Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Музейные штаммы рода Mycobacterium. Биологические свойства, поддержание и применение в экспериментально-клинических условиях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Музейные штаммы рода Mycobacterium. Биологические свойства, поддержание и применение в экспериментально-клинических условиях"

i'ivs

На правах рукописи

ПУЗАНОВ Владимир Алексеевич

МУЗЕЙНЫЕ ШТАММЫ РОДА MYCOBACTERIUM. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, ПОДДЕРЖАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ.

03.00.07- микробиология.

Автореферат диссертации на соискание ученой стенени кандидата медицинских наук.

Москва - 1998.

Работа выполнена в Це[пральном научно-исследовательском институте туберкулеза Российской Академии Медицинских наук.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Голышевская В.И.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Леви Д.Т.

доктор биологических наук, профессор Баснакьян И.А.

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова.

Защита состоится 1998 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д 084.18.01 при Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им . Г. Н. Габричевского МЗ РФ.

(125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Е .М. Горская.

1 ТТТ7 л 7ТТ Т Trv-'TT ТТТПП"" М I Л I HlM-irtJlDnUL.!. D iirUDJICJVlO.

Известно, что биологические материалы е процессе хранения и пересевов изменяют или утрачивают некоторые свои свойства несмотря на Еысокую устойчивость к химическим и физическим воздействиям. Род Mycobacterium не является исключением из этого ряда. Изучение биологических и биохимических характеристик основных музейных (коллекционных) лабораторных и клинических штаммов имеет важное практическое, научное и теоретическое значение. Проблема стандартизации типичных музейных штаммов остается значимой в современной микробиологии, что связано с необходимостью сравнения различных лабораторных исследований независимо от места и времени их проведения. Очевидно, что чем более тонко и полно охарактеризован музейный штамм, тем больше возможностей представляется исследователю для обнаружения изменений, наступающих непосредственно со штаммом и сравнения результатов экспериментов с контрольными или ранее полученными. Подробное описание штаммоЕ микобактерий позволяет усовершенствовать документацию (паспорта), сопровождающую штаммы.

ЛЕЛЬ РАБОТЫ.

Изучить основные биологические и биохимические свойства лабораторных штаммов рода Mycobacterium из музея культур ЦНИИТ РАМН, а также клинических чувствительных и резистентных изоля-тов от больных туберкулезом.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.Изучить тинкториальные и культуральные особенности МБ.

¿.Изучить выживаемость и сохранение основных биологических свойств МБ при хранении в различных температурных условиях.

3.Охарактеризовать биологические свойства М.tuberculosis Academia с целью замены тест-штамма М.tuberculosis H37Rv.

4.Разработать метод клонирования МБ.

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1.Метод клонирования МБ.

Е.Тест-штамм М.tuberculosis Academia.

3.Дополнительные методы окраски для характеристики тинкто-риапьных свойств лабораторных штаммов.

4.Дополнительные характеристики для паспортизации лабораторных и клинических культур.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ.

При изучении тинкториальных особенностей 5 основных музейных штаммов рода Mycobacterium в фазе экспоненциального роста и при хранении до 6 мес. с оспользоЕанием стандартных (Циль-Ниль-сена, Бой) и нетрадиционных (Грам, Романовского-Гимза) методов окраски определено, что морфологические и тинкториальные свойства типичных (палочковидных),кокковидных и L-форм МБ, а также их наличие и количество меняются в зависимости от вида, Еозрас-та культур или сроков их хранения.Предложено использовать указанные методы окраски для оценки свойств МБ.

Изучены в сравнении культуральные особенности ряда музейных и клинических чувствительных и резистентных к противотуберкулезным препаратам штаммов МБ, позволяющие в деле контроля правильности приготовления питательных сред и определения лекарственной резистентности МБ, заменить вирулентный штамм М.tuberculosis H37Rv на авирулентный штамм М.tuberculosis Academia.

На основе концепции о S- и R-формах микобактерий разработан биологический метод клонирования фенотипически полноценных культур МБ. Предложен метод определения степени вирулентности микобактерий по массивности обсемененности паренхиматозных органов экспериментальных животных.

С целью обеспечения сохранности биологических свойств рабочих культур музейных штаммов МБ предложено использовать их хранение при -70°С в составе р-ров БСА и твин-80.

Установлена различная антибактериальная активность препаратов в отношении штаммов МБ, применяемых для оценки МИК.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные положения диссертации доложены на Всесоюзном семинаре "Современные проблемы антибиотикорезистентности"('1Э88); Симпозиуме ЦНИИТ по вопросам изменчивости микобактерий туберкулеза (1988); Всесоюзном семинаре"Микробиологические методы исследования во фтизиопуяьмонологии" (1990); Всероссийской научно-практической конференции "Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики инфекций"(1993); Выездном цикле усовершенствования врачей-лаборантов в Гомеле,Беларусь (1996); Б и 6 национальных конгрессах по болезням органов дыхания (1995, 1996); 7 съезде ВОЗМП (1997); Научно-практических конференциях ЦНИИТ (1990); Секции "Микробиология и иммунология туберкулеза"

Московского отделения БОЗМП и Курсах усовершенствования фтизиатров и микобактериологов в ЦНИИТ; в ДНИИТ на совместном заседании отделов микробиологии, патоморфологии и иммунологии (1996).

ОБЪОу! И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Работа изложена на страницах машинописного текста, включая иллюстрации 19 таблиц и б рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 6 глав собственных исследований, заключения и выеодов, указателя литературы, включающего 117работ отечественных и зарубежных авторов.

Основные результаты, приведенные в диссертации, получены автором лично. Исследования тинкториальных свойсте № проведены совместно с к.м.н.Николаевой Г.М.;ростовых свойств с применением радиоизотопного метода - с к.б.н.Бибергаль Е.А.; по хранению и использованию тест-штаммов для оценки ШК - с к.м.н.Корнеевым А.А., д.м.н.Никоненко Б.В.уравнительной характеристики и замены тест-штаммов - с к.м.н.Аникиным В.А., к.м.н.Попеску Т.Т., д.м.н.Гедымин Л.Е.; по получению клонированных штаммов - с к.м.н.Корнеевым А.А..к.м.н.Гришиной Т.Д.,к.б.н. Черноусовой Л.Н.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Микробиологические анализы были выполнены согласно приказа Минздрава СССР N 558 "Об унификации микробиологических методов иследования при туберкулезе"(1978).

Обработку диагностического материала производили 10% р-ром NasP04,смесь центрифугировали 10-15 мин при £000 g. Надосадоч-ную жидкость сливали, из осадка делали мазок с последующим окрашиванием. Для посева использовали 0,1 мл осадка , который засевали на плотные яичные среды Финна-2 (Ф2), Аникина -6 (А6). ПосеЕЫ Еыращивали в стационарных условиях при 3?°С.Просмотр посевного материала производили каждые 7 дней в течение 3 мес.

Для дифференциации М.tuberculosis и М.bovis использовали комбинированную среду с ТСХ и НаГОз на основе плотных сред Ле-венштейна-Йенсена (ЛЙ) и Попеску (П) [Приказ N558,1978;11опеску Т.Т.,1990;Гришина Т.Д.,1994].Для дифференциации атипичных мико-бактерий (АМБ) использовали методы, рекомендованные приказом МЗ СССР N 558, кроме того применяли ряд сред и методик американской схема определений микобактерий (МБ)[Mycobacterium culture collection,1980].При типировании атипичных микобактерий и клао-

снфикации их по группам (Ranyon) использовали методы описанные в Приказе N558, дополнительно изучали рост на средах с ТСХ, резистентность к гидроксиламину.

Биологические,культуральные и тинкториальные свойства МБ изучены в соответствии с рекомендациями, изложенными в приложении N1 к Приказу N558 МЗ СССР от 1978г.Были исследованы лабораторные штаммы МБ из музея культур ЦНИИТ РАМН :М.tuberculosis H37Rv,M.tuberculosis Erdman.M.tuberculosis Academia, M.bovis Bovinus-8, M.bovis BCG ,M.bovis Vallee, M.avium, M.fortui-tum,M.kansasii,a также клинических чувствительных и полирезистентных штаммов МБ.Для изучения тинкториальных свойств дополнительно использованы методы окраски МБ по Граму,Романовско-му-Гимзе и Мурохаши.Для исследования культуральных свойств штаммов дополнительно использованы жидкие питательные среды: Школьниковой (Ш).Локкемана (Л),Сотона (С).Попеску (П) и NN 3,23 с радиоизотопной меткой.

Для разработки метода получения клонированных культур МБ применяли твинсодержашие питательные среды, гомогенизацию культуры методом растирания в фарфоровых ступках и пробирках Вида-ля, ультразвуковой дезинтегратор, а так же разработанный и описанный в главе "Получение клонированных штаммов микобактерий" метод, основанный на использовании биологической модели.

Лекарственную устойчивость (ЛУ) клинических изолятов и музейных штаммов МБ определяли методом абсолютных концентраций (моноустойчивость).Ряд по определению ЛУ включал две контрольные пробирки без ПТП, пробирку с комбинированной средой, содержащей ТСХ (0,1 мкг/мл) и О, IX NaNQs, среды с ПТП и салициловым натрием.

Морские свинки и мши были получены из центрального питомника экспериментальных животных РАМН (Столбовая,Мое.обл.) и содержались в виварии ЦНИИТ РАМН.Зутаназию животных проводили под эфирным (этиловый эфир), гексаналовым или тиопенталовым наркозом посредством введения в/брюшинно ( 150-200 мг/'кг массы).

Статистическую обработку результатов исследований производили в соответствии с рекомендациями И.П.Ашмарина и А.А.Воробьева "Статистические методы в микробиологических исследованиях".

- о -

ТИНКТОРИАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МУЗЕЙНЫХ ШТАММОВ МИКОБАКТЕРЙЙ.

Бактериоскопическая характеристика тинкториальных свойсте МБ является одной из основных и доступных в определении особенностей штамма и может служить первичным видовым дифференциально-диагностическим тестом. Однако паспорта штаммов МБ не предусматривают описание тинкториальных особенностей штаммов и ограничиваются липгь общими замечаниями о кислото- и спиртоустой-чиеости МБ при окраске стандартными методами (по Циль-Нильсену и флюорохромными красителями - по Адамчику и Бою). Однако для полной тинкториальной характеристики популяции МБ. которая включает в себя целый спектр клеток с измененными свойствами, окраски по Циль-Нильсену и Бою явно не достаточно. Традиционные методы позволяют выявить только типичные кислотоустойчивые палочковидные и кислотоустойчивые кокковидные формы МБ.

В эксперимент были взяты штаммы М.tuberculosis Erdman, М.tuberculosis Academia, М.bovis Bovinus-8, M.bovis BOG Russian, M. avium Avium-53. Мазки лабораторных штаммов красили стандартными методами по Бою(Б) и Цилю-Нильсену (ЦН), а также нетрадиционными в отношении окраски МБ методами - по Граму (Г) и Романовскому-Гимзе (РГ).Дублированные мазки просматривали независимо два исследователя, которые тщательно описьтали состояние популяции и составляющие ее элементы (формы), их размер, интенсивность окрашивания.Эксперименты повторяли на культурах со среды Павловского через 1,5 и 5,5 мес.

Результаты бактериоскопии на примере М.tuberculosis Erdman представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Тинкториальные свойства М.tuberculosis Erdman.

! Метод окраски¡ i Возраст культуры ¡ Сроки хранения культуры

1 3 нед. | 1.5 мес. i i 5,5 мес.

По Бою i 1 Изогнутые палочки,¡То же, что в i |МБ7 зернистые

изолированно лежа-|3-х недельной ¡по всей длине,

щие и в скоплениях¡культуре. ¡часть их блед-

1 До 20% МВТ не окра] ¡но окрашена.

- б -

| шены.Корд-фактор +| | I 1 I

По Цилю- 1 | Тонкие, изогнутые 1 В МБТ выражена

Нильсену | палочки размером 1 зернистость,

I 1,5 до Е мкм. Еди | -//- часть МБТ сла-

| ничные шаровидные 1 боокрашена,еди

! структуры диамет- 1 ничные слабоок

| ром 2-10 мкм. т 1 1 рашенные зерна

По Граму 1 | Фиолетовые Г(+)- 1 1 Много Г(+)-зе-

! зерна и палочки. 1 | -//1 рен.

По Романов- 1 I МБТ не окрашены, 1 |Часть МБТ окра Скопления си-

скому-Гимзе | скопления свето- |шена в сирене- реневых и фио

| преломляющих вый или фиоле- летовых МБТ.

| структур. |товый цвет,еди

1 |ничные светоп-

1 ! |реломляющие

1 1 |зерна. (

В целом исследование показало, что в популяции вирулентных штаммов Егёшап и Воу1шз-8 число неокрашенных клеток значительно меньше,чем у менее вирулентных штаммов. Наличие зернистости МБ в старых культурах фиксируется независимо от видовой принадлежности. Кислотоустойчивые Ь-формы МБ обнаружены только у молодых культур вирулентных видов, а некислотоустойчиЕые - у штаммов со сниженной вирулентностью. Обращает на себя внимание, что культура ВСБ , единственная из изученных в данном исследовании, имела Ь-формы независимо от возраста.Была выявлена особенность результатов окраски по Г у описанных видов МБ в зависимости от возраста и срока хранения культуры: 3-х недельные вирулентные штаммы Егс1тап и Воуд.пиз-8 окрашиваются положительно, а культуры со сниженной или отсутствующей вирулентностью того же возраста(Асас1е1П1а,ВСа,Ау1шп-53)- грамотрицательны. Во всех молодых культурах присутствуют Г(+)-кокковидные формы МБ, число которых возрастает по мере старения популяции. При окрашивании методом РГ хорошо выявляются зернистые шары ь-форм МБ,а

молодые вирулентные культуры Erdman и Bovinus-8 не окрашиваются гематологическими красителями, но по мере старения часть клеток приобретает сиреневую или фиолетовую окраску. Культуры с ослабленной вирулентностью, независимо от возраста, хорошо окрашиваются этими красителями.

Так!™ образом, определены следующие особенности испытанных штаммов МБ: морфологические и тинкториальные свойства МБ, окрашенных стандартными методами по Пилю-Нильсену и Бою, меняются в зависимости от вида, Еозраста культур или сроков хранения; нетрадиционные методы окраски - по Грачу и Романовскому-Гимзе -дают возможность дополнительно еыяеить различные формы изменчивости МБ, такие как Грам положительные кокковидные формы № и L-формы МБ; наличие и количество измененных форм, входящих в микобактериальную популяцию, зависят от вида или сроков хранения культур.

Тинкториальные свойства МБ являются значимым дифференциально- диагностическим тестом, позволяющим характеризовать микобактериальную популяцию по элементам ее составляющим.Использование четырех методов окраски является обязательным этапом для видовой характеристики штамма, и может быть рекомендовано как один из экспресс-тестов с включением в Паспорта музейных культур.

РОСТОВЫЕ СВОЙСТВА И ВЫЖИВАЕМОСТЬ МИКОБАКТЕРИЙ ПРИ ХРАНЕНИИ В РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРНЫХ УСЛОВИЯХ.

С целью изучения ростовых свойств MB на основе радиоизотопного метода определена метаболическая активность МБ и возможность ускоренной идентификации штаммов.

Из таблицы 2 видно, что оптимальной для проведения экспериментов явилась среда Ш с ÍGZ р-ром плазмы. Скорость деления клеток М.tuberculosis составила в среднем 10,7 часа, для клеток М.bovis - е среднем 8.25 часа, а клетки М.kansasii и M.fortui-tum делились со скоростью 12,4 и 2,4 часа соответственно.

- о -

Таблица 2.

Скорость деления МБ на жидких питательных средах

Штамм МБ i i |Питательные среды| t t 1 1Б1 1 1 i 1Б2 т+1э5(час

1 i i ! 2 i 1 3 I 1 4 5

М.tuber. H37Rv i |Школь никова+10%пл 1 1 *1 1 * 10,3+0,45

1 | N 3 1 35 | 1 66 26,3+4,3

1 М. tubErdman i Школьникова+ЮХпл 1 65 | f 409 9,1+1,8

i j Школьникова+10%пл 1 I *| 1 * 16,2+0,1

M.tuber. N 5343 1 i Школьникова+10%пд I 1 123 | 795 8,9+2,1

1 | N 23 i 64 i 1 128 24,1+2,7

¡MM 1 | Школьникоьа+ЮХпл i 1 * 1 i * 7,4+0,4

M.tuber. N6661 ! 1Школьникова+1(Жпл 1 1 127 | 1 778 9,2+0,5

! | Локкеман t 1 105 | 282 16,9+1,2

M. bovis Vallee t 1 | N 3 l i i 24,8|34,2 51,9+8,1

M.bovis Bovinus-8 1 | Школьникова+Ю&пл i i ** 8,3+1,7

i | Локкеман t 1 11 i i 16 44,5+1,7

t | N 3 I 12,6| 1 26 23,0+4,2

M.bovis BCG/R-INH i i |Школьникова+ЮХпл 1 1 48 | i 364 О ejt -1 r-i О,¿+1,О

i |Школьникова+10%пл 1 *i 12,4+0,6

М.kansasii |---h -1-1-

1 N 3 | i i 13,4| 19,2¡32, i i 7+5 4

1 1 М. fortuitum | Школь никова+Юлпл | i i 1 1 2, i i 4+0 5

* - среднее из 2 экспериментов/ ** - ср.из 3 экспер./ *** - ср. из 4 экспер.

Было проверено также влияние величины инокулята на скорость деления МБ в жидкой питательной среде N3. Результаты опытов приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Влияние величины инокулята на скорость деления клеток МБ (часы).

■ Величина инокулята Скорость деления МБ при посевной дозе.. в часа;-; в 1мл(Х+1дь)

Штамм МБ i 2,5х104 i i 2.5X106 2,5х107

М. tub.H37RV i 25,4+4,0 | 26,6+4,1 26,3+4,3

M.tub.Academia » 24,1+2,1 i ! 24,1+2,1 21,9+1,8

M.bovis Bov.-S 1 28,4+5,0 | i 20,8+4,2 23,0+4,2

M.kansasii i 32,7+5,4 ¡ 1 26,5+4,0

Как видно из таблицы 3 в диапазоне посевной дозы от 104 до 1Q7 микробных тел в мл скорость деления клеток МБ одинакова и по этому признаку штамм М.tuberculosis Academia не отличается от штамма М.tuberculosis H3?Rv.

Экспериментально отработан радиоизотопный метод типирова-ния МБ (таблица 4).

Таблица 4.

Результаты типироЕания МБ Со помощью ТСХ и радиоизотопной метки).

-г

День экспери! мента (-

3-й день

I 4-й день

Критерии

Вариант

I Ig

tCT.

Ig/Igll Ig

tCT.

Ig/Igl

Результат ти-пирова-ния

ПО) l\V

H37RV+TCK

|661 16 1387 47

5,5

¿ i' i

455 52 | 8,1

M.bovis

Bovirms-3 Bov.+ TCH

11233 57 1669 48

11605 61 j 1,8 |717 51 |11,:

1,2

M.bovis

БСВ ECG+TCH

|673 34 ¡824 79

1Л

|936 47 | 0,8 |994 80 | 0,6

0,9

M.tub., Атип.МБ

T

622 622+TCH

1962 46 1853 134

Ц262 52 I 1,1 11155 158|

1,6

1.1

M. tub. , Атип.МБ

3639 3639+TCH

|972 75 1933 66

0.4

1,0 I

|1297 97 | 1106 67 | 1,6

1,1

M.tub., Атип.МБ

Í. Ig - индекс роста на среде без ингибитора, Ig! - индекс роста на среде с ингибитором TCH.tcT.- критерий Стьюдента).

Различия между контролем и вариантом с ТСН для штаммов М.tuberculosis H37Kv и М.bovis Bovinus-8 имеют высокий уровень достоверности. Отношение Ig без ингибитора к Ig в присутствии ТСН, больше 1 (1,7-2,2).Это говорит о том, что оба штамма относятся к бычьему виду- Д-кя штаммов М.bovis BCG, 622 и 3632 различия не достоверны, а отношение определено меньше 1- эти штаммы относятся либо к М.tuberculosis, либо к группе АМБ. Полученные результаты подтверждены культурально-биохимическими методами на комбинированной среде с ТСХ и NallOs.

Анализ результатов, проведенных экспериментальных исследований, убеждает, что метод специфических ингибиторов на базе

О

радиоизотопного метода может быть использован для типирования музейных и клинических штаммов МБ в течение 3-х - 4-х суток.

Штамм М.tuberculosis H37Rv, впервые выделенный в 1905г. из легких больного туберкулезом человека, начиная с 1934г. по предложению W.Steenken используется в бактериологических лабораториях как контрольный, эталонный [Mycobacterium coli.,1980]. Основным критерием для тест-штамма должна являться его безусловная чувствительность ко Есем применяемым во фтизиатрии ПТП. Вместе с тем,будучи многократно перевиваемым б течение нескольких десятков лет в лабораторных условиях штамм адаптирован к питательным средам и по сбоим ростовым потребностям резко отличается от клинических штаммов. Г.А.Коротаев и Т.И.Козулицына [1978, 1981] показали, что тест-штамм H37Rv не является лучшим штаммом для контроля при определении ЛУ МВТ. Василев В.Н.[1971] и Томан К.[19803 считают, что H37RV более устойчив к INH и особенно к ПАСК, чем дикие штаммы. В тоже время штамм H37RV продолжает оставаться вирулентным, что не может не отражаться на эпидемической ситуации в лабораториях. Так, по данным Приймака A.A.[1993], профессиональная заболеваемость сотрудников бактериологических лабораторий противотуберкулезных учреждениях РФ в 10 раз выше,чем среди лиц проживающих в контакте с больным туберкулезом и в 50 раз выше, чем среди населения в среднем по стране.

Поэтому, вопрос об адекватной замене контрольного гест-штамма в деле постановки методов определения лекарственной чувствительности МБ, контроля приготовления питательных сред, а в последнее время - и для выбора тест-штамма при постановке по-лимеравно-цепной реакции,требует своего рассмотрения.

Принципиально важной для тэст-штамма является его природная чувствительность к основным ПТП. Показано, что тест-штамм Academia по чувствительности к основным ПТП ближе к диким (клиническим) изолятам, нежели H37Rv.

Штамм Academia способен образовывать косы в жидкой питательной среде (один из признаков патогенности). Для окончательного решения вопроса о вирулентности тест-штамма М.tuberculosis Academia, было проведено определение вирулентности штамма с использованием морских свинок,которые являются наиболее чувствительными животными к М.tuberculosis.Тестирование штамма Acade-

miа было проведено параллельно с штаммом Н371?у.Доза заражения М.tuberculosis H37RV составила 0,025 мг, для штамма М.tuberculosis Academia - доза заражения была увеличена в 40 раз и составила 1,0 мг на животное.Гибель свинок инфицированых H37Rv наступила на 52-57 сутки. Сеинки, инфицированные штаммом Academia были выведены из эксперимента через 4 мес. наблюдения. Гис-томорфологическую характеристику проводили совместно с сотрудником отдела патоморфологии ЦНИИТ PAÍVÍH д.м.н.Гедымин Л.Е. Определено,что у штамма Academia отсутствует вирулентность, в отличии от тест-штамма H37Rv.

Таким образом, штамм Academia предлагается использовать в качестве контрольного тест-штамма при постановке методов определения лекарственной резистентности клинических изолятов МБ.

Хранение лиофилизированных музейных штаммов не вызывает трудностей. Однако, проблемой остается хранение рабочих культур этих штаммов на протяжении длительного времени.Проведен поиск приемлемых методов консервации рабочих культур МБ. Была предпринята попытка хранения МБ в специальной среде, состоящей из 2% тиомочеЕИНЫ и 8% сахарозы. Хранение проб было осуществлено при температурных режимах:2-4° С, -5,-20 и -70° С. В контрольном исследовании, вместо антиокислителя и консерванта, был использован физ.р-р. Жизнеспособность МБ определяли по количеству КОЕ на плотной питательной среде Ф2. Испытанию были подвергнуты M.bovis BCG и М.tuberculosis Erdman.

Таблица 5.

Выживаемость клеток M.bovis BCG и М.tuberculosis Erdman при различной температуре хранения в зависимости от состава консервирующей жидкости.

т-1-г

|Темпера- |N раз') | тура хра-1 водящей |нения (С)|жидкос-i |ти

Штамм МБ

КОЕ/мл íxiü"6'

Через 6 мес хранения

i г

КОЕ | % КОЕ в мл I

ЛКУ

M.bovis BCG

о ,0 ■С.-**

I 1

не опред

0 ¡ не опред

__I_

-1-

I

I I 1-5° С I 1 [_ •1 | 550 | 0,4| 1 0,4

1 ! 1 1 п 1 1 I 1 1 о | ! | 1 0 ! 1 не опред

1 1 1 1 1-20° С | 1 | 1 1 I | 1920| 1 | 1 1,48| 1 0,3

1 1 1 I 1 1 1 : I 2 1 ! 1 720 1 | | 1 0,55! ! 0,34

1 МЛиЬег! си1оз1з| ЕгсЬпап 1 1 1 1 ! о л [ 1Ь | 1 1 1 ! 1,з | 1 | 1 0,0065| 0,7

1 П 200 | | 1 ' Г) «с. 1 1 I о 1 I | 1 0 1 1 не опред

1 1 I 1 1-5° С | 1 1 ! 1 | 1400| ! | 1 0,7| 1 0,36

1 1 1 п 1 1 1 | п 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 не опред

1 1 1 1 1 ¡-20° С | 1 1 1 | 2470| 1 [ 1 1,25! 1 0,32

1 1 I 1 Н ! I 1 1 2 ! 1 I 450 | 1 г ! П ОО 1 1 0,44

(р-р N 1 - физ.р-р; р-р N2 ~ .С/о тиомочевины и 8% сахарозы;

ЛКУ-логарифмический коэффициент убыли жиеых МБ).

Анализ данных показал, что число КОЕ через 6 мес хранения можно было наблюдать при Т -5° С и -20° С, однако их количество составляло от 0,23 до 1,48,1 от исходного.ЛКУ указывает на высокие потери живых микробов или на их конгломерацию.Настоящий способ оказался неэффективным для хранения рабочих культур МБ.

Проведены исследования сохранности биологических свойств МБ при температуре -70° С.Штамм МБ был высеян из ампул на среду Л-Й, и после инкубации из взвеси МБ растиранием на холоде приготовлены гомогенаты на 0,1% р-ре бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,051 р-ре твин-80. Концентрация МБ составила 1,0 мкг/мл (3-5х107 КОЕ/мл). Гомогенаты аликвотированы по 1,0 мкг/мл в кол-ве 50 проб и заморожены при -70° С. Высевы проб производили через 1 мес. и затем - каждые 2-3 недели в течение 1 года.Жизнеспособность клеток МВТ после хранения оценивали по результатам подсчета КОЕ на чашках Петри со средой ЛЙ и по степени вирулентности для мышей чувствительных к туберкулезу линии

BALB/c.

При температуре хранения -70°С в составе БСА и твина, жизнеспособность клеток МБ не подверглась изменениям. Аналогичные результаты были получены при испытании степени вирулентности аликБОТИровачных проб М.tuberculosis H37Rv: при заражении групп мышей, состоявших из 10 жиботных весом 18-20 г, сроки их гибели от генерализованного туберкулеза составили от 24 до 27 дней не зависимо от длительности хранения инфекционного материала.Рекомендован сохранный способ депонирования рабочих разведений штаммов МБ для обеспечения долгосрочных серий экспериментальных исследований.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕСТ-ШТАММОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ IN VITRO МЯК ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫ)1; СРЕДСТВ.

Арсенал противотуберкулезных препаратов ограничен. Использование их в клинике фтизиатрии остается достаточно интенсивным, что на фоне длительных сроков лечения больных туберкулезом создает проблему замены,которая осложняется резистентностью МБ к наиболее активным ПТП.Испытание активности новых ПТП является одним из приоритетных направлений в микобактериологии. К тако-еым следует отнести группу хинолонов.Подтвержденная активность фторхинолонов Блечет за собой необходимость выбора тест-штамма для контроля постановки тестов по определению резистентности клинических изолятов.

Проведена оценка лабораторных и клинических штаммов по МИК для офлоксацина (в сравнении с рифампицином и пиразинамидом). Показано, что чувствительность к 0FL и RMP тест-штамма Academia составила соответственно Х=1,2±0,5 и Х=0,9±0,8; H37Rv-X=l,0±0,5 и X=3,6±l,l; BoviriU3-8- Х=0,8±0,4 и X=l,8±0,64; BCG-X=1,0±0,7 и Х=£,1±1,55. Выраженная чувствительность к 0FL определена и у полирезкстентных клинических изолятов N2761 и N3111 (оба R-SM,VM,INH,RMP), N2630/R-SM, VM,INH.RMP.EMB.Определено, что клинические штаммы, резистентные к RMP,хорошо подавляются 0FL, а чувствительные клинические штаммы лучше подавляются 0FL, чем RMP, что позволяет рекомендовать его для активного использования в схемах лечения больных туберкулезом.

Показано также,что МИК порошковидного отечественного PZA выше Е 2 раза таблетироганной формы при испытании препарата на тест-штамме М.tuberculosis Academia.При использовании для этих

- 1 г) -

целей клинического штамма М. tuberculosis N 395 отмечена равно высокая активность отечественного PZA независимо от формы выпуска препарата. Подтверждено отсутствие активности Р2А в отношении М.bovis Bovinus-8, что является видоеой особенностью штамма.Настоящее наблюдение подтверждает, что до использования во фтизиатрической практике впервые синтезированных препаратов, а также новых форм известных лекарственных средств и ранее не применявшихся препаратов, необходимо проводить их тестирование in vitro для определения МИК.Определение ШК препарата должно осуществляться одновременно на тест-штаммзх и клинических чувствительных и полирезистентных изолятах.Аналогичному исследованию МИК должны подвергаться и различные формы выпуска препаратов. Снижение эффективности препарата, по данным определения ШК in vitro, может явиться показанием к увеличению дозировки препарата (если это позволяет состояние больного) или отмене препарата.

Установлено, что природная чувствительность к ПТП тест-штамма М. tuberculosis Academia, определенная по МИК,наиболее близка к диким клиническим изолятам МВТ, что позволяет использовать его в качестве контрольного и при определении резистентности штаммов к препарата!/ фторхинолонового ряда.

ПОЛУЧЕНИЕ КЛОНИРОВАННЫХ ШТАММОВ МИКОБАКТЕРИЙ.

В современной микобактериологии остается не решенным вопрос получения достоверных количественных характеристик бактериальных материалов, Еырааенных in vitro.В практической микобактериологии не удается получить серии однородных культур даке б следующей генерации МБ. Конгломерация клеток, выращенных in vitro, и корд-фактор, являются препятствием для определения такой важной характеристики штаммог и культур, каковой является вирулентность, а также для получения клонированных культур и штаммов МБ. В этой связи представляется невозможным гарантировать воспроизводимость количественных определений клеток МБ и, следовательно, инфицирующих и летальных доз возбудителя туберкулеза. Получение клонированных культур и адекватная оценка вирулентности возможны при использовании материалов, содержащих единичные клетки №. Принятая система подсчета КОЕ [Mitchison D., 19941 указывает лишь на концентрацию частиц загруженных микробными клетками, но не на их общее количество.

Описанное состояние проблемы диктует необходимость поиска метода эффективной гомогенизации с дезинтеграцией микобактери-альной взвеси, выращенной In vitro, для экспериментальных исследовании.

Детергент-содержащая среда Дюбо, по результатам бактериос-копических методов по ЦН и мурохаши. не обеспечивает эффективную гомогенизацию микобактериальных взвесей тест-штамма М.tuberculosis H37Rv, что отражено в таблице 6.

Таблица 6.

Состояние микобактериальной популяции в гомогенизированной взвеси и в фазе адаптации МБ на среде Дюбо.

1 Сроки бактериоскопии | 1 \ Количественное состояние популяции МБ (в 100 полях зрения)

г 1 1 1 I 1 f Кол-ео единичных клеток i ! Кол-во i малых 1 (2-3 кл.) 1 конгл. i i 1 Кол-во ¡ больших 1 (>10 кл.) 1 конгл. 1

1 После приготовления | взвеси по 5 ст.мут. | i осгц 1 1 192 1 1 1 1 87 1 1

1 После 2 дней инку- | бации на среде Дюбо | F 338 1 1 262 1 i 1 1 19 1 i

Аналогичные результаты были получены и на жидкой питательной среде Ш, с включением в ее состав Твин-80. Определено,что сочетанная дезинтеграции взвеси МБТ механическим способом (растиранием) совместно с использованием детергента является недостаточной. Данный метод не допускает возможности копийного повторения опыта.

Была предпринята попытка получения однородного гомогената МБ используя ультразвуковой дезинтегратор (УЗД). Испытанию были подвергнуты штаммы М.tuberculosis H3?Rv и М.bovis BCG.Взвесь МБ подвергали воздействию УЗД (Bransonic,США)»длительность воздействия от 1,3,6,10 мин.- до 20 мин. Результаты сравнивали с контрольной пробой со взвесью МБ, не подвергавшихся обработке.

Для выявления характера изменений наступивших в популяции МБ после волнового воздействия использовали методы бактериоскопии по Б и Мурохаши (М) для определения живых и мертвых клеток МБ.

Параллельное использование двух различных методов бактериоскопии еыявило, что ультразвуковое воздействие является недостаточным для полной дезинтеграции конгломератов. Выявлены количественные и качественные изменения клеток: основной формой наблюдения в мазках становятся кокковидные и/или структурно измененные МБ.Бактериоскопия по М позволила определить резкое снижение количества живых клеток (на 85-80%). Гомогенизация взвеси МБ с помощью УЗД показала невозможность его использования - даже длительное волновое воздействие не приводило к полноценной гомогенизации взвеси до единичных клеток.

Было обращено внимание на то. что как правило, МБ в мазках приготовленных из патологического материала от больных людей и зараженных животных, располагаются отдельно,а в материалах полученных in vitro, всегда присутствовали конгломераты, а у ряда штаммов и корд-фактср. В дальнейшем была предложена биологическая модель получения клонированных штаммов, основанная на постулате ,что МБ, находящиеся в организме животного, относятся к 3-форме. Мы исходили из общепринятого определения клона, как культуры микроорганизмов, полученной при размножении одной клетки данного вида или штамма [Бакулина К.А.,Краева З.Л..19801.

Исходя из постулата, морских свинок заражали внутрисердеч-но взвесью нескольких штаммов МБ в дозе 1х109 микробных клеток по оптическому стандарту мутности. Через 7 дней проводили зута-назию животных, делали мазки-отпечатки из паренхиматозных органов (легких, печени и селезенки), а биоптат растирали в ступке. Гомогенат разводили до 10~7 и из каждого десятикратного разведения по 0,1мл высевали на чашки Петри со средой Финна-2.

Обработку патологического материала детергентами не проводили, т.к. предварительно было показано, что после обработки клинических полирезистентных штаммов соответствующими р-рами кислоты, NaOH или ХГГ высеваемость их на питательной среде была ниже, чем в контроле.

В мазках-отпечатках органов окрашенных по Бою, подсчитывали количество отдельно лежащих клеток МБ. Через 14-21 дней инкубации на средах подсчитывали отдельные колонии МБ. Единичные

- IB -

колонки из предельных разведений снимали петлей и переносили на косяки с аналогичной средой, получая таким образом посевной материал для накопления клонированной биомассы.

Бактериоскопическое наблюдение за количеством МБ в мазках - отпечатках органов и определение КОЕ показало высокую степень корреляции между изучаемыми признаками и его достоверность (г min = 0,95). Анализ ДНК, выделенной из клонированных штаммов, с помощью метода дактилоскопии показал, что испытуемые клоны генетически однородны. Совместно с сотрудниками лаборатории биотехнологии и клинической иммуногенетики ЦНШТ РАМН к.б.н. Черноусовой Л.Н. и к.б.н.Калининой O.A. на основании данных иммуноблотинга микобактериальных культур о моноклональ-ными антителами, специфичными к М.tuberculosis-комплексу, показали, что у МБ, высеянных из организма человека, в сравнении с аналогами, полученными с искусственных питательных сред, определяются как общие, так и уникальные антигенные детерминанты, т.е.имеются различия в антигенной структуре. Различия в антигенной структуре были показаны и при тестировании музейных штаммов МБ: М.tuberculosis H37Rv, Academia и Erdman; М.bovis Bovinus-8 и BCG. Методом Western blot с моноклональными антителами к М.tuberculosis-комплексу были выявлены сходства и различия в антигенной структуре как МБ, относящихся к М.tuberculosis по сравнению с М.bovis, так и KS, относящихся к разным штаммам одного вида.

Определение вирулентности М.tuberculosis Erdman и М.tuberculosis клинического изолята обнаруживает явную тропность данных штаммов к легочной ткани - разница между КОЕ определяемых в легких в сравнении с другими паренхиматозными органами составляет от 2 до 9 раз, чего не определяется е более ранние сроки. Никакой другой из испытанных штаммов не давал преимущественного поражения легких над остальными органами. Данное биологическое тестирование, очевидно, может быть использовано в виде дифференциально-диагностического теста при типировании штаммов.Количественный метод определения пораженности паренхиматозных органов является более совершенным, нежели т.н. индекс пораженное™ органов, расчитываемый на основании визуального макроморфологи-ческого определения степени обсеменности внутренних органов инфицированных животных и определяемый при вскрытии.

Разработанные совместно с к.м.н.Коркеевым А.А.и к.м.н.Гришиной Т.Д. методы определения вирулентности и клонирования штаммов МБ представляются принципиально важными для создания выверенных коллекций фенотипически однородных культур МБ. Модель клонирования может иметь применение и в молекулярно-гене-тических исследованиях.

ВЫВОДЫ.

1.Использование методов бактериоскопии по Циль-Нильсену, Бою,Грачу и Романоьскому-Гимзе позволило изучить клеточный состав микэбактериальной популяции в экспоненциальной фазе роста и при хранении. Определено, что морфологические и тинкториальные свойства микобактерий меняются в зависимости от вида, возраста культур и их вирулентности.

2.Определено,что ростовые свойства лабораторных штаммов целесообразно изучать на жидких питательных средах с добавлением 10% плазмы крови.Величина инокулята микобактерий в посевных дозах от 104 до 10' не влияет на скорость деления клеток микобактерий. Установлено, что наиболее полно биологические свойства № сохраняются в рабочих культурах штаммов микобактерий, содержащих в своем составе бычий сывороточный альбумин и твин-80 при температуре-70°С.

3.На примере изучения МИК для офлоксацина и рифампицина показано, что лабораторные и клинические штаммы М.tuberculosis характеризуются различной величиной МйК. что необходимо учитывать при изучении активности новых противотуберкулезных препаратов .

4.Изучены тинкториальные, биохимические и биологические (включая вирулентность для чувствительных экспериментальных животных - морских свинок) свойства М.tuberculosis Academia.Доказана возможность адекватной замены вирулентного тест-штамма М.tuberculosis H37Rv на М.tuberculosis Academia при изучении ростовых свойств № на различных питательных средах и определении лекарственной резистентности микобактерий туберкулеза, как контрольного чувствительного и авирулентного штамма.

5.Теоретической основой для разработки метода клонирования послужила концепция утверждающая, что микобактерии в организме человека и чувствительных животных находятся в S-форме и являются фенотипически полноценными, не подвергаются конгломерации.

- го -

Разработанный биологический метод клонирования позволяет получать клоны из единичных клеток при посеве мокроты от больных туберкулезом или органов экспериментальных животных.Метод позволяет создавать выверенные коллекции лабораторных штаммов ми-кобактерий с заданными характеристиками.Модель клонирования может найти применение б молекулярно-генетических исследованиях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

Т.Лля получения клонированных штаммов использовать феноти-пически полноценные культуры (изоляты) от больных или из паренхиматозных органов чувствительных животных (морских сеинок);

2.Для оценки тинкториалъных свойств лабораторных и экспериментальных штаммоЕ микобактерий использовать комплекс красителей предусмотренных методами Циль-Нильсена, Воя, Грама и Романовского- Г имза;

3.В качестве биологически безопасного и чувствительного к основным противотуберкулезным препаратам, предложено использовать референс-штамм М.tuberculosis Academia для контроля постановки методов определения лекарственной резистентности клинических штаммов микобактерий, а также для изучения ростоЕых свойств микобактерий и их выживаемости при различны?; условиях и специальных воздействиях на микобактерии;

4.С целью сохранения биологических свойств основных музейных штаммов предложено периодическое пассирование их через организм чувствительных животных;

5.Предложено дополнить паспортные характеристики коллекционных штаммов микобактерий результатами окраски по Граму и Ро-маковскому-Гимзе, нитратредуктазной активности роста на комбинированной среде с ТСХ и NaNOy, роста на среде с салицшгавокис-дым натрием. В ряд по определению лекарственной устойчивости включить комбинированную среду и среду с с-алициловокислым натрием.