Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфогенез и формирование фотосинтетического аппарата в каллусной культуре картофеля

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Морфогенез и формирование фотосинтетического аппарата в каллусной культуре картофеля"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕЛШЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РАСТЕНИЕВОДСТВА имени Н. И. ВАВИЛОВА

~РГ6 од

На правах рукописи

КАЗАКОВА Елена Альбертовна

УДК 581.132+581.143.6

МОРФОГЕНЕЗ И ФОР;\ШРОВАНИЕ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА В КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЕ КАРТОФЕЛЯ

Специальность: 03.00.12 — Физиология растений 03.00.23 — Биотехнология

АВТОР ЕФ ЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1993

Работа выполнена в лабораториях физиологии растений и биотехнологии Всесоюзного научно-исследовательского института растениеводства имени Н. И. Вавилова в 1987—1992 г.

Научный. руководитель — доктор биологических наук, профессор О. Д. Быков.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук С. С. Медведев; кандидат биологических наук В. Е. Васильева.

Ведущее учреждение — Санкт-Петербургский государственный аграрный университет (г. Пушкин).

Защита диссертации состоится «¿^» ¿ХГ/г/Х^&Л* 1Э93 г. в

А часов па заседании Специализированного совета Д 020.18.02 по присуждению ученой степени доктора биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте имени Н. И: Вавилова по адресу: 190000," Санкт-Петербург, ул. Герцена, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н. И. Вавилова.

Автореферат разослан « ёеШпЛгС^?^ 19дз г_

Ученый секретарь Специализированного совета,' доктор биологических наук

Э. А. Гончарова

ОБЩАЯ. ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы! Знание основных закономерностей Функционирования Фотосинтезирумцих растительных тканей в условиях in vitro позволит более эффективно использовать клеточные культуры в биотехнологическом производстве, сделать более экономичным ■ процесс культивирования. В теоретическом отношении представляет значительный: интерес связь морфогенеза с особенностями Формирования фотосинтетического аппарата в каллусной культуре, роль света как мор-Фогенетического Фактора. Поэтому изучение становления Фотосинтетической активности культивируемых in vitro тканей представляет интерес и для физиологии растении и для биотехнологии. Недостаточно изучено в какой мере эффективность регенерации связана с процессами Фотосинтеза.

Цели- и задачи работы; Целью настоящей работы был поиск связей морФогенетических процессов в каллусной культуре картофеля с особенностями Формирования Фотосинтетического аппарата и типом питания культивируемых in vitro тканей (авто-, миксо- или гетеротрофным). Для' её решения были поставлены следующие задачи:

1) изучить динамику изменения ростовых показателей, концентрации пигментов и поглощения углекислого газа тканями эксплантов, каллуса и растений-регенерантов картофеля в процессах каллдусогенеза и Формирования побегов;

2) исследовать влияние Факторов среда (концентрации сахарозы и 6-бензиламинопурина) и условия культивирования (темнота-свет) на ростовые показатели, концентрацию пигментов и поглощение 14С02;

3) изучить каллусогенную и регенерационную способность, 'потенциальную интенсивность Фотосинтеза и концентрацию пигментов у разных сортов картофеля, культивируемых in vitro.

Научная новизна: Впервые проведено систематическое изучение накопления пигментов и динамики Фотосинтетических показателей в процессе кэллусогенеза, дифференциации каллуса и Формирования побегов. Установлена зависимость между Фотосинтезом и Эффективностью регенерации в культуре стеблевого каллуса картофеля. На основании корреляционного анализа показано, что начало повышения концентрации хлороФИллов в тканях каллуса сопряжено с Формированием побегов. Показана зависимость накопления пигментов и поглощения С02 от освещенности и концентрации сахарозы в среде. Установлено, что 2% концентрация сахарозы в питательной среде (по сравнению с 0,5£) стимулирует накопление пигментов, светозависимую ассимиляцию С02 и

... 4

побегообразование. Показано, что характер накопления биомассы мик-сотроФнов'культурой и условия, способствующие наибольшему образованию регенерангов (концентрация 6-бензиламинопурина и сахарозы в среде), сортоспецифичны.

Практическая значимость: Полученные результаты могут служить основой для оценки типа питания (авто-, миксо- или гетеротрофного) регенерантов и каллусных тканей. Проведенные эксперименты позволяют оптимизировать условия выращивания пробирочных растения. Определены концентрации 6-бензиламинопурина (БАП), способствующие мак- • симальному образованию побегов у сортов с разной регенерационнои способностью. Установлены оптимальные, Физиологически обоснованные сроки высадки в почву растенш-регенерантов. Выделившиеся сорта с высокой регенерационнои способностью ,(Янтарный, Herald, Заравшан, Amalia, Детскосельскш, Истринскии) можно рекомендовать для селек-ционно-генетаческих исследований. Использованный нами комплекс методов для оптимизации условий культивирования in vitro может быть рекомендован для других растительных объектов.

Апробация работы: Материалы диссертации были доложены на международной конференции "фотосинтез и Фотобиотехнология" (Пушкно-на-Оке, 1991), заседании Физиологической секции Всесоюзного Ботанического Общества (Санкт-Петербург, 1992), in молодшноя конференции ботаников г.Ленинграда (Ленинград, 1090), на конференциях аспирантов и молодах научных сотрудников ВНИИ? им,Н.И.Вавилова (Ленинград, Санкт-Петербург, 1989, 199D, 1992, 1993) и научных семинарах лаборатория физиологии и биотехнологии ВНИИР.

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, 2 в печати.

Структура и объ^м диссертации: Диссертационная работа построена по традиционному плану и включает: введение} обзор литературы! методическую часть; экспериментальную часть, в которой приведены результаты исследования, заключение и выводы.• Диссертация изложена-на JG8 страницах машинописного текста и иллюстриройана 17 рисунками, таблицами и ¿-^"фотографиями. Список литературы включает наименования, из на иностранных языках.

Список сокращении: БАП - 6-бензиламинопурин¡ НУК - а-нафткл,-уксусная кислота! PC - регенерационная способность! ССК - светосо-биррющщ комплекс, хлф - хлорофилл; кар - каротроиды.

ОБЪЕКТЫ И. МЕТОЛУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования являлись 18 образцов картофеля из коллекции ВИР: 1) отечественные сорта - Белорусский ранний, ВИР-1, Гатчинский, Детскосельскш, Добро, Заравшан, Истринский, Невский, Пригожий 2, Янтарный! 2) сорта зарубежной селекции - Adretta, Amalia, Apta,. Ceres, Early Rose, Herald, Superior И ГИбрВД N2 (Fj Solanum albicans x Granda). Исходные ОбрЭЗЦЫ ЭСОПТИЧОСКИХ ПрОбирОЧных растения, полученные из апикальных меристем, были любезно предоставлены Э.В.Трускиповым и Л.И.Алексеевой, за что приносим им искреннюю благодарность.1 Клональное микроразмножение исходных образцов проводили-по методике Г.Н.Винклер и Р.Г.Бутенко <1970).. В качестве эксплантов использовали междоузлия пробирочных растений картофеля, так как их морФогенетический потенциал оказался наибольшим (Суриков, Цилосани, 1980). Междоузлия длиной 5-7 мм горизонтально помещали на . агаризованную питательную среду Дкаррета (jarret et ai., 1980), содержащую макро- и микроэлементы, витамины И мезоинозит ПО прописи Мурасите И Скуга (Murashige, Skoog, 1962), а также 3 мг/л БАП,0,03 мг/л а-наФтилуксуснои кислоты (КУК), и 0,5 мг/л гиббереллйна, В отдельных опытах варьировали концентрацию БАЛ и сахарозы. Культуры выращивали в Фитотроне при 16-часовом Фотопериоде, освещенности 5-8 клк от ламп типа ДРЛ и температуре 21 (днем) и 16 (ночью) градусов.

Оценку межсортовой изменчивости rio регенерационной способности (PC) в каллуснои культуре проводили по методике Л.И.Алексеевой (1990).

Концентрацию хлороФиллов и каротшюидов определяли в ацетоновой вытяжке на спектрофотометре uitrospek и при длинах волн 662 и 844 и 470 нм (Шлык, 1971). Расчет содержания пигментов вели ра сырую и сухую массу по Формулам Лжстенталера (1984). Затем рассчитывали отношения Хлфй/Хлфь и П^ф/Г^р- Хлорофилл светосоиирающего комплекса (ССК) рассчитывали по Формуле Хда ССК =Хлфь-1,2 + Хлфь, предложенной Kura-Hotta et.al. (1987).

Интенсивность Фотосинтеза измеряли радиометрическим методом (Быков, 1990). Образцы помещали в ассимиляционную камеру с принудительным перемешиванием воздуха объемом 20 дм3 при температуре 27°С, освещенности на уровне растений 25 клк и относительной влажности воздуха 60%. Концентрацию С02 в камере определяли.с помощью инфракрасного газоанализатора. После адаптации растительных обмк-тов к новым условиям в камеру вводили меченую углекислоту с общей активностью 200 мкКи. Экспозиция с 14С0„ составляла 60 мин. Пробы

Фиксировали и высушивали в сушильном шкэфу при температуре 95°С в течение суток. Для определения активности из образцов готовили препараты со слоем полного поглощения /э-лучея. Радиоактивность препаратов измеряли с помощью торцового, счетчика. Таким образом с точностью до постоянного коэффициента определялась удельная активность (имп/мин-мг), которая пропорциональна интенсивности Фотосинтеза в расчете на единицу массы (Быков, Кошкин, 1069а; 19696).

С02-газообмен и световые кривые Фотосинтеза растений определяли на установке, в которой воздух продували через пробирку с интактным регенерирующим каллусом. Освещенность в опытах задавали на трех уровнях - 10, 20 и 30 клк. Воздух с ИС02 в пробирку поступал из резервуара объемом 20 л с исходной активностью 1 мКи и естественной концентрацией <0,СШ). Время экспозиции 20 и 40 с.

Для определения величины углекислотного компенсационного пункта, скорости видимого и потенциального Фотосинтеза растения-регенеранты раскладывали в один слой в двустворчатой рамке с тер-мостатирущим устройством и помещали в ассимиляционную камеру в которой поддерживалась температура 22°С. Концентрацию С02 измеряли инфракрасным газоанализатором uras 2т в открытой системе. Освещенность в опыте 130 вт-м"2 (30 клк).

Все эксперименты проводили в трехкратной биологической пов-торности. Статистическую обработку осуществляли по общепринятой методике, используя оценку средних, корреляционный, регрессионный и дисгорсиошЛш анализы (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

JL. Характеристика морфогенеза в каллусе картофеля in vitro

Изученные сорта картофеля различались по интенсивности каллу-согенеза, цвету и консистенции каллуса, срокам начала . регенерации и числу побегов (табл.1). При этом, в зависимости от сорта, происходило образование каллуса разных типов: как например, плотного глобулярного ярко-зеленого у сорта Янтарный, рыхлого зернистого спотло-золоного у сортов Белорусский раннии, Пригожи 2, Добро, Em-iy козе, рыхлого буроватого у сорта Гатчинский и светло-желтого водянистого у гибрида иг.

у Сорта с плотным глобулярным каллусом чаще регенерировали. Тот фукт, что но всо каллусы данного сорта переходят к морфогенезу, шрэлгно, свидетельствует о данетрантности признака "регенерацион-н:ы способность" (PC) (Фадеева и-др., 1976,'ЮТ). Основным пока-

Табл.1. Увеличение концентрации хлорофилла и показатели регенерационной способности в каллусноя культуре картофеля разных сортов

Сорт

Число изученных экс-плантов,

Начало повышения ■ концентрации хлорофилла, неделя

Начало

появления

первых

растений-

ре генерантов,

неделя

Амплитуда концентрации хлорофилла за период побегообразования, мкг/г сухой массы

Средаее число

регенерантов на эксплант (после 12 недель),

X+m

Высокая ШГйНеращощШ способность

Янтарный 100 3,0 3,3 7Э0 18,6*3,48

Herald 120 3,5 4,5 620 13,2+1,2?

Двтско-

СОЛЬСКИИ 50 6,0 6,3 390 8,3+0,98

Amalla 48 4,0 зео 6,1+0,85

Средняя регенерэционная способность

НИР-1 '45 10,0 10,3 330 5,2+0,98

Apta 44 9,0 9,8 290 3,8+0,53

Сегез 42 7,0 7,6 270 2,3+0,42

Superior 40 9,0 9,5 210 3,1^0,49

Низкая регенерашонная , , способность

Гатчинскии 54 11,0 11,0 180 0,3+0,04

Добро 50 ' 4,0 4,1 130 . 0,4+0,02

Невский 50 4,0 4,3 60 0,5+0,05

зателем, характеризующим PC, по нашему мнению является среднее число регенерантов на 1 эксплант. Если число побегов на зксплант больше 6-ти, то PC условно считали высокой; если в пределах 1-6, то средней; если меньше 1, то низкой (табл.1). Начало регенерации наблюдали на 3,3-11 нед в зависимости от сорта. Выделившиеся в наших -опытах образцы с высокой PC (Янтарный, Herald, Детскосельскии, Amalia и ЗараВШан) могут быть использованы В селекции in vitro.

Дальнейшую работу по изучению Фотосинтеза проводили на 2-х грушах сортов (с высокой и низкой PC).

II, Динамика пигментного состава стеблевого каллуса картофеля В ходе культивирования

Концентрацию пигментов определяли в процессе культивирования в тканях зксплантов, каллуса и растения-регенерантов.

Через неделю культивирования ткани зксплантов разрастаются на концах и концентрация пигментов в них несколько повышается. Затем, на протяжении всего периода культивирования, содержание пигментов в тканях зксплантов колеблется на относительно высоком уровне. Это свидетельствует о том, что в тканях культивируемых междоузлий^ под воздействием условии культивирования, активно идут обменные процессы и биосинтез веществ, необходимых для деления клеток, что способствует пролиферации с последующей дифференциацией клеток.

Б каллусных культурах по сравнению с тканями зксплантов и регенерантов свдермание пигментов невелико. В тканях каллуса сорта Янтарный до 3-й недели культивирования наблюдалось снижение концентрации Еэдф и Хкар на 47% и 12% от первоначальной величины соответственно (рис.1). По-видимому, это объясняется тем, что в этот период наблюдается интенсивный рост массы каллуса на концах зксплантов, а накопление зеленых пигментов происходит в основном в поверхностном освещенном слое. Поэтому концентрация пигментов в расчете на всв массу невелика. ,

На 4-ой неделе культивирования начинается побегообразование. К Б-ои неделе регенерация приобретает массовый характер. Параллельно происходит изменение характера кривых концентрации ¡с^ и Е^р. Их максимумы приходятся на 8 и 6 недели к достигают 156% и 214» от первоначальной концентрации пигментов в каллусных тканях соответственно (рис.1). Таким образом, относительное накопление каротроидов идет быстрее, чей накопление хлорофиллов. Возможно, это объясняется защитной ролью каротиноидов, особенно важной в период становления Фотосинтетическбго аппарата. Амплитуда колебании

2 »

г}1«4«г«|«и ««м «

монцв*-Фшлла,

«оо пев'

«90 >09

» Деоо

. 1...--Н * I К-... / \ \

\ // У^Х

Ч на«и4 .»гЫЛ

л/

'ч Яитарнни

I Т^ | <в « ач «в* л нч ни

Рис.1. Изменение концентрации пигментов в каллусных тканях картофеля сорта Янтарный в процессе культивирования,

начало регенерации

1 - 2 - ОФа!

3 - ХЛФЬ» 4 - Екар

Рис.2. Концентрация хлорофилла в тканях каллуса разных сортов картофеля в зависимости от возраста культуры

| - начало регенерации

I:

к.

»»»» » »4 I I Г» |»М(1|> « || М1Я »<!< 13« К Я 1« »Ц111Ч Л Я1* ХсчцнтРыт

Янтарный ШШ Л»г«инс*1/и ХО£РО

Рис.3. Влияние концентрации БАП на Формироваие метения-регене-рантов из каллуса разных сортов картофеля (Х+ш), где 0; 0,5;....10 - концентрация БАП, мг/л

абсолютных значении концентрации хлфа, хлфь и е^ значительно больше, чем Е^р.

Концентрация пигментов в тканях растений-регенерантов значительно выше, чем в каллусе, е^ особенно возрастает к 10-ой неделе культивирования - от 164 до 389 мкг/г сырой массы, особенно за счет увеличения концентрации "хлф . Это объясняется увеличением листовой поверхности и ростом отношения массы листьев к массе побегов, Пониженная концентрация хлорофиллов и каротиноидов в тканях каллуса по сравнению с регенерантами отмечается у всех сортов для культур разного возраста. Индекс хлф /хлфь у регенерантов ниже, чем у сформированных листьев картофеля, выращенного в почве. Это характерно для ранних этапов морфогенеза, и, возможно, свидетельствует о незавершенности Формирования Фотосинтетического аппарата 10-нодельных регенерантов картофеля, Как известно, низкое содержание хлорофилла ъ связано с плохим развитием светособираюших комплексов, которые недостаточно контактируют друг с другом, что приводит к недоразвитости системы гран.

Ба основании изменения концентраций хлорофилла и каротиноидов можно предположить, что процессы, ведущие к Формированию фотосинтетического аппарата, сходны у растений, выращенных in vitro и in

vivo.

iti, Изменение концентрации хлорофилла а морфогенном кмш-ё картофеля в зависимости si регенерапионнои способности сорта

Абсо^иотные значения концентрации пигментов в каляусных тканях разных сортов картофеля значительно варьируют и не зависят от PC сорта (рис.2). Вместе .с тем, сходен общий ход кривых изменения концентрации хлорофилла в тканях каллуса в зависимости от возраста культуры у всех изученных нами сортов. Причем, первоначально кал-лусоганез сопровождается снижением содержания хлорофилла, а перед появлением регенерантов содержание хлорофилла в тканях каллусд возрастает. Особенно выражен этот ЭФФект у сортов . с высокой PC. Обнаружена существенная прямая корреляция (г=0,66) между началом повышения концентрации хлорофилла и появлением первых побегов (та<5л.1).

Согласно литературным данным морфогенные участки каллуса становятся зелеными (Jarret et ai., 1980 as 1980 6¡ . Цилосани, 1980¡ Зл'ьконин, 1988). В отличие от этих работ нами проведена количественная оценка изменения концентрации хлорофилла в морфогенном каллусе. В результате экспериментов обнаружена существенная положи-

тельная корреляция (г=0,92) между увеличением концентрации хлорофилла в период побегообразования (разность мевду максимальным и минимальным значениями концентрации) и средним числом регенерантов в расчете на 1 зксплант (табл.1). Другими словами, чем сильнее воврастает концентрация хлорофилла в каллусе, тем выше его PC.

Таким образом, на основании полученных результатов установлено, что начало повышения концентрации хлорофилла в стеблевом каллусе картофеля свидетельствует о Начале морфогенеза. Отсюда следует, что начало увеличения концентрации пигментов в каллусе можно рассматривать как сигнал перехода его к побегообразованию.

!

ту. Регенерашонная способность разных сортов картофзлд ш зависимости от концентрации БШ В среде

■ Известно, что цитокинины оказывают существенное влияние на процессы хлоропластогенеэа (Кулэева, 1973).

В нашей работе показано влияние цитокинина БАЛ на регенерацию в культуре стеблевого каллуса разных сортов картофеля. Проводили сравнение 4-х сортов при использовании 11 концентраций БАП от 0 до 10 мг/л (варианты БО-БЮ). У всех сортов число регенерантов, формирующихся на одном экспланте, существенно зависело от варианта опыта (рис.З). Сорта с высокой PC характеризовались большим размахом колебаний по этому показателю, по сравнению с сортами с низкой PC.

У сортов с высокой PC,(Янтарный и Herald) максимальный выход регенерантов наблюдали при относительно низких значениях БАП (2-4 мг/л). Средние и высокие концентрации БАП (7-10 мг/л) на эти сорта оказывали обратное действие - они вызывали ослабление и даже . прекращение регенерации. Например, у сорта Янтарный, который является эталоном высокой PC (Трускинов, Алексеева, 1990) отсутствовала регенерация при 9-10 мг/л БАП в питательной среде. У сортов с низкой PC (Гатчинский, Добро) наивысший выход побегов наблюдали при повышенных концентрациях БАП (7-10 мг/л)..

По-видимому, чтобы повысить выход сформированных побегов из уже•заложившихся почек у сортов картофеля с низкой PC, необходимо сбалансировать соотношение Фитогормонов в каллусных тканях введением дополнительных цигокининов в питательную среду.

Характер кривых масса-возраст при разных концентрациях БАП (рис.4) обусловлен разными направлениями морфогенеза. ■ Повышение соотношения цитокинины/ауксины существенно измененяет морфогенез: при низких концентрациях БАП наблюдается ризогенез, при средних

IV tbb

1»

125 j les

115

|СО< в

А 6 1. 1J Л64

СЫРА» М

МАССА, мг

• Б 0,5 J

.у Л jS

А -и-

t 2 3 А 5 Ь 7 i S 1.4112 I 2 3 A 5 6 7 J 3 M И 12 I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ff (¿(3 tf (5

одраст культуры, икд. Влияние БАП на рост биомассм культуры картофеля Гатчински*} в ааеисииости от восэр&ст*.

too

Рис. 4 С сорт

2 лJ>ep, £ «тар П к г/г {ЬЛи мдссы

rh

rf

у

СЗ -I <лф Ш -2 w

г+

0.9 I »5 & 0.5 I 9.* I КЭнЫктаецч!

„ мЯниыый Гатчинский •/•

Рис.5. Пигментный состав каллусмой культуры картофеля в зависимости от концентрации сахарозы

1 - Ц,Лф. 2 - Ц,.

кар

|5!8

3 Si»■

I1»*

ifbu <а т • ¡Ф з Э I it i « "• as ui Si"*

30 JO § 70

г

S 50 i:

53

5 10

s

130 20 10

ю го зо

ОСЬЕШЕНИОСТМл* Рис.Б, Световые кривые фотосинтеза растений-регенерантов, выращенным на среде с разным уровнем сахарозы

1 — сорт Янтарный. 2К сахарозы!

2 - сорт Янтарный, Осахарозы» (

3 — сорт Гатчинский. 23* сахарозы*

4 — сорт Гатчинский,' 0,5И сахарозы.

га jjiT"

0»W. ■ ir

Ufn [l«j

Лтг и'ы'й' " " " euw^ti«, iimd lel^A

Щ-иаилиtu

В-ммм

О-щтамиш

. • - «I? . iniiill . .... (kirwuZ wiui №unoi Seftiux

1»ИС, Г,

Og культу рани тманай и органов картофеля.

значениях концентрации БАП - каллусогенез, при более высоких концентрациях - образование побегов, У сорта Гатчинский (низкая К!) в вариантах БО и Б0,5 каллусогенез отсутствовал. На Фоне относительно высокого содержания ауксинов в среде наблюдался интенсивный ри-зогенез. У сорта Янтарный (высокая РС) наряду с корнеобразованием имел место и небольшой каллусогенез даже в варианте БО. На основании этого Факта можно предположить, что стеблевые экспланты картофеля сорта Янтарный имеют довольно высокий уровень эндогенных ш-токининов. Рост биомассы в вариантах БО и БО,5 для обоих сортов происходил медленно, в'основном за счет увеличения массы корней. Методом наименьших квадратов показано, что зависимость роста биомассы от возраста эксплзнта для этих вариантов описывается степенной Функцией, т.е. уравнением вида у=ахЬ (рис.4, А).

В вариантах Б1 (сорт Янтарный), Б1-БЗ (сорт Гатчинский) наблюдали самый низкий прирост биомассы за счет каллусогенеза. Рост биомассы в этих вариантах апроксимировали линейной функцией: У=а+Ьх (рис.4, Б). У сорта Янтарный в варианте Б1 лаг-Фаза роста каллуса довольно продолжительна и составляет 10-14 дней, тогда как в контроле (вариант БЗ) 5-7 дней. Масса каллуса о регенерантами в варианте Б1 в любом возрасте ниш контроля за счет того, что БАП в больших концентрациях (3 мг/л> стимулирует кущение. ,'

Дальнейшее повышение концентрации БАП до 10 мг/л у сорта Гатчинский усиливало побегообразование и приводило к росту биомассы. Рост последней в вариантах Б4-Б10 лучше апроксимируется экспоненциальной функцией, т.е. выражением вида у=еа+Ъх (рис.4, В). Причем, чем выше была концентрация БАП в среде, тем раньше начиналось образование побегов у этого сорта. В стареющей культуре сорта Гатчинский (20 нед) различия по общей биомассе мевду вариантами не столь заметны, хотя в вариантах Б9 и Б10 она несколько выше.

' У сорта же Янтарный в диапазоне концентраций 2-3 мг/л происходило увеличение числа побегов на . зксплант и возрастала общая биомасса. Таким образом, ткани, образующие побеги во всех случаях растут значительно быстрее. Последующее повышение концентрации БАП от 4 до 8 мг/л вызвало снижение количества образующихся побегов и уменьшение суммарной биомассы.

Коэффициенты регрессии (ь) и свободные члены уравнения (а) достоверно (р<0,05) отличны от 0. Приведенные Формулы можно применять для определения общей биомассы первичного стеблевого каллуса в зависимости от продолжительности периода культивирования. Результаты дисперсионного анализа показали, что информационная способность Формул достаточна, поскольку их коэффициент детерминации

весьма велик (не ниже 87 Ж) и они значимы, т.к. рассчитанный критерии Фишера г>0,001. Уровень значимости формул р<0,05.

Таким образом,' математические выражения, описывающие рост биомассы экспланта и каллуса, как было найдено, зависят от направления морфогенеза. Концентрация БАП в питательной сроде существенно влияет на ход последнего и в зависимости от РС сорта картофеля может как стимулировать, так и понижать выход растения-регенерантов.

Х- Влияние освещенности и состава питательной среды на рост, пигментный состав и морфогенез культуры

Длительно выравдшаемые в темноте культуры первичного каллуса картофеля но содержали хлорофилла и являлись гетеротрофными. Темпы роста культур на свету и в темноте существенно различаются. Ткани, находившиеся на све'Гу и способные к Фотосинтезу, т.о. обладавшие миксотроФным (частично автотрофным, частично гетеротрофным) способом питания, характеризуются повышенной скоростью роста по сравнению с питающимися только гетеротроФйо. Между растущими на свету каллусами изученных сортов картофеля с высокой и низкой РС обнаружены достоверные отличия по скорости прироста биомассы в единицу времени, тогда как выращиваемые в темноте культуры этих же сортов по темпам прироста биомассы существенно не отличались. Можно предположить, что способность каллуса картофеля к морфогенезу на свету связана с фотоморфофизиологическими процессами и с Фотосинтезом. Кроме того, доштельно выращиваемые на свету ткани обладали меньшей оводненностью.

' . Сахароза (при одинаковых условиях освещения) оказывает несом' ненное положительное влияние как на рост тканей и содержание, сухого вещества, так и на синтез хлороФиллов и каротиноидов (рис.5). Причем, все исследованные сорта, отличавшиеся высокой РС, оказались более отзывчивыми на увеличение концентрации сахарозы в среде по сравнению с сортами, у которых РС была относительно низкой.

Формирование побегов наблюдали только на свету. Побегообразование у всех изученных нами сортов на сроде с 2% сахарозы начиналось на 1-4 недели раньше, чем на среде С 0,558 сахарозы. Причем, у высокоморфоганнных сортов быстрее начиналась регенерация. В варианте с высокой концентрацией сахарозы (2%) число каляусов с реге-нерантами и количество побегов на один регенерирующий каллус было больше, чем в варианте с низкой концентрацией сахарозы (0,5Ж).

Таким образом, рост и содержание пигментов в культивируемых тканях зависит от состава питательной среды, условий культивирова-

шя и степени дифференцированное™ тканей. Результаты проведенных опытов позволяют сделать вывод о том, что между регенерационными процессами и Фотосинтезом в культуре.каллуса картофеля существует положительная связь.

уь. Поглощение углекислого газа' культурой каллуса картофеля.

С целью выяснения зависимости между Фотосинтезом и морфогенезом в дифференцирующихся тканях картофеля нами были проведены опыты на каллусных культурах и регенерантах картофеля сортов Янтарный и Гатчинский, культивированных на питательной среде Джаррета,- содержавшей 0,53! или 2% сахарозы в качестве источника углеводов.

Для характеристики Фотосинтеза опыты проводили с использованием радиоуглерода (14С02> и экспозицией продолжительностью 40 с. При этом наиболее высокую ассимиляцию С02 обнаружили каллусы с ре-генерантами сорта Янтарный на среде с 2% сахарозой. Их интенсивность ассимиляции в 40 раз превышала скорость поглощения 1ЛС02 в варианте с 0,6% сахарозой. Интенсивность ассимиляции С02 для каллуса без регенерантов на среде с 2% сахарозы также была несколько выше, чем для каллуса выращенного на среде с 0,5% сахарозы. Другими словами, на среде с 2% сахарозы интенсивность Фотосинтеза была выше и у каллуса, и у регенерантов. У сорта Гатчинский различий по интенсивности поглощения С02 между вариантами 2 и 0,5% сахарозы а среде обнаружено не было. Таким образом, регенерационноспособный сорт Янтарный оказался гораздо более отзывчивым на повышение концентрации сахарозы в питательной среде, причем увеличивалось как количество образующихся побегов, так и накопление хлорофилла и фотосинтетическая активность рас.тении-регенерантов и каллусных тканей. Это можно объяснить тем, что сахароза способствует реализации морфогенетического потенциала, что ведет к развитию Фотосинтети-чеокого аппарата и, в итоге, к усилению Фотосинтеза.

Данные по включению радиоактивной метки при разных уровнях освещенности показали, что с повышением освещенности интенсивность Фиксации С02 возрастает (рис.6). У сорта Янтарный (с высокой РС) различия световых кривых между вариантами опыта <2 и 0,556 сахарозы) намного значительнее, чем у сорта Гатчинский. У растений обоих сортов, выращенных на 2% сахарозе, световые кривые были выше, чем таковые у растений, выращенных на 0,5!? сахарозе. Наши результаты дополняют данные, полученные Н.П.Воскресенской с соавторами-(Воскресенская и др., 1990) на асептических пробирочных■растениях картофеля сорта Миранда, Этими авторами установлено, что высокая

<10Ж) концентрация сахарозы подавляет Фотосинтез по сравнению с 1% концентрацией сахарозы в среде. Наши опыты показали, что для стимуляции Фотосинтеза.пробирочных растения оптимальной является концентрация 1-ЯЖ, с понижением концентрации сахарозы в среде (например, до 0,5%) интенсивность фотосинтеза существенно снижается и ослабляется зависимость Фотосинтеза от освещенности (особенно для сорта Янтарный). Отсюда следует, что опгимизация концентрации сахарозы в сроде ускоряет достижение автотроФности рогенерантами.

Таким образом, сахароза (в концентрации 2%) в среде на свету ■ стимулирует накопление хлорофилла, способствует ускорению морфогенеза каллуса и, как результат, повышает интенсивность Фотосинтеза, особенно у регенерационноспособных сортов.

У сортов картофеля с высокой РС (в отличие от сортов с низкой РС) с повышением освещенности существенно увеличивается Фотосинте-• 1 тическая Фиксация .

Результаты, полученные при изучении зависимости Фотосинтеза регенерантов от интенсивности света, наводят на мысль, что можно экспериментально регулировать степень автотроФности культуры картофеля. Так как данные результаты получены при культивировании растительного материала при 5-6 клк, то можно предположить, что при повышении освещенность до более высокого уровня (20-30 клк) потенциальные возможности Фотосинтетического аппарата картофеля для сортов с высокой регенерационноя способностью будут реализованы в еще большей мере.

' В ряде экспериментов изучали поглощение 14С02 отдельно тканями каллуса, эксплантов и регенерантами разного возраста. Экспериментальные данные выражали в абсолютных величинах и в процентах по • отношению к контролю. Последним служила радиоактивность регенерантов картофеля сорта Янтарный 5-ти недельного возраста.

Сравнительная оценка радиоактивности образцов показывает, что интенсивность Фотосинтеза в расчете на единицу сухой массы тканей каллусов значительно ниже, чем у регенерантов. Причем интенсивность ассимиляции С02 каллусных тканей весьма значительно варьирует (от 8 до 106Ж от контроля) в зависимости от их сортовой принадлежности и возраста (рис.7). При образовании каллуса обычно наблюдается некоторое снижение поглощения углекислого гзоо по сравнению с исходным уровнем, с появлением регенерантов интенсивность Фотосинтеза каллусных тканей возрастает,, а при старении культуры несколько снижается. Эти данные положительно коррелируют с динамикой концентрации хлорофилла в каллусных тканях.

Поглощение С02 тканями зкегиантов.разных сортов - монео взрь-

ирующая величина и составляет 26-110& от контроля. Что касается поглощения углекислого газа регенерантами всех изученных сортов, то оно было выше контрольного (рис.7). С увеличением возраста побегов (до 7 нед от начала морфогенеза) интенсивность Фотосинтеза повышалась, и к 10-ой, нед культивирования увеличилась в 8,5 раз.

Регенеранты разных сортов по интенсивности Фотосинтеза отличаются между собой как в расчете на единицу сухой массы, так и 'В' расчете на единицу пигментов. У регенерантов активность на единицу пигментов значительно выше, чем для каллуса и зксплантов. Интенсивность поглощения углекислого газа положительна коррелирует с суммарной концентрацией хлорофиллов. Об зтом можно судить по отношению удельной радиоактивности образца к концентрации хлорофиллов. Для зксплантов это соотношение составляет 1,3-4,7, для каллусов 1,4-17,6, для регенерантов 6,0-61,1.

Таким образом, каллусогенез и развитие растении-регенерантов на свету в значительной мере определяются становлением Фотосинтетического аппарата.

Принципиальное значение имеет вопрос о соотношении интенсивности Фотосинтеза и дыхания кахлуснои культуры. Показателем этого соотношения является углекислотныи компенсационный пункт (УКП), который представляет собой ту концентрацию С02, при которой в данных условиях Фотосинтез и дыхание равны по величине, т.е. компенсируют друг друга. Для листьев С3-растений при температуре 25°С УКП составляет около 50 ррш, для листьев С4-растенш - менее б ррш. Измерения, сделанные нами совместна с В.А.Кошкиным, показали, что УКП регенерантов с отделенной корневой системой сортов Детско-сельскии, Заравшан, Amalia и. Истринский' при освещенности 130 вт-м"2 составляет 150-170 ррш, т.е. примерно в 3 раза выше, чем для нормальных листьев этих растений. Это указывает на то, что у • побегов, полученных из каллуса, соотношение интенсивности дыхания на свету к интенсивности Фотосинтеза примерно в 3 раза больше, чем таковое у листьев нормальных Сэ-растению®.

' Концентрация хлорофилла в культивируемых тканях значительно ниже, чем у зрелых листьев растений. Однако,, истинный Фотосинтез регенерантов картофеля в возрасте 8-ми нед довольно высок: для сорта Детскосельский - 64 мг COg • ч-1 • г""1, ддя сорта Заравшан - 33 МГ С02'Ч-1'Г-1, ДЛЯ сорта Amalia - 48 КГ CQg-ПГ-1, ДЛЯ СОрТЭ Истринский 61 мг С02 ■ ч""1 • г-1. Таким образом, потенциальная интенсивность Фотосинтеза растений-регенерантов свидетельствует о том, что их Фотосинтетическиа аппарат к 8-ми недальному возрасту достаточно сформирован и они могут обеспечить автотрофное шганиэ при -

переносе их в почву.

Повышение концентрации С02 и освещенности в культивационных сосудах могут способствовать более быстрому росту и переходу культуры на автотрофныя тип питания, что должно благоприятно сказаться на последующей адаптации растений к обычным условиям.

Итак, в результате -анализа морФогенетических изменении в культуре стеблевого каллуса разных сортов картофеля были выделены контрастные по регенерационной способности группы. При культивировании каллусов всех сортов наблюдали■ сходную динамику изменения концентрации пигментов. Каллусогенеза сначала сопровождался снижением концентрации хлорофилла, а затеи возрастанием, что, вероятно, связано с закладкой зеленых эмбриональных клеточных комшюксоа.

Источником углерода для растении-регенерантов являются продукты Фотосинтетическои-ассимиляции С02 и сахароза питательной среды. Таким образом, пробирочные растения характеризуются миксо-троФным питанием. Установлено влияние освещенности и концентрации сахарозы в питательной среде на ассимиляцию С02 растениями-рЬгенерэнтами. '

выводы

1. В процессе образования стеблевого каллуса картофеля у всех изученных сортов картофеля происходит снижение концентрации пигментов; с переходом к Формированию растэний-регенерантов концентрация хлорофилла в каллусных тканях возрастает. Повышение концентрации хлорофиллов коррелирует с. началом морфогенеза.

2. Показано, что свет и Фотосинтетические процессы необходимы' для регенерации в культуре стеблевого каллуса картофеля.

3. Фотоассимиляция С0а растениями-регенерантами, как и накопление в них хлорофилла, замедлены при концентрации сахарозы в среде О.БЖ' и стимулируются при концентрации 255.

4. Повышение освещенности существенно увеличивает Фотосинте'гичес-кую Фиксацию С0г растениями-регенерантами сортов картофеля с высокой регенерационной способностью, У регенерантов сортов с низкой регенерационной способностью описаныи ЭФФект от повышения освещенности выражен слабее.

Б..Направление морфогенеза каллуса и характер накопления- биомассы ииксотроФной культурой, а также потребность в 6-бензиламино-цурине сортоспецифичны.

6. Растения-регенеранты наряду с гетеротрофным обладают достаточно хорошо выраженным фототрофным типом питания; по потенциальной интенсивности Фотосинтеза и по содержанию хлорофилла они приближаются к растениям, выращенным в обычных условиях, причем соотношение хлороФиллов а и ь й тканях регенерантов близко к значениям зтого показателя для ранних этапов онтогенеза' растений картофеля, выращенных в почве.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОГ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Казакова Е.А. Изменение некоторых Фотосинтетических характеристик в онтогенезе каллуса и регенерантов картофеля in vitro // Бюлл.ВИР. - 1990. - №197. - С.67-69,

2. Казакова Е.А. Динамика некоторых Фогосинтетических показателей в процессе культивирования первичного каллуса картофеля // Тр.З молод.конФ.ботан. Ленинграда, Ленинград, апр,, 1990. 4,2 / Ботан.ин-Т АН СССР. - Л. - 1990. - С.72-82. - ДЕЛ. в ВИНИТИ 14.11.90, N-5701-В90.

3. Казакова Е.А. Пигментный состав каллуса и регенерантов картофеля в онтогенезе // Бюлл.ВИР. - 1990. - №204. - С.70-75.

4. Казакова Е.А. Влияние концентрации цитокинина (БАП) «на рост, морфогенез и пигментный состав первичного каллуса картофеля // Бюлл.ВИР. - 1991. - №207. - 0.65-68.

5. Быков О.Д., Казакова Е.А. Фотосинтез в культуре первичного каллуса картофеля и Тез.докл. и сообщ.мевд.конФ. "Фотосинтез и Фотобиотехнология". - Пущино. - 1991. - С.106-107.

6. Казакова'Е.А. Влияние света и сахарозы на рост, морфогенез и пигментный состав' картофеля в культуре in vitro // Бюлл.ВИР. -1993. печати).

' 7.'Быков О.Д., Казакова Е.А. Фотосинтез и морфогенез в культуре стеблевого каллуса картофеля // Тезисы докладов hi съезда Всероссийского общества физиологов растений. - 1993. (в печати).