Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональные изменения тимуса при экспериментальном канцерогенезе, вызванном введением 1,2-диметилгидразина в различной дозировке

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональные изменения тимуса при экспериментальном канцерогенезе, вызванном введением 1,2-диметилгидразина в различной дозировке"

На правах рукописи

КОСТРОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ТИМУСА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ, ВЫЗВАННОМ ВВЕДЕНИЕМ 1,2-ДИМЕТИ Л ГИДРАЗИНА В РАЗЛИЧНОЙ ДОЗИРОВКЕ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 7 К'СН Ш

Санкт-Петербург 2013

005531002

Работа выполнена на кафедре нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Стручко Глеб Юрьевич

Официальные оппоненты:

Мельникова Валентина Филипповна,доктор медицинских наук, профессор Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, кафедра патологической анатомии с курсом судебной медицины, профессор

Одинцова Ирина Алексеевна, доктор медицинских наук, профессор Федеральное государственное казенное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия им.С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации, кафедра гистологии с курсом эмбриологии, заведующая

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «27» июня 2013 г. в «15 часов 30 мин.» на заседании диссертационного совета Д. 208.087.01 при ГБОУ ВПО СПбГПМА Минздравсоцразвития России по адресу: 194100, г. Санкт-Петербург, Литовская ул., 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ГБОУ ВПО СПбГПМА Минздравсоцразвития России по адресу: 194100, г. Санкт-Петербург, Кантемировская ул., 16

Автореферат разослан » 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор _ Кульбах Ольга Станиславовна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

В последние годы отмечается значительный рост числа онкологических заболеваний во всем мире (В.И. Чиссов и др., 2013). Проблема рака является одной из самых актуальных и сложных в медицине, ведь в настоящее время отмечается повышение смертности от злокачественных опухолей не только среди людей пожилого возраста, но и среди относительно молодого поколения (Ш.Х. Ганцев, 2010).

Благодаря эпидемиологическим и экспериментальным исследованиям известны сотни причин, которые могут привести к развитию новообразований. Согласно данным литературы развитие рака связывают с особенностями образа жизни (М.А. Забежинский, 2011) и окружающей человека среды (А.Д. Власов, 2009; Л.Ф. Писарева и др., 2009). Известно, что воздействие ионизирующей радиации, химических канцерогенов, а также негенотоксичных агентов вызывает развитие опухоли (Л.Ф. Писарева и др., 2009). К одному из таких агентов относятся гидразины - класс химических элементов, канцерогенное действие которых стали изучать сравнительно недавно. Известно огромное количество производных этого соединения, среди которых изучены только 100. Из них 40 вредны для здоровья людей, а 20 являются канцерогенами для животных (В. Toth, 1980).

Важная роль в реализации канцерогенного эффекта принадлежит нейроэндокринной и иммунной системе (М.А. Забежинский, 2011). При этом изменения иммунного статуса онкологических больных зависит как от типа опухоли, стадии процесса, так и от индивидуальных особенностей (Ю.А. Гриневич и др., 1986; А.Н. Глушков, 1991).

Установлено, что клетки иммунной системы являются основным эффекторным механизмом, обеспечивающим антигенный гомеостаз организма (A.B. Крылов, 2008). Важнейшая роль в противораковом иммунном ответе принадлежит тимусу, в котором происходит дифференцировка основных популяций Т-лимфоцитов при регулирующем влиянии эпителиальных и дендритных клеток. По-видимому, развитие опухоли происходит из-за неэффективности иммунного ответа, в результате развития иммунодепрессивных состояний, сопровождающих рост большинства опухолей (A.B. Крылов, 2008; И.В. Орадовская и др., 2011). До сих пор остается открытым вопрос о том, с помощью какого механизма злокачественные новообразования уходят от противоопухолевого надзора.

Некоторые авторы связывают этот процесс с образованием различных иммуносупрессорных факторов, которые выделяются как самими опухолевыми клетками, так и нормальными клетками организма (A.B. Крылов, 2008). Одним из таких агентов, согласно данным литературы, является ростовой фактор эндотелия сосудов, который вызывает развитие инволюции тимуса (Ohm et al., 2003), а она, в свою очередь, приводит к развитию Т-клеточного иммунодефицита в организме (Е.П. Киселева, 2004).

Предполагают также, что инволюцию тимуса могут вызывать еще такие факторы, как компоненты внеклеточного матрикса, продукты распада опухоли, метаболические факторы, оказывающие отрицательное действие на периферические Т-лимфоциты.

Из анализа приведенных данных литературы следует, что, несмотря на большое внимание исследователей к изучению механизмов инволюции тимуса при опухолевом росте, мы не встретили сведений о морфологии тимуса и биоаминном обеспечении его структур при введении 1,2-диметил гидразина.

Поэтому изучение акцидентальной инволюции тимуса в условиях развития опухоли является актуальной задачей исследования и дает новое, более целостное представление о патогенезе злокачественного роста, что, в дальнейшем, позволит разработать более эффективные методы прогнозирования, мониторирования и лечения новообразований.

Цель исследования - оценить морфофункциональное состояние тимуса крыс через 30, 60, 90 и 120 суток после введения 1,2-диметилгидразина в различной дозировке.

Задачи исследования:

1. Провести морфометрию коркового и мозгового вещества долек тимуса крыс через 30, 60, 90 и 120 суток после введения канцерогена в общей дозе 40 мг/кг и 80 мг/кг

2. Провести морфометрию люминесцирующих клеток у крыс через 30, 60, 90 и 120 суток после окончания введения канцерогена в различной дозировке

3. Выявить изменения содержания биогенных аминов в люминесцирующих структурах тимуса, определить их отношение через 30, 60, 90 и 120 суток после введения канцерогена в различной дозировке

4. Изучить популяцию тучных клеток тимуса, содержание в них биогенных аминов, а также степень дегрануляции в эти же сроки после введения канцерогена в зависимости от дозы препарата

5. Дать иммуногистохимическую характеристику морфологии и количественного распределения дендритных, РСИА+-, СОЗ+-, СЭ1А+- и Тг+- клеток тимуса у крыс через 30, 60, 90 и 120 суток после окончания курса инъекций в зависимости от дозы введения препарата

Научная новизна работы. Впервые в динамике прослежены структурные изменения тимуса при введении 1,2-диметилгидразина в различной дозировке. Введение канцерогена сопровождается уменьшением ширины коркового и площади мозгового вещества долек тимуса.

С помощью люминесцентно-гистохимического исследования установлено, что на фоне введения канцерогена возрастает количество и размеры люминесцирующих гранулярных клеток тимуса.

Впервые показано, что введение 1,2-диметилгидразина в различной дозировке сопровождается волнообразными изменениями уровня биогенных аминов во всех структурах тимуса: увеличение их активности наблюдается через 30 суток, снижение - через 60 суток, пик их содержания приходится на 90 сутки, повторное, но менее значительное уменьшение обнаруживается через 120 суток.

В работе установлено, что на фоне введения канцерогена в разной дозировке отношение (серотонин + гистамин) / катехоламины в структурах тимуса изменяется разнонаправлено: при введении канцерогена в дозе 80 мг/кг наблюдается двухфазное увеличение этого показателя во всех исследуемых структурах тимуса через 60 и 120 суток; при введении 1,2-диметилгидразина в меньшей дозе данное отношение также увеличивается через 60 и 120 суток, но только в премедуллярных и тучных клетках и в тимоцитах их микроокружения, в остальных структурах оно повышается через 30 и 90 суток.

Впервые изучено содержание в тучных клетках биогенных аминов, степень их дегрануляции после окончания введения 1,2-диметилгидразина в разной дозе.

Впервые обнаружено, что введение канцерогена в разной дозе приводит к увеличению 8100+-, РСЫА+-, СБЗ+, С01А+ и Тг+ клеток.

Научно-теоретическая значимость

Материалы диссертационного исследования дополняют сведения о морфофункциональном состоянии тимуса на разных этапах канцерогенеза, расширяют представление о механизмах взаимодействия центрального органа иммуногенеза и развивающейся злокачественной опухоли. Полученные данные имеют интерес для гистологов, онкологов и иммунологов.

Практическая значимость

Работа носит экспериментально-теоретический характер. На основании проведенных экспериментальных исследований дополнен механизм развития инволюции тимуса при росте опухоли.

Результаты работы используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий и семинаров на кафедре цитологии, эмбриологии и гистологии ФГБОУ ВПО «ЧГУ им. И.Н. Ульянова», кафедре терапии и семейной медицины АУ Чувашии «Институт усовершенствования врачей», в практике БУ «Республиканский клинический онкологический диспансер». Итоги исследования отражены в опубликованных статьях и тезисах.

Научные положения, выносимые на защиту:

1. Введение 1,2-диметилгидразина вне зависимости от дозы приводит к достоверному увеличению в тимусе тучных, дендритных, PCNA+-, CD1A+- и CD3+-клеток. Максимальное количество этих клеток регистрируется через 90 суток после введения канцерогена у животных обеих групп. Через 120 суток у всех подопытных животных выявляется достоверное уменьшение CD3+-, CD1A+- и PCNA+- клеток.

2. Рост злокачественной опухоли толстой кишки, вызванный введением 1,2-диметилгидразина, сопровождается развитием акцидентальной инволюции тимуса: выявляется изменение формы долек тимуса, отмечается перераспределение уровня биогенных аминов -увеличивается уровень гистамина и серотонина, уменьшается диаметр коркового и площадь мозгового вещества с замещением паренхимы соединительной и жировой тканью. Выявленные изменения отмечаются на более раннем сроке (через 60 суток) при введении канцерогена в дозе 80 мг/кг.

Апробация работы и публикации

Основные результаты работы были представлены на XLVII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», посвященной 50-летию НГУ (Новосибирск, 2009); VIII Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине (Тула, 2009); Международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Ивановской школы лимфологов (Иваново, 2009); XVI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2011); Межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Республиканского клинического онкологического диспансера «Новые технологии в диагностике и лечении злокачественных новообразований» (Чебоксары, 2011); XVII Международном конгрессе по реабилитации (Париж, Франция, 2011); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2011); XII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2011); на V Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2012); на Международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения проф. Б.З. Перлина «Актуальные вопросы морфологии» (Кишинев, 2012). Материалы докладывались на Всероссийской конференции с международным участием «Морфология в теории и практике», посвященной 90-летию со дня рождения профессора Д.С. Гордон (Чебоксары, 2012).

По теме диссертации опубликовано 24 научные работы (тезисы-8, статьи-16). 7 работ (из них 6 - статьи) опубликованы в ведущих рецензируемых российских научных журналах из перечня ВАК, рекомендованного для публикаций основных результатов диссертаций на соискание ученых степеней.

Структура н объем диссертации

Диссертация состоит из введения и шести глав: обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов и заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста (собственно текста - 120 страниц), содержит 8 таблиц и проиллюстрирована 79 рисунками, включая микрофотографии. Список литературы содержит 285 источника, в том числе 95 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 140 белых нелинейных крысах-самцах массой 150-180 г. Животные содержались в виварии, уход за ними осуществляли по нормам и правилам обращения с лабораторными животными. Проведенное исследование единогласно одобрено на заседании этического комитета медицинского факультета ФГБОУ ВПО «ЧГУ им. И.Н. Ульянова» протокол №6 от 1 марта 2013 года.

Животные были разделены на три группы: 1-интактные (п=20); 2-животные с внутрибрюшинным введением канцерогена в общей дозе 40 мг/кг (п=60); 3- животные с внутрибрюшинным введением канцерогена в общей дозе 80 мг/кг (п=60). Введение водного раствора канцерогена (1,2-диметилгидразин дигидрохлорид) проводилось 1 раз в неделю в течение 4 недель. Выведение животных из эксперимента проводилось через 30, 60, 90 и 120 суток после последней инъекции путем декапитации. При патоморфологическом исследовании учитывались частота развития новообразований, их морфологические особенности, локализация. Объектом исследования служил тимус.

В работе использовались следующие методы:

\.Люминес11ентно-гистохгшический метод Фалька-Хшларпа (В Falk., N Hillarp., 1962) в модификации Е.М. Крохиной (Е.М. Крохина, П.Н. Александров, 1969) - для обнаружения серотонина и катехоламинов в структурах тимуса.

1.Люмииесцеитио-гистохимический метод Кросса, Эвена, Роста (S.A. Cross et. al., 1971) - для обнаружения гистамина в структурах тимуса.

Ъ.Метод цитоспектрофлуориметрии (С. Юденфренд, 1965; В.Н. Карнаухов, 1978; В.Л. Калмыков, 1982) - для количественного определения уровней серотонина, катехоламинов и гистамина в структурах тимуса.

Измерения производили с помощью насадки ФМЭЛ-1А, которая устанавливалась на люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ-4. Выходное напряжение при всех измерениях составляло 600 В.

4.Для характеристики суммарно-направленного действия биогенных аминов высчитывалось отношение (СТ+ГСТ)/КА, свидетельствующее о функциональном состоянии клеток тимуса (Г.Ю. Стручко, 2003).

5.Метод окраски полихромным толуидиновым синим по Унна — для качественной и количественной характеристики популяции тучных клеток тимуса. Тучные клетки подсчитывали в десяти полях зрения микроскопа (объектив 40 и окуляр 15). По степени дегрануляции выделяли 4 типа клеток: Т-0 — тучные клетки с плотно заполненными неразличимыми гранулами и ядром; Т-1 — клетки с отдельно различимыми гранулами и неполностью замаскированным ядром; Т-2 — клетки с хорошо различимыми гранулами как внутри, так и вокруг клетки и отчетливым ядром; Т-3 — опустошенные тучные клетки с единичными гранулами внутри и рассеянными гранулами вокруг клетки (Д.П. Линднер и др., 1980; Г.Ю. Стручко и др., 1995).

6. Иммуногистохимические методы с использованием моноклональных (МКАТ) и поликлональных (ГТКАТ) антител фирмы Santa Cruze (США) (DJ. Dabbs, 2002):

а) МКАТ к CD3 (маркер зрелых Т-лимфоцитов);

б) МКАТ к CD1A (маркер кортикальных тимоцитов);

в) МКАТ к PCNA (маркер пролиферирующих клеток),

г) ПКАТ к белку S-100 (маркер клеток нейроэктодермального

происхождения и дендритных клеток);

д) МКАТ к тучным клеткам, положительным к триптазе (Тг+).

Материал для исследования фиксировали 10% нейтральным формалином

в течение 24 ч, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37С° в течение 18 ч. Восстановление антигенной активности осуществлялось в цитратном буфере pH 6,0 в автоклаве при температуре 96С° в течение 20 мин с последующим остыванием в течение 90 мин. Для выявления иммуногистохимических реакций в работе применялась система визуализации LSAB-2. В качестве внутреннего контроля реакции служила неиммунизированная кроличья сыворотка. Результаты реакций оценивали с применением микроскопа МИКРОМЕД 3 ЛЮМ путем подсчета позитивно окрашенных клеток на 100 клеток в десяти полях зрения, выражая результаты в процентах и единицах в поле зрения.

7.Метод окраски гематоксилином и эозином для оценки общегистологической картины и проведения морфометрических измерений коркового и мозгового вещества тимуса.

%.Морфометрический метод выполняли с помощью автоматизированного морфометрического комплекса, включавшего микроскоп МИКРОМЕД 3 ЛЮМ, цифровую фотокамеру и персональный компьютер с

набором прикладных программ. Использовались программы Микро-Анализ для измерения размеров люминесцирующих клеток, пакет программ Sigma Scan Pro для измерения толщины коркового и площади мозгового вещества тимуса, а также количественных характеристик иммуногистохимических реакций.

9.Статистическая обработка полученных цифровых данных проведена с помощью пакета программ Microsoft office (Word и Excel) на компьютере. В работе приводятся следующие показатели: М — средняя арифметическая величина; m — средняя ошибка средней арифметической величины. Статистическую достоверность оценивали по t-критерию Стьюдента (Гублер Е.В. и др., 1973; Власов В.В., 2001; Реброва О.Ю., 2002).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Структура тимуса при введении канцерогена в общей дозе 40 мг/кг через 30 и 60 суток после окончания курса инъекций, несмотря на выявленные при гистологическом исследовании признаки развивающейся опухоли толстой кишки в виде пролиферации крипт и дисплазии, не отличается от интактных животных.

При исследовании тимуса с помощью люминесцентной микроскопии выявляются дольки полигональной формы с хорошо различимым мозговым и корковым веществом. В паренхиме тимуса обнаруживаются люминесцирующие гранулярные клетки премедуллярной, субкапсулярной зон и тучные клетки, которые различаются по форме, расположению, размеру, а также по числу, размеру и цвету гранул.

Параллельная постановка иммуногистохимических реакций показывает, что люминесцирующие гранулярные клетки кортико-медуллярной зоны дают положительную реакцию на белок S-100, который является одним из маркеров дендритных клеток. Иммуногистохимическая реакция на белок S-100, PCNA и триптазу тучных клеток не дает достоверных отличий в количестве клеток на этих сроках исследования по сравнению с интактными крысами соответствующего возраста. Нами обнаруживаются единичные тучные клетки, положительные к триптазе. Количество же CD3+ и CD1A+ клеток по сравнению с интактными животными увеличивается в 1,5 и 3 раза соответственно.

Введение канцерогена в общей дозе 80 мг/кг в эти же сроки исследования серьезно изменяет морфологию тимуса. Увеличивается количество жировой и соединительной ткани, изменяется форма долек, уменьшается толщина коркового и площадь мозгового вещества и масса органа. Наиболее выраженные изменения отмечаются через 60 суток после окончания курса инъекций, когда дольки приобретают веретенообразную или полулунную форму, граница коркового и мозгового вещества стерта, увеличивается количество люминесцирующих клеток, которые располагаются хаотично по всей ткани. Премедуллярные клетки крупные,

яркие и глыбчатые, диаметром до 20,7 ± 0,2 мкм, плотно заполненными гранулами. На фоне темно-зеленого свечения паренхимы обнаруживаются неяркие «клетки-тени» с угасающим диффузным свечением. Возможно, что они являются остатками распавшихся люминесцирующих гранулярных клеток.

С помощью цитоспектрофлюориметрии нами выявлен дисбаланс уровня биогенных аминов в исследуемых структурах. Отмечается снижение уровня моноаминов в субкапсулярных и тучных клетках и тимоцитарной паренхиме коркового вещества по сравнению с предыдущим сроком исследования, однако их содержание остается выше интактных значений. Содержание гистамина по сравнению с предыдущим сроком в субкапсулярных и премедуллярных клетках, а также в тимоцитах мозгового вещества увеличивается в 1,3; 2,5 и 1,9 раза соответственно.

Известно, что на функциональную активность структур тимуса влияет как абсолютное содержание биогенных аминов, так и их отношение. Нами высчитывалось отношение (СТ+ГСТ)/КА, увеличение которого косвенно свидетельствует о подавлении активности клетки, снижение - о ее стимуляции (Г.Ю. Стручко и др., 2012). При введении канцерогена в двойной дозе данное отношение через 60 суток по сравнению с интактными и животными предыдущей группы увеличивается в премедуллярных и субкапсулярных клетках, а также в тимоцитах коркового и мозгового вещества (рисунок 1).

т

І і

І . л Ш г 1 1

П 1 ■" I 11

ПМК СКК ТКВ ТМВ ТК М/ОТК

■ интактные ■ 30 суток ■ 60 суток

Рисунок 1 - Отношение (серотонин+гистамин)/катехоламины в биоаминосодержащих структурах тимуса у интактных крыс и через 30 и 60 суток после окончания введения канцерогена в общей дозе 80 мг/кг

Окраска срезов по методу Унна позволила установить, что несмотря на снижение общего количества тучных клеток, процентное содержание дегранулированных Т-3 форм по сравнению с 30-ью сутками увеличивается на 23%, а недегранулированные Т-0 и слабодегранулированные Т-1 формы уменьшаются на 9%. Известно, что выявленное уменьшение количества тучных клеток может быть связано с нарушением их миграции при развитии опухоли (Н.М. Бережная, 2009; Н.Н. ОНуепа-ЫеЮ е1 а1, 2007).

При иммуногистохимическом исследовании тимуса выявлено более чем двукратное увеличение количества Б-ЮО"1" клеток (рисунок 2), в то время как число СОЗ+, СО IА+ и PCNA+ клеток не отличается от интактной группы животных. Процентное повышение дендритных клеток на этом сроке исследования свидетельствует о том, что тимус начинает реагировать на введение канцерогена при формировании предопухолевых изменений в толстой кишке. Установлено, что основной функцией дендритных клеток является поглощение и процессинг доступных им антигенов (М.В.Пащенков, Б.В. Пинегин, 2006; Р. Сиегшопргег е1 а1., 2002).

Дендритные клетки представляют на своей поверхности собственные антигенные пептиды организма в комплексе с белками МНС, и тем самым они выполняют важную роль в механизмах центральной Т-клеточной ареактивности (Б.Б. Бижигитова и др., 2011).

Рисунок 2 - Тимус. 60 суток после окончания введения канцерогена в общей дозе 80 мг/кг. Увеличение 8-100+клеток. Иммуногистохимическая реакция на белок Б100. МИКРОМЕД 3 ЛЮМ. Ув. 1 ООх

Через 90 суток после окончания введения канцерогена у экспериментальных животных обеих групп отсутствуют дольки правильной округлой формы, в основном встречаются крупные полигональные дольки, которые принимают вытянутую форму (рисунок 3).

Рисунок 3 - Тимус. 90 суток после окончания введения канцерогена в общей дозе 80 мг/кг. Долька с мозговым веществом веретенообразной формы. Окраска гематоксилином и эозином. МИКРОМЕД 3 ЛЮМ. Ув. 100х

Заметно увеличивается площадь мозгового вещества и, соответственно, масса органа по сравнению с показателями интактных крыс и животных с предыдущим сроком. При этом большую часть паренхимы замещает жировая и соединительная ткань. Подобные изменения соответствуют первой фазе акцидентальной инволюции тимуса (Е.Г. Турицына, 2009; И.В. Силантьева и др., 2011). На наш взгляд такое состояние можно расценивать, как попытку тимуса компенсировать начинающиеся нарушения функции органа, что совпадает с данными литературы (Н.М. Киселева и др., 2012).

Мозговое вещество принимает неправильную амебовидную форму и не содержит люминесцирующих клеток. В корковом веществе, наоборот, располагается множество люминесцирующих клеток, которые неравномерно распределены от кортико-медуллярной границы до периферии. При этом параллельная постановка иммуногистохимической реакции на белок 8100, выявляет достоверное увеличение количества дендритных клеток. Известно, что увеличение количества люминесцирующих гранулярных клеток может быть следствием увеличения дендритных клеток, которые выделяют

ннтерлейкины или гормоны для межклеточного взаимодействия: ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-а (О.Ю. Леплина, 2011).

При окраске срезов тимуса полихромным толуидиновым синим выявляются дольки с большим количеством тучных клеток. При введении канцерогена в меньшей дозе эти клетки обнаруживаются не в соединительнотканных перегородках, а в прилежащей соединительной ткани.

Установлено, что плотность распределения тучных клеток увеличивается с прогрессией злокачественного новообразования (E.Crivellato, 2009). Мы предполагаем, что это связано со способностью тучных клеток экспрессировать триптазу, которая обладает выраженными ангиогенными свойствами (Н.М. Бережная, 2009; А. Cabanillas-Saez et al, 2002). По данным литературы тучные клетки тимуса участвуют в замещении паренхимы органа соединительной тканью посредством выделения медиаторов, которые стимулируют пролиферацию фибробластов и синтез ими коллагена (И.В. Рева, O.A. Сингур, 2006).

При введении канцерогена в общей дозе 40 мг/кг выявляется достоверное повышение количества CD3+-, CDIA+- и PSNA+ клеток, в то время как процентное содержание этих же клеток при введении канцерогена в двойной дозе не отличается от процентного содержания этих клеток у интактных крыс того же возраста (рисунок 4).

Рисунок 4 - Тимус. 90 суток после окончания введения канцерогена в общей дозе 80 мг/кг. Увеличение С01А+ клеток. Иммуногистохимическая реакция на СБ1 А. МИКРОМЕД 3 ЛЮМ. Ув. ЮОх

На более позднем сроке - через 120 суток на фоне развития опухоли толстой кишки, имеющей морфологию аденокарциномы, у крыс обеих групп

выявляются значительные изменения в тимусе. Происходит уменьшение массы тимуса, а также площади мозгового и толщины коркового вещества (рисунок 5).

0,8

2

5 0,7 го

Р 0,6

| 0,5 <и

О 0,4 о

о 0,3

га

2 0,2 о

5 0,1 .а

£ о

¿Г

Ч?

V-

сС

Рисунок 5 - Изменение площади мозгового вещества тимуса у интактных крыс и после введения канцерогена в общей дозе 40 мг/кг

При введении канцерогена в общей дозе 40 мг/кг при люминесцентной микроскопии выявляются дольки с малым количеством клеток, а в некоторых дольках визуализируются лишь их остатки в виде сплошных оранжеватых пятен или гранул с расплывчатыми контурами. Премедуллярные клетки малочисленны, встречаются скопления субкапсулярных клеток до 8-10 в поле зрения. Обнаруженное нами уменьшение общего количества люминесцирующих клеток, их разрыхление и ослабление люминесценции, на наш взгляд, может свидетельствовать о том, что на этом сроке исследования в тимусе происходят процессы утилизации погибшей ткани.

При введении канцерогена в дозе 80 мг/кг выявляются дольки измененной формы со множеством скоплений крупных, глыбчатых, ярко-желтых и наполненных гранулами люминесцирующих гранулярных клеток, наибольший диаметр которых достигает 22,3 ± 0,6 мкм. При слиянии нескольких ЛГК часто образуются большие клеточные конгломераты (рисунок 6).

Рисунок 6 - Тимус. 120 суток после окончания введения канцерогена в общей дозе 80 мг/кг. Крупные премедуллярные клетки на фоне ярко светящейся тимоцитарной паренхимы. МИКРОМЕД 3 ЛЮМ. Метод Фалька. Ув. бООх

На этом сроке исследования при введении канцерогена в меньшей дозе содержание биогенных аминов изменяется неоднозначно. Лишь содержание гистамина по сравнению с интактными животными достоверно возрастает в премедуллярных и субкапсулярных клетках, а также в тимоцитах коркового и мозгового вещества.

Если рассматривать группу животных с введением канцерогена в двойной дозе, то по сравнению с предыдущим сроком исследования выявляется достоверное уменьшение уровня биогенных аминов в исследуемых структурах. Однако уровень гистамина в тимоцитах коркового вещества превышает норму в 1,7 раза, хотя содержание остальных биоаминов в изучаемых клетках достоверно не меняется.

На окрашенных гематоксилином и эозином срезах выявляется увеличение количества жировой и соединительной ткани. Обнаруживаются дольки с корковым веществом в сочетании с мелкоочаговыми фрагментами мозгового вещества.

Количество тучных клеток вне зависимости от дозы введения канцерогена увеличивается в основном за счет недегранулированных и слабодегранулированных форм. При этом у крыс с введением канцерогена в дозе 40 мг/кг эти клетки обнаруживаются в паренхиме тимуса.

Иммуногистохимическим методами у крыс обеих групп установлено увеличение числа дендритных и клеток, положительных к триптазе и уменьшение количества СОЗ+- и РСЫА+ клеток в тимусе. Количество же незрелых тимоцитов при введении канцерогена в меньшей дозе уменьшается, а при введении 1,2-диметилгидразина в дозе 80 мг/кг структурные изменения ткани тимуса характеризуются уменьшением плотности расположения С01А+ клеток, но в отдельных долях все же встречаются скопления этих клеток. Существует гипотеза о том, что при опухолевом росте может усиливаться выход незрелых тимоцитов, которые мигрируют в опухоль, где они поддерживают рост трансформированных клеток, так называемая лимфозависимая фаза роста (К. М. МаНп<1а е1 а11, 1998).

Таким образом, полученные нами изменения морфофункционального состояния тимуса при введении 1,2-диметилгидразина свидетельствуют о развитии акцидентальной инволюции (Е.Г. Турицына, 2009; Д.В. Васендин и др., 2011), выражающейся в уменьшении размеров коркового и мозгового вещества, в изменении формы долек, в снижении массы тимуса, в жировом перерождении органа, в дисбалансе уровня биогенных аминов со значительным возрастанием доли гистамина, который выступает как фактор, тормозящий процессы восстановления, в увеличении количества тучных и дендритных клеток, а также в уменьшении количества С01А+-, РСЫА+- и СОЗ+ клеток. При этом процесс более выражен и начинается раньше при введении канцерогена в общей дозе 80 мг/кг.

Ключевая роль в процессах развития акцидентальной инволюции тимуса принадлежит дендритным, а также тучным клеткам. Большое значение, по-нашему мнению, принадлежит и биогенным аминам.

ВЫВОДЫ

1. Введение 1,2-диметилгидразина приводит к изменению структуры тимуса, уменьшению его массы, толщины коркового и площади мозгового вещества долек, к увеличению жировой и соединительной ткани, значительному увеличению количества и величины тимусных люминесцирующих клеток. При этом данные изменения при введении 1,2-диметилгидразина в общей дозе 40 мг/кг обнаруживаются через 120 суток после окончания курса инъекций. При введении канцерогена в общей дозе 80 мг/кг эти изменения отмечаются уже через 60 суток.

2. Морфологические изменения в тимусе после введения 1,2-диметилгидразина вне зависимости от дозы сопровождаются изменениями интенсивности люминесценции его биоаминсодержащих структур: регистрируются волнообразные изменения уровня серотонина, гистамина, катехоламинов во всех изучаемых структурах тимуса через 30-120 суток. Увеличение их активности наблюдается через 30 суток, снижение - через 60 суток,

пик их содержания приходится на 90 сутки, повторное, но менее значительное уменьшение обнаруживается через 120 суток.

3. Введение 1,2-диметилгидразина приводит к изменению отношения (СТ+ГСТ)/КА в структурах тимуса через 30, 60, 90 и 120 суток. Вне зависимости от дозы введения канцерогена во всех исследуемых структурах тимуса эти изменения носят волнообразный характер: при введении канцерогена в дозе 80 мг/кг наблюдается двухфазное увеличение этого показателя во всех исследуемых структурах тимуса через 60 и 120 суток; при введении 1,2-диметилгидразина в меньшей дозе данное отношение также увеличивается через 60 и 120 суток, но только в премедуллярных и тучных клетках и в тимоцитах их микроокружения, в остальных структурах оно повышается через 30 и 90 суток.

4. Введение 1,2-диметилгидразина в общей дозе 80 мг/кг сопровождается нарастанием числа тучных клеток в основном за счет дегранулированных форм. При использовании канцерогена в меньшей дозе количество тучных клеток увеличивается преимущественно за счет недегранулированных форм. При этом через 90 и 120 суток тучные клетки обнаруживаются не только в соединительнотканных перегородках, но и в паренхиме тимуса.

5. Введение 1,2-диметилгидразина приводит к разнонаправленным изменениям морфологии клеток тимуса: первое увеличение дендритных клеток более чем в два раза отмечается через 60 суток после окончания введения 1,2-диметилгидразина в общей дозе 80 мг/кг. Через 90 суток после окончания введения 1,2-диметилгидразина у животных обеих групп выявлено увеличение числа дендритных и тучных, СБЗ+- РСИА+- и С01А+- клеток; через 120 суток - уменьшение СОЗ+- РСМА+- и С01А+- клеток.

6. Введение 1,2-диметилгидразина приводит к развитию акцидентальной инволюции тимуса, которая имеет выраженный фазовый характер. Первая фаза акцидентальной инволюции тимуса формируется при введении канцерогена в общей дозе 40 мг/кг только через 90 суток, вторая и третья - через 120 суток. При введении 1,2-диметилгидразина в общей дозе 80 мг/кг первая, вторая и третья фаза акцидентальной инволюции формируются через 90, 60 и 120 суток после окончания курса инъекций и свидетельствуют о функциональном напряжении иммунной системы.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бессонова, К.В. Экспериментальный канцерогенез в условиях приобретенного иммунодефицита / К.В. Бессонова, Е.В. Москвичев, О.Ю. Кострова, Г.Ю. Стручко // Студент и научно-технический прогресс: Мат. XLVII Международной научной студенческой конференции, посвященная 50-летию НГУ. - Новосибирск. - 2009. - С. 5.

2. Морфология рака толстой кишки после применения 1,2-диметилгидразин дигидрохлорида / Е.В. Москвичев, Г.Ю. Стручко, JI.M. Меркулова, О.Ю. Кострова и др. // Вестник новых медицинских технологий.

- 2009, Т. XVI, № 2. - Сборник материалов 8-й Всероссийской университетской научно-практической конф. молодых ученых по медицине.

- Тула. 2009. - С. 121-122.

3. Морфофункциональное исследование тимуса через 1-4 месяца после окончания курса введения канцерогена. / Г.Ю. Стручко, JI.M. Меркулова, Е.В. Москвичев, О.Ю. Кострова и др. // Вестник новых медицинских технологий. - 2009, Т. XVI, № 2. - Сборник материалов 8-й Всероссийской университетской научно-практической конф. молодых ученых по медицине.

- Тула. 2009. - С. 163-164.

4. Влияние канцерогенеза на морфофункциональное состояние тимуса / JI.M. Меркулова, Г.Ю. Стручко, Е.В. Москвичев, М.Н. Михайлова, О.Ю. Кострова и др. // Вопросы клинической и экспериментальной медицины: Мат. научно-практ. конф., поев. 90-летию со дня рождения проф. Амосовой В.В. - Чебоксары, Изд-во Чуваш, ун-та. 2009. - С. 215-219.

5. Развитие акцидентальной инволюции тимуса на фоне использования канцерогена / JI.M. Меркулова, Г.Ю. Стручко, Е.В. Москвичев, М.Н. Михайлова, О.Ю. Кострова // Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической морфологии: мат. международ, науч. конф., поев. 65-летию ивановской школы лимфологов. - Иваново. 2009. - С. 161-166.

6. Морфофункциональное состояние тимуса в условиях развития опухоли толстой кишки / Г.Ю. Стручко, JI.M. Меркулова, Е.В. Москвичев, М.Н. Михайлова, О.Ю. Кострова и др. // Здравоохранение Чувашии. 2009. -№ 3. - С. 47-51.

7. Люминесцентно-гистохимическое исследование биоаминсодержащих структур тимуса при введении канцерогена на фоне вторичного иммунодефицита / Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко, О.Ю. Кострова и др. // Клиническая и экспериментальная медицина: сб. науч. тр. к 15-летию Диагностического центра ГУЗ «Республиканская клиническая больница» МЗ и CP ЧР. - Чебоксары. 2010. - С. 130-132.

8. Инволюция тимуса как последствие экспериментального канцерогенеза / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев, О.Ю.

Кострова и др. // Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия. -Оренбург. 2010. Вып. 10,- С. 84-87.

9. Кострова, О.Ю. Тучноклеточная популяция тимуса при введении канцерогена на фоне иммуносупрессии / О.Ю. Кострова, Г.Ю. Стручко // Мат. XVI Всероссийской науч-практ. конф. «Молодые ученые в медицине» (Казань, 22-23 апреля 2011 г.). - Казань. 2011. - С. 128.

10. Морфологические особенности опухоли толстой кишки при вторичном иммунодефиците / Г.Ю. Стручко, Е.В. Москвичев, О.Ю. Кострова и др. // Мат. XVI Всероссийской науч-практ. конф. «Молодые ученые в медицине» (Казань, 22-23 апреля 2011 г.). - Казань. 2011. - С.134-135.

11. Морфофункциональное исследование тимуса при введении 1,2-диметилгидразина на фоне вторичного иммунодефицита / Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко, О.Ю. Кострова и др. // Аллергология и иммунология: Мат. XVI Международного конгресса по реабилитации в медицине и иммунореабилитации. Париж. Франция. 30 апреля-3 мая 2011г. Т. 12. - № 1. -С. 47.

12. Акцидентальная инволюция тимуса на фоне развития злокачественной опухоли, осложненной иммунодефицитом / Г.Ю. Стручко, Е.В. Москвичев, Л.М. Меркулова, О.Ю. Кострова и др. // Мат. II Всероссийской науч.-практ. конф. с междунар. участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии». Курск, 17-19 мая 2011.-С. 256-257.

13. Исследование особенностей развития злокачественной опухоли при различном иммуноэндокринном статусе / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев, О.Ю. Кострова и др. // Мат. научно-практ. конф. «Вопросы клинической медицины». - Вып. 1. - Чебоксары,- 2011.- С. 174-177.

14. Участие дендритных и нейроэндокринных клеток тимуса в развитии его инволюции при формировании экспериментальной опухоли толстой кишки / М.Н. Михайлова, Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, О.Ю. Кострова и др. // Вестник Чувашского университета. -Чебоксары. - 2011. - № 3. С. 377-383.

15. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика опухолей желудочно-кишечного тракта на фоне иммунной недостаточности / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев, О.Ю. Кострова и др. // Вестник Чувашского университета. - Чебоксары, 2011. - № 3. С. 450-456.

16. Иммуногистохимическое исследование тимуса на фоне злокачественного роста / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев, М.Н. Михайлова, О.Ю. Кострова и др. // Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия,- Оренбург. - 2011. Вып. 11. - С. 25-29.

17. Морфология тимуса при канцерогенезе в зависимости от кратности введения 1,2-диметилгилразина / О.Ю. Кострова, Г.Ю. Стручко, Л.М.

Меркулова и др. // Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия. Оренбург. - 2011. - Вып. 11. - С. 30-36.

18. Люминесцирующие гранулярные клетки тимуса при развитии экспериментальной опухоли толстой кишки / Е.Г. Драндрова, Г.Ю. Стручко, О.Ю. Кострова и др. // Сб. трудов XII Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке» 7-10 декабря 2011, г. Москва - С.66-68.

19. Иммуногистохимическая характеристика акцидентальной инволюции тимуса после спленэктомии / Е.В. Москвичев, Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко, М.Н. Михайлова, О.Ю. Кострова // Вестник Национального медико-хирургического Центра им. Н.И. Пирогова. -2012. - Т. 7. - № 2. - С. 40-43.

20. Цитоархитектоника тимуса через 5 месяцев после окончания курса введения канцерогена на фоне вторичного иммунодефицита / Г.Ю. Стручко, О.Ю. Кострова, М.Н. Михайлова, И.С. Стоменская // Мат. V Всероссийской научно-практич. Конф. «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». - Москва, 18 мая 2012. - С. 130132.

21. Акцидентальная инволюция тимуса крыс на фоне канцерогенеза / О.Ю. Кострова, Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, М.Н. Михайлова и др. // Актуальные вопросы морфологии: труды международной конференции, поев. 100-летию со дня рождения проф. Б.З. Перлина. - Кишинев (20-22 сентября), 2012. - С.274-277.

22. Акцидентальная инволюция тимуса крыс на фоне развития аденокарциноми толстой кишки, индуцируемой 1,2-диметилгидразином на фоне удаления селезенки / О.Ю. Кострова, М.Н. Михайлова, Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова и др. // Вестник Чувашского университета. -Чебоксары. - 2012. - № 3. - С.416-423.

23. Кострова, О.Ю. Акцидентальная инволюция тимуса крыс на фоне развития аденокарциномы толстой кишки, вызванной введением канцерогена в различной дозировке / О.Ю. Кострова // Фундаментальные исследования. - 2013. -№3 часть 3. - С.321-324.

24. Тучные клетки тимуса на фоне развития аденокарциномы толстой кишки / О.Ю. Кострова, Л.М. Меркулова, Г.Ю. Стручко, М.Н. Михайлова и др. // Современные проблемы науки и образования, 2013-№2. http ://www.science-education.ru/108-8714.

Подписано в печать 23.05.2013 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №11.

Отпечатано в РИО БНУ «Чувашский государственный институт гуманитарных наук»

428015, г. Чебоксары, Московский пр., 29, корп.1. Тел. (8352) 45-02-50, 45-07-87,45-00-05 Факс (8352) 45-00-05 E-mail: human2000@yandex/ru