Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфогенетический потенциал рода пырейник (ELYMUS L. ) и возможности его использования в интродукции и селекции

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Морфогенетический потенциал рода пырейник (ELYMUS L. ) и возможности его использования в интродукции и селекции"

На правах рукописи

С\'

АГАФОНОВА Ольга Викторовна

МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ РОДА ПЫРЕЙНИК (ЕиУМив Ь.) И ВОЗМОЖНОСТИ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ИНТРОДУКЦИИ И СЕЛЕКЦИИ

03.00.05 — "Ботаника" 03.00.15 — "Генетика"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

НОВОСИБИРСК 1997

Работа выполнена в Центральном сибирском ботаническом саду Сибирского отделения РАН, Новосибирск.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. И. Щапова,

доктор биологических наук Р. А. Цильке, доктор биологических наук Г. В. Денисов.

Ведущая организация: Главный ботанический сад АН РАН, Москва.

Защита состоится П 1997 г. в /г- часов на заседании

диссертационного совета Д 002.90.01 по защите диссертаций на соискание степени доктора наук при Центральном Сибирском Ботаническом саду СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, Золо-тодолинская, 101.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центрального Сибирского Ботанического сада СО РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационног-------

кандидат биологических наук

Э. А. Ершова

Актуальность проблемы.

Пырейник (Elijmiis L.) является крупнейшим родом в трибе Пше-ницевые (Triticeae Dum.) семейства Злаковые (Poaceae Barnh.) и состоит более чем из 150 полиплоидных видов (Цвелев, 1976; Dewey, 1984). Виды этого рода, поделенные на ряд секций, распространены почти во всех внетропических странах обоих полушарий, а частично даже и в горных районах тропиков.

Широкий естественный ареал этого рода, охватывающий умеренный пояс Евразии: от зоны вечной мерзлоты и лесного пояса Сибири до аридных зон Казахстана и высокогорий Памиро-Алая обеспечивается высокой экологической пластичностью его представителей и устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды.

На территории бывшего СССР произрастает свыше 70 видов, большое количество подвидов и разновидностей пырейника (Черепанов, 1981) с широким диапазоном изменчивости. Многие виды представляют интерес как кормовые интродуценты (Макарова, 1974; Денисов, 1980) и как потенциальные доноры полезных признаков для улучшения хлебных культур (Lu, Bothmer 1990, 1991; Dong et al., 1992).

Виды и популяции рода пырейник заключают в себе большой запас генетической изменчивости, значительная часть которого не имеет четкого фенотипического выражения в морфологических или иных внешне различимых признаках. Эта часть представляет своего рода скрытый запас генетической изменчивости — генетический потенциал, который играет большую роль в существовании вида и его эволюции.

Однако, данные о внутривидовых пределах изменчивости и общем потенциале рода во многом противоречивы и очень ограничены. Крайне затруднены: анализ морфологически однородных популяций, идентификация н маркирование особей и генотипов, не имеющих внешних фенотипических различий. Практически отсутствуют сведения о чистоте исходных родительских форм, о генетическом расщеплении в гибридных поколениях, а следовательно, о наследственной природе признаков, как диагностических, так и хозяйственно-ценных.

Многие виды рода являются сенокосными и пастбищными кормовыми растениями. В силу исключительно высокой зимостойкости П. сибирского, особенно перспективным является возделывание данного вида в зоне вечной мерзлоты, на обширных территориях Республики Саха (Якутия) и Магаданской области, где в настоящее время площади под многолетними травами прирастают почти исключительно за счет волоснеца (Денисов и др., 1980). Но созданные к настоящему времени сорта П. сибирского (волоснеца) несмотря на высокие

кормовые качества, остаются невостребованными из-за наличия жесткой шероховатой ости, ухудшающей поедаемость его животными и, самое главное, крайне затрудняющей механизированный посев семян (Макарова, 1965; Новоселова и др., 1978; Денисов, 1980). Предпринималась поцытка получить формы П. сибирского с укороченными остями при помощи индуцированного мутагенеза, но она не принесла положительных результатов, так как полученная короткоостая форма оказалась стерильной (Агафонов и Тарасенко, 1980).

Все перечисленные выше обстоятельства значительно осложняют изучение огромного генетического потенциала рода пырейник и использование его генофонда в интродукции и селекции.

Во многом преодоление этих трудностей возможно с помощью белковых маркеров, характеризующихся значительным внутривидовым полиморфизмом и независимостью компонентного состава от внешних условий среды (Конарев, 1983; Созинов, 1985).

В то же время на практике не каждый белок может быть использован в качестве генетического маркера и не всякая генетическая система легко поддается маркированию белками. При этом, необходимо учитывать следующее.

1. Для проведения сравнительных исследовании по белкам-маркерам очень важно исключить влияние внешних факторов среды, а также онтогенетической и тканевой изменчивости.

2. Сравнительный анализ большого числа представителей многих видов, родов и семейств культурных растений и их диких сородичей методом электрофореза показал, что специфичность разных групп белков неодинакова. У одних она проявляется на уровне рода, трибы и семейства, у других — на уровне вида и подвида, у третьих — на уровне биотипов, их генетических групп и популяций.

Наиболее удобными маркерами в этом отношении многие авторы считают изоферменты эстераз и запасные белки эндосперма (проламины и глютелины).

Наши исследования с использованием изоферментов эстераз в качестве маркеров показали, что несмотря на явные преимущества по сравнению с другими ферментами, спектры изоферментов эстераз характеризовались относительно низкой изменчивостью, а также зависимостью от стадий онтогенеза. Другая группа белков — запасные белки эндосперма, свободна от отмеченных выше недостатков и характеризовалась значительным внутривидовым полиморфизмом и независимостью от условий произрастания растений. Доступность семенного материала и высокая воспроизводимость результатов

электрофоретического анализа делают запасные белки эндосперма незаменимыми генетическими маркерами для точной идентификации родительских форм, контроля всех этапов гибридизации, а также в анализе популяций, видов и регистрации генетических ресурсов для ген-банков.

Однако, для решения аналогичных задач у представителен рода пырейник электрофоретический метод пока не получил широкого применения. Одной из причин, затрудняющих электрофорез белков из отдельных зерновок многолетников, является их малая масса. Существующие методы разделения проламинов ориентированы на индивидуальный анализ зерновок массой не менее 5-10 мг. Приготовление белкового экстракта из муки мелкой отдельной зерновки многолетнего злака массой 0,1 — 1,0 мг затруднено тем, что с уменьшением общего количества запасных белков растет относительная доля оболочки.

Поэтому для изучения внутрипопуляционной и внутривидовой изменчивости у представителей рода пырейник предстояло модифицировать существующие методики экстракции и электрофоретического разделения в полиакриламидиом геле (ПЛАГ) проламинов для анализа отдельных зерновок, характеризующихся малыми размерами.

Цель и задачи исследований.

Основной целью исследований явилось изучение изменчивости по изоферментам эстераз и запасным белкам эндосперма и возможности получения короткоостых форм в роде пырейник.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методические подходы для изучения изменчивости по изоферментам эстераз и запасным белкам эндосперма у представителей рода пырейник.

2. Изучить внутрппопуляционную и внутривидовую изменчивость, межвидовые различия и геномную специфичность по изоферментам эстераз и запасным белкам эндосперма у некоторых видов рода пырейник.

3. Получить короткоостые формы П. сибирского, используя метод половой гибридизации в сочетании с белковым маркированием.

4. Провести генетический анализ признака безостости/остистости у гибридов р2 П. сибирского в сравнении с П. длинноколосым/П. якутским.

Защищаемые положения.

1. Изоферменты эстераз можно использовать для идентификации видов, а проламины и глютелины — для идентификации и регистрации конкретных генотипов, для выявления внутрипопуляционной и внутривидовой изменчивости, а также для установления межвидовых различий и геномной специфичности в роде пырейник.

2. Методом половой гибридизации в сочетании с белковым маркированием и последующим отбором можно получить короткоостые формы у П. сибирского и П. длинноколосого/П. якутского.

3. Признак безостости/остистости у П. сибирского контролируется двумя несцепленными аддитивными генами, в то время как у П. длинноколосого/П. якутского — одним геном с неполным доминированием.

Научная новизна работы.

Впервые разработаны и предложены методические подходы для изучения генетической изменчивости в роде пырейник. Проведен внут-рипопуляционный, внутривидовой и межвидовой анализ изоферментов эстераз и запасных белков эндосперма у видов рода пырейник. По изоферментам эстераз у представителей П. сибирского показана онтогенетическая изменчивость. Установлено, что наиболее полным и выраженным спектром изоферментов эстераз характеризуются трехдневные проростки. По электрофоретическим свойствам запасных белков эндосперма выявлена геномная специфичность у видов рода пырейник. Впервые методом половой гибридизации в сочетании с белковым маркированием получены короткоостые формы у некоторых представителей рода пырейник. Проведен генетический анализ признака безо-стости/остистости у П. сибирского и П. длинноколосого/П. якутского.

Практическая ценность работы.

Модифицированный нами метод электрофоретического разделения в полиакриламидном геле запасных белков эндосперма можно использовать для всех представителей трибы Пшеницевые, характеризующихся малыми размерами зерновки. Разрешающей способности данного метода достаточно, чтобы анализировать половину эндосперма зерновки, а оставшуюся часть вместе с зародышем проращивать и получать взрослое растение с известным исходным составом проламиновых компонентов спектра. Изучение популяционной изменчивости у П. сибирского и вычисление коэффициента сходства позволило оценить степень изменчивости каждой популяции и степень сходства и различия между ними. Эти данные полезны в вопросах таксономии и филогении рода пырейник. Результаты по геномной специфичности представляют научный интерес для исследователей, занимающихся вопросами эволюции геномов, а также могут послужить научной основой для разработки вопросов маркирования геномов, контролирующих определенные признаки, в том числе хозяйственно-ценные, у дикорастущих злаков рода пырейник. Полученные короткоостые формы, несущие также гены морозо- и засухоустойчивости являются исходным

материалом для селекции короткоостых форм пырейника, улучшающих кормовые качества сена и способствующих облегчению механизированного посева семян. Определение количества генов, контролирующих признак безостостости/остистостости у П. сибирского и П. длинноколосого/П. якутского имеет определенное значение для развития частной генетики этих видов. Формы, биотипы и популяции пырейника могут быть записаны в виде "белковых формул" по спектру компонентов проламина, которые легко переносятся на перфокарту для машинной обработки заключенной в них информации с целью регистрации генетических ресурсов для геибанков.

Апробация работы. Результаты работы обсуждались на Отчетной научной сессии Центрального сибирского ботанического сада СО РАН (1996), материалы исследований были представлены на IV Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987), на V съезде ВОГиС им. Вавилова (Москва, 1987), на IV Всесоюзном совещании по хемосистематике и эволюционной биохимии высших растений (Москва, 1990), на 72-м ежегодном совещании Тихоокеанского Отделения Американской Ассоциации по развитию науки (Логан, штат Юта, США, 1991), на VIII Международном симпозиуме по генетике пшеницы (Пекин, 1993), на 1 и 2 Международных симпозиумах по Пшеницевым (Хелсинборг, Швеция, 1991; Логан, Юта, США, 1994), на Международном Симпозиуме по онтогенезу у растений (Киев, 1995), на Всесоюзной конференции "Проблемы изучения растительного покрова Сибири" (Томск, 1995).

Публикации. По теме диссертации автором опубликовано 28 печатных работ (10 за рубежом), в том числе: одна монография (в соавторстве), одно изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 208 страницах машинописного текста, имеет 19 таблиц, 40 рисунков и 2 приложения. Состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 221 наименование, в том числе 141 на иностранном языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовались семена дикорастущих растений рода пырейник, собранные в различных географических точках Евразии и Северной Америки, а также коллекционные образцы и сорта из следующих источников:

1. Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, Новосибирск (ЦСБС).

2. Нюрбенский стационар Якутского института биологии ЯНЦ СО РАН, Республика Саха (Якутия) (ЯИБ).

3. Научно-исследовательская лаборатория кормовых и фуражных растений, Логан, Университет штата Юта, США (LC).

4. Отделение селекции растений, Свалов, Шведский Аграрный Университет, Швеция (SD).

Материалы. Всего в анализ было взято 50 видов и около 300 популяций рода пырейник. Объектами популяционных исследований служили выборки семян (из каждой популяции от 10 до 200 образцов в зависимости от поставленной задачи) следующих видов пырейника: II. сибирский (Elymus sibiricus) L., П. иркутский (Е. ircutensis) Peschkova, П. смешиваемый (Е. confusus) (Roshev.) Tzvelev., П. изменчивый (Е. mutabilis) (Drobov) Tzvelev., П. преддерновинный (Е. ргае-caespitosus) (Nevski) Tzvel., П. Комарова (Е. komarovii) (Nevski) Tzvel., П. волокнистый (Е. fibrosus) (Schrenk) Tzvel., II. почти-волокнистый (E. subfibrosus) (Tzvel.) Tzvel., П. шероховатостебель-ный (E. trachycaulus) (Link) Gould et Shinners., П. ново-английский (E. novae-angliae) (Scribn.) Tzvel., П. длинноколосый (E. macrourus) (Turcz.) Tzvel., П. якутский E. jacutensis (Drob.) Tzvel., П. камчадалов (E. kamczadalorum) (Nevski) Tzvel., П. кроноцкнй (E. kronokensis) (Кош.) Tzvel., П. Гмелина (E. gmelinii) (Ledcb.) Tzvel., П. реснитчатый (E. ciliaris) (Trin.) Tzvel., П. повислый (E. pendulinus) (Nevski) Tzvel., II. полуребристый (E. semicostatus) Ness ex Stued, П. Аболина (E. abolinii) (Drob.) Tzvel., П. длинновальковатый (E. dolichatcrus) (Keng) Löve, П. прерывистоколосый (E. praeruptus) Tzvel., П. тибетский (E. tibeticus) (Meld.) G. Singh, II. длшшоостый (E. longearista-tus) (Boiss.) Tzvel., П. Янга (E. yangii) B. R. Lu, П. поникший (E. nutans) Griseb., П. алатавский (E. alatavicus) (Drob.) Löve, П. Баталина (E. batalinii) (Krasn.) Nevski, П. даурский (E. dahuricus) Turcz. ex. Griseb., П. Невский (E. nevskii) Tzvel., П. Федченко

(E. fedtschenkoi) Tzvel., II. сизейший (Е. glaucissimus) (V. Pop.) Tzvel., П. чимганский (Е. tshimganicus) (Drob.) Tzvel., П. амурский (Е. amurensis) (Droh.) Czer., II. канадский (E. canadensis) L. и др.

В сравнительные анализы были взяты образцы семян из следующих родов трибы Пшеннцевые: житняк гребенчатый (Agropyron crista-tum) (L.) Beauv., пырей коленчатый (Elytrigia geniculata) (Trin.) Nevski, ячмень гривастый (Hordeum jubatum) L., ломкоколосник ситниковый (Psathyrostachys juncea) (Fish.) Nevski, колосняк (Leymus) Höchst.

Методы. В основу классификации видов положена система Цвеле-ва с дополнениями Пешковой (Цвелев, 1976; Пешкова, 1990).

Для разделения изофермешов лстераз, проламннов и глютелинов у пырейника применяли вертикальный диск-электрофорез в полпакри-лампдиом геле (Г1ААГ). Для электрофореза белков эндосперма использовали алюмншгй-лактатпую (Bushuk et al., 1978) или SDS-гелево-буфериую системы (Leammly, 1970) в соответствии с модификациями (Агафонова и Агафонов, 1991).

Процедуры получения и обработки белковых экстрактов проводили согласно разработанной нами методике экстракции и электрофорети-ческого разделения в ПААГ проламннов из отдельных зерновок у многолетников трибы Пшеннцевые (Triticeae) с массой эндосперма 0,11,0 мг. Получено авторское свидетельство X? 1546022 (1989).

Для получения короткоостых форм применяли метод половой гибридизации. Эту методику успешно используют при внутри- и межвидовых скрещиваниях многолетних злаков трибы Пшеннцевые в отделе селекции растеши'! Шведского Аграрного Университета (г. Спадов, Швеция) (Lu et al., 1990).

Для строгой количественной оценки электрофоретической подвижности каждого белкового компонента применялся стандартный маркер, позволяющий сравнивать результаты отдельных опытов в единой системе отсчета. В качестве такого стандарта нами выбран электрофоре-тпческин спектр проламннов П. сибирского из природной популяции алтайская-1. Все данные, приводимые в настоящей работе, получены в экспериментах, где наряду с опытными образцами анализировались одна две зерновки со стандартным спектром, содержащим 15 хорошо выраженных и 8 минорных компонентов.

Математическая обработка была проведена по Н. А. Плохинскому и Аяла (Плохинский, 1980; Ayala at al., 1970).

ВНУТРИВИДОВАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ И МЕЖВИДОВЫЕ РАЗЛИЧИЯ ПО ИЗОФЕРМЕНТАМ ЭСТЕРАЗ В РОДЕ ПЫРЕЙНИК

Прежде, чем приступить к внутрипопуляциониому, внутри- и межвидовому анализу изоферментов эстераз у П. сибирского, необходимо было выявить тканеспецифнческие и онтогенетические особенности, характерные для растений данного вида.

Поскольку в работах но изучению изофермептной вариабельности часто используются проростки разных возрастов, нами было проведено изучение эстеразных спектров в колеоптиле проростков, полученных при замачивании семян с промежутками в одни день.

Опыт проводили на растениях одной из лиши'! горноалтайской популяции II. сибирского, самоопыленноп в течение 4 поколении. Растения этой линии характеризовались идентичными спектрами эстераз.

В опыт были взяты проростки в возрасте от 2 до 7 дней с момента появления колеоптиле. Наибольшее количество изоферментов обнаружено в трехдневном колеоптиле. На основании зпмограмм, полученных от нескольких линий, был составлен суммарный спектр множественных форм эстераз горноалтайской популяции Г1. сибирского. Все зоны с эстеразной активностью мы разделили на 4 группы — А, В, С и D. Наиболее быстро мигрирующей является группа А, состоящая из трех четко обозначенных зон: Al, А2, A3. В некоторых случаях выявляются только две зоны. Группа В характеризуется пятью зонами В1-В5, одна пз которых (В1) имеет слабую активность. Группа С представлена четырьмя зонами С1-С4 со средней скоростью миграции. Для медленно мигрирующей группы D наиболее типичны три зоны: 1)2, D3, D4, зона D1 является относительно непостоянной. Наиболее стабильной для данной популяции является группа А, характеризующаяся постоянными зонами At и А2. Наиболее вариабельной является группа С, которая на стадии колеоптиле может быть представлена четырьмя или меньшим числом зон, вплоть до полного их отсутствия (возможно наличие зон в виде следов). При этом онтогенетические сдвиги накладываются на внутрипопуляционную изменчивость и несколько затрудняют анализ.

Следует отметит!) обратную зависимость между активностью группы С и зон Dl, D2 в процессе развития колеоптиле. Увеличение активности зон группы С со второго по седьмой день сопровождается снижением активности зон группы D, причем зоны D3 и D4 снижают свою активность в меньшей степени. Последние являются относительно

постоянными, но часто слабыми по активности и трудными для идентифицирования ввиду малых скоростей миграции.

Таким образом, из опыта следует, что наиболее полным и выраженным эсгеразным спектром характеризуются трехдневные проростки (колеоптиле) П. сибирского. Длина колеоптиле при этом составляет около 10 мм.

Для установления зависимости спектра изоферментов эстераз от возраста исследовались растения горноалтайской популяции на стадии трехдневных проростков, трех листьев и листья взрослых перезимовавших растений.

На электрофоретическнх спектрах образцов на стадии трех листьев не были обнаружены изоформы эстераз группы А, резко уменьшилась активность (до следов) у изоформы С2 и, возможно, ЮЗ. При этом увеличилась активность изоферментов СЗ пли С4. У взрослых, перезимовавших растений в молодых листьях вновь появились изоформы группы А, свойственные проросткам. Изоформы группы В, выявляемые на стадии трех листьев, остались неизменными. Наибольшая активность у перезимовавших растений на стадии, предшествующей колошению, была обнаружена у изоформ СЗ и С4, в то время как активность группы Э резко уменьшилась. Очевидно, что конечный взрослый организм получается как приобретением, так и потерями в изофермептпом составе эмбрионов, в процессе диффереици-ровки тканей.

Некоторые исследователи считают наиболее оптимальным материалом для сравнительных электрофоретическнх исследований ферменты семян, так как различия в вегетативных фалах развития растеши! затрудняют анализ изоферментных спектров (Конарев, 1973; Яаска и др., 1977; Конарев, 1983). Зрелые семена представляют собой четко определенную фазу развития, а их семядоли, эндосперм и зародыш — морфогенетиче-ски и функционально однородные ткани (Конарев, 1973, 1974).

Представители рода пырейник имеют мелкие семена, индивидуальный анализ которых затруднен но причине невозможности повышения разрешающей способности метода. Кроме того, спектры изоферментов эстераз у этих растений, как показали наши исследования, достаточно бедны и для сравнительных популяционных исследований мало информативны. Поэтому подобные исследования целесообразнее проводить при строгом соответствии стадий онтогенеза у анализируемых растений, выращенных в одинаковых условиях. По нашим данным одновозрастные этиолированные проростки и зеленые всходы на стадии трех листьев могут успешно использоваться для таких исследований.

Для выявления внутрипопуляционной изменчивости по изофермен-там эстераз в опыт были взяты образцы на стадии трехдневных проростков (в количестве 20 штук) из популяций произрастающих в Горном Алтае, окрестностях Читы, Тувы, Братска, Якутии, Благовещенска, из Приморского края (Кедровая падь) и со станции ВИР. Изо-ферментные спектры внутри всех изученных выборок оказались полностью идентичными.

Сравнение изоферментных спектров эстераз в разных популяциях П. сибирского проводили на стадии трехдневных проростков у выборочно взятых растений из перечисленных выше популяций.

Интересно отметить, что электрофоретические спектры образцов у этих популяций были очень похожими. Полное совпадение отмечено по группе А, а также по изоформам В2, ВЗ, В5, С2, С4, БЗ и 04. По остальным изоформам наблюдается незначительная изменчивость, что, в первом приближении, свидетельствует об относительно небольшой внутривидовой изменчивости эстеразных спектров.

Для сравнения спектров изоферментов эстераз у разных видов были проанализированы трехдневные проростки (по 10 образцов из разных популяций каждого вида) П. сибирского и близких к нему видов П. смешиваемого и П. собачьего. Несмотря на некоторую близость этих видов в систематическом отношении, для каждого из них характерен свой электрофоретический спектр изоферментов эстераз. Вовлечение в анализ других видов: П. шероховатосте-бельный, П. ново-английский, П. Гмслина, II. повислый, П. си-зейший, П. реснитчатый, П. амурский, П. канадский подтверждает, что каждый вид имеет специфическую картину распределения изоферментов эстераз.

Таким образом, обобщая результаты электрофоретического разделения изоферментов эстераз, можно сказать, что наиболее полный спектр изоферментов эстераз П. сибирского характеризуется 16 изо-формами, разделенными на группы А, В, С и О в соответствии с относительными скоростями миграции.

Учитывая существующую онтогенетическую изменчивость эстеразных спектров, трехдневные проростки и растения на стадии трех листьев являются оптимальным материалом для проведения сравнительных и других исследований в роде пырейник.

Эстеразы пырейника являются видоспецифичными ферментами, т. е., несмотря на обширность и определенную прерывность ареала, обладают рядом консервативных изоформ, отражающих видовую принадлежность. Это важно, поскольку многие морфологические признаки

дикорастущих растений имеют непрерывную изменчивость и в ряде случаев не гарантируют точное определение вида.

Мы улсе отмечали, что изозимный состав эстераз может в той или иной мере меняться с возрастом растения и под влиянием условий окружающей среды. Это затрудняет использование экстрактов фермента из листьев или других вегетативных органов для сравнительного анализа. Более удобны в этом отношении белки семян, т. к. зрелые семена представляют собой четко определенную фазу развития. Генетические системы, обеспечивающие образование запасных продуктов семени, но своей биологической сущности должны быть более стабильными, чем системы синтеза ферментов, в данном случае, изозимов эстераз.

ВНУТРИВИДОВАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ И МЕЖВИДОВЫЕ РАЗЛИЧИЯ ПО ЗАПАСНЫМ БЕЛКАМ ЭНДОСПЕРМА В РОДЕ ПЫРЕЙНИК

Суть методики, разработанной нами для многолетников трибы Пшешщевыс, характеризующихся малой зерновкой (масса эндосперма 0,1-1,0 мг) заключается в следующем. У размоченной зерновки препаровальной иглой отсекали зародыш и через отверстие в оболочке выдавливали полужидкий эндосперм, прокатывая с противоположного конца зерновки тонким стержнем из нержавеющей стали. Полученный изолированный эндоенрем, отделенный от оболочки и зародыша, содержит весь комплекс запасных белков без примесей.

Объектами популяционпых исследований служили выборки семян (из каждой от 40 до 60 образцов) П. сибирского, собранных в трех местах дикого произрастания: алтайская-1 (окр. с. Топучее, Шебалин-ского р-на Республики Алтай), алтайская-2 (окр. с. Каярлык, Онгу-дайского р-на Республики Алтай), тувинская (окр. г. Туран, Республики Тува). Для сравнительного анализа были взяты отдельные зерновки из ряда других природных популяций азиатской части бывшего СССР и гербарных образцов, собранных сотрудниками ЦСБС в разных районах Республики Тува в 1972-1975 гг.: Восточно-Казахстанская обл., окр. пос. Катон-Карагай; Иркутская обл., окр. г. Братска; Республика Саха (Якутия), окр. пос. Сангар и пос. Хандыга; Читинская обл., окр. г. Краснокаменска; Амурская обл., окр. г. Благовещенска; Приморский край, окр. г. Владивостока (ст. "Океанская", ст. "Чайка"); Приморский край, заповедник "Кедровая падь"; Республика Тува, Пий-Хемский р-н, Зап. Саян, окр. пос. Эрбек, 1975 г. (гербарий № 1); Республика Тува, Овюрский р-н, окр. пос. Ак-Чыра, 1973 г.

(гербарий № 2); Республика Тува, Тандинский р-н, сев. склон хребта Танну-Ола, окр. пос. Хову-Аксы, 1973 г. (гербарий № 3); Республика Тува, Овюрский р-н, южн. склон хр. Танну-Ола, долина р. Ирбитей, 1972 г. (гербарий № 4).

За основу был взят метод электрофореза запасных белков эндосперма в алюминий-лактатной системе (Bushuk et al., 1978).

Отдельные компоненты спектра предлагается обозначать символом ELY (от латинского названия рода) с указанием величины относительной электрофоретической подвижности (ОЭП), установленной в сравнении со спектром-стандартом. Наиболее подвижный компонент спектра-стаидарта, полученного в контрольном опыте, обозначен как ELY—100. В порядке уменьшения электрофоретической подвижности компоненты объединили в условные зоны альфа-, бета- и гамма -проламинов с границами в точках 46 и 81 ед. Подобная номенклатура, впервые предложенная Войчиком и соавторами (Woychik et al., 1961) для глиадинов пшениц, не потеряла своего значения и до настоящего времени ввиду ряда достоинств при анализе проламиновых спектров.

Индивидуальным анализом семян алтайской-1 (57 зерновок) выявлены различия по двум альтернативным компонентам ELY-24 и ELY-25 (соответственно 12 и 37 зерновок) или их отсутствию (8 зерновок). Такая незначительная изменчивость, на наш взгляд, не мешает выбору спектра алтайской-1 в качестве эталона при анализе проламинов пырейника. Существенным достоинством указанного спектра является равномерное распределение компонентов по электрофоретическому треку, дающее возможность строго промаркировать всю его протяженность.

В выборке семян из популяции алтайская-2 (96 зерновок) в составе зоны бета наиболее непостоянными компонентами были ELY—47, ELY-48,5, ELY-50. Между ними образуются все возможные комбинации из двух или трех компонентов. Часть зоны в пределах 67-79 ед. мало изменчива. В зоне гамма во всех зерновках обнаружены компоненты ELY-23 и ELY-29. Для остальных характерны практически все сочетания, но с разной частотой. Исключение составляет ELY-27, обнаруженный только в сочетании с ELY-30,5 и ELY-32,5, последние в редких случаях встречаются но одному. Можно предположить, что некоторые компоненты проламина П. сибирского наследуются независимо. Вместе с тем для некоторых сочетаний компонентов, в частности, в зоне альфа (ELY-92,5 и ELY-97; ELY-81 и ELY-85) нельзя исключить сцепленного наследования соответствующих генов.

Выборка семян из тувинской популяции (32 зерновки) характеризуется полной идентичностью спектров. Высокая однородность выборок

тувинской и алтайской-1 может объясняться происхождением данных популяций (а точнее, микропопуляций) от единичных растений в условиях преимущественного самоопыления.

Были проанализированы отдельные зерновки из некоторых гербар-ных образцов П. сибирского, собранных в разных районах Республики Тува. С каждого гербариого листа отбиралось по четыре выполненных зерновки. Спектры проламинов у зерновок с одного листа были полностью идентичны, что подтверждает преобладание в естественных условиях самоопыленных растений. Однако, отличия между разными образцами оказались весьма значительными. В зоне альфа, наиболее обедненной компонентами, сходства в их электрофоретпческой подвижности практически нет. В зоне бета обращает на себя внимание сходство между образцами 1 и 4 несмотря на то, что по данным этикетки гербариого листа, места сбора образцов разделяет Центральная Тувинская котловина и хребет Восточный Танпу-Ола. В то лее время образцы 2 п 4, собранные на его южном склоне на расстоянии менее 20 км вдоль хребта, характеризуются довольно незначительным сходством пролампновых спектров по всем трем зонам. В зоне гамма у образцов 1, 2 и 3 имеется сходная, а возможно и идентичная группа из трех компонентов в промежутке 37-43 ед. ОЭП.

Как известно, ироламины пшеницы (глнадины), разделенные в кислом геле, объединяют в зоны альфа-, бета-, гамма- н омега-глпадннов. Ранее высказывалось мнение, что для проламинов всех представителей трибы Пшенпцевые характерно сходное распределение компонентов (Копарев, 1983) и для их регистрации может быть применена единая номенклатура, разработанная автором для хлебных культур.

Результаты наших исследований не подтверждают этот тезис. Каждому таксону трибы свойственно специфическое распределение белковых компонентов на электрофореграммах, обусловленное нх свойствами на молекулярно-генетическом уровне. Видимо, можно говорить о специфической архитектонике спектра, отражающей эволюцию базисных геномов пли их стабильных комбинаций. По нашему мнению, многообразие молекулярных форм пролампновых белков дикорастущих злаков не позволяет вести регистрацию отдельных компонентов спектра иначе, как через величину относительной электрофоретпческон подвижности.

Для более полной оценки диапазона внутривидовой изменчивости II. сибирского по компонентному составу проламинов был проведен сравнительный выборочный анализ зерновок из 17 географических точек азиатской части бывшего СССР, включая Китай (рис. 1). Л для

Рис. 1. Электрофоретическпе спектры запасных белков эндосперма в популяциях пырейника сибирского из азиатской части бывшего СССР (1, 4) и Китая (2 — Хпньян, 3 — Сичуань). — стандартный спектр

полноты охвата изменчивости по электрофоретическим спектрам белков эндосперма в качестве маркеров наряду с проламинами использовали глютелнны. За основу был взят метод электрофореза белков эндосперма в БОБ-гелево-буферной системе (Ьеашш1у, 1970).

Электрофоретическое разделение белковых экстрактов эндосперма проводили в двух вариантах: с 2-меркаптоэтанолом и без него. Экстракция запасных белков 2%-м раствором БББ дает возможность изучать электрофоретические спектры, лишенные субъединиц глютели-на. В отсутствие 2-меркаптоэтанола, (вариант -Ме) разрушающего четвертичную структуру этих высокомолекулярных белков, последние остаются в стартовых карманах. Добавление в часть экстракта 2-меркаптоэтанола (вариант +Ме) приводит к появлению на гелях субъединиц глютелина, а также влияет на электрофоретическую подвижность некоторых проламиновых компонентов.

Большая изменчивость и присутствие множества компонентов в области 28-40 кО, полученных при анализе (+Ме) индивидуальных зерновок П. сибирского из Горного Алтая, затрудняло генетический анализ. Поэтому мы проанализировали спектры только в области 4090 кО, поделив эту область (условно) на две части. Анализ проводили только по основным компонентам. Проламиновый компонент 3 и глю-телиновый компонент 6 присутствовали на электрофорегических спектрах довольно редко, в то время как глютелиновый компонент 5 встречался очень часто. Проламиновые компоненты 1 и 2 появлялись на спектрах приблизительно с одинаковой частотой. У всех изученных образцов, взятых из Горного Алтая, были обнаружены характерные глютелиновые компоненты в области 54-60 кО. Область 38-46 кО характеризовалась непостоянными компонентами, представляющими собой белки только проламиновой группы. Наиболее типичная пролами-новая группа в этом районе — группа 1.

Коэффициенты сходства 5т для этих популяций вычисляли по формуле Аяла (Ауа1а е1 а1., 1970). Для этого были проанализированы но компонентному составу электрофоретические спектры в количестве 20 из каждой популяции. Учитывались компоненты только в области 40-90 кО. Коэффициенты сходства вычисляли по отношению количества общих фракций для двух сравниваемых спектров к максимальному количеству фракций, зафиксированных на каждом спектре.

Интересно отметить, что картина распределения компонентов на электрофоретических спектрах растений из Горного Алтая была очень сходна с картиной распределения компонентов в популяции Хипьян, что также подтверждается коэффициентом сходства. Коэффициент

сходства для этих популяций определяется самой большой величиной (0,422), в то время как сходство между популяциями Хиньяи-Сичуань (обе из Китая) оказалось самым маленьким (5ш = 0,307), что подтверждается различием в распределении ряда компонентов на элек-трофоретических спектрах (см. рис. 1). Вероятно, это отражает филогению внутривидового ранга. Электрофоретическая подвижность пары глютелиновых компонентов (субъединиц), присутствующих во всех изученных образцах Горного Алтая и обнаруженных в области 58 кО, не изменилась в образцах популяции из Хиньяна.

Сравнение всех 17 изученных популяций П. сибирского между собой по коэффициенту сходства (5П1) показало, что наибольшее сходство по электрофоретическим спектрам проламинов было выявлено между популяциями из Бурятии (В1Ш-8810) и Читы (СН1-8641) (Б,,, = 0,675). Наименьшее значение коэффициента сходства (5т = 0,083) было обнаружено между популяциями из Бурятии (В1Ш-8810) и Приморского края (РИК-8413), Читы (СН1-8641) и Приморского края (РКК-8413), Братска (ВКА-8603) и Приморского края (РШС-8413), Тувы (ТиУ~8401) и Приморского края (РНК~8413). Из сравнения видно, что популяция из Приморского края достаточно сильно отличалась от других исследованных нами популяций картиной распределения компонентов на электрофоретических спектрах. Таким образом, каждая популяция П. сибирского характеризовалась различной изменчивостью и специфической картиной распределения проламиновых и глютелиновых компонентов.

Необходимо отметить, что во всех изученных популяциях П. сибирского в области 58 кБ были обнаружены наиболее постоянные компоненты, которые можно рассматривать как консервативные субъединицы вида (см. рис. 1).

Общее распределение проламиновых компонентов у образцов, на наш взгляд, соответствует предложенной выше номенклатуре, включающей разграничение на зоны альфа, бета и гамма. Внутривидовая многокомпонентная совокупность проламиновых белков II. сибирского представляет с06011 непрерывный спектр изменчивости по электрофорети-ческой подвижности. Поэтому наиболее адекватный способ обозначения и учета отдельных компонентов в настоящее время возможен через точную фиксацию величины ОЭП путем сравнения со стандартным спектром.

Для выявления видовой специфичности белков эндосперма была предпринята попытка изучить электрофоретичсские спектры у некоторых видов рода пырейник. В опыт были взяты следующие виды и популяции (по 10 образцов из каждой), собранные в разных географических точках: 17 популяций П. сибирского, 15 популяций П. даурского, 7 популяций П. реснитчатого, 3 популяции П. собачьего, 2 популяции

Г1. преддерновинного, 2 популяции П. волокнистого. Электрофорез проводили при тех же условиях, что были описаны выше. В качестве маркеров использовали проламины и глютелины.

В целом, для П. сибирского наблюдалось большое сходство в структуре белковых спектров как в варианте -Ме, так и в +Ме. В варианте +Ме была обнаружена пара консервативных субъединиц глю-телина массой около 58 кО, характерная для всех изученных образцов П. сибирского. Зерновки П. даурского в большей степени различались между собой по белковым спектрам. Консервативных субъединиц глю-телина, свойственных всем изученным образцам П. даурского, в этом виде не обнаружено. Возможно, обширный ареал, занимаемый этим видом, а следовательно, различные эколого-географические условия произрастания, способствуют высокой изменчивости по ряду морфологических признаков. Электрофоретические спектры П. реснитчатого отличались от спектров П. даурского. В варианте -Ме все компоненты можно разделить на четыре зоны. Причем, в области 39 кЭ присутствовала специфическая для вида группа компонентов. Что касается видов II. преддерновинный и П. волокнистый, на их спектрах была обнаружена пара консервативных субъединиц глклелипа массой около 58 кО, характерная для образцов П. сибирского. Вовлечение в анализ еще 25 других видов подтверждает, что практически каждый вид имеет специфическую картину распределения компонентов проламина и глютелнна. Однако, консервативные компоненты, характерные для определенного вида, найдены только для П. сибирского.

Таким образом, запасные белки эндосперма (проламины и глютелины) молшо использовать для идентификации и регистрации конкретных генотипов, для выявления внутринопуляционных и внутривидовых пулов, а также для установления межвидовых различий в роде пырейник.

Сходное строение и размеры зерновок, а также биохимические свойства проламинов позволяют, как показали исследования, применять модифицированный нами метод электрофоретического разделения компонентов проламина, как единый для всех многолетних представителей трибы. Разрешающей способности метода достаточно, чтобы анализировать половину зерновки, а оставшуюся часть вместе с зародышем проращивать и получать взрослое растение с известным исходным составом проламиновых компонентов спектра.

Использование проламиновых маркеров в изучении многолетних злаков кормового назначения позволит разрабатывать вопросы контролирования селекционного процесса на уровне генотипов, а также

решать такие частные задачи, как установление структуры и степени филогенетической близости отдельных изолированных популяций.

Однако, для повышения эффективности маркирования необходимы исследования геномной и хромосомной локализации проламинкоди-рующих генов и их сопряженности с генетическими системами, контролирующими хозяйственные признаки. Результаты по выявлению геномной специфичности, полученные с помощью электрофореза белков эндосперма у видов с разной геномной конституцией будут изложены в следующем разделе.

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ ЭНДОСПЕРМА У ВИДОВ ПЫРЕЙНИКА С РАЗНОЙ ГЕНОМНОЙ СТРУКТУРОЙ

С целью установления геномной специфичности по запасным белкам эндосперма было проведено сравнительное изучение некоторых видов рода пырейник с различной геномной структурой (SH-, SY-, SHY-, SSY- и SYP-), репрезентативно представленных генотипами из многих точек ареала.

SH-геномные виды. П. сибирский ALT-84-1 (Алтай), ZEJ-88-6 (Амурская обл.), SAK-91-13 (Сахалин), КАМ-92-18 (Камчатка), VLA-84-51 (Владивосток), Н10238 (Памиро-Алай, Таджикистан); П. иркутский GAC-89-23 и П. собачий GAC-89-21 (Алтай); П. смешиваемый AMU-88-4 и CHI-93-3 (Амурская и Читинская обл.); П. изменчивый АСН-89-32 (Алтай), BAJ-92-2 (Бурятия); П. преддерно-винный CUR-88-3 (Центр. Тянь-Шань); TI. Комарова GAL-84-25, GUK-91-3 и GUK-93-16 (Алтай); П. волокнистый из Новосибирска, Алтая и Приморья; II. почти-волокнистый JAN-89-16 (Саха (Якутия)); П. длинноколосый JAC-86-10 (Саха (Якутия)); П. камчадалов KAM— 92-1 (Камчатка); П. кроноцкий АСН-89-52, АСН-89-4 (Алтай) и JAC-82-7 (Саха (Якутия)).

SY-геномные виды. П. Гмелина из Приморья и Алтая; П. реснитчатый из Приморья; 6 образцов П. повислого из Китая (Сичуань) и 8 других видов получены от проф. Р. вон Ботмера (SD): А — П. полуребристый (а — Н3288, Индия; b — Н4002, Пакистан), В — П. Аболииа (а — Н8486, Китай; b — Н3306, SU), С — П. длшшовальковатый (а — Н8024 и b — Н8033, Китай), D — П. нрерывистоколосьш, F — П. тибетский (а — Н8361 и b — Н8070, Китай), G — П. длинноостый (а — II3275, Иран; Ь - Н4114, Пакистан), Н - П. Янга (а - Н8341 и Ь -Н8992, Китай).

Рис. 2. Электрофоретические спектры запасных белков эндосперма у видов пырейника с разной геномной структурой. Вариант -Ме

A. ЗН-пчюмные ниды: а — П. сибирский (81), Ь — II. иркутским, с — П. собачин, с! - II. прсддсрпонипный, с - II илмсичпный, I - Г1. смешиваемый.

B. ЯПУ-кчюмпые виды II. даурский: а Атгай, Ь — Читинский, с - Приморский, с! -- центральный Тянь-Шань.

C. I), Е. ЗУчсномныс виды. С - П Гмслипа' а -- Приморский, Ь - Алтай; I) - П повислый: Г> образцов на Сичуапь, Китай; I- - II. рссшгпатый: 6 образцов ил Примсцккою края

вНУ-геномные виды. II. даурский САС-89-14 (Алтай), С1П-86-35 (Читинская обл.), УЬЛ-86-42 и Р1*А-86-2 (Приморский крап), ИЛИ—88—18 (Центр. Тянь-Шань, Кпргпзстан) и образец 118107 из Китая (Сичуапь); II. поникший ВЛК-88-4, ВЛ1*-88~22, ВАК-88-24 (Центр. Тянь-Шань), 015-81-65 (Памнро-Алан, Таджикистан) и образец 117362 пз Китая (Сичуапь).

БУР-геномиые виды. Н. алатавскнй, образцы Р1-531709, Р1-499588, 0-2664 получены из Живо!! Коллекции ШИЛ АИБ (ЬС); П. Баталина образец Р1-531562 (иЗОЛ) и ВЛК-88-29 из Центрального Тянь-Шаня.

ББУ-геномные виды. II. сизейший КЛ5-85-ЗА и КА5-85-85-311 (Северный Тянь-Шань, Казахстан); II. чпмганскнй, КА5-85-43 (Северный Тянь-Шань), ВЛН-88-11 и С1Ж-88-12 (Центр. Тянь-Шань). В качестве маркеров использовали проламины и глютелнны. За основу был взят элсктрофоретнческий метод разделения белков эндосперма в ЗПБ-гелево-буферной системе (1^еатт1у, 1970).

Большинство белков эндосперма были распределены в диапазоне молекулярных масс 25-84 kD. После обработки экстрактов 2-меркаптоэтанолом (+Ме) у SH-геномных видов относительная элек-трофоретическая подвижность проламиновых компонентов в области 40-50 kD оставалась неизменной, за исключением высокомолекулярных компонентов или их аналогов. В целом зерновки SH-геномных видов характеризовались сходством электрофоретических свойств и распределением белковых групп на электрофореграммах как в вариап те -Ме (рис. 2, Л), так и в варианте +Мс, в то время как по результатам кластерного анализа морфологических признаков, эти виды пырейника не образуют на дендрограмме сколько-нибудь компактной группы (Jensen et al., 1992).

Проламнны П. даурского (SHY-геном), П. Гмелпна и П. повислого (у обоих SY-геиом) в варианте -Ме имели похожие электрофоретиче-екпе спектры (рис. 2 В, С, D). На электрофореграммах можно выделить три группы компонентов. Наиболее интенсивные белковые зоны локализованы в области 30-35 kD независимо от варианта. Относительно бедные компонентами группы локализованы в области 40-46 kD (вариант -Ме) или 40-60 kD (вариант +Ме).

Электрофоретпческие спектры зерновок II. реснитчатого (SY-геном) характеризовались специфической группой компонентов с молекулярной массой ниже 40 kD (рис. 2 Ю и отличались от других видов в обоих вариантах. В целом, распределение белковых зон на электрофореграммах других SY-геномных видов (вариант -Ме) не отличалось от распределения в образцах П. Гмелина и П. повислого за исключением следующих): 1) на электрофоретических спектрах зерновок II. длинно-вальковатого и П. прерывистоколосого были обнаружены идентичные пары фракций с молекулярной массой ниже 40 kD; 2) для образцов II. Яша характерно наличие группы компонентов в области около 50 kD.

Большое количество компонентой и высокая изменчивость в пределах вида несколько затрудняет сравнительный визуальный анализ электрофоретических спектров данных видов в варианте + Ме, но, тем не менее, можно выделить некоторые специфические особенности. IIa электрофоретических спектрах II. Янга были обнаружены высокомолекулярные компоненты с молекулярной массой около 70 kD характерные для большинства SIl-геномных видов. Существует некоторая степень изменчивости компонентов у образцов того же вида за исключением II. длннновальковатого, у которого электрофоретпческие спектры были одинаковыми у обоих образцов как в варианте -Ме, так и +Ме. Кроме того, у П. длннновальковатого присутствовало больше

общих компонентов с образцом Н3283 П. прерывистоколосого из бывшего СССР, чем между двумя образцами Н3282 и Н3283 этого вида. Наибольшие различия в олектрофоретических спектрах между образцами одного и того же вида были выявлены у П. тибетского и II. длинноостого.

Таким образом, картина электрофоретических спектров белков эндосперма у изученных видов не всегда однозначно отражала нх геномную конституцию. Например, на электрофоретических спектрах SY-геномных видов было выявлено визуально больше различий, чем между некоторыми SY- и SHY- или SH-геномными видами. Очевидно, что свойства эндоспермальных белков являются вторичными по отношению к интрогрессивной эволюции, широко охватывающей род пырейник.

Образцы П. поникшего и П. даурского характеризовались идентичными геномами (SHY-геном), но достаточно сильно различались элек-трофоретическими спектрами. Последние у П. поникшего насыщены белковыми компонентами, а в зоне 70 kD присутствовали более интенсивные компоненты, чем у II. даурского. В то же время в изученных образцах П. сизейшего и П. чимганского (SSY-геном) электрофорети-ческне спектры похожи как по общему распределению компонентов на группы, так и по наличию идентичных по молекулярным массам (ОЭП) полипептидов.

IIa электрофоретических спектрах образцов SYP-геномных видов (П. Баталина и П. алатавский) было обнаружено большое сходство как в распределении групп компонентов, так и отдельных полипептидов. Это соответствует данным о высокой степени фсртильности гибридов F] между некоторыми образцами этих двух видов (Jensen, 1988).

Итак, картина электрофоретических спектров у всех изученных образцов зависела от того, проводилась ли обработка белковых экстрактов 2-меркаптоэтанолом или нет.

Высокий уровень белковой специфичности, проявляющийся в общности как отдельных компонентов, так и в распределении групп компонентов на электрофоретических спектрах, был характерен для некоторых Sil- и SYP-геномных видов. Визуальное сходство в распределении групп компонентов на электрофоретических спектрах, вероятно, указывает на несколько пониженный уровень белковой специфичности. Это можно было наблюдать у таких азиатских SH- и SSY-геномных видов, как II. сибирский, II. изменчивый и П. смешиваемый; П. якутский из Республики Алтай и П. длшшоколосьш из Республики Саха (Якутия); П. сизейший и П. чимганский. Можно предположить, что некоторые образцы этих видов способны к взаимной интрогрессии.

Что касается геномной специфичности, выявляемой посредством электрофореза запасных белков эндосперма, то она не одинакова для различных гругш видов: наиболее выражена для некоторых БЫ- н БУР-геномных видов, несколько меньше для ББУ- и незначительна для остальных, особенно БУ-геномных, видов.

Сравнительное электрофоретическое изучение проламиновой фракции и субъединиц глютелина запасных белков эндосперма у злаков с разной геномной структурой показало, что наличие того или иного генома накладывает отпечаток на распределение компонентов проламипа на спектре.

ПОЛУЧЕНИЕ КОРОТКООСТЫХ ФОРМ МЕТОДОМ половой ГИБРИДИЗАЦИИ И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРИЗНАКА БЕЗОСТОСТИ/ОСТИСТОСТИ У П. СИБИРСКОГО И П. ДЛИННОКОЛОСОГО/П. ЯКУТСКОГО

В силу исключительно высокой зимостойкости П. сибирского, особегаю перспективным является возделывание данного вида в зоне вечной мерзлоты, на обширных территориях Республики Саха (Якутия) и Магаданской области, где в настоящее время площади под многолетними травам прирастают почти исключительно за счет волоснеца (Денисов и др., 1980).

Созданные к настоящему времени сорта П. сибирского характеризуются хорошими кормовыми качествами (Макарова, 1965; Новоселова и др., 1978). Однако, все они имеют общий недостаток: нижняя цветковая чешуя заканчивается длинной шероховатой остью (до 25 мм), из-за чего ухудшается поедаемость корма животными и затрудняется механизированный посев семян (Новоселова и др., 1978).

Для получения фертильиых короткоостых форм П. сибирского мы применили метод половой гибридизации в сочетании с белковым маркированием. Гибридизацию проводили в условиях климатической камеры.

В качестве родителей использовали короткоостые формы пырейника, предоставленные Г. В. Денисовым (ЯИБ) и представляющие собой, по его мнению, спонтанный гибрид между растениями сорта Камалнн-ский-7 (получен на основе П. сибирского) и П. изменчивого, а также-природные образцы П. сибирского: КА2-79~31 (Казахстан, Восточно-Казахстанская обл. с. Катон-Карагай); 2ЕА~88~06 (Амурская обл., г. Зея); УЬА-84-51 (Приморский край, г. Владивосток, ст. ВИР); 5АК-91-13 (Сахалинская обл., г. Южно-Сахалинск); образец ЛАС-83-26 сорта Камалинский-7, предоставлен Г. В. Денисовым; образец ОМ-270 сорта Омский-16, солеустойчивый, предоставлен Б. А. Абубеке-ровым (Зап.-Сиб. Селекцентр).

Наиболее перспективными для селекции могут быть особи сахалинской, якутской и зейской популяций, так как они характеризуются большей вегетативной массой, лучшими кормовыми качествами, а растения якутской популяции — высокой степенью зимостойкости. Однако, все эти растения имеют длинные, шероховатые, более или менее изогнутые ости (рис. 3).

Упомянутые выше короткоостые формы самоопылялись в условиях экспериментального участка ЦСБС СО РАН в течение двух лет. В результате был отобран образец 511-252-06, характеризующийся очень короткими остями (2-3 мм). Эта короткоостая форма использовалась в гибриднзационной программе в следующих комбинациях (табл. 1).

Семена Б) были высеяны на экспериментальном участке ЦСБС СО РАН и в р2 отобраны формы со значительно укороченными остями (рис. 4). После двукратного самоопыления семена с этих растений высевали на Коллекционном участке индивидуального стояния для получения полной характеристики каждой отдельной особи и окончательного отбора короткоостых форм.

Гибридные растения ^ П. сибирского характеризовались промежуточной длиной ости. У растений ¥2 определяли тип наследования и количество генов, контролирующих признак безостости/остистости и сравнивали с таковым у П. длинноколосого/П. якутского.

Для установления числа генов, контролирующих этот признак, мы исходили из того, что обе родительские формы гомозиготны, т. е. в генотипе одной содержатся рецессивные, а в генотипе другой — доминантные аллели генов. Учитывая, что в ¥2 1/16 часть растений фено-типически сходна с рецессивной родительской формой, мы предположили, что различия в количестве генов, контролирующих признак безостости/остистости определяются двумя парами аллелей — двумя генами. Из 16 квадратов решетки Пиннета для дигибридного скрещивания, 15 будут содержать от 1 до 4 доминантных аллелей, и лишь только одна комбинация в нижнем правом углу представляет полный двойной рецессив.

Для получения растений ¥2 в условиях открытого грунта было посеяно по 120-150 семян из каждой гибридной комбинации с учетом того, чтобы после перезимовки можно было проанализировать не менее 100 растений. Всхожесть гибридных семян не отличалась от всхожести исходных форм и специальных методов выращивания проростков на питательных средах не требовалось.

Расщепление по признаку безостости/остистости в каждой из комбинаций Бг выглядело следующим образом (табл. 2).

Таблица 1

Гибридные комбинации и основные этапы гибридизации II. сибирского

№ Гибридная комбинация Количество Количество Количество

п/и Растение эмаскулированных опыленных созревших

Материнское Отцовское цветков цветков семян

1 ЗН-252-0С х КАг-79-31 47 26 24

2 5Н-252-06 х гЕЛ-88-06 14 10 9

3 5Н-252-06 х МС-83-26 37 26 23

4 МС-83-26 ж 5Н-252-06 21 12 11

5 5АК-91-13 х 511-252-06 6 2 2

6 5Н-252-06 х 5АК-91-13 9 7 7

7 5Н-236-06 х УЬА-84-51 12 9 9

8 У1Л-84-51 х 8Н-236-01 10 7 7

9 5Н-252-06 х УЬА-84-51 5 2 2

10 УЬА-84-51 х 511-252-06 6 6 6

Таблица 2

Мснделсвское расщепление на фенотииические классы но длине ости В р2 II. сибирского

Вариант Фенотип (ость) Наблюдаемое Ожидаемое X2

SH-252-6 х KAZ-79-31 Короткая И 6 2,153

Остальные 89 90

SH-252-6 х ZEJ-88-06 Короткая 8 7 0,613

Остальные 103 105

SH-252-6 х JAC-83-26 Короткая 9 8 1,315

Остальные 115 120

SH-252-G х SAK-91-13 Короткая 10 6 2,840

Остальные 86 90

SH-252-6 х VLA-84-51 Короткая 11 7 2,841

Остальные 110 105

Из табл. 2 видно, что 15/16 часть из всех проанализированных растений составляли длинноостые формы и формы с промежуточной длиной ости (в таблице обозначены как "остальные") и только 1/16 часть — короткоостые, т. е. отношение короткоостых форм к "остальным" равно 1 : 15. При числе степеней свободы = 1, Р = 3,84 при 0,05 значимости, т. е. величина "хи-квадрат" во всех классах была меньше теоретически ожидаемого Р. Следовательно, полученное расщепление статистически соответствует теоретически ожидаемому 15 : 1, т. е. является достоверным.

Рис. 3. Колосья родительских форм пырейника сибирского А -- БАК 91-13, В УЬЛ 84-51, С - 7, И Л 88-0(3, П - смесь семян

и, □

Рис. 4. Колосья короткоостых форм пырейника сибирского, полученные методом половой гибридизации

Л - 252-6 х SAK 91-13, В -- 252-6 х VLA 81-51, С - 252-6 х ZEA 88-06, D - смесь семян

В то время как только 1/16 часть растений проявлялась фенотипи-чески так же, как рецессивная родительская форма, у 15/16 части растений наблюдалась непрерывная изменчивость по длине остей. Статистические характеристики и результаты однофакторного дисперсионного анализа по длине ости у растений в изученных гибридных комбинациях показали, что коэффициент вариации — показатель относительной изменчивости признака у всех изученных гибридных комбинаций П. сибирского характеризуется значительной величиной (V > 20%).

Из данных дисперсионного анализа Р фактическое значительно больше Г теоретического (Рфакт. = 42,737; Рхеор. = 1,79) следует, что различия в степени проявления признака остистости обусловлены ге-нотипической дискретностью, это подтверждается также коэффициентом наследуемости: Ь2 = 0,66 (или 66%).

Поскольку этот полимерный признак контролируется, предположительно, двумя аддитивными генами, то можно выделить пять генотипов, включающих доминантные гены и встречающихся со следующей частотой:

Число доминантных генов в генотипе 4А ЗА 2А 1А 0А

Частота генотипов 1/16 4/16 6/16 4/16 1/16

Частота фенотипов 1 4 6 4 1

Анализ полученных данных показал, что в ¥2 было выявлено 6,25% (что соответствует 1/16 части) как короткоостых, так и длинноостых форм, фенотипически сходных с родительскими. Однако, распределение оставшихся растений на промежуточные три класса по величине остей оказалось затруднительным в силу некоторой корреляционной зависимости, существующей между длиной ости и колоса. Коэффициент корреляции, подсчитанный для гибридов р2 комбинации 5Н-252-6 х ЯАК-91-13 равен 0,72, т. е. больше 0 и меньше 1. Поскольку его значение близко к 1, то это означает, что функциональная зависимость между длиной колоса и длиной ости выражена значительно и ею пренебрегать не следует. Кроме того, варьирование длины остей внутри колоса также является дополнительным фактором, способствующим наличию непрерывной изменчивости по длине ости у растений П. сибирского. Тем не менее, по результатам гибридологического анализа можно заключить, что признак безостости/остистости у П. сибирского контролируется двумя несцепленными аддитивными генами.

Для сравнения был проведен генетический анализ признака безостости/остистости у растений комплекса П. длинноколосый/П. якутский. Особи последнего, включенные в гибридизацию, выращивались из семян дикорастущих растений, различающихся рядом морфологических признаков, таксономически пртвдлежащих к близкородственным

видам II. длинноколосый и П. якутский, собранных в разных эколого-географических зонах. Диагностическим отличительным признаком этих двух видов является длина остей цветочных чешуй: II. длинноколосый — безостые или с остями до 3 мм, П. якутский — ости до 12 мм (Сосуд. раст.,Сов. Дальн. Востока, 1985).

Для генетического анализа растений р2 по признаку остистости использовались семена гибрида П. якутский АМи-90-1 х П. длинноколосый ЛАС-89-22, характеризующегося наивысшей семенной фертильностыо в Р] (44,6%). Длина ости цветочных чешуй у данного гибрида не превышала 3 мм, что не полностью соответствует промежуточному фенотипу и скорее свидетельствует о неполном домшшровании признака безостости. Одной из причин этого, по-видимому, является наличие у генотипа .1АС-89-22 фактора, кнгибирующего остистость. Из 200 гибридных семян Р|, посеянных на экспериментальном участке ЦСБС СО РАН было получено 168 всходов и после перезимовки — 143 растения на стадии колошения. У растений р2 фиксировались признаки "длинноостые чешуи/безостые чешуи" и "промежуточные" — фенотип гетерозиготных растений с длиной ости 3 мм.

Индивидуальный анализ 143 растений показал, что особей с короткими и длинными остями было примерно поровну, в то время как с промежуточной длиной ости — вдвое больше, т. с. справедливо соотношение 1:2:1. Это означает, что признак безостости/остистости у П. длинноколосого/П. якутского котролируется одним геном с неполным доминированием.

Таким образом, признак безостости/остистости у П. сибирского контролируется двумя несцепленными аддитивными генами, в то время, как у П. длинноколосого/П. якутского — одним геном с неполным доминированием.

Одним из факторов, обогащающих генофонд растений новыми комбинациями наследственных структур и способствующих увеличению естественного биологического разнообразия, является метод половой гибридизации и вовлечение в интродукционный и селекционный процесс всё большего количества дикорастущих растений, в первую очередь, редких и исчезающих видов и отдельных форм с целыо сохранения ценных генотипов. Преимуществом метода искусственной половой гибридизации является включение в процесс биотипов и форм с желаемыми признаками и получение большого разнообразия форм с различным сочетанием признаков, в том числе, жизненно важных, таких, как семенная продуктивность и устойчивость к неблагоприятным факторам среды (морозам, засухе, вредителям). Это играет большую роль в сохранении как редких и исчезающих видов, так и отдельных биотипов и форм, представляющих научный и практический интерес.

выводы

1. Установлено, что наиболее полным и выраженным спектром нзоферментов эстераз у особей П. сибирского характеризуются трехдневные проростки. Суммарный спектр нзоферментов эстераз горноалтайской популяции П. сибирского представлен 16-ю изоформами, разделенными на группы Л, В, С и D в соответствии с относительными скоростями миграции.

2. Несмотря на то, что каждая популяция П. сибирского характеризуется специфическим компонентным составом проламинов и различной изменчивостью, во всех изученных популяциях этого вида были обнаружены наиболее постоянные компоненты в области около 58 kD, которые можно рассматривать как консервативные субъединицы вида.

3. Сравнительное электрофорстическое изучение проламиновой фракции и субъеднниц глютелина запасных белков эндосперма у видов пырейника с разной геномной структурой показало, что наличие того или иного генома накладывает отпечаток на распределение компонентов проламииа на спектре, что выражается для разных групп видов различием в геномной специфичности, выявляемой посредством электрофореза запасных белков эндосперма. Последняя наиболее выражена для некоторых Sil- и SYP-геиомных видов, несколько меньше — для SSY- и незначительно — для остальных, особенно, для SY-геномных видов.

4. Изоферменты эстераз можно использовать в качестве маркеров на видовом уровне, а проламины и глютелины — для идентификации отдельных генотипов, для выявления внутрнпопуляционной и внутривидовой изменчивости, межвидовых различий и геномной специфичности в роде пырейник.

5. Сходное строение и размеры зерновок, а также биохимические свойства проламинов позволяют применять модифицированный нами метод электрофоретического разделения компонентов проламииа, как единый для всех многолетних представителей трибы Пшеницевые. Разрешающей способности метода достаточно, чтобы анализировать половпну зерновки, а оставшуюся часть вместе с зародышем проращивать и получать взрослое растение с известным исходным составом проламнповых компонентов спектра.

6. Общее распределение проламиновых компонентов у изученных образцов соответствует предложенной выше номенклатуре, включающей разграничение на зоны альфа, бета и гамма. Внутривидовая многокомпонентная совокупность проламиновых белков П. сибирского

представляет собой непрерывный спектр изменчивости по электрофо ретической подвижности. Поэтому наиболее адекватный способ обо значения и учета отдельных компонентов в настоящее время возможе! через точную фиксацию величины ОЭП путем сравнения со стандарт ным спектром-

7. Методом половой гибридизации в сочетании с белковым марки рованием получены короткоостые формы у пяти популяций П. сибирского и двух сортов, выведенных на его основе. Наиболее перепек тивными для селекции могут быть короткоостые формы, полученные I результате гибридизации с особями сахалинской, якутской и зейско1 популяций.

8. В результате генетического анализа признака безостости/остнс тости было установлено, что у П. сибирского этот признак контролируется двумя несцепленными аддитивными генами, в то время как } П. длинноколосого/П. якутского — одним геном с неполным доминированием.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Тарасенко Н. Д., Агафонова О. В., Агафонов А. В. Генетические аспекты селекции кормовых растений. — Н.: Наука, 1985.— 119 с.

Агафонова О. В., Агафонов А. В. Использование электрофоретиче-ских спектров ферментов и проламннов для генетического маркирования дикорастущих кормовых элимоидных злаков // Тез. докл. Молекулярные механизмы генетических процессов, Москва, 1987. - С. 108-109.

Агафонова О. В., Агафонов А. В. Возможность белкового маркирования дикорастущих кормовых злаков с использованием электрофо-ретических спектров ферментов и проламннов // Тез. докл. V съездг ВОГиС им. Вавилова, Москва, 1987,- Т. IV.- Ч. 3,- С. 11-12.

Агафонов А. В., Агафонова О. В. Способ идентификации генотнпог многолетних злаков трибы Пшеницевые (ТгШсеае) // А. с. СССР № 1546022,- 1989.- 4 с.

Агафонов А. В., Агафонова О. В. Внутривидовая изменчивости проламннов пырейника сибирского, выявляемая методом одномерной электрофореза // Генетика,— 1990.— Т. 26, № 2.— С. 304-311.

Агафонов А. В., Агафонова О. В. Электрофоретические спектры проламина у образцов пырея бескорневищного различного происхождения // Генетика,- 1990. - Т. 26, № 11.- С. 1992-2001.

Агафонов А. В., Агафонова О. В. Проламины многолетних злаков трибы Triticeae Dummort., как генетические маркеры внутривидовой изменчивости и микроэволюционных процессов в природе и при интродукции / / Тез. IV Всесоюзного совещания по хемосистематике и эволюционной биохимии высших растений, Москва, 1990.— С. 6~8.

Агафонова О. В., Агафонов А. В. Повышение разрешающей способности электрофоретического метода для таксономических и генети-ко-селекционных исследований многолетних злаков трибы Пшеиице-вые (Triticeae).- 1991. Деп. ВИНИТИ № 2467,- В91,- 11 с.

Agafonov A., Agafonova О. About the necessity of establishment of the prioretic criterions of Triticeae species // Abstr. of 1st International Triticeae symposium, Helsinborg, Sweden, 1991. Abstr. LI.4.

Agafonova O., Agafonov A. Prolamine-gluteline complex of endosperm storage protein as an indication of microevolutional processes in Triticeae grasses // Abstr. of 1st International Triticeae symposium, Helsinborg, Sweden, 1991.- P. 16.

Агафонов А. В., Агафонова О. В. SDS-электрофорез белков эндосперма у представителей рода пырейник (Elymus L.) с различной геномной структурой /,/ Сибирский биологический журнал.— 1992. - Вып. 3,- С. 7-12.

Agafonov А. V., Agafonova О. V. The strategy of Reproductive Gene Pools (RGP) and Introgressive Gene Pools (IGP) in the biosystematic treatment of Elymus species // Abstr. of VIII International Wheat Genetics symposium, Beijing, China, 1993. — P. 47.

Agafonova О. V., Agafonov A. V. SDS-Electrophoresis of endosperm protein in Elymus species with different genomic constitution // Abstr. of VIII International Wheat Genetics symposium, Beijing, China, 1993. — P. 20.

Bennett J. II., Agafonov A. V., Agafonova О. V., Jensen К. B. Che-motaxonomy of Triticeae grasses: Characterization of true breeding lines and hybrid crosses // Abstr. of 2nd International Triticeae symposium, Logan, Utah, USA, 1994. - P.27.

Agafonova О. V., Agafonov A. V., Kostina E. V. Are there three levels of endosperm protein electrophoretic specificity in Elymus species? // Abstr. of 2nd International Triticeae symposium, Logan, Utah, USA, 1994,- P. 40.

Агафонова О. В., Агафонов А. В. Принцип Рекомбинационных (РГП) и Интрогрессивных (ИГП) Генпулов в биосистематических и генетико-селекционных исследованиях рода Пырейник (Elymus L.) // Тез. I (VI) съезда ВОГиС им. Вавилова (Саратов, декабрь 1994) // Генетика (приложение).— 1994. — Т. 30.— С. 4.

Agafonov A. V., Agafonova О. V. The Principle of Recombination Gene Pools (RGP) and Introgression Gene Pool (IGP) in the biosystem-atic treatment of Elymus species / / Abstr. of 2nd International Triticeae symposium, Logan, Utah, USA, 1994. — P. 41.

Agafonova О. V. Are there three levels of endosperm protein electro-phoretic specificity in Elymus Species? // Proceeding of the 2nd International Triticeae Symposium, Logan, Utah, USA. 1994.— P. 261-264.

Агафонова О. В. Использование нзоферментов эстераз для маркирования некоторых стадий онтогенеза в популяциях пырейника сибирского // Тез. Междунар. Симпозиума по онтогенезу у растений, Киев. 1995.- С. 6.

Агафонова О. В. Изучение внутривидового потенциала у пырейника сибирского методами половой гибридизации и белкового маркирования. Всесоюзн. конф. // Тез. конф. по проблемам изучения растительного покрова Сибири, Томск.— 1995.— С. 230.

Агафонов А. В., Агафонова О. В., Саломон Б., Лу Б.-Р. Репродуктивная совместимость биотопов пырейника длинноколосого (Elymus macrourus) и пырейника якутского (Elymus jacutensis) и генетический анализ диагностического признака остистости // Сибирский экологический журнал.— 1996.— № 6.— С. 527-533.

Агафонова О. В. Получение короткоостых форм методом половой гибридизации и генетический анализ признака безостости/остистости у пырейника сибирского // Препринт, Новосибирск,— 1996.— 27 с.

Агафонова О. В. Генетический анализ признака короткоостости у пырейника сибирского // Докл. Акад. Паук.— 1996.— Т. 352.— № 4.

Агафонова О. В. Метод половой гибридизации и его значение для увеличения биологического разнообразия / / Сибирский экологический журнал,- 1997,- № 1,- С. 77-80.