новизна:

Впервые разработана в экспериментальных условиях методика имплантации костномозговых мононуклеарных клеток в лазерные каналы.

Проведен анализ непосредственных результатов и дана комплексная морфо7 функциональная оценка неоангиогенеза после комбинированного лазерно-индуцированного и клеточно-опосредованного неоангиогенеза на модели хронической ишемии конечностей крыс. Оценены отдаленные результаты комбинированного применения имплантации костномозговых мононуклеарных клеток в сочетании с лазерным туннелированием мышц конечностей. Проанализирована динамика изменения тканевого кровотока и степени ишемии конечностей при сочетанном применении лазерно-индуцированного и клеточно-опосредованного неоангиогенеза. Впервые при комплексной морфо-функциональной оценке проведен анализ ангиогенного потенциала методики лазерного туннелирования и имплантации костномозговых клеток и обоснована значимость данной методики в сердечно-сосудистой хирургии.

Теоретическая и практическая значимость:

Разработана в эксперименте методика имплантации костномозговых мононуклеарных клеточных культур и использовании полупроводникового лазера. Результаты работы позволяют сделать новый шаг по освоению метода лечения пациентов с хронической ишемией конечностей. Полученные в процессе экспериментального исследования результаты вносят существенный вклад в понимание роли эндотелиальных клеток-предшественников костномозгового происхождения в процессах васкуляризации ишемизированных областей скелетной мускулатуры, позволяют усовершенствовать метод непрямой реваскуляризации конечностей.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Комбинация клеточно-опосредованного и лазер-индуцированного ангиогенеза обладает более выраженным ангиогенным потенциалом против изолированной имплантации мононуклеарных клеток костного мозга на модели ишемии конечностей.

2. Комбинированная морфо-функциональная оценка с использованием методов иммуногистохимического определения капиллярной сети на основе окрашивания СД31+ и лазерной доплеровской флуометрии адекватно отражает состояние микроциркуляторного русла.

Апробация материалов диссертации.

Основные материалы исследования доложены на VI научных чтениях, посвященных памяти академика РАМН Е.Н.Мешалкина, с международным участием (Новосибирск, 2008), на VII Международной конференции "Гемореология и микроциркуляция" (Ярославль, 2009), на заседании ученого совета Новосибирского научно-исследовательского института патологии кровообращения имени академика E.H. Мешалкина (Новосибирск, 2009), на заседании Ученого совета Новосибирского государственного медицинского университета (Новосибирск, 2012).

Публикации по теме диссертации.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных научных работ, из них 3 статьи - в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых для публикаций результатов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста и содержит 4 таблицы и 17 рисунков, работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы результатов собственного исследования, заключения и обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Список использованной литературы содержит перечень 177 работ отечественных и зарубежных авторов. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Новрузов, Руслан Байрам оглы

Выводы:

1. Морфо-функциональный анализ ишемизированных конечностей, показал: запустевание сосудов микроциркуляторного русла, развитие периваскулярного и межмышечного склероза, уменьшение численной плотности С031 позитивных сосудов, а так же уменьшение показателей

85 кровотока: снижение индекса эффективности микроциркуляции и снижение показателей перфузии тканей.

2. Для клеточно-опосредованного ангиогенеза при имплантации мононуклеарной фракции костного мозга было характерным формирование сосудов микроциркуляторного русла с гиперхромным эндотелием, присутствием умеренного количества мононуклеарных клеток в местах имплантации, увеличение численной плотности СБЗ1 позитивных сосудов, а так же умеренным увеличением показателей кровотока по результатам лазерной допплеровской флоуметрии.

3. Комбинированный клеточно-опосредованный и лазерно-индуцированный ангиогенез морфологически проявляется формированием значительного количества хаотично ориентированных сосудов с гиперхромным эндотелием и элементами ангиоматоза, формированием сосудов синусоидного типа, присутствием значительного количества мононуклеарных клеток, достоверным увеличением численной плотности СБ31 позитивных сосудов, а также увеличением индекса эффективности микроциркуляции и показателей перфузии ткани.

4. Процентное соотношение имплантируемых ВгсШ-позитивных и негативных мононуклеарных клеток костного мозга остается неизменным в зонах инъекции как при имплантации клеток иглой, так и при введении клеток в лазерные каналы в изучаемые сроки - 6, 12 и 24 часа.

5. Сопоставление результатов комбинированного лазерно-индуцированного и клеточно-опосредованного ангиогенеза против изолированной инъекции мононуклеарных клеток костного мозга проявляется достоверно значимым увеличением сосудов СБ 31+ микроциркуляторно русла, а также функциональных показателей лазерной допплеровской флоуметрии, выявлен эффект улучшения микроциркуляции, наиболее выраженный функционированием активного механизма модуляции тканевого кровотока.

Рекомендации по использованию научных выводов:

1. Для улучшения перфузии конечностей следует применять комбинированный метод имплантация костномозговых мононуклеарных клеток костного мозга в сформированные лазерные каналы, так как при этом способе наблюдается наибольшая степень неоваскуляризации.

2. Мы рекомендуем методику непрямой комбинированной реваскуляризации конечностей с использованием мононуклеарной фракции костномозговых клеток и лазерного туннелирования для дальнейшего изучения эффективности методов непрямой реваскуляризаци.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Новрузов, Руслан Байрам оглы, Новосибирск

1. Афонин Д.Н., Лебедев Л.В. Малые ампутации при ишемии нижних конечностей. Проблемы клинической ангиологии и сосудистой хирургии. // Сборник научных работ. -Иркутск. -1999/2000. -С.15-18.

2. Беликов A.B., Скрипник A.B. Лазерные биомедицинские технологии (часть 1).// Учебное пособие.-Санкт-Петербург. -2008.

3. Бокерия Л.А., Гудкова Р.Г. // Хирургия сердца и сосудов в Российской федерации. Москва. -1998; -С 43.

4. Бурлева Е.П. Значение клинико-эпидемиологического и экономического анализа для организации помощи пациентам с хронической артериальной недостаточностью нижних конечностей. // Ангиология и сосудистая хирургия . -2002. -Т.8. -№4. -С. 15-20.

5. Бурлева Е.П. Критическая ишемия нижних конечностей: современные клинические и управленческие подходы. // Дисс. . доктора мед. наук.-Москва. -2003.

6. Бурлева Е.П., Смирнов O.A. Размышления по поводу критической ишемии конечностей. // Ангиология и сосудистая хирургия. 1999. -Том 5 — №1. -С. 17-21.

7. Волков A.B. Пластичность стволовых клеток костного мозга: участие Flk-1+ клеток в химеризации кожи и в дифференцировке // Клеточная трансплантология и тканевая инженерияю 2005.-№1.-С. 11-13.

8. Габбасов З.А., Соболева Э.Л. Стволовые клетки костного мозга и их участие в атерогенезе человека. // Клиническая геронтология. -2005. —Т. 11.— №10. -С 3-7.

9. Гавриленко A.B., Кохан Е.П., Абрамян A.B. и др. Применение поясничной симпатэктомии в лечении облитерирующий заболеваний артерий нижних конечностей современный взгляд на проблему. // Ангиология и сосудистая хирургия. -2004. -№3. -С.90-95.

10. Гавриленко A.B., Омаржанов O.A. Выбор метода хирургического лечения при критической ишемии нижних конечностей. // Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. 11. -2006. С.8.

11. Генык С.Н., Крыса В.М., Гудз И.М., Пыптюк A.B. Методический подход к лечению критической ишемии нижних конечностей. // Грудная и сердечно-сосудистая хирургия. -1996. -№6. -С.323.

12. Герасимов В.Б. , Авксентьева М.В., Воробьев П.А., Баркаган З.С.,89

13. Деркач Е.В„ Фисенко В.П. Фармакоэкономика Вазапростана при критической ишемии нижних конечностей. // Ангиология и сосудистая хирургия . -2001. -Т.7. -№3. -С.21-27.

14. Голованева Е.С., Козель А.И., Попов Г.К. Патофизиологический механизм реваскуляризации тканей с помощью воздействия высокоинтенсивного лазерного излучения. // Вестник Российской академии медицинских наук. Москва. 2003. - №6. -С.23-26.

15. Давыденко В.В., Мачс В.М. Стимулированный ангиогенез- новое направление в лечении при ишемических состояниях. // Вестник хирургии.-2000. -Т.159. -№1. С.117- 120.

16. Деев Р.В., Берсенев A.B. Роль стволовых стромальных (мезенхимальных) клеток в формировании гетеротопических оссификатов // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2005. № 1. - С. 46-48.

17. Демидова O.A. Комбинированное лечение хронической ишемии нижних конечностей с использованием стимулятора ангиогенеза. // Дисс. . кандидата мед. наук. Москва. - 2005.

18. Дерлеменко Л.И. К динамике температурных изменений в тканях при лазерном облучении. // Биофизика. 1978. - №23. - С.556- 557.

19. Диверт В.Э. Импульсная активность в кожных афферентных волокнах крысы при сочетанном воздействии локальной температуры и давления. // Бюллетень СО РАМН №4. С. 110.

20. Зусманович Ф.Н. Реваскуляризирующая остеотрепанация в лечении хронической критической ишемии конечностей. // Хирургия. 1999. -№4. -С. 10-12.

21. Казьмин З.В. Комплексное хирургическое и консервативное лечение хронической критической ишемии при отсутствии условий прямой реваскуляризации нижних конечностей. // Дисс. . кандидата мед. наук.-Москва. -2006

22. Каримов 3.3. Хирургическое лечение окклюзий бедренно-подколенно-берцового сегменте при критической ишемии. // Ангиология и сосудистая хирургия . -2001. -Т.7. -№2.С.82-85.

23. Козлов В.И. Механизм модуляции кровотока в системе микроциркуляции и его расстройство при гипертонической болезни. // Материалы II Всероссийского симпозиума «Применение лазерной допплеровской флоуметрии в медицинской практике».Москва. -2000, -С. 515.

24. Королев В.Н. Оптимизация результатов хирургического леченияпатологии периферических артерий путем использования дистанционной91гамма-терапии. // Автореферат дисс. . кандидата мед. наук. -Новосибирск. 2003.

25. Кротовский Г.С., Зудин A.M. // Тактика лечения пациентов с критической ишемией нижних конечностей. Москва. -2005.

26. Ларионов П.М., Чернявский A.M., Боярских У.А. и др. Различные варианты непрямой реваскуляризации миокарда с использованием аутологичных стволовых клеток // Медицинская консультация. 2004. -№ 45. -С.2-6.

27. Лосев Р.З., Буров Ю.А., Москаленко А.Н. и др. Хирургическое лечение больных с критической ишемией нижних конечностей атеросклеротического генеза. // Вестник хирургии. -1999. -№4. -С.42^14.

28. Лосев Р.З., Буров Ю.А., Москаленко А.Н. и др. Хирургическое лечение больных с критической ишемией нижних конечностей атеросклеротического генеза. // Вестник хирургии. -1999. -№4. -С.42-44

29. Малайцев В.В., Богданова И.М., Сухих Г.Т. Современные представления о биологии стволовой клетки. // Архив патологии-2002-№4 С.7-12

30. Петухов Е.Б., Кошкин В.М., Вагнер Т.Е. Квантовая гемотерапия при поздних стадиях хронической артериальной недостаточности. // Клиническая хирургия. -1985. -№7.С.43-45.

31. Плетнев С.Д. Лазеры в клинической медицине. // Руководство. -Москва, Медицина, 1996

32. Плетнев С.Д., Девятков Н.Д., Беляев В.П. // Газовые лазеры в экспериментальной и клинической онкологии. Москва, Медицина. -1978. -С.184.

33. Покровский A.B., Дан В.Н., Сапелкин C.B., Перисаев Г.А. Аспирин или оральные антикоагулянты после реконструктивных сосудистых операций на артериях нижних конечностей: что лучше? // Ангиология и сосудистая хирургия. 2004. -Т. 10. -№1. - С. 12-16.

34. Покровский A.B., Дан В.Н., Чупин A.B., Хоровец А.Г. Артериализация венозной системы стопы в лечении критической ишемии нижней конечности при окклюзии дистального артериального русла. // Ангиология и сосудистая хирургия. 1996. -Т. 4. -С. 73.

35. Покровский A.B., Кияшко В.А. Клиническая ангиология на пороге XXI века. // Российский медицинский журнал. 1999. -№ 3. - С. 3-7

36. Покровский A.B., Кошкин В.М., Кириченко A.A. и др. Вазапростан (простагландин El) в лечении тяжелых стадий артериальной недостаточности нижних конечностей. // Пособие для врачей. -Москва, -1999.

37. Савельев B.C., Кошкин В.М. // Критическая ишемия нижних конечностей. Москва, Медицина. -1997. - С. 11-80.

38. Сергеевичев Д.С. Морфологический и молекулярный аналих ангиогенеза при моделировании ишемии и реваскуляризации миокарда. // Автореф. дис. кандидата мед. наук. Новосибирск. -2009. -С. 21

39. Фокин A.A., Козель А.И., Конов О.И. и др. Средства оценки реваскуляризирующей возможности высокоинтенсивного лазерного излучения в процессе эксперимента на животных. // Лазерные технологии в медицине. -Челябинск. -1998. -Вып.1. -С.39-43.

40. Хамитов Ф.Ф., Брискин Б.С., Лисицкий Д.А., Чельдиев К.В. Consilium medicum. // Хирургия. 2008. -N 1. -С.70-74

41. Царев O.A. Хирургическое лечение больных облитерирующим атеросклерозом аорты и периферических артерий с использованием низкоинтенсивного лазерного излучения. // Автореферат дисс. .доктора мед. наук. -Саратов. -1999.

42. Швальб П.Г., Пешкин П.Г., Мартынов А.И. и др. Рентгеноваскулярная реваскуляризация. Москва, Медицина. - 1987. -С. 23-24

43. Шевцов В.И., Бунов B.C., Гордиевских Н.И. Влияние туннелизации на давление в полости большеберцовой кости при артериальной недостаточности в конечности. // Вестник хирургии. 1999. -№6. - С.43-46

44. Шевченко Ю.Л., Матвеев С.А. // Клеточные технологии в сердечно сосудистой хирургии. Москва, Медицина. - 2005.

45. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Гуреев С.В., Темнов А.А., Остроумов Е.Н., Васильев К.Н., Сухачев А.А., Никольская А.О., Шумаков Д.В. Клеточная трансплантация. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. -2006. -№4. -С. 94-102.

46. Amento E.P., Ehsani N., Palmer H., Libby P. (1991) Cytokines and growth factors positively and negatively regulate interstitial collagen gene expression in human vascular smooth muscle cells. // Arterioscler. Thromb.-Vol.l 1(5) -P.1223-1230.

47. Aqel N.M., Ball R.Y.,Waldmann H., Mitchinson M.J. Monocytic origin of foam cells in human atherosclerotic plaques.//Atherosclerosis, 1984, Vol.53. 265-271

48. Arvidsson A, Collin T, Kirik D, Kokaia Z, Lindvall O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. // Nat Med. 2002 Vol.8(9). -P. 928-930.

49. Asahara Т., Murohara Т., Sullivan A., Silver M., Van der Zee R., Li Т., Witzenbichler В., Schatteman G., Isner J.M. Isolation of putative progenitor cells for angiogenesis. // Science 275. -P. 964-967t

50. Aulivola B.Hile CN, Hamdan AD, Sheahan MG, Veraldi JR, Skillman JJ, Campbell DR, Scovell SD, LoGerfo FW, Pomposelli FB Jr. Major lower extremity amputation: outcome of a modern series. // Arch Surg. 2004. -Vol. 139(4). -P. 395-9; discussion 399.

51. Balzer K, Rogatti W., Ruttqerodt K. Efficacy and tolerability of intra-arterial and intravenous prostaglandin El infusions in occlusive arterial disease stage III/IV. // Vasa Suppl. -1989. Vol.28. -P. 31-38

52. Bavendiek U., Libby P., Kilbride M. et al. (2002) Induction of tissue factor expression in human endothelial cells by CD40 ligand is mediated via activator protein 1, nuclear factor kappa B, and Egr-1. // J. Biol. Chem., Vol.277(28) . -P. 25032-25039.

53. Beg A.A, Baltimore D. An essential role for NF-kappaB in preventing TNF-alpha-induced cell death. // Science. 1996. - Vol.274. . -P. 782-784.

54. Chen J., Sanberg P.R., Li Y. et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats // Stroke. -2001. Vol. 32. -P. 2682-2688.

55. Chen X, Li Y, Wang L, Katakowski M, Zhang L, Chen J, Xu Y, Gautam SC, Chopp M. Ischemic rat brain extracts induce human marrow stromal cell growth factor production. Neuropathology. 2002 Dec;22(4):275-9

56. Croce K., Libby P. (2007) Intertwining of thrombosis and inflammation in atherosclerosis. // Curr. Opin. Hematol., 14(1) . -P. 55-61

57. Cybulsky M.I., Gimbrone M.A. Jr (1991) Endothelial expression of a mononuclear leukocyte adhesion molecule during atherogenesis. // Science. 1991. -Vol.251(4995). -P. 788-791.

58. Cybulsky M.I., Iiyama K., Li H. et al. (2001) A major role for VCAM-1, butnot ICAM-1, in early atherosclerosis. // J. Clin. Invest., -Vol. 107(10). -P. 125595

59. Degischer S., Labs K.H., Hohstrasser J., Aschwanden M., Tschoepl M., Jaeger K.A. Physical training for intermittent claudication: a comparison of structured rehabilitation versus home-based training. // Vase. Med.-2002-Vol.7(2). -P. 109-115.

60. Dormandy J., Mahir M., Ascady G., Balsano F., De Leeuw P., Blombery P., Bousser M.G., Clement D., Coffman J., Deutshinoff A., et al., Fate of the patient with chronic leg ischaemia. // J. Cardiovascular Surgery. -1989. -30 (1). -P.50-57.

61. Duan J., Murohara T. et.al. Hyperholesterolemia inhibitis angiogenesis in response to hindlimb ischemia. // Circulation. -2000. -Vol. 102. -P. 370-376.

62. Esato K., Hamano K., Li T.S., Furutani A., Seyama A., Takenaka H., Zempo N. Neovascularization induced by autologous bone marrow cell implantation in peripheral arterial disease. //Cell Transplant. 2002. -Vol. 11(8). -P.747-52.

63. Ferrara N. Vascular endothelial growth factor: molecular and biological aspects // Curr. Top. Microbiol. Immunol. -1999. Vol. 237. -P.l-30.

64. Folkman J. Therapeutic angiogenesis in ischemic limb. // Ibid. -1998. -Vol. 97.-P. 1108-1110.

65. Folkman J., Klagsburn M. Angiogenetic factors. // Science. -1987. -Vol.235., №4787. -P. 442-447.

66. Fong G.H., Klingensmith J., Wood C.R. Regulation of flt-1 expression during mouse embryogenesis suggests a role in the establishment of vascular endothelium. // Dev. Dyn. -1996. -Vol.207. -P. 1-10.

67. Fuchs JSA. Atherogenesis and the medical management of Atherosclerosis. // Vascular surgery. Philadelphia: W.B. Saunders Company. -1996.-Vol.l -P.222-235.

68. Gerety S. S., Wang H. U., Chen Z. F. et al. Symmetrical mutant phenotypes96of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development // Mol. Cell. 1999. - Vol. 4. - P. 403-414.

69. Gerhard J. Muller, Brita Schaladach. Воздействие лазера на ткани при трансмиокардиальной реваскуляризации. // Лазерная медицина. 1998., Т. №2., Выпуск 1.-С. 4-8.

70. Godin I.E, Garcia-Porrero J.A., Dieterlen-Lievre F. Stem cell emergence and hemopoietic activity are incompatible in mouse intraembryonic sites. // J. Experimental Medicine. 1999. - vol.190. -P. 43-52.

71. Godin I.E., Garcia-Porrero J.A., Coutinho A.Para-aortic splanchnopleura from early mouse embryos contains В la cell progenitors. // Nature. 1993. - Vol. 364. -P. 67-70.

72. Grayston J.T. Background and current knowledge of Chlamydia pneumoniae and atherosclerosis. // J Infect Disease. 2000.-Vol.l81(3). -P. 402-410

73. Haimovici H. Matas Lecture. The early pioneers in vascular surgery and their legacy. // J Cardiovasc Surg (Torino).1984 -Vol.25(4).-P. 275-86.

74. Hardy R.I., Bove K.E., James F.W., Kaplan S., Goldman L. A histologic study of laser-induced transmyocardial channels. //Lasers. Surg. Med. -1987-Vol. 6. .-P. 563-573.

75. Helisch A., Ware A. // Thrombosis Haemostasis. 1999. 82.-P. 772-780.

76. Herzog Y., Kalcheim C., Kahane N. et al. Differential expression of neuropilin-1 and neuropilin-2 in arteries and veins // Mech. Dev. 2001. - Vol. 109. - P. 115-119.

77. Ho T.K., Rajkumar V., Black D.C., Abraham D., Baker D. Critical Limb Ischemia Classification and Therapeutic Angiogenesis. // International Journal of Angiology 2005.-Vol.14.-P. 49-59

78. Iba O, Matsubara H., Nozawa Y., Fujiyama S., Amano K., Mori Y., Kojima H., Iwasaka T. Angiogenesis is by implantation of peripheral blood mononuclear cells and platelets into ischemic limbs. // Circulation. 2002:8; 106(15) .-P. 2019-25

79. Jansen E.D., Frenz M., Kadipasaoglu K.A. et al. Laser-tissue interaction during transmyocardial laser revascularization. // Ann. Thorac. Surg. -1997. -Vol. 63. .-P. 640-647.

80. Jongstra-Bilen J., Haidari M., Zhu S.N. et al. (2006) Low-grade chronic inflammation in regions of the normal mouse arterial intima predisposed to atherosclerosis. // J. Exp. Med. .-Vol.203(9) .-P. 2073-2083

81. Kabrun N., Buhring H.J., Choi K. Flk-1 expression defines a population of early embryonic hematopoietic precursors. // Development. 1997.-Vol.124. -P. 2039-2048.

82. Kalra M, Gloviczki P, Bower TC, Panneton JM, Harmsen WS, Jenkins GD, Stanson AW, Toomey BJ, Canton LG. Limb salvage after successful pedal bypass grafting is associated with improved long-term survival. // J.Vasc.Surg. 2001. .Vol.33 (1) .-P. 6-16.

83. Kamihata H., Matsubara H., Nishiue T. et al. Implantation of bone marrowmononuclear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion andregional function via side supply of angioblasts, angiogenic ligands, and cytokines.98

84. Circulation.-2001.-Vol. 104-P. 1046-1052.

85. Kaski J.C., Zouridakis E.G. Inflammation, infection and acute coronary plaque events. //Eur Heart J. 2001.-Vol.3(I) .-P. 10-15.,

86. Kohmoto T., De Rosa C.M., Yamamoto N. Evidence of vascular growth associated with laser treatment of normal canine myocardium. // Ann Thorac Surg. 1998. -Vol.65.-P. 1360-1367.

87. Krause D.S. Plasticity of marrow-derived stem cells. // Gene Ther. 2002-Vol.9.-P. 754-758.

88. Kroger K, Stang A, Kondratieva J, Moebus S, Beck E, Schmermund A,Mohlenkamp S, Dragano N, Siegrist J, Jockel KH, Erbel R. Prevalence of peripheral arterial disease—results of the Heinz Nixdorf recall study. // Eur J Epidemiol 2006.-Vol.21.-P. 279-285

89. Kullander K. and Klein R. Mechanisms and functions of Eph and ephrin signalling // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2002. - Vol. 3. - P. 475 - 486.

90. Kvernmo H.D., Stefanovska A., Kirkeboen K.A., Kvernebo K. // Oscillations in the human cutaneous blood perfusion signal modified by endothelium-dependent and endothelium-independent vasodilators. // Microvasc. Res. 1999. .-Vol.57. № 3.-P. 298-309

91. Lagasse E.N., Connors H.A., Al-Dhalimy M.L. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. // Nat. Med. -2000. -Vol. 6. -P. 1229-1234.

92. Lawson N. D., Scheer N., Pham V. N. et al. Notch signaling is required for arterial-venous differentiation during embryonic vascular development // Development.-2001.-Vol.128.-P. 3675-3683.

93. Libby P. Current concepts of the pathogenesis of the acute coronary syndromes. // Circulation. -2001.-Vol. 104(3) .-P. 365-372

94. Libby P., Aikawa M. Stabilization of atherosclerotic plaques: new mechanisms and clinical targets. //Nat. Med.-2002-Vol 8(11) -P. 1257-1262.

95. Libby P., Simon D.I. Inflammation and thrombosis: the clot thickens. // Circulation. -2001.-Vol. 103(13): 1718-1720.

96. Libby P., Theroux P. (2005) Pathophysiology of coronary artery disease. // Circulation.-2005.-Vol 111(25): 3481-3488.

97. Mach F., Schonbeck U., Bonnefoy J.Y. et al. (1997) Activation of monocyte/macrophage functions related to acute atheroma complication by ligation of CD40: induction of collagenase, stromelysin, and tissue factor. // Circulation. .-Vol 96(2): 396-399

98. Mach F., Schonbeck U., Sukhova G.K. et al. (1998) Reduction of atherosclerosis in mice by inhibition of CD40 signalling. // Nature.-Vol 394(6689) .-P. 200-203.

99. Managment of Peripheral Arterial Disease. TransAtlantic Inter-Society Consensus. I I Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. 2000 -Vol 19 (Suppl.A)

100. Markus H.S., Ruigrok Y., Ali N., Powell J.F. Endothelial nitric oxidesynthase exon 7 polymorphism, ischemic cerebrovascular disease, and carotid atheroma. // Stroke. 1998.-Vol 29(9) .-P. 1908-11

101. Marshak D.R., Gardner R.L., Gottlieb D. // Stem cell biology. 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, -P. 550

102. Maseri A., Cianflone D. Inflammation in acute coronary syndromes. // Eur Heart J. 2002-Vol 4(B) .-P. 8-13

103. Mason D.P., Kenagy R.D., Hasenstab D. et al. (1999) Matrix metalloproteinase-9 overexpression enhances vascular smooth muscle cell migration and alters remodeling in the injured rat carotid artery. // Circ. Res.-Vol 85(12) .-P. 1179-1185

104. Maximow A. Der Lymphozyt als gemeinsame Stammzelle der verschiedenen Blutelemente in der embryonalen Entwicklung und im postfetalen Leben der Säugetiere. // Folia Haematol (Leipz). I909.-Vol.8.-P. 125-141

105. Medvinsky A.L., Samoylina N.L., Müller A.M.An early preliver intra-embryonic source of CFU-S in the developing mouse. // Nature. 1993. vol. 364. - p. 64-67

106. Michael Simons, J. Anthony Ware. Therapeutic angiogenesis in cardiovascular disease. Nature Reviews Drug Discovery. -2003., 2, №11, -P. 863872.

107. Morishige K., Shimokawa H., Matsumoto Y. et al. (2003) Overexpression of matrix metalloproteinase-9 promotes intravascular thrombus formation in porcine coronary arteries in vivo. // Cardiovasc. Res. -Vol.57(2) -P. 572-585

108. Moulton K.S., Vakili K., Zurakowski D. etal. (2003) Inhibition of plaque neovascularization reduces macrophage accumulation and progression of advanced atherosclerosis. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA.-Vol. 100(8) .-P. 4736-4741.

109. Müller A.M., Medvinsky A.L, Strouboulis J. Development of hematopoieticstem cell activity in the mouse embryo. // Immunity. 1994. -Vol.1. -P. 291—101

110. Murohara T., Ikeda H., Duan J., Shintani S., Sasaki K., Eguchi H., Onitsuka I., Matsui K., Imaizumi T. Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization. // J Clin Invest 2000-Vol. 105(11) -P. 1527-1536

111. Murray P.D.F. The development in vitro of the blood of the early chick embryo. //Proc. Roy. Soc. 1932. -Vol.111. -P. 497-521.

112. Naghavi M., Libby P., Falk E. et al. (2003) From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I. // Circulation, 108(14) .-P. 1664-1672.

113. Neri Serneri G.G., Prisco D., Martini F., et al. Acute T-cell activation is detectable in unstable angina. // Circulation. 1997. -Vol.95.-P. 1806-1812

114. Norgren L, Hiatt WR, Dormandy JA, Nehler MR, Harris KA, Fowkes FGR. Inter-Society Consensus for the Management of Peripheral Arterial Disease (TASC II). // J Vase Surg 2007. -Vol.45.-P. 65-67.

115. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Jakoniuk I., Anderson S.M., Li B., Pickel J., McKay R., Nadal-Ginard B., Bodine D.M., Leri A., Anversa P. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. // Nature 2001; 410 (6829) .-P. 701-705.

116. Ozerdem U., Alitalo K., Salven P., Li A.Contribution of bone marrow-derived pericyte precursor cells to corneal vasculogenesis. // Invest Ophthalmol Vis. Sei. 2005. -Vol.46(10) .-P. 3502-3506.

117. Pelosi E., Valtieri M., Coppola S., Bocta R., Gabbianelli M., Lulli V., Varziali G., Masella B., Muller R., Scadari C., Testa U., Bonaneo G., Peschle C. Identification of the hemangioblast in postnatal life. // Blood 2002. -Vol.100: 3203-3208

118. Pesce M., Orlandi A., Iachininoto M.G., Straino S., Torella A.R., Rizzuti V.,102

119. Pompilio G., Bonanno G., Scambia G., Capogrossi M.C. Myoendothelial differentiation of human umbilical cord blood-derived stem cells in ischemic limb tissues. // Circ Res 2003. -Vol.93; 5.-P. 51-62

120. Prockop D.G. Marrow Stromal Cells as Stem Cells for Nonhematopoietic Tissues. // Science -1997. -Vol. 276. -P. 1634-1642.

121. Raines E.W., Ferri N. (2005) Thematic review series: The immune system and atherogenesis. Cytokines affecting endothelial and smooth muscle cells in vascular disease. // J. Lipid. Res., 46(6) -P. 1081-1092

122. Riess P., Zhang C., Saatman K. et al. Transplanted neural stem cells survive, differentiate, and improve neurological motor function after experimental traumatic brain injury //Neurosurg-2000 Vol.51. -P. 1043-1054.

123. Robbins M., Topol E.J. Inflammation in acute coronary syndromes. Acutecoronary syndromes // E.J. Topol. 2nd ed., revised and expanded. N.Y.Marcel Dekker Inc., 2001. -P. 1-31.

124. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis an update.N. Engl. // J. Med., 1986,314.-P.489-500

125. Ross R., Harker L. Hyperlipidemia and atherosclerosis. // Science, 1976, 193.-P. 1094-1100.

126. Saikku P., Mattila K. Niemien M., et al. Serological evidence of an association of a novel Chlamydia, TWAR, with chronic coronary heart disease and acute myocardial infarction. //Lancet. 1998;2. -P. 983-986.

127. Schonbeck U., Sukhova G.K., Shimizu K. et al. (2000) Inhibition of CD40 signaling limits evolution of established atherosclerosis in mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(13). -P.7458-7463

128. Selvin E, Erlinger TP.// Prevalence of and risk factors for peripheral arterialdisease in the United States: National Health and Nutrition Examination Survey,1031999-2000. // Circulation. 2004. Vol. 110. -P.738-740.

129. Shintani S, Murohara T., Ikeda H., Ueno T., Sasaki K., Duan J., Imaizumi T. Augmentation of postnatal neovascularization with autologous bone marrow transplantation. // Circulation 2001:13; 103(6) . -P.897-903.

130. Spanier T., Smith C.R., Burkhoff D. Angiogenesis: a possible mechanism underlying the clinical benefits of transmyocardial laser revascularization. // J. Clin Laser Med Surg. (6) 1997. -P. 269-273.

131. Sukhova G.K., Schonbeck U., Rabkin E. et al. (1999) Evidence for increased collagenolysis by interstitial collagenases-1 and -3 in vulnerable human atheromatous plaques. // Circulation, 99(19). -P. 2503-2509.

132. Till L.E., McCulloch E.A. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. // Rad. Res. 1961; 14. -P.213-222.

133. Tomita M., Adachi Y., Yamada T. et al. Bone marrow-derived stem cells can differentiate into retinal cells in injured rat retina. // Stem cell -2002. -Vol. 20. -P. 279-283.

134. Villa N., Walker L., Lindsell C. E. et al. Vascular expression of Notch pathway receptors and ligands is restricted to arterial vessels // Mech. Dev. 2001. -Vol. 108.-P. 161-164.

135. Walter D. H., Dimmeler S. Endothelial Progenitor Cells: Regulation and Contribution to Adult Neovascularization // Herz. 2002. vol. 27. -P.579-88.

136. Wang H. U., Chen Z. F. and Anderson D. J. Molecular distinction and104angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4 // Cell. 1998. - Vol. 93. - P. 741-753.

137. Whitlow P.L, Knopf W.D., O'Neill W.W., Kaul U., Londero H., Shawl F.A. Percutaneous transmyocardial revascularization in patients with refractory angina. // Circulation. -1998. -Vol. 98. -Suppl. 1. -P.87.

138. Yamashita J., Itoh H., Hirashima M. Flkl-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors // Nature. 2000. vol. 408. -P.92-96.

139. Yannaki E., Papayannopoulou T. Stem cell have an identity crisis // Haema.- 2001.vol.4, №3. p.158-166.

140. Yin Y., Que J., Teh M. Embryonic Cell Lines with Endothelial Potential: An In Vitro System for Studying Endothelial Differentiation // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2004. vol. 24. . -P.691.

141. Young P.E., Baumhueter S., and Lasky L.A. The sialomucin CD34 is expressed on hematopoietic cells and blood vessels during murine development. // Blood.- 1995. vol. 85.-P.96-105.

142. Zhong T. P., Childs S., Leu J. P. et al. Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery // Nature. 2001. - Vol. 414. - P. 216-220.

143. Ziegelhoeffer T, Fernandez B, Kostin S, Heil M, Voswinckel R, Helisch A, Schaper W. Bone marrow-derived cells do not incorporate into the adult growing vasculature. // Circ Res 2004. Vol.94. -P. 230-238

144. Anggard E. Nitric oxide: mediator, murderer, and medicine. //Lancet. 1994.- Vol.343(8907). -P.l 199-1206