Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Музейные штаммы рода Mycobacterium. Биологические свойства, поддержание и применение в экспериментально-клинических условиях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Музейные штаммы рода Mycobacterium. Биологические свойства, поддержание и применение в экспериментально-клинических условиях"

И Г

- 8 М

На правах рукописи

ПУЗАНОВ Владимир Алексеевич

МУЗЕЙНЫЕ ШТАММЫ РОДА MYCOBACTERIUM. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, ПОДДЕРЖАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ.

03.00.07- микробиология.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Москва - 1998.

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза Российской Академии Медицинских наук.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Голышевская В.И.

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова.

Диссертационного совета Д 084.18.01 при Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им . Г. Н. Габричевского МЗ РФ.

(125212, Москва , ул. Адмирала Макарова, д. 10)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Леви Д.Т.

доктор биологических наук, профессор Баснакьян И.А.

Защита состоится

1998 г. в часов на заседании

Автореферат разослан

1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Е .М. Горская.

1 l'wi д ttt ттттппгтттттпт

rti\j JMJionuulb игurwjcivia.

Известно. что биологические материалы в процессе хранения и пересевов изменяют или утрачивают некоторые свои свойства несмотря на высокую устойчивость к химическим и физическим воздействиям. Род Mycobacterium не является исключением из этого ряда. Изучение биологических и биохимических характеристик основных музейных ("коллекционных) лабораторных и клинических штаммов имеет важное практическое, научное и теоретическое значение. Проблема стандартизации типичных музейных штаммов остается значимой в современной микробиологии, что связано с необходимостью сравнения различных лабораторных исследований независимо от места и времени их проведения. Очевидно, что чем более тонко и полно охарактеризован музейный штамм, тем больше возможностей представляется исследователю для обнаружения изменений, наступающих непосредственно со штаммом и сравнения результатов экспериментов с контрольными или ранее полученными. Подробное описание штаммов микобактерий позволяет усовершенствовать документацию (паспорта), сопровохдэощую штаммы.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

Изучить основные биологические и биохимические свойства лабораторных штаммов рода Mycobacterium из музея культур ЦНШТ РАМН, а также клинических чувствительных и резистентных изоля-тов от больных туберкулезом.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.Изучить тинкториальные и культуральные особенности МБ.

£.Изучить выживаемость и сохранение осноеных биологических свойств MB при хранении в различных температурных условиях.

3.Охарактеризовать биологические свойства М.tuberculosis Academia с целью замены тест-штамма М.tuberculosis H37Rv.

4.Разработать метод клонирования МБ.

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1.Метод клонирования Ж.

Z.Тест-штамм М.tuberculosis Academia.

3.Дополнительные методы окраски для характеристики тинкто-риальных сеойств лабораторных штаммов.

4.Дополнительные характеристики для паспортизации лабораторных и клинических культур.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ.

При изучении тинкториальных особенностей 5 основных музейных штаммов рода Mycobacterium в фазе экспоненциального роста и при хранении до б мес. с оспользованием стандартных (Циль-Нильсена, Бой) и нетрадиционных (Грам, Романовского-Гимза) методов окраски определено, что морфологические и тинкториальные свойства типичных (палочковидных),кокковидных и L-форм МБ, а также их наличие и количество меняются б зависимости от вида, Еозрас-та культур или срокоЕ их хранения.Предложено использовать указанные методы окраски для оценки свойств МБ.

Изучены в сравнении культуральные особенности ряда музейных и клинических чувствительных и резистентных к противотуберкулезным препаратам штаммов МБ, позволяющие в деле контроля правильности приготовления питательных сред и определения лекарственной резистентности МБ, заменить вирулентный штамм М.tuberculosis H37Rv на авирулентный штамм М.tuberculosis Academia.

На основе концепции о S- и R-формах микобактерий разработан биологический метод клонирования фенотипически полноценных культур МБ. Предложен метод определения степени вирулентности микобактерий по массивности обсемененности паренхиматозных органов экспериментальных животных.

С целью обеспечения сохранности биологических свойств рабочих культур музейных штаммов МБ предложено использовать их хранение при -70°С в составе р-ров БСА и твин-80.

Установлена различная антибактериальная активность препаратов в отношении штаммов МБ, применяемых для оценки МИК.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные положения диссертации доложены на Всесоюзном семинаре "Современные проблемы антибиотикорезистентности"('1988); Симпозиуме ЦНИИТ по вопросам изменчивости микобактерий туберкулеза (1988); Всесоюзном семинаре"Микробиологические методы исследования во фтизиопульмонологии" (1990); Всероссийской научно-практической конференции "Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики инфекций"(1993); Выездном цикле усовершенствования врачей-лаборантов в Гомеле,Беларусь (1996); 5 и 6 национальных конгрессах по болезням органов дыхания (1995, 1996); 7 съезде ВОЗШ (1997); Научно-практических конференциях ЦНИИТ (1990); Секции "Микробиология и иммунология туберкулеза"

- О -

Московского отделения ВОЭМП и Курсах усовершенствования фтизиатров и микобактериологов в ДНИИТ; в ЦНШТ на совместном заседании отделов микробиологии, патоморфологии и иммунологии (1996).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Работа изложена на страницах машинописного текста, включая иллюстрации 19 таблиц и 6 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 6 глав собственных исследований, заключения и выеодов, указателя литературы, включающего 117работ отечественных и зарубежных авторов.

Основные результаты, приведенные в диссертации, получены автором лично. Исследования тинкториальных свойств МБ проведены совместно с к.м.н.НиколаеЕСЙ Г.М.;ростовых свойств с применением радиоизотопного метода - с к.б.н.Бибергаль Е.А.; по хранению и использованию тест-штаммов для оценки МИК - с к.м.н.Корнеевым А.А., д.м.н.Никоненко Б.В.;сравнительной характеристики и замены тест-штаммов - с к.м.н.Аникиным В.А., к.м.н.Попеску Т.Т., д.м.н.Гедымин Л. Е.; по получению клонированных штаммов - с к.м.н.Корнеевым А.А. „к.м.н.Гришиной Т.Д.,к.б.н. Черноусовой JI.H.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Микробиологические анализы были выполнены согласно приказа Минздрава СССР N 558 "Об унификации микробиологических методов «следования при туберкулезе"(1978).

Обработку диагностического материала производили 10% р-ром МазР04,смесь центрифугировали 10-15 мин при 2000 g. Надосадоч-ную жидкость сливали, из осадка делали мазок с последующим окрашиванием. Для посева использовали 0,1 мл осадка , который засевали на плотные яичные среды Финна-2 (Ф2), Аникина -6 (Аб). Посевы выращивали в стационарных условиях при 37°С.Просмотр посевного материала производили каждые 7 дней в течение 3 мес.

Для дифференциации М.tuberculosis и М.bovis использовали комбинированную среду с ТСХ и НаМОз на основе плотных сред Ле-венштейна-Йенсена (ЛЙ) и Попеску (П) [Приказ N558,1978;11опеску Т.Т.,1990;Гришина Т.Д.,19943.Для дифференциации атипичных мико-бактерий (АМБ) использовали методы, рекомендованные приказом МЗ СССР N 558, кроме того применяли ряд сред и методик американской схемы определений микобактерий (МБ)[Mycobacterium culture collection,19801.При типировании атипичных микобактерий и клас-

снфикации их по группам (Ranvon) использовали методы описанные в Приказе N558, дополнительно изучали рост на средах с ТСХ, резистентность к гидрокоиламину.

Биологические,культуральные и тинкториальные свойства МБ изучены в соответствии с рекомендациями, изложенными в приложении N1 к Приказу N558 МЗ СССР от 1978г.Были исследованы лабораторные штаммы МБ из музея культур ЦНШТ РАМН :М. tuberculosis H37Rv,M.tuberculosis Erdmari.M.tuberculosis Academia, M.bovis Bovinus-8, M.bovis BCG ,M.bovis Vallee, M.avium, M.fortui-tum.M.kansasii.a также клинических чувствительных и полирезистентных штаммов МБ.Для изучения тинкториальных свойств дополнительно использованы методы окраски МБ по Граму.Романовско-му-Гимзе и Мурохаши.Для исследования культуральных свойств штаммов дополнительно использованы жидкие питательные среды: Школьниковой (Ш),Локкемана (Л).Сотона (С),Попеску (П) и NN 3,23 с радиоизотопной меткой.

Для разработки метода получения клонированных культур МБ применяли твинсодержащие питательные среды, гомогенизацию культуры методом растирания в фарфоровых ступках и пробирках Видали .ультразвуковой дезинтегратор, а так же разработанный и описанный в главе "Получение клонированных штаммов микобактерий" метод, основанный на использовании биологической модели.

Лекарственную устойчивость (ЛУ) клинических изолятов и музейных штаммов МБ определяли методом абсолютных концентраций (моноустойчивость).Ряд по определению ЛУ включал две контрольные пробирки без ПТП, пробирку с комбинированной средой, содержащей ТСХ (0,1 мкг/мл) и 0,1% NaNOs, среды с ПТП и салициловым натрием.

Морские свинки и мыши были получены из центрального питомника экспериментальных животных РАМН (Столбовая,Мое.обл.) и содержались в виварии ЦНИИТ РАМН.Зутаназию животных проводили под эфирным (этиловый эфир), гексаналовым или тиопенталовым наркозом посредством введения в/бршинно ( 150-200 мг/кг массы).

Статистическую обработку результатов исследований производили в соответствии с рекомендациями И.П.Ашмарина и А.А.Воробьева "Статистические методы в микробиологических исследованиях".

- о -

ТИНКТОРИАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МУЗЕЙНЫХ ШТАММОВ МИКОБАКТЕРИЙ.

Бактериоскопическая характеристика тинкториальных свойсте МБ является одной из осноеных и доступных в определении особенностей штамма и может служить первичным видовым дифференциально- диагностическим тестом. Однако паспорта штаммов МБ не предусматривают описание тинкториальных особенностей штаммов и ограничиваются лишь общими замечаниями о кислото- и спиртоустой-чивости МБ при окраске стандартными методами (по Пиль-Нильсену и флюорохромными красителями - по Адамчику и Бою). Однако для полной тинкториальной характеристики популяции МБ, которая включает в себя целый спектр клеток с измененными свойствами, окраски по Циль-Нильсену и Бою явно не достаточно. Традиционные методы позволяют выявить только типичные кислотоустойчивые палочковидные и кислотоустойчивые кокковидные формы МБ.

В эксперимент были взяты штаммы М.tuberculosis Erdrnan, М.tuberculosis Academia, М.bovis Bovinus-8, M.bovis BOG Russian, M. avium AvíUjTi-53. Мазки лабораторных штаммов красили стандартными методами по Бою(Б) и Цилю-Нильсену (ЦК), а также нетрадиционными в отношении окраски № методами - по Граму (Г) и РоманоЕскому-Гимзе (РГ).Дублированные мавки просматривали независимо дбэ исследователя, которые тщательно описывали состояние популяции и составляющие ее элементы (формы), их размер, интенсивность окрашивания.Эксперименты повторяли на культурах со среды Павловского через 1,5 и 5,5 мес.

Результаты бактериоскопии на примере М.tuberculosis Erdman представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Тинкториальные свойства М.tuberculosis Erdrnan.

Метод окраски i Возраст культуры j Сроки хранения культуры i

1 3 нед. | 1,5 мес. i ¡ 5,5 мес.

По Бою 1 Изогнутые палочки,|То же, что в 1 1 МВТ зернистые

изолированно лека-¡3-х недельной |по всей длине,

щие и в скоплениях)культуре. 1 часть их блед-

До 20% МВТ не окра| |но окрашена.

- б -

| шены.Корд-фактор +| |

По Цилю- | Тонкие, изогнутые В МБТ выражена

Нильсену | палочки размером зернистость,

! 1,5 до £ мкм. Еди часть МБТ сла-

| ничные шаровидные боокрашена,еди

| структуры диамет- ничные слабоок

I ром 2-10 мкм. решенные зерна

По Граму I Фиолетовые Г(+)- Много Г(+)-зе-

I зерна и палочки. рен.

По Романов- 1 МБТ не окрашены, Часть МБТ окра Скопления си-

скому-Гимае | скопления сесто- шена в сирене- реневых и фио

| преломляющих вый или фиоле- летовых МБТ.

! структур. товый цвет,еди

ничные светоп-

реломляющие

1 зерна. |

В целом исследование показало, что в популяции вирулентных штаммов Егс1тап и ВоуггшБ-З число неокрашенных клеток значительно меньше,чем у менее вирулентных штаммов. Наличие зернистости МБ в старых культурах фиксируется независимо от видовой принадлежности. Кислотоустойчивые Ь-формы МБ обнаружены только у молодых культур вирулентных видов, а некислотоустойчивые - у штаммов со сниженной вирулентностью. Обращает на себя внимание, что культура ВСБ , единственная из изученных в данном исследовании, имела Ь-формы независимо от возраста.Была выявлена особенность результатов окраски по Г у описанных видов МБ в зависимости от возраста и срока хранения культуры: 3-х недельные вирулентные штаммы Егскпап и Воушиэ-в окрашиваются положительно, а культуры со сниженной или отсутствующей вирулентностью того же Бозраста(Ас^еп11а!ВСБ,Ау1шг1-53)- грамотрицательны. Во всех молодых культура:-; присутствуют Г(+)-кокковидные формы МБ, число которых возрастает по мере старения популяции. При окрашивании методом РГ хорошо выявляются зернистые шары Ь-форм МБ,а

молодые вирулентные культуры Erdman и Bovinus-8 не окрашиваются гематологическими красителями, но по мере старения часть клеток приобретает сиреневую или фиолетовую окраску. Культуры с ослабленной вирулентностью, независимо от возраста, хорошо окрашиваются этими красителями.

Таким образом, определены следующие особенности испытанных штаммов МБ: морфологические и тинкториальные свойства МБ, окрашенных стандартными методами по Пилю-Нильсену и Бою, меняются в зависимости от вида, возраста культур или сроков хранения; нетрадиционные методы окраски - по Грачу и Романовскому-Гимзе -дают возможность дополнительно выявить различные формы изменчивости МБ, такие как Грам положительные кокковидные формы МБ и L-формы МБ; наличие и количество измененных форм, входящих в микобактериальную популяцию, зависят от вида или сроков хранения культур.

Тинкториальные свойства МБ являются значимым дифференциально-диагностическим тестом, позволяющим характеризовать микобактериальную популяцию по элементам ее составляющим.Использование четырех методов окраски является обязательны),i этапом для видоеой характеристики штамма, и может быть рекомендовано как один из экспресс-тестов с включением в Паспорта музейных культур.

РОСТОВЫЕ СВОЙСТВА И ВЫЖИВАЕМОСТЬ МИКОЕАКТЕРИЙ ПРИ ХРАНЕНИИ В РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРНЫХ УСЛОВИЯХ.

С целью изучения ростовых сеойств МБ на основе радиоизотопного метода определена метаболическая активность МБ и возможность ускоренной идентификации штаммов.

Из таблицы 2 видно, что оптимальной для проведения экспериментов явилась среда Ш с 10% р-ром плазмы. Скорость деления клеток М.tuberculosis составила в среднем 10,7 часа, для клеток М.bovis - в среднем 8,25 часа, а клетки M.kansasii и M.fortui-tuiTi делились со скоростью 12,4 и 2,4 часа соответственно.

Таблица 2.

Скорость деления МБ на жидких питательных средах

Штамм Ж i i ¡Питательные среды| i i i i igs т+1д5(час

1 i i 1 2 ! 1 1 3 4 5

М.tuber. H37Rv 1 1 !Школьникова+10%пл| 1 1 * * 10,3+0,45

1 1 i N 3 | • i 35 66 26,3+4,3

1 1 М.tubErdman|Школьникова+10%пл| ! 1 65 409 9,1+1,8

i i |Школь никова+10%пл| | ! * * 16,2+0,1

M.tuber. N 5343 ! I j Школьникова+10%пл! I i 123 795 8,9+2.1

! i ! N 23 1 64 128 24,1+2,7

iJAM i i |Школьникова+10%пл| * * 7,4+0,4

M. tuber. N6651 1 ! | Школьникова+ЮХпл I 1 I 127 778 9,2+0,5

1 1 | Локкеман | t t 105 282 16,9+1,2

M. bovis Vallee t i i 1 IN 3 | 1 ! 24,8 34,2 51,9+8,1

M.bovis Bovinus-ö 1 1 |Школьникова+10%пл| 1 1 ** ** 8,3+1,7

1 ! | Локкеман | ( ! 11 16 44,5+1,7

1 1 | N 3 | 12,6 26 23,0+4,2

M.bovis BCG/'R- INH i 1 t | t ] |Школьникова+10%пл| ! | 48 364 8,2+1,3

i 1 |Школьникова+10%пл| л 12,4+0,6

- з -

M.kansasii |- -¡-,-

1 N 3 | i i 13,4j 19,2|32,7+5,4 i i

1 1 М.fortuitum1 Школьникова+10%пл| .i i 1 i *A*¡ ***| 2,4+0,5

i i

* - среднее из 2 экспериментов/ ** - ср.из 3 зкспер./ *** - ср. из 4 зкспер.

Было проверено также влияние величины инокулята на скорость деления МБ в жидкой питательной среде N3. Результаты опытов приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Злияние величины инокулята на скорость деления клеток МБ (часы).

Величина инокулята Скорость деления МБ при посевной дозе.. в часа;-; в 1мл(Х+I95)

Штамм МБ i 2,5х104 1 i 2,5х10б 2,5х107

М. tub.H37Rv I 25,4+4,0 ¡ 26,6+4,1 26,3+4,3

M.tub.Academia 1 24,1+2.1 | 1 П Л -1 1 О 1 £,t , 1"Г<С., 1 21,9+1,8

M.bovis Bov.-8 1 28,4+5,0 | I 20,8+4,2 23,0+4,2

M.kansasii i 32,7+5,4 i i 26,5+4,0 -

Как видно из таблицы 3 в диапазоне посеьной дозы от 104 до 10' микробных тел в мл скорость деления клеток МБ одинакова и по этому признаку штамм М.tuberculosis Academia не отличается от штамма М.tuberculosis H37Rv.

Экспериментально отработан радиоизотопный метод типирова-ния МБ (таблица 4).

Габлица 4.

Результаты типирования МБ (с помощью ТСХ и радиоизотопной метки).

День экспери! мента Ь

-и день

4-й день

Критерии

Вариант

! I&

i i tCT. ¡ Igv'lgll Ig

icT.¡Ig/Igl

Результат типирования

U^D-» ПО/ KV

H37RV+TCK

|661 16 ¡387 47

5.5

1 -ч

I J-:

1936 29 i 455 52

5,1 | 2,0

М.bovis

Bovinus-8 Bov.+ ТОН

I1233 57 1669 48

7,8

11605 61 1717 51

M.bovis

~г

ECG BCG+TCH

|673 34 1824 79

1,8 | 0,8

¡936 47 |994 80

0,6 i 0,9

M.tub., Атип-Mí

"Г

622 622+TCH

1962 46 1853 134

11262 52 1,1 |1155 158

1,6 | 1,1

М. tub.: Атип.№

3639 3639+ТСН

1972 75 1933 66

| 11297 97

0,4 I 1,0 ¡1106 67

1,6 | 1,1

М.tub., Атип. ívG

(Ig - индекс роста на среде без ингибитора, Igi - индекс роста на среде с ингибитором ТСНДст.- критерий Стьюдента).

Различия между контролем и вариантом с ТСК для штаммов М.tuberculosis H37Rv и М. bovis Bovinus-8 имеют высокий уровень достоверности. Отношение Ig без ингибитора к Ig в присутствии ТСН, больше 1 (1,7-2,2).Это говорит о том, что оба штамма относятся к бычьему виду. Для штаммов М.bovis BOG, 622 и 3632 различия не достоверны, а отношение определено меньше 1- эти штаммы относятся либо к М.tuberculosis, либо к группе АМБ. Полученные результаты подтверждены культурально-биохимическими методами на комбинированной среде с ТСХ и NaNOs.

Анализ результатов, проведенных экспериментальных исследований, убеждает, что метод специфических ингибиторов на базе

О

радиоизотопного метода может быть использоьан для типирования музейных и клинических штаммов № в течение 3-х - 4-х суток.

Штамм М.tuberculosis H37Rv, впервые Еыделенный в 1905г. из легких больного туберкулезом человека, начиная с 1934г. по предложению W.Steenkeri используется в бактериологических лабораториях как контрольный, эталонный [Mycobacterium coli.,1980]. Основным критерием для тест-штамма должна являться его безусловная чувствительность ко Есем применяемым во фтизиатрии ПТП. Вместе с тем.будучи многократно перевиваемым в течение нескольких десятков лет в лабораторных условиях штамм адаптирован к питательным средам и по своим ростовым потребностям резко отличается от клинических штаммов. Г.А.Коротаев и Т.М.Козулицына [1978, 1981] показали, что тест-штамм H37Rv не является лучшим штаммом для контроля при определении ЛУ МВТ. Василев В.Н.[19711 и Томан К.[1980] считают, 4tg H37Rv более устойчив к INH и особенно к ПАСК, чем дикие штаммы. В гоже время штамм H37RV продолжает оставаться вирулентным, что не может не отражаться на эпидемической ситуации в лабораториях. Так, по данным Приймака A.A.[1993], профессиональная заболеваемость сотрудников бактериологических лабораторий противотуберкулезных учреждениях PI в 10 раз выше,чем среди лиц проживающих в контакте с больным туберкулезом и в 50 раз Еыше, чем среди населения в среднем по стране.

Поэтому, вопрос об адекватной замене контрольного тест-штамма в деле постановки методов определения лекарственной чувствительности Ж, контроля приготовления питательных сред, а в последнее Еремя - и для выбора тест-штамма при постановке по-лимеравно-цепной реакции,требует своего рассмотрения.

Принципиально важной для тест-штамма является его природная чувствительность к основным ПТП. Показано, что тест-штамм Academia по чувствительности к основным ПТП ближе к диким (клиническим) изолятам, нежели H37RV.

Штамм Academia способен образовывать косы в жидкой питательной среде (один из признаков патогенности). Для окончательного решения иопроса о вирулентности тест-штамма М.tuberculosis Academia, было проведено определение вирулентности штамма с использованием морских свинок,которые являются наиболее чувствительными животными к М.tuberculosis.Тестирование штамма Acade-

- IS -

mia было проведено параллельно с штаммом Н371?у.Доза заражения М.tuberculosis H37RV составила 0,025 мг, для штамма М.tuberculosis Academia - доза заражения была увеличена в 40 раз и составила 1,0 мг на животное.Гибель свинок инфицированых H37Rv наступила на 62-57 сутки. Свинга!, инфицированные штаммом Academia были выведены из эксперимента через 4 мес. наблюдения. Гис-томорфологическую характеристику проводили совместно с сотрудником отдела патоморфологии ЦНИИТ РАМН д.м. н.Гедымин Л.Е. Определено,что у штамма Academia отсутствует вирулентность, в отличии от тест-штамма H37Rv.

Таким образом, штамм Academia предлагается использовать в качестве контрольного тест-штамма при постановке методов определения лекарственной резистентности клинических изолятов МБ.

трудностей. Однако, проблемой остается хранение рабочих культур этих штаммов на протяжении длительного времени.Проведен поиск приемлемых методов консервации рабочих культур МБ. Была предпринята попытка хранения МБ е специальной среде, состоящей из 2Z тиомочевины и 8Х сахарозы. Хранение проб было осуществлено при температурных режимах:2-4° С, -5,-20 и -70° С. В контрольном исследовании, вместо антиокислителя и консерванта, был использован физ.р-р. Жизнеспособность МБ определяли по количеству КОЕ на плотной питательной среде Ф2. Испытанию были подвергнуты М.bovis BOG и М.tuberculosis Erdman.

Таблица 5.

Выживаемость клеток М.bovis BOG и М.tuberculosis Erdman при различной температуре хранения в зависимости от состава консервирующей жидкости.

__—--,-¡-

Темпера- |N раз- | Через б мес хранения тура хра-| водящей i-¡—--г-—-

Штамм МБ

КОЕ/мл

(х10~6)

нения (С)i жидкое-1 КОЕ | % КОЕ

|ти | в мл | -1-!-i--

ЛКУ

М.bovis BCG

П Л О п о

1 I О ¡ о

не опред

О ¡ 0

не опред

т

- ir, -

целей клинического штамма М.tuberculosis N 395 отмечена равно высокая активность отечественного PZA независимо от формы выпуска препарата. Подтверждено отсутствие активности PZA в отношении М.bovis Bovinus-8, что является видовой особенностью штамма.Настоящее наблюдение подтверждает, что до использования во фтизиатрической практике впервые синтезированных препаратов, а также новых форм известных лекарственных средств и ранее не применявшихся препаратов, необходимо проводить их тестирование in vitro для определения МИК.Определение МИК препарата должно осуществляться одновременно на тест-штаммах и клинических чувствительных и полирезистентных изолятах.Аналогичному исследованию МИК должны подвергаться и различные Форш выпуска препаратов. Снижение эффективности препарата, по данным определения МИК in vitro, может явиться показанием к увеличению дозировки препарата (если это позволяет состояние больного) или отмене препарата.

Установлено, что природная чувствительность к ПТП тест-штамма М.tuberculosis Academia, определенная по МИК,наиболее близка к диким клиническим изолятам МВТ, что позволяет использовать его в качестве контрольного и при определении резистентности штаммов к препаратам фторхинолонового ряда.

ПОЛУЧЕНИЕ КЛОНИРОВАННЫХ ШТАММОВ МИКОБАКТЕРИЙ.

В современной микобактериологии остается не решенным вопрос получения достоверных количественных характеристик бактериальных материалов, выращенных in vitro.В практической микобактериологии не удается получить серии однородных культур даже в следующей генерации МБ. Конгломерация клеток, выращенных in vitro, и корд-фактор, являются препятствием для определения такой важной характеристики штаммов и культур, каковой является вирулентность, а также для получения клонированных культур и штаммов МБ. В этой связи представляется невозможным гарантировать воспроизводимость количественных определений клеток МБ и, следовательно, инфицирующих и летальных доз возбудителя туберкулеза. Получение клонированных культур и адекватная оценка вирулентности возможны при использовании материалов, содержащих единичные клетки МБ.Принятая система подсчета КОЕ [Mitchison D., 13941 указывает лишь на концентрацию частиц загруженных микробными клетками, ко не на их общее количество.

Описанное состояние проблемы диктует необходимость поиска метода эффективной гомогенизации с дезинтеграцией микобактери-альной взвеси, выращенной in vitro, для экспериментальных исследований.

Детергент-содержащая среда Дюбо, по результатам бактериос-копических методов по ЦН и Мурохаши, не обеспечивает эффективную гомогенизацию микобактериальных взвесей тест-штамма М. tuberculosis H37Rv, что отражено в таблице 6.

Таблица 6.

Состояние микобактериадьной популяции в гомогенизированной взвеси и в фазе адаптации МБ на среде Дюбо.

1 Сроки бактериоскопии | Количественное состояние популяции МБ

1 (в 100 полях зрения)

1 Кол-ео i i ! Кол-ьо 1 Кол-во

1 единичных 1 малых 1 больших

1 клеток 1 (2-3 кл.) 1 (>10 кл.)

1 I конгл. 1 i i конгл.

После приготовления | 235 1 i 1 192 1 87

взвеси по 5 ст.мут. | 1 1 i i

1 После 2 дней инку- | 338 I I 1 262 1 19

бации на среде Дюбо | i 1 1 i i

Аналогичные результаты были получены и на жидкой питательной среде Ш, с включением в ее состав Твин-80. Определено,что сочетанная дезинтеграции взвеси МВТ механическим способом (растиранием) совместно с использованием детергента является недостаточной. Данный метод не допускает возможности копийного повторения опыта.

Была предпринята попытка получения однородного гомогената MB используя ультразвуковой дезинтегратор (УЗД). Испытанию были подвергнуты штаммы М.tuberculosis H37Rv и М.bovis BCG.Взвесь МБ подвергали воздействию УЗД (Bransonic,США).длительность воздействия от 1,3,6,10 мин.- до 20 мин. Результаты сравнивали с контрольной пробой со взвесью МБ, не подвергавшихся обработке.

Для выявления характера изменений наступивших в популяции МБ после волнового воздействия использовали методы бактериоскопии по Б и Мурохаши (М) для определения живых и мертвых клеток МБ.

Параллельное использование деух различных методов бактериоскопии выявило, что ультразвуковое воздействие является недостаточным для полной дезинтеграции конгломератов. Выявлены количественные и качественные изменения клеток: осноеной формой наблюдения в мазках становятся коккоьидные и/или структурно измененные МБ.Бактериоскопия по М позволила определить резкое снижение количества жиеых клеток (на 85-90%). Гомогенизация взвеси МБ с помощью УЗД показала невозможность его использования - даже длительное волновое воздействие не приводило к полноценной гомогенизации взвеси до единичных клеток.

Было обращено внимание на то, что как правило, МБ в мазках приготовленных из патологического материала от больных людей и зараженных животных, располагаются отдельно,а в материалах полученных in vitro, всегда присутствовали конгломераты, а у ряда штаммов и корд-фактор. В дальнейшем была предложена биологическая модель получения клонированных штаммов, основанная на постулате ,что МБ, находящиеся в организме животного, относятся к 3-форме. Мы исходили из общепринятого определения клона, как культуры микроорганизмов, полученной при размножении одной клетки данного вида или штамма СБакулина Н.А.,Краева Э.Л.,1980].

Исходя из постулата, морских свинок заражали внутрисердеч-но взгесыо нескольких штаммов МБ в дозе 1х109 микробных клеток по оптическому стандарту мутности. Через 7 дней проводили зута-назню животных, делали мазки-отпечатки из паренхиматозных органов (легких, печени и селезенки), а биоптат растирали в ступке. Гомстенат разводили до 10~7 и из каждого десятикратного разведения по 0,1мл высевали на чашки Петри со средой Финна-2.

Обработку патологического материала детергентами не проводили, т.к. предварительно было показано, что после обработки клинических полирезистентных штаммов соответствующими р-рами кислоты, NaOH или ХГГ высеваемость их на питательной среде была ниже, чем в контроле.

В мазках-отпечатках органов окрашенных по Бою, подсчитывали количество отдельно лежащих клеток МБ. Через 14-21 дней инкубации на средах подсчитывали отдельные колонии МБ. Единичные

колонки из предельных разЕедений снимали петлей и переносили на косяки с аналогичной средой, получая таким образом посевной материал для накопления клонированной биомассы.

Бактериоскопическое наблюдение за количеством МБ в мазках-отпечатках органов и определение КОЕ показало высокую степень корреляции между изучаемыми признаками и его достоверность (г min = 0,95). Анализ ДНК, выделенной из клонированных штаммов, с помощью метода дактилоскопии показал, что испытуемые клоны генетически однородны. Совместно с сотрудниками лаборатории биотехнологии и клинической иммуногенетики ЦНИИТ РАМН к.б.н. Черноусовой Л.Н. и к.б.н.Калининой O.A. на основании данных иммуноблотинга микобактериапьных культур с моноклональ-ными антителами, специфичными к М. tuberculosis-комплексу, показали, что у МБ, высеянных из организма человека, в сравнении с аналогами, полученными с искусственных питательных сред, определяются как общие, так и уникальные антигенные детерминанты, т.е.имеются различия в антигенной структуре. Различия в антигенной структуре были показаны и при тестировании музейных штаммов МБ: М.tuberculosis H37Rv, Academia и Erdman; M.bovis Bovinus-8 и BCG. Методом Western blot с моноклональными антителами к M.tuberculosis-комплексу были выявлены сходства и различия в антигенной структуре как МБ, относящихся к М.tuberculosis по сравнению с М.bovis, так и МБ, относящихся к разным штаммам одного вида.

Определение вирулентности М.tuberculosis Erdman и M.tuberculosis клинического изолята обнаруживает явную тропность данных штаммов к легочной ткани - разница между КОЕ определяемых в легких в сравнении с другими паренхиматозными органами составляет от 2 до 9 раз, чего не определяется в более ранние сроки. Никакой другой из испытанных штаммов не давал преимущественного поражения легких над остальными органами. Данное биологическое тестирование, очевидно, может быть использовано в виде дифференциально-диагностического теста при типировании штаммов.Количественный метод определения пораженности паренхиматозных органов является более совершенным, нежели т.н. индекс пораженности органов, расчитываемый на основании визуального макроморфологи-ческого определения степени обсеменности внутренних органов инфицированных животных и определяемый при вскрытии.

Разработанные совместно с к.м.н.Корнеевым А.А.и к.ы.н.Гришиной Т.Д. методы определения вирулентности и клонирования штаммов МБ представляются принципиально важными для создания выверенных коллекций фенотипически однородных культур МБ. Модель клонирования может иметь применение и в молекулярно-гене-тических исследованиях.

ВЫВОДЫ.

i.Использование методов бактериоскопии по Циль-Нильсену, Зою.Граму и Романовскому-Гимзе позволило изучить клеточный состав микобактериальной популяции в экспоненциальной фазе роста и при хранении. Определено, что морфологические и тинкториальные свойства микобактерий меняются в зависимости от вида, возраста культур и их вирулентности.

2.Определено,что ростовые свойства лабораторных штйммое целесообразно изучать на жидких питательных средах с добавлением 101 плазмы крови.Величина инокулята микобактерий в посевных дозах от 104 до 1С' не влияет на скорость деления клеток микобактерий. Установлено, что наиболее полно биологические свойства МБ сохраняются в рабочих культурах штаммов микобактерий, содержащих в своем составе бычий сывороточный альбумин и твин-80 при температуре-70°С.

3.На примере изучения МИК для офлокеацина и рифампицина показано, что лабораторные и клинические штаммы М.tuberculosis характеризуются различной величиной МИК, что необходимо учитывать при изучении активности новых противотуберкулезных препаратов .

4.Изучены тинкториальные, биохимические и биологические (включая вирулентность для чувствительных экспериментальных животных - морских свинок) свойства М.tuberculosis Academia.Доказана возможность адекватной замены вирулентного тест-штамма М.tuberculosis H37Rv на М.tuberculosis Academia при изучении ростовых свойств МБ на различных питательных среда?; и определении лекарственной резистентности микобактерий туберкулеза, как контрольного чувствительного и авирулентного штамма.

5.Теоретической основой для разработки метода клонирования послужила концепция утверждающая, что микобактерии в организме человека и чувствительных животных находится в S-форме и являются фенотипически полноценными, не подвергаются конгломерации.

- so -

Разработанный биологический метод клонирования позволяет получать клоны из единичных клеток при посеве мокроты от больных туберкулезом или органов экспериментальных тавотных.Метод позволяет создавать выверенные коллекции лабораторных штаммов ми-кобактерий с заданными характеристиками.Модель клонирования может найти применение в молекулярно-генетических исследованиях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1.Для получения клонированных штаммов использовать феноти-пически полноценные культуры (изоляты) от больных или из паренхиматозных органов чувствительных животных (морских свинок);

2.Дли оценки тинкториальных свойств лабораторных и экспериментальных штаммов микобактерий использовать комплекс красителей предусмотренных методами Циль-Нильсена, Боя, Грама и Ро-манавского-Гимза;

3.В качестве биологически безопасного и чувствительного к основным противотуберкулезным препаратам, предложено использовать референс-штамм М.tuberculosis Academia для контроля постановки методов определения лекарственной резистентности клинических штаммов микобактерий, а также для изучения ростовых свойств микобактерий и их выживаемости при различных условиях и специальных воздействиях на микобактерии;

4.С целью сохранения биологических сьойств основных музейных штаммов предложено периодическое пассирование их через организм чувствительных животных;

5.Предложено дополнить паспортные характеристики коллекционных штаммов микобактерий результатами окраски по Граму и Ро-мановскому-Гимзе, нитратредуктазной активности роста на комбинированной среде с ТСХ и NaNOy, роста на среде с салициловокис-лым натрием. В ряд по определению лекарственной устойчивости включить комбинированную среду и среду с салициловокислым натрием.