Морфологический и молекулярный анализ ангиогенеза при моделировании ишемии и реваскуляризации миокарда

Сергеевичев, Давид Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфологический и молекулярный анализ ангиогенеза при моделировании ишемии и реваскуляризации миокарда
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Морфологический и молекулярный анализ ангиогенеза при моделировании ишемии и реваскуляризации миокарда"

ии-з- 1

На правах рукописи

Сергеевичев Давид Сергеевич

МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ АНГИОГЕНЕЗА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ИШЕМИИ И РЕВАСКУЛЯРИЗАЦИИ МИОКАРДА

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск — 2009

003472601

Работа выполнена в ФГУ Новосибирском научно-исследовательском институте патологии кровообращения имени академика Е.Н.Мешалкина Росмедтехнологий и в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

Ларионов Петр Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук профессор

Архипов Сергей Алексеевич Торнуев Юрий Васильевич

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава.

Защита диссертации состоится «_»_ 2009 г.

в_час. на заседании диссертационного совета Д 001.037.01 в

ГУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2).

Автореферат диссертации разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001.037.01

доктор биологических наук Молодых Ольга Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ишемические состояния органов, в том числе инсульты, атеросклероз нижних конечностей, облитерирую-щий эндартериит, ишемическая болезнь сердца и их осложнения, занимают ведущее место среди причин инвалидизации и смертности преимущественно трудоспособного населения. Несмотря на значительный прогресс в профилактике и лечении рисков их развития, включая широкое распространение хирургических и эндоваску-лярных методов реваскуляризации, медико-социальная значимость этих патологий не снижается. По характеру и выраженности последствий, наносимых обществу (общей утрате трудоспособного населения), эти заболевания занимают второе место после рака легкого, поскольку являются наиболее частой причиной смерти в молодом возрасте. В связи с этим, разработка альтернативных методов улучшения кровоснабжения ишемизированных тканей остается актуальной. Терапевтический ангиогенез, который иноэда называют биологическим шунтированием, представляет собой новую тактику улучшения перфузии ишемизированных тканей с помощью усиления естественных, но недостаточных процессов неоваскуляризации. Разработке этой лечебной тактики способствовало развитие современных представлений о молекулярных и клеточных механизмах регуляции роста и ремоделирования кровеносных сосудов.

Большое внимание в этом аспекте уделяется теоретическим и практическим разработкам использования клеток мононуклеарной фракции костного мозга (МНФ КМ). Это объясняется их уникальным свойством - пластичностью, т.е. способностью дифференцироваться в клетки практически всех мезенхимальных тканей. Проведен ряд исследований, в которых доказана возможность клеток из костного мозга и других источников дифференцироваться в клетки других типов (нейроны головного и спинного мозга, гепатоциты, клеточные популяции поджелудочной железы, в том числе продуцирующие инсулин, эндотелиоциты, миобласты, остеоциты, хондроциты, эпителиоциты и др.) (Деев Р.В. и др., 2005; Волков А.В. и др., 2005; Chen J. et al., 2001; Arvidsson A. et al., 2002; Riess P. et al., 2002; Li Y. et al., 2002; Aliotta J.M. et al., 2007).

Большие надежды, вызванные многообещающими данными экспериментальных исследований и в основном неконтролируемых клинических исследований, сменились разочарованием после получения результатов масштабных двойных слепых рандомизированных плацебо-контролируемых клинических испытаний, не подтвердивших однозначно эффективность такой тактики (Darwin J. et al., 2007). Более того, в экспериментальном исследовании имплантации несепарированных мононуклеарных клеток (МНК) КМ в зоны ишемического поражения миокарда собак выявлен рост костных балок в рубцовой зоне (Ларионов П.М. и др., 2004).

После первой публикации (Asahara T. et al., 1997) об использовании эндотелиальных предшественников многие исследователи сосредоточили свое внимание на применении различных сепарированных клеток МНФ КМ с целью регуляции ангиоваскулогенеза. Появилось множество экспериментальных данных, свидетельствующих об ангиогенной эффективности различных фракций МНК, их сочетаний, генетических модификациях, а также о методах доставки клеток в ишемизированную область. Одним из самых многообещающих методов доставки клеток МНФ в очаг поражения на сегодняшний день является их имплантация в слепые лазерные трансмиокардиальные каналы (Ларионов П.М. и др., 2004; Patel A.N. et al., 2007; Klein H.M. et al., 2004; Angoulvant D. et al., 2004; Tse H.F. et al., 2007; Zhao H. et al., 2007; Gowdak L.H.W. et al, 2008; Horvath K.A, 2008).

Важным этапом в обосновании возможности терапевтического использования МНК с целью коррекции последствий ишемических состояний является изучение молекулярных механизмов активации и ускорения неадекватного васкулогенеза, способов оптимизации получения эндотелиальных клеток-предшественников с необходимыми свойствами. Большое значение имеет разработка подходов к снижению побочных эффектов клеточной терапии и комбинированному использованию разных методов реваскуляризации. Это обосновывает актуальность изучения особенностей репаративной регенерации миокарда в условиях хронической ишемии при инт-рамиокардиальной имплантации различных клеточных популяций МНФ КМ с использованием в качестве объекта эксперимента животного с относительно большой массой тела.

Цель исследования - изучить структурную реорганизацию миокарда и молекулярные механизмы ангиогенеза при моделирова-

нии ишемической болезни сердца и трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации с использованием интрамиокардиальной имплантации клеток мононуклеарной фракции костного мозга.

Задачи исследования:

1. Изучить морфологические и иммуногистохимические изменения миокарда собак при моделировании ишемической болезни сердца.

2. Изучить морфологические и иммуногистохимические изменения миокарда в зонах трансмиокардиальной лазерной реваскуля-ризации (ТМЛР) с имплантацией МНК КМ.

3. Оценить цитологические и молекулярные особенности прилипающих и неприлипающих к пластику мононуклеарных клеток костного мозга.

4. Оценить и сопоставить изменения микроциркуляторного русла в зонах ишемии и реваскуляризации морфологическими и радиологическими методами.

5. Изучить цитологические характеристики имплантированных клеток костного мозга, формирующих сосудистую почку.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Клетки мононуклеарной фракции костного мозга обладают ангиогенным и остеогенным потенциалом.

2. Направленная индукция аутологичныхклеток костного мозга в культуре является источником эндотелиальных клеток-предшественников.

3. К биологическим особенностям прилипающей и неприлипа-ющей фракций мононуклеарных клеток костного мозга относятся минимальные фенотипические и акцентированные молекулярно-генетические различия, что определяет потенциал их использования.

Научная новизна. Впервые проведено изучение особенностей структурной реорганизации миокарда собак при моделировании ишемических повреждений и трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации с использованием интрамиокардиальной имплантации клеток МНФ КМ. Установлено, что применение интрамиокардиальной имплантации несепарированных клеток костного мозга и трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации с имплантацией неприлипающей фракции клеток костного мозга в постинфарктный период способствует индукции ангиогенеза в рубцовой и перируб-цовой зонах миокарда левого желудочка собак. Выявлены побочные

эффекты интрамиокардиальной имплантации несепарированной фракции клеток костного мозга, заключающиеся в появлении очагов эктопической регенерации (оссификации, хондрогенеза).

Впервые показано, что кратковременное сепарирование на пластике мононуклеарных клеток костного мозга позволяет получить фракции клеток с различным ангиогенным и остеогенным потенциалом. Показано, что клетки неприлипающей фракции обладают более значительным ангиогенным потенциалом и существенно более низким остео- и хондрогенным потенциалом, чем клетки прилипающей фракции. По данным иммуноцитохимических исследований, около 90% клеток неприлипающей фракции экспрессируют маркеры эндотелиальных клеток - изолектин-В4 и УЕОР-К2 (рецептор-2 к вазо-эндотелиальному фактору роста), что позволяет отнести их к эндотелиальным предшественникам. Интрамиокардиальная имплантация неприлипающих клеток костного мозга способствует усилению экспрессии мРНК УЕСИ-А (вазо-эндотелиального фактора роста А) и 80Р-1 (стромального клеточно-продуцируемого фактора-1), необходимых для интенсификации роста сосудов.

Впервые описаны последовательные стадии новообразования сосудов в зонах корригирующих воздействий. Дана цитологическая характеристика ангиобластной клетки.

Впервые разработан метод комплексного количественного анализа уровня экспрессии мРНК генов семейства фактора роста эндотелия сосудов (УЕОБ), генов аггрекана, люмикана и остепон-тина в клетках различных МНФ КМ собаки.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в процессе исследования результаты развивают существующие представления о механизмах направленного ангиоваскулогенеза миокарда в постинфарктный период при использовании лазерных и клеточных технологий.

Обоснован метод непрямой реваскуляризации миокарда с использованием импульсного полупроводникового лазера и фракционированных МНК КМ, который используется в клинической практике ФРУ «Новосибирского НИИ патологии кровообращения Росмедтехнологий». Получена приоритетная справка № 2006128967 на выдачу патента на изобретение «Способ лазерного энграфтинга клеток».

Апробация работы. Основные положения, выводы и практические рекомендации доложены на VI научных чтениях с международ-

ным участием, посвященных памяти академика E.H. Мешалкина, «Новые технологии в сердечно-сосудистой хирургии и интервенционной кардиологии» (Новосибирск, 2008); IV Всероссийском съезде трансплантологов памяти академика В.И.Шумакова (Москва, 2008); Всероссийской юбилейной научно-практической конференции патологоанатомов с международным участием к 100-летию проф. П.Г.Подзолкова (Красноярск, 2008); межлабораторной научной конференции ФГУ Новосибирского научно-исследовательского института патологии кровообращения им. акад. Е.Н.Мешалкина Росмедтехнологий и ГУ Научно-исследовательского института региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2009).

Публикацни. По теме диссертации опубликованы 7 работ, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Материал изложен на 102 страницах компьютерного текста, включающего 25 рисунков и 6 таблиц. Список литературы содержит 137 работ. Весь материал, представленный в диссертации, собран, обработан и проанализирован лично автором.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 21 беспородных собаках обоего пола в возрасте 3-5 лет массой от 15 до 20 кг. Животных содержали в стационарных условиях вивария в условиях естественного светового режима на стандартной лабораторной диете. При проведении экспериментов руководствовались рекомендациями, изложенными в Приказе № 755 МЗ СССР от 12.08.1977 г. Все экспериментальные работы выполнены с соблюдением правил биоэтики, утвержденных Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или других целей.

У всех животных ишемические повреждения миокарда моделировали путем перевязки передней межжелудочковой артерии и коллатеральных ветвей первой диагональной артерии в услови-

ях интубационного наркоза. Формирование инфаркта миокарда подтверждалось электрокардиографически и визуально. В послеоперационном периоде все животные получали анальгетики и антибактериальную терапию. Двое животных погибли от острой сердечной недостаточности. Через 3 мес на втором этапе проведены две серии экспериментов по реваскуляризации миокарда: имплантация прилипающей фракции клеток МНФ КМ в перирубцовую зону (4 животных), ТМЛР с имплантацией неприлипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) (8 животных).

Лазерное тоннелирование осуществляли при помощи полупроводникового лазера «ИРЭ-Полюс» с длиной волны 1,56 мкм. Лазерное излучение мощностью 6 - 8 Вт проводили через кварцевый световод в непрерывном режиме (Караськов A.M. и др., 2007). Для сочетанного применения ТМЛР и имплантации МНФ КМ создавали по 8 -12 слепых (непроникающих в полость левого желудочка) косо направленных лазерных каналов перифокально области постинфарктного рубца переднебоковой стенки левого желудочка.

Костный мозг получали при пунктировании задней верхней ости подвздошной кости накануне перед повторной операцией. МНФ КМ сепарировали путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографин 1.077 г/мл при 400g в течение 30 мин. Для получения прилипающей и неприлипающей фракций клеток КМ суспензию отмывали забуференным физиологическим раствором и инкубировали 30 мин в культуральных флаконах в среде RPMI-1640 для разделения прилипающей и неприлипающей фракций МНК. Оставшиеся в суспензии клетки (неприлипающая фракция) собирали, концентрировали центрифугированием в забуференном физиологическом растворе. Процессинг клеток, адгезированных на пластике (прилипающая фракция), различался фазой снятия путем кратковременной инкубации в растворе Версена с трипсином. Перед имплантацией несепарированные клетки МНФ КМ и клетки неприлипающей фракции разводили физиологическим раствором до концентрации 5х10бкл/мл в объеме 2 мл. Полученную суспензию имплантировали в предварительно созданные лазерные каналы, наружное отверстие ушивали предварительно наложенным кисетным швом. Оставшийся клеточный материал подвергали иммуноцито-химическому и количественному ОТ-ПЦР анализу.

Затем следовал иммуноцитологический анализ быстро прилипающих и неприлипающих клеток МНФ костномозгового проис-

хождения. Фенотип различных фракций МНК КМ анализировали на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием панели антител к CD31/CD34, CD34/CD45, CD73, CD90, CD 105 (Becton Dickinson, США) согласно рекомендаций производителей.

Эвтаназию экспериментальных животных выполняли через 4 нед после повторной операции. Животных контрольной группы (п = 7) выводили из эксперимента через 3 мес после первичной операции. После макроскопического анализа производили забор материала для исследования плотности сосудов в области воздействий на миокард и ишемизированных зонах. Участки миокарда препарировали по заранее оставленным шовным меткам.

Для микроскопического исследования забирали миокард пе-реднебоковой стенки и верхушки левого желудочка сердца. Криос-татные серийные срезы толщиной 7 мкм, перпендикулярные оси трансмиокардиального канала, окрашивали гематоксилином и эозином и по ван Гизону. Производили подсчет количества и площади сосудов в выделяемой зоне как шдемизированного миокарда, так и в месте воздействия. Для этого криостатные срезы монтировали на обработанные L-полилизином предметные стекла, подсушивали и окрашивали изолекгином-В4, меченными AlexaFluor594 (Invitrogen, США) по авторской методике. Доя анализа микроциркуляции учитывали только численную плотность сосудов диаметром до 40 мкм.

Для морфологического анализа использовали программно-аппаратные комплексы на базе микроскопов Axioskop FL-40 (с камерой AxioCam MRc, программный пакет AxioVision 3.1 с модулем MultiChannel) и Axiovert М200 (с камерой AxioCam HRc, программный пакет AxioVision 4.7) (Carl Zeiss, Германия). Для подготовки гистологических образцов был использован криостат «Microm» НМ-550 (Carl Zeiss, Германия) и расходные материалы BioVitrum (Санкт-Петербург).

Для исследования уровня экспрессии мРНК генов семейства VEGF, SDF-1, аггрекана, люмикана, остеопонтина в клетках МНФ КМ был разработан метод количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Для этого были проанализированы базы данных мРНК и геномных последовательностей собаки. На основании анализа гомологии нуклеотидных последовательностей выбранных экспрессирующихся генов, а также секвенированных фрагментов генома были идентифицированы соответствующие гены и мРНК

Таблица 1. Номера последовательностей исследуемых генов из базы данных СепВапк и разработанные для них пары праймеров

Ген GenBank № Последовательность праймеров

VEGF-A NM001025370, NM001025369, NM001025368, NM001033756, NM001025367, NM003376, NM001025366 5'- CTTGCCTTGCTGCTCTACC -3'

5'- CACACAGGATGGCTTGAAG -3'

VEGF-B NM003377 5'- AGCACCAAGTCCGGATG -3'

5'- GTCTGGCTTCACAGCACTG -3'

VEGF-C NM005429.2 5'- TGCCGATGCATGTCTAAACT -3'

5'- TGAACAGGTCTCTTCATCCAG -3'

VEGF-D NM004469.2 5'- GTATGGACTCTCGCTCAGCAT -3'

5'- AGGCTCTCTTCATTGCAACAG -3'

Асап NM001135.2 NM013227.2 5'- CTGCAACTGAAGTGCCC -3'

5'- AGGCTGATGGTTCCTCTGA -3'

Lum NM002345.3 5'-GCGGCTCCAAGTGTTAGAG-3'

5' -GCGGCTCC AAGTGTTAG AG-3'

Osp NM001040058 NM000582 NMOO1040060 5'- GCCGAGGTGATAGTGTGGTT -3'

5'- GCCGAGGTGATAGTGTGGTT -3'

ß-актин NM001101.2 5'- CTGGAACGGTGAAGTGAC -3'

5'- AAGGGACTTCCTGTAACAATGC -3'

собаки. Для этих последовательностей были спроектированы пары праймеров, позволяющие специфично амплифицировагь фрагменты кДНК генов семейства VEGF, Асап, Lum, Osp, SDF-1, а также гена-нормализатора ß-актина (табл. 1).

Для ОТ-ПЦР использовали расходные материалы Axygen (США) и оборудование Bio-Rad (iQ5 Real-Time PCR Detection System, США).

Для оценки «эндотелиального потенциала» неприлипающих клеток МНФ было проведено их иммуноцитохимическое исследование после инкубации в средах направленной дифференцировки

EndoCult и MesenCult (StemCell Inc., Канада). Использованы антитела к маркерам незрелого эндотелия (изолектин-В4) и эндотелия de novo образующихся артериальных сосудов VEGF-R2 (Invitrogen, США).

Исследование перфузии миокарда до и после операции выполнено с использованием гамма-камеры «DIACAM» (Siemens, Германия) в планарном режиме.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологические изменения миокарда при моделировании ишемических повреждений. Основной морфологической характеристикой миокарда через 3 мес после моделирования ишемической болезни сердца были обширные рубцовые поля, распространяющиеся от субэпикардиального слоя миокарда через все слои к эндокарду. Наряду с этим наблюдалось своеобразное «запустевание» сосудистого русла, как крупных артериальных и венозных сосудов, так и мелких артериол и венул. Сам процесс «за-пустевания» мог реализовываться в облитерации просветов за счет гиперпластических процессов во внутреннем и еще в большей степени в среднем слое артерий. Другим вариантом ремоделирования сосудов, наблюдаемым в миокарде при данной модели хронической ишемической болезни сердца, была перекалибровка сосудов и/или формирование многоствольных сосудов. Постоянно наблюдаемым морфологическим изменением было жировое замещение миокарда, преимущественно в субэпикардиальном слое с распространением до среднего слоя. В таких случаях наблюдались группы мышечных волокон, окруженных жировой тканью. Вне очагов рубцовых изменений миокарда появлялись сосуды замыкающего типа. Среди других морфологических изменений, характеризующих использованную нами модель ишемического повреждения миокарда, следует отметить выраженный отек миокарда, присутствие в рубцовой и перирубцовой зонах очаговых лимфоцитарных инфильтратов и значительную гипертрофию отдельных мышечных волокон.

Морфологические изменения мпокарда при моделировании ишемических повреждений и реваскуляризацин мнокарда путем имплантации фракционированных клеток МНФ КМ. В 4 наблюдениях, в которых была использована имплантация прили-

пающей фракции МНК, выявлена распространенная оссификация эпикарда и субэпикардиального слоя миокарда - диффузный рост костных балок, ориентированных преимущественно к эпикарду и субэпикардиальному слою. В некоторых случаях дифференцировались хрящевые пластинки и отмечалась очаговая калыдафикация без образования костных или хрящевых структур. В местах оссифика-ции наблюдалась различной степени выраженности остеокластная реакция на эти новообразованные костные балки.

Следующим по значимости и постоянно встречающимся проявлением атипичного морфогенеза был ангиоматоз, развивающийся в зонах имплантации неприлипающих МНК. Важно отметить, что клетки, формирующие ангиоматозные структуры, часто сохраняли пролиферативную активность. Наблюдалось характерное для анги-оматоза формирование структур по типу «сосуда в сосуде». Кроме того, в зонах имплантации МНФ КМ в эпикарде и субэпикардиаль-ном слое миокарда наблюдался диффузный рост небольших моно-морфных сосудов с гиперхромным эндотелием; здесь же обнаруживались «сосудистые почки». Еще одной постоянно встречающейся морфологической характеристикой зон имплантации МНФ КМ было наличие в них очаговых инфильтратов из бластных клеток, часто с пролиферативной активностью.

Выявление распространенной оссификации миокарда после имплантации прилипающих клеток МНФ КМ и атипичного ангиомато-за после имплантации неприлипающих клеток МНФ КМ обусловило необходимость проведения специального молекулярно-генетичес-кого и цитологического анализа собственно этих фракций.

Иммунофенотипирование фракций МНК методом проточной цитофлюориметрии. Анализ иммунофенотипических характеристик МНК КМ проводили с использованием маркеров гемопо-этических стволовых клеток (СИЗ4), лимфоидных клеток (С045), эндотелиальных клеток (СЭЗ1), а также маркеров мезенхимальных стволовых клеток (СБ73, СБ90, С0105). Анализ прилипающей и неприлипающей к пластику фракций МНК КМ методом проточной цитофлюориметрии выявил их следующий фенотипический состав (табл. 2).

Распределение маркеров дифференцировки отражает преобладание клеток с фенотипом зрелых клеток крови (СШ4"/45+) и клеток с фенотипом С034"/45", последние из которых многими исследователями причисляются к категории истинно плюрипотентных.

Таблица 2. Процентное распределение суммарных гейтов клеток исследуемых фракций МНК КМ

Фракция клеток CD

31/34- 31-/34+ 31+ /34+ 31+ /34- 34/45- 34-/45+ 34+ /45+ 34+ /45- 73 90 105

Неприли-пающая 51,46 0,74 0,56 47,17 20,56 87,41 0,81 0,2 23,43 36,43 34,43

Прилипающая 55,26 0,87 0,29 43,34 11,61 78,56 0,79 0,22 34 31,57 27,86

Значение «р» 0,383 0,558 0,160 0,372 0,039* 0.038* 0,928 0,462 0,118 0,618 0,097

Примечание. * - р<0,05 при сравнении обеих фракций.

Одновременно высоким оказался процент клеток с эндотелиальным фенотипом CD311, что, по всей видимости, в условиях формирования ишемического состояния указывает на компенсаторную индукцию клеток костного мозга к продукции и дифференцировке в клетки эндотелиальной направленности.

При анализе клеточных фракций значимые различия (р<0,05) установлены только для клеток фракций CD34Y45" и CD34745+. В обеих фракциях МНФ КМ присутствовали мезенхимальные стволовые клетки (см. табл. 2), которые являются предшественниками различных соединительнотканных клеток (Pittenger M.F. et al., 1999) и могут обусловливать эктопическую регенерацию при их интрамиокардиальной имплантации.

Исследование уровня экспрессии мРНК генов аггрекана, лю-микана и остеопонтина в сепарированных клетках МНФ КМ. В связи с тем, что интрамиокардиальная имплантация прилипающих МНК в миокард вызывала такой побочный эффект, как рост костных балок, был проведен анализ хондро-остеогенного потенциала разных фракций клеток путем определения уровня экспрессии мРНК генов аггрекана, люмикана, остеопонтина. Дня данного анализа был использован метод количественной ОТ-ПЦР с интеркалирующим красителем SYBR Green I.

Установлено, что экспрессия генов хондро-остеогенеза в клетках супернатанта (непршшпающей фракции) в сравнении с клетками прилипающей фракции значительно снижена (р<0,05) (рис. 1). Выявлено, что уровень экспрессии гена аггрекана в неприлипающей фракции примерно в 3 раза ниже уровня прилипающей фракции,

о , о 4 а с

о л

х 2

° 1 а 1

аггрекан люмикан остеопонтин

Рис. 1. Относительный уровень экспрессии мРНК генов аггрекана, люми-кана и остеопонтина в неприлипающей и прилипающей фракциях МНК КМ. Значения приведены в арбитражных единицах (р<0,05).

гена люмикана - в 6 раз, гена остеопонтина ~ в ] 1 раз. Полученные данные подтверждают необходимость фракционирования клеток МНФ КМ перед интрамиокардиальной имплантацией.

Исследование уровня экспрессии мРНК генов семейства VEGF в сепарированных клетках МНФ КМ. Выраженная индукция ангиогенеза в перирубцовой зоне при проведении ТМЛР с имплантацией неприлипающей фракции МНК КМ обусловила исследование их ангиогеных свойств. Для этого был проведен количественный ПЦР-анализ экспрессии генов VEGF семейств А, В, С и D в прилипающей и неприлипающей фракциях. В клетках супер-натанта (неприлипающей фракции) была обнаружена повышенная экспрессия мРНК генов VEGF-D, -В, в меньшей степени VEGF-A, необходимых в основном для васкулогенеза артериальных сосудов (рис. 2). В клетках же прилипающей фракции был значительно повышен уровень экспрессии генов VEGF-С и -В, продукты которых в большей мере индуцируют лимфангиогенез (Olofsson В. et al, 1999; Pepper M.S. et al, 2003).

Полученные данные также свидетельствуют о целесообразности процедуры фракционирования клеток МНФ КМ для направленного васкулогенеза. Интрамиокардиальное имплантирование неприлипающей фракции МНК КМ не только снижает риск формирования

□неприлип фракция

s прилип, фракция

УЕвР-А

УЕСР-В

УЕйР-С

УЕвР-О

Рис. 2. Относительный уровень экспрессии мРНК генов У ЕСтР-А, -В, -С, -Б в клетках супернатанта и прилипающей фракции МНК КМ (р<0,05).

костных элементов в миокарде, но и способствует увеличению ангиогенного потенциала.

Морфологические изменения миокарда при моделировании ишемических повреждений и реваскуляризации миокарда путем имплантации неприлипающей фракции МНК в лазерные каналы. При обзорном микроскопическом изучении зон миокарда, в которых проводилось комбинированное лазерное воздействие с имплантацией неприлипающих клеток МНФ КМ, выявлены постоянно встречающиеся морфологические изменения, которые в основном отражали особенности неоангиогенеза при данных условиях коррекции. К таким особенностям относились: появление зон с высокой степенью неоваскуляризации, формирование крупных тонкостенных сосудов и синусоидов, ангиоматоз.

В участках кардиосклероза с высокой степенью неоваскуляризации отмечалась своеобразная ориентация коллагеновых волокон и новообразованных сосудов: среди продольно упорядоченных соединительнотканных волокон располагались поперечно ориентированные мелкие полнокровные сосуды (диаметром от 15 до 20 мкм). Крупные тонкостенные сосуды (диаметром более 1000 мкм), часто кровенаполненные, были ориентированы в направлении границы рубцовой зоны или располагались непосредственно в зоне рубца. Тонкостенные сосуды синусоидного типа (диаметром от

40 до 500 мкм) всегда были ориентированы в направлении зоны воздействия.

Интрамиокардиальный ангиоматоз был наиболее значимым и постоянно встречающимся морфогенетическим событием при постинфарктном ремоделировании миокарда в условиях ТМЛР с имплантацией МНФ КМ. В этих наблюдениях также выявлялось характерное для ангиоматоза формирование ангиальных структур по типу «сосуда в сосуде». Отмечался диффузный рост мономорфных сосудов, регистрировались «сосудистые почки».

В участках корригирующих воздействий на миокард постоянно присутствовали очаговые скопления бластных клеток, частично многоядерных, часто с пролиферативной активностью. В таких зонах прослеживались стадии формирования капилляра от крупной клетки с гиперхромным эксцентрично расположенным ядром и слабо оксифильной цитоплазмой (напоминавшей плазматическую клетку) к следующей стадии, когда ядро удлинялось и появлялось своеобразное расщепление с неравномерной конденсацией хроматина. На следующем этапе прослеживалось формирование сосудистой почки без четко сформированного просвета и далее сосудистой почки со сформированным просветом. Надо отметить, что подобные образования наблюдались в своеобразных инфильтратах, имеющих форму цепочки.

В зоне корригирующих воздействий отмечался феномен «мумификации» отдельных мышечных волокон и небольших групп волокон, для которого было характерно сохранение поперечной исчерченности мышечных сегментов.

Анализ численной плотности сосудов диаметром до 40 мкм в ишемизированном миокарде и после операции непрямой ревас-куляризации показал следующие результаты. При моделировании ишемической болезни сердца средняя плотность сосудов составила 2144±93/мм2, а при имплантации клеток МНФ КМ в лазерные каналы - 293 8±60/мм2 (на 37% больше, р<0,05). Произошло также статистически значимое увеличение удельной площади микрососудов (в среднем на 73%). Эти данные свидетельствуют о том, что наиболее выраженная индукция агиогенеза достигается при использовании ТМЛР в сочетании с имплантацией клеток в лазерные каналы.

Исследование уровня экспрессии мРНК генов УЕвЕ-А и 8БГ в ишемизированном миокарде и зонах реваскулярнзации. Анализ влияния имплантации неприлипающих клеток КМ в лазер-

О. 2

о о 0) а. с о

<ч л

ш о а.

5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

□ Контроль (ХИБС) в Имплантация клеток в

Iй

VEGF-A

SDF-1

Рис. 3. Относительный уровень экспрессии мРНК генов VEGF-A и SDF в ишемизированном миокарде и зонах имплантации неприлипающей фракции мононуклеарных клеток костного мозга (р<0,05).

ные каналы на уровень экспрессии мРНК генов VEGF-A и SDF в зонах комплексной реваскуляризации миокарда свидетельствует о достоверном увеличении продукции этих цитокинов. Через 4 нед после имплантации клеток МНФ КМ в лазерные каналы уровень экспрессии мРНК генов VEGF-A и SDF в миокарде вырос соответственно в 4 и 10 раз (рис. 3).

Полученные данные отражают высокую индуцирующую способность TMJIP с имплантацией неприлипающей фракции клеток КМ в отношении синтеза цитокинов (VEGF-A и SDF-1), осуществляющих паракринную регуляцию процессов мобилизации эндотелиальных прогениторных клеток из костного мозга в очаг ишемического поражения (Urbich С., Dimmeier S., 2004), увеличение проницаемости сосудистой стенки с зоне ишемии, усиление пролиферации и миграции эндотелиоцитов, формирования ими тубулярных структур (Breier G. et al., 1992), а также адгезию клеток-предшественников к эндотелиоцитам и элементам стромы (De Falco Е. et al., 2004).

Результаты исследований клеточных популяций в средах направленной дифференцировки. Важное значение для индукции процесса неоваскулогенеза, являющегося основным морфогенети-ческим феноменом используемых технологий реваскуляризации. имеет не только мобилизационная и хемотаксическая активность

Таблица 3. Результаты иммуноцитохимического окрашивания индуцированных фракций мононуклеарных клеток костного мозга

Изолектин-В4 VEGF-рецептор 2

всего позитивные всего позитивные

EndoCult 510 470 520 460

MesenCult 440 410 420 410

DMEM/F12 510 460 500 460

МНК КМ, но и их способность к направленной дифференцировке в очаге поражения. В этом аспекте мы исследовали «эндотелиаль-ный потенциал» неприлипающих клеток МНФ - их способность к трансдифференцировке в эндотелиоциты. Для этого было проведено иммуноцитохимическое исследование этих клеток после инкубации в средах направленной дифференцировки с последующей окраской к маркерам незрелого эндотелия (изолектин-В4) и эндотелия de novo образующихся артериальных сосудов (VEGF-R2). Процентное содержание позитивно окрашиваемых клеток совпадало в обеих группах, что свидетельствовало о солокализации этих маркеров (табл. 3).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что основная часть клеток (около 90%) неприлипающей фракции относилась к эндотелиальным предшественникам, на что указывало одновременное выявление в них изолектина-В, и VEGF-R2.

Анализ перфузии миокарда по данным сцинтиграфии. При сопоставлении данных планарной сцинтиграфии до и после операции комплексной реваскуляризации установлено, что имплантация МНК КМ в слепые лазерные каналы способствовала увеличению перфузии ишемизированного миокарда. Так, имплантация клеток МНФ в лазерные каналы обусловила увеличение перфузии на 50% в верхушечном сегменте и исчезновение дефекта перфузии по боковой стенке левого желудочка с формированием области гиперперфузии. Следует отметить, что при использовании лазерного воздействия перфузия улучшилась на 20%, при интрамиокардиальной имплантации клеток МНФ КМ - на 30% (Чернявский A.M. и др., 2007).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что использование в постинфарктный период интрамиокардиальной имплантации неприлипающих клеток МНФ КМ способствует индукции ангиогенеза в перирубцовой зоне миокарда собак. Вы-

явленный нами диффузный рост сосудов в субэпикардиальных слоях миокарда и ангиоматоз составляют морфологическую основу регистрируемого улучшения сердечной деятельности. Интрами-окардиальная имплантация клеток МНФ КМ в лазерные каналы способствует значительному увеличению удельной площади и численной плотности сосудов в зоне воздействия.

Эти данные согласуются с результатами других исследователей, которые показали, что имплантация мононуклеарных клеток костного мозга пациентам с ишемической болезнью сердца способствует в основном улучшению перфузии миокарда, но практически не влияет на размеры рубца (Yao К. et al, 2008; Zhao Q. et al, 2008). Одновременно при использовании прилипающих клеток костного мозга установлена высокая вероятность оссификации миокарда, которая относится к осложнениям проведенной клеточной терапии. Трансдифференцировка имплантированных в периинфарктную зону МНФ КМ в остеобласты и хондробласты относится к вариантам эктопической регенерации и может быть обусловлена как отсутствием в микроокружении клеток МНФ необходимых для тканеспецифичес-кой дифференцировки факторов, так и молекулярно-биологачески-ми свойствами присутствующих в имплантатах клеток, прекоммити-рованных в направлении дифференцировки соединительнотканных клеток (Haynesworth S.E. et al., 1992). Последнее подтверждается высоким уровнем экспрессии в прилипающих клетках МНФ КМ мРНК ряда генов, вовлеченных в хондро- и остеогенез.

Полученные результаты свидетельствуют о необходимом предварительном фракционировании клеток костного мозга при их имплантации в постинфарктный миокард. Важно отметить, что в зонах имплантации МНФ КМ длительное время сохраняются бластные формы, для которых характерна, как правило, высокая пролиферативная активность. Это обстоятельство требует длительного контроля за морфогенетическими событиями, происходящими как в зонах имплантации аутологичных клеток, так и в дистальных от очага инфаркта зонах миокарда.

ВЫВОДЫ

1. Применение интрамиокардиальной имплантации неприли-пающей фракции клеток костного мозга в постинфарктный период

способствует индукции ангиогенеза в рубцовой и перирубцовой зонах миокарда левого желудочка собак. К морфологическим проявлениям неоангиогенеза в миокарде при использовании лазерных и клеточных технологий относятся ангиоматоз, формирование крупных тонкостенных сосудов и синусоидов, высокая плотность новообразованных сосудов.

2. Ангиогенез в зонах корригирующих воздействий связан с пролиферативной активностью и трансформацией бластных клеток, которые формируют сосудистые почки, развивающиеся в микроцир-куляторные сосуды. Ангиобластная клетка обладает следующими морфологическими характеристиками: крупная с гиперхромным эксцентрично расположенным ядром (плазмоцитоподобная) и слабо оксифильной цитоплазмой.

3. Ангиогенный эффект имплантированных мононуклеарных клеток костного мозга обусловлен высоким содержанием (43 -47%) как в прилипающей, так и неприлипающей фракциях клеток с фенотипом СОЗ Г. Более выраженный ангиогенный потенциал клеток неприлипающей фракции обусловлен более высоким уровнем экспрессии в них мРНК генов цитокинов УЕОБ В и Б, необходимых для роста артериальных сосудов. По данным иммуноцитохими-ческого исследования, около 90% клеток неприлипающей фракции относятся к эндотелиальным предшественникам, экспрессирующим маркеры эндотелиальных клеток - гоолектин-В4 и УЕОБ-И.

4. В зонах реваскуляризации постинфарктного миокарда после лазерного воздействия с имплантацией неприлипающих клеток костного мозга значительно возрастает уровень экспрессии мРНК генов УБвР-А и 8БР-1 по сравнению с моделью ишемических повреждений без корригирующих воздействий. Эти изменения сопровождаются достоверным возрастанием структурной плотности сосудов диаметром до 40 мкм, что способствует улучшению перфузии миокарда. По данным сцинтиграфии, в верхушечном сегменте перфузия возрастает на 50%, исчезает дефект перфузии по боковой стенке левого желудочка и формируется область гиперперфузии.

5. Использование прилипающих клеток мононуклеарной фракции костного мозга в постинфарктный период вызывает распространенную оссификацию эпикарда и субэпикардиального слоя миокарда с формированием небольших костных балок. К проявлениям индуцированной эктопической оссификации миокарда

относятся также формирование хрящевых пластинок и очаговая кальцификация. Имплантация неприлипающих мононуклеарных клеток костного мозга в лазерные трансмиокардиальные каналы не вызывает эктопической регенерации миокарда.

6. Значительный остеогенный и хондрогенный потенциал мононуклеарных клеток костного мозга обусловлен присутствием как в прилипающей, так и неприлипающей фракциях мезенхимальных стволовых клеток. В прилипающей фракции клеток уровень экспрессии мРНК генов остео- и хондрогенеза (аггрекана, люмикана, остеопонтина) достоверно выше, чем в неприлипающей фракции, что обосновывают необходимость их фракционирования перед интрамиокардиальной имплантацией.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Караськов A.M., Ларионов П.М., Чернявский А.М., Субботин Д.В., Сергеевичев Д.С. и др. Морфофункциональная и молекуляр-но-генетическая оценка экспериментальных результатов вариантов непрямой реваскуляризации с использованием различных клеток костномозгового происхождения // Патология кровообращения и кардиохирургия. - 2007. - № 4. - С. 75 - 81.

2. Чернявский A.M., Ларионов П.М., Фомичев A.B., Субботин Д.В., Сергеевичев Д.С. и др. Морфофункциональная оценка различных методов непрямой реваскуляризации миокарда в эксперименте // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2007. - № 6. - С. 30-36.

3. Сергеевичев Д.С., Субботин Д.В., Новрузов Р.Б., Субботина O.A., Ларионов П.М. Исследование различных фракций костного мозга для стимуляции неоангиогенеза // VI научные чтения с международным участием, посвященные памяти акад. РАМН E.H. Мешалкина «Новые технологии в сердечно-сосудистой хирургии и интервенционной кардиологии». - Новосибирск, 2008. - С. 152.

4. Субботина O.A., Сергеевичев Д.С., Субботин Д.В., Новрузов Р.Б., Ларионов П.М. Получение кардиомиоцитоподобных клеток из мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга // VI научные чтения с международным участием, посвященные памяти акад. РАМН E.H. Мешалкина «Новые технологии в сердечно-сосу-

диетой хирургии и интервенционной кардиологии». - Новосибирск, 2008.-С. 151.

5. Ларионов П.М, Чернявский A.M., Асташов В.В, Новрузов Р.Б, Казаков О.В, Субботин Д.В, Сергеевичев Д.С. и др. Морфо-функциональная оценка направленного ангиогенеза с использованием сепарированной мононуклеарной фракции костного мозга при ишемии нижних конечностей // Актуальные вопросы современной патологии. - Красноярск, 2008. - С. 240 - 243.

6. Larionov Р.М, Chernyavsky A.M., Bondar V.U, Boyarskih U.A, Potapenko M.M., Subbotin D.V, Sergeyevichev D.S. et al. Directed angiovascular genesis // XIII International conference on the methods of aerophysical research. - Novosibirsk, 2007. - Vol. 2. - P. 98 - 102.

7. Ларионов П.М, Сергеевичев Д.С, Чернявский A.M., Новрузов Р.Б, Лушникова ЕЛ, Субботин Д.В, Караськов A.M., Непомнящих Л.М. Ангиоматоз и эктопическая оссификация в миокарде собак после интрамиокардиальной имплантации клеток мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга при моделировании ишеми-ческой болезни сердца // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 147, № 5. - С. 576 - 582.

Отпечатано с оригинал-макета, подготовленного в редакционно-издателъеком отделе ГУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2

Соискатель

Подписано в печать 19.02.2009. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 7.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сергеевичев, Давид Сергеевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Костный мозг как источник клеток-предшественников неоваскулогенеза

1.2 Особенности эмбриогенеза сосудистой системы

1.2.1 Эндотелиальные клетки во время эмбрионального развития

1.2.2 Формирование первичного капиллярного сплетения

1.2.3 Ремоделирование капиллярного сплетения в артерии и вены

1.2.4 Молекулярные маркеры эндотелиальных клеток

1.3 Формирование сосудов и ангиогенные факторы

1.3.1 Модель формирования сосудов

1.3.2 Вазо-эндотелиальные факторы роста - их разновидности и рецепторы ' 25 1.3.3.Регуляция VEGF

1.3.4 Ангиопоэтины и их Tie-рецепторы

1.3.5 Angl и стабилизация клеточной стенки

1.3.6 Ang2: агонист или антагонист?

1.4 Лектины

1.5 Резюме

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Общая структура эксперимента

2.2 Характеристика материала

2.3 Моделирование хронической ишемической болезни сердца

2.4 Получение мононуклеарной фракции аутологичных клеток костного мозга и разделение ее на фракции

2.5 Морфологическое исследование образцов.

2.6 Иммуногистохимические и иммуноцитохимические методы исследования

2.7 Молекулярные методы исследования

2.8 Проточная цитофлюориметрия

2.9 Исследование фракций МНК КМ после культивирования в средах направленной клеточной дифференцировки

2.10 Оценка перфузии миокарда с использованием 99тТс

2.11 Статистические методы исследования

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Морфологический анализ миокарда при моделировании хронической ишемической болезни сердца

3.2 Морфологический анализ миокарда при моделировании хронической ишемической болезни сердца после имплантации прилипающих клеток мононуклеарной фракции костного мозга

3.3 Морфологический анализ миокарда при моделировании хронической ишемической болезни сердца после имплантации неприлипающих клеток мононуклеарной фракции костного мозга в лазерные каналы

3.4 Морфометрический анализ миокарда при проведении реваскуляризации

3.5 Проточный цитофлюориметрический анализ популяций клеток

3.6 Оценка уровня экспрессии генов-маркеров хондро-остеогенеза

3.7 Оценка уровня экспрессии генов вазо-эндотелиальных факторов роста в сепарированных мононуклеарных клетках костного мозга

3.8 Исследование уровня экспрессии мРНК генов VEGF-A и SDF в ишемизированном миокарде и зонах реваскуляризации

3.9 Иммуноцитологическое исследование клеточных популяций в средах направленной дифференцировки

3.10 Анализ перфузии миокарда по данным сцинтиграфии после операции комплексной реваскуляризации

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфологический и молекулярный анализ ангиогенеза при моделировании ишемии и реваскуляризации миокарда"

Актуальность темы. Ишемические состояния органов, в том числе инсульты, атеросклероз нижних конечностей, облитерирующий эндартериит, ишемическая болезнь сердца и их осложнения, занимают ведущее место среди причин инвалидизации и смертности преимущественно трудоспособного населения. Несмотря на значительный прогресс в профилактике рисков их развития и лечении, включая широкое распространение хирургических и эн-доваскулярных методов реваскуляризации, медико-социальная значимость этих патологий не снижается. По характеру и выраженности последствий, наносимых обществу (общей утрате трудоспособного населения), эти заболевания занимают второе место после рака легкого, поскольку являются наиболее частой причиной смерти в молодом возрасте. В связи с этим, разработка альтернативных методов улучшения кровоснабжения ишемизированных тканей остается актуальной. Терапевтический ангиогенез, который иногда называют биологическим шунтированием, представляет собой новую тактику улучшения перфузии ишемизированных тканей с помощью усиления естественных, но недостаточных процессов неоваскуляризации. Разработке этой лечебной тактики способствовало развитие современных представлений о молекулярных и клеточных механизмах регуляции роста и ремоделирования кровеносных сосудов.

Большое внимание в этом аспекте уделяется теоретическим и практическим разработкам использования клеток мононуклеарной фракции костного мозга (МНФ КМ). Это объясняется их уникальным свойством - пластичностью, т.е. способностью дифференцироваться в клетки практически всех мезенхимальных тканей. Проведен ряд исследований, в которых доказана возможность клеток костного мозга и других источников дифференцироваться в клетки других типов (нейроны головного и спинного мозга, гепатоциты, клеточные популяции поджелудочной железы, в том числе продуцирующие инсулин, эндотелиоциты, миобласты, остеоциты, хондроциты, эпителиоциты и др.), (Деев Р.В. и др., 2005; Волков А.В. и др., 2005; Chen J. et al., 2001; Ar-vidsson A. et al., 2002; Riess P. et al., 2002; Aliotta J.M. et al., 2007).

За время, прошедшее после опубликования первой работы по терапевтическому ангиогенезу (Isner J.M. et al., 1996), было проведено более тысячи исследований, посвященных данной проблеме. Большие надежды, вызванные многообещающими данными экспериментальных исследований и в основном неконтролируемых клинических исследований, сменились разочарованием после получения результатов масштабных двойных слепых рандомизированных плацебо-контролируемых клинических испытаний, не подтвердивших однозначно эффективность такой тактики (Darwin J. et al., 2007). Более того, в экспериментальном исследовании имплантации несепарированных моно-нуклеарных клеток (МНК) КМ в зоны ишемического поражения миокарда собак выявлен рост костных балок в рубцовой зоне (Ларионов П.М. и др., 2004).

После первой публикации (Asahara T. et al., 1997) об использовании эн-дотелиальных предшественников многие исследователи сосредоточили свое внимание на применении различных сепарированных клеток МНФ КМ с целью регуляции ангиоваскулогенеза. Появилось множество экспериментальных данных, свидетельствующих об ангиогенной эффективности различных фракций МНК, их сочетаний, генетических модификациях, а также о методах доставки клеток в ишемизированную область. Одним из самых многообещающих методов доставки клеток МНФ в очаг поражения на сегодняшний день является их имплантация в слепые лазерные трансмиокардиальные каналы (Ларионов П.М. и др., 2004; Patel A.N. et al., 2007; Klein H.M. et al., 2004; Angoulvant D. et al., 2004; Zhao H. et al., 2007; Gowdak L.H.W. et al., 2008; Horvath K.A., 2008).

Важным этапом в обосновании возможности терапевтического использования МНК с целью коррекции последствий ишемических состояний является изучение молекулярных механизмов активации и ускорения неадекватного васкулогенеза, способов оптимизации получения эндотелиальных клеток-предшественников с необходимыми свойствами. Большое значение имеет разработка подходов к снижению побочных эффектов клеточной терапии и комбинированному использованию разных методов реваскуляризации. Это обосновывает актуальность изучения особенностей репаративной регенерации миокарда в условиях хронической ишемии при интрамиокардиальной имплантации различных клеточных популяций МНФ КМ с использованием в качестве объекта эксперимента животного с относительно большой массой тела.

Цель исследования

- изучить структурную реорганизацию миокарда и молекулярные механизмы ангиогенеза при моделировании ишемической болезни сердца и трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации с использованием интрамиокардиальной имплантации клеток мононуклеарной фракции костного мозга.

Задачи исследования:

2.Изучить морфологические и иммуногистохимические изменения миокарда в зонах трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации (ТМЛР) с имплантацией МНК КМ.

3.Оценить цитологические и молекулярные особенности прилипающих и неприлипающих к пластику мононуклеарных клеток костного мозга.

5.Изучить цитологические характеристики имплантированных клеток костного мозга, формирующих сосудистую почку.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Клетки мононуклеарной фракции костного мозга обладают ангиоген-ным и остеогенным потенциалом.

2. Направленная индукция аутологичных клеток костного мозга в культуре является источником эндотелиальных клеток-предшественников.

3.К биологическим особенностям прилипающей и неприлипающей фракций мононуклеарных клеток костного мозга относятся минимальные фено-типические и акцентированные молекулярно-генетические различия, что определяет потенциал их использования.

Научная новизна.

Впервые проведено изучение особенностей структурной реорганизации миокарда собак при моделировании ишемических повреждений и трансмио-кардиальной лазерной реваскуляризации с использованием интрамиокарди-альной имплантации клеток МНФ КМ. Установлено, что применение интра-миокардиальной имплантации несепарированных клеток костного мозга и трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации с имплантацией неприлипающей фракции клеток костного мозга в постинфарктный период способствует индукции ангиогенеза в рубцовой и перирубцовой зонах миокарда левого желудочка собак. Выявлены побочные эффекты интрамиокардиальной имплантации несепарированной фракции клеток костного мозга, заключающиеся в появлении очагов эктопической регенерации (оссификации, хондро-генеза).

Впервые показано, что кратковременное сепарирование на пластике мононуклеарных клеток костного мозга позволяет получить фракции клеток с различным ангиогенным и остеогенным потенциалом. Показано, что клетки неприлипающей фракции обладают более значительным ангиогенным потенциалом и существенно более низким остео- и хондрогенным потенциалом, чем клетки прилипающей фракции. По данным иммуноцитохимических исследований, около 90% клеток неприлипающей фракции экспрессируют маркеры эндотелиальных клеток - изолектин-В4 и УЕОР-Б12 (рецептор-2 к вазо-эндотелиальному фактору роста), что позволяет отнести их к эндотели-альным предшественникам. Интрамиокардиальная имплантация неприли-пающих клеток костного мозга способствует усилению экспрессии мРНК УЕОР-А (вазо-эндотелиального фактора роста А) и 8ВР-1 (стромального клеточно-продуцируемого фактора-1), необходимых для интенсификации роста сосудов.

Впервые описаны последовательные стадии новообразования сосудов в зонах корригирующих воздействий. Дана цитологическая характеристика ан-гиобластной клетки.

Впервые разработан метод комплексного количественного анализа уровня экспрессии мРНК генов семейства УЕОР, генов аггрекана, люмикана и остепонтина в клетках различных МНФ КМ собаки.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученные в процессе исследования результаты развивают существующие представления о механизмах направленного ангиоваскулогенеза миокарда в постинфарктный период при использовании лазерных и клеточных технологий.

Обоснован метод непрямой реваскуляризации миокарда с использованием импульсного полупроводникового лазера и фракционированных МНК КМ, который используется в клинической практике ФГУ «Новосибирского НИИ патологии кровообращения Росмедтехнологий». Получена приоритетная справка № 2006128967 на выдачу патента на изобретение «Способ лазерного энграфтинга клеток».

Апробация работы.

Основные положения, выводы и практические рекомендации доложены на VI научных чтениях с международным участием, посвященных памяти академика E.H. Мешалкина, «Новые технологии в сердечно-сосудистой хирургии и интервенционной кардиологии» (Новосибирск, 2008). IV Всероссийском съезде трансплантологов памяти академика В.И.Шумакова (Москва, 2008). Всероссийской юбилейной научно-практической конференции патологоанатомов с международным участием к 100-летию проф. П.Г.Подзолкова (Красноярск, 2008), межлабораторной научной конференции ФГУ Новосибирского научно-исследовательского института патологии кровообращения им. акад. Е.Н.Мешалкина Росмедтехнологий и ГУ Научно-исследовательского института региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2009).

Публикации.

По теме диссертации опубликованы 7 работ, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Материал изложен на 102 страницах компьютерного текста, включающего 25 рисунков и 6 таблиц. Список литературы содержит 137 работ. Весь материал, представленный в диссертации, собран, обработан и проанализирован лично автором.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Сергеевичев, Давид Сергеевич

ВЫВОДЫ

1. Применение интрамиокардиальной имплантации неприлипающей фракции клеток костного мозга в постинфарктный период способствует индукции ангиогенеза в рубцовой и перирубцовой зонах миокарда левого желудочка собак. К морфологическим проявлениям неоангиогенеза в миокарде при использовании лазерных и клеточных технологий относятся ангиоматоз, формирование крупных тонкостенных сосудов и синусоидов, высокая плотность новообразованных сосудов.

2. Ангиогенез в зонах корригирующих воздействий связан с пролифе-ративной активностью и трансформацией бластных клеток, которые формируют сосудистые почки, развивающиеся в микроциркуляторные сосуды. Аи-гиобластная клетка обладает следующими морфологическими характеристиками: крупная с гиперхромным эксцентрично расположенным ядром (плаз-моцитоподобная) и слабо оксифильной цитоплазмой.

3. Ангиогенный эффект имплантированных мононуклеарных клеток костного мозга обусловлен высоким содержанием (43 - 47%) как в прилипающей, так и неприлипающей фракциях клеток с фенотипом СЭ31+. Более выраженный ангиогенный потенциал клеток неприлипающей фракции обусловлен более высоким уровнем экспрессии в них мРНК генов цитокинов УЕвР В и О, необходимых для роста артериальных сосудов. По данным им-муноцитохимического исследования, около 90% клеток неприлипающей фракции относятся к эндотелиальным предшественникам, экспрессирующим маркеры эндотелиальных клеток - изолектин-В4 и УЕСР-Ы2.

4. В зонах реваскуляризации постинфарктного миокарда после лазерного воздействия с имплантацией неприлипающих клеток костного мозга значительно возрастает уровень экспрессии мРНК генов УЕвР-А и 80Р-1 по сравнению с моделью ишемических повреждений без корригирующих воздействий. Эти изменения сопровождаются достоверным возрастанием структурной плотности сосудов диаметром до 40 мкм, что способствует улучшению перфузии миокарда. По данным сцинтиграфии, в верхушечном сегменте перфузия возрастает на 50%, исчезает дефект перфузии по боковой стенке левого желудочка и формируется область гиперперфузии.

5. Использование прилипающих клеток мононуклеарной фракции костного мозга в постинфарктный период вызывает распространенную оссифи-кацию эпикарда и субэпикардиального слоя миокарда с формированием небольших костных балок. К проявлениям индуцированной эктопической ос-сификации миокарда относятся также формирование хрящевых пластинок и очаговая кальцификация. Имплантация неприлипающих мононуклеарных клеток костного мозга в лазерные трансмиокардиальные каналы не вызывает эктопической регенерации миокарда.

6. Значительный остеогенный и хондрогенный потенциал мононуклеарных клеток костного мозга обусловлен присутствием как в прилипающей, так и неприлипающей фракциях мезенхимальных стволовых клеток. В прилипающей фракции клеток уровень экспрессии мРНК генов остео- и хондро-генеза (аггрекана, люмикана, остеопонтина) достоверно выше, чем в неприлипающей фракции, что обосновывают необходимость их фракционирования перед интрамиокардиальной имплантацией.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью непрямой реваскуляризации миоркарда при хронической ишемической болезни сердца рекомендуется сочетать имплантацию непри-липающией фракции мононуклеарных клеток КМ, приготовленных согласно предложенного в исследовании протокола, с формированием 8-12 косо-расходящихся слепых трансмиокардиальных лазерных каналов.

2. При хронической ишемической болезни сердца не рекомендуется любая интрамиокардиальная имплантация прилипающих мононуклеарных клеток КМ, так как в этом случае велика вероятность формирования инра-миокардиальных очагов кальцификации, диффузных костных балок и островков хрящевой ткани.

3. Для экспериментального исследования особенностей процессов со-судообразования, сопровождающих различные физиологические и патологические состояния в тканях миокарда собаки, рекомендуется использовать предложенный нами метод количественного определения уровня экспрессии мРНК генов УЕОР-А, -В, -С, -Б, 80Р-1, а для оценки уровня хондро-остеогенного потенциала использовать анализ уровня экспресии мРНК генов аггрекана, люмикана и остепонтина в сочетании с морфологическим исследованием миокарда.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сергеевичев, Давид Сергеевич, Новосибирск

1. Волков A.B. Пластичность стволовых клеток костного мозга: участие Flk-1+ клеток в химеризации кожи и в дифференцировке // Клеточная трансплантология и тканевая инженерияю 2005. №1. - С. 11-13.

2. Головнева Е.С., Попов Г.К. Механизмы лазерной индукции неоангиогене-за // Известия Челябинского научного центра. -2003. -№ 3. С. 113-117.

3. Гольдберг Е. Д., Дыгай А. М, Шахов И. А. Методы культуры тканей в гематологии. Томск 1992.

4. Деев Р.В., Берсенев A.B. Роль стволовых стромальных (мезенхимальных) клеток в формировании гетеротопических оссификатов // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2005. № 1. - С. 46-48.

5. Козель А.И., Гиниатуллин Р.У., Евдокимов C.B. и др. Экспериментально-морфологические аспекты трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации // Хирургия. 2000. -№11.- С. 8-10.

6. Королев Н.П. Функции лектинов в клетке // Общие проблемы физико-химической биологии. Итоги науки и техники. М.: Наука. -1984. Т. 1.

7. Ларионов П.М., Чернявский A.M., Боярских У.А. и др. Различные варианты непрямой реваскуляризации миокарда с использованием аутологичных стволовых клеток // Медицинская консультация.- 2004 № 45. - С. 2 - 6.

8. Лахтин В. М. Лектины//Биотехнология. 1985.-№ 5. - С. 11-27.

9. Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А. Клеточные основы кроветворного микроокружения. М.: Медицина, 1980.

10. Хейфиц Л.Б., Абалкин В.А. Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности верографин-фиколл // Лабораторное дело. -1973.-№ 10.-С. 579-581.

11. Чернявский A.M., Ларионов П.М., Фомичев А.В. и др. Морфо-функциональная оценка различных методов непрямой реваскуляризации миокарда в эксперименте // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2007. - № 6. - С. 30-36.

12. Юрасов С.В., Владимирская Е.Б., Румянцев А.Г. и др. Выделение гемо-поэтических стволовых клеток из пуповинной крови человека для трансплантации// Гематол. и трансфузиол. -1997. Т.42(2). - С. 10-15.

13. Abedin М., Tintut Y., Demer L.L. Mesenchymal stem cells and the artery wall // Circ. Res. 2004. - Vol. 95(7). - P. 671-676.

14. Aiello L.P., Avery R.L., Arrigg P.G. et al. Vascular endothelial growth factor in ocular fluid of patients with diabetic retinopathy and other retinal disorders // N. Engl. J. Med. -1994. Vol. 331. - P. 1480-1487.

15. Al-Khaldi A., Eliopoulos N., Martineau D. et al. Postnatal bone marrow stromal cells elicit a potent VEGF-dependent neoangiogenic response in vivo // Gene Ther. 2003. - Vol. 10(8). - P. 621-629.

16. Alon Т., Hemo I., Itin A. et al. Vascular endothelial growth factor acts as a survival factor for newly formed retinal vessels and has implications for retinopathy of prematurity // Nature Med. 1995. - Vol. 1. - P. 1024-1028.

17. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids

18. Research. 1997. - Vol. 25. - P. 3389-3402.

19. Angoulvant D., Fazel S., Li R.K. Neovascularization derived from cell transplantation in ischemic myocardium // Mol. Cell Biochem- 2004. Vol. 264. -P. 133-142.

20. Arvidsson A., Collin T., Kirik D. et al. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke // Nature Medicine. 2002. -Vol. 8.-P. 963-970.

21. Asahara T., Murohara T., Sullivan A. et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis // Science. -1997. -Vol. 275. -P. 964-967.

22. Baksh D., Song L., Tuan R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy // J. Cell. Mol. Med. 2004. - Vol 8 (3). - P. 301-316.

23. Benjamin L. E., Hemo I. And Keshet E. A plasticity window for blood vessel remodeling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF // Development. 1998. - Vol. 125.-P. 1591-1598.

24. Bellomo D., Headrick J.P., Silins G.U. et al. Mice lacking the vascular endothelial growth factor-B gene (Vegfb) have smaller hearts, dysfunctional coronary vasculature, and impaired recovery from cardiac ischemia // Circ. Res. -2000.-Vol. 86. E29-E35.

25. Bhatia M. AC 133 expression in human stem cells // Leukemia. 2001. - Vol. 15(11).-P. 1685-1688.

26. Brown J., Hunt R. Lectins // Intern. Rev. Cytol. -1978. -Vol. 52. -P. 277-349.

27. Campagnoli C., Roberts I.A., Kumar S. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow // Blood. 2001. -Vol. 98. - P. 2396-2402.

28. Carmeliet P. and Jain R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases // Nature. 2000. - Vol. 407. - P. 249-257.

29. Carmeliet P., Ferreira V., Breier G. et al. Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single VEGF allele // Nature. -1996. Vol. 380.-P. 435^139.

30. Carmeliet P., Ng Y., Nuyens D. et al. Impaired myocardial angiogenesis and ischemic cardiomyopathy in mice lacking the vascular endothelial growth factor isoforms VEGF 164 and VEGF 188 //Nature Med.-1999.-Vol.5.-P.495-502.

31. Chen J., Sanberg P.R., Li Y. et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats // Stroke. -2001Vol. 32. P. 2682-2688.

32. Choi K., Kennedy M., Kazarov A. et al. A common precursor for hematopoietic and endothelial cells // Development. -1998. -Vol. 125. -P. 725-732.

33. Chomczynski P. and Sacchi. N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Analytical Biochem-istr. 1987. -Vol. 162.-P. 156-159.

34. Coulombel L. Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays // 0ncogene.-2004.-Vol.23 .-P. 210-7222.

35. Darwin J. Prockop and Scott D. Olson. Clinical trials with adult stem/progenitor cells for tissue repair: let's not overlook some essential precautions // Blood. 2007. - Vol. 109(8). - P. 3147-3151.

36. Davis S., Aldrich T.H., Jones P.F. et al. Isolation of angiopoietin-1, a ligand for the TIE2 receptor, by secretion-trap expression cloning // Cell. 1996. -Vol. 87.-P. 1161-1169.

37. De Falco E., Porcelli D., Torella A.R. SDF-1 involvement in endothelial phe-notype and ischemia-induced recruitment of bone marrow progenitor cells. // Blood. 2004. - Vol. 104. - P. 3472-3482.

38. Detmar M., Brown L.F., Schon M.P. et al. Increased microvascular density and enhanced leukocyte rolling and adhesion in the skin of VEGF transgenic mice // J. Invest. Dermatol. 1998. - Vol. 111. - P. 1-6.

39. Dimmeler S. and A. Leri Aging and Disease as Modifiers of Efficacy of Cell Therapy//Circ. Res.-2008. Vol.102 (11). - P. 1319 - 1330.

40. Drake C.J., Little C.D. VEGF and vascular fusion: implications for normal and pathological vessels. //J. Histochem. Cytochem.-1999.-Vol.47.-P.1351-1356.

41. Dumont D. J., Gradwohl G. J., Fong G.-H. et al. The endothelial-specific receptor tyrosine kinase, tek, is a member of a new subfamily of receptors // Oncogene. 1993.-Vol. 8.-P. 1293-1301.

42. Eichmann A., Marcelle C. et al. Two molecules related to the VEGF receptor are expressed in early endothelial cells during avian embryonic development // Mech. Dev. 1993. - vol. 42, P. 33-48.

43. Eriksson U. and Alitalo K. Structure, expression and receptor-binding properties of novel vascular endothelial growth factors // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1999. - Vol. 237. - P. 4157.

44. Ferrara N. The Biology of Vascular Endothelial Growth Factor. // Endocrine Reviews. 1997. - Vol. 18 (1). -P. 4-25.

45. Ferrara N. et al. Vascular endothelial growth factor is essential for corpus lu-teum angiogenesis // Nature Med. 1998. -Vol. 4. - P. 336-340.

46. Ferrara N. Vascular endothelial growth factor: molecular and biological aspects // Curr. Top. Microbiol. Immunol. -1999. Vol. 237. - P. 1-30.

47. Fong G. H., Rossant J., Gertenstein M. et al. Role of the Fit-1 receptor tyrosine kinase in regulating assembly of vascular endothelium // Nature. 1995. -Vol. 376. - P.66-70.

48. Gehling U.M., Ergiin S., Schumacher U. In vitro differentiation of endothelial cells from AC133-positive progenitor cells // Blood. 2000. - Vol. 95(10). - P. 3106-3112.

49. Gentili C, Cancedda R. Cartilage and bone extracellular matrix. // Current pharmaceutical design. 2009. - Vol. 15(12).- P. 1334-1348.

50. Gerber H. P. et al. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice // Development. 1999a. - Vol. 126. - P. 1149-1159.

51. Gerber H. P. et al. VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification and angiogenesis during endochondral bone formation // Nature Med. -1999b.-Vol. 5.-P. 623-628.

52. Gerety S. S., Wang H. U., Chen Z. F. et al. Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development // Mol. Cell. 1999. - Vol. 4. - P. 403-414.

53. Goede V., Schmidt T., Kimmina S. et al. Analysis of blood vessel maturation processes during cyclic ovarian angiogenesis // Lab. Invest. 1998. - Vol. 78. -P. 1385-1394.

54. Gold E., Balding P. Receptor-specific proteins: plant and animal lectins // New York. 1975.

55. Goldstein I., Hayes C. Advances in carbohydrate chemistry and biochemistry // New York. 1978. - Vol. 35. - P. 127-340.

56. Gowdak L.H., Schettert I.T., Rochitte C.E. Transmyocardial laser revascularization plus cell therapy for refractory angina // Int. J. Cardiol. 2008. - Vol. 127(2).-P. 295-297.

57. Guofeng R., Lloyd H.M., Entman M.L. Morphological characteristics of the microvasculature in healing myocardial infarcts. // J. of Histochemistry and Cytochemistry. 2002. - vol. 50. - P. 71-79.

58. Hasebe H., Osada M., Kodama Y. Therapeutic angiogenesis by autologous transplantation of bone-marrow cells in a patient with progressive limb ischemia due to arteriosclerosis obliterans: a case report // J. Cardiol. 2004. - Vol. 43(4).-P. 179-183.

59. Heeschen C., Lehmann R., Honold J. et al. Profoundly reduced neovascularization capacity of bone marrow mononuclear cells derived from patients with chronic ischemic heart disease //Circulation.-2004.-Vol. 109. P. 1615-1622.

60. Herzog Y., Kalcheim C., Kahane N. et al. Differential expression of neu-ropilin-1 and neuropilin-2 in arteries and veins // Mech. Dev. 2001. - Vol. 109.-P. 115-119.

61. Hitchon C., Wong K., Ma G. et al. Hypoxia-induced production of stromal cell-derived factor 1 (CXCL12) and vascular endothelial growth factor bysynovial fibroblasts // Arthritis Rheum. -2002.-Vol.46(10). P. 2587-2597.

62. Hiratsuka S., Minowa O., Kuno J.et al. Flt-1 lacking the tyrosine kinase domain is sufficient for normal development and angiogenesis in mice // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. - Vol. 95. - P. 9349-9354.

63. Holash J., Wiegand S. J. and Yancopoulos G. D. New model of tumor angiogenesis: dynamic balance between vessel regression and growth mediated by angiopoietins and VEGF // Oncogene. 1999. - Vol. 18. - P. 5356-5362.

64. Holash J. et al. Vessel cooption, regression, and growth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF // Science. 1999. - Vol. 284. -. 1994-1998.

65. Horvath K.A. Transmyocardial laser revascularization // J. Card. Surg. -2008. Vol. 23(3). - P. 266-76.

66. Huss R.N. Isolation of Primary and Immortalized CD34- Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells // Stem cell. -2000. -Vol. 18. P. 1-9.

67. Iba O., Matsubara H., Nozawa Y. Angiogenesis by implantation of peripheral blood mononuclear cells and platelets into ischemic limbs // Circulation. -2002. Vol. 106(15). - P. 2019-2025.

68. Isner J.M. Tissue responses to ischemia: local and remote responses for preserving perfusion of ischemic muscle. //Journal of Clinical Investigation. -2000. Vol. 106. - P. 615-621.

69. Issa Z, Bhakta D, Navarrete A. et al. A novel canine model of ischemic ventricular arrhythmias.// Heart Rhythm. 2004. - IS. - S189.

70. Iwama A. et al. Molecular cloning and characterization of mouse Tie and Tek receptor tyrosine kinase genes and their expression in hematopoietic stem cells //Biochem. Biophys. Res. Commun.-1993.-Vol. 195.-P. 301-309.

71. Jaakola L., Pirttila A.M., Vuosku J. et al., Method based on electrophoresis and gel extraction for obtaining genomic DNA-free cDNA without DNase treatment // BioTechniques. 2004. - Vol. 37. - P. 744-748.

72. Jackson K.A., Majka S.M., Wang H. et al. Regeneration of ischemic cardiacmuscle and vascular endothelium by adult stem cells// J. Clin. Invest. 2001. -Vol.107(11). - P. 1355-1356.

73. Kawasaki T., Kitsukawa T., Bekku Y. et al. A requirement for neuropilin-1 in embryonic vessel formation //Devel.-1999.-Vol.126.-P. 4895-4902.

74. Kocher A.A., Szabolcs M.J., Takuma S. et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblastsprevent.//Nat.Med. -2001,-Vol.7.-P.430-436.

75. Kullander K. and Klein R. Mechanisms and functions of Eph and ephrin signalling // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2002. - Vol. 3. - P. 475 - 486.

76. Lando D, Peet D.J., Whelan D.A. et al. Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain a hypoxic switch//Science.-2002.-Vol.295.-P.858-861.

77. Larcher F., Murillas R., Bolontrade M. et al. VEGF/VPF overexpression in skin of transgenic mice induces angiogenesis, vascular hyperpermeability and accelerated tumor development // Oncogene-1998.-Vol.l7.-P.303-311.

78. Larrivee B, Niessen K, Pollet I, et al Minimal contribution of marrow-derived endothelial precursors to tumor vasculature. // J. Immunol. 2005. - Vol. 175. - P.2890-2899.

79. Lawson N. D., Scheer N., Pham V. N. et al. Notch signaling is required for arterial-venous differentiation during embryonic vascular development // Development. 2001. - Vol. 128. - P. 3675-3683.

80. Le Noble F., Moyon D., Pardanaud L. et al. Flow regulates arterial-venous differentiation in the chick embryo // Develop. -2004. -Vol.131. -P.361-375.

81. Lee R.J., Springer M.L., Blanco-Bose W.E. VEGF gene delivery to myocardium deleterious effects of unregulated expression // Circulation. 2000.1. Vol. 102.-P. 898-901.

82. Levenberg S., Golub J.S., Amit M. et al. Endothelial cells derived from human embryonic stem cells//Proc. Natl. Acad. Sci.-2002.-Vol.99.-P.4391-4396.

83. Li Y., Chen J., Chen X.G. et al. Human marrow stromal cell therapy for stroke in rat // Neurology. 2002. - Vol. 59. - P. 514-523.

84. Maisonpierre P.C., Goldfarb M., Yancopoulos G.D. et al. Distinct rat genes with related profiles of expression define a Tie receptor tyrosine kinase family //Oncogene. 1993.-Vol. 8.-P. 1631 - 1637.

85. Maisonpierre P. C. et al. Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis // Science 1997. - Vol. 277. - P. 55-60.

86. Masuda H., Kalka C., Asahara T. Endothelial progenitor cells for regeneration // Hum Cell. 2000. - Vol. 13(4). - P. 153-160.

87. Muller-Ehmsen J., Braun D., Schneider T. et al. Decreased number of circulating progenitor cells in obesity: beneficial effects of weight reduction//Eur. Heart J. 2008. - Vol .29(12). - P. 1560 - 1568.

88. Murohara T., Ikeda H., Duan J. et al. Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization // J. Clin. Invest. -2000.-Vol. 105(11).-P. 1527-1536.

89. Murray P. The development «in vitro» of blood of the early chick embryo // Proc. Roy. Soc. 1932.-Vol. 111. - P. 497-521.

90. Neufeld G., Cohen T., Shraga N. et al. The neuropilins: multifunctional semaphorin and VEGF receptors that modulate axon guidance and angiogenesis//Trends Cardio vase. Med. -2002. Vol. 12.-P. 13-19.

91. Nicolson G., Irimura T. Lectins//Biology Cell.-1984.-Vol.51.-P.157-164.

92. Olofsson, B., Jeltsch, M., Eriksson, U. et al. Current biology of VEGF-B and VEGF-C. // Curr. Opin. Biotechnol. 1999. - Vol. 10. - P. 528-535.

93. Ozawa C. R., Banfi A., Glazer N. L. Microenvironmental VEGF concentration, not total dose, determines a threshold between normal and aberrant angiogenesis//J. Clin. Invest. 2004.-Vol. 113. - P. 516-527.

94. Nagy J. A., Vasile E., Feng D. Vascular Permeability Factor/Vascular Endothelial Growth Factor Induces Lymphangiogenesis as well as Angiogenesis // J. Exp. Med. 2002.-Vol. 196(11).- P. 1497-1506.

95. Paku S., Paweletz N. First steps of tumor-related angiogenesis. // Lab Invest Patel AN, Spadaccio C, Kuzman M. 1991. - Vol. 65. - P. 334-346.

96. Patel A.N., Spadaccio C., Kuzman M. et al. Improved cell survival in infarc-ted myocardium using a novel combination transmyocardial laser and cell delivery system // Cell Transplant. -2007. Vol. 16(9). P. 899-905.

97. Pérsico M. G., Vincenti V. and DiPalma T. Structure, expression and receptor-binding properties of placenta growth factor (P1GF) // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1999. - Vol. 237. - P. 31-40.

98. Pesce M., Orlandi A., Iachininoto M.G. Myoendothelial differentiation of human umbilical cord blood-derived stem cells in ischemic limb tissues // Circ Res. 2003. - Vol. 93(5). - E51-62.

99. Pettersson A., Nagy J.A., Brown L.F., Heterogeneity of the angiogenic response induced in different normal adult tissues by vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor // Lab.Inv. 2000.-Vol.80. P. 99-115.

100. Pierce E. A., Foley E. D. and Smith L. E. Regulation of vascular endothelial growth factor by oxygen in a model of retinopathy of prematurity // Arch. Ophthalmol. 1996. - Vol. 114. - P. 1219-1228.

101. Riess P., Zhang C., Saatman K. et al. Transplanted neural stem cells survive, differentiate, and improve neurological motor function after experimental traumatic brain injury //Neurosurg-2000.- Vol.51. -P. 1043-1054.

102. Sabin F. On the origin of the lymphatic system from the veins and the de-celopment of the lymph hearts and thoracic duct in the pig // Am. J. Anat. -1902.-Vol. l.-P. 367- 391.

103. Sabin F. Studies on the origin of blood-vessels and of red blood corpusculesas seen in the living blastoderm of chicks during the second day of incubation // Carnegie Contrib. Embryol. -1920. Vol. 272 .- P. 214-262.

104. Shalaby F. et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice // Nature. 1995. - Vol. 376. - P. 62-66.

105. Ozaki S., Meyns B., Racz R. et al. Effect of transmyocardial laser revascularization on chronic ischemic hearts in sheep// Eur. J. Cardiothorac. Surg. -2000,-Vol. 18.- P. 404-410.

106. Soker S., Takashima S., Miao H. et al. Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular endothelial growth factor // Cell. 1998. - Vol. 92. - P. 735-745.

107. Springer M. L., Chen A. S., Kraft P. E. et al. VEGF gene delivery to muscle: potential role for vasculogenesis // Mol. Cell.-1998.-Vol.2.- P.549-558.

108. Stacker, S. A., Caesar, C., Baldwin, M. E. et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics // Nature Medicine. 2001. -Vol. 7.-P. 186-191.

109. Stone J., Itin A., Alon T. et al. Development of retinal vasculature is mediated by hypoxia-induced vascular endothelial growth factor (VEGF) expression i by neuroglia // J. Neurosci. 1995. - Vol. 15. - P. 4738-4747.

110. Stone J., Chan-Ling T., Pe'er J. et al. Roles of vascular endothelial growth factor and astrocyte degeneration in the genesis of retinopathy of prematurity // Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 1996. - Vol. 37. - P. 290-299.

111. Suri C. et al. Requisite role of Angiopoietin-1, a ligand for the Tie2 receptor, during embryonic angiogenesis // Cell. -1996. -Vol. 87. P. 1171-1180.

112. Suri C. et al. Angiopoietin-1 promotes increased vascularization in vivo // Science. 1998.-Vol. 282.-P. 468-471.

113. Taipale J. et al. Vascular endothelial growth factor receptor-3 // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1999. - Vol. 237. - P. 85-96.

114. Takahashi T, Shibuya M. The vascular endothelial growth factor (VEGF)/

115. VEGF receptor system and its role under physiological and pathological conditions // Clinical Science. 2005.- Vol. 109. - P. 227-241.

116. Thurston G., Suri C., Smith K. et al. Leakage-resistant blood vessels in mice transgenically overexpressing Ang-1//Science-1999.-Vol.286.-P.2511-2514.

117. Thurston G., Rudge J.S., Ioffe E. et al. Angiopoietin-1 protects the adult vasculature against plasma leakage // Nat. Med.-2000.-Vol. 6. P. 460-463.

118. Valenzuela D.M., Griffiths J., Rojas J. et al. Angiopoietins 3 and 4: diverging gene counterparts in mouse and man // Proc. Natl Acad. Sci. 1999. - Vol.96. -P. 1904-1909.

119. Villa N., Walker L., Lindsell C. E. et al. Vascular expression of Notch pathway receptors and ligands is restricted to arterial vessels // Mech. Dev. 2001. -Vol. 108.-P. 161-164.

120. Wang H. U., Chen Z. F. and Anderson D. J. Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4 // Cell. 1998. - Vol. 93. - P. 741-753.

121. Wenhui J, Aiqun M., Tingzhong W. et al Homing and differentiation of mesenchymal stem cells delivered intravenously to ischemic myocardium in vivo: a time-series study // Arc. Eur. J. Physiol. 2006. - Vol. 453(1). - P. 43-52.

122. Yamaguchi M., Ikebuchi K., Hirayama K. Different adhesive characteristics and VLA-4 expression of CD34+ progenitors in G0/G1 versus S+G2/M phases of the cell cycle // Blood. 1998. - Vol. 92. - P. 842-848.

123. Zahradka P. Novel Role for Osteopontin in Cardiac Fibrosis // Circulation Research. 2008. - Vol. 102. - P. 270-272.

124. Zagzag D. et al. In situ expression of angiopoietins in astrocytomas identifies angiopoietin-2 as an early marker of tumor angiogenesis // Exp. Neurol. -1999.-Vol. 159.-P. 391-400.

125. Zhao H., Wan F. Bone marrow cell transplantation combined with transmyo-cardial revascularization and off-pump coronary bypass grafting: three-in-one surgery on ischemic heart // Beijing Da Xue Bao.-2007.- Vol.39.-P. 432-433.

126. Zhong T. P., Childs S., Leu J. P. et al. Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery // Nature. 2001. - Vol. 414. - P. 216-220.

Информация о работе

Сергеевичев, Давид Сергеевич
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2009
ВАК 03.00.25

Диссертация

Морфологический и молекулярный анализ ангиогенеза при моделировании ишемии и реваскуляризации миокарда - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы