Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональное исследование стволовых клеток беспозвоночных животных с репродуктивной стратегией, включающей бесполое размножение

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональное исследование стволовых клеток беспозвоночных животных с репродуктивной стратегией, включающей бесполое размножение"



На правах рукописи

АХМАДИЕВА Анна Владимировна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК БЕСПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ С РЕПРОДУКТИВНОЙ СТРАТЕГИЕЙ, ВКЛЮЧАЮЩЕЙ БЕСПОЛОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ

03 00 25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток - 2008

003163410

Работа выполнена в Институте биологии моря имени А. В. Жирмунского

ДВО РАН

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор

Валерия Васильевна Исаева

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук

Владимир Владимирович Юшин Кандидат биологических наук, доцент Наталья Павловна Токмакова

Ведущая организация: Институт биологии развития

им Н К Кольцова РАН

Защита состоится февраля 2008 г в 10 часов на заседании

диссертационного совета Д 005 008 01 при Институте биологии моря имени А В Жирмунского ДВО РАН по адресу 690041, Владивосток, ул. Пальчевского, 17 Телефон- (4232) 310-905, факс (4232) 310-900, e-mail: inmarbio@mail primorve ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря ДВО РАН (690041, Владивосток, ул Пальчевского, 17) Отзывы просим присылать на e-mail- mvaschenko@mail ru

Автореферат разослан

января 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук б) üuc&f&fftHZtl? ^ А Ващенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Эмбриональные стволовые клетки человека широко исследуются ввиду перспектив их практического применения для клеточной терапии, такие исследования составляют основу новых биомедицинских технологий Для понимания клеточных, субклеточных и молекулярных механизмов, определяющих особенности морфофункциональной организации тотипотентных стволовых клеток, дающих начало всем клеточным линиям и всему спектру дифференцировок клеток Metazoa, необходимо их сравнительное исследование у различных представителей многоклеточных животных Однако стволовые клетки беспозвоночных животных, как правило, значительно менее изучены сравнительно с эмбриональными стволовыми клетками млекопитающих У беспозвоночных с бесполым размножением линия тотипотентных стволовых клеток поддерживается в течение всей жизни организма это археоциты губок, интерстициальные клетки кишечнополостных, необласты турбеллярий и стволовые клетки колониальных асцидий (Agata, Watanabe, 1999, Shibata et al, 1999, Weissman, 2000, Gschwenter et al, 2001, Peter et al, 2001 и др) Стволовые клетки колониальных беспозвоночных других таксонов почти не изучены, стволовые же клетки корнеголовых ракообразных, некоторые представители которых имеют колониальную стадию жизненного цикла, впервые обнаружены нами (Isaeva et al, 2001)

Множество молекулярно-биологических данных свидетельствует о том, что поддержание организации и функциональной активности зародышевой плазмы обеспечивается консервативными механизмами, общими для всех исследованных Metazoa от губок, гидроидов и планарий до млекопитающих (Ikenishi, 1998, Shibata, 1999, Wyhe, 1999, Metazoa, Cooley, 2000, Seydoux, Braun, 2006, Strome, Lehman, 2007) Основываясь на литературных и

собственных данных, мы предполагаем подобную консервативность ультраструктурной организации стволовых клеток

Стволовые клетки исследованных нами колониальных беспозвоночных обладают морфологическими характеристиками, общими для стволовых, эмбриональных, первичных половых и гениальных клеток всех Metazoa крупным светлым ядром с деконденсированным хроматином, крупным ядрышком, компактной базофильной цитоплазмой, детерминантами зародышевой плазмы характерной ультраструктурной морфологии (Isaeva et al, 2001, Ахмадиева и др , 2007, Исаева и др , 2007)

Работа направлена на решение проблемы общности и консерватизма морфофункциональной организации тотипотентных стволовых клеток Metazoa путем изучения беспозвоночных животных с бесполым размножением и постоянной самоподдерживающейся линией стволовых клеток, способных продуцировать как половые, так и соматические клетки Молекулярно-биологические данные других авторов свидетельствуют о древних консервативных механизмах функциональной организации детерминантов линии половых клеток Metazoa Терминальные (половые, или зародышевые) детерминанты исследовались в качестве ультраструктурного маркера тотипотентных стволовых клеток беспозвоночных животных Цитохимическим маркером стволовых клеток была избрана цитохимическая реакция выявления активности щелочной фосфатазы, ранее широко использованная для идентификации эмбриональных стволовых клеток и первичных половых клеток млекопитающих (Chiquoine, 1954, Mintz, 1959, Talbot et al, 1993, Thomson et al, 1995, 1998 и др) На беспозвоночных животных подобные исследования впервые проведены нами В качестве молекулярного маркера тотипотентных стволовых клеток штанарий, гидры и колониальных корнеголовых (Shibata et al, 1999, Mochizuki et al, 2001, Shukalyuk et al, 2007) применено выявление специфической избирательной экспрессии продукта гена vasa методом гибридизации in situ

Цель работы - исследовать структурную и функциональную организацию стволовых клеток представителей пяти типов многоклеточных животных РопГега, Сгнс1апа, Р1а1уЬе1ттЛе8, Aгthropoda и СЬойаШ в связи с теоретической и практической важностью изучения эмбриональных стволовых клеток, а также проблемами обособления линий половых и соматических клеток, бесполого размножения, колониальное™, стратегии размножения и развития Ме1ахоа

Для достижения цели исследования поставлены следующие задачи

1 Изучить ультраструктурные особенности стволовых клеток губки ОзсагеНа та1ак1ю\ч (РопГега)

2 Изучить ультраструктурные, цитохимические и иммунохимические особенности стволовых клеток гидроидного полипа ОЬека longlsslma (Спк1апа)

3 Изучить ультраструктурные особенности стволовых и гениальных клеток планарии Си-агска (Огщезш) Пцгта (РЫуЬеЫтШез)

4 Изучить ультраструктурные, цитохимические и иммунохимические особенности стволовых и эмбриональных клеток корнеголовых ракообразных Ре1^а$1еге11а ¡р ааЬв и Ро1уаясш ро1у£епеа (АгШгорос1а)

5 Изучить ультраструктурные и цитохимические особенности стволовых клеток асцидии Во!гу11т шЬегсиш (СИогсЫа)

6 Провести сравнительный морфофункциональный анализ стволовых клеток исследованных представителей Ме1агоа

Научная новизна

Сведения о стволовых клетках большинства колониальных беспозвоночных неполны, а для некоторых таксонов до сих пор отсутствуют Мы впервые начали проводить на беспозвоночных животных исследования с выявлением активности щелочной фосфотазы как маркера тотипотентных (или плюрипотентных) стволовых клеток

Исследованы стволовые клетки (археоциты) у бесспикульной губки Oscarella malakhovi В цитоплазме археоцитов впервые обнаружены терминальные гранулы

В больших интерстициальных клетках колониального гидроида Obelia longissima найдены терминальные гранулы (именуемые исследователями других видов гидроидов плотными телами) Выявлено специфическое окрашивание интерстициальных клеток при цитохимической реакции на щелочную фосфатазу, найдена позитивная реакция больших интерстициальных клеток при иммунохимической реакции выявления ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA)

В необластах (стволовых клетках) и гениальных клетках планарии Girardia tigrina найдены терминальные гранулы типичной морфологии (именуемые у планарий хроматоидными телами)

Стволовые клетки колониальных корнеголовых ракообразных впервые обнаружены и исследованы нами Показано, что при почковании столонов интерны стволовые клетки дают начало зачаткам бластозооидов, а затем мигрируют в зачаток яичника, становясь гениальными клетками В стволовых клетках Peltogasterella gracilis найдены терминальные гранулы типичной морфологии В терминальных гранулах дробящихся эмбрионов Polyascus polygenea обнаружена специфическая избирательная экспрессия продукта гена vasa - маркера клеток половой линии Metazoa и тотипотентных стволовых клеток беспозвоночных, размножающихся бесполым путем Стволовые клетки Peltogasterella gracilis - единственный тип клеток, проявляющих интенсивную позитивную реакцию при вьивлении ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA)

В ранних почках и сосудистой системе колонии Botryllus tuberatus впервые обнаружены недифференцированные клетки, обладающие морфологическими признаками стволовых и первичных половых клеток многоклеточных животных Стволовые клетки содержат мелкие терминальные гранулы, сходные с материалом nuage позвоночных животных.

В развивающихся почках и некоторых клетках популяции гемоцитов выявлена интенсивная экспрессия активности щелочной фосфатазы, цитохимического маркера эмбриональных стволовых и первичных половых клеток позвоночных животных

Таким образом, в результате проведенного анализа выявлены общие ультраструктурные, а также некоторые цитохимические и молекулярные особенности строения стволовых клеток у исследованных представителей типов Ponfera, Cradana, Platyhelminthes, Arthropoda и Chordata Теоретическое и практическое значение

Показано, что у беспозвоночных животных с бесполым размножением тотипотентные (по меньшей мере, плюрипотентные) клетки - источник клеточного материала для реализации жизненной стратегии, включающей и половое, и бесполое размножение, эти клетки способны дифференцироваться в половые и соматические клетки Эти клетки обладают эволюционно консервативными чертами морфофункциональной организации, объединяющими их с тотипотентными клетками раннего зародыша и клетками половой линии Результаты работы могут быть использованы в практике преподавания клеточной биологии и биологии развития студентам-биологам

Апробация работы

Материалы исследований докладывались на конференции ИБМ ДВО РАН (2007 г), на научных семинарах лаборатории продукционной биологии ИБМ ДВО РАН (2005, 2006, 2007 гт), были представлены в виде стендового сообщения на конференции по клеточной биологии в Сан-Франциско (The American Society for Cell Biology, 45th Annual Meeting, 2005) Публикации

По теме диссертации опубликованы 5 статей, в том числе 4 статьи в журналах из списка, рекомендуемого ВАК, 2 тезисов, 1 статья принята к печати

Структура работы

Диссертация содержит 117 страниц, включает 75 рисунков и состоит из следующих разделов введение, обзор литературы, материал и методы, собственные данные, обсуждение, заключение, выводы и список литературы, включающий 151 наименование, из них 136 на иностранных языках

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

Биологические и биомедицинские исследования стволовых клеток млекопитающих активно проводятся в связи с перспективами клеточной терапии, однако ключевые субклеточные и молекулярные механизмы тотипотентности и потенциального бессмертия стволовых клеток до сих пор недостаточно изучены Для понимания этих фундаментальных механизмов необходимо сравнительное исследование стволовых и половых клеток различных представителей многоклеточных животных Согласно общепринятым представлениям, стволовые клетки - это клетки эмбрионов или взрослых организмов, способные репродуцировать себя в течение длительного периода, а в случае взрослых организмов - на протяжении всей жизни организма, эта способность стволовых клеток называется самообновлением Тотипотентные клетки могут дать начало всем клеточным типам развивающегося организма Плюрипотентные (мультипотентные) стволовые клетки способны дать многие типы клеток (МагеЬак й а1, 2001, \Vinslow, 2001)

Репродуктивная стратегия многоклеточных животных может включать как половое, так и бесполое размножение У размножающихся лишь половым путем организмов в раннем эмбриогенезе отделяется линия первичных половых клеток, сохраняющих тотипотентность и дающих начало гаметам, а после слияния яйцеклетки и спермия - тотипотентной зиготе, способной к развитию всех типов клеток организма следующего поколения (\Vylie, 1999, Наг, 2000) Клетки половой линии могут быть

идентифицированы и прослежены в ходе развития организма благодаря присутствию специализированной области цитоплазмы, называемой терминальной (половой, зародышевой) плазмой, включающей митохондрии и специфические ультраструктурные маркеры - терминальные (половые) детерминанты Половые детерминанты представлены гранулярным или фибриллярным материалом, именуемым у различных животных полярными, или терминальными гранулами (телами), хроматоидными, перинуклеарными или плотными телами, нуаж (nuage) и т д (Mahowald, 1971, 2001, Beams, Kessel, 1974, Eddy, 1975, Айзенштадт, 1984, Ikemshi, 1998, Saffman, Lasko, 1999, Houston, King, 2000, Исаева, Реунов, 2001, Matova, Cooley, 2001, Seydoux, Braun, 2006)

Показано, что локализованные в половых детерминантах молекулы вовлечены в детерминацию клеток половой линии, а кодирующие их гены эволюционно консервативны у различных исследованных представителей Metazoa - от губок и гидроидов до млекопитающих (Ikemshi, 1998, Saffman, Lasko, 1999, Houston, King, 2000, Matova, Cooley, 2001, Seydoux, Braun, 2006) В частности, в составе терминальных гранул представителей нематод, планарий, насекомых и позвоночных найден белковый продукт (РНК-хеликаза) гена vasa или его гомологов - один из ключевых детерминан гов линии половых клеток (Ding, Lipshitz, 1993, Ikemshi, 1998, Saffman, Lasko, 1999, Shibata et al, 1999, Houston, King, 2000, Matova, Cooley, 2001, Mochizuki et al, 2001, Seydoux, Braun, 2006) Таким образом, особенности структурной организации цитоплазмы и функциональной активности клеток половой линии обеспечиваются эволюционно консервативными механизмами, общими для всех исследованных многоклеточных животных

У беспозвоночных животных с чередованием полового и бесполого размножения не происходит раннего выделения линии половых клеток (Buss, 1999), тогда как линия тотипотентных (по крайней мере мультипотентных) стволовых клеток, способных к дифференциации во все типы (или широкий спектр) клеток организма, включая клетки половой линии, поддерживается

митотическим делением в течение всей жизни индивида или колонии Примерами таких стволовых клеток являются археоциты губок, интерстициальные клетки книдарий, необласты турбеллярий и стволовые клетки колониальных асцидий и корнеголовых ракообразных (Bode, 1996, Agata, Watanabe, 1999, Shibata et al, 1999, Weissman, 2ООО, Gschwentner et al, 2001, Peter et al, 2001, Shukalyuk et al, 2005, 2007) Морфофункциональные характеристики такого рода стволовых клеток оказываются общими для эмбриональных стволовых клеток и клеток половой линии всех исследованных многоклеточных животных высокое ядерно-цитоплазматическое отношение, крупное ядро с диффузным хроматином и большим ядрышком, базофильная цитоплазма, включающая специфические структурированные терминальные гранулы, содержащие набор специфических регуляторных молекул Тотипотентные стволовые клетки обеспечивают бесполое и половое размножение, оказываясь предшественниками и половых, и соматических клеток, что наиболее убедительно продемонстрировано на планариях (Bagufla et al, 1989, Shibata et al, 1999, Peter et al, 2001) Сведения о стволовых клетках большинства колониальных беспозвоночных неполны, а для некоторых таксонов отсутствуют

Электронно-плотные тела, подобные или идентичные терминальным гранулам клеток половой линии, обнаружены в тотипотентных стволовых клетках (необластах) планарий (Shibata et al, 1999, Isaeva et al, 2005), больших интерстициальных клетках гидры Pelmatohydra robusta (Noda, Kanai, 1977, Mochizuki et al, 2001) и стволовых клетках колониальных корнеголовых ракообразных (Shukalyuk et al, 2005) У планарий (Shibata et al, 1999), гидры (Mochizuki et al, 2001) и колониального корнеголового ракообразного Polyascus polygenea (Shukalyuk et al, 2007) показано присутствие продукта гомолога гена vasa, вовлеченного в детерминацию тотипотентности клеток, не только в клетках половой линии, но и в тотипотентных стволовых клетках

Материал и методы

Сбор материала

Oscarella malakhovi

Губка Oscarella malakhovi Ereskovsky, 2006 была собрана в районе Морской биологической станции (МБС) «Восток» Института биологии моря имени А В Жирмунского ДВО РАН (на «Бакланьих камнях») с глубины 0,35-0,55 м в августе 2006 г и июле 2007 г

Obelia longissima

Гидроидный полип Obelia longissima Pallas, 1766 был собран на побережье Уссурийского залива (зал Петра Великого Японского моря) в районе бухты Тихой, в феврале-марте 2005 г , когда происходит почкование колоний и образование новых зооидов

Girardia (Dugesia) tigrina

Для исследования были использованы планарии Girardia (Dugesia)

tigrina De Vries, Sluys, 1991 бесполой расы, культивируемые в лабораторных условиях при комнатной температуре в стеклянной посуде Кормом для планарий служили трубочник и мотыль

Peltogasterella gracilis, Polyascus polygenea, Peltogaster reticulatus

Корнеголовые ракообразные Peltogasterella gracilis, Kruger, 1912, паразит раков-отшельников Pagurus pectmatus и Pagiirus ochotensis, Polyascus polygenea Glenner, Lutzen, Takahashi, 2003, паразитирующая на прибрежном крабе Hemigrapsus sanguineus, и Peltogaster reticulatus Shuno, паразит рака-отшельника Pagunis proximus , были собраны в осенне-летний период 19982007 гг в районе Морской биологической станции (МБС) «Восток» Института биологии моря имени А В Жирмунского ДВО РАН на глубинах от 0,1-0,5 м до 1,5-5 м

Botryllus tuberatus

Колонии асцидии Botryllus tuberatus Ritter et Forsyth, 1917 были собраны в районе Морской биологической станции «Восток» (МБС) Института биологии моря имени А В Жирмунского ДВО РАН (на «Бакланьих камнях») с глубины 0,35-0,55 м в сентябре 2005 г и в августе 2006 г

Гистологические исследования

Для гистологического исследования участки колоний Obeha longissima, Botryllus tuberatus и Oscarella malakhovi фиксировали жидкостью Буэна, образцы обрабатывали по стандартным гистологическим методикам, обезвоживали, заливали в парафин, серийные срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином Караччи и заключали в канадский бальзам

Трансмиссионная электронная микроскопия

Для электронно-микроскопического анализа участки колоний фиксировали 2 5% раствором глютаральдегида в какодилатном буфере (pH 7 4), дофиксировали в 2% четырехокиси осмия (OsO,t), дегидратировали этанолом и ацетоном и заключали в эпон-аралдит Ультратонкие срезы (50-60 нм) получали с помощью ультратома Ultracut-E (Reichert), контрастировали 2% водным раствором уранилацетата и цитрата свинца и изучали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEM 100В

Сканирующая электронная микроскопия

Для сканирующей электронной микроскопии небольшие участки колонии Obelia longissima и целых медуз фиксировали 10% формалином на морской воде и 2 5% глутаральдегидом на какодилатном буфере с осмомолярностью 1100 моем В дальнейшем материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне, высушивали методом критической точки Затем образцы монтировали на металлические столики электропроводным клеем и после напыления золотом и платиной исследовали в сканирующих микроскопах Hitachi и LEO-430

Цитохимические исследования

Для выявления активности щелочной фосфатазы использовали принятый для эмбриональных стволовых клеток млекопитающих протокол с некоторыми модификациями методики применительно к использованному материалу (Исаева и др , 2003)

Иммунохимические исследования

Для метода непрямого авидин-биотинового пероксидазного иммунохимического мечения (PCNA) парафиновые срезы толщиной 5-10 мкм депарафинировали, устраняли неспецифическое окрашивание (фон) Для увеличения проницаемости мембран прогревали препараты с водным раствором детергента Препараты, находящиеся в растворе детергента, охлаждали до комнатной температуры, промывали бидистиллированной водой, нагретой до 37°С Затем предварительно окантованные препараты инкубировали в растворе 3% перекиси водорода на 2 М фосфатном буфере и промывали троекратно в бидистиллированной воде

Для связывания первых (специфических) антител с тканевьм антигеном препараты инкубировали во влажной камере с моноклональными антителами мыши (monoclonal mouse anti-PCNA antibodies, clone PC 10, ready-to-use) при температуре 37°С Далее многократно промывали дистиллированной водой Для взаимодействия вторых антител, связанных с биотином, с первыми антителами препараты при температуре 37° С инкубировали со вторыми, биотинилированными антителами (Biotimlated link Dako) Далее отмывали дистиллированной водой Для взаимодействия вторых антител со стрептавидином-биотинилированной пероксидазой препараты инкубировали со стрептавидин-биотин-пероксидазным комплексом, после чего отмывали дистиллированной водой Стрептавидин-биотиновый пероксидазный комплекс выявляли с помощью 3 3 '-диаминбензидин-тетрахлорида (DAB-chromogen DAKO), приготовленного на 0,02 М фосфатном буфере (pH 7,2) Для активации 3 3 '-диаминбензидина-тетрахлорида в раствор добавляли 5

мкл 3% перекиси водорода Препараты инкубировали на водяной бане при температуре 37°С, промывали дистиллированной водой, докрашивали гематоксилином, обезвоживали по стандартной методике и заключали в бальзам

Выявление продукта гомолога гена vasa

При молекулярно-генетических исследованиях были проведены выделение ДНК, амплификация с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), клонирование и секвенирование ДНК экстрагировалась из свежего или фиксированного в 96% этиловом спирте материала, проводилась ПЦР-амшшфикация фрагментов гомологов генов vasa семейства DEAD-box, экспрессирующихся в стволовых и половых клетках различных Metazoa (Shukalyuk et al, 2007) С целью проведения молекулярной гибридизации in situ на тотальных препаратах столонов интерны применены смысловые и антисмысловые зонды РНК, синтезированной на клонах фрагментов ДНК, гомологичных гену vasa и другим генам семейства DEAD, меченые дигоксигенином (Shukalyuk et al, 2007)

Результаты исследования

Oscarella malakhovi (Porifera)

Бесспикульная губка Oscarella malakhovi описана Ересковским (Erescovsky, 2006) Этим автором изучено гистологическое строение и клеточные типы губки, а также бесполое размножение путем почкования

В июле происходит половое размножение губки и развитие зародышей внутри тела материнской губки

После окончания периода полового размножения наблюдалось почкование губки На полутонких срезах губки в этот период найдены скопления археоцитов, участвующих в образовании почек

Ультраструктурное изучение археоцитов выявляет ядро с диффузным хроматином и крупным ядрышком, ободок цитоплазмы, содержащей

рибосомы, митохондрии и нередко вакуоли Впервые в цитоплазме археоцитов найдены небольшие терминальные тела типичной морфологии, располагающиеся вблизи ядерной оболочки По периферии терминальных тел видны полисомные комплексы

ОЬеИа longissima (Сш()апа)

Интерстициальные и гениальные клетки колониального гидроида ОЬека \ongissima обладают ультраструктурной морфологией, типичной для стволовых и половых клеток всех многоклеточных животных большим ядром с диффузным хроматином и крупным ядрышком, базофильной цитоплазмой, включающей специфические терминальные тела, оогенные клетки содержат также пористые пластинки (АкЬтасЬеуа ьЧ а1, 2005) Наблюдали миграцию стволовых (интерстициальных и первичных половых) клеток внутри столона О longlsslma и их участие в формировании медузоидного поколения Клеточный состав столонов колонии ОЬека longlsslma типичен для гидроидов и включает эпителиально-мышечные эктодермальные и энтодермальные клетки, интерстициальные клетки (1-клетки), а также нематоциты, железистые и нервные клетки

В почкующейся колонии множество крупных 1-клеток мигрирует по мезоглее ценосарка к местам формирования почек, вблизи формирующейся почки и в развивающихся зоовдах найдены многочисленные 1-клетки характерной морфологии с интенсивно базофильной (при окраске гематоксилином) цитоплазмой, крупным светлым ядром и большим ядрышком Гениальные клетки О ¡обмята отличимы от 1-клеток лишь несколько большим размером, ранние ооциты в развивающихся гонозооидах по размеру (20-30 мкм) в полтора-два раза больше крупных 1-клеток Характерной общей ультраструктурной особенностью как крупных 1-клеток, так и гениальных клеток и ооцитов оказываются электронно-плотные терминальные тела Отличительные особенности ооцитов — крупные фагосомы, содержащие остатки вспомогательных клеток, и пористые

пластинки - типичные для оогенных клеток производные ядерной оболочки, отделенные от нее рядами везикул

Цитохимическая реакция выявления активности щелочной фосфатазы вызывала избирательное окрашивание гениальных и i-клеток, причем специфическая кирпично-красная окраска таких клеток по цвету и интенсивности подобна окраске культивируемых эмбриональных стволовых клеток мыши, использованных в качестве контроля Такое избирательное окрашивание выделяло гениальные и i-клетки среди дифференцированных соматических клеток колонии, характеризующихся слабой неспецифической окраской желтого или коричневатого цвета

Применение иммунохимической реакции для выявления ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) показало, что гениальные и 1-клетки отличались от дифференцированных соматических клеток более интенсивным окрашиванием

Girardia (Dugesia) tigrina (Plathyhelminthes)

В лаборатории эмбриологии ИБМ одна из планарий бесполой расы, размножавшейся исключительно путем архитомии в течение 40 лет, отложила два кокона, гистологическое и ультраструктурное исследование этой особи показало наличие гонад и гениальных клеток

Изучение необластов и гениальных клеток планарий бесполой расы и спонтанно сексуализированной особи на ультраструктурном уровне показало присутствие типичных для планарий хроматоидных тел, расположенных вблизи ядерной оболочки, часто у ядерных пор и ранее описанную (Isaeva et al, 2005) трансформацию митохондрий в хроматоидные тела

Peltogasterella gracilis, Polyascus polygenea, Peltogaster reticulatus

(Arthropoda)

Проведено гистологическое и ультраструктурное исследование представителей корнеголовых ракообразных (Crustacea Rhizocephala) -

Peltogasterella gracilis, паразита раков-отшельников, и Polyascus polygenea, паразита прибрежного краба За счет бесполого размножения у некоторых видов корнеголовых на паразитической стадии их жизненного цикла развивается колониальная организация - уникальное явление не только для класса ракообразных, но и для всего типа членистоногих Внутри каждой почки столона формируется компактный кластер недифференцированных стволовых клеток, такие же клетки поодиночке мигрируют внутри столона По нашим данным, стволовые клетки корнеголовых ракообразных обладают морфологическими чертами, общими для эмбриональных, стволовых и половых клеток других многоклеточных животных высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, крупным ядром с деконденсированным хроматином, крупным ядрышком, тонким ободком интенсивно базофильной цитоплазмы с детерминантами зародышевой (половой) плазмы характерной ультраструктурной морфологии После формирования зачатков бластозооидов стволовые клетки мигрируют в развивающийся яичник будущей экстерны, становясь первичными половыми клетками

Таким образом, тотипотентные стволовые клетки колониальных корнеголовых ракообразных служат предшественниками как соматических, так и половых клеток и тем самым обеспечивают их уникальную для представителей членистоногих репродуктивную стратегию с реализацией бесполого и полового размножения

У корнеголового Peltogaster reticulatus, имеющего, как правило, одну экстерну, в интерне найдены столоноподобные структуры и три-четыре зачатка экстерн, наиболее развитые зачатки содержали вителлогенные ооциты Таким образом, этот вид корнеголового также оказался колониальным Вероятно, зрелая экстерна подавляет развитие зачатков, становящееся возможным в случае ее утраты

Репродуктивная стратегия колониальных ракообразных вовлекает трехступенчатый каскад количественного умножения потомства бесполое размножение путем почкования столона интерны, повторное развитие

множественных экстерн и повторные циклы полового размножения каждой экстерны

Цитохимическая реакция выявления активности щелочной фосфатазы у дробящихся эмбрионов Polyascus pofygenea вызывала наиболее интенсивное окрашивание терминальных тел, выявляя их присутствие в каждом бластомере

Применение метода молекулярной гибридизации in situ выявило избирательную специфическую экспрессию РНК гомолога гена vasa в терминальных телах дробящихся эмбрионов Polyascus pofygenea

Botryllus tuberatus (Chordata)

Морфология бластозооидов колониальной асцидии Botryllus tuberatus типична для описанной ранее у представителей рода Botryllus Почка, развивающаяся при паллеальном почковании на латеральной стороне материнского бластозооида, снаружи покрыта эпидермисом, локально связанньм с внутренним атриальным (перибранхиальным) эпителием Внутренний клеточный слой неоднороден и включает, помимо эпителиальных клеток, плотную клеточную массу с морфологическими признаками недифференцированных эмбриональных стволовых клеток Такие клетки содержат крупное ядро с диффузным хроматином и большим плотным ядрышком, объем цитоплазмы невелик относительно размера ядра

Цитоплазма стволовых клеток содержит митохондрии, многочисленные рибосомы, явные морфологические признаки цитодифференциации отсутствуют В цитоплазме некоторых стволовых клеток ранних почек В tuberatus найдены небольшие электронно-плотные тела, контактирующие с ядерной оболочкой, сходные не с крупными терминальными гранулами других исследованных представителей беспозвоночных, но с мелкогранулярным материалом нуаж (nuage), нередко встречающимся у позвоночных Такие мелкие перинуклеарные тельца, сходные с терминальными, встречаются на срезах стволовых клеток, найдены также

центриоли Изолированные клетки подобной морфологии найдены внутри кровеносных сосудов колонии В tuberatus Цитохимическая реакция выявления активности щелочной фосфатазы вызывала интенсивное окрашивание развивающихся почек и части клеточной популяции гемоцитов в сосудах и сосудистых ампулах, причем специфическая кирпично-красная окраска таких клеток по цвету и интенсивности подобна окраске культивируемых эмбриональных стволовых клеток мыши, использованных ранее в качестве контроля По крайней мере часть окрашенных клеток популяции гемоцитов - клетки с крупным ядром и ядрышком и узким ободком интенсивно окрашенной цитоплазмы

Заключение

У беспозвоночных животных с бесполым размножением стволовые клетки способны дифференцироваться как в соматические клетки, так и в гаметы Способность стволовых клеток беспозвоночных дифференцироваться в половые клетки позволяет причислить их к тотипотентным, подобным клеткам половой линии - вне зависимости от широты спектра их соматических производных Подобны общая морфология тотипотентных (плюрипотентных) стволовых клеток, включающая и ультраструктурный уровень (герминальные тела), подвижность, способность к самообновлению путем митотической репродукции, экспрессия гена vasa, активность щелочной фосфатазы Половые и тотипотентные стволовые клетки - привилегированные, «хищные» клетки, склонные к «паразитизму», как это показано на колониальных асцидиях (Pancer et al, 1995, Stoner, Weissman, 1996, Laird, De Tomaso, 2004/2005) Эти клетки способны к конкуренции и подвержены естественному отбору у химерных организмов, например, химерных колоний асцидий (Stoner et al, 1999, Buss, 1999, Weissman, 2000, Laird et al, 2005) Первичные половые и тотипотентные (мультипотентные) стволовые клетки способны к обширным миграциям в

пределах организма и «хомингу» с конечной локализацией в гонадах или местах бесполого размножения или ранения организма

Обнаружение в ранних почках асцидий В íuberatus недифференцированных стволовых клеток снимает теоретические проблемы, связанные с предполагавшимся ранее развитием производных всех трех зародышевых листков из одного лишь эпителиального слоя - атриального эпителия - при паллеальном почковании ботриллид (Bernll, 1961, Иванова-Казас, 1978) Асцидии рода Botryllus, как и колониальные корнеголовые ракообразные, оказываются встроенными в общий ряд многоклеточных животных, репродуктивная стратегия которых включает бесполое размножение, реализуемое за счет резервных, стволовых клеток

Показано, что кодирующие детерминацию клеток половой линии гены эволюционно консервативны у различных исследованных представителей Metazoa от гидроидов до млекопитающих (Mochizuki et al, 2001, Shibata et al, 1999) Селективная экспрессия продукта гена, родственного гену vasa -эволюционно консервативного маркера и детерминанта клеток половой линии - выявлена не только в клетках половой линии, но и в плюрипотентных интерстициальных клетках гидры (Mochizuki et al, 2001), тотипотентных необластах планарий (Shibata et al, 1999), а также в тотипотентных стволовых и эмбриональных клетках корнеголовых ракообразных (Shukalyuk et al, 2007)

Высокий уровень активности щелочной фосфатазы служит маркером эмбриональных стволовых клеток и первичных половых клеток млекопитающих и других представителей позвоночных (см Исаева и др, 2003, Shukalyuk et al, 2005), разработанный на млекопитающих метод идентификации эмбриональных стволовых клеток успешно применен нами для выявления стволовых клеток беспозвоночных животных Высокая активность щелочной фосфатазы обнаружена в интерстициальных клетках, а также гениальных клетках гидроида О longissima, ранних почках и части популяции гемоцитов асцидии В íuberatus, а также стволовых клеток

исследованных видов колониальных корнеголовых Наши данные - первое свидетельство общности этой функциональной характеристики у размножающихся бесполым путем животных столь различных типов, как книдарии, членистоногие и хордовые

Специфическая избирательная экспрессия РНК гомолога гена vasa в терминальных телах всех или большинства бластомеров дробящихся эмбрионов корнеголового Р polygenea свидетельствует о тотипотентности бластомеров и означает радикальную перестройку раннего развития, типичного для членистоногих животных и всей ветви Ecdysozoa - скачок от детерминированного мозаичного дробтения с ранним выделением полового зачатка к регулятивному развитию

Тотипотентные стволовые клетки животных с бесполым размножением, как и клетки половой линии, происходят в раннем эмбриогенезе от тотипотентных бластомеров или их производных, сохранивших тотипотентность Мы полагаем, что эволюционно и онтогенетически родственные тотипотентные эмбриональные, первичные половые и стволовые клетки относятся к популяциям резервных клеток, сохраняющих неограниченный морфогенетический потенциал и способных к реализации полной программы развития

Таким образом, литературные и наши собственные данные свидетельствуют об эволюционном консерватизме и общности морфофункциональной организации клеток половой линии и стволовых клеток, а также субклеточных и молекулярных основ тотипотентности и потенциального бессмертия стволовых и половых клеток Metazoa от губок и гидроидов до млекопитающих Самообновляющийся резерв стволовых клеток беспозвоночных с бесполым размножением - клеточная основа репродуктивной стратегии, включающей половое и бесполое размножение

Выводы

1 В цитоплазме археоцитов (стволовых клеток) губки Oscarella malakhovi (Porifera) впервые обнаружены терминальные гранулы, показано участие археоцитов в почковании этого вида

2 В цитоплазме больших интерстициальных клеток колониального гидроида Obeha longissima (Cnidana) найдены терминальные гранулы, выявлена специфическая экспрессия активности щелочной фосфатазы и ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA)

3 В необластах (стволовых клетках) и гониальных клетках планарии Girardia (Dugesia) tigrina (Platyhelminthes) найдены терминальные гранулы типичной морфологии

4 Стволовые клетки колониального корнеголового ракообразного Polyascus polygenea (Arthropoda) впервые обнаружены и исследованы нами В стволовых клетках корнеголового Peltogasterella gracilis обнаружены терминальные гранулы типичной морфологии, стволовые клетки этого вида проявляют специфическую экспрессию щелочной фосфатазы и ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) Специфическая избирательная экспрессия продукта гена vasa обнаружена в терминальных гранулах всех или большинства бластомеров дробящихся эмбрионов Polyascus polygenea

5 Впервые найдены и описаны стволовые клетки асцидии с паллеальным почкованием Botryllus tuberatus (Chordata), эти клетки содержат мелкие терминальные гранулы, сходные с материалом nuage позвоночных животных, и проявляют избирательную активность щелочной фосфатазы

6 Самообновляющийся резерв тотипотентных стволовых клеток -клеточная основа репродуктивной стратегии, включающей половое и бесполое размножение, такие клетки обладают эволюционно консервативными морфофункциональными характеристиками, общими для эмбриональных, стволовых клеток и клеток половой линии Metazoa

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Isaeva V V , Shukalyuk А I., Trofimova (Akhmadieva) А V, Korn О М , Rybakov А V The structure of colonial interna in Sacculma polygenea (Crustacea Cirripedia Rhizocephala) // Crustacean Research 2001 № 30 P 134-147.

2 Корн О M, Шукалюк А И , Трофимова (Ахмадиева) А В , Исаева В В Репродуктивная стадия жизненного цикла корнеголового ракообразного Polyascus polygenea (Crustacea Cirripedia) // Биология моря 2004 Т 30, № 5 С 380-392

3 Корн О М, Ахмадиева А В , Рыбаков А В Шукалюк А И Уровень зараженности краба Hemigrapsus sanguineus паразитическим ракообразным Polyascus polygenea (Crustacea Cirripedia) в заливе Восток Японского моря//Биология моря 2005. Т 31, №3 С 155-158

4 Akhmadieva А V, Shukalyuk А I, Isaeva V V Interstitial cells m reproductive strategy of colonial hydroid Obeha longissima II The American Society for Cell Biology, 45th Annual Meeting, San Francisco, 2005 P. 752a

5 Исаева В В , Шукалюк А И, Ахмадиева А В. Стволовые клетки беспозвоночных животных с репродуктивной стратегией, включающей бесполое размножение//Биология моря 2007 Т 33, №1 С 3-10

6 Ахмадиева А В , Шукалюк А И , Александрова Я Н , Исаева В.В Стволовые клетки в бесполом размножении колониальной асцидии Botryllus tuberatus II Биология моря 2007. Т 33, №3 С 217-222

7 Исаева В.В , Шукалюк А И , Ахмадиева А В , Александрова Я Н Эволюционный консерватизм морфофункциональной организации тотипотентных стволовых клеток Metazoa // Цитология (Тезисы докладов и сообщений И съезда общества клеточной биологии Санкт-Петербург) 2007 Т 49, №9 С 751

АХМАДИЕВА Анна Владимировна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК БЕСПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ С РЕПРОДУКТИВНОЙ СТРАТЕГИЕЙ, ВКЛЮЧАЮЩЕЙ БЕСПОЛОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 10 01 200В г Формат 60x90/16 1 уч -изд. л Тираж 100 экз Заказ № 87 Отпечатано в типографии издательского центра ФГУП «ТИНРО-Центр» г Владивосток, ул Западная, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ахмадиева, Анна Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Археоциты губок (Porifera).

2.2. Интерстициальные клетки (Cnidaria).

2.3. Необласты планарий (Platyhelminthes).

2.4. Колониальные корнеголовые ракообразные (Arthropoda).

2.5. Стволовые клетки колониальных асцидий-ботриллид (Chordata).

3. Материал и методы.

3.1. Сбор материала.

3.1.1. Oscarella malakhovi.

3.1.2. Obelia longissima.

3.1.3. Girardia (Dugesia) tigrina.

3.1.4. Peltogasterellci gracilis, Polyascuspolygenea, Peltogaster reticulatus.

3.1.5. Botryllus tuberatus.

3.2. Гистологические исследования.

3.3. Трансмиссионная электронная микроскопия.

3.4. Сканирующая электронная микроскопия.

3.5. Цитохимические исследования.

3.6. Иммунохимические исследования.

3.7. Выявление продукта гомолога гена vasa.Л.

4. Результаты.

4.1. Oscarella malakhovi (Porifera).

4.3. Girardia (Dugesia) tigrina (Platyhelminthes).

414. Peltogasterell'a gracilis, Polyascuspolygenea, Peltogaster reticulatus (Arthropoda).

4.5. Botryllus tuberatus (Chordata).

5. Обсуждение.

5.1. Археоциты губки Oscarella malakhovi.

5.2. Интерстициальные клетки книдарии Obelia longissima.

5.3. Необласты планарии Girardia tigrina.

5.4. Стволовые клетки корнеголовых ракообразных Peltogasterella gracilis, Polyascus polygenea и Peltogaster reticulatus.

5.5. Стволовые клетки асцидии Botryllus tuberatus.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфофункциональное исследование стволовых клеток беспозвоночных животных с репродуктивной стратегией, включающей бесполое размножение"

Актуальность проблемы

Эмбриональные стволовые клетки человека широко исследуются ввиду перспектив их практического применения для клеточной терапии; такие исследования составляют основу новых биомедицинских технологий. Для понимания клеточных, субклеточных и молекулярных механизмов, определяющих особенности морфофункциональной организации тотипотентных стволовых клеток, дающих начало всем клеточным линиям и всему спектру дифференцировок клеток Metazoa, необходимо их сравнительное исследование у различных представителей многоклеточных животных. Однако стволовые клетки беспозвоночных животных, как правило, значительно менее изучены сравнительно с эмбриональными стволовыми клетками млекопитающих. У беспозвоночных с бесполым размножением линия тотипотентных стволовых клеток поддерживается в течение всей жизни организма: это археоциты губок, интерстициальные клетки кишечнополостных, необласты турбеллярий и стволовые клетки колониальных асцидий (Agata, Watanabe, 1999; Shibata et al., 1999; Weissman, 2000; Gschwenter et al., 2001; Peter et al., 2001 и др.). Стволовые клетки колониальных беспозвоночных других таксонов почти не изучены; стволовые же клетки корнеголовых ракообразных, некоторые представители которых имеют колониальную стадию жизненного цикла, впервые обнаружены нами (Isaeva et al., 2001; Shukalyuk et al., 2005, 2007).

Множество молекулярно-биологических данных свидетельствует о том, что поддержание организации и функциональной активности зародышевой плазмы обеспечивается консервативными механизмами, общими для всех исследованных Metazoa от губок, гидроидов и планарий до млекопитающих (Ikenishi, 1998; Shibata, 1999; Wylie, 1999; Metazoa, Cooley, 2000; Исаева, Реунов, 2001; Исаева и др., 2007). Основываясь на литературных и собственных данных, мы» предполагаем подобную консервативность ультраструктурной организации стволовых клеток.

Стволовые клетки исследованных нами колониальных беспозвоночных обладают морфологическими характеристиками, общими для стволовых, t эмбриональных и первичных половых клеток всех Metazoa: крупным светлым ядром с деконденсированным хроматином, крупным ядрышком, компактной базофильной цитоплазмой, детерминантами зародышевой плазмы характерной ультраструктурной морфологии (Isaeva et al., 2001, 2005; Shukalyuk et al., 2005, 2007; Ахмадиева и др., 2007; Исаева и др., 2007).

Работа направлена на решение проблемы общности и консерватизма морфофункциональной организации тотипотентных стволовых клеток Metazoa путем изучения беспозвоночных животных с бесполым размножением и постоянной-самоподдерживающейся линией тотипотентных стволовых клеток, способных продуцировать как половые, так и соматические клетки. Молекулярно-биологические данные других авторов свидетельствуют о древних консервативных механизмах функциональной организации детерминантов линии половых клеток Metazoa. Половые, или зародышевые детерминанты исследовались в качестве ультраструктурного маркера тотипотентных стволовых клеток беспозвоночных животных. Цитохимическим маркером стволовых клеток была избрана цитохимическая реакция выявления активности щелочной фосфатазы, ранее широко использованная для идентификации эмбриональных стволовых клеток и первичных половых клеток млекопитающих (Chiquoine, 1954; Mintz, 1959; Talbot et al., 1993; Thomson et al., 1995, 1998 и др.). На беспозвоночных животных подобные исследования впервые проведены нами. В качестве молекулярного маркера тотипотентных стволовых клеток (Shibata et al., 1999; Mochizuki et al., 2001; Shukalyuk et al., 2007) применено выявление специфической избирательной экспрессии продукта гена vasa методом гибридизации in situ.

Цель работы - исследовать структурную и функциональную организацию стволовых клеток представителей пяти типов многоклеточных животных: Porifera, Cnidaria, Platyhelminthes, Arthropoda и Chordata в связи с теоретической и практической важностью изучения эмбриональных стволовых клеток, а также проблемами обособления линий половых и соматических клеток, бесполого размножения, колониальное™, стратегии размножения и развития Metazoa.

Для достижения цели исследования поставлены следующие задачи:

1. Изучить ультраструктурные особенности стволовых клеток губки Oscarella malakhovi (Porifera).

2. Изучить ультраструктурные, цитохимические и иммунохимические особенности стволовых клеток гидроидного полипа Obelia longissima (Cnidaria).

3. Изучить ультраструктурные особенности стволовых и гониальных клеток планарии Girardia (Dugesia) tigrina (Platyhelminthes).

4. Изучить ультраструктурные, цитохимические и иммунохимические особенности стволовых и эмбриональных клеток корнеголовых ракообразных Peltogasterella gracilis и Polyascus polygenea (Arthropoda).

5. Изучить ультраструктурные и цитохимические особенности стволовых клеток асцидии Botryllus tuberatus (Chordata).

6. Провести сравнительный морфофункциональный анализ стволовых клеток исследованных представителей Metazoa.

Научная новизна

Сведения о стволовых клетках большинства колониальных беспозвоночных неполны, а для некоторых таксонов до сих пор отсутствуют. Мы впервые начали проводить на беспозвоночных животных исследования с выявлением активности щелочной фосфотазы как маркера, тотипотентных (или плюрипотентных) стволовых клеток.

Исследованы стволовые клетки (археоциты) у недавно- описанного вида бесспикульной губки Oscarella malakhovi. В цитоплазме археоцитов впервые обнаружены терминальные гранулы.

В больших интерстициальных клетках колониального гидроида Obelia longissima найдены терминальные гранулы (именуемые у других исследованных видов гидроидов плотными телами). Выявлено специфическое окрашивание интерстициальных клеток при цитохимической реакции на щелочную фосфатазу; найдена позитивная' реакция больших интерстициальных клеток при иммунохимической реакции выявления ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA).

В необластах (стволовых клетках) и гениальных клетках планарии Girardia tigrina найдены терминальные гранулы типичной морфологии (именуемые у планарий хроматоидными телами).

Стволовые клетки колониальных корнеголовых ракообразных впервые обнаружены и исследованы нами. Показано, что при почковании столонов интерны стволовые клетки дают начало зачаткам бластозооидов, а затем мигрируют в зачаток яичника, становясь гениальными клетками. В стволовых клетках Peltogasterella gracilis найдены терминальные гранулы типичной морфологии. В терминальных гранулах дробящихся эмбрионов Polyascus polygenea обнаружена специфическая избирательная экспрессия* продукта гена vasa - маркера клеток половой линии и тотипотентных стволовых клеток беспозвоночных. Стволовые клетки Peltogasterella gracilis - единственный тип клеток, проявляющих интенсивную- позитивную1 реакцию при выявлении ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA).

В ранних почках и сосудистой системе колонии Botryllus tuberatus впервые обнаружены недифференцированные клетки, обладающие морфологическими признаками стволовых и первичных половых клеток многоклеточных животных. Стволовые клетки, содержат мелкие терминальные гранулы, сходные с материалом nuage позвоночных животных.

В развивающихся почках и некоторых клетках популяции гемоцитов выявлена интенсивная экспрессия активности щелочной фосфатазы, цитохимического маркера эмбриональных стволовых и первичных половых клеток позвоночных животных.

Таким образом, в результате проведенного анализа выявлены общие ультраструктурные, а также некоторые цитохимические и молекулярные особенности строения стволовых клеток у исследованных представителей типов Porifera, Cnidaria, Platyhelminthes; Arthropoda и Chordata.

Теоретическое и практическое значение

Для; понимания фундаментальных механизмов; обеспечивающих поддержание тотипотентности и; потенциального бессмертия клеток половой линии и стволовых клеток необходимо сравнительное исследование таких клеток у различных представителей многоклеточных животных. У беспозвоночных животных с" бесполым размножением тотипотентные: (по меньшей мере, плюрипотентные). клетки - источник клеточного материала для; реализации жизненной стратегии, включающей и< половое^ и: бесполое размножение; эти клетки способны дифференцироваться в= половые: и соматические клетки. В цитоплазме клеток половой линии; найдены специфические ультраструктурные маркеры (половые детерминанты) — плотные фибриллярные или гранулярные тельца, именуемые у разных животных терминальными гранулами; полярными гранулами, хроматоидными телами, плотными телами, нуаж (nuage) и т.д. Молекулярно-биологические данные (Ikenishi, 1998; Saffman, Lasko, 1999; Houston, King, 2000; Matova; Cooley, 2001) свидетельствуют о том, что некоторые молекулы, локализованные в гранулах половых детерминантов, действительно вовлечены в детерминацию клеток половой линии, а особенности структурной организации цитоплазмы и функциональной активности; клеток половой линии обеспечиваются консервативными механизмами; , общими^ для» исследованных . многоклеточных животных. Предполагается; подобный консерватизм ультраструктурной организации тотипотентных стволовых клеток.

Апробация работы

Материалы исследований докладывались на ежегодной конференции молодых ученых ИБМ ДВО РАН (2007 г.), на научных семинарах лаборатории продукционной биологии ИБМ ДВО РАН (2005, 2006, 2007 гг.), были представлены в виде стенда на конференции по клеточной биологии в Сан-Франциско: The American Society for Cell Biology, 45lh Annual Meeting, 2005.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 5 статей (в том числе 4 статьи из списка, рекомендуемого ВАК), 2 тезисов; 1 статья принята к печати.

Структура работы

Диссертация содержит 117 страниц, работа включает 75 рисунков и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материал и методы, собственные данные, обсуждение, заключение, выводы и список литературы, включающий 213 наименований, из них 187 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Ахмадиева, Анна Владимировна

6. Выводы

1. В цитоплазме археоцитов (стволовых клеток) губки Oscarella malakhovi (Porifera) впервые обнаружены терминальные гранулы; показано участие археоцитов в почковании этого вида.

2. В цитоплазме больших интерстициальных клеток колониального гидроида Obelia longissima (Cnidaria) найдены терминальные гранулы, выявлена специфическая экспрессия активности щелочной фосфатазы и ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA).

3. В необластах (стволовых клетках) и гониальных клетках планарии Girardia (Dugesia) tigrina (Platyhelminthes) найдены терминальные гранулы типичной морфологии.

4. Стволовые клетки колониального корнеголового ракообразного Polyascus polygenea (Arthropoda) впервые обнаружены и исследованы нами. В стволовых клетках Peltogasterella gracilis обнаружены терминальные гранулы типичной морфологии; стволовые клетки этого вида проявляют специфическую экспрессию щелочной фосфатазы и ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA). Специфическая избирательная экспрессия продукта гена vasa обнаружена в терминальных гранулах всех или большинства бластомеров дробящихся эмбрионов Polyascus polygenea.

5. Впервые найдены и описаны стволовые клетки асцидии с паллеальным почкованием Botryllus tuberatus (Chordata); эти клетки содержат мелкие терминальные гранулы, сходные с материалом nuage позвоночных животных, и проявляют избирательную активность щелочной фосфатазы.

6. Самообновляющийся резерв тотипотентных стволовых клеток — клеточная основа репродуктивной стратегии, включающей половое и бесполое размножение; такие клетки обладают эволюционно консервативными морфофункциональными характеристиками, общими для эмбриональных, стволовых клеток и клеток половой линии Metazoa.

Заключение

Итак, стволовые клетки размножающихся бесполым путем животных столь различных таксонов, как губки, книдарии, плоские черви, членистоногие и хордовые, обладают эволюционно консервативными признаками, предположительно связанными с поддержанием их тотипотентности и потенциального бессмертия. Самообновляющийся пул тотипотентных стволовых клеток колониальных беспозвоночных обеспечивает их репродуктивную стратегию, включающую и бесполое, и половое размножение.

У беспозвоночных животных с бесполым размножением стволовые клетки способны дифференцироваться как в соматические клетки, так и в гаметы, подобно клеткам половой линии. Подобны их общая морфология, включающая и ультраструктурный уровень (терминальные тела), экспрессия гена vasa, активность щелочной фосфатазы, способность к репродукции (самообновлению), тотипотентность и потенциальное бессмертие этих клеток. У паразитических корнеголовых стволовые клетки «культивируются» в питательной среде гемолимфы родственного организма хозяина, а у свободно живущих беспозвоночных — в собственном организме. Половые и тотипотентные стволовые клетки — привилегированные, «хищные» клетки, способные выживать при голодании за счет «каннибализма» (Kerszberg, Wolpert, 1998) и склонные к «паразитизму», как это показано на колониальных асцидиях (Pancer et al., 1995; Stoner, Weissman, 1996; Laird, De Tomaso, 2004/2005). Эти клетки способны к конкуренции и подвержены естественному отбору у химерных организмов, например, химерных колоний асцидий (Stoner et al., 1999; Buss, 1999; Weissman, 2000; Laird et al., 2005). Первичные половые и тотипотентные (плюрипотентные) стволовые клетки способны к обширным миграциям в пределах организма и «хомингу» с конечной локализацией в гонадах или местах бесполого размножения, а у одиночных организмов, способных к бесполому размножению (турбеллярий) - к раневой поверхности после деления или повреждения. Первичные половые клетки и соматические стволовые клетки обладают многими общими морфологическими чертами и вовлекают функции родственных генов; предполагается их эволюционная и онтогенетическая связь (Weissman, 2000; Extavour, Akam, 2003; Zwaka, Thomson, 2005; Hayashi et al., 2007; Travis, 2007). Отмечены общие черты морфофункциональной организации и предполагаемое эволюционное родство клеток половой линии и тотипотентных стволовых клеток размножающихся бесполым путем многоклеточных животных (Shukalyuk, Isaeva, 2005а, b; Исаева и др., 2007). Общность морфологических черт и экспрессии родственных генов в клетках половой линии и соматических стволовых клеток привела к предположению о возникновении первичных половых клеток в эволюции как субпопуляции стволовых клеток (Extavour, Akam, 2003; Travis, 2007). Мы полагаем, что сценарий происхождения первичных половых клеток от популяции тотипотентных эмбриональных стволовых клеток реализован у ныне живущих многоклеточных животных, способных к бесполому размножению, включая столь продвинутые таксоны, как членистоногие и хордовые.

Таким образом, поддержание морфофункциональной организации тотипотентных стволовых клеток обеспечивается эволюционно консервативными механизмами, общими для всех исследованных представителей многоклеточных животных.

Клетки половой линии, как и тотипотенные стволовые клетки животных с бесполым размножением, происходят в раннем эмбриогенезе от тотипотентных бластомеров или их производных, сохранивших тотипотентность. Полагаем, что эволюционно и онтогенетически родственные тотипотентные эмбриональные, первичные половые и стволовые клетки относятся к популяциям резервных клеток, способных к реализации полной программы развития. Концепция резервных, «отложенных» клеток (set-aside cells), сохраняющих неограниченный морфогенетический потенциал, разработана Дэвидсоном и другими авторами (Davidson, 1991; Davidson et al., 1995; Peterson et al., 1997; Jenner, 2000; Collins, Valentine, 2001).

Таким образом, имеющиеся в литературе и наши собственные данные свидетельствуют об эволюционном консерватизме и общности исследованных морфологических и функциональных характеристик клеток половой линии и тотипотентных (или плюрипотентных) стволовых клеток, а также субклеточных и молекулярных основ тотипотентности и потенциального бессмертия стволовых и половых клеток Metazoa от губок и книдарий до хордовых. У беспозвоночных животных с бесполым размножением стволовые клетки способны дифференцироваться и в половые, и в соматические клетки, тем самым представляя собой источник клеточного материала для реализации жизненной стратегии, включающей половое и бесполое размножение.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ахмадиева, Анна Владимировна, Владивосток

1. Айзенштадт Т.Б. Цитология оогенеза. М.: Наука. 1984. С. 247

2. Айзенштадт Т.Б., Полтева Д.Г. Происхождение половых клеток и ранние стадии оогенеза у морского гидроидного полипа Obelia II Онтогенез. 1981. Т. 12, №3. С. 243-250.

3. Айзенштадт Т.Б., Полтева Д.Г. Исследование вителлогенеза у гидроидных полипов Obelia flexuosa и Obelia loveni // Онтогенез. 1982. Т. 13, № 1. С. 28-33.

4. Ахмадиева А.В., Шукалюк А.И., Александрова Я.Н., Исаева В.В. Стволовые клетки в бесполом размножении колониальной асцидии Botryllus tuberatus,//Биология моря. 2007. Т. 33, № 2. С. 134-137.

5. Захаров И:А. Бактерии управляют половым размножением насекомых //• Природа. 1999. № 5. С. 28-34.

6. Иванова-Казас О.М. Бесполое размножение животных. JL: Издательство Ленинградского университета. 1977. С. 240.

7. Иванова-Казас О.М. Сравнительная эмбриология беспозвоночных животных. Низшие хордовые. М.: Наука. 1978. С. 167.

8. Исаева В.В., Реунов А.А. Половая плазма и детерминация клеток половой линии: роль митохондрий // Биол. моря. 2001. № 4. С. 231-237.

9. Исаева В.В., Рыбаков А.В., Касьянов В.Л. Выявление in vitro колониальной организации интерны корнеголовых ракообразных Peltogasterella gracilis и Sacculinapolygenea II Докл. РАН. 1999. Т. 366, № 6. С. 840-842.

10. Исаева В.В., Шукалюк А.И. Колониальные корнеголовые ракообразные (Crustacea: Rhizocephala): бесполое размножение, стволовые клетки, репродуктивная стратегия. М.: Наука. 2007. С. 132.

11. Исаева В.В., Шукалюк А.И., Ахмадиева А.В. Стволовые клетки беспозвоночных животных с репродуктивной стратегией, включающей бесполое размножение//Биология моря. 2007. Т. 33, № 1. С. 3-10.

12. Исаева; В .В., Шукалюк А.И., Кизилова Е.А. Выявление стволовых клеток в колониальной; интерне корнеголовых' ракообразных Peltogasterella gracilis и Sacculina polygenea на паразитической стадии жизненного цикла // Цитология. 2003. Т. 45. № 8. G. 758-763.

13. Касьянов В.Л. Репродуктивная стратегия морских двустворчатых моллюсков и иглокожих. Л.: Наука. 1989. С. 179.

14. Касьянов В.Л., Корн О.М., Рыбаков А.В. Репродуктивная стратегия усоногих ракообразных. 1. Половой5 диморфизм, репродуктивная: система, гаметогенез // Биология моря. 1997а. Т. 23, № 5. С. 263-274.

15. Касьянов В.Л., Корн О.М., Рыбаков А.В. Репродуктивная стратегия, усоногих ракообразных. 2. Бесполое размножение; плодовитость, репродуктивные циклы // Биол. моря. 1997. Т. 23,'№ 6. С. 337-344.

16. Касьянов В.Л., Корн О.М., Рыбаков А.В. Репродуктивная стратегия усоногих ракообразных. 3. Эмбриональное развитие- и ранние личинки // Биология; моря. 1998. Т. 24, № 5. С. 269-277.

17. Касьянов В.Л., Корн О.М., Рыбаков А.В: Репродуктивная стратегия усоногих ракообразных. 4. Циприсовидные личинки, метаморфоз, оседание // Биология моря. 1999; Т. 25, № 1. С. 3-12.

18. Кленов M.G., Столяренко А.Д., Рязанский С.С., Соколова О.А., Константинов И.Н., Гвоздев В.А. Роль коротких РНК в рефляции экспрессии генов и мобильных элементов в.герминативных клетках // Онтогенез. 2007. Т. 38, № 3. С. 213-227.

19. Корн О.М., Шукалюк А.И-V Трофимова А.А.,. Исаева^ В.В. Репродуктивная стадия жизненного цикла- корнеголового ракообразного Polyascus

20. Sacculina) polygenea (Crustacea: Cirripedia) // Биол. моря. 2004. Т. 30, № 4. С. 380-392.

21. Крылова Т.А., Зенин В.В., Михайлова Н.А., Пинаев Г.П., Никольский Н.Н., Полянская Г.Г. Постоянные линии эмбриональных стволовых клеток человека// Цитология. 2005. Т. 47, № 2. С. 121-129.

22. Полтева Д.Г. Проблема трансдифференцировки клеток и морфогенезы у гидроидов // Онтогенез. 1996. Т. 27, № 1. С. 17-27.

23. Шукалюк А.И. Организация интерны Sacculina polygenea (Crustacea: Rhizocephala) // Биол. моря. 2002. Т. 28, № 5. С. 366-371.

24. Шукалюк А.И., Исаева В.В. Прижизненное и гистологическое исследование организации интерны корнеголового рака Sacculina polygenea II Биол. моря. 2000. Т. 26, № 3. С. 200-202.

25. Шукалюк А.И., Байбородин С.И., Исаева В.В. Организация интерны корнеголового ракообразного Peltogasterella gracilis II Биол. моря. 2001. Т. 27, № 1.С. 134-137.

26. Agata К., Watanabe К. Molecular and cellular aspects of planarian regeneration // Cell Develop. Biol. 1999. Vol. 10. P. 377-383.

27. Amikura R., Kashikawa,M., Nakamura A., Kobayashi S., Presence of mitochondria-type ribosomes outside mitochondria in germ plasm of Drosophila embiyos, Proc. Nat. Acad: Sci. USA. 2001. Vol. 98 P. 9133-9138.

28. Auladell С., Garcia-Valero J., Baguna J. Ultrastructural localization of RNA in the chromatoid bodies of undifferentiated cells (neoblasts) in planarians by the RNAse-gold complex technique // J. Morphol. 1993. Vol. 216. P. 319-326.

29. Berrill' N.J. Growth, development, and pattern. Freeman and Company: San

30. Bresciani J., ttoeg J. Comparative ultrastructure of the root system in rhizocephalan'barnacles (Crustacea: Cirripedia: Rhizocephala) // J. Morphol. 2001. Vol. 249. № 1. P. 9-42.

31. Burighel P., Cloney R.A. Urochordata: Ascidiacea // Microscopic Anatomy of Invertebrates. Vol. 15. Eds. Harrison F.W., Ruppert E.E. Wiley-Liss: New York e a. 1997. P. 221-347.

32. Buss L.W. Slime molds, ascidians and the utility of evolutionary theory // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 8801-8803.

33. Campbell R.D. Tissue dynamics of steady state growth in Hydra littoralis. Ill Behavior of specific cell types during tissue movements. // J. Exp. Zool. 1967. Vol. 164. P. 379-392.

34. Campbell R.D. Cnidaria // In: Reproduction of marine invertebrates. Eds. Giese A.C., Pierse J.S. New York, London: Academic Press. Vol. 1. 1974. P. 133199.

35. Campbell R.D. Development of hydra lacking interstitial and nerve cells ("epithelial hydra"). // Symp. Soc. Dev. Biol. 1979. Vol. 37. P. 267-293.

36. Campbell R.D., Bode H.R. Terminology for morphology and cell types. // Hydra: Research Methods (H. M. Lenhoff, Ed.). Plenum, New York. 1983. P. 5-14.

37. Carre D., Djediat C., Sardet C. Formation of a large Vasa-positive germ granules and its inheritance by germ cells in the enigmatic Chaetognaths // Development. 2002. Vol. 129. P. 661-670.

38. Castrillon D.H., Quade B.J., Wang T.Y., Quigley C., Crum C.P. The human VASA gene is specifically expressed in the germ cell lineage // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. P. 9585-9590.

39. Chiquoine A.D. The identification, origin and migration of the primordial germ cells of the mouse embryo // Anat. Rec. 1954. Vol. 118. P. 135-146.

40. Cima F., Perin A., Burighel P., Ballarin L. Morpho-functional characterization of haemocytes of the compound ascidian Botrylloides leachi (Tunicata, Ascidiacea) // Acta Zool. 2001. Vol. 82. P. 261-274.

41. Clark A.T., Bodnar M.S., Fox M., Rodriquez R.T., Abeyta M.J., Firpo M.T., Pcra R.A.R. Spontaneous differentiation of germ cells from human embryonic stem cells in vitro.// Human Molec Genetics. 2004. Vol. 13. P. 727-739:

42. Collins. A.G., Valentine J.W. Defining phyla: evolutionary pathways to metazoan body plan//Evolution Develop. 2001 . Vol. 3. P. 432-442.

43. Connes R. Contribution a l'etude de la proliferation par voie: asexuee: chez le Sycon. // Bull. Soc. Zool. France. 1964. Vol. 89: P. 188-195.

44. Connes R. Structure et developpement des bourgeons chez l'eponge siliceuse Tethya lyncurium Lamarck. Recherches experimentales et cytologiques. // Arch. Zool. Exp. Generale. 1967. Vol. 108. P. 157-195.

45. Corley L.S., White M.A., Strand M.R. Both eondogenous and environmental factors affect embryo proliferation in the polyembryonic wasp Copidosoma floridanum II Evolut. Develop. 2005. Vol. 7. P. 115-121.

46. Corriero G., Liaci L.S., Marzano C.N., Gaino E. Reproductive strategies of Mycale contarenii (Porifera, Demospongiae). // Mar. Biol: 1998. Vol. 131. P: 319327.

47. Coward, S.J., Chromatoid bodies in somatic cells, of the planarian: Observation on their behavior during mitosis. // Anat Rec. 1974. Vol. 180 P. 533-546.

48. Culp P., Niisslein-Volhard C., Hopkins N. High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88. P. 7953-7957.

49. Daley G.Q. Gametes from embryonic stem cells: a cup half empty or half full? // Science. 2007. Vol. 316. P. 409-410.

50. David C.N., Gierer A. Cell cyclekinetics anddevelopment of Hydra attenuate.lll. Nerve and nematocyte differentiation. // J. Cell Sci. 1974. Vol. 16. P. 359375.

51. Davidson E.H. Spatial mechanisms of gene regulation in metazoan embryos // Development. 1991. Vol. 113. P. 1-26.

52. Davidson E.H., Peterson K.J., Cameron R.A. Origin of bilaterian body plan: evolution of developmental regulatory mechanisms // Science. 1995. Vol*. 270. P. 1319-1325.

53. Davis L.E. Differentiation of neurosensory cells in hydra. // J. Cell Sci. 1969. Vol. 5. P. 699-726.

54. Davis L.E. Differentiation of ganglionic cells in hydra. // J. Exp. Zool. 1971. Vol. 176. P. 107-128.

55. De Vries D.E., Sluys E. Phylogenetic relationship of the genus Dugesia (Platyhelminthes, Tricladida, Paludicola) // J. Zool. London. 1991. Vol. 223. P. 103-106.

56. Erescovsky A.V. A new species of Oscarella (Demospongiae: Plakinidae) from the Western Sea of Japan II Zootaxa 1376. 2006. P. 37-51.

57. Ereskovsky A.V. Comparative embryology of Sponges (Porifera). Sanct-Petersburg University Press, St. Petersburg. 2005.

58. Extavour C.G. The fate of isolated blastomeres with respect to germ cells formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis H Develop. Biol: 2005. Vol. 277. P. 387-402.

59. Extavour C.G., Akam M. Mechanisms of germ cell specification across the metazoans: epigenesistand preformation //Development. 2003'. Vol. 130. P. 5869-5884.

60. Extavour • C.G.", Pang K., Matus D.Q., Martindale M.Q. vasa and nanos expression patterns in a sea anemone and the evolution of bilaterian germ cell specification mechanisms // Evolut. Develop. 2005. Vol. 7. P. 201215.

61. Fabioux C., Huvert A., belong C., Robert R., Pouvreau S., Daniel J. Y., Minguant C., Le Pennec M. Oyster vasa-like gene as a marker of the germline cell development in Crassostrea gigas II Biochem. Biophys. Res. Com: 2004. Vol. 320. P. 592-598.

62. Fell P.E. Porifera. In: Giese AC, Pearce JS (eds) Reproduction of marine invertebrates. Academic, New York. 1974. P. 51-132.

63. Fell P.E. Porifera. In: Adiyodi KG, Adiyodi RG (eds) Reproductive biology of invertebrates. 6A: asexual propagation and reproductive strategies. Oxford and IBH, New Delhi. 1993. P. 1-^4.

64. Fujimura M., Takamura K. Characterization of an ascidian DEAD-box gene, Ci-DEAD1: specific expression in the germ cells and its mRNA localization in the posterior-most blastomeres in early embryos // Devel. Genes Evolut. 2000. Vol. 210. P. 64-72.

65. Fujisawa T. Role of interstitial: cell migration in generating position-dependent patterns of nerve cell differentiation in Hydra. II Dev. Biol. 1989. Vol. 133. P: 77-82.

66. Gaino E., Scalera Liaci L., Sciscioli M., Corriero G. Investigation of the budding process in Tethya citrina and Tethya aurantium (Porifera, Demospongiae). // Zoomorphology. 2006. Vol. 125. P. 87-97.

67. Geijsen N., Horoschalc M., Kim K., Gribnau J., Eggan K., Daley G.Q. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells // Nature. 2003. Vol. 427. P. 148-154.

68. Glenner H. Cypris metamorphosis, injection and earliest internal development of the rhizocephalan Loxothylacus panopei (Gissler) (Crustacea: Cirripedia: Rhizocephala: Sacculinidae) // J. Morphol. 2001. Vol. 249. P. 43-75.

69. Gschwentner R., Ladurner P., Nimeth K., Rieger R. Stem cells in a basal bilaterian. S-phase and mitotic cells in Convolutriloba longifissura И Cell Tissue Res. 2001. Vol. 304. P. 401-408.

70. Hall P.A., Woods A.L. Immunohistochemical markers of cellular proliferation: achievements, problems and prospects // Cell Tissue Kinet. 1990. Vol. 23. P. 23-55.

71. Hay В., Jan L. Y., Jan Y. N. A protein component of Drosophila polar granules is encoded by vasa and has extensive sequence similarity to ATP-dependent helicases // Cell. 1988. Vol. 55. P. 577-587.

72. Hayashi K., de Sousa Lopes S.M.C., Surani M.A. Germ cell specification in mice // Science. 2007. Vol. 316. P. 394-396.

73. Heimfeld S., Bode H. R. Interstitial cell migration in Hydra attenuate. I. Quantitative description of cell movements. // Dev. Biol. 1984. Vol. 105. P. 19.

74. Herlands R.L., Bode H.R. Oriented migration of interstitial cells and nematocytes in Hydra attenuate. II Wilhem Roux'Arch. 1974. Vol. 176. P. 67-88.

75. Hoeg J.T. Rhizocephala // Microscopic Anatomy of Invertebrates. Eds. Harrison, F.W., Humes, A.G. Vol. 9. Crustacea. N.Y.: Wiley-Liss. 1992. P. 313-345.

76. H0eg J.T., Liitzen J. Comparative morphology and phylogeny of the family Thompsoniidae (Cirripedia, Rhizocephala, Akentrogonida), with descriptionsof three new genera and seven new species // Zool. Scripta. 1993. Vol. 22. P. 363-386.

77. H0eg J.T., Liitzen J. Life cycle and reproduction in the Cirripedia Rhizocephala // Oceanogr. Mar. Biol.: Ann. Rev. 1995. V. 33. P. 427-485.

78. Hogan B. Primordial germ cells as stem cells // Stem Cell Biology. Marshak D.R., Gardner R.L., Gottlieb D. (Eds.) New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001. P. 189-204.

79. Honegger T.G., Ziirrer D., Tardent P. Oogenesis in Hydra carnea: a new model based on light and electron microscopic analyses of oocyte and nurse cell differentiation // Tissue Cell. 1989. Vol. 21. P. 381-393.

80. Hong Y., Winkler C., Schartl M. 1998. Production of medakafish chimeras from a stable embryonic stem cell line // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Vol. 95. P. 3679-3684.

81. Hong Y., Winkler C., Schartl M. 1998. Production of medakafish chimeras from a stable embryonic stem cell line // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Vol. 95. P. 3679-3684.

82. Hori I. An ultrastructural study of the chromatoid body in planarian regenerative cells // J. Electron Microsc. 1982. Vol. 31. P. 63-72.

83. Hori I., Cytological approach to morphogenesis in the planarian blastema. II. The effect of neuropeptides, J. Submicrosc. Cytol. Pathol. 1997. Vol. 24. P. 91-97.

84. Houston D.W., King M.L. Germ plasm and molecular determinants of germ cell fate // Curr. Top. Develop. Biol. 2000. Vol. 50. P. 155-181.

85. Hubner K., Fuhrmann G., Christenson L., Kehler J,, Reinhold R., De La Fuente R., Wood J., Strauss J., Boiani M., Scholer H. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells // Science. 2003. Vol. 300. P. 1251-1256.

86. Jenner R.A. Evolution of animal body plans: the role of metazoan phylogeny at the interface between pattern and process // Evolut. Develop. 2000f.Vol. 2. P. 208-221.

87. Juliano C.E., Voronina E., Stack C., Aldrich M., Cameron A.R., Wessel G.M. Germ line determinants are not localized early in sea urchin development, but do accumulate in the small micromere lineage // Develop. Biol. 2006. Vol. 300. P. 4-6-415.

88. Kashikawa M., Amikura R., Nakamura A., Kobayashi S. Mitochondrial small ribosomal RNA' is present on> polar granules in early cleavage embryos of Drosophila melanogaster I I Develop. Growth. Differ. 1999. Vol. 41. P. 495107

89. Kasyanov V.L. Reproductive Strategy of Marine Bivalves and Echinoderms.

90. Enfield, NH, USA: Science Publishers Inc. 2001. P. 229. Kenk R. 1937. Sexual and asexual reproduction in Euplanaria tigrina(Girard) //

91. Biol. Bull. Vol. 73. P. 127-143. Kerszberg M., Wolpert L. The origin of Metazoa and the egg: a role for cell death

92. J. Theor. Biol. 1998. Vol.193. P. 535-537. King C.C. A model for transposon-based eukaryote regulatiry evolution // J. Theor.

93. Biol. 1985. Vol. 114. P. 447-462. Kloc M., Bilinski S., Chan A.P., Etkin L.D. Mitochondrial ribosomal RNA in the germinal granules in Xenopus embryos revisited // Differentiation. 2000. Vol. 67. P. 80-83.

94. Mahowald A.P. Polar granules in Drosophila. III. The continuity of polar granules during the life cycle of Drosophila II J. Exp. Zool. 1971. Vol. 17. P. 551-563.1. V.

95. Mahowald A.P. Assembly of the Drosophila germ plasm // Internat. Rev. Cytol. 2001. Vol. 203. P. 187-213.

96. Marshak D.R., Gardner R.L., Gottlieb D. (Eds.) Stem Cell Biology. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001. P. 550.

97. Martin J.W., Davies, G.E. An updated classification of the recent Crustacea // Natural History Museum of Los Angeles County, Sci. Ser. 2001. Vol. 39. P. 157.

98. Matova N., Cooley L. Comparative aspects of animal oogenesis // Develop. Biol. 2001. Vol. 16. P. 1-30.

99. McLaren A., Lawson K.A. How is the mouse germ-cell lineage established? // Differentiation. 2005. Vol. 73. P. 435-437.

100. Merchant-Larios H., Mendelovic F., Alvarez-Buyalla A. Characterization of alkaline phosphatase from primordial germ cells and ontogenesis of this enzyme in the mouse // Differentiation. 1985. Vol. 29. P. 145-151.

101. Mintz В. Continuity of the female germ cell line from embryo to adult // Arch. Micr. Morphol. Exper. 1959. Vol. 48. P. 155-172.

102. Mochizuki K., Nishimiya-Fujisawa C., Fujisawa T. Universal occurrence of the rasa-related genes among metazoans and their germline expression in Hydra //Develop. Genes Evol. 2001. Vol. 211. P. 299-308.

103. Mueller Т., Wullimann M.F. Anatomy of neurogenesis in the early zebrafish brain //Develop. Brain Res. 2003. Vol. 140. P. 137-155.

104. Miiller W.E.G. Telomerase activity in sponges (Porifera) the closest-related taxa of the hypothetical ancestral animal the Urmetazoa // Telomeres and telomerase / Eds Krupp G., Parwaresch R. Georgetown. Molecular Biology Intelligence. 2002. P. 300-313.

105. Miiller W.E.G. The stem cell concept in sponges (Porifera): Metazoan traits // Seminars in Cell and Developmental Biology. 2006. Vol. 17. P. 481-491.

106. Noda K., Kanai G. An ultrastructural observation of Pelmatohydra robusta at sexual and asexual stages, with a special reference to "germinal plasm" // J. Ultrastruct. Res. 1977. Vol. 61. P. 284-294.

107. Ohta S. A multi-fuctional organelle mitochondrion is involved in cell death, proliferation and disease // Curr. Medicin. Chemistry. 2003. Vol. 10. P. 24852494.

108. Orii H., Sakurai Т., Watanabe K. Distribution of the stem cells (neoblasts) in the planarian Dugesia japonica II Dev. Genes Evol. 2005. Vol. 215. P. 143-157.

109. Pain В., Clark M.E., Shen M., Nakazawa H., Sakura M., Samarut J., Etches R.J. Long-term in vitro culture and characterization of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialitiesm I I Development. 1996. Vol. 122. P. 2339-2348.

110. Pancer Z., Gershon H., Rinkevich B. Coexistence and possible parasitism of somatic and germ cell lines in chimeras of the colonial urochordate Botryllus schlosseri 11 Ъ\о\. Bull. 1995. Vol. 189. P. 106-112.

111. Peterson K.J., Cameron R.A., Davidson E.H. Set-aside cells in maximal indirect development: evolutionary and developmental significance // BioEssays. 1997. Vol. 19. P. 623-631.

112. Raz E. The function and regulation of the vasa-like genes in germ-cell development // Genome Biology. 2000. Vol. 3. P. 1017.1-1017.6.

113. Resnick J.L., Bixler L.S., Cheng L., Donovan P.G. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture //Nature. 1992. Vol. 359: P. 550-551.

114. Reunov A. Is there a germ plasm in mouse oocytes? // Zygote. 2004. Vol. 12. P. 329-332.

115. Reunov A. Structures related to the germ plasm in mouse // Zygote. 2006. Vol. 14. P. 231-238.

116. Reunov A., Isaeva V., Au D., Wu R. Is it possible the arising of nuage constituents from mitochondria? // Develop., Growth, Different. 2000. Vol. 42. N 2. P. 129-143.

117. Rich F., Tardent P. Untersuchung zur Nematocyten Differenzierung bei Hydra attenuate. //Rev. Suisse Zool. 1969. Vol. 76. P. 779-789.

118. Rieger R.M., Tyler S., Smith III J.P.S. and Rieger G.E. Plathelminthes: Turbellaria. In: Microscopic Anatomy of Invertebrates. Plathelminths and Nemertea, Vol. 3. F.W. Harrison (ed.), Wiley-Liss, New York. 1991. P. 7140.

119. Rinkevich B. The colonial urochordate Botryllus schlosseri: from stem cells and natural tissue transplantation to issues in evolutionary ecology // BioEssays. 2002. Vol. 24. P. 730-740.

120. Rosak S., Linder P. DEAD-box proteins: the driving forces behind RNA methabolism // Rev. Mol. Cell Biol. 2004. Vol. 5. P. 232-240.'

121. Rubiliani G., Turquier Y., Payen G.G. Recherche sur l'ontogenese des rhizocephales. I. Les stades precoces de la phase endoparasitaire chez Sacculina carcini Thompson // Cahiers Biol. Marine. 1982. Vol. 23. P. 287297.

122. Saffman E.E., Lasko F. Germline development in vertebrates and invertebrates // Cell Mol. Life Sci. 1999. Vol. 55. P. 1141-1163.

123. Saitou M., Payer В., Lange U.C., Erhardt S., Barton S.C., Surani M.A. Specification of germ cell fate in mice // Phil. Trans. Royal Soc. London. 2003. Vol. 358. P. 1363-1370.

124. Sailer U. Formation and construction of asexual buds of the freshwater sponge Radiospongilla cerebellata (Porifera, Spongillidae). I I Zoomorphology. 1990. Vol. 109. P. 295-301.

125. Schaefer C.B., Ooi S.K.T., Bestor Т.Н., Bourchis D. Epigenetic decisions in mammalian germ cells // Science. 2007. Vol. 316. P. 398-399.

126. Seydoux G., Braun R.E. Pathway to totipotency: lessons from-germ cell's // Cell. 2006. Vol. 127. P. 891-904.

127. Shibata N., Umesono Y., Orii H., Sakurai Т., Watanabe K., Agata K. Expression of vasa (vas)-related genes in germline cells and totipotent somatic stem cells of planarians //Develop. Biol. 1999. Vol. 206. P. 73-87.

128. Shukalyuk A.I., Isaeva V.V. Stem cells in invertebrate animals: evolutionary conservative mechanism of totipotency // International Society for Stem Cell Research: 3rd Annual Meeting (San Francisco, June 2005). 2005. Abstracts. P. 214-215.

129. Shukalyuk A., Isaeva V., Kizilova E., Baiborodin S. Stem cells in reproductive strategy of colonial rhizocephalan crustaceans (Crustacea: Cirripedia: Rhizocephala) // Invertebr. Reprod. Develop. 2005. Vol. 48. P. 41-53.

130. Simpson T.L. The cell biology of sponges. Springer, Berlin Heidelberg4New York. 1984.

131. Slautterback D.B., Fawcett D.W. The development of the cnidoblasts of Hydra. An electron microscope study of cell differentiation. // J. Biophys. Biochem. ! Cytol. 1959. Vol. 5. P. 441-452.

132. Stem cell biology. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001. P. 550.

133. Stoner D.S., Rinkevich В., Weissman I.L. Heritable germ and somatic cell lineage competitions in chimeric colonial protochordates // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 9148-9153.

134. Stoner D.S., Weissman I.L. Somatic and germ cell parasitism in a colonial ascidian: possible role for a highly polymorphic allorecognition system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93. P. 15254-15259.

135. Stoop H., Honecker F., Cools M., de Krijger R., Bokemeyer C., Looijenga L.H.J. Differentiation and development of human female germ cells during prenatal gonadogenesis: an immunohistochemical study // Human Reproduction. 2005. Vol. 20. P. 1466-1476.

136. Strome S., Lehman R. Germ versus soma decisions: lessons from flies and worms // Science. 2007. Vol. 316. P. 392-393.

137. Sun L., Bradford C.S., Ghosh C., Collodi P. ES-like cell cultures derived from early zebrafish embryos // Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1995. Vol.4. P. 193199.

138. Sunanaga N., Saito Y., Kawamura K. Postembryonic epigenesis of Kara-positive germ cells from aggregated hemoblasts in the colonial ascidian, Botryllus primigenus II Develop. Growth Differ. 2006. Vol. 48. P. 87-100.

139. Surani M.A. Imprinting and the initiation of gene silencing in germ line // Cell. 1998. Vol. 93. P. 309-312.

140. Takahashi Т., Lutzen J. Asexual reproduction as part of the life cycle in Sacculina polygenea (Cirripedia: Rhizocephala: Sacculinidae). // J. Crust Biol. 1998. Vol. 18. №2. P. 321-331.

141. Takamura K., Fujimura M., Yamaguchi Y. Primordial germ cells originate from the endodermal strand cells in the ascidian Ciona intestinalis // Devel. Genes Evolut. 2002. Vol. 212. P. 11-18.

142. Talbot N.C., Rexroad C.E. Jr., Pursel V.G., Powell A.M. Alkaline phosphatase of pig and sheep epiblast cells in culture // Mol. Reprod. Devel. 1993. Vol. 36. P. 139-147.

143. Science. 2005. Vol. 309. P. 678-679. Wagers A.J., Weissman, I.L. Plasticity of adult stem cells // Cell. 2004. Vol. 116. P. 639-648.

144. Walker G. Introduction to the Rhizocephala (Crustacea: Cirripedia) // J. Morphol. 2001. Vol. 249. P. 1-8.

145. Watanabe M., Itoh K., Abe K., Adisawa Т., Ikenishi K., Furusawa M. Immuno-. localization of DEAD family proteins in germ cell line cells of Xenopus embryos //Develop., Growth, Differ. 1992. Vol. 34. P. 223-231.

146. Weissman I.L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution // Cell. 2000. Vol. 100. P. 157-168.

147. Williamson A., Lehman R. Germ cell development in Drosophila // Annu. Rev. Devel. Biol. 1996. Vol. 12. P. 365-391.

148. Winslow T. Stem cells. Scientific Progress and Future Research Directions. Bethesda: National Institutes of Health. 2001.

149. Wylie C. Germ cells // Cell. 1999. Vol. 96. № 2. P. 165-174.

150. Zwaka T.P., Thomson J.A. A germ cell origin of embryonic stem cells? // Development. 2005. Vol. 132. P. 227-233.