Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональные особенности организма, регенераторный потенциал кожи и пути их коррекции у белых крыс заключительного периода онтогенеза

ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональные особенности организма, регенераторный потенциал кожи и пути их коррекции у белых крыс заключительного периода онтогенеза"

На правах рукописи

005012313

ПОХОДЕНКО Мария Витальевна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ

ОРГАНИЗМА, РЕГЕНЕРАТОРНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ КОЖИ И ПУТИ ИХ КОРРЕКЦИИ У БЕЛЫХ КРЫС ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНОГО ПЕРИОДА ОНТОГЕНЕЗА

03.03.05 - биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 И АР т

Ставрополь - 20]2

005012313

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный университет» и Южном научном центре Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор Тимченко Людмила Дмитриевна.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент Порублев Владислав Анатольевич;

доктор биологических наук, доцент Чистяков Владимир Анатольевич.

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Брянский государственный университет имени академика И.Г. Петровского».

Защита диссертации состоится_1 ¡м&рн^О'_2012 г.

в /4 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корп. 2, комн. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан_/6 Ср_2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета / Д ^ Ржепаковский И.В.

e-mail: labini@stavsu.ru

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Процесс старения возникает на самых ранних этапах становления организма и ведет к недостаточности физиологических функций, гибели клеток, ограничению приспособительных возможностей организма, снижению их надежности, развитию возрастной патологии и увеличению вероятности смерти (Фролькис В.В., 1969; Виленчик М.М., 1987; Чеботарев Д.Ф., 2001; Столбовская О.В., 2006; Dilman V.M., 1994; Asok В.Т., 1999; Wrona D, 2006). Одним из основных вопросов, который интересует исследователей, занимающихся изучением особенностей старения, является выяснение изменчивости регенерации с возрастом (Сидорова В.Ф., 1976; Полежаев Л.В., 1977; Лиознер Л.Д., 1982; Карлсон Б.М., 1986; Солопаев Б.П., 1990; Курилов И.Н., 2009 и др.), тем более, что многочисленные сведения по этому вопросу очень разноречивы.

В настоящее время изучены общие механизмы и тонкие звенья патогенеза биологического старения. Однако нет единого мнения на то, какие механизмы важнее, и когда они вступают в действия, а также как они сочетаются между собой. Поэтому для полноценной и достоверной оценки процесса старения необходимо комплексное изучение показателей, отражающих не только интенсивность регенераторных процессов, но и их регуляторные механизмы (Ходосова И.А., 1976; Анисимов В.Н., 1997; Войтенко В.П., 1999; Донцов В.И., 2000; Этинген Л.Е., 2003).

Однако в доступной литературе отсутствуют четкие критерии морфо-функциональной полноценности организма и уровня регенерации в период старости. Это касается практически всех млекопитающих, в частности белых крыс, являющихся классической моделью в биологии для исследований многочисленных процессов, в том числе влияния различных биологических активных препаратов, рассматриваемых в качестве потенциальных геронтологических средств.

Большое число исследователей, занимающихся изучением регенерации в процессе старения, отводят важную роль коже, которая является экзоорганом, наиболее подверженным влиянию повреждающих факторов и ее возрастные изменения отчетливо видны (Мяделец О.Д., Адаскевич В.П., 1997; Афанасьев Ю.И, 1999; Коргунова Р.В., 2005; Мирзоева П.Н., 2008; Auger F.A., 2009).

Поскольку регенерация кожи в заключительном этапе онтогенеза обусловлена многочисленными регуляторными механизмами, находящимися в тесной взаимосвязи с морфофункциональным гомеостазом, то для обеспечения функциональной активности кожных покровов в старости, наиболее рациональным является изыскание путей влияния на сложный комплекс механизмов, регулирующих регенераторную активность (Ткаченко С.Б., Потекаев H.H., 2003; Смирнова И.О., 2004). При создании лекарственных препаратов с такими свойствами целесообразным является использование объектов, богатых биологически активными веществами, среди которых приоритетными являются препараты на основе эмбриональных тканей млекопи-

тающих и птиц, адекватно влияющих на метаболические системы стареющего организма (Обухова Л.К., 1975; Западнюк В.И., 1990; Анисимов В.Н., 2000; Рыжак Г.А., 2004; Курилов И.Н., 2009). В то же время, имеются сообщения о новых эффективных биологически активных препаратах на основе эмбриональной ткани птиц (Ржепаковский И.В., 2005; Маханьков О.В., Сумеркина В.А., 2006; Тимченко Л.Д., 2007, 2008, 2009; Курилов И.Н., 2009; Munoz-Sanjaun, Kay Simandl В., Fallon J.F., Nathans J., 1999), которые, хотя и представляются перспективными, но не подкреплены сведениями об их использовании в период старости. Однако, при применении любых препаратов в заключительном периоде онтогенеза, даже комплексы из естественных источников могут оказывать непредвиденное, в том числе отрицательное воздействие, что требует всестороннего изучения.

Несмотря на то, что потенциал эмбриональных тканей при изыскании ге-ропротекгорных, в том числе регенеринстимулирующих средств, еще не исчерпан, их разработка и применение для функциональной коррекции в заключительном периоде онтогенеза возможны лишь на этиопатогенетической основе, требующей всестороннего изучения морфофункциональных показателей организма и регенераторного потенциала кожи экспериментальных животных.

Цель исследования: изучение морфофункциональных показателей организма, регенераторного потенциала кожи старых крыс и разработка путей их рациональной коррекции.

Задачи исследования:

1) изучить морфофункциональные особенности организма белых крыс в старческий период онтогенеза с использованием гематологических, биохимических, цитохимических и иммунологических показателей;

2) оценить регенераторный потенциал кожи животных в заключительном периоде онтогенеза;

3) изучить динамику морфофункциональных показателей организма крыс в старости под влиянием нового препарата «Биокомфорт»;

4) исследовать репаративную регенерацию кожи старых крыс под влиянием биологически активного препарата «Биокомфорт».

Научная новизна исследования.

Впервые с учетом комплекса показателей (гистологических, гематологических, биохимических, цитологических, цитохимических, иммунологических) дана оценка регенераторной способности кожи белых крыс во взаимосвязи с морфофункциональным статусом их организма в старческий период онтогенеза. Установлены нормативные значения изученных показателей для белых крыс в период старости.

Дано теоретическое и экспериментальное обоснование этиопатогенетической коррекции морфофункциональных показателей организма и уровня регенерации кожи у старых крыс с помощью нового биологически активного препарата «Биокомфорт».

Впервые с учетом комплекса показателей (гематологических, биохимических, цитохимических и иммунологических) подтверждено положи-

тельное влияние препарата «Биокомфорт» на организм крыс заключительного периода онтогенеза.

Доказана регенеринстимулирующая эффективность препарата «Биокомфорт» на основе активированной эмбрионально-яичной массы и подтверждено преимущество его применения у старых крыс по сравнению с традиционными средствами. Приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом РФ № 2433171 «Способ получения биологически активной субстанции из эмбрионально-яичной массы для приготовления противоожоговой пластины и противоожоговая пластина на его основе».

Теоретическая и практическая значимость исследования.

Полученные сведения о широком комплексе показателей организма (гематологических, биохимических, цитохимических, иммунологических), а также установленная коррелятивная зависимость между ними и критериями регенераторной способности кожи белых крыс, углубляют и расширяют представление о морфофункциональных особенностях организма и регенераторном потенциале кожи в заключительном периоде онтогенеза и вносят теоретический вклад в биологию.

На примере белых крыс дано экспериментальное обоснование целесообразности применения нового биологически активного препарата «Биокомфорт» в заключительном периоде онтогенеза для повышения физиологической активности организма, в том числе для восстановительной способности кожи, что является основанием для дальнейших доклинических и клинических испытаний с целью использования этого препарата для животных и человека.

Эффективность применения препарата «Биокомфорт» подтверждена на животных в участковой ветеринарной лечебнице № 2 г. Ставрополя.

Результаты исследования используются в научно-исследовательской и практической работе отдела прикладной биологии научно-исследовательского института биологии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет», а также в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторных занятий по биологии развития и размножения, гистологии, эмбриологии и физиологии на медико-биолого-химическом факультете в Ставропольском государственном университете, Ставропольском государственном аграрном университете, Ставропольском филиале Московского государственного гуманитарного университета им. М.А. Шолохова, Самарской государственной сельскохозяйственной академии.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на третьей, четвертой, пятой, шестой и седьмой ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (г. Ростов-на-Дону, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011), где доклады автора отмечены дипломом лауреата, дипломом первой, второй и третьей степени, тремя почетными грамотами; на Всероссийском смотре-конкурсе научно-технического творчества студентов высших учебных заведений «ЭВРИКА-2007» (г. Новочеркасск, 2007 г.), где доклад отмечен дипломом

третьей степени; на VI Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (г. Астрахань, 2008 г.); на научной конференции «Университетская наука -региону» (Ставропольский государственный университет, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011); на международной научно-практической конференции посвященной 30-летию КБГСХА им. В.М. Кокова (г. Нальчик, 2011 г.).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Комплекс изученных морфофункциональных показателей и характер коррелятивной зависимости между ними объективно отражают особенности морфофункционального статуса и регенераторного потенциала кожи белых крыс в заключительном периоде онтогенеза.

2. Биологически активный препарат «Биокомфорт» оказывает выраженное стимулирующее действие на морфофункционапьные показатели организма и репаративную регенерацию кожи белых крыс в период старости.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 3 из них - в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени, а также получен патент РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах компьютерного набора, иллюстрирована 22 фотографиями, в том числе 19 микрофотографиями, 6 диаграммами, 14 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и приложений. Список использованной литературы содержит 310 источников, в том числе 48 работ зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная работа выполнена на кафедре общей биологии, в проблемной научно-исследовательской лаборатории экспериментальной иммуно-морфологии, иммунопатологии и иммунобиотехнологии Ставропольского государственного университета и на базовой кафедре иммунологии и микробиологии Южного научного центра Российской академии наук при СГУ в течение 2007-2011 гг. Цитохимические и иммунологические исследования проведены на базе Ставропольского научно-исследовательского противочумного института.

В качестве подопытных животных использовали самок белых крыс стока Вистар с исходной массой тела 220-250 г. При формировании возрастных групп учитывали рекомендации С.М. Ланга и Р.П. Уилсона (1993), в соответствии с которыми в онтогенезе крыс выделяют репродуктивный (5-18 месяцев) и заключительный (19-40 месяцев) периоды. Экспериментальная работа осуществлялась в два этапа. На первом этапе (а) проводилась оценка морфофункциональных показателей организма и регенераторного потенциала кожи у крыс в возрасте 24 месяца, в количестве 100 животных. Для объективной оценки ве-

личин показателей, установленных у старых крыс, сравнивали с аналогичными показателями у крыс (п=100) в репродуктивном возрасте (9 месяцев).

На втором этапе (б) эксперимента исследовали влияние препарата «Биокомфорт» на интенсивность морфофункциональных процессов организма и репаративной регенерации кожи у крыс в возрасте 24 месяца. Для этого было создано 3 группы, по 30 крыс в каждой. Первая группа (16) включала в себя животных, получавших препарат «Биокомфорт» перорально в дозе 0,1 мл/кг в течение 10 дней. Вторую группу (116) составили животные, которым скарифицировали кожу в области загривка, затем в течение 10 дней скарификат обрабатывали новым препаратом «Биокомфорт». В третьей группе (Шб) животным также скарифицировали кожу в области загривка, но рану обрабатывали официнальным препаратом - мазью «Заживин». Контролем для всех трех групп служили показатели, полученные до опыта.

Результаты опыта оценивали у животных первой (б) группы на 10 сутки, крыс второй (б) и третьей (б) групп на 2-е, 4-е, 10-е сутки. Крыс умерщвляли путем декапитации.

Гематологические и биохимические исследования крови проводились с использованием общепринятых методик (Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики, 2004). Общий белок сыворотки крови определяли колориметрическим биуретовым методом с использованием биохимического фотометра Stat fax 1904+R и набора реагентов ПРОТЕИН-НОВО (В-8012).

Активность миелопероксидазы в мазках крови определяли по Грехему -Кноллю (Graham G.: Цит. по Бутенко З.А., 1974), сукцинатдегидрогеназы -по Р.П. Нарциссова (1969), щелочной фосфатазы - по Л. Кэплоу (1955), кислой фосфатазы - по А. Гольдбергу и Т. Барка (1965), катионных белков -по В.Е. Пигаревскому (1978).

Оценку иммунного статуса проводили с использованием метода непрямой иммунофлюоресценции (Медицинская иммунология, 1999, т. 1, № 5).

У животных второй (б) и третьей (б) групп отбирали кожу в области ска-рификата на границе со здоровой тканью. Далее проводили гистологическое исследование кожи по общепринятой методике с окраской гематоксилин-эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону (Сулейманов С.М. и др., 2000).

На гистологических препаратах определяли митотический индекс эпителиальных клеток (Сычёва Л.П., 2007; Rakic S., Zecevic N., 2000).

Ядрышковые организаторы выявляли в эпителиальных клетках с помощью нитрата серебра (Trendelenburg M.F., 1996).

Количество апоптических и некротических клеток в коже определяли по методике A.A. Абдувалиева и М.С. Гильдиевой (2006).

Результаты экспериментов подвергали вариационно-статистической обработке с использованием программы Primer of Biostatistics (Version 4.03) (Арешидзе Д.А., 2003).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Морфофункциональные показатели организма старых крыс

В процессе гематологических исследований (табл. 1) установлено, что количество эритроцитов у крыс в старческий период составляет 2,97±0,41 (Р<0,05), что на 25,3% меньше чем у крыс репродуктивного этапа онтогенеза. При оптической микроскопии не выявлено каких-либо морфологических особенностей эритроцитов у старых животных. Уровень гемоглобина у старых животных по сравнению с уровнем гемоглобина у крыс репродуктивного возраста меньше на 8,7%. Цветовой показатель у крыс в заключительном периоде онтогенеза выше на 22%, а содержание гемоглобина в одном эритроците ниже на 10,9% по отношению к величинам этих же показателей в репродуктивном периоде жизни.

Таблица 1

Содержание эритроцитов и гемоглобина в крови белых крыс в заключительном и репродуктивном периодах онтогенеза, (М±т)

Группы, п=100 Эритроциты, 1012/л Гемоглобин, г/л Среднее содержание гемоглобина в одном эритроците, пг Цветовой показатель

1а 2,97±0,41* 109,10±3,30* 36,70+1,63* 1,10+0,05*

На 3,98±0,32 119,40*3,12 41,20±1,51 0,90±0,03

Примечание:

1а группа - крысы заключительного периода онтогенеза; Па группа - крысы репродуктивного периода онтогенеза; *(Р<0,05) - в сравнении со Па группой.

1а группа

ЕЭ лимфоциты ШЗ базофилы

Па группа

Ьа эозинофилы §¡3 С/Н ЕЭ П/Н Ш моноциты

Рис. 1. Лейкоцитарная формула крыс в заключительном (1а группа) и репродуктивном (Па группа) этапах онтогенеза.

В заключительном этапе онтогенеза количество лейкоцитов на 15,1% меньше (рис. 1), чем количество лейкоцитов у молодых. У животных в заключительном периоде онтогенеза количество лимфоцитов ниже на 11,6%, базофилов - на 44,4%, эозинофилов - на 48,3%, моноцитов - на 42,9%, число палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов - на 47,5% и 16,1%, соответственно, по сравнению со значениями этих же показателей у крыс в репродуктивном возрасте.

Количество общего белка в заключительный этап онтогенеза на 11,3 г/л ниже по сравнению с уровнем общего белка, отмеченным у крыс репродуктивного возраста.

Биохимические исследования позволили установить, что в старости количество общего белка в сыворотке крови у крыс ниже на 11,14%, количество белков альбуминовой фракции меньше на 15,65±0,57 г/л, ß-глобулинов - на 3,45±0,1 г/л (Р<0,05), а количество а- и у-глобулинов больше на 20,8% и 45%, соответственно, по сравнению с величинами этих показателей в репродуктивном возрасте.

Анализ иммунологических результатов (табл. 2) позволил выявить, что в заключительном периоде жизни, в сравнении с репродуктивным, число CD3 клеток ниже на 4,68%, CD4 - на 2,61%, CD8a - на 1,88% и CD19 - на 2,06%.

Таблица 2

Популяции и субпопуляции лимфоцитов в крови у крыс в заключительном и репродуктивном периодах онтогенеза, (М±ш)

Группы, п=100 CD3, % CD4, % CD8a, % CD19, %

1а 50,92±2,63* 32,04±0,94* 18,80±0,66* 41,60±0,92*

IIa 55,60±1,46 34,65±1,35 20,68±0,79 43,66±1,07

1а группа - крысы заключительного периода онтогенеза; IIa группа - крысы репродуктивного периода онтогенеза; *(Р<0,05) - в сравнении со IIa группой.

При цитохимической оценке активности нейтрофилов крови выявлено, что у старых крыс в сравнении с молодыми уровень ЩФ больше на 46,5%, а активность MITO, СДГ и КБ ниже на 12,5%, 40% и 7,9%, соответственно. Полученные результаты, по мнению A.B. Ягоды и Локтева H.A. (2005), могут свидетельствовать о развитии в заключительном периоде жизни гипоксии, а также об активизации воспалительной реакции, что сопровождается увеличением фагоцитарной активности нейтрофилов, наблюдающейся на фоне снижения их общего числа.

Все установленные значения показателей старых крыс, оставались в крайних пределах нормативных значений в соответствии с указаниями С.М. Ланга и Р.П. Уилсон (1993).

Особенности регенерации кожи крыс в заключительном периоде онтогенеза

В результате гистологических исследований установлено, что у старых крыс, по сравнению с крысами репродуктивного возраста, толщина эпидермиса и дермы меньше на 15% и 9,2%, соответственно, слои эпидермиса выражены нечетко, межсосочковые выросты сглажены (рис. 2). Пучки кол-лагеновых волокон местами утолщены, иногда рыхлые, как в верхних, так и в нижележащих отделах дермы (рис. 3), количество межуточного вещества в дерме уменьшается. Структура эластических волокон местами нарушена, в сосочковом и сетчатом слоях дермы эластические волокна обнару-

живаются в виде мелких, утолщенных, фрагментированных структур. Комплексная оценка всех показателей кожи старых крыс позволяет нам судить о ее структурных изменениях в заключительный этап онтогенеза.

При проведении цитологического исследования выявили, что у старых крыс митотический индекс, отражающий митотическую активность эпителия, снижен на 25%, а апоптический и некротический индексы всех структурных элементов кожи повышены в 2,5 и 2,7 раза, соответственно, в сравнении с уровнем этих же показателей у молодых животных. В старости уровень мито-тического индекса эпителиальных клеток кожи к апоптозу составил 1:1,6; а к некрозу - 1:1,3. Такая динамика свидетельствует о смещении баланса между процессами пролиферации и апоптоза в сторону запрограммированной клеточной гибели. По нашему мнению, этот факт указывает, что с возрастом повышается уровень факторов инициирующих апоптическую гибель.

Рис. 2. Эпидермис кожи со сглаженными Рис. 3. Коллагеновые волокна в дерме ко-межсосочковыми выростами у старой крысы. жи у старой крысы.

Окраска гематоксилин-эозином, х400. Окраска по Ван-Гизону, х 100.

Для прогнозирования степени влияния тех или иных физиологических механизмов на интенсивность процессов регенерации, характерных именно для старческого периода жизни, проведен коррелятивный анализ между апоптическим и митотическим индексами с изученными морфофункцио-нальными показателями организма.

Наиболее тесная положительная коррелятивная зависимость апоптическо-го индекса установлена с некротическим индексом, кислой и щелочной фос-фатазами, отрицательная - с катионными белками нейтрофилов. Митотический индекс имеет положительную корреляцию с количеством лейкоцитов, общим белком, с катионными белками нейтрофилов, Т- и В-лимфоцитами (СТО, СБ 19) и отрицательную с кислой и щелочной фосфатазами нейтрофилов. С другими показателями выявлены менее тесные коррелятивные взаимосвязи. Установленная коррелятивная зависимость позволила выявить значимость каждого исследуемого показателя при оценке интенсивности регенерации, что также обусловливает их этиопатогенетическую значимость при выборе наиболее рационального метода коррекции.

Характеристика нового биологически активного препарата «Биокомфорт»

В связи с этиопатогенетическими потребностями в коррекции морфо-функциональных показателей организма и репаративной регенерации кожи в период старости, нами разработан и применен препарат «Биокомфорт» на основе активированной эмбрионально-яичной массы.

Учитывая сложность механизмов старения, а также коррелятивные связи между различными показателями у старых крыс, мы сделали вывод, что препараты, используемые в старости должны обладать широким спектром действия: регенеринстимулирующим, антиоксидантным, адаптогенным и иммуностимулирующим. Поэтому в разрабатываемый препарат дополнительно включили следующие компоненты: экстракт каллизии душистой (антиоксидантное, адаптогенное и регенеринстимулирующее действие), янтарная кислота (антиоксидантное действие), амарантовое масло (иммуностимулирующее, регенеринстимулирующее и противоопухолевое действие) и желатин - в качестве формообразующего средства.

С учетом особенностей составных компонентов, предлагаемый нами препарат «Биокомфорта имеет сложный, сбалансированный химический состав и представляет высокую физиологическую ценность, что позволяет прогнозировать его положительный эффект на организм старого животного. Однако, учитывая высокую чувствительность организма в заключительном периоде онтогенеза к действию различных химических соединений, требуются дополнительные исследования по специфике влияния препарата в период старости.

Влияние препарата «Биокомфорт» на морфофункциональные показатели организма старых крыс

Животные опытной группы в течение всего эксперимента были активными без признаков каких-либо видимых нарушений общего состояния здоровья. Заметных различий в количестве потребляемой пищи и воды у животных также не было установлено в сравнении с животными до опыта.

Анализ результатов исследования влияния препарата «Биокомфорт» на гематологические показатели (табл. 3) старых крыс свидетельствует об увеличение числа эритроцитов в 1,5 раза, уровня гемоглобина в 1,08 раза относительно значений этих показателей до опыта. Однако у крыс после опыта цветовой показатель и уровень содержания гемоглобина в одном эритроците снизились на 28,5% и 29,1%, соответственно.

Под влиянием препарата «Биокомфорт» у старых животных отмечено увеличение содержания лейкоцитов (табл. 3) крови на 16,7%, что может указывать как на иммуностимулирующую активность препарата, так и быть следствием обогащения стандартного рациона белками и витаминами, входящими в его состав, вызывая тем самым физиологический лейкоцитоз. Увеличение количества лимфоцитов 16,6% и нейтрофилов на 33,3% (в пределах установленной нормы) указывает на повышение иммунного статуса старых крыс, получавших исследуемый препарат в сравнении с данными значениями до опыта. Об этом также свидетельствует увеличение моноцитов крови у крыс под влиянием препарата «Биокомфорт» в 10 раз, что свидетельствует о пополнении ре-

зерва потенциальных макрофагов для выполнения полноценной фагоцитарной функции и усилению механизмов неспецифического иммунного звена.

Сравнительный анализ уровня общего белка и соотношения альбуминовой фракции к глобулиновой в сыворотке крови животных под влиянием препарата «Биокомфорт» в сравнении с аналогичными показателями до опыта выявил существенные различия. В группе животных, которым применяли препарат происходит увеличение количества общего белка (на 9,1%), некоторых его фракций (альбуминов - на 9,6% и у-глобулинов - на 29,2%) и альбумин-глобулинового соотношения на 4,35 % {табл. 4) в сравнении с этими значениями до опыта. Этот факт совместно с результатами гематологических исследований отражает модулирующее действие БАВ препарата «Биокомфорт» на состояние метаболических процессов и иммунной функции животных в период старости.

Таблица 3

Гематологические показатели старых крыс при пероральном применении препарата «Биокомфорт», (М±ш)

Группы, п=30 Эрит-ты, 1012/л Hb, г/л Hb, в 1 эр-те., пг Цв- ток. Лейко циты, ю7л Лим фоци-ты, 109/л Базо-филы, 109/л Эози-нофи-лы, 109/л Нейтро филы, 109/л Моноциты, 109/л

П С

до опыта 2,97± 0,32 109,10 ±2,90 36,70± 2,90 1,10± 0,10 3,59 ±0,15 2,47 ±0,10 0,17 ±0,04 0,13 ±0,09 0,05 ±0,01 0,86 ±0,02 0,01 ±0,002

16 4,48± 0,59* 117,60 ±3,02* 26,25± 1,81* 0,78± 0,10* 4,13 ±0,19* 2,88± 0,15* 0,08 ±0,01* 0,12 ±0,07 0,08 ±0,01* 0,77 ±0,03* 0,10± 0,03*

Примечание:

16 группа - использовали препарат «Биокомфорт»;

*(Р<0,05) - в сравнении с показателями, установленными до опыта.

Таблица 4

Содержание общего белка и его фракций в сыворотке крови крыс в заключительном периоде онтогенеза под влиянием препарата «Биокомфорт», (М±ш)

Группы, п=30 Общий белок г/л Альбумины г/л а-глобулины г/л ß-глобулины г/л у-глобулины г/л Н

до опыта 78,24±2,42 32,18±1,70 21,48±1,84 15,45±1,83 9,13±0,56 0,69

16 86,06±2,86* 35,49±1,34* 23,54±1,08 15,23±1,59 11,80±1,05* 0,72

Примечание:

16 группа - использовали препарат «Биокомфорт»;

Н - альбумин-глобулиновое соотношение;

*(Р<0,05) - в сравнении с показателями, установленными до опыта.

При цитохимическом исследовании нейтрофилов крови в группе, где применяли препарат «Биокомфорт», наблюдается снижение (в пределах, установленной нами нормы) уровня щелочной на 15,3 %, на фоне увеличения миелопероксидазы, катионных белков и сукцинатдегидрогеназы на 7%, 10,5% и 14,2%, соответственно, по отношению к уровню этих ферментов, зафиксированных до опыта.

Иммунологические исследования показали, что под влиянием препарата «Биокомфорт» у старых животных происходит увеличение (в пределах установленных нами нормативных величин для старых крыс) количества Т-клеточной популяции (СБЗ - на 4,89%, СЫ - на 4,31%, СБ8а - на 2,33%), а также препарат положительно влияет на гуморальное звено иммунитета, что подтверждается увеличением количества В-лимфоцитов (СО 19 - на 2,38%) на фоне повышения у-глобулинов (табл. 5).

Таблица 5

Динамика популяций и субпопуляций лимфоцитов крови старых крыс под влиянием препарата «Биокомфорт», (М±т)

Группы,п=30 СОЗ, % С04, % С08а. % СП 19, %

до опыта 51,42±1,63 29,14±1,02 20,28±0,75 40,96±0,85

16 56,31± 1,46* 33,45±1,35* 22,61±0,84* 43,34±0,81*

Примечание:

16 группа - использовали препарат «Биокомфорт»;

*(Р<0,05) - в сравнении с показателями, зафиксированными до опыта.

Влияние препарата «Биокомфорт» на регенерацию кожи старых крыс

Под влиянием препарата «Биокомфорт» в сравнении с традиционно используемыми средствами, уже к 4-м суткам происходит повышение интенсивности пролиферативной активности элементов эпителиальной и соединительной ткани, а также восстановление микроциркуляторного русла (рис. 4) и снижение интенсивности гиперемии сосудов. К 10-м суткам у животных, где использовали препарат «Биокомфорт» толщина эпидермиса на 15,7% (рис. 5), а толщина дермы на 9,5% выше результата, установленного на эти же сутки в группе у животных, которым применяли препарат «Заживин».

Рис. 4. Кровеносные сосуды сетчатого слоя дермы крыс под влиянием препарата

«Биокомфорт» на 4-е сутки опыта. Окраска гематоксилин-эозином, *400.

Для углубленной оценки интенсивности митотической активности клеток базального слоя эпителия кожи в процессе регенерации под влиянием препарата «Биокомфорт», использовали метод подсчета ядрышковых орга-

Рис. 5. Восстановленный эпидермис на месте

раневого дефекта у крыс под влиянием препарата «Биокомфорт» на 10-е сутки опыта. Окраска гематоксилин-эозином, хЮО.

низаторов, позволяющий выявить ранние признаки митоза на различных этапах репаративного процесса.

У старых крыс под влиянием препарата «Биокомфорт» уже на 2-е сутки установлено увеличение количества гранул серебра в ядрах эпителиальных клеток кожи. При этом зафиксированное значение на 21,1% выше результата, выявленного у животных, которым применяли препарат «Заживин». К 10-м суткам после нанесения скарификата под влиянием препарата «Биокомфорт» отмечали снижение количества ядрышковых организаторов на 13,57% относительно четвертых суток, и приближается к значению, установленного до опыта, а под влиянием традиционных средств величина данного показателя продолжала увеличиваться.

При проведении цитологических исследований было выявлено, что у животных с поврежденной кожей, которым использовали препарат «Биокомфорт», к 4-м суткам наблюдали снижение уровня клеточной гибели (апоптоз-ного индекса - в 1,2 раза, некротического индекса - в 1,3 раза) относительно вторых суток опыта. А к 10-м суткам значения этих показателей приближаются к их уровню до опыта. К этому времени уровень клеточной гибели у крыс, которым применяли препарат «Заживин», продолжает возрастать.

Установленное снижение цитологических показателей на фоне увеличения количества ядрышковых организаторов в эпителиальных клетках кожи свидетельствует о преобладании процессов пролиферации, а соответственно о повышении восстановительной активности под влиянием препарата «Биокомфорт».

Иммунологические и цитохимические показатели старых крыс

под влиянием препарата «Биокомфорт» при повреждении кожи

О степени влияния препарата «Биокомфорт» на организм старых крыс судили и по изменению цитохимических и иммунологических показателей крови, которые четко отражают интенсивность ферментативных реакций в динамике репаративного и воспалительно-деструктивного процесса.

Иммунологические показатели у крыс, которым при скарификации кожи применяли препарат «Биокомфорт», а также официнальное средство «Заживин», на 2-е и 4-е сутки после повреждения имеют сходную динамику. Так на 2-е сутки, относительно результатов до опыта, отмечено увеличение числа Т-лимфоцитов (СБЗ, СБ4, СБ8а) и уменьшение В-клеток (СБ 19) как под влиянием препарата «Заживин», так и препарата «Биокомфорт». К 10-м суткам результаты, установленные у животных в группе, где использовали официнальное средства «Заживин», свидетельствуют о том, что организм продолжал инициировать иммунную реакцию в ответ на повреждение, при этом уровень цитотоксических Т-лимфоцитов (СБ8а) оставался высоким. Значения показателей, зафиксированных у животных, которым использовали препарат «Биокомфорт» приближались к исходным величинам этих показателей.

Анализ результатов цитохимических исследований {табл. 6) показал, что под влиянием препарата «Биокомфорт» на 2-е сутки опыта происходит

снижение уровня катионных белков в 1,78 раз, миелопероксидазы - в 1,82 раз и щелочной фосфатазы - в 1,6 раз и повышение уровнем кислой фосфатазы в 1,75 раз и сукцинатдегидрогеназы - в 1,5 раза относительно значений до опыта. На 4-е сутки установлено увеличение активности МПО в 1,61 раза, ЩФ - в 1,3 раза и КФ - в 1,25 раз и снижение активности КБ в 1,07 раз и СДГ - в 1,25 раз относительно результатов, установленных на 2-е сутки. Такая же динамика прослеживается в группе, где использовали препарат «Заживин».

Таблица б

Сравнительная оценка ферментативной активности нейтрофилов крыс в заключительном периоде онтогенеза, (М±ш)

Сутки опыта Группа, п=30 Средний цитохимический показатель

КБ МПО КФ ЩФ СДГ

до опыта 1,51±0,03 1,53±0,09 1,28±0,05 2,33±0,19 1,26±0,01

2-е сутки Нб 0,84±0,06* 0,84±0,05* 2,24±0,11* 1,44±0,01* 1,87±0,05*

Шб 1,28±0,07* 1,04±0,04* 2,28±0,03* 1,60±0,06* 1,59±0,01*

4-е сутки Иб 1,40±0,02* 1,36±0,02* 1,60±0,11* 1,76±0,02* 1,59±0,04*

Шб 1,12±0,04* 1,20±0,05* 2,01±0,05* 2,16±0,07* 1,41 ±0,06*

10-е сутки Нб ¡,48±0,08* 1,46±0,07 1,38±0,01* 1,65±0,07* 1,29±0,01*

Шб 2,00±0,03* 1,12±0,05* 1,52±0,08* 1,40±0,06* 1,35±0,03*

Примечание:

Пб группа - использовали препарат «Биокомфорт»;

Шб группа - использовали препарат «Заживин»;

*(Р<0,05) - в сравнении с показателями, зафиксированными до опыта.

Но уже к 10-м суткам после повреждения кожи под влиянием препарата «Биокомфорт» происходит снижение уровня кислой и щелочной фосфатаз, наряду с повышением уровнем катионного белка, миелопероксидазы и сукцинатдегидрогеназы нейтрофилов крови относительно исходных значений.

ВЫВОДЫ

1. Адаптационно-компенсаторные процессы в организме старых крыс сопряжены с понижением количества эритроцитов, гемоглобина и среднего содержания гемоглобина в одном эритроците, увеличением цветового показателя; изменением в белковом метаболизме, заключающимся в уменьшении количества общего белка, альбуминов, увеличении - глобулинов, а также в повышении уровня ЩФ и КФ, снижении - КБ, МПО и СДГ в ней-трофилах, уменьшении количества СБЗ, СБ4, СБ8а и СЭ19 относительно аналогичных показателей белых крыс репродуктивного возраста, что свидетельствует о функциональном напряжении различных регуляторных механизмов гомеостаза. Отсутствие выраженных признаков нарушения состояния здоровья и диапазон основных гематологических показателей в пределах крайних границ общепринятой нормы позволяют считать установленные количественные значения нормативными для белых крыс в заключительном периоде онтогенеза.

2. Регенераторный потенциал кожи у старых крыс ниже, чем у крыс в репродуктивном периоде онтогенеза и характеризуется цитологическими и гистологическими особенностями. Так митотический индекс эпителия ниже в 1,3 раза, а уровень гибели клеток кожи выше (некроз - в 2,7 раза, апоптоз - в 2,5 раза). Клеточные слои эпидермиса нечетко выражены, межсосочковые выросты базапьной мембраны сглажены, в дерме - уменьшение количества межуточного вещества, утолщение коллагеновых и нарушение структуры эластических волокон. Толщина эпидермиса меньше на 15%, дермы - на 9,2%.

3. Уровень апоптоза и митоза кожи крыс старческого периода онтогенеза находится в разной степени коррелятивной зависимости с изучаемыми параметрами гомеостаза, что отражает значимость каждого исследуемого показателя при оценке интенсивности регенерации и является этиопатогенетической основой рациональной коррекции. Митотический индекс эпителиальных клеток кожи наиболее тесно коррелирует с общим количеством лейкоцитов, общим белком, с катионными белками, кислой и щелочной фосфатазами нейтро-филов, Т- и В-лимфоцитами (CD3, CD19). Апоптический индекс клеток кожи имеет наиболее тесную корреляцию с некротическим индексом, кислой и щелочной фосфатазами, катионными белками нейтрофилов.

4. Применение препарата «Биокомфорт» старым крысам per os способствует активизации гемопоэза, заключающегося в нормализации показателей крови, а также в усилении белкового метаболизма, проявляющегося увеличением количества общего белка и альбуминов, а также у-глобулинов, по сравнению с этими показателями до опыта. Отрицательного воздействия препарата на организм старых крыс не установлено.

5. Изменения цитохимических и иммунологических показателей, заключающиеся в повышение уровня КБ, МПО, СДГ и уменьшении ЩФ в нейтро-филах крови, а также увеличении числа CD3, CD4, CD8a и CD19 у старых крыс при пероральном применении препарата «Биокомфорт», относительно значений аналогичных показателей до опыта, свидетельствуют об усилении фагоцитарной активности и повышении иммунного статуса их организма.

6. Под влиянием препарата «Биокомфорт» отмечена положительная динамика репаративного процесса в коже старых крыс, заключающаяся в активизации пролиферативной активности клеток базального слоя эпидермиса, что сопровождается увеличением числа ядрышковых организаторов в клетках эпителия в 1,3 раза, на фоне снижения уровня апоптического в 2 раза и некротического индексов - в 1,8 раза, в более интенсивном образовании коллагеновых волокон по сравнению с официнальным препаратом « Заживин».

7. Ферментативная активность нейтрофилов и динамика популяций и субпопуляций лимфоцитов у старых животных при повреждении кожи возрастает под влиянием нового биологически активного препарата «Биокомфорт» по сравнению с традиционно используемым препаратом «Заживин».

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты исследования гематологических, биохимических, иммунологических и цитохимических показателей организма и регенераторного потенциала кожи у белых лабораторных крыс стока Вис-тар в заключительном периоде онтогенеза могут быть использованы в качестве нормативных и диагностических критериев, а также в научных целях при испытаниях на этих животных других препаратов.

2. Научные разработки, патентная и техническая документация могут служить основой для проведения расширенных доклинических и клинических испытаний биологически активного препарата «Биокомфорт» и организации его дальнейшего производства с целью использования животным и человеку для повышения физиологической активности организма, в том числе для восстановительной способности кожи.

3. Материалы диссертационной работы могут быть использованы при организации учебного процесса, составлении учебно-методических материалов и монографий по биологии размножения и развития, эмбриологии, гистологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Тимченко, Л.Д. Испытание эффективности противоожоговых пластин «Биорегенерин ПП-1» / Л. Д. Тимченко, И.В. Ржепаковский, В.Н. Вакулин, Е.Г. Затона, М.В. Сварич // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: Мат-лы 52-й научно-метод. конф. «Университетская наука - региону». - Ставрополь: Изд-во СГУ, 2007. - С. 240-242.

2. Затона, Е.Г. Новые средства для повышения регенеративных свойств кожи и слизистых оболочек на основе биологически активной субстанции «Иммовит» / Е.Г. Затона, М.В. Сварич // Третья ежегодная научная конференция студентов и аспирантов базовых кафедр ЮНЦ РАН: Тезисы докладов. - Ростов-на-Дону: Изд-во ЮНЦ РАН, 2007. - С. 20-21.

3. Сварич, М.В. Моделирование и изучение биологически активных препаратов и биоматериалов для активизации процесса регенерации тканей живого организма / М.В. Сварич, Е.Г. Затона, Л.Д. Тимченко // Сборник конкурсных работ Всероссийского смотра-конкурса научно-технического творчества студентов высших учебных заведений «ЭВРИКА-2007». - Новочеркасск: Изд-во Оникс +, 2007. - С. 133-134.

4. Тимченко, Л.Д. Морфологические показатели и общий белок крови белых крыс в заключительном периоде онтогенеза под влиянием нового биологически активного препарата «Биокомфорт» / Л.Д. Тимченко, Е.Г. Затона, М.В. Сварич, И.В. Ржепаковский, В.Н. Вакулин // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: Мат-лы 53-й научно-метод. конф. «Университетская наука - региону». - Ставрополь: Изд-во СГУ, 2008. - С. 179-182.

5. Сварич, М.В. Влияние ультрафиолетового облучения на уровень альфа-фетопротеина в сыворотке крови куриного эмбриона / М.В. Сварич // Четвертая ежегодная научная конференция студентов и аспирантов ба-

зовых кафедр ЮНЦ РАН: Тезисы докладов. - Ростов-на-Дону: Изд-во ЮНЦ РАН, 2008.-С. 11-12.

6. Затона, Е.Г Влияние биологически активного препарата «Биорегенерин-гель» на концентрацию малонового диальдегида в крови белых крыс при термических повреждениях / Е.Г. Затона, М.В. Сврич, Н.М. Хлы-стунова // Четвертая ежегодная научная конференция студентов и аспирантов базовых кафедр ЮНЦ РАН: Тезисы докладов. - Ростов-на-Дону: Изд-во ЮНЦ РАН, 2008. - С. 12-13.

7. Тимченко, Л.Д. Экспериментальное обоснование выбора оптимальных сроков развития и путей повышения биологической активности тканей куриного эмбриона с целью использования при разработке биологически активных препаратов / Л.Д. Тимченко, И.В. Ржепаковский, А.П. Трунова, Е.Г. Затона, М.В. Сварич // Астраханский медицинский журнал (приложение): Мат-лы 6-й междунар. научно-практ. конф. «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (г. Астрахань, 8-11 сентября 2008 г.). - 2008. - № 3. - С. 205-208.

8. Затона, Е.Г. Белковый обмен у белых крыс линии Вистар в репродуктивном и заключительном периоде развития / Е.Г. Затона, М.В. Похо-денко // Пятая ежегодная научная конференция студентов и аспирантов базовых кафедр ЮНЦ РАН: Тезисы докладов. - Ростов-на-Дону: Изд-во ЮНЦ РАН, 2009. - С.18-19.

9. Тимченко, Л.Д. Сравнительная оценка цитохимических показателей нейтрофилов крыс репродуктивного и заключительного этапов онтогенеза / Л.Д. Тимченко, Е.Г. Затона, М.В. Походенко, О.В. Логвиненко // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: Мат-лы 54-й научной конф. «Университетская наука - региону». - Ставрополь: Изд-во СГУ, 2009. - С. 71-74.

10. Тимченко, Л.Д. Оценка функциональной активности лимфоцитов под влиянием биологически активных препаратов при разных повреждениях кожи у лабораторных крыс репродуктивного и заключительного периода онтогенеза / Л.Д. Тимченко, Е.Г. Затона, М.В. Походенко // Вестник Московского государственного областного университета. Серия «Естественные науки». - 2009. - № 4. - С. 168-173.

11. Походенко, М.В. Гематологические показатели белых крыс заключительного периода онтогенеза при пероральном применении нового биологически активного препарата «Биокомфорт» / М.В. Походенко // Шестая ежегодная научная конференция студентов и аспирантов базовых кафедр ЮНЦ РАН: Тезисы докладов. - Ростов-на-Дону: Изд-во ЮНЦ РАН, 2010. - С. 36-37.

12. Тимченко, Л.Д. Ферментативная активность нейтрофилов лабораторных крыс в репродуктивном периоде онтогенеза при повреждении покровных тканей под влиянием нового биологически активного препарата на основе эмбрионально-яичной массы / Л.Д. Тимченко, Е.Г. Затона, М.В. Походенко // Вестник Московского госу-

дарственного областного университета. Серия «Естественные науки». -2010.- № 1.-С. 71-75.

13. Тимченко, Л.Д. Влияние нового биологически активного препарата «Биокомфорт» на ферментативную активность нейтрофилов лабораторных крыс заключительного периода онтогенеза при повреждении покровных тканей / Л.Д. Тимченко, М.В. Походенко, Е.Г. Затона, И.В. Ржепаковскии // Аграрная Россия. - 2010. - № 2. - С. 32-34.

14. Тимченко, Л.Д. Морфологические особенности кожи белых крыс в заключительный период онтогенеза / Л.Д. Тимченко, М.В. Походенко, Е.Г. Горяйнова, И.В. Ржепаковскии // Современные научно-практические достижения в морфологии животного мира: Мат-лы I междунар. научно-практ. интернет-конф. - Брянск: Изд-во Ладомир, 2011. - С. 46-48.

15. Походенко, М.В. Влияние нового биологически активного препарата «Биокомфорт» на белковый обмен белых крыс заключительного этапа онтогенеза при экспериментальном повреждении кожи / М.В. Походенко // Седьмая ежегодная научная конференция студентов и аспирантов базовых кафедр ЮНЦ РАН: Тезисы докладов. - Ростов-на-Дону: Изд-во ЮНЦ РА Н, 2011. - С. 39-40.

16. Походенко, М.В. Апоптоз кожи белых крыс в заключительный период онтогенеза / М.В. Походенко // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона: Мат-лы 56-й научно-метод. конф. «Университетская наука - региону». - Ставрополь: Изд-во СГУ, 2011. - С. 175-178.

17. Походенко, М.В. Морфологические особенности регенераторного процесса кожи крыс в заключительный период онтогенеза под влиянием нового препарата «Биокомфорт» / М.В. Походенко // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона: Мат-лы 56-й научно-метод. конф. «Университетская наука - региону». - Ставрополь: Изд-во СГУ, 2011. - С. 178-181.

18. Походенко, М.В. Иммунологические показатели белых крыс в заключительный период онтогенеза в норме и под влиянием препарата «Биокомфорт» / М.В. Походенко, Л.Д. Тимченко // Современные проблемы теории и практики инновационного развития АПК: Мат-лы международной научн. практ. конф. - Нальчик: Изд-во ООО «Полиграфсервис и Т», 2011. - С. 129-130.

19. Походенко, М.В. Функциональная активность ядрышковых организаторов эпителиальных клеток кожи у старых крыс под влиянием препарата «Биокомфорт» / М.В. Походенко // Современные проблемы теории и практики инновационного развития АПК: Мат-лы международной научн. практ. конф. - Нальчик: Изд-во ООО «Полиграфсервис иТ», 2011. - С. 130-132.

20. Патент № 2433171 РФ. Способ получения биологически активной субстанции из эмбрионально-яичной массы для приготовления прто-тивоожоговон пластины и противоожоговая пластина на его основе / Л.Д. Тимченко, И.В. Ржепаковскии, В.Н. Вакулии, Е.Г. Затона, М.В. Походенко. - Приоритет от 16.06.2010; Опубл. 10.11.2011. -Бюл. № 31.

Список сокращений

АФП - альфафетопротеин;

БАВ - биологически активные вещества;

БАД - биологически активные добавки;

КБ - катионные белки;

КФ - кислая фосфатаза;

МПО - миелопероксидаза;

СДГ - сукцинатдегидрогеназа;

С/Н - сегментоядерные нейтрофилы;

П/Н - палочкоядерные нейтрофилы;

ЩФ - щелочная фосфатача;

СПЗ - поверхностный мембранный белок

Т-лимфоцитов;

СЭ4 - поверхностный мембранный белок Т-хелперов;

СШа - поверхностный мембранный белок цитотоксических Т-лимфоцитов; С019 - поверхностный мембранный белок В-лимфоцитов.

Подписано в печать 10.02.2012 Формат 60x84 1/16 Усл.печ.л. 1,22 Уч.-изд.л. 1,19 Бумага офсетная_Тираж 100 экз._Заказ 37

Отпечатано в Издагельско-полпграфлческом комплексе Ставропольского государственного университета. 355009, Ставрополь, ул.Пушкина, 1.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Походенко, Мария Витальевна, Ставрополь

61 12-3/688

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИИ

ФГБОУ ВПО «СТАВРОПОЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ЮЖНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

Походенко Мария Витальевна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗМА, РЕГЕНЕРАТОРНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ КОЖИ И ПУТИ ИХ КОРРЕКЦИИ У БЕЛЫХ КРЫС ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНОГО ПЕРИОДА ОНТОГЕНЕЗА

03.03.05 - биология развития, эмбриология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор Л.Д. Тимченко

Ставрополь - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................................................................3

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................................4

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................10

1.1. Морфофункциональные особенности организма в заключительном периоде онтогенеза........................................................................10

1.2. Функциональная морфология кожи и ее регенераторная способность в зависимости от возраста ........... 19

1.3. Биологические средства физиологической стимуляции организма и регенерации в старости................................................................27

Глава И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............................39

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ............48

3.1. Морфофункциональные показатели организма старых крыс..........................................................................................................................................48

3.2. Особенности регенерации кожи крые в заключительном периоде онтогенеза..................................................................................................................53

3.3. Характеристика нового биологически активного препарата «Биоком&оот»..................................................................................................................58

X. я.

3.4. Влияние препарата «Биокомфорт» на морфофункциональные показатели организма старых крыс......... 63

3.5. Влияние препарата «Биокомфорт» на регенерацию кожи старых крыс............................................................ 67

3.6. Иммунологические и цитохимические показатели старых крыс под влиянием препарата «Биокомфорт» при повреждении кожи...................................................................... 73

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ........................ 77

ВЫВОДЫ.............................................................................. 93

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОШНДАЦИИ.......................................... 95

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................... 96

ПРИЛОЖЕНИЯ....................................................................... 127

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФП - альфафетопротеин;

БАВ - биологически активные вещества;

БАД - биологически активные добавки;

КБ - катионные белки;

КФ - кислая фосфагаза;

МПО - миелопероксидаза;

СДГ - сукцинатдегидрогеназа;

С/Н - сегментоядерные нейтрофилы;

П/Н - палочкоядерные нейтрофилы;

ЩФ - щелочная фосфатаза;

СБЗ - Т-лимфоцит;

СБ4 - Т-хелпер;

СБ8а - цитотоксический Т-лимфоцит;

СБ 19 - В-лимфоцит ;

СОД - супероксиддисмутаза.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Процесс старения возникает на самых ранних этапах становления организма и ведет к недостаточности физиологических функций, гибели клеток, ограничению приспособительных возможностей организма, снижению их надежности, развитию возрастной патологии и увеличению вероятности смерти (Фролькис В.В., 1969; Виленчик М.М., 1987; Чеботарев Д.Ф., 2001; Столбовская О.В., 2006; Dilman V.M., 1994; Asok В.Т., 1999; Wrona D, 2006). Одним из основных вопросов, который интересует исследователей, занимающихся изучением особенностей старения, является выяснение изменчивости регенерации с возрастом (Сидорова В.Ф., 1976; Полежаев Л.В., 1977; Лиознер Л.Д, 1982; Карлсон Б.М., 1986; Солопаев Б.П., 1990; Курилов И.Н., 2009 и др.), тем более, что многочисленные сведения по этому вопросу очень разноречивы.

В настоящее время изучены общие механизмы и тонкие звенья патогенеза биологического старения. Однако нет единого мнения на то, какие механизмы важнее, и когда они вступают в действия, а также как они сочетаются между собой. Поэтому для полноценной и достоверной оценки процесса старения необходимо комплексное изучение показателей, отражающих не только интенсивность регенераторных процессов, но и их регуляторные механизмы (Ходосова И.А., 1976; Анисимов В.Н., 1997; Войтенко В.П., 1999; Донцов В.И., 2000; Этинген Л.Е., 2003).

Однако в доступной литературе отсутствуют четкие критерии морфо-функциональной полноценности организма и уровня регенерации в период старости. Это касается практически всех млекопитающих, в частности белых крыс, являющихся классической моделью в биологии для исследований многочисленных процессов, в том числе влияния различных биологических активных препаратов, рассматриваемых в качестве потенциальных геронто-логических средств.

Большое число исследователей, занимающихся изучением регенерации в процессе старения, отводят важную роль коже, которая является экзоорга-

ном, наиболее подверженным влиянию повреждающих факторов и ее возрастные изменения отчетливо видны (Мяделец О.Д., Адаскевич В.П., 1997; Афанасьев Ю.И., 1999; Коргунова Р.В., 2005; Мирзоева П.Н., 2008; Auger F.A., Lacroix D., Germain L., 2009).

Поскольку регенерация кожи в заключительном этапе онтогенеза обусловлена многочисленными регуляторными механизмами, находящимися в тесной взаимосвязи с морфофункциональным гомеостазом, то для обеспечения функциональной активности кожных покровов в старости, наиболее рациональным является изыскание путей влияния на сложный комплекс механизмов, регулирующих регенераторную активность (Романова JI.K., 1984; Смирнова И.О., 2004). При создании лекарственных препаратов с такими свойствами целесообразным является использование объектов, богатых биологически активными веществами, среди которых приоритетными являются препараты на основе эмбриональных тканей млекопитающих и птиц, адекватно влияющих на метаболические системы стареющего организма (Обухова Л.К., 1975; Западнюк В.И., 1990; Анисимов В.Н., 2000; Рыжак Г.А., 2004; Курилов И.Н., 2009). В то же время, имеются сообщения о новых эффективных биологически активных препаратах на основе эмбриональной ткани птиц (Ржепаковский И.В., 2005; Маханьков О.В., Сумеркина В.А., 2006; Тимченко Л.Д., 2007, 2008, 2009; Курилов И.Н., 2009; Munoz-Sanjaun, Kay Simandl В., Fallon J.F., Nathans J., 1999), которые, хотя и представляются перспективными, но не подкреплены сведениями об их использовании в период старости. Однако, при применении любых препаратов в заключительном периоде онтогенеза, даже комплексы из естественных источников могут оказывать непредвиденное, в том числе отрицательное воздействие, что требует всестороннего изучения.

Несмотря на то, что потенциал эмбриональных тканей при изыскании геропротекторных, в том числе регенеринстимулирующих средств, еще не исчерпан, их разработка и применение для функциональной коррекции на заключительном этапе онтогенеза возможны лишь на этиопатогенетической

основе, требующей всестороннего изучения морфофункциональных показателей организма и регенераторного потенциала кожи экспериментальных животных.

Цель исследования: изучение морфофункциональных показателей организма, регенераторного потенциала кожи старых крыс и разработка путей их рациональной коррекции.

Задачи исследования:

1) изучить морфофункциональные особенности организма белых крыс в старческий период онтогенеза с использованием гематологических, биохимических, цитохимических и иммунологических показателей;

2) оценить регенераторный потенциал кожи животных в заключительном периоде онтогенеза;

3) изучить динамику морфофункциональных показателей организма крыс в старости под влиянием нового препарата «Биокомфорт»;

4)исследовать репаративную регенерацию кожи старых крыс под влиянием биологически активного препарата «Биокомфорт».

Научная новизна исследования.

Впервые с учетом комплекса показателей (гистологических, гематологических, биохимических, цитологических, цитохимических, иммунологических) дана оценка регенераторной способности кожи белых крыс во взаимосвязи с морфофункциональным статусом их организма в старческий период онтогенеза. Установлены нормативные значения изученных показателей для белых крыс в период старости.

Дано теоретическое и экспериментальное обоснование этиопатогенети-ческой коррекции морфофункциональных показателей организма и уровня регенерации кожи у старых крыс с помощью нового биологически активного препарата «Биокомфорт».

Впервые с учетом комплекса показателей (гематологических, биохимических, цитохимических и иммунологических) подтверждено положи-

тельное влияние препарата «Биокомфорт» на организм крыс заключительного периода онтогенеза.

Доказана регенеринстимулирующая эффективность препарата «Биокомфорт» на основе активированной эмбрионально-яичной массы и подтверждено преимущество его применения у старых крыс по сравнению с традиционными средствами. Приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом РФ № 2433171 «Способ получения биологически активной субстанции из эмбрионально-яичной массы для приготовления противоожоговой пластины и противоожоговая пластина на его основе».

Теоретическая и практическая значимость исследования.

Полученные сведения о широком комплексе показателей организма (гематологических, биохимических, цитохимических, иммунологических), а также установленная коррелятивная зависимость между ними и критериями регенераторной способности кожи белых крыс, углубляют и расширяют представление о морфофункциональных особенностях организма и регенераторном потенциале кожи в заключительном периоде онтогенеза и вносят теоретический вклад в биологию размножения и развития.

На примере белых крыс дано экспериментальное обоснование целесообразности применения нового биологически активного препарата «Биокомфорт» в заключительный период онтогенеза для повышения физиологической активности организма, в том числе для восстановительной способности кожи, что является основанием для дальнейших доклинических и клинических испытаний с целью использования этого препарата для животных и человека.

Эффективность применения препарата «Биокомфорт» подтверждена на животных в участковой ветеринарной лечебнице № 2 г. Ставрополя.

Результаты исследования используются в научно-исследовательской и практической работе отдела прикладной биологии научно-исследовательского института биологии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный

федеральный университет», а также в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторных занятий по биологии развития и размножения, гистологии, эмбриологии и физиологии на медико-биолого-химическом факультете в Ставропольском государственном университете, Ставропольском государственном аграрном университете, Ставропольском филиале Московского государственного гуманитарного университета им. М.А. Шолохова, Самарской государственной сельскохозяйственной академии.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на третьей, четвертой, пятой, шестой и седьмой ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (г. Ростов-на-Дону, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011), где доклады автора отмечены дипломом лауреата, дипломом первой, второй и третьей степени, тремя почетными грамотами; на Всероссийском смотре-конкурсе научно-технического творчества студентов высших учебных заведений «ЭВРИКА-2007» (г. Новочеркасск, 2007 г.), где доклад отмечен дипломом третьей степени; на VI Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (г. Астрахань, 2008 г.); на научной конференции «Университетская наука - региону» (Ставропольский государственный университет, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011); на международной научно-практической конференции посвященной 30-летию КБГСХА им. В.М. Кокова (г. Нальчик, 2011 г.).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Комплекс изученных морфофункциональных показателей и характер коррелятивной зависимости между ними объективно отражают особенности морфофункционального статуса и регенераторного потенциала кожи белых крыс в заключительном периоде онтогенеза.

2. Биологически активный препарат «Биокомфорт» оказывает выраженное стимулирующее действие на морфофункциональные показатели ор-

ганизма и репаративную регенерацию кожи белых крыс в заключительный период онтогенеза.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ, в том числе три из них - в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени и получен патент РФ на изобретение № 2433171.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах компьютерного набора, иллюстрирована 22 фотографиями, в том числе 19 микрофотографиями, 6 диаграммами, 14 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и приложений. Список использованной литературы содержит 310 источников, в том числе 48 работ зарубежных авторов.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Морфофункциональные особенности организма в заключительном

периоде онтогенеза

Старение - разрушительный процесс, вызываемый внутренними и внешними факторами, проявляющийся определенными изменениями на биохимическом, цитологическом и гистологическом уровнях, нарушающий деятельность клеток и приводящий к неполноценности физиологических функций, ограничению приспособительных возможностей организма, развитию возрастной патологии и увеличению вероятности смерти (Звычайный М.А., 2004).

Старение гарантирует смерть организма и, следовательно, обеспечивает одно из главных свойств живой материи - ее дискретность во времени. При старении изменяются многие структуры и функции организма и поэтому трудно определить, что же является клеточным и молекулярным инициальным субстратом старения. Кроме того, на сам процесс старения, в частности на его скорость, оказывают влияние многие гены и факторы среды (Алтухов Ю.П., 1998). Отсюда проистекает и обилие различных гипотез о природе старения (Потапенко А.И., 1999).

Процесс старения характеризуется нарастающим снижением надежности регуляции гомеостаза, снижением возможного диапазона приспособления. Это отчетливо выявляется при использовании различных нагрузок, которые неизбежно и постепенно возникают в течение жизни. В этом случае, несмотря на гомеостатический уровень функции, в старости выявляются ее изменения. Вся жизнь представляет собой бесконечную цепь потрясений внутренней среды организма, постоянных нарушений гомеостаза. В ходе этих потрясений мобилизуются и совершенствуются адаптационно-регуляторные механизмы, способствующие сохранению гомеостаза (Фролькис В.В., 1969; Ванюшин Б.Ф., Бердышев Г.Д., 1977).

Хотя признаки старения большинства тканей, органов и систем достаточно хорошо изучены, первичные причины наблюдаемых изменений до на-

стоящего времени не вполне ясны, что приводит к попыткам дать им объяснение в ряде теорий, иногда противоречащих друг другу.

На сегодня насчитывается более 200 теорий старения. Делались попытки объяснить старение внешними факторами. Сюда относится концепция о значении накопления в организме радиоактивных веществ, непрерывной бомбардировки организма космическими лучами. В ряде теорий большую роль в развитие старческих изменений отводят эндогенным интоксикациям. И.И. Мечников указывал на значение интестинальной интоксикации (Дуп-ленко Ю.К., 1985). Рассматриваются экологические аспекты (например, роль плотности популяции), вопросы, связанные с влиянием «истории жизни» на ее продолжительность, значение видовых особенностей (например, подвижность в ряду близкородственных видов), а также участие в процессе старения некоторых биохимических механизмов, таких как развитие аутоиммунных процессов и накопление ряда химических веществ, в частности, специфического «пигмента старения» липофусцина. Делаются попытки построения модели старения на базе принципов термодинамики неравновесных процессов (Ходосова И.А., 1976; Этинген Л.Е., 2003; Кузник Б.И., Цыбиков H.H., 2005; Carey J., 2001; Dunn-Walters D.K., Banerjee M., Mehr R., 2003).

Процесс старения приводит к накоплению структурных и функциональных нарушений на всех уровнях организации живого. Можно указать, по крайней мере, на два принципиально разных источника «повреждений и ошибок» в клетке. Частота ошибок, например, при копировании матрицы ДНК или при синтезе белка определяется несовершенством способа передачи информации от одной молекулы к другой и связана, в основном, с особенностями молекулярной