Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нанобиокомпозитные материалы с использованием оксидоредуктаз

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Нанобиокомпозитные материалы с использованием оксидоредуктаз"

На правах рукописи

Зейфман Юлия Сергеевна

Нанобиокомпозитные материалы с использованием оксидоредуктаз: получение, свойства и применение

03.01.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

г 1 ПАР 2013

005050930

Москва-2013

005050930

Работа выполнена в отделе «Белковая фабрика» Курчатовского НБИКС-центра Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт» и лаборатории инженерной энзимологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук.

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ведущая организация

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Попов Владимир Олегович

Решетилов Анатолий Николаевич

доктор химических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, заведующий лабораторией биосенсоров

Жердев Анатолий Виталиевич

кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, ведущий научный сотрудник

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Защита состоится «11» апреля 2013г. в часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.ЗЗ, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.ЗЗ, строение 1.

Автореферат разослан «07»

Исср< ^ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее время интенсивно развивается новое научное направление, бионика, включающее в себя фундаментальные и прикладные исследования на границе двух областей - электроники и биологии. Современная проблема бионики состоит в создании интерфейса между «живым и неживым», а именно в эффективном сопряжении биологических систем с электронным устройством. Примером успешной реализации автономного биоэлектронного устройства является кохлеарный имплантат («бионическое ухо») -сложное электронное устройство, имплантируемое в улитку внутреннего уха с целью стимуляции слуховых нервов.

Биокомпозитные материалы являются весьма перспективными для клеточной инженерии, электростимулирования роста нервных клеток, создания имплантатов для контролируемого введения лекарственных средств, био-/хемосенсоров и других устройств. Использование электропроводящих материалов, включая электропроводящие полимеры, такие как полианилин, полипиррол или полиэти-лендиокситиофен, позволяет получать композиты с различными биоматериалами с сохранением биологической активности последних, которую можно изменять воздействием электрического поля. Электропроводящие нано/микроматериалы позволяют электронно соединять в единые гибридные системы белки, ферменты, ДНК или живые клетки.

Использование нанобиокомпозитных материалов позволит повысить эффективность гибридных биоустройств за счет увеличения полезной площади при одинаковых геометрических размерах (создание так называемых трехмерных биоансамблей). Кроме того, переход к биосенсорам и биотопливным элементам (БТЭ) нано- и микроразмеров позволяет увеличивать диффузионный массопере-нос субстратов к поверхности электродов за счет перехода от планарной к полусферической диффузии, что в конечном счете приводит к увеличению удельной мощности БТЭ и снижению предела обнаружения биосенсоров.

В последние годы большое внимание уделяется разработке потенциально имплантируемых миниатюрных автономных источников электропитания (АИЭ), в том числе биотопливных элементов и суперконденсаторов. Безмембранные биотопливные элементы, использующие в качестве топлива глюкозу, а в качестве окислителя дикислород, растворенные в биологических жидкостях, имеют большой потенциал для обеспечения энергией различных имплантированных биомедицинских устройств. Использование нанобиокомпозитных катализаторов в БТЭ позволит повысить эффективность этих устройств. Биокомпозиты также

могут являться основой для создания суперконденсаторов, аккумулирующих энергию, вырабатываемую биотопливным элементом.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение нанобиокомпозитных материалов на основе редокс-ферментов и их использование для конструирования потенциально имплантируемых автономных источников электропитания, а именно биотопливных элементов и суперконденсаторов.

Для достижения данных целей были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать биохимические и кинетические параметры используемых в работе оксидоредуктаз (билирубиноксидазы и целлобиозодегидрогеназы).

2. Получить биокомпозиты на основе редокс-ферментов и электропроводящих наноматериалов и изучить их характеристики.

3. Разработать методику создания электродов (биоанода и биокатода) для автономного источника электропитания и изучить их биоэлектрохимические характеристики.

4. Создать лабораторный макет биотопливного элемента и провести его испытания.

5. Подобрать и оптимизировать условия ферментативного синтеза электропроводящего интерполимерного комплекса полианилин/ДНК, исследовать его физико-химические характеристики и определить удельную электрохимическую емкость полученного нанобиокомпозита.

Научная новизна работы. В работе впервые проведено комплексное исследование биокатализаторов (билирубиноксидазы Myrothecium verrucaria, лакказ Trametes hirsuta и Rhus vernicifera) реакции электровосстановления дикислорода на катоде автономного источника электропитания, изготовленного с использованием бумаги из ориентированных углеродных нанотрубок (buckypaper, БУНТ). Показано, что наилучшим биокатализатором этой реакции при физиологических условиях является билирубиноксидаза. Установлено, что материал электрода (БУНТ) позволяет достигать высоких плотностей тока за счет развитой поверхности электрода и увеличения массопереноса дикислорода. Впервые синтезирован электропроводящий интерполимерный комплекс на основе полианилина (ПАНИ) и ДНК с участием микропероксидазы-11 (МП). Показано, что полимеры, полученные с использованием МП и пероксидазы из корней хрена (ПХ), имеют противоположную оптическую активность.

Практическая значимость работы. Показано, что электропроводящие нанобиокомпозиты на основе БОД являются эффективными катодными катализаторами реакции электровосстановления дикислорода, функционирующими в физиологических условиях.

Иммобилизация биокатализаторов на новом электропроводящем материале -бумаге из ориентированных углеродных нанотрубок - позволяет достигать высоких плотностей тока.

БТЭ на основе биокомпозитных материалов перспективны для электропитания различных имплантированных биомедицинских устройств, таких как сенсоры, устройства для стимулирования нервных окончаний, системы контролируемого дозирования лекарств и др.

Биокомпозитный материал на основе ДНК и электропроводящего полианилина, полученный пероксидаза-катализируемым методом, обладает высокой удельной емкостью и может являться материалом для электродов имплантируемого суперконденсатора (устройства накопления и хранения энергии).

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях: VIII национальная конференция «Рентгеновское, Синхротронное излучения. Нейтроны и Электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии» (Москва, Россия, 2011), школа-конференция молодых ученых «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины» (Москва, Россия, 2011).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 4 печатных работы, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ, и 2 тезисов докладов в материалах конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 46 рисунков и 10 таблиц. Список цитируемой литературы включает 239 наименований.

Сокращения, принятые в тексте. АБТС - диаммониевая соль 2,2'-азино-бис-(З-этилбензотиазолин-б-сульфоновой) кислоты, АИЭ - автономный источник электропитания, АСМ - атомно-силовая микроскопия, БОД - билирубиноксидаза, БТЭ - биотопливный элемент, БУНТ - бумага из ориентированных углеродных нанотрубок, КД - круговой дихроизм, МП - микропероксидаза-11, МУНТ -многостенные углеродные нанотрубки, фМУНТ - функционализированные МУНТ, НВЭ - нормальный водородный электрод, ПХ - пероксидаза из корней хрена, ФБ -фосфатный буферный раствор, ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор, ЦБ -цитратный буферный раствор, ЦЦГ - целлобиозодегидрогеназа, FTIR - ИК-спектроскопия с преобразованием Фурье.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования.

Первая глава содержит обзор литературы, посвященный описанию свойств ферментов, используемых в работе; классификации биотопливных элементов и примерам БТЭ, описанных в литературе; методам ферментативного синтеза электропроводящего полианилина и его свойствам.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования.

Очистка билирубиноксидазы. В работе был использован коммерческий препарат БОД «Bilirubin Oxidase Amano 3» (Amano Enzyme Inc., Япония). Исходный препарат содержал 43 % белка по массе. Для очистки БОД от возможных небелковых примесей и концентрирования фермента навеску коммерческого препарата БОД (~300 мг) растворяли в 50 мл 10 мМ ФБ (рН 7.0) и диализовали против того же буфера. После диализа раствор наносили на колонку (3 х 50 см) с носителем Toyopearl DEAE-650M («TOSOH», Япония), предварительно уравновешенную тем же буферным раствором. Белки элюировали 100 мМ ФБ (рН 7.0).

Определение биохимических параметров билирубиноксидазы и целлобио-изодегидрогеназы. Концентрацию белков определяли по разности оптической плотности при длинах волн 228.5 и 234.5 нм с использованием соответствующего градуировочного графика.

Активность БОД измеряли спектрофотометрически с использованием следующих хромогенных субстратов: АБТС (е405 = 36800 М~'см"'), bC([Fe(CN)6] (е42о = 1040 M"W), K4[Mo(CN)8] (£386= 1220 M~W), пирокатехин (е410= 740 M"W) в 0.1 М Na-фосфатном (рН 7.0), 0.1 М Na-цитратном (рН 4.0), 0.04 М универсальном или 0.1 М фосфатно-солевом (рН 7.4) буферных растворах. Активность ЦДГ определяли с использованием хромогенного субстрата 2,6-дихлорфенолиндофе-нола (е52о= 6900 M"W при рН<6.0; е600= 11800 M'W при рН>6.0).

Определение константы Михаэлиса по дикислороду проводили с использованием кислородного электрода типа Кларка в 0.1 М ФБ (рН 7.0), содержащем 4 мМ АБТС, продувая через ячейку дикислород или аргон в течение разных промежутков времени для получения различных концентраций дикислорода.

Для получения биокомпозитов к водной дисперсии многостенных углеродных нанотрубок, предварительно обработанных азотной кислотой, наносажи или наночастиц золота добавляли растворы оксидоредуктаз, инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре, после чего центрифугировали, отделяли супернатант и ресуспендировали осадок в ФБ.

Электроды на основе бумаги из ориентированных углеродных нанотрубок

изготавливали путем фильтрации спиртовой дисперсии функционализированных азотной кислотой МУНТ через фторопластовый фильтр с диаметром пор 0.2 мкм. Для модификации поверхности электродов 20 мкл раствора фермента в ФБ с концентрацией 10 мг/мл наносили на поверхность электрода и инкубировали в течение 2 ч при 4°С во влажной атмосфере. Полученные ферментные электроды промывали и хранили в ФБ при 4°С.

Электрохимические исследования ферментных электродов проводили с использованием потенциостата-гальваностата «АиЫаЬ-РОБТ 302РЯА» (Ме1хоЬт АиЫаЬ, Голландия) по трехэлектродной схеме.

При исследовании характеристик БТЭ электроды подключали по двух-электродной схеме, в которой биокатод выступал в качестве электрода сравнения, а биоанод - в качестве рабочего электрода. Установившееся напряжение между двумя электродами определяли при разомкнутой цепи, а также при различных сопротивлениях (330 - 0.2 кОм), включенных в цепь.

Исследование рН-профиля биокатодов проводили в 0.04 М универсальном буфере в диапазоне рН от 3.5 до 8.0, записывая поляризационные кривые в интервале от 0.9 до 0.2 В отн. НВЭ.

Исследование стабильности ферментных электродов проводили в течение 2 суток в 0.1 М ФСБ (рН 7.4) при 37°С, измеряя через определенные интервалы времени электрокаталитическую активность биоанода и биокатода.

Синтез интерполимерных комплексов ПАНИ/ДНК проводили при 4°С с использованием ПХ и МП. Раствор ДНК с концентрацией 0.5 мг/мл в 10 мМ ЦБ (рН 4.3), содержащий известное количество анилина, перемешивали в течение 30 мин для установления электростатического равновесия между отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК и протонированными аминогруппами молекул анилина. Затем в реакционную среду добавляли соответствующий фермент и инициировали реакцию пероксидом водорода. Для удаления непрореа-гировавшего мономера полученные биокомпозиты диализовали против 2000-кратного избытка деионизованной воды, подкисленной соляной кислотой до рН 4.3, в течение 24 ч при 4°С.

Морфологию интерполимерных комплексов изучали методом атомно-силовой микроскопии с использованием микроскопа «МТЕОЯА» (ЫТ-МБТ, Россия) в полуконтактном режиме. Для этого образец наносили на подложку из высокоориентированного пирографита, инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре, промывали водой и высушивали образец в потоке азота.

Спектральные исследования. Измерения спектров кругового дихроизма проводили на КД-спектрометре «Chirascan» (Applied Photophysics, Англия).

FTIR-исследование биокомпозитов проводили по стандартной методике с использованием таблеток КВг на ИК-спектрометре «IRPrestige-21» (Shimadzu, Япония).

В третьей главе приводятся собственные результаты и их обсуждение.

Биохимические характеристики билирубиноксидазы и целлобиозоде-гидрогеназы. Согласно данным электрофореза в денатурирующих условиях (рис. 1, дорожка 2), в исходном препарате присутствовали два белка с молекулярными массами 60 кДа (основной белок) и 48 кДа (минорная фракция). Однако минорная фракция белка, присутствующая в исходном препарате, осталась и после ионно-обменной хроматографии (рис. 1, дорожка 3). Методом MALDI TOF было показано, что белок минорной фракции является продуктом частичной деструкции БОД. Для удаления минорной фракции дополнительно была проведена гель-проникающая хроматография образцов БОД, что привело к значительным потерям белка. Однако получить гомогенный фермент не удалось. Поэтому в дальнейших экспериментах использовали препарат БОД после ионообменной хроматографии. Активность фермента, измеренная по окислению АБТС в насыщенном воздухом ФБ (рН 7.0), составила 58 МЕ/мг.

На электронном спектре БОД присутствовал интенсивный пик поглощения в области 600-610 нм, соответствующий Т1 центру фермента, а также перегиб в области 330 нм, соответствующий ТЗ центру. Одним из основных параметров, от которого зависит скорость окисления субстратов оксидазами, является различие значений редокс-потенциалов между субстратом-донором и первичным акцептором электронов — Т1 центром фермента. Были определены кинетические параметры БОД по трем субстратам с окислительно-восстановительными потенциалами ниже, равным и выше потенциала Т1 центра фермента, который составляет по литературным данным 670 мВ отн. НВЭ. Результаты представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы, БОД эффективно катализирует окисление как субстратов с потенциалом, равным либо меньшим редокс-потенциала Т1 центра, так и окисление октацианомолибдата, редокс-потенциал которого превышает на 110мВ редокс-потенциал Т1 центра фермента. При этом большое влияние на

1 2 3

Рис. 1. Результаты ДСН-ПААГ-электрофореза препарата БОД. 1 - маркеры, 2 - исходный препарат БОД, 3 - препарат БОД после ионообменной хроматографии.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования.

Первая глава содержит обзор литературы, посвященный описанию свойств ферментов, используемых в работе; классификации биотопливных элементов и примерам БТЭ, описанных в литературе; методам ферментативного синтеза электропроводящего полианилина и его свойствам.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования.

Очистка билирубиноксидазы. В работе был использован коммерческий препарат БОД «Bilirubin Oxidase Amano 3» (Amano Enzyme Inc., Япония). Исходный препарат содержал 43 % белка по массе. Для очистки БОД от возможных небелковых примесей и концентрирования фермента навеску коммерческого препарата БОД (-300 мг) растворяли в 50 мл 10 мМ ФБ (рН 7.0) и диализовали против того же буфера. После диализа раствор наносили на колонку (3 х 50 см) с носителем Toyopearl DEAE-650M («TOSOH», Япония), предварительно уравновешенную тем же буферным раствором. Белки элюировали 100 мМ ФБ (рН 7.0).

Определение биохимических параметров билирубиноксидазы и целлобио-изодегидрогеназы. Концентрацию белков определяли по разности оптической плотности при длинах волн 228.5 и 234.5 нм с использованием соответствующего градуировочного графика.

Активность БОД измеряли спектрофотометрически с использованием следующих хромогенных субстратов: АБТС (s405 = 36800 М_1см"'), K4[Fe(CN)6] (е42о = 1040 M'W1), K4[Mo(CN)8] (s386= 1220 M"W), пирокатехин (е4ю= 740 NT'cm"1) в 0.1 М Na-фосфатном (рН 7.0), 0.1 М Na-цитратном (рН 4.0), 0.04 М универсальном или 0.1 М фосфатно-солевом (рН 7.4) буферных растворах. Активность ЦДГ определяли с использованием хромогенного субстрата 2,6-дихлорфенолиндофе-нола (е520= 6900 МГ'см"1 при рН<6.0; е600= 11800 M'W при рН>6.0).

Определение константы Михаэлиса по дикислороду проводили с использованием кислородного электрода типа Кларка в 0.1 М ФБ (рН 7.0), содержащем 4 мМ АБТС, продувая через ячейку дикислород или аргон в течение разных промежутков времени для получения различных концентраций дикислорода.

Для получения биокомпозитов к водной дисперсии многостенных углеродных нанотрубок, предварительно обработанных азотной кислотой, наносажи или наночастиц золота добавляли растворы оксидоредуктаз, инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре, после чего центрифугировали, отделяли супернатант и ресуспендировали осадок в ФБ.

Одной из характеристик потенциально имплантируемого БТЭ является стабильность его функционирования. В большой степени это определяется свойствами биокатализатора. Поэтому была измерена стабильность БОД в ФСБ (рН 7.4) при 37°С, т.е. в условиях, близких к физиологическим. Период полуинактивации фермента был равен 3 ч. Через сутки инкубации остаточная активность фермента составляла ~10 % от исходной, однако на этом уровне она стабилизировалась и оставалась практически неизменной в течение 7 дней.

Известно, что активность некоторых медь-содержащих оксидаз, например лакказ, ингибируется хлорид-ионами, что ограничивает их использование в физиологических жидкостях. Было исследовано влияние концентрации хлорид-ионов на активность БОД в реакции окисления АБТС. Показано, что хлорид-ионы являются конкурентным ингибитором фермента с константой ингибирования 96±14 мМ. Таким образом, при использовании БОД в физиологической среде, например плазме крови, концентрация ионов хлора в которой составляет около 100 мМ, скорость ферментативной реакции будет снижена на -50%, однако ферментативная активность в этих условиях достаточна для эффективного восстановления дикислорода.

В качестве анодного биокатализатора реакции окисления глюкозы в работе была использована целлобиозодегидрогеназа из аскомицета Согупаяст Жегтор/гПш.

Как видно из данных ДСН-ПААГ-электрофореза (рис. 3), препарат фермента представляет собой гомогенный белок с молекулярной массой 94 кДа. Активность ЦДГ, измеренная с использованием в качестве субстрата - донора электронов глюкозы и в качестве акцептора электронов 2,6-дихлорфенолиндофенола в ФБ (рН 7.0), составляла 2.1 МЕ/мг. Константа Михаэлиса по глюкозе, измеренная в 0.1 М ФБ (рН 7.0), составила 62±5 мМ, а каталитическая константа 0.185±0.005 с" .

1

2

94 кДа

. 130 кДа 100 кДа 70 кДа

Рис. 3. Результаты ДСН-ПААГ-электрофореза препарата ЦДГ.

20 -

3 4 5 6 7 8

рН

Рис. 4. Зависимость относительной активности ЦДГ от рН реакционной среды.

Условия: 0.04 М универсальный буферный раствор.

Исследование рН-зависимости каталитической активности ЦДГ (рис. 4) показало, что фермент сохраняет более 40% своей максимальной активности в области нейтральных значений рН. Необходимо отметить, что ЦДГ является высокостабильным ферментом: при инкубировании при 37°С в течение 5 суток его каталитическая активность не изменялась.

Получение биокомпозитов и изучение их характеристик. Электропроводящие биокомпозиты на основе МУНТ, наносажи и следующих ферментов: БОД, лакказа R. vernicifera, лакказа Т. hirsuta и ЦДГ - были получены путем адсорбции биокатализаторов на поверхности наноматериалов. В таблице 2 представлены данные по активности нанобиокомпозитов в процентах от исходной активности нативных ферментов.

Таблица 2. Относительная каталитическая активность оксидоредуктаз в биоком-

позитах.

Фермент Амунт/фермент/Аисх,% Ананосажа/фермент/А-исхэ /о

БОД M.verrucaria 15 10

ЦДГ C.thermophilus 25 19

Лакказа T.hirsuta 8 14

Лакказа R.vernicifera 10 7

Как видно из таблицы 2, при адсорбции на наноматериалах происходило снижение активности ферментов, но при этом все оксидоредуктазы сохраняли часть исходной активности, что делает приемлемым использование биокомпозитов на их основе в качестве электрокатализаторов. Были проведены исследования стабильности дисперсий биокомпозитов на основе ферментов в ФСБ (рН 7.4) при 37°С. Необходимо отметить, что иммобилизация ферментов на различных наноматериалах не привела к повышению их стабильности. Для биокомпозитов на основе лакказ и БОД наблюдалось более резкое падение активности в первые часы инкубации по сравнению с нативными ферментами, однако затем, как и для нативных ферментов, происходила стабилизация уровня активности биокомпозитов.

Был также получен биокомпозит на основе БОД и наночастиц коллоидного золота. Каталитическая активность БОД в составе биокомпозита составила 12% от исходной активности фермента.

Таким образом, физическая адсорбция ферментов на электропроводящих наноматериалах позволяет получить биокатализаторы, пригодные для создания БТЭ.

Получение бумаги из ориентированных углеродных нанотрубок. Для получения бумаги из ориентированных углеродных нанотрубок были использованы фМУНТ, которые получали обработкой коммерческих углеродных нанотрубок концентрированной азотной кислотой, что приводило к значительной гидрофилиза-ции поверхности углеродного наноматери-ала. БТЖ-исследование фМУНТ показало, что в колебательных спектрах помимо полос поглощения при 1520 см"1 и 1160см"1, соответствующих С=С и С-С

связям, соответственно, присутствует пик -1

Рис. 5. Изображение БУНТ, полученное методом сканирующей электронной микроскопии.

0,0 -, -0,2 -0,4

при 1620 см" , характеризующий колебания С=0 связи, а также широкий пик при 3406 см"1, свидетельствующий о присутствии ОН-групп. Анализ элементного состава исходных МУНТ и фМУНТ показал, что обработка наноматериала азотной кислотой приводит к снижению количества металлов в образце фМУНТ.

Структура полученной БУНТ была исследована методом сканирующей электронной микроскопии (рис. 5). Видно, что электродный материал имеет плотно-упакованную сетчатую структуру, состоящую из отдельных волокон углеродного наноматериала. Удельная электропроводность БУНТ, измеренная четырехточечным методом, составила 16.2 мСм/см.

Изготовления биокатода биотопливного элемента. В настоящее время показано, что некоторые «голубые» оксидазы могут осуществлять окисление дикислорода по механизму прямого электронного переноса, при котором электрод выполняет функцию донора электронов, заменяя субстрат в ферментативной реакции. Следует отметить, что для конструирования БТЭ использование прямого электронного переноса является более простым и перспективным по сравнению с медиаторным вследствие диффузионной подвижности, а иногда и токсичности редокс-медиаторов. Катод

-1,2

200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Е отн. НВЭ, мВ Рис. 6. Линейные вольтамперограм-мы, записанные на ферментных БУНТ-катодах, модифицированных лакказой Т. hirsuta (/); БОД (2); лакказой R. vernicifera (.?); контроль в отсутствии ферментов (4). Условия: насыщенный воздухом ФБ, рН 7.0 (2, 3, 4)\ ЦБ, рН 4.5 (/), скорость развертки потенциала 10 мВ/с.

БТЭ изготавливали путем физической адсорбции соответствующих оксидаз на поверхности электрода из БУНТ. В качестве катодных биокатализаторов использовали лакказы Т. hirsuta и R. verniclfera, а также БОД М. verrucaria.

Для всех трех биокатодов наблюдали ускорение реакции электровосстановления дикислорода, основанное на прямом электронном переносе, причем начало электрокаталитической реакции восстановления дикислорода при оптимальных для каждого фермента условиях коррелировало со значениями редокс-потенциалов Т1 центров ферментов (рис. 6, таблица 3). При потенциалах ниже 350 мВ отн. НВЭ наблюдалось неферментативное электровосстановление кислорода на БУНТ-электродах в отсутствие биокатализаторов, однако потенциал начала данного процесса как минимум на 150 мВ ниже потенциалов биоэлектро-каталитического восстановления дикислорода. Наиболее высокий потенциал наблюдался на БУНТ-электроде, модифицированном грибной лакказой Т. hirsuta (рис. 6, кривая 1), а наиболее низкий - на БУНТ-электроде с иммобилизованной древесной лакказой R. vernicifera (рис. 6, кривая 3).

Таблица 3. Сравнение редокс-потенциалов Т1 центров ферментов и потенциалов начала электровосстановления кислорода па биокатодах.

Фермент Редокс-потенциал Т1 центра фермента, мВ отн. НВЭ Потенциал начала электровосстановления дикислорода на биокатоде, мВ отн. НВЭ

Лакказа Т.hirsuta 780 900

Лакказа R.vernicifera 430 540

БОД M.verrucaria 670 740

Практически одинаковые значения плотностей тока для всех трех ферментов (-200 мкА/см2 за вычетом фона) свидетельствуют о диффузионно-контролируемом протекании реакции. Ферментные электроды, изготовленные из БУНТ и модифицированные «голубыми» оксидазами, имели приблизительно на порядок более высокие плотности тока при одинаковых потенциалах по сравнению с ненаноструктурированными электродами из спектрального графита (5-13 мкАУсм2) с иммобилизованными на его поверхности указанными выше ферментами.

Для биокатода БОД/БУНТ впервые качественно показано, что в интервале потенциалов 550-700 мВ отн. НВЭ биоэлектрокаталитическое восстановление дикислорода протекает по четырехэлектронному механизму до воды без образования пероксида водорода. Для этого электрод БОД/БУНТ выдерживали в 0.1 М ФСБ (рН 7.4) при потенциале 620 мВ отн. НВЭ в течение 2 ч при перемешивании.

Наличие пероксида водорода определяли спектрофотометрически по реакции окисления АБТС в присутствии пероксидазы из корней хрена.

Таким образом, все три биокатода продемонстрировали эффективное элек-

Основным требованием, предъявляемым к потенциально имплантируемым биотопливным элементам, является возможность их функционирования при физиологических условиях с минимальной потерей мощности. На рис. 7 приведены рН-зависимости относительной активности БУНТ-электродов, модифицированных лакказами и БОД. Как видно из рисунка, электрод с грибной лакказой Т. hirsuta проявляет электрокаталитическую активность только в области кислых значений рН и каталитически неактивен при рН >6.5, что согласуется с рН-зависимостями, характерными как для на-тивного фермента, так и для водных дисперсий биокомпозитов. Электроды, модифицированные лакказой R. vernicifera и БОД, имели максимум электрокаталитической активности при нейтральных значениях рН раствора. Таким образом, для функционирования в физиологических жидкостях могут быть использованы только биокатоды на основе лакказы R. vernicifera и БОД. Поскольку потенциал начала электровосстановления дикислорода для модифицированного БОД электрода приблизительно на 200 мВ выше, чем для катода с лакказой R. vernicifera, то напряжение БТЭ с катодом на основе БОД будет примерно на 200 мВ выше, чем с катодом на основе лакказы R. vernicifera. Поэтому дальнейшие исследования проводили с биокатодом, модифицированным БОД.

Изготовление биоанода биотопливного элемента. В качестве анодного биокатализатора, ускоряющего реакцию электроокисления глюкозы по механизму прямого безмедиаторного электрокатализа, использовали ЦДГ из аскомицета С. thermophilus. Для изготовления биоанода был использован метод физической адсорбции фермента на поверхности БУНТ.

При добавлении в рабочий раствор глюкозы стационарный потенциал биоанода смещался в область отрицательных значений приблизительно на 40 мВ по сравнению с контролем в отсутствие глюкозы (таблица 4).

тровосстановление дикислорода.

Рис. 7. Зависимость от рН относительной активности биокатодов на основе БУНТ, модифицированных лакказой Т. hirsuta (1), БОД (2) и лакказой R. vernicifera (3). Условия измерений: насыщенный воздухом 0.04 М универсальный буфер.

Концентрация глюкозы, мМ Стационарный потенциал, мВ отн. НВЭ

0 290

5 270

100 249

Смещение стационарного потенциала биоанода было достаточно небольшим, что, по-видимому, связано с низкой каталитической активностью ЦЦГ при использовании в качестве субстрата глюкозы. Изучение биоэлектрокаталитиче-ских свойств биоанода ЦЦГ/БУНТ проводили в ФСБ (рН 7.4) в присутствии глюкозы (5 мМ и 100 мМ) методами линейной вольтамперометрии и хронопотен-циометрии. Из линейных вольтамперограмм (рис. 8), записанных на биоаноде, видно, что величина анодного тока при одинаковом потенциале увеличивается с увеличением концентрации глюкозы в рабочем растворе. Однако плотность биоэлектрокаталитического тока при потенциале 400 мВ отн. НВЭ составляет за вычетом фона 7 и 27 мкАУсм2 при 5 и 100 мМ глюкозы, соответственно, что является следствием низкой биоэлектро-кататлитической активности ЦЦГ в реакции окисления глюкозы. Хроноампе-рометрические измерения показали, что при потенциале 270 мВ отн. НВЭ в присутствии различных концентраций глюкозы (5 и 100 мМ) достигается устойчивый во времени анодный биоэлектрокаталитический ток, составляющий 3.2 мкА/см2 при 5 мМ глюкозы и 8.8 мкА/см2 при 100 мМ глюкозы.

Исследование стабильности биоэлектродов. Другой важной характеристикой потенциально имплантируемого БТЭ является стабильность его функционирования при физиологических условиях, т.е. в области нейтральных значениях рН при 37°С в присутствии хлорид-ионов, которая в свою очередь определяется стабильностью биокатода и биоанода. Стабильность ферментного электрода может зависеть от целого ряда параметров: стабильности используемого фермента и метода его иммобилизации на поверхности электрода; свойств электропроводящей матрицы, используемой для создания электрода, и др. Как было показано при изучении нативного препарата БОД, фермент не является достаточно термо-

13

Е отн. НВЭ, мВ

Рис. 8. Линейные вольтамперограммы, записанные на биоанодс ЦДГ/БУНТ: I - контроль, 0 мМ глюкозы; 2-5 мМ глюкозы; 3 - 100 мМ глюкозы.

Условия: скорость развертки потенциала 2 мВ/с; насыщенный воздухом ФСБ, рН 7.4.

стабильным, как и биокомпозит на его основе. Однако достоверную информацию о стабильности биоэлектрода можно получить только после проведения его испытаний. В связи с этим были исследованы долговременные стабильности

Как видно из рис. 9, биоанод ЦЦГ/БУНТ обладал высокой стабильностью в условиях, близких к физиологическим, и сохранял более 70% от своей первоначальной биоэлектрокаталитической активности после 2 суток инкубации при 37°С в ФСБ (рН 7.4). Иммобилизация БОД на БУНТ-электроде не привела к стабилизации фермента: период полуинактивации ферментного электрода составил 1 ч. Однако, после 2 суток инкубации фермент сохранял —10-15 % первоначальной активности, причем после резкого падения каталитического тока в течение первых 5 ч инкубации электрокаталитическая активность биокатода в реакции восстановления дикислорода стабилизировалась и в дальнейшем практически не изменялась. Аналогичное поведение характерно и для гомогенного фермента. Поскольку активность ЦДГ в физиологических условиях значительно ниже, чем БОД, то лимитирующим фактором эффективного функционирования БТЭ может являться низкая электрокаталитическая активность биоанода.

Исследование характеристик биоэлектродов в сыворотке крови. Для изучения возможностей и ограничений использования разработанных биоэлектродов для создания потенциально имплантируемых БТЭ было проведено исследование их характеристик в сыворотке крови. В отличие от ФСБ, сыворотка крови содержит различные белки, а также низкомолекулярные соединения, которые могут являться эффекторами каталитической активности оксидаз, изменяя их активность, а также участвовать в побочных электродных реакциях, приводя к деполяризации электродов.

биоанода и биокатода (рис. 9).

О 10 20 30 40 50 Время, ч

Рис. 9. Стабильность анода ЦДГ7БУНТ (/) и катода БОД/БУНТ (2) при 37°С в ФСБ, рН 7.4.

Биокатод на основе БОД проявлял высокую каталитическую активность в реакции безмедиаторного электровосстановления дикислорода в сыворотке крови человека (рис. 10, кривая 2) по сравнению с контрольным образцом БУНТ в отсутствии фермента (кривая 1). Однако через 1 ч инкубации биокатода в сыворотке крови электрокаталитическая активность электрода существенно уменьшалась, что проявлялось как в снижении каталитического тока, так и в снижении значения потенциала начала восстановления дикислорода (кривая 5). Перенос биокатода из сыворотки в ФСБ приводил к восстановлению первоначальной электрокаталитической активности ферментного электрода. Можно предположить, что значительное снижение каталитической активности

-0,1 -0,2 І -0,3

3 £

-0,4 -

00 400 600 800

Є отн. НВЭ, мВ Рис. 10. Линейные вольтамперо-граммы, записанные на электродах: I - контроль БУНТ в сыворотке крови; 2 - БОД/БУНТ сразу после внесения в сыворотку;

3 - БОД/БУНТ после инкубации в сыворотке в течение одного часа;

4 - после перенесения БОД/БУНТ из сыворотки в ФСБ.

Условия: насыщенная воздухом сыворотка крови человека или ФСБ, рН 7.4, скорость развертки потенциала 10 мВ/с.

2

о 120

биокатода связано с побочными электрохимическими процессами электроокисле-

2 ния компонентов сыворотки крови, например, Ь-аскорбата, на поверхности наноструктурированного биокатода, а также экранированием биоэлектрокатали-затора белками сыворотки крови.

На рис. 11 представлены данные по каталитической активности биоанода ЦДГ/БУНТ в сыворотке крови кролика. Концентрация глюкозы в сыворотке, измеренная с помощью портативного глю-кометра, составляла 2.1 мМ. Удельный электрокаталитический ток биоанода на —10 мкА/см2 превышал значение тока в

300

600

400 500

Е отн. НВЭ, мВ Рис. 11. Линейные вольтамперо-граммы, записанные на электродах: / - БУНТ, 2 - ЦДГ/БУНТ. Условия: скорость развертки потенциала 2 мВ/с, сыворотка крови кролика, содержащая 2.1 мМ глюкозы.

отсутствии ЦДГ.

Изучение характеристик БТЭ на основе БУНТ-электродов. Безмембранный БТЭ, разработанный в ходе исследования, состоит из биоанода и биокатода, закрепленных в пластиковый держатель на расстоянии 0.5 см друг от друга.

Одним из основных параметров автономных источников электропитания является их удельная мощность, рассчитанная на единицу поверхности. На рис. 12 представлена зависимость удельной мощности БТЭ на основе БОД-БУНТ и ЦДГ/БУНТ электродов от напряжения (кривая 1).

Напряжение БТЭ, измеренное при разомкнутой цепи, было равно 450 мВ, а максимальная удельная мощность -9.5 мкВт/см2 при напряжении 350 мВ.

Для оценки возможности применения данного типа БТЭ в качестве потенциально имплантируемого устройства были исследованы его характеристики в сыворотке крови кролика (рис. 12, кривая 2), в которой параметры БТЭ были значительно хуже, чем в ФСБ, содержащем глюкозу: напряжение при разомкнутой цепи составило 280 мВ, а максимальная мощность - 8 мкВт/см2 при напряжении 160 мВ. Уменьшение напряжения при разомкнутой цепи может быть связано с более низкой концентрацией глюкозы (2.1 мМ) в сыворотке, а также деполяризацией биокатода за счет окисления электроактивных компонентов сыворотки.

Удельная мощность потенциально имплантируемого БТЭ при определенном напряжении зависит от нескольких параметров: эффективности биокатализаторов как в катодной, так и в анодной реакциях (чем меньше перенапряжение этих реакций и больше плотность тока, тем выше мощность БТЭ); массопереноса субстратов к поверхности электродов БТЭ; концентрации топлива и окислителя в биологических жидкостях. Разработанный биокатод БОД/БУНТ функционирует в диффузионно-контролируемом режиме при достаточно высоких плотностях тока. Сравнительно низкие удельная мощность и напряжение при разомкнутой цепи БТЭ связаны с недостаточной активностью биоанода ЦДГ/БУНТ. Для повышения

Напряжение, мВ Рис. 12. Зависимость удельной мощности БТЭ БОД/БУНТ-ЦДГ/БУНТ от напряжения : 1 - ФСБ, рН 7.4, содержащий 5 мМ глюкозы; 2 - сыворотка крови кролика.

Напряжение, мВ

Рис. 13. Зависимость удельной мощности БТЭгп/БУНТ-БОД/БУНТот напряжения.

Условия: насыщенный воздухом ФСБ, рН 7.4.

мощности, а также рабочего напряжения устройства на анод из БУНТ были нанесены наночастицы цинка. Таким образом, был получен электрод Zn/БУНТ.

На рис. 13 представлена зависимость удельной мощности АИЭ, состоящего из анода Zn/БУНТ и катода БОД/БУНТ, от напряжения. Удельная мощность выросла в десятки раз по сравнению с БТЭ, в котором в качестве анода использовали биокомпозит ЦЦГ/БУНТ. Использование цинка также привело к значительному увеличению рабочего напряжения источника электропитания. Напряжение при разомкнутой цепи элемента составило 1460 мВ.

Синтез электропроводящих биокомпозитов ПАНИ/ДНК. Для энергообеспечения некоторых имплантированных биомедицинских микроустройств требуется кратковременная подача электрического импульса большой мощности. В настоящее время это может лучше всего обеспечить имплантированный суперконденсатор (электрохимический конденсатор), который является устройством хранения и накопления энергии и может заряжаться от имплантированного БТЭ, использующего в качестве топлива и окислителя компоненты биологических жидкостей, и при необходимости служить источником электропитания большой мощности. Основой для имплантируемого суперконденсатора являются электроды из нетоксичных и биосовместимых материалов с высокой удельной емкостью. В работе был проведен ферментативно-катализируемый синтез интерполимерных комплексов ДНК с электропроводящим полианилином (ПАНИ) и изучены физико-химические характеристики полученных биокомпозитов.

Для синтеза электропроводящего комплекса ПАНИ/ДНК использовали коммерчески доступный препарат дезоксирибонуклеата натрия («Деринат»), содержащий, по данным электрофореза, молекулы ДНК от 50 до 900 пар нуклеотидов. Окислительную полимеризацию анилина на матрице ДНК проводили с использованием пероксидазы из корней хрена и биомиметика — микропероксидазы-11. При проведении матричного синтеза ПАНИ в результате полимеризации анилина на матрице ДНК с использованием обоих биокатализаторов были получены водные дисперсии интерполимерных комплексов ПАНИ/ДНК зеленого цвета, характерного для электропроводящего ПАНИ. На электронных спектрах водных дисперсий присутствовали пики поглощения в областях 420 нм и 750 нм, соответствующие электропроводящему ПАНИ в составе обоих биокомпозитов (рис. 14). В контрольном эксперименте в отсутствии ДНК при полимеризации анилина происходило образование коричневого водонерастворимого осадка неэлектропроводящего разветвленного полимера, что подтверждает важную роль матрицы ДНК в образовании электропроводящей формы ПАНИ.

А, нм' А, нм

Рис. 14. Изменение во времени электронных спектров комплексов ПЛНИ/ДНК: а - с использованием ПХ (/ -5 мин, 2- 15 мин, 3- 60 мин, 4- 240 мин), б-с использованием МП (/ - 30 мин, 2 - 120 мин, 3- 24 ч).

На рис. 14а представлены спектры поглощения комплекса ПАНИ/ДНК при различных временах синтеза с использованием ПХ. В процессе реакции поглощение при 750 нм уменьшалось, при этом увеличивалось поглощение при длинах волн выше 950 нм, что может свидетельствовать об увеличении длины цепи п-сопряжения и образовании полимера с более упорядоченной структурой. В спектрах поглощения ПАНИ/ДНК, синтезированного с использованием МП, происходило увеличение поглощения в области 750 нм (рис. 146). Однако, в отличие от полимеризации анилина, катализируемой ПХ, смещение поглощения ПАНИ в длинноволновую область не наблюдалось, что свидетельствует об образовании полианилина с другими физико-химическими характеристиками. Вследствие существенно более низкой удельной активности МП (500 и 6 МЕ/мг для ПХ и МП, соответственно, в 0.1 М ЦБ, рН 4.3) синтез полимера с её участием, а, следовательно, и рост оптической плотности, проходил значительно медленнее.

Было исследовано влияние концентрации пероксида водорода на протекание реакции полимеризации с использованием ПХ. Для этого полимеризацию анилина проводили при различных соотношениях концентраций пероксида водорода и мономера анилина в реакционной смеси. Через 90 мин протекания реакции записывали электронные спектры, которые показали образование окисленной формы ПАНИ (пернигранилина) при соотношении Н202/анилин > 2. Оптимальным для получения эмеральдиновой соли ПАНИ в составе комплекса с ДНК было выбрано эквимолярное соотношение реагентов.

Дедопирование-редопирование ферментативно синтезированных комплексов ПАНИ/ДНК. Для полученных образцов интерполимерных комплексов, синтезированных с использованием обоих биокатализаторов, были записаны электронные спектры в дедопированном (неэлектропроводящем) состоянии

(рис. 15). Дедопирование, т.е. переход исходного электропроводящего ПАНИ в форме эмеральдиновой соли в неэлектропроводящее эмеральдиновое основание, проводили путем обработки комплексов ПАНИ/ДНК водным раствором гид-роксида натрия с рН 10.0.

А, нм А, нм

Рис. 15. Электронные спектры комплексов ПАНИ/ДНК, полученных с использованием ПХ (а) и МП (б): допированная (/), делопированная (2), редопированная (5) форма ПАНИ.

При переводе интерполимерных комплексов ПАНИ/ДНК в щелочную среду в обоих случаях исчезал пик поглощения при 420 нм и появлялся интенсивный максимум в области 550 нм, соответствующий поглощению хиноидного кольца, что свидетельствовало о переходе ПАНИ в форму эмеральдинового основания. Также полностью исчезала широкая полоса поглощения в области выше 700 нм. При этом дедопирование интерполимерных комплексов являлось обратимым процессом: при переводе комплексов ПАНИ/ДНК обратно в кислые значения pH спектры приобретали исходный вид (рис. 15, кривые 5).

FTIR-спектроскопия комплексов ПАНИ/ДНК. Методом ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье были охарактеризованы повторяющиеся звенья полианилина в составе комплексов ПАНИ/ДНК. Спектры обоих образцов были достаточно близки и имели характерные для электропроводящего ПАНИ волновые числа в областях 1590-1600 см"1 и 1480-1500 см"1, отвечающие, соответственно, хинондииминным и фенилендиаминным группам в повторяющихся звеньях электропроводящего полимера. Полоса поглощения в области 1320 см"1 соответствует колебаниям C-N связей вторичных ароматических аминов; колебания при 820 см"1 характеризуют пара-замещенные ароматические кольца, а полоса при 860 см"1 свидетельствует о присутствии в образце небольшого количества разветвленного полимера (1,2 - замещение).

Изучение морфологии полученных комплексов методом атомно-силовой микроскопии. Морфология синтезированных с использованием двух биокатали-

заторов комплексов ПАНИ/ДНК была изучена методом атомно-силовой микроскопии. Исходная ДНК представляла собой нитевидные скрученные объекты длиной 50-300 нм. Поскольку длина одного нуклеотида составляет 0.34 нм, то, соответственно, расчетная длина молекул используемого препарата ДНК (50 -900 п.н.) составляет 20-300 нм. Таким образом, наблюдаемые размеры молекул ДНК на АСМ-изображении согласуются с данными электрофореза.

- "Л \ V*. *

' I

а 9

Г V* |

1 0 Г

? * |

\

г ^ ~ Я

1

Рис. 16. АСМ-изображения ДНК (а) и комплексов ПАНИ/ДНК, синтезированный с использованием ПХ (б) и МП (в).

Из полученных АСМ-изображений видно (рис. 16), что ПАНИ синтезировался преимущественно вдоль нитей ДНК, поскольку на изображениях отсутствуют объекты иной морфологии, отличной от исходных нитей ДНК.

Спектры кругового дихроизма синтезированных комплексов ПАНИ/ДНК. Спектры кругового дихроизма позволяют получать информацию о вторичной структуре ПАНИ, синтезированного на матрице ДНК. Поскольку ПАНИ не содержит асимметричных атомов углерода в своей структуре, его оптическая активность обусловлена спиралевидной конформацией, приобретенной полимером в результате синтеза на спирали ДНК. КД-спектры образцов ПАНИ/ДНК, полученных с использованием ПХ и МП, а также спектр используемой ДНК представлены на рис. 17.

0,8

0,4

3

о. 0,0

£

■0,4

-0,8

400 Л, нм

600

300 350

450 Л, нм

Рис. 17. Спектры кругового дихроизма ДНК (/) и комплексов ПАНИ/ДНК (2), синтезированных с использованием ПХ (а) и МП (б).

На спектре комплекса, синтезированного с использованием ПХ (рис. 17а, кривая 2), присутствует широкий пик в области 350-490 нм, соответствующий положительному направлению вращения плоскости поляризованного света, который соответствует электропроводящему ПАНИ и отсутствует в контрольных спектрах исходной ДНК (кривая /). На КД-спектре дедопированного ПАНИ этот пик также отсутствовал.

Использование МП в качестве катализатора ферментативного синтеза ПАНИ на матрице ДНК позволило получить ПАНИ с противоположной оптической активностью (рис. 176, кривая 2) по сравнению с образцом ДНК/ПАНИ, синтезированном с использованием ПХ. На КД-спектре интерполимерного комплекса, синтезированного с участием МП, появлялся соответствующий отрицательной поляризации света широкий пик в области 370-450 нм, а также полоса отрицательного вращения в области выше 460 нм. Различия в стереохимии получаемых биокомпозитов свидетельствуют об основополагающей роли биокатализатора в направлении закручивания спирали электропроводящего полимера на матрице ДНК, т.е. оптическая активность получаемых образцов полимеров, по-видимому, связана с внутренними свойствами и строением используемого для синтеза ПАНИ фермента.

Емкостные характеристики интерполимерного комплекса ПАНИ/ДНК.

Основными характеристиками композитов, используемых для изготовления электродов суперконденсаторов, являются их электрохимическая удельная

емкость и стабильность, которая выражается в количестве циклов заряд/разряд или в стабильности циклических вольтампе-рограмм после многократного сканирования потенциала электрода. Удельную емкость комплекса ПАНИ/ДНК рассчитывали из циклических вольтамперограмм, записанных при различных скоростях развертки потенциала (рис. 18), с учетом массы биокомпозита, нанесенного на поверхность токоотвода. В качестве токоот-вода использовали клейкую ленту, покрытую слоем углеродного материала, образовавшегося после приклеивания клейкой ленты к поверхности графитовой фольги. На циклических вольтамперограммах

120

40

-«о-

■" 1

-0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,0 0,7

Е, В отн. Ад|АдС1 Рис. 18. Циклические вольтамперо-граммы, записанные на электроде с комплексом ПЛНИ/ДНК при различных скоростях развертки потенциала: 1-5 мВ/с,2-10 мВ/с, 3-50 мВ/с, 4- 100 мВ/с. Условия: 0.1 М ЦБ (рН 4.5), содержащий 150 мМ МаС1.

(рис. 18) присутствовали две пары псевдообратимых пиков, соответствующие редокс-превращениям ПАНИ. Удельную емкость интерполимерного комплекса

\т

рассчитывали по формуле С = --, где С — удельная емкость (Ф/г), / - ток (А),

уАЕт

Е - потенциал (В), V - скорость развертки потенциала (В/с), т - масса биокомпозита, нанесенного на электрод (г). Как видно из таблицы 5, удельная емкость зависела от скорости изменения потенциала электрода и уменьшалась с увеличением скорости развертки потенциала.

Таблица 5. Удельная емкость интерполимерного комплекса ПАНИ/ДНК в зависимости от скорости развертки потенциала.

Скорость развертки потенциала, мВ/с Удельная емкость, Ф/г

5 17.4

10 16.4

50 13.6

100 11.9

Уменьшение емкости связано с наличием электроактивных участков внутри частиц ПАНИ в составе биокомпозита, которые не могут подвергаться полному редокс превращению при высоких скоростях развертки потенциала. Возможно, это обусловлено замедленной диффузией заряд-компенсирующих ионов в объем частиц ПАНИ. Таким образом, часть композита не функционирует при высоких скоростях процесса заряд/разряд.

Стабильность синтезированного биокомпозита ПАНИ/ДНК/ПХ была исследована методом циклической вольтамперометрии при непрерывном сканировании потенциала электрода (200 циклов в интервале потенциалов от -100 мВ до +600 мВ отн. Ag|AgCl). Интервал потенциалов был выбран таким образом, чтобы при электрохимическом окислении ПАНИ не образовывалась его окисленная форма - пернигранилин, которая является нестабильной и легко гидролизуется в водных растворах. После 200 циклов сканирования потенциала удельная емкость биокомпозита не изменялась.

Выводы

1. Разработаны биокомпозитные материалы на основе бумаги из углеродных нанотрубок и окислительно-восстановительных ферментов, а также ферментативно синтезированного электропроводящего полианилина на матрице ДНК.

2. Впервые показано, что электровосстановление дикислорода на биокатоде с биллирубиноксидазой протекает непосредственно до воды без образования пероксида водорода. Биокатод функционирует при нейтральных значениях рН в присутствии ионов хлора, однако лимитирующим фактором для создания эффективного катода биотопливного элемента является стабильность билирубиноксида-зы.

3. Биоанод на основе целлобиозодегидрогеназы обладает высокой стабильностью и функционирует в кинетически контролируемом режиме электроокисления глюкозы. Однако каталитическая активность целлобиозодегидрогеназы недостаточна для эффективного функционирования биоанода топливного элемента.

4. Создан макет безмедиаторного и безмембранного биотопливного элемента на основе оксидоредуктаз, использующего в качестве «топлива» глюкозу, а в качестве окислителя дикислород. Показано, что в насыщенном воздухом фосфат-но-солевом буферном растворе, содержащем глюкозу, электрохимические характеристики биоустройства выше, чем в сыворотке крови.

5. Впервые показано, что электропроводящий полианилин, синтезированный на матрице ДНК с участием пероксидазы из корней хрена, имеет противоположную оптическую активность по сравнению с полимером, полученным с использованием биомиметика - микропероксидазы-11. Биокомпозит полианилин/ДНК может быть использован в качестве материала электрода для изготовления источника накопления и хранения энергии.

Список публикаций по теме диссертации

1.Ю.С. Зейфман, И.О. Майборода, Ю.В. Грищенко, О.В. Морозова, И.С. Васильева, Г.П. Шумакович, А.И. Ярополов. Ферментативный синтез электропроводящих биокомпозитов на основе ДНК и оптически активного полианилина. Прикладная биохимия и микробиология, 2012, том 48, № 2, с. 169-175.

2. Dmitry V. Pankratov, Yulia S. Zeifman, Olga V. Morozova, Galina P. Shuma-kovich, Irina S. Vasil'eva, Sergey Shleev, Vladimir O. Popov, Alexander I. Yaropolov. A comparative study of biocathodes based on multiwall carbon nanotube buckypapers modified with three different multicopper oxidases. Electroanalysis, 2013, DOI: 10.1002/elan.201200516.

3. Ю.С. Зейфман. Разработка ферментного имплантируемого биотопливного элемента. Школа-конференция молодых ученых «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины», Москва, 29-30 сентября 2011 г. Материалы конференции, с. 30.

4. Ю.С. Зейфман, Г.П. Шумакович, И.О. Майборода, Ю. В. Грищенко. Ферментативный синтез электропроводящих биокомпозитов на основе ДНК и полианилина. VIII национальная конференция «Рентгеновское, синхротронное излучения. Нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии», Москва, 14-18 ноября 2011 г. Материалы конференции, с. 57.

Заказ №09-р/03/2013 Подписано в печать 06.03.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таіІ:гак@ср-.ги