Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Mos-родственные нуклеотидные последовательности в геноме высших эукариот

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Mos-родственные нуклеотидные последовательности в геноме высших эукариот"

Академия наук СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

На правах рукописи

БЕРДИЧЕВСКИЙ Федор Бенорович

УДК 577.29

MOS-РОДСТВЕННЫЕ НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В ГЕНОМЕ ВЫСШИХ ЭУКАРИОТ

Специальность 03.00.03— молекулярная биология

I

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1988

Работа выполнена в лаборатории .молекулярных основ оикогсиеза Института молекулярной биологии Академии наук СССР.

Научные руководители —

кандидат химических наук И. М. Чумаков,

доктор биологических наук, профессор Л. Л. Киселев.

Официальные оппоненты —•

доктор биологических наук В. М. Кавсан, кандидат биологических наук С. А. Недоспасов.

Ведущая организация — Институт биологии развития АН СССР, им. Н. К- Кольцова.

Защита состоится «

/6 »_

_(988 г. в ' час.

на заседании Специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологин АН СССР по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии АН СССР. :^ £

Автореферат разослан « »__1988 г.

Актуальность проблемы. К одной из актуальных проблем современной молекулярной биологии относится выяснение природы процессов, приводящих к соматическим заболеваниям, в частности, к развитию опухолей. За последние годы найдены гены, изменение структуры которых вызывает эти заболевания, однако для многих болезней причины их возникновения остаются неизвестными. Поэтому идентификация новых генов, расшифровка их структуры и изучение функций белков, ими кодируемых, может привести к пониманию молекулярных основ некоторых неинфекционных заболеваний с неизвестной этиологией.

Одним из подходов к обнаружению новых нуклеотидных последовательностей в геноме служит молекулярная гибридизация в «нестрогих» условиях. Используя этот метод, удалось клонировать новые представители семейства протоонкогенов ras (Capon et ah, 1987), myc (Depinho et ah, 1986), mos (Заба-ровский и др., 1984). Использование гибридизации в нестрогих условиях может также привести к обнаружению новых генов, имеющих отдаленное родство с исходной пробой.

Цель работы. Целью работы был поиск новых, транскрип-ционно-актнвных генов человека, родственных гену mos, а также исследование структурных и некоторых функциональных характеристик mos-родственных нуклеотидных последовательностей у высших эукариотических организмов.

Научная новизна работы. Из библиотеки кДНК эмбриона человека в бактериофаге К gtlO выделен клон son3 а определена первичная структура вставки из этого клопа. При сравнении аминокислотной последовательности, транслированной с son3 с банком аминокислотных последовательностей показано, что п ее состав входят участки, гомологичные онкобелку mos, а также некоторым ядерным белкам как структурным (галлнн, протамииы), так и регуляторным (семейство онкобелков myc).

Обнаружена эволюционная консервативность локусов son и Ко 1 в геномах всех исследованных видов позвоночных, в то время, как локус ORAgpS обнаружен лишь в геноме представителей отрядов грызунов и приматов. Кроме того, показана

эволюционная консервативность гена mos в геномах всех исследованных позвоночных. Используя соматические гибриды между клетками хомяка и человека, показано, что локусы К51, ORAgp5 и mos не сцеплены на одной хромосоме у человека. Определена хромосомная локализация локуса son у человека (21-я хромосома). Обнаружено, что локус son экспрессируется в клетках плаценты человека в виде единственного транскрипта размером не менее 8,5 т. н. Показано присутствие нескольких транскриптов локуса К51 в тканях эмбриона крысы. Размер транскриптов составлял 9,5 т. п., 6,0 т. н., 2,1 т. п., (1,8 т. н. и 1,3 т. н.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на XVI Конференции ФЕБО (Москва, 1984 г.), на I Всесоюзном совещании «Онкогены, онкобелки и ростовые факторы» (Кяяри-ку, 1986 г.), па Всесоюзной конференции «Молекулярная биология генов высших организмов» (Москва, 1987 г.).

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Работа изложена на /о8 страниц машинописного текста и иллюстрирована 2ST рисунками и V таблицами. Список цитированной литературы включает /^наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Молекулярное клонирование локуса son из библиотеки кДНК эмбриона человека. Одним из перспективных подходов к поиску новых генов может служить молекулярная гибридизация библиотеки генов с выбранным зондом (пробо'й) в «нестрогих» условиях, что позволяет обнаружить нуклеотидные последовательности, имеющие частичную гомологию с исходной пробой. Применяя в качестве молекулярного зонда геи v-mos, клонированный ранее в нашей лаборатории (Чумаков и др., 1980), клонирован ряд mos-родственных участков генома человека (Забаров-ский и др., 1981) и крысы (Саянова и др., 1983).

Анализ транскрипции одного из таких локусов крысы — Kol, где в качестве пробы использован уникальный фрагмент этого локуса, показал присутствие транскриптов в эмбриональных тканях крысы (рис. 1 ). Размер основного транскрипта составляет 2,1 т. н. Однако при более длительном экспонировании радиоавтографа удается обнаружить дополнительные транскрипты размером от ~9,5 т. и. до 1,3 т. к.

Рис. 1. Блот-гибридизацпя 32Р тр I ■■■"■■ ^ К51/12-пробы с образцами поли (А) +

РНК выделенной из эмбриона кры-, : : ¿.i :<.>■<'; eu (1), почек (2) и исчеин (3).

ж

2 8 Si

Используя в качестве гибрндизациошюи пробы уникальный Pstl-фрагмепт локуса К51, из библиотеки кДНК эмбриона человека в бактериофаге 7, gtlO были выделены три фага, один из которых (soii3) гнбридизовался также со смесью 23-члеиных синтетических иуклеотндов, кодирующих участок консервативного, домена генов mos. Участки son3 были субклонированы г. бактериофаги М13тр18 и М13тр19. Определение первичной структуры son3 было проведено с использованием дидезоксипу-клеозидтрифосфатов (Sanger et al., 1980). Размер расшифрованной роследовательпости составил 1454 нуклеотида. В son3 имеется только одна протяженная открытая рамка считывания. Отсутствие сигнала нолиаденнлнрования и ноли(А)тракта, а также инициирующего ко дона на 5'-копцс открытой рамки свидетельствует о том, что son3 яляется частью транскрппта локуса son человека.

а-32 Р-меченный son3 гнбрнднзуется с тремя Н'пнИП-фрагмен-тамп геномной ДНК человека размером 7,1; 2.8; 2,3; т. и. .и (рис.2), что свидетельствует, но-впднмому, об ннтронирован-ностп участка генома, представленного в клоне son3.

Участок son3 содержит короткие повторы. Во фрагменте soii3 обнаружены 4 тандемных совершенных повтора размером 21 и. и. (начиная с 801-го нуклеотида и по 884 нуклеотпд)

2 3 4

"v.

5 6 7

Ш

23,1 9,6 - 6.6

23s1

- 9.6

- 6,6

- 43

4.3.

.3,3 Zß

2,3; 2,0

Рис. 2. Блот-гибрлднзация 32Р son3-npo6bi с образцами ДНК моржа (I), -кролика (2), крота (3), слона (■!), расщеплешшой EcoRI. и ДНК плаценты человека, расщепленной BamHI (5). расщепленной совместно ВатШ — HiridllI (G), расщепленной HindIII (?)■

ACCCCCAGCCGCCGCAGCCGC (рис. 3), которые фланкированы с обеих сторон этими же повторами, б каждом из которых имеются rio 2 нуклеотидные замены в 1-м (А-*-Т) и 6-м (С-*-А) положениях у'5'-концевого повтора и в 6-м (С^Т)'п в 12-м (С-^Т) положениях — у З'-концевого повтора. Интересно, что из этих замей 3 являются синонимическими. Анализ аминокислотной последовательности son3, выведенной из иуклеотидной последовательности (рис. 4), позволяет вычленить «область пептидных повторов», охватывающую 209 аминокислот от 169 до 357. В центральной части этой области находится тандемно' повторенный гептапептид Thr—Pro—Ser—Arg—Arg—Ser—Arg (на рис. 4, повтор А), каждый из которых кодирован 21-членным нуклео-тидным повтором. Область повторов типа А с N- и С-концов фланкирована одинаковыми последовательностями длиной 19 аминбкислот (с единичной заменой), левая часть которых (до 248 и 309 аминокислоты) гомологична повтору типа А:

760 770 ' 780 - ?90 800

CTGTGGGTAG AAGAAGGAGC TTTAGCATTT CCCCAAGCCG CCGCAGCCGC

810 -820 830 8'i0 • 850

ACCCCCAGCC GCCGCAGCCG CACCCCCAGC CGCCGCAGCC GCACCCCCAG

860 870 880 890 . -900

CCGCCGCAGC CGCACCCCCA GCCGCCGGAG CCGCACCCCT TGCCGTCGGA

910 ■ 920 930 94 0 950

GCCGCACCCC AAGCCGCCGG AGAAGATCAA GGTCTGTGGT AAGAAGACGA

Рис. 3. Фрагмент нуклеотиднон последовательности EcoRI"UCTanK" клона

son3.

241 /С-ly.

Thr-Pro-Ser-Arg- Arg-Ar g-Arg-Ser-7al-y0^Ar.7,-Arg-Arg

302 259

-Ser-Phe-Ser-Ile^gQ

(на рис: 4 повтор В). С N-копца к повтору типа В примыкают повтор типа А (с 232 по 238 аминокислоту), а с С-конца — 3 тандемных повтора (рис. 4, повтор С) с консенсусом

, ^ Pro-X-Arg~Arg-Arg-Arg-Ser~Arg (Thr) (Leu)(Lys)(Phe)

(с 321 по 347 аминокислоту). Вслед за этими повторами лежит декапепт'ид - Ser—Ser—Glu—Arg— Gly—Arg— Ser—Pro—Lys— Arg. Интересно, что в области повторов son3 чтот пептид пред-

5

10 20 3C

I ñ rt n L L 3 P К E 3 2 Li G E к E V P p p P к E T L P D s G F

4Û 50 60

5 A N I E D I L' Л D L V R p L L p p И E R L T S L R h G

70 50 5 0

I £ U P L t S 'J V VJ К D R s Л í. 2 P '. V s 3 H P E R A 3 E

100 1 30 1 20

О S С E E к D DYE T F V К V К A с T К г. л R К X R T I R

120 14 0 1 50

u R к R R к E L S L £ X S E V S V p î: s !_ M t t; r f: R T S' E

1 60 1 70 1S0

о H 3 Л R 3 S 3 S У 5 i; R S Q T R о R y- p 2 f; R P R R

e

190 200 210

s c; R Q n S К •b 1. J, R 3 V 3 i- '3 R R p S P К I; R 2 Ï: 3 R

l I l~— О f "

Z ".. 0 --] r, ¿ J'w 2 ч 0

E R t: R F R 3 S 3 R £ M r ? R P s p Г P S R R S R 3 "

О J)

¿50 260 270

T p 3 R Fi R p. " о V G î: Г h p 3 I 3 R 3 R R 3 R T P S R

S V J) i Л

sao 2 90 200

f¡ s T ? S R R 3 Г! T P S H П 3 s T P S p R S R T p 3 H Г' _

"Г - л J? 1 ■ Л i J)

3 1 0 320 330

R T p R R R R 3 R c. V V R R R S F 3 ï S F* V R L R Г.' s R ':

i - в С i

Э-'.О 350 360

Р L R R R. - 3 R 3 F T H R i> p R С 3 E T- 3 R S F К R L T D

С i С V Z>

370 260 390

L D К Л Q r_ E T ; t. :i A A к A С A ï. A G V P L F' P l

А СО А10 Ара

KP А р Р Р X I Е Е К V Л К Î: 3 С Л Т I Е Р: I. Т Е К С К О

Vi О V',0 л г, О

IAOSKKDDDV i ¥ n к р h V 3 d е еевврр f y п ii

'¡fiO Л 7 0 /,80

PFKLSBPKPI FF К h N I A Л Л К Р ï Р Р к П О У Т L

Т К Е F

а

Рис. 4. Аминокислотная последовательность son3, выведенная из пуклеотпд-ной последопательпост/î. «Область пептидных повторов» подчеркнута. Аминокислотная последовательность приведена в однобуквенпом коде: А—алашш, С —цистеин, Д — аспарагиновая кислота, Е—глутамнповая кислота, F — фенплалакгга, G — глицин, I—гаолейцгш, H—гистнднн, К — лизин, L — ленцин, M — метиошш, N — аспарапш, Р — пролнн, Q — глутамшг, R — аргинин, S — серии, Y — валин, Т — треонин, Y—тирозин, \у — триптофан.

ставлен тандемно еще дважды, правда, в днвергированной форме (от 195 по 220 амнпокнелоту). Этот повтор обозначен на рис. 4 буквой D. Кроме того, повтору D предшествует 2 тандемно расположенные родственные последовательности

169 ïhrN xArg4 ^rg-Arg • - 101

Arg-Ser-Arg-Ber Ser-Arg- Arg-Arg-Ser

182 Se/ ЬУ^ 193

(на рис. 4 повтор Е).

Таким образом, «область пептидных повторов» содержит в своем составе 5 типов повторенных последовательностей (А—Е). Эти последовательности разных типов в значительной мере гомологичны друг другу. Частично это сходство является отражением «повторного» характера структуры ДНК, кодирующей область пептидных повторов (рис. 5).

Участок son3 имеет гомологию с генами mos и туе. При компьютерном сравнении транслированной с son3 аминокислотной последовательности с банком аминокислотных последова-

эопз

400

-300

200

100

/ •

/ v>* •

■ ifi-* ■

'jy

шт-

Ж '//У У^ у

' У

У

100

200

300

400

вопз

тсльпостей была обнаружена гомология С-коицевоц части son3 с протоонкобелком mos человека (рис. 6а). Гомология составляла 30% на участке длиной 60 аминокислот и частично захватывала' консервативный домен белка mos. Кроме того, была обнаружена гомология son3 с ДНК-связывающими белками — как структурными (галлии, некоторые' протамины). так и регуля-торными ядерными белками, кодированными генами туе мыши,, человека и курицы. Интересно, что son3 гомологичен наиболее консервативной области онкобелков семейства туе (~34% на протяжении более чем 90 аминокислот). Кроме того, эта гомология носит мозаичный характер: N-концевая часть son3 гомологична С-концевой части онкобелков семейства туе; область пептидных повторов наиболее гомологична (— 55%) галлину-бел-ку, ответственному за сверхкомиактнзашио ДНК в ядрах спер:

S0N3 361 LDKAQLLCT АРАЗААЛАМСАР'GVPI Г РЗРРл Г г- FT Т V.» XKSGG S г: :: S J ä е J / й- "t Я -

С-MOS "55 L G 3 С L 3 Y 3 L Г V V 3 L L L F L Р 3 3 31V; i L Р , .L3P А 3 3 L3 33 33 7C3I33 л GOri3 ATISEL .TEXCr.q <<Zd

;; ü -:s к

с-;;оз gcssplepllcfq 2:3 золз 4 llspkes . scoEb;tr]p?pp;-;F.;'L' . ЗЗЗРЗ . ippЗЗЗРЗAPP V .... p

■■ " ü:f ü -k ~ г; ч s. :■ s

С-МУС 33 4 L L S S T P 3 А P 0 G 3 P E P L У Г H G С T 3 Р T Г 3 3 0.3 ЗгЗЗЗРЗР2Р;;333;P p P

30X3 PLL?KDP;3PLTSLRAGIEGPLAA5DVG;?DFSAAGP773 3:3-3"A5P3':Grp;<P v7 й s й i s * г s *

С-НУС QfiPGKRSE . SG3P3 AGGHSK PPPP3 PL 7L KR . . . . 3n73TPC3P Y:> А PP "Pkij ,< i у S0H3 33 7 PSn3VGP-SPSF3ISPSaPSRTF3RRSPrP3PPS3TPSPP3PTP3P33P

ä SS ää ;;« s * SS *«Ü ss ;; <з«55

3 ALP III 2 P Y P S R G ,3 S P 3 R P T R P 3 P p 3 P p 3 3 P PP S F я 3 3 3 3 3 . . . 3 3 P p 3GP 3 :3i T p3 n P3f.TP3P R RК3л PM ;s;г;; »f

GALLIK GCSRRfiRYGSPRPPFR (,(,

Рис. 6. Гомология аминокислотной последовательности son3 с: а) белком mos человека; б) белком с-щус человека; в) Таллином петуха.

матозоидов петуха (рис. бв); к С-коицевой части области пептидных повторов примыкает участок, гомологичный N-концевой части онкобелков семейства туе; на С-копце аминокислотной последовательности son-З расположен участок, гомологичный онкобелку mos. Таким образом, аминокислотную последовательность son3 можно условно разделить на 3 дом'ена, где структурный домен, гомологичный галлиау, фланкируется доменами, гомологичными онкобелкам туе и mos.

В настоящее время известно несколько белков, имеющих в-своем составе повторенные на аминокислотном уровне последо-. вательпости; например, сложная структура пре-про-белка_ фактора Виллебрандта (Bonthron et ab, 1986), про.тооикобелок myb, в составе которого обнаружена область трех тандемпо рас-: положенных несовершенных повторов (Rosson, Reddy. 1986). Полученные нами результаты позволяют предположить, что son3 является частью гена, кодирующего новый ДНК-связываю-

щин белок с необычной «повторной» структурой, в составе которого, помимо домена, гомологичного структурным белкам, имеется домен, гомологичный регуляториым протоонхобелкам семейства туе.

Эволюционная консервативность генов mos, mos-родст-венных локусов son, ORAgp5 и К51. Для понимания эволюцпои-ио-времениого аспекта возникновения семейства mos-родствсн-ных локусов в геноме высших эукариот, структурной взаимосвязи локуса son с другими представителями этого семейства генов, их возможной функции был предпринят поиск mos-род-ствспных генов в геномах различных классов позвоночных, в основном млекопитающих и птиц.

Свежезамороженный трупный материал, представленный московским зоопарком, измельчали и растирали в жидком азоте; клетки лнзировали додецилсульфатом Na и далее проводили феиольную депротешшзацшо. Тотальную клеточную ДНК гпдро-лизовали рестрнктазами EcoRI или Hindlll и подвергали электрофорезу в 0,8—1 % агарозиом геле. Затем материал переносили на шггроцеллюлозпын фильтр. Гибридизацию и отмывку фильтров проводили в «строгих» условиях (И. Чумаков и др., 1985), что исключало перекрестную гибридизацию различных nios-родственных локусов. Клонированные в бактериофагах серии М13 mp геи mos и его 5'- и 3'- концевые части, а также

1 >' "J :V

"ЯЛ

v. - . • • и.-:, Я.

- „ ■ ■■ t

-

б..: Х'.-ъ ■' s ■ to - Л 1 ?2 ч И

— КЛ _ иь — Г <с £ * 1 . m ir

.. .. ' «4

-КД --is.

- г<>

Рис. 7. Блот-глбридизацпя пробы 32Р тр-у-тоэ с оСразцпми ДНК моржа (!) кролика (2), крота (3), бородавочника (4), лошади Пржевальского (5), тупайи (6), человека (7), тигра (8), крысы (9), мыши (10), агути (11), сирийского хомяка (12), фазаил (13), еулташш (М), обработанных ЕсоГи-В качестве молекулярных маркеров размеров гибридизующияся фрагментов использовали ДНК бактериофага расщепленную Нт(Ш1 (для образ-• цов 1—5, 13, 11) к ДНК бактериофага X Хароп 27, расщепленную

ВёИП (6-12).

участки локусов К51 и ORAgpS использовали п качестве моле- кулярных проб. з:!Р меченные радиоактивные пробы получали с использованием универсально]! затравки и большого фрагмента ДНК-полимеразы I из Е. coli. Удельная активность меченой пробы составляла 5-108 — МО9 нмп/мпп/мкг. В качестве son-пробы использовали клонированный -в плазмпде pGEM3 зопЗ-фрагмент, меченный в реакции пшс-трансляцнп.

Для обнаружения последовательностей, гомологичных гену mos в геноме различных видов животных, ДНК расщепляли рестриктазой EcoRI.

Показано, что у представителен большинства видов животных п птиц с полной v-mos-пробой гнбридпзуется одни фрагмент ДНК, что, скорее всего, говорит о присутствии одного основного mos-локуса в гаплоидном геноме этих видов животных (рис. 7). Это согласуется с известными данными о единственном основном локусе mos у человека, мыши и крысы. В ДНК представителей отрядов парнокопытных и непарнокопытных обнаружено но два гпбрндизугощпхея EcoRI-фрагмента. Это может быть либо следствием присутствия участка узнавания для EcoRI внутри кодирующей части гена, либо свидетельством того, что в геноме копытных животных присутствует по два основных mos-локуса. Чтобы решить эту альтернативу, была проведена молекулярная гибридизация 5'- и З'-субгенных v-mos-проб с ДНК. представителей этих отрядов, гндро-Лнзованных рестрпктазами EcoRI и HindIII. Оказалось, что в обоих случаях эти грибы гнбрндпзуются с одними и теми же фрагментами, причем подвижность гпбрндизугощпхея в этом опыте EcoRI-фрагментов совпадала с подвижностью фрагментов,- гпбридизующпхея с целой v-mos-npo6oii.

Кроме того, гибридизация этой пробы с образцами ДНК быка от 5-ти животных обнаруживает во всех случаях 2 EcoRI-фрагмента размером 1,5 т.и.н. п 1,9 т.п.п., что по-видимому, исключает возможность существования в популяциях некоторых копытных дополнительного аллелыюго варианта гена mos и свидетельствует в пользу того, что в геномах представителей двух отрядов копытных имеется 2 основных гена mos. Можно предположить, что это явилось следствием дупликации гена mos в половых клетках общего предка копытных.

Таким образом, подтверждена эволюционная консервативность гена mos в геноме некоторых классов позвоночных.

Гибридизация "2P-pGson3-;ipo6bi с ДНК представителей различных классов позвоночных также обнаружила эволюционную консервативность этого локуса. Гпбрндизующнеся фрагменты обнаруживаются в образцах ДНК различных представи-

Рис. 8. Блот-гибрпдизация пробы 32Р mp К51/12, содержащей уникальны» фрагмент локуса К51 с образцами' ДНК тигра (1), моржа (2), лошади Пржевальского (3), кролика (4), неловека (5), китайского хомяка (G), султанки (7), фазана (8), обработанных EcoRI-.

телей класса млекопитающих, а также в геноме крокодила и лягушки (рис. 3), что свидетельствует об эволюционной древности локуса.

При гибридизации пробы, содержащей фрагмент локуса К51 с ДНК различных отрядов млекопитающих, расщепленной реет -риктазой EcoRI, в геноме представителен всех исследованных отрядов обнаруживаются нуклеотндные последовательности, гомологичные локусу К51 крысы (рис. 8). Подвижность парализующихся фрагментов в этом случае отличается от подвижности фрагментов, гибрндизующихся с son-пробой. Этот факт может свидетельствовать о том, что локус son не является у человека полным аналогом локуса К51 крысы, а содержит участки, гомологичные последовательностям, представленным в локусе К51. Локус son является новым эволюционно-консер-вативным локусом, присутствующим в геноме всех изученных позвоночных.

При изучении первичной структуры ORAgpS локуса оказалось (Забаровский и др., 1984), что участок mos-гомологич-ной последовательности, входящей в его состав, прерывается двойной вставкой повторов Alu-тппа и, кроме того, в этом случае не удавалось обнаружить протяженной открытой рамки считывания. Это позволило предположить, что в состав ORAgpS локуса входят последовательности, представляющие собой псев-догеи môs. Кроме того, анализ первичной структуры этого участка свидетельствовал, что он возник ~ 65 млн. лет назад (Забаровский и др; 1985). Для подтверждения этих расчетных данных была проведена гибридизация mos-гомологичной пробы из ORAgp5 с ДНК различных отрядов млекопитающих и птиц, расщепленной EcoRI (рис. 9). Оказалось,, что кроме гнбридизу-ющегося фрагмента размером 8,5 т.п.н. в ДНК человека локус

ÖRAgp5 представлен только, в геноме мышн Ec.oRI-фраг-мситом размером 10,5 т.п.и. Полученные данные,по гибридиза-цнИ согласуются с расчетными данными о времени появлении ORAgp5 и свидетельствуют, что дупликация гена mos, приведшая к появлению этого псевдогена, произошла в пеоиод дивергенции общего предка приматов и грызунов от древних насекомоядных.

Помимо псевдогена mos в составе локуса ORAgpS имеются другие участки гомологии с онкогеном mos, которые входят в состав EcoRI-фрагмента размером 6 т. п. п. Гибридизация mos-

Рис. 9. Б.ют-гибриднзация 32Р шр 588U5-npo6u, содержащей уникальный фрагмент локуса ORAgp5, с EcoRI-фрагментамп тотальной ДНК человека (1), тунайн (2), моржа (3), бородавчика (4), мышн (5), султанки, (в),

фазана (7).

гомологичной пробы из этого фрагмента с образцами ДНК приматов, относящихся к трем различным семействам, показывает, что во всех исследованных случаях подвижность EcoRI-гибридизующпхея фрагментов совпадает, И хотя ранее не удалось обнаружить транскрипции ORAgpS, консервативность двух EcoRI-учаетков позволяет йредположнть существование гипотетической функции у последовательностей, входящих . »„состав этого участка локуса ORAgp5. - \ ■ Хромосомная локализация ttws-родственных локусов человека, Важной характеристикой генов является их хромосом-

? з 4 5 С ?

пая локализация, Определение хромосомной локализации онкоген-родственных последовательностей, в частности, позволяет предсказать возможное участие этих последовательностей в процессах ракового перерождения клеток. Кроме того, определение хромосомной локализации генов даст сведения об их структурно-функциональных взаимоотношениях.

Ранее (Забаровский и др., 1985) была высказана гипотеза о возможном участии ретровирусов в процессе образования семейства mos-гомологпчных, последовательностей. Эта гипотеза, основанная на обнаруженной тесной ассоциации mos-гомологнчных и ретровирусоподобиых последовательностей в геноме человека, мыши и крысы, предполагает иптергацшо про-ретровируса вблизи геи.а mos, его захват при выщеплении, образование копии к ДНК с последующей реинтеграцией в геном хозяина (Забаровский и др., 1985). Альтернативной гипотезой возникновения семейства mos-родственных. локусов могла быть тандемпая .дупликация основного гена mos. Следствием этих событий могло являться с одной стороны, хромосомная ие-сцснлсппость mos-родственных последовательностей, а с другой — их кластерная локализация в участке одной хромосомы (в случае тапдемной дупликации).

Для определения хромосомной сценленности mos-родст-венных локусов у человека использовали соматические гибриды клеток хомяка и человека, в которых происходит неспецифическая сегрегация человеческих хромосом. Была получена панель из 24 гибридных клонов нз линии фибробластов китайского хомяка \Vobre5, дефектных по гену гуанпнгнпоксантинфосфорн-бознлтраисферазы и устойчивой к убанну (ГГФРТ— oub+) и диплоидных фибробластов легкого эмбриона человека линии 4. Родительские клетки .растили на среде Игла с 10% телячьей сывороткой и по 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина; гибридные клоны отбирали на той же среде с добавлением селективных компонентов НАТ-спстемы (100 мм гипоксантнна, 0,4 мм ампноптерина, .16 мм тимндпна н.1 мм, убаина). Слияние клеток проводили в монослое на чашках Петри (10 см в диаметре) по методу Дэвидсона с применением 50% полиэтилен-гликоля 6000. Через 48 час. после слияния клетки высевали на селективную среду. Клонирование осуществляли в 96-лупочных планшетах. Каждый клон наращивали до 10s клеток; ДНК из клонов выделена методом фенольной депротеинпзацпн, гидро-лизована рестриктазой EcoRI.

При гибридизации с меченной 32Р уникальной пробой mpCL-3 (участок ORAgp5 локуса, субклонированнын в бактериофаге AU3 mplO EcoRI—BamMI) лишь в образцах ДНК клоно(

К15 и М9 был обнаружен гнбрпднзующипся фрагмент размером 6 т.п.п. (рис. Юв), что соответствует полученным ранее результатам для ДНК плаценты человека (Чумаков и др., 1985). При данных условиях гибридизации и отмывки нитроцеллюлозпых фильтров (5 х SSC, 67°С, 18—20 ч,—гибридизация; O.lxSS.C, 65° С, 50 Mifn—отмывка) ДНК, выделенная из клеток китайского хомяка, не гибридизовалась с этой пробой. Аналогичные результаты были получены при использовании в качестве пробы уникального участка из EcoRI-фрагмента размером 8,5 т. п.~ н. локуса ORAgp5. Для анализа сегрегации гена mos и локуса К51 у человека ДНК тех же гибридных клонов Ki, К4, К15, M9 и КХ гибрпднзовалп с меченной 32Р v-mos пробой и уникальным участком локуса К51. На рис. 10а показано, что в образцах ДНК всех гибридных клонов при молекулярной гибридизации с, 32Р v-mos обнаруживается EcoRI-фрагмент размером «11' т.п.и., который соответствует гену mos хомяка. В. образцах ДНК клонов К1, К4, М9 и КХ найден v-mos фрагмент размером 2,8 т.п.и., который в свою очередь соответствует гену mos человека. При гибридизации пробы, содержащей уникальный фрагмент локуса К51 с образцами ДНК этих же гибридных клонов, лишь в ДНК клона К4, помимо К51 -гомологичного гибридизующегося фрагмента хомяка размером 5,9 т.п.п. присутствует К51-гомо-логнчиый гибриднзующийся фрагмент человека размером 7,8 т.п.и. (рис. 106). Таким образом, результаты свидетельствуют о хромосомной несценленпоетп гена mos, который расположен на 8-й хромосоме человека (Aaronson, 1982), лок\'сов ORAgpS и К51.

Хромосомная песцеплснность гена mos, локусов ORAgpS и К51 служит косвенным подтверждением предположения об участии ретровирусов в образовании семейства mos-родственных последовательностей.

Для определения точной хромосомной локализации локуса son человека использовали охарактеризованную панель гибридных клонов между клетками человека и мыши (ДНК гибридных клонов получена от К. Шнрингера, Свободный Университет Брюсселя, Бельгия).

При гибридизации образцов ДНК этих клонов с 3-Р son3-пробоп обнаружилось, что помимо двух вопЗ-гомологиЧных EcoRI-фрагментов мыши, присутствующих во всех клопах, в ДНК нескольких клопов обнаруживаются гнбрнднзующнеся EcoRl-фрагменты, характерные для ДНК человека. Анализ хромосомного состава всех гибридных клонов позволяет сделать вывод, что локус son расположен па 21-й хромосоме человека (табл. 1 ). Интересно, что для многих опухолей и лейкозов че-

ловека огмечепы транслокации¡различных \чисткой этой хромосомы, что в принцип« может привести к изменению характера экспрессии этого гена. ;

A'X W № КН Ш W АН A>t W hl № № ¿V

ШШЙШШШШШ ШШШШШ-. Л

АН w КХ Ш$№№ Kf

Рис. 10. Определение хромосомной сцепленности . гена 'niOS; и локуеон ÜRAgpa и К51 у человека. Гибридизация образцов ДНК гибридных клонов, обработанных EcoRl с Р mp-V-moS-npo6oi1 (а), с 32Р 'тр К51/12-пробоГ' (б) н с 32Р inpCL-3-пробой (б), содержащей уникальный фрагмент локуса ORAgpS. Л4—образец ДНК, выделенной из диплоидных фнбробластов человка; \\' — образец ДНК, выделенной из клеточной линии фнбробластов китайского хомяка. ' .

Гибриды Хромосомы человека

ооа<+> I 2 3 4 о 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 IG 17 10 19 20 21 22 л

HAII — - - + + + - + — — - - - - + _ - + + — -

HAI3 30л(+) + - — + + + - + — - + - _ - - -1- + - т + + - ■+

НВЗЗ зоп(+> - - (+)(+) - + - + - - + - ч- - - - - г -ь -

НВ34 00П<-> / л - - (+) - -) - - - + - - + - - + + - - - + . -

1Ш43 + + + + - + + + - - + + - + + + + + + + + + +

HBIII Son<+> + - - - - (+) - - - + - - j. - - - + — -

HBI12 яоп(+) - - + (-) - (-) - - + + - + - - + - - - + — -

HBI42 ЗОП^ - - - (+) - - - - - - - - - + - - - - - -

HBI8I аоп<+>. + I - - + + + - - + + + + + - + + + + + + -

HBI82 воп(+) • ' — - + + + + -1- + - - + + + + + - н- + + + + -

НВ24 аоп(+) .,+ + _ + + + + + -1- -1- -I- + + + + + 1-

НВ249 зоп<*> . + — _ + _ + + + _ _ + — + + + + + —

Таблица 1. Хромосомным состав гибридных клонов, использованный для определения хромосомной локализации son3- Знак -f означает, что данная хромосома представлена в 60% метафазных пластинок данного клона; знак ( + ) — в 30—60% метафазных пластинок; знак (—) — в 0—30% метофазиих пластинок;* знак — означает что данную хромосому нельзя обнаружить ни в одной из исследованных метафазных пластнпок; SOn+ — в образце ДНК гибридного клона обнаруживается характерный EcoR.I'ФРагЛ1СЕ1Т> гибридизую-щийся с son-пробои. ;;

Анализ транскрипции локуса son в тканях человека и крысы.

Эволюционная консервативность, а также недавно обнаруженная слабая транскрипция гена mos в репродуктивных органах (Propst, 1985) свидетельствуют о возможном участии продукта этого гена в процессах раннего эмбриогенеза, либо в процессах созревания половых клеток. Присутствие локусов son и К51 в геномах всех исследованных видов нозвочных также может свидетельствовать о важности кодируемых ими .функции. С целыо изучения функциональной активности локуса son был проведен анализ транскрипции в некоторых тканях человека. Тотальную РНК из замороженных в жидком азоте тканей выделяли депротеиннзацней горячим фенолом. Выделение фракции поли-(А)+ РНК осуществляли хроматографией на колонке с олиго (dT) — целлюлозой. После электрофореза в 1% денатурирующем (с формальдегидом) агарозпом геле проводили перенос на пптроцеллюлозные фильтры. Предгибрндиза-цию, гибридизацию и отмывку фильтров проводили в «строгих» условиях.

Показано, что локус son транскрибируется в виде единственного высокомолекулярного транскрппта размером не менее 8,5 т.н. (рис. II). Такой транскрипт обнаруживается в плаценте, печени и в других тканях человека. Размер транскрппта, так же как и данные по первичной структуре свидетельствуют о том, что son3 является частью транскрибируемой с локуса son-последователыюсти.

i Z ъ Ь

Рис. II. Гибридизация 32Р 5011^ пробы с образцами тотальной РНК, выделенной из плаценты (4), эмбриональной печени (2), эмбриональных ночек (3), легких эмбриона (I) человека.

WS:

Таким образом, и эволюционный консерватизм локусов К.51 и их транскрипционная активность в различных тканях человека и крысы свидетельствуют о том, что продукты этих локусов являются важным функциональным звеном в цепях клеточного метаболизма.

ВЫВОДЫ

1. Из библиотеки кДНК эмбриона человека выделен клон son3 и определена его нуклеотндная последовательность. Участки аминокислотной последовательности son3, выведенной из первичной структуры ДНК, имеют гомологию с протоонкобелком mos человека, а также с ДНК-связывающимп ядерными белками как структурными (галлин), так и регуляторными (прото-онкобелки семейства туе). В центральной части son3 имеется область тандемно расположенных пептидных (от 7 до 19 аминокислот) повторов.

2. Показана эволюционная консервативность гена mos; локус son и ранее описанный локус K5I присутствуют в геноме всех исследованных видов животных, а локус ORAgp5 — только в геномах-приматов и грызунов.

3. При помощи соматических гибридов между клетками хомяка и человека показана хромосомная несцепленность гена mos и двух mos-родственных локусов К.51 и ORAgp5 у человека.

4. Установлено, что локус son у человека расположен на 21-й хромосоме.

5. Обнаружена транскрипционная активность локуса son в различных тканях человека и локуса К51 в эмбрионе крысы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ф. Б. Б е р д и ч е в с к и й, И. М. Чумаков. Хромосомная несцепленность двух генов семейства mos v человека. 1984. Докл. АН СССР, т. 279, № 3, с. 748—750.

2. Ф. Б. Б е р д и ч е в с к и й, I I. М. Г а р а н и и а, Ю. П. Швец, И, И. С у с т е р о в и ч, И. М. Ч у м а к о в, Л. Л. Киселев. Эволюционные варианты гена mos. 1986. Мол. биол., т. 20, № 2, с. 536—545.

3. Ф. Б. Б е р д и ч е в с к и й, И. М. Ч у м а к о в, Л. Л. К нс е л е в. Расшифровка первичной последовательности участка son3 генома человека: идентификация нового белка, имеюще-

го, необычную структуру. 1988. Мол. биол., т. 22, № 3, с. У34.

4. Ф. Б. Б е р д и ч е в с к и й, И. M Чумаков. Транскрип- ционно-активный локус генома человека из семейства генов

mos, 1988, Генетика, т. 24, № 2, с. $66-$63

5. I. M. Chumakov, F. В. Berdichevsky, Yu. P. Shvets, D. G. Demirov, L. L. Kisselev, Detection and the structure of several cellular genes related to mos oncogene. XVII Meeting of the European Tumor virus group. Dresden, 1987. Abstracts, p. 9.

Сдано в набор 21.04.88. Подписано к печати 26.04.88. Т—03053. Заказ 2075. Тираж 150._

Типография издательства Сенеро-Осетннского обкома КПСС. г. Орджоникидзе, ул. Тбилисская 98.