Морфо-физиологические аспекты взаимодействий микроорганизмов в микробных сообществах

Рыбальченко, Оксана Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфо-физиологические аспекты взаимодействий микроорганизмов в микробных сообществах
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Морфо-физиологические аспекты взаимодействий микроорганизмов в микробных сообществах"

На правах рукописи

РЫБАЛЬЧЕНКО ?

ОКСАНА ВЛАДИМИРОВНА '

Морфо-физиологические аспекты взаимодействий микроорганизмов в микробных сообществах

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2003

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете и ГНЦ Гос НИИ особо чистых биопрепаратов.

Научный консультант, член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор

¡Громов Борис Васильевич

Официальные оппоненты доктор технических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Красникова Людмила Васильевна Никитина

Валентина Николаевна Добрица

Валерий Павлович

Ведущая организация: Санкт-Петербургская государственная фармацевтическая академия.

Защита состоится 4 июля 2003 года в /0.00 часов № на заседании

Диссертационного совета Д 212 230.04 Санкт-Петербургского государственного Технологического института (технического университета) по адресу. 190013, Санкт-Петербург, Московский пр. 26, СПбТИ(ТУ)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного Технологического института (технического университета). Замечания и отзывы по данной работе, заверенные печатью, в одном экземпляре, просим направлять по адресу: 190013, Санкт-Петербург, Московский пр, 26, СПбТИ(ТУ), Ученый Совет.

Автореферат разослан ¿О, ¿Ь 2003 г.

Ученый секретарь . _ —

Диссертационного совета - - Т. Б Лисицкая

(I 2o5~

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Работа относится к новому научному направлению в микробиологии - микробной экологии, предметом которого является выявление закономерностей взаимодействия микроорганизмов между собой и окружающей средой. В настоящее время становится очевидным, что процессы, в которых участвуют микроорганизмы, находясь в природных, лабораторных или промышленных условиях, необходимо анализировать на уровне популяций, представленных как однородными, так и смешанными микробными сообществами [Shapiro, 1985].

В связи с необходимостью оценки состояния всех структурных элементов микробиоценозов, постоянно изменяющихся в результате жизнедеятельности микроорганизмов, исследование структуры микробных сообществ является одной из основных и наиболее трудно решаемых проблем микробной экологии. Решение таких многоуровневых задач возможно только при условии применения комплексного, системного подхода и требует создания принципиально новых методов исследования микроэкологических систем.

Вместе с тем, в настоящее время появились данные, свидетельствующие о различиях в поведении и свойствах бактерий in vivo и in vitro, проявляющихся, например, в повышенной устойчивости in vivo к антимикробным препаратам, химиопрепаратам, факторам иммунной защиты, а также экстремальным воздействиям окружающей среды [Дебабов, 1999].

В связи с этим, внимание микробиологов, в последнее время было обращено на создание новых методов, позволяющих осуществлять комплексные исследования бактерий in situ, т.е. непосредственно в естественных условиях обитания: природных экосистемах или микробных сообществах в тканях организма-хозяина, развивающихся в качестве нормальной микрофлоры, а также в ходе инфекционного процесса.

В развитии исследований данного направления несомненную значимость может представлять разработанный нами комплекс электронно-микроскопических методов, позволяющий выявлять структуру микробных сообществ непосредственно в естественных для них условиях in situ [Рыбальченко, Савкова, 1989]. В основу предложенной автором концепции комплексного анализа структуры микробных сообществ различными электронно-микроскопическими методами положен принципиально новый аспект исследования функционирования микробных популяций, как целостных многоуровневых систем, предполагающих осуществление взаимодействия как между самими микроорганизмами, так и с окружающей средой на молекулярном, клеточном и популяционном уровнях [Какорин, Ровнов, Рыбальченко и др., 1991]. Анализ собственных результатов и данных литературы позволил предположить, что углубленную информацию о функциональных характеристиках и механизмах взаимодействия объектов в микроэкосистемах можно получить только при совместим^I

S БИБЛИОТЕКА I

I SW»!

морфо-физиологических особенностей микроорганизмов, структуры их микробных сообществ и состояния субстратов на которых они развиваются. Разработанные нами методы и приемы позволяют достаточно быстро дифференцировать и прогнозировать реакцию микробиологической составляющей исследуемого микробиоценоза, возникающую в результате воздействия на микроорганизмы физико-химических факторов окружающей среды таких, как температура, обезвоживание, кислотный и щелочной шоки. Получаемые характеристики структуры микробных сообществ являются необходимым и высоко информативным этапом исследования, позволяющим •оценить не только общее состояние микробиоценоза, но и прогнозировать в данных конкретных условиях дальнейшее поведение отдельных групп микроорганизмов на основании определения их морфо-физиологических свойств.

Тема диссертации связана с планом основных научно-исследовательских работ медицинского факультета СПбГУ и включена в федеральную целевую программу «Исследование молекулярных механизмов функций развития и коррекции дисфункций в организме человека». Номер государственной регистрации: № 01. 200. 2 07590.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы — выявление закономерностей и индивидуальных особенностей взаимодействия микроорганизмов между собой и окружающей средой на молекулярном, клеточном и популяционном уровнях. Знание законов, регулирующих рост, развитие и взаимоотношения микроорганизмов в микробных сообществах, необходимо для развития фундаментальной, теоретической и практической биотехнологии, поскольку без них невозможна оптимизация биотехнологических процессов, в основе которых лежит получение культуры микроорганизмов. Электронно-микроскопический анализ микробных экосистем должен включать комплексное исследование, позволяющее выявлять как структуру самих материалов и субстратов, так и развивающихся на них микробных сообществ. В связи с этим возникла необходимость проведения систематизации и стандартизации уже известных электронно-микроскопических методов, создания новых и выбора оптимальных разработок в этом направлении для решения задач в области фундаментальной микробиологии, теоретической и практической биотехнологии. В соответствии с указанной целью были разработаны несколько современных аспектов данной проблемы (методический, морфо-физиологический, экологический) и поставлены следующие основные задачи:

МЕТОДИЧЕСКИЙ АСПЕКТ

1. Разработать новые электронно-микроскопические методы, модификации методов и приемы, позволяющие проводить фундаментальные исследования структуры однородных и смешанных микробных сообществ in situ.

МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ АСПЕКТ

1. Выявить морфологические особенности клеток различных видов бактерий (представители родов Escherichia, Shigella, Salmonella, Bacillus, Lactobacillus, Brevibacterium, Staphylococcus, Campylobacter, Helicobacter и т. д.), проявляющиеся в оптимальных условиях, а также характерные изменения при действии экстремальных факторов (повышенная температура, обезвоживание, низкие и высокие значения рН).

2. Выявить закономерности проявления морфо-физиологической гетерогенности при оптимальных условиях развития микробных популяций, при стандартизированных условиях и изменяющихся параметрах негативных воздействий окружающей среды.

3. Проанализировать механизмы, регулирующие морфо-физиологические свойства клеток в бактериальных популяциях, определить роль экстраклеточной белковой системы в этих процессах.

4. Отработать максимально эффективную методологию оценки функционально-структурных изменений микроорганизмов в процессе биотехнологического производства на основе комплексного исследования структуры микробных популяций различными физическими (ориентационная кондуктометрия, УФ-, ИК-спектроскопия) и электронно-микроскопическими методами.

5. Усовершенствовать методологию исследования морфологических особенностей строения однородных и смешанных микробных сообществ различного типа (колонии, биопленки, колониеподобные сообщества).

6. Разработать систему комплексной оценки значимости элементов кооперации и специализации бактериальных клеток в микробных ассоциациях, обеспечивающих функционирование микробных популяций, как целостных многоуровневых систем, взаимодействие бактерий в которых осуществляется на молекулярном, клеточном и популяционном уровнях.

7. Определить и выделить морфологические маркеры и признаки, характеризующие начальные, промежуточные и завершающие изменения на всех этапах проявления антагонистических взаимоотношений между прокариотическими микроорганизмами- (на примере лактобацилл, патогенных и условно-патогенных бактерий), а также между прокариотическими и эукариотическими микроорганизмами (на примере лактобацилл и дрожжеподобных грибов) для осуществления скрининга и оперативного мониторинга стандартных и моделируемых микробиоценозов с заданным алгоритмом функционирования.

ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ АСПЕКТ

1. Обосновать критерии электронно-микроскопического тестирования процессов биодеструкции различных материалов, служащих субстратом для развития микроорганизмов.

2. Разработать электронно-микроскопические методы оценки степени защиты материалов от биодеградации.

3. Создать систему морфологического мониторинга за изменениями при биодеструктивных процессах для объективного и стандартизированного контроля за нарушениями структуры микробиоценозов в природных и искусственных экосистемах.

Научная новизна результатов. Впервые на основе комплексного сравнительного электронно-микроскопического анализа (просвечивающая и сканирующая электронная микроскопия) на клеточном и популяционном уровнях разработана методология количественной и качественной характеристики различных видов микроорганизмов при оптимальных и экстремальных условиях развития и действии физико-химических факторов (повышенная температура, обезвоживание, низкие и высокие значения рН) на примере бактериальных монокультур и микробных ассоциаций.

Впервые различными электронно-микроскопическими методами на ультратонком уровне выявлено особое морфо-физиологическое состояние бактериальных клеток — покоящиеся формы (электронно-плотные клетки). Показана универсальность данного явления для всех видов исследованных в работе микроорганизмов.

Установлены закономерности в изменении структуры бактериальных популяций на разных этапах развития в жидких и на плотных питательных средах, проявляющиеся в изменении морфологической гетерогенности и соотношения различных типов клеток: физиологически активных, покоящихся, автолизированных и инволюционных.

На основе собственных разработок произведен анализ ультратонкой организации колоний широкого круга микроорганизмов и впервые показано, что микробные колонии покрыты поверхностной пленкой, в основе которой находится трехслойная мембрана; колонии разделены на зоны, содержащие определенные морфологические типы клеток; между клетками в колониях выявлено два типа контактов (плотное слипание и цитоплазматические мостики), благодаря которым клетки образуют сложную трехмерную систему.

Впервые установленная специфичность ультраструктурных изменений при тепловых воздействиях, обезвоживании, кислотном и щелочном шоках предоставляет возможность анализа и направленного воспроизведения морфо-физиологических свойств бактериальных клеток при дозированном действии экстремальных факторов в процессе биотехнологического производства.

Впервые отмечена взаимосвязь между появлением специфических ультраструктурных изменений в клетках и свойствами внеклеточной среды при тепловых воздействиях. Морфологические изменения при тепловых воздействиях на клеточном уровне проявлялись в появлении

некристаллических гранул в цитоплазме, на популяционном в изменении соотношения морфологических типов клеток.

Впервые выявлено участие ^Я-гена системы теплового шока в изменении морфологических свойств энтеробактерий при тепловых воздействиях. Ультраструктурные изменения в клетках и колониях энтеробактерий, дефектных по Мр11-гену системы теплового шока, проявлялись: в появлении некристаллических гранул в цитоплазме, образовании толстой поверхностной пленки на ранних стадиях развития колоний, филаментации клеток в результате нарушения процесса септообразования. Установлено, что грануляция цитоплазмы при сублетальном тепловом воздействии обусловлена изменением регуляции метаболизма ЫрЯ-геном.

Впервые на ультратонком уровне установлены специфические признаки изменения морфологической гетерогенности — изменение соотношения различных морфологических типов клеток, отражающее сложные взаимоотношения микроорганизмов в микробных сообществах различного типа, что создает предпосылки для их регулирования в процессе решения различных биотехнологических задач.

Впервые выявлены ультраструктурные особенности строения смешанных микробных сообществ, характеризующихся антагонистическим типом взаимоотношений. Показано, что межклеточные взаимодействия в микробных сообществах данного типа проявляются на молекулярном (действие продуктов метаболизма — бактериоцинов), клеточном (ультраструктурные изменения в клеточных органеллах) и популяционном (изменение структуры популяции) уровнях.

Впервые показаны биодеструктивные изменения минералов в процессе физического моделирования регулируемой агроэкосистемы (корнеобитаемые среды - растения), свидетельствующие о непосредственном участии мгасробиоты в трансформации гранитного щебня в биокосное вещество, сходное с почвой.

Впервые на основе электронно-микроскопического анализа структуры микробных сообществ и биодеструктивных изменений субстратов (почва, минералы, нефть, бумага, кожа, кость, пергамен) разработаны методы экспресс-анализа для оценки и рекомендаций по охране состояния природных экосистем и культурных памятников.

Научно-практическое значение работы. Научно-практическая ценность полученных результатов заключается в раскрытии основных закономерностей изменения гетерогенной структуры микробных сообществ различного типа (однородные колонии, колониеподобные сообщества, смешанные бактериальные сообщества), а также сложных механизмов взаимодействия между микроорганизмами внутри этих сообществ и воздействия на окружающую среду. Полученные данные по морфологической гетерогенности микробных сообществ различных типов, а также разработанные методы и основные подходы в оценке выявленных закономерностей морфо-физиологического состояния микроорганизмов (особенно обнаружение покоящихся форм клеток) перспективны для прогнозирования развитая микробных сообществ на различных субстратах in vivo, а также в процессе культивирования с заданными характеристиками, что особенно важно для биотехнологического производства.

Данные по ультратонкому строению смешанных микробных сообществ; морфологические признаки, свидетельствующие о симбиотическом или антагонистическом типе взаимоотношений, могут быть использованы при разработке лекарственных препаратов-пробиотиков и рекомендаций для их применения.

На современном этапе данные по ультратонкому строению микробных сообществ (наличие защитной поверхностной пленки, определенные соотношения морфо-физиологических типов клеток, контакты между клетками, межклеточный матрикс) имеют значение при практической разработке новых методов лечения и диагностики инфекционных заболеваний.

На основе анализа структуры микробных сообществ и биодеструктивных изменений субстратов разработаны теоретические и экспериментальные обоснования целесообразности электронно-микроскопических исследований для прогнозирования динамики процессов, протекающих в различных микробиоценозах.

Близкие характеристики основных параметров микробных сообществ различного типа, выявленные в процессе комплексного электронно-микроскопического исследования, позволяют рассматривать микробные сообщества, как удобную модель для перспективного изучения различных аспектов взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой, в том числе и с организмом человека.

Результаты исследований включены в курс лекций и практических занятий «Микробиология, вирусология и иммунология» на медицинском факультете, в курс лекций «Медицинская микробиология» на биолого-почвенном факультете Санкт-Петербургского государственного университета, а также используются в курсе лекций по микробиологии Санкт-Петербургского технологического института и Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования (МАЛО).

Апробация работы. Основные результаты и положения работы обсуждались на 42 всесоюзных, всероссийских и международных конференциях и симпозиумах: Всесоюзная Научная Конференция «Метаболические плазмиды бактерий» (Таллин, 1982), Всесоюзная Конференция «Термостабильные организмы в природе и практике народного хозяйства» (Москва, 1983), Всесоюзная Научная Конференция «Регуляция микробного метаболизма» (Пущино, 1989), Всесоюзная Научная Конференция «Лимитирование и ингибирование микроорганизмов» (Пущино, 1989), Всесоюзная Научная Конференция «Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии» (Махачкала, 1990), 1-ая Всесоюзная Научная Конференция «Теория и практика электронно-оптического исследования коллоидных систем» (Оболенск, 1990), Всесоюзная Научно-техиическая Конференция «Охрана окружающей среды на предприятиях Минмедпрома СССР» (Ташкент, 1990), ASM International Conference «Multicellular behavior of bacteria in nature, industry and the laboratory» (Woods Hole, Massachusetts, 1990), International Conference of Medical Biotechnological Immunization and AIDS (Leningrad, 1991), Всесоюзная Научная Конференция «Биотехнология и биофизика микробных популяций» (Алма-Ата, 1991), П-й Международный микологический симпозиум «Микозы и иммунодефтшты» (Ленинград, 1991), 10th International Conference of Surface forces (Moscow, 1992), Всесоюзная Конференция «Сенсорные системы» (Москва, 1992), Международная Конференция «Загрязнение окружающей среды, проблемы токсикологии и эпидемиологии» (Пермь, 1993), 6th International Beijing Conference and Exhibition of Instrumental Analysis (Beijing, 1995), Международный симпозиум, посвященный году Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 1995), III Международный симпозиум «Патогенез, диагностика и терапия микозов и микогенной аллергии» (Санкт-Петербург, 1995), 4th International Conference on structural studies of historical buildings STREMA'95, Structural Studies of Historical Buildings (Southampton, Boston, 1995), 4-я международная конференция «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург. 1996), 4-л International Symposium on the Conservation of Monuments in the Mediterranean Basin (Rhodes, 1997), 7th International Beijing Conference and Exhibition of Instrumental Analysis (Beijing, 1997), Международная Конференция «Консервация памятников культуры» (Санкт-Петербург, 1997), Международный Симпозиум «Стратегия экологической безопасности Санкт-Петербурга с использованием опыта Нидерландов» (Санкт-Петербург, 1997).2-я Международная Конференция по охране окружающей среды для населения и будущих поколений (Самара, 1997), 1-й Международный Конгресс «Слабые и сверхсильные поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 1997), 6-ая Международная Конференция «СПИД, рак и родственные проблемы» Санкт-Петербург, 1998), Научная Конференция «Современная микробиология,

состояние, достижения, перспективы» (Санкт-Петербург, 1998), 5th International Symposium on Metal Ions in Biology and Medicine (Neucherberg/Munich, 1998), Всероссийская конференция «Экологические проблемы биодеградации промышленных строительных материалов и отходов производства» (Пенза, 1998), 6th International Mycological Congress (Israel, 1998), 7-я Международная Конференция «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 1999), III съезд Докучаевского общества почвоведов (Суздаль, 2000), 8-я Международная Конференция «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 2000), 6-ая Международная конференция «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана» (Москва-Щелково, 2001), Международная Научно-практическая Конференция «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 84 печатных работах, включающих: 1 монографию; 34 работы, опубликованные в научных периодических изданиях, в их число входит 17 отечественных рецензируемых научных журналов, 5 зарубежных научных журналов. 42 работы опубликованы в материалах всесоюзных, всероссийских, международных конференций и симпозиумов и в 7 методических рекомендациях. Все перечисленные печатные работы содержат информацию, использованную при написании диссертации.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены во введении, 5 главах, заключении и выводах. В первой главе представлены основные объекты и методические приемы. В каждой следующей главе первый подраздел посвящен обзору литературы по проблемам, анализируемым в данной главе. В следующих подразделах изложены результаты исследований и заключительные замечания. Работа документирована 200 элекгронограммами и рисунками, 24 таблицами. Список литературы включает 427 ссылок. Общий объем диссертации - 349 с.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность темы, формулируются цель и задачи; показана научная новизна, практическая ценность, результаты апробации, структура диссертации.

В первой главе изложена методология проведения электронно-микроскопических исследований для выявления морфо-физиологических закономерностей не только на уровне отдельных клеток, но и целых микробных сообществ. Показаны специфика и преимущества разработанных автором электронно-микроскопических методов и приемов, выявляющих морфологические характеристаки, определяющие структуру микробных сообществ. В отличие от традиционных электронно-микроскопических методов авторские разработки сделали возможным проведение морфологических исследований внеклеточных структур, определяющих взаимодействия микробных клеток в микробных сообществах. До

настоящего времени полученные данные касались прежде всего морфологии самих клеток, тогда как информация о взаимодействии бактериальных клеток, входящих в состав микробных популяций, как между собой, так и с окружающей средой, была явно недостаточной. При сопоставлении морфо-физиологических характеристик микробных клеток при их развитии in vitro и in vivo, они не всегда совпадали, что свидетельствовало о существовании особых законов развития и взаимодействия микроорганизмов в микробных сообществах. Незнание этих закономерностей, на данном этапе развития микробиологии, может быть оправдано только лишь отсутствием соответствующих приемов, в том числе и электронно-микроскопических методов исследований. Разногласия в оценке морфо-физиологических характеристик отдельных клеток in vitro и клеток, входящих в состав микробных популяций in vivo создали необходимость развития вспомогательных методов, позволяющих проводить электронно-микроскопические исследования на уровне целых популяций. Для реализации поставленной задачи, которая заключалась в устранении обнаруженных противоречий и удовлетворяла бы правилам, с одной стороны, микробиологической науки, а с другой стороны, требованиям электронно-микроскопических исследований, нами был разработан ряд принципиально новых приемов в процедуре приготовления электронно-микроскопических препаратов.

Следующая часть главы посвящена описанию основных объектов и методов исследования. Главными объектами исследований являлись сообщества микроорганизмов (бактерий и микроскопических грибов), развивающиеся в жидких и на плотных питательных средах в условиях опыта in vitro, а также на различных субстратах и материалах в естественной среде обитания in vivo.

Основная часть работы выполнена на культурах энтеробактерий, принадлежащих к родам: Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Proteus, Campylobacter, Helicobacter и т.д. Для работы использованы некоторые виды Streptococcus, Staphylococcus, Brevibacterium, Lactobacillus, Bifidobacterium, представители некоторых родов микромицетов: Cladosporium, Penicillium, Aspergillus и дрожжеподобных грибов рода Candida. Для проведения сравнительного анализа использованы некоторые штаммы термофильных бацилл Bacillus thermononliquefaciens ТР1 и Bacillus tostus TP9, выделенные нами из горячих источников Камчатки [Андреев, Рыбальченко, Шалаева, 1983], идентификацию бактерий осуществляли по руководству [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1984]. Микроорганизмы получены из музеев кафедр микробиологии МАЛО, МУ им. И.П. Павлова и лаборатории НИИЭМ им. Пастера, ПИЯФ им. Б.П. Константинова, ГИСК им. J1.A. Тарасевича и Американской коллекции типовых культур АТСС. Результаты биохимического анализа использованных в работе бактериальных штаммов подтвердили их

принадлежность к соответствующим родам и видам. Полученные данные соответствуют биохимическим характеристикам, представленным в руководстве [Определитель бактерий Берджи, 1997].

Для выращивания бактерий in vitro использовали жидкие и плотные питательные среды различного состава: аминопептидная, мясопептонная, глюкозо-минеральная и др. Термофильные бациллы выращивали в среде с крахмалом и мелом. Микромицеты выращивали на сусло-агаре, среде Сабуро и Чапека. Рост микроорганизмов оценивали по изменению оптической плотности бактериальных суспензий и количеству колоний на плотных питательных средах.

Смешанные и колониеподобные микробные сообщества, выращивали совместно с Вербицкой Н.Б. и Тец В.В. на плотных питательных средах. Отобраны пары бактерий, не проявляющие взаимного антагонизма: Е. coli — М. luteus; Е. coli — В. cereus; Е. coli — S. aureus, Е. coli — S. faecalis; E. coli — B. flavum; B. cereus — S. aureus; B. flavum — P. aeruginosa; P. aeruginosa — S. aureus и некоторые другие.

Антагонистическую активность лакгобацилл по отношению к различным видам микроорганизмов определяли на средах МРС-1 и МРС-4 в НИИ особо чистых биопрепаратов совместно с Вербицкой Н.Б.

Ответные реакции бактерий па стрессовые воздействия (тепловой, кислотный, щелочной шок, обезвоживание) исследовали на клетках, выращенных до логарифмической фазы роста. Высев осуществляли на полные и селективные плотные питательные среды.

Спектры поглощения внеклеточной среды в ультрафиолетовой (240350 нм) и ближней инфракрасной (2200-1800 нм) области получены с использованием двухлучевого спектрофотометра Acta MVII (Beckman, США) в НИИ особо чистых биопрепаратов совместно с Н.В. Ровновым.

Ориентационно-кондуктометрические измерения проведены на физическом факультете СПбГУ совместно с С.А. Какориным [Войтылов, Какорин, Трусов, 1990].

Электронно-микроскопическое исследование осуществляли одновременно несколькими классическими методами: позитивного окрашивания [Brenner, Home, 1959; Glauert, 1965], ультратонких срезов [Hayat, 1974], цитохимическим методом выявления кислых полисахаридов [Kobayashi, Saboe-Hansen, 1971], методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) [Black, 1974].

При использовании метода позитивного окрашивания в каждом случае просматривали не менее 50 сеточек (3-4-кратные опыты, с 3-5-кратными повторами, из каждого препарата готовили по 2-3 образца, из каждого образца готовили по 2-3 сеточки). При использовании метода ультратонких срезов в каждом случае исследовали не менее ста ультратонких срезов (3-4-кратные опыты с 3-5-кратными повторами, из каждого препарата готовили по 2-3 образца, из каждого образца готовили по 4-6 ультратонких срезов).

Для СЭМ соблюдали следующую схему отбора материала (3-4-кратные опыты с 3-5-кратными повторами, из каждого препарата готовили по 2-3 образца, из каждого образца готовили по 2-3 объекта для исследования).

Для оценки степени гетерогенности микробной популяции нами на основе классического метода позитивного окрашивания разработан метод контрастирования уранилацетатом, позволяющий в качестве одного из критериев оценки морфо-физиологического состояния бактериальных клеток использовать интенсивность электронной плотности цитоплазмы [Рыбальченко, Савкова, 1989]. Особенность разработанного нами метода позитивного окрашивания заключалась в использовании уранилацитата меньшей концентрации (0,1%-ный водный раствор уранилацитата, вместо положенного 1-2%-ного), ускоренной обработке препаратов контрастером (не позже, чем через 30 сек после извлечения образцов из приборов или прекращения действия условий опыта), сокращении времени обработки контрастером до 30 сек. Для подтверждения данных, полученных методом позитивного окрашивания, использовали разработанные нами методы ультратонких срезов и СЭМ [Tetz, Rybalchenko, Savkova, 1990]. Для исследования ультраструктуры микробных сообществ in situ потребовалось создать особые методы, модификации методов и приемы [Tetz, Rybalchenko, Savkova, 1993]. Разработанный нами метод СЭМ колоний предотвращает появление артефактов, связанных с нарушением их поверхностных структур и позволяет исследовать как целые колонии, так и отпечатки с них. Отпечатки с колоний получали, прикасаясь медной сеткой, покрытой формваровой пленкой-подложкой к поверхности фиксированной глутаральдегидом колонии, что позволяло выявить внутреннее устройство колонии, не нарушая пространственного расположения клеток, поскольку отпечатки готовили из фиксированных колоний [Tetz, Rybalchenko, Savkova, 1990]. Разработанный нами метод позитивного окрашивания отпечатков с поверхности колоний позволяет оценить не только морфологические свойства бактериальных клеток, но и выявить их естественное расположение относительно друг друга и установить контакты между отдельными особями в популяции in situ. Разработанный нами метод ультратонких срезов колоний предотвращает появление артефактов й предоставляет информацию о естественной структуре микробных сообществ.

Межклеточные взаимодействия в смешанных микробных сообществах исследовали методами ультратонких срезов и позитивного окрашивания. Пробы для электронно-микроскопического анализа в случае отсутствия визуально выраженного антагонистического воздействия бактериальных культур отбирали из зон близкого контакта исследуемых микроорганизмов. При визуально выраженном антагонистическом воздействии бактерий пробы отбирали из зон появления видимого роста тест-культур. Особенность подготовки образцов заключалась в сохранении исходной структуры и пространственного расположения исследуемых объектов.

Исследование биодсструктивных изменений памятников культуры с целью идентификации микроорганизмов-деструкторов и выявления характера и степени разрушения с дальнейшим прогнозом возможных нарушений целостности объектов проводили разработанным нами методом СЭМ [Рыбальченко, Савкова, 1989]. Данный метод может быть успешно применен для исследования поверхности музейных экспонатов, поскольку во многом отвечает основным требованиям классической диагностики: объективность (исключено появление артефактов); многоуровневостъ (выявление состояния как самого объекта исследования, так и причины биодеструкции); краткосрочность (продолжительность анализа составляет от 5 до 24 ч), при этом для анализа требуются образцы микроскопических размеров (площадью около 1 м м2).

Основными объектами электронно-микроскопического изучения служили: бумага, пергамен, кожа, ткани, минералы (мрамор, гранит, известняк, слюда). Были исследованы памятники культуры из Российской Национальной Библиотеки (РНБ) и Государственного Эрмитажа (ГЭ): восточная рукопись XV в. - ветхая рисовая бумага; старинный печатный лист - тряпичная бумага; оберег - кожаное изделие XVII в.; кости мамонта; фрагменты деревянного саркофага 1 в. и. э.; фрагменты трех мраморных рельефов из греческих колоний I-III вв. н. э.; две античные мраморные статуи I-HI вв. н. э.; фрагмент античного мрамора из раскопок в Херсонесе; в качестве контроля использовали интакшые образцы современных материалов из бумаги, кожи, кости и мрамора.

Процесс старения и биодеструкции материалов изучали в модельных условиях в лаборатории биологического контроля НРБ совместно с Добрусиной С.А. и Беликовой Т.Д., используя систему искусственного старения бумаги и пергамена, а также in situ на памятниках культуры (старинные рукописи, античные мраморные скульптуры, деревянный саркофаг и т.д.) совместно с JI.B. Словашевской и O.JI. Смоляницкой.

Изменения структуры гранитного щебня при длительном выращивании растений в регулируемых агроэкосистемах, созданных академиком Е.И. Ермаковым, исследовали методом СЭМ [Ермаков, Зверева, Рыбальченко, Непримерова, 2000].

Оценку биодеструктивных изменений нефти проводили, анализируя активность и структуру микробных ассоциаций, отличающихся высокой скоростью роста и утилизации нефтяных углеводородов [Зольникова, Кхариф, Рыбальченко, Рощина, Яковлев, 1998]. Бактерии-алканотрофы выделены на кафедре микробиологического синтеза СПБ ТИ Н.В. Зольниковой.

Геоэкологическую экспертизу образцов почвы и горных пород с глубины от 1 до 2750 м проводили по методу Т.Н. Нижарадзе с применением разработанного нами метода позитивного окрашивания [Нижарадзе, Рыбальченко, Руднева, Томилин, 1997].

Морфометрический анализ осуществляли на анализаторе изображения IBAS-1 (Германия); число обсчитанных на приборе электронограмм составляло не менее трехсот в каждом отдельном случае.

Обработку полученных результатов проводили на ЭВМ IBAS-1 с использованием программы для компьютерного анализа изображения «Иста-Видеотест» (Image Analisys System Videotest).

Во второй главе проведен электронно-микроскопический анализ морфологической гетерогенности микробных сообществ различных видов микроорганизмов. Морфологическая гетерогенность отмечена во всех популяциях бактерий, различающихся по типу строения клеточной стенки (грамотрицательные бактерии - Е. coli, С. jejuni, С. coli; грамположительные бактерии - В. flavurn); термофилов (В. thermononliquefaciens, В. tostus); сапрофитов (E.coli); патогенных для человека и животных (С. coli, С. jejuni, Н. pylori); промышленных продуцентов (В. flavum). Показано, что степень морфологической гетерогенности зависит от условий выращивания и действия различных экстремальных факторов (повышенной температуры, обезвоживания, изменения значений pH). В составе всех исследованных микробных популяций идентифицировано несколько морфологических типов клеток (физиологически активные - электронно-прозрачные, покоящиеся - электронно-плотные), отличающихся' по характеру протекающих в них деструктивных нарушений, возникающих при изменении параметров роста и действии экстремальных факторов. Характер изменений зависит от реакции и поведения каждой отдельной особи, при этом соотношение морфологических типов клеток существенно меняется.

Сравнительный анализ ультраструктурных изменений, вызванных различными видами стрессовых воздействий в клетках грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, относящихся как к мезо-, так и к термофильным группам, свидетельствует о появлении при любом виде воздействия неспецифических морфо-физиологических признаков (нарастание доли автолизированных, инволюционных и покоящихся клеток), а также ряда специфических перестроек. Повышение температуры, в отличие от других видов воздействия, приводит к специфическим ультраструктурным изменениям в цитоплазме, что проявляется в разрушении белково-рибосомального комплекса и образовании электронно-плотных некристаллических гранул. Появление гранул не является артефактом, поскольку их существование в клетках при тепловых воздействиях было продемонстрировано двумя различными методами (ультратонких срезов и позитивного окрашивания). Сделан вывод о том, что разнообразие морфологических типов клеток является одним из механизмов, способствующих сохранению и переходу популяции в покоящееся состояние при экстремальных условиях. При нормализации условий роста происходит переход клеток в активное состояние. Полученные данные предоставляют дополнительный материал для выявления морфо-физиологической

дифференцировки, а также роли клеточных взаимодействий микроорганизмов в микробных популяциях, что необходимо для понимания закономерностей их социального поведения и, возможно, позволит в дальнейшем приблизиться к пониманию регуляторных механизмов развития микробных сообществ.

Третья глава посвящена исследованию структуры однородных и смешанных микробных сообществ, развивающихся на плотных и в жидких питательньЪс средах: колоний, бактериальных газонов (биопленок). Описана структура неизвестных ранее колониеподобных микробных сообществ и различных вариантов смешанных микробных сообществ [Tetz, Rybalchenko, 1997], образованных разными видами бактерий. Указанные микробные сообщества представляют собой устойчивые формы, обладающие рядом характерных и воспроизводимых свойств. Выявлены ультраструктурные особенности микробных сообществ, свидетельствующие о наличии неизвестных ранее свойств микроорганизмов. Показано, что наряду с общими закономерностями микробные сообщества разного уровня организации (колонии, бактериальный газон, колониеподобные сообщества, смешанные микробные сообщества), обладают рядом индивидуальных свойств. Морфологические признаки, характерные как для одного вида бактерий, так и для всего микробного сообщества в целом (образование защитной пленки на поверхности микробного сообщества и клеточных контактов между бактериями), можно отнести к общим свойствам микробных сообществ. Показано, что все исследованные в работе микробные сообщества отграничены от окружающей среды особой структурой -поверхностной пленкой, основу которой составляет трехслойная элементарная мембрана. В случае газонного роста величина поверхностной пленки соизмерима с площадью, занимаемой бактериальным газоном. Поверхностная пленка смешанного микробного сообщества является общей для различных видов бактерий. Материал для формирования поверхностной пленки доставляется, мембранными везикулами, секретируемыми бактериальными клетками, и выявляемыми затем в матриксе, после чего они перемещаются к поверхности микробного сообщества. Ранее показано, что мембранные везикулы грамотрицательных бактерий могут включать различные вещества: полисахариды, липиды, белки, ферменты и токсины [Rothfield, Pearlman-Kothens, 1969; Goodell, Schwarz, 1985, Mayrand, Grenier, 1989;Zhoue. a., 1998].

Вероятно, именно поверхностная пленка вместе с внеклеточным матриксом обеспечивает повышенную устойчивость бактериям, находящимся внутри микробных сообществ, без изменения их индивидуальной чувствительности к действию негативных факторов.

При образовании микробных сообществ в жидких питательных средах, бактериальные клетки также могут быть окружены дополнительными

многослойными мембранными структурами, отграничивающими их от окружающей среды.

Таким образом, при формировании любых типов микробных сообществ, возникают дополнительные барьеры между клетками и внешней средой. Принципиально важным следует считать существование между клетками в микробных сообществах различных типов межклеточных контактов. По сравнению с единичными клетками, находящимися в жидких средах, бактерии внутри микробных сообществ проявляют особые свойства, выражающиеся в образовании контактов между клетками. Грамотрицательные бактерии могут соединяться между собой мембранными выростами, формирующими цитоплазматические мостики, или за счет тесного слипания, при котором участок стенки становится общим для двух клеток [Tetz, Rybalchenko, Savkova, 1990]. Ранее было описано объединение клеток различных видов бактерий за счет межклеточного матрикса [Высоцкий, 1968; Высоцкий и др., 1985; Draker, Wittaker, 1971; Медведева и др., 1991]. Впоследствии существование межклеточных контактов типа тесного слипания, впервые описанных нами на примере Е. coli, S. typhimurium и S. flexneri, было также показано и у бифидобактерий [Новик, Высоцкий, 1995]. Возможность формирования межклеточных контактов, которые могут обеспечивать передачу молекул от клетки к клетке, у грамотрицательных бактерий показано на примере гонококков и псевдомонад [Todd е.а., 1984; Bayer, Easterbrook, 1991]. Авторы отмечают, что в образовании контактов у нейссерий могут принимать участие пили. Грамположительные бактерии соединяются между собой только по типу «тесного слипания» клеток, при котором общими становятся участки пептидогликанового слоя. Контакты между клетками, как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий образуются во всех направлениях, формируя единую трехмерную систему. Возможно, объединение бактерий в единую систему способствует более совершенной регуляции процессов жизнедеятельности в микробных сообществах, по сравнению с независимо существующими бактериальными клетками. Особенности строения зон контакта, образование бактериями внутри сообщества трехмерной взаимосвязанной' системы позволяют предполагать возможность выработки общего ответа, даже если воздействию подвергалась только часть клеток сообщества. К индивидуальным свойствам микробных сообществ можно отнести их форму и размеры, морфологическую гетерогенность клеток, скорость старения клеток, проявление признаков специализации клеток внутри микробного сообщества, а также особенности строения поверхностной пленки и межклеточных контактов. Дифференциация бактерий происходит во всех типах микробных сообществ. Однако только в колониях обнаружено разделение бактерий по способности образовывать гликокаликс. Межклеточные контакты образуются во всех типах сообществ. Однако в колониях они формируются, как принято считать,

между потомками одной клетки, в то время как в остальных случаях в их образовании участвуют различные клетки Наибольший интерес представляют контакты между грамположительными и грамотринательными бактериями, входящих в состав смешанного микробного сообщества.

Таким образом, получены принципиально новые данные об особенностях жизнедеятельности микроорганизмов, строении разных типов микробных сообществ и входящих в их состав внеклеточных мембран, возможно, определяющих чувствительность бактерий к различным факторам внешней среды, в том числе, вероятно, и к антимикробным препаратам. Результаты исследований могут быть применены при разработке рекомендаций по использованию антимикробных препаратов, химиопрепаратов, дезинфицирующих средств с учетом особенностей строения и функционирования структурных компонентов микробных сообществ, обеспечивающих повышенную устойчивость к негативным факторам.

Четвертая глава посвящена исследованию морфо-физиологических аспектов антагонистических взаимоотношений между прокариотами, а также микроорганизмами с различным уровнем эволюционной организации: про- и эукариотами (бактерии и дрожжеподобные грибы). Показало, что взаимодействие микроорганизмов между собой осуществляется не только на уровне отдельных клеток, но и на популяционном уровне. При этом реакцией популяций на антагонистическое воздействие может быть изменение их структуры, т.е. соотношения клеток различного морфологического тала или возникновение качественно новых специфических признаков, т. е. микроэволюционные процессы. На молекулярном уровне исследован механизм гибели бактерий под действием лактоцинов. Установлено, что лакгоцины вызывают функциональные нарушения цитоплазматической мембраны и нуклеоида. Выявлены взаимоотношения нормальной, условно-патогенной и патогенной микрофлоры при различных дисбиотических состояниях, при которых происходит нарушение структуры и функции нормальной микрофлоры человека.

Таким образом, электронно-микроскопический анализ структуры микробных популяций, выявление характера взаимодействия микроорганизмов друг на друга in vitro может быть использован при подборе наиболее эффективных препаратов-пробиотиков для коррекции дисбиотических состояний. Исследование простейших микробных ассоциаций, способных оказывать влияние на формирование более сложных микробиоценозов, возможно, в дальнейшем позволит выявлять механизмы, контролирующие функционирование такой сложнейшей экологической системы, как человеческий организм.

В пятой главе проведено электронно-микроскопическое исследование взаимодействий между микроорганизмами и различными компонентами окружающей среды: минералами, почвой, нефтью, бумагой, пергаменом,

кожей. Участие микроорганизмов в почвообразовании, биодеструкции различных минералов и материалов не подлежит сомнению, при этом формирование сложных смешанных микробных сообществ и их роль в этих процессах изучена недостаточно.

Выявлены особенности биогенного изменения поверхности частиц гранита в корнеобитаемых средах при длительном выращивании растений в регулируемой агроэкосистеме. Анализ гранитного щебня после 23 вегетаций яровой пшеницы и томата выявил избирательное биогенное выветривание минералов гранита — расщепление и коррозию пластинок слюд, образование следов травления на поверхности зерен полевых шпатов. к Исследование методом СЭМ поверхности деструктурированных

памятников культуры показало, что в большинстве случаев причиной разрушения различных минералов являются микроорганизмы: бактерии и микроскопические грибы. В процессе жизнедеятельности микромицеты выделяют биологически активные вещества, которые вызывают разрушение материалов, что позволяет гифам грибов проникать в толщу субстрата и создавать условия для развития более влаголюбивых микроорганизмов -бактерий и водорослей. СЭМ позволяет достаточно быстро и с минимальными затратами как самих образцов, так и реактивов, выявить причину биоповреждений памятников культуры, а также прогнозировать дальнейшее развитие деструктивных изменений. Показано, что проведение электронно-микроскопического анализа по предложенной нами методике необходимо для оптимизации реставрационных работ и определения дальнейших способов консервации памятников культуры.

Разработанный нами комплекс электронно-микроскопических методов позволил выявить структуру наиболее активных почвенных микробных сообществ бактерий-алканотрофов, представленных ассоциацией грамположительных и грамотрицательных бактерий. Установлено, что именно эти ассоциации микроорганизмов более глубоко и интенсивно разрушали нефтепродукты.

Обсуждение

Данное исследование включает электронно-микроскопический анализ микроэкосистем с целью выявления морфологических особенностей и механизмов взаимодействия микроорганизмов в микробных сообществах между собой и окружающей средой на молекулярном, клеточном и популяционном уровнях. Микробная популяция представляет собой - сложную, гетерогенную систему, ответ которой на внешние воздействия зависит от реакции и поведения всех ее компонентов. Комплексное электронно-микроскопическое исследование включает анализ микробных сообществ на нескольких уровнях, в том числе структуру субстрата, на котором развиваются микробные сообщества, с учетом воздействия на всю систему самых различных факторов окружающей среды. Поэтому, в первую очередь, необходимо было провести детальное исследование

ультраструктурной организации интактных клеток различных видов микроорганизмов, отличающихся, с одной стороны, по принципу строения клеточной стенки (грамотрицательные и грамположительные бактерии), с другой, по температурному оптимуму роста (мезофильные и термофильные бактерии). В дальнейшем, возникла необходимость сравнительного изучения морфологических особенностей представителей различных групп микроорганизмов после воздействия повышенной температуры, обезвоживания, низких и высоких значений pH с целью выявления специфических ультраструктурных изменений при действии указанных экстремальных факторов.

Результаты, полученные в ходе первого этапа электронно-микроскопического исследования, привели к необходимости анализа структуры популяции и выявления морфологической гетерогенности микробных сообществ. В любой популяции наряду с бактериями, имеющими характерную для данного вида ультраструктурную организацию, можно обнаружить морфологические варианты, отличающиеся не только по строению, но и по физиологическим и генетическим свойствам [Иванов, 1990]. Электронно-микроскопический анализ, проводимый одновременно несколькими методами, дает возможность выявить в составе микробной популяции различные морфологические типы клеток. Последние по-разному реагируют на изменение параметров выращивания и действие экстремальных факторов, что проявляется в различной степени выраженности ультраструктурных изменений. В связи с этим для исследования влияния различных факторов на бактериальные культуры необходимо анализировать реакции на эти воздействия не только отдельных клеток, но и всей популяции в целом.

Морфологическая гетерогенность микробных популяций Электронно-микроскопический анализ всех исследованных в работе видов микроорганизмов, наряду с признаками, характерными для данного вида и рода, выявил большое разнообразие ультраструктурных особенностей у бактерий, свидетельствующее о гетерогенноста микробных популяций. Подобные наблюдения поставили нас перед необходимостью исследования взаимосвязи морфометрических и физиологических характеристик бактерий в процессе их развития.

Морфологические типы клеток Для оценки степени гетерогенности микробной популяции Е. coli Ml 7 анализировали интенсивность электронной плотности цитоплазмы бактериальных клеток. В результате в структуре микробных популяций выделены два класса бактериальных клеток: электронно-прозрачные и электронно-плотные. Измерение размеров клеток на анализаторе изображения IBAS I (Германия) подтвердило разделение популяции на две группы: линейные размеры электронно-прозрачных и электронно-плотных клеток отличались на 39%, а объемные на 290%. Полученные результаты

также были подтверждены методом ориентационной кондукгометрии. Привлечение в качестве дополнительного критерия ультраструктурного состояния клеточных органелл позволило выделить 5 основных морфологических типов клеток: морфологически интакгные делящиеся и неделящиеся (электронно-прозрачные), покоящиеся (электронно-плотные), клетки с начальными деструктивными изменениями в цитоплазме и клеточной стенке (электронно-прозрачные), инволюционные (электронно-прозрачные), частично или полностью автолизированные.

Покоящиеся клетки Аналогичные морфологические формы клеток у Е. coli Ml 7 на уровне световой микроскопии наблюдала группа авторов [Свентицкий и др. авт. св-во]. В работах Г.И. Эль-Регистан с соавторами [Эль-Регистан и др., 1979а; Эль-Регистан и др., 19796; Эль-Регистан и др, 1980; Дуда и др., 1982; Эль-Регистан и др., 1983] методами световой микроскопии при изучении Bacillus subtilis, В. cereus, Pseudomonas carboxydoflava и др. отмечено появление клеток, характеризующихся повышенной рефрактильностью. Подобные клетки были по объему на 20-40% меньше обычных бактерий и по данным авторов обладали пониженной метаболической активностью, т.е. находились в анабиотическом состоянии (покоящиеся формы). Поскольку функциональные особенности некоторых из перечисленных морфологических типов клеток (интакгные, делящиеся, автолизированные) общеизвестны, то в обсуждении внимание будет акцентировано на значительно менее изученных вегетативных покоящихся (электронно-плотных) клетках.

Дополнительные основания для отнесения электронно-плотных клеток к покоящимся формам дают наши наблюдения за ними в процессе выращивания и действия экстремальных факторов. Например, наличие электронно-плотных клеток в посевном материале, снижение или полное их исчезновение в логарифмической фазе роста, появление и возрастание их числа в стационарной фазе роста, присутствие в регидратированных препаратах и хранящихся культурах, а также их появление при медленном понижении или повышении температуры инкубационной среды свидетельствуют в пользу высказанного выше предположения.

Морфологические признаки, свойственные покоящимся бактериальным клеткам, обнаружены и у эукариотических организмов. В монографии О. И. Епифановой [Епифанова, 1983] приводится сравнительный анализ структурно-функциональных особенностей пролиферирующих и покоящихся клеток. На различных перевиваемых клеточных линиях показано, что клетки и их ядра уменьшаются в размерах при переходе культуры в стационарную фазу роста [Терских, Зорин, 1971; Терских, Засимовская, 1971;-. Yen, et al, 1975], при этом увеличивается плотность клеток [Grdina, е. а., 1974; Ng, Inch, 1978]. В детальном электронно-микроскопическом исследовании Дж. Шеридана с соавторами [Sheridan е. а.,

1981], выполненом на культуре клеток меланомы человека, становлено, что уменьшение размеров ядер по достижении стационарной фазы роста происходит параллельно с уменьшением размеров клеток. Этот процесс сопровождается конденсацией митохондрий, вакуолизацией цитоплазмы и другими морфологическими изменениями. При действии стимуляторов клеточной пролиферации размеры покоящихся клеток вновь увеличиваются. Структура наружной мембраны покоящихся клеток претерпевает характерные изменения, приводящие к тому, что в целом она становится более стабильной по сравнению с мембраной пролиферирующих клеток. На поверхности покоящихся клеток увеличивается количество серосодержащих глюкозаминогликанов, способных аккумулировать ионы кальция, благодаря чему происходит фиксация белков плазматической мембраны [Vannuchi, Chiarugi, 1977]. Существенным образом изменяется при переходе клеток в состояние покоя метаболизм фосфолипидов. Установлено, что в состоянии покоя в клетках фибробластов кожи человека общее количество холестерина снижается. В электронно-микроскопическом исследовании опухолевых клетках крови от лейкозных больных, нами также были выявлены два морфологических варианта клеток, характеризующиеся указанными выше ультраструктурными особенностями [Жуковский, Ровнов, Тяготин, Рыбальченко и др., 1996].

Сопоставление собственных результатов и данных литературы позволяет считать, что образование покоящихся электронно-плотных клеток — универсальное явление для про- и эукариотических микро- и макроорганизмов. Покоящиеся формы клеток обнаружены во всех исследованных нами популяциях, независимо от их принадлежности к грамотрицательным, грамположительным, мезофильным или термофильным микроорганизмам.

Морфологический анализ микробных популяций, развивающихся в жидкой питательной среде

Морфологический анализ популяций Е. coli М17 и В. flavum Е531, развивающихся в жидкой питательной среде, выявил большое разнообразие морфологических форм клеток, отличающихся по размерам, форме и ультраструктурной организации. Соотношение различных морфологических форм клеток менялось в зависимости от возраста популяции и отражало физиологическое состояние клеток. Наиболее высокий уровень морфологической гетерогенности отмечен в популяциях, где в качестве инокулята использовали материал, в котором обнаруживались все пять « морфологических типов клеток. Например, 70% посевного материала Е. coli Ml 7 составляли инволюционные и частично автолизированные клетки, 24% -электронно-плотные клетки и только 6% клеток сохраняли интактную ультраструктуру. Соотношение морфологических типов клеток изменялось по мере развития популяции: в начале логарифмической фазы роста доля морфологически интактных клеток увеличивалась до 93%, при этом доля

остальных морфологических типов уменьшалась до минимального уровня. Начало стационарной фазы роста характеризовалось уменьшением доли морфологически интактных клеток до 85% с одновременным увеличением доли электронно-плотных покоящихся форм, доля которых с 2% в начале логарифмической фазы роста возрастала до 10%. Частично деструктурированные и почти полностью автолизированные клетки составляли 4 и 1% соответственно. По мере старения популяции доля электронно-плотных клеток продолжала возрастать и в более позднем стационаре к концу 7-го ч выращивания составляла около 40%.

Таким образом, морфометрический анализ микробной популяции позволяет получить дополнительные данные для сравнительной оценки функционального состояния входящих в ее состав клеток.

Морфологический анализ разных типов микробных сообществ,

развивающихся на плотных питательных средах

Образование везикул отмечено у представителей различных родов: Escherichia, Vibrio, Bacteroides, Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas, Serratia, Veillonella [Nowotny et al., 1982; Deslauries et al., 1990; Grenier, Mayrand, 1987; Shoberg, Thomas, 1993; Kadurugamuwa, Beveridge, 1995; Dorward, Garon, 1989; Wispelwy et al., 1989; Biaden, Mergenhagen, 1964]. Подобные структуры наблюдали при выращивании бактерий в жидких питательных средах. Установлено, что их число изменялось в зависимости от условий выращивания, например, возрастало при неблагоприятных воздействиях [Knox et al, 1966; Kadurugamuwa, Beverige, 1995]. Наличие везикул в различных сообществах грамотрицательных бактерий, выращенных на плотных питательных средах, впервые было показано в наших работах [Tetz, Rybalchenko, Savkova, 1990; Tetz, Rybalchenko, Savkova, 1993 a, b, с]. Способность грамположительных бактерий образовывать мембранные везикулы оставалась до последнего времени неизвестной. Используя различные электронно-микроскопические методы, мы наблюдали многочисленные полиморфные мембранные везикулы в микробных сообществах всех исследованных нами видов грамположительных бактерий:

Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus, Brevibacterium, Streptoccocus, Lactobacillus и т.д. [Tetz, Rybalchenko, Savkova, 1990; Tetz, Rybalchenko, Savkova, 1993 a, b, c; Tetz, Rybalchenko, 1997]. Формирование мембранных везикул являлось общим свойством для грам отрицательных и для грамположительных бактерий. Происхождение мембранных везикул у грамотрицательных бактерий связывают с внешней мембраной их клеточной стенки [Chatterje, Das, 1967; Gankema е.а., 1980; Williams, Holt, 1985; Mayrand, Grenier, 1989]. Была разработана схема процесса формирования подобных структур [Zhou е.а., 1998]. Предложенный авторами механизм их образования позволяет объяснить наличие в составе мембранных везикул фрагментов пептидогликана [Kadumgamuwa, Beverige, 1995]. Отсутствие внешней мембраны в клеточной стенке грамположительных бактерий позволяет предположить, что единственным источником образования мембранных везикул у грамположительных бактерий может служить цитоплазматическая мембрана. Возможно, что и у грамотрицательных бактерий цитоплазматическая мембрана также принимает участие в формировании мембранных везикул. Образование везикул, по-видимому, происходит по принципу постепенной сборки компонентов, синтезируемых, и в дальнейшем экскретируемых из клетки в окружающую среду. Установлено, что в состав мембранных везикул включены белки (токсины и ферменты) полисахариды, а также липиды [Дуда и др. 1996; DeVoe, Gilchrist, 1973; Booth е.а., 1977; Forsbeig е.а., 1981; Clien е. а., 1985; Goodel, Shwarz, 1985; Austin-Pratnerand Booth, 1984; Li, Beverige, 1996]. До сих пор до конца не выяснен вопрос о биологических функциях мембранных везикул. В работе Z. Li, A.J. Clarke и T.J. Beveridge [Li, Clarke, Beveridge, 1998] показана способность мембранных везикул, выделенных из клеток 15 штаммов грамотрицательных бактерий (Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Salmonella, Shigella) лизировать клетки различных грамотрицательных и грамположительных бактерий, включая представителей рода Mycobacterium. Электронно-микроскопическими методами показано разрушение клеточных стенок бактерий под действием пептидогликановых гидролаз, выделенных из мембранных везикул [Kadumgamuwa, Beverige, 1996J.

Согласно полученным нами данным, одной из функций мембранных везикул является транспорт необходимых для образования поверхностной пленки веществ, при этом везикулы диффундируют через межклеточный матрикс, всплывают на поверхности микробного сообщества, и сливаясь друг с другом, формируют поверхностную пленку. Фрагменты трехслойной мембраны, входящие в состав везикул, соединяясь между собой, формируют основу поверхностной пленки, а внутреннее содержимое везикул образует прилегающие к ней слои аморфного вещества. Подобная транспортная функция хорошо известна для мембранных везикул внутри различных зукариотических клеток, некоторое сходство просматривается также и с

процессом экзоцитоза в животных эукариотических клетках. Необходимо отметить, что существование внеклеточных мембранных везикул отмечено у эукариотических организмов только в костной ткани [Anderson, 1976; Felix, Fleish, 1976]. Допустимо полагать, что появление мембранных везикул на поверхности пептидогликанового слоя клеточных стенок грамположительных бактерий привело в ходе эволюционного развития к образованию внешней мембраны клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Слияние на поверхности грамположительных бактерий фрагментов мембран, входящих в состав везикул, при определенных условиях могло привести к образованию дополнительного компонента клеточной стенки -внешней мембраны.

Особый интерес представляет трехслойная мембрана в составе поверхностной пленки на микробных сообществах. Подобных образований не обнаружено в других биологических системах. Поверхностную пленку в виде аморфных полисахаридных слоев, покрывающих колонии или ее отдельные участей, наблюдали у различных бактерий и ранее [Константинова и др., 1979; Шеховцев, Жарикова, 1984; Shapiro, 1985; Павлова и др. 1990]. Авторы предполагали, что полисахаридная пленка образуется в результате жизнедеятельности бактерий, а также при их частичном разрушении. Однако мембрана в составе этой пленки обнаружена не была. Очевидно, объектом наблюдения этих авторов были только аморфные слои поверхностной пленки. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что все исследованные микробные сообщества, выращенные на плотных питательных средах, окружены мембраной, которая имеет ультратонкое строение, свойственное всем бактериальным мембранам. Протяженность такой мембраны может соответствовать длине поверхности микробного сообщества. Особенно отчетливо это прослеживается в препаратах, полученных методом позитивного окрашивания пленок предварительно снятых с поверхности микробных сообществ.

Наиболее важным следует признать факт наличия трехслойной мембраны в составе пленки, образованной на поверхности смешанных микробных сообществ (CMC). Возможно, пленки на них формируются также как и в однородных микробных сообществах, за счет слияния мембранных везикул, продуцируемых всеми, а может быть, только отдельными представителями CMC. Мембранные везикулы, диффундируя через матрикс, поднимаются к поверхности микробных сообществ и, сливаясь, образуют единую мембрану. В пользу указанного выше способа образования мембраны поверхностной пленки свидетельствует последовательность ее формирования, а также слияние мембранных везикул [Tetz, Rybalchenko, Savkova, 1990; Tetz, Rybalchenko, Savkova, 1993 a, b, с]. Мембраны поверхностных пленок микробных сообществ образуются в результате слияния мембранных везикул, что позволяет высказать предположение о механизме доставки веществ, формирующих ее аморфные слои. Различными

электронно-микроскопическими методами нами показано, что наружный аморфный слой появляется после образования мембраны, при этом его толщина значительно увеличивается в процессе дальнейшего роста микробных сообществ. Однако нельзя исключать возможность образования мембраны поверхностной пленки из веществ, секретируемых клетками, но не входящих в состав мембранных везикул. Использование для построения поверхностной пленки клеточного детрита не столь существенно, поскольку пленка на поверхности микробных сообществ формируется одновременно с увеличением числа жизнеспособных клеток, когда еще не отмечена гибель и деструкция бактерий. Наибольший интерес представляет исследование биохимического состава и функциональных особенностей мембран, входящих в состав поверхностных пленок. Очевидно, как любая биологическая мембрана, она формирует границу между внешней и внутренней средой микробного сообщества. Возможно, бактерии, образовавшие сообщество, оказываются наиболее защищенными от воздействия различных факторов внешней среды, а также от влияния других микроорганизмов. В этой связи выявление механизмов транспорта веществ через мембрану в разных направлениях и защитного действия поверхностной пленки представляет особый интерес. Факт наличия мембран в составе микробных сообществ свидетельствует об их важной роли в организации и регуляции жизнедеятельности микроорганизмов. Внеклеточные мембраны, отграничивающие зоны из физиологически активных и автолизированных клеток внутри CMC, свидетельствуют о дифференциации и наличии антагонистического компонента взаимодействия представителей разных видов микроорганизмов. Возможно, при образовании подобных мембранных структур используются элементы погибших клеток. В этом процессе могут принимать участие физиологически активные клетки, одной из функций которых, возможно, является регуляция взаимоотношений с деструктурированными клетками, воспринимаемыми ими как компонент внешней среды или питательный субстрат. Идентичные мембранные структуры в отдельных случаях можно обнаружить и в однородных микробных сообществах на более поздних сроках выращивания, когда ускоряется процесс отмирания и увеличивается число автолизированных клеток. В этих случаях зоны, включающие значительное число деструктурированных клеток, отделены от остальной части микробного сообщества многослойными мембранами и мощным слоем электронно-плотного аморфного вещества.

В целом полученные данные свидетельствуют о существовании различных вариантов внеклеточных мембран, часть из которых не имеет известных аналогов. Исследование механизмов образования, состава и функций мембран, входящих в состав микробных сообществ, позволит в дальнейшем выявить новые закономерности жизнедеятельности микроорганизмов. Микробные сообщества, развивающиеся в виде биопленок

на поверхности самых различных предметов и напоминающие по своей организации бактериальный газон, являются наиболее распространенной формой существования микроорганизмов в естественных условиях обитания in situ. При этом с внешней средой контактируют не отдельные клетки, а целые сообщества микроорганизмов, защищенные комплексом дополнительных структур. В этой связи стала очевидной необходимость применения новых подходов и методов при исследовании воздействия на бактерии физико-химических факторов внешней среды. Первые сведения об особенностях взаимодействия целых микробных сообществ с различными факторами окружающей среды были получены на биопленках [Costerton, Cheng, Geese, 1987; Gilbert, Collier, Brown, 1990; Ketyi, 1991]. Авторы показали, что бактерии, находящиеся внутри биопленок, более устойчивы при действии различных веществ и антимикробных препаратов. Повышение резистентности, в основном связывали с защитными свойствами полисахаридного матрикса, в толще которого находились микроколонии, при этом необходимо отметить, что поверхностных пленок и каких-либо мембран в составе биопленок авторы не обнаруживали. Указанные данные свидетельствуют о важной роли поверхностных структур микробных сообществ в обеспечении защиты от действия негативных факторов окружающей среды. По всей вероятности, повышение выживаемости бактерий в данных случаях связано с наличием дополнительных барьеров, отграничивающих их от внешней среды.

Таким образом, поверхностная пленка, аморфный полисахаридный слой, а также межклеточный матрикс могут рассматриваться в качестве основных структурных компонентов микробных сообществ, свидетельствующих о наличии в них элементов кооперации и специализации, препятствующих воздействию негативных факторов окружающей среды.

Исследование влияния антимикробных препаратов на микробные сообщества, защищенные от внешней среды поверхностной пленкой, может иметь большое практическое значение для оценки не только чувствительности бактерий, но и способности различных веществ -проникать через эти барьеры.

Результаты проведенного электронно-микроскопического анализа подтверждают высказанные ранее предположения о проявлении бактериальными клетками свойств, присущих многоклеточным организмам [Иерусалимский, 1963; Shapiro, 1985]. Актуальность применения системного подхода для понимания механизмов, обеспечивающих существование микробных сообществ в виде целостных структур подтверждена данными по исследованию выживаемости микроорганизмов, входящих в состав биопленок при действии антимикробных препаратов [Costerton, 1987; Gilbert et al., 1990; Ketyi, 1991]. Повышение устойчивости бактерий, входящих в состав микробных сообществ, развивающихся в виде биологических пленок в макроорганизме или на поверхности каких-либо субстратов, можно

объяснить особой организацией микробных сообществ, дополнительные структуры которых в виде поверхностной пленки препятствуют проникновению антимикробных препаратов.

Таким образом, выявленные нами ультраструктурные особенности микробных сообществ, развивающихся как в жидких, так и на плотных питательных средах, указывают на наличие общих закономерностей в их развитии. Структура популяции, проявляющаяся в изменении соотношения морфологических типов клеток, свидетельствует об особенностях ее поведения, отражая основные свойства и тенденции развития микробных сообществ.

Биодеструкция материалов

Биодеструкция минералов и трансформация почвы

Исследование гранитного щебня при длительном выращивании на нем растений в регулируемых агроэкосистемах (РАЭС) выявило интенсивное воздействие биоты на корнеобитаемые системы (КС), что выразилось в образовании глубоких трещин и привело к биодеструкции минералов. При этом, в первую очередь, выкрашивались минералы, включающие элементы сравнительно легко доступные для живых организмов - триоктаэдрические слюды. В зависимости от особенностей химического состава и кристаллического строения характер изменения минералов был различен. Кварц и полевые шпаты измельчались сильнее слюд, но слюды подвергались более глубоким химическим изменениям. Это выразилось у слюд в осветлении окраски (потеря железа), расщеплении и закручивании краев (потеря калия из межслоев), появлении следов травления и коррозии на поверхности зерен. Главным местом атаки живых организмов и их метаболитов в щебне являлись участки контакта зерен и дефекты строения (трещины, царапины). Аналогичные наблюдения были сделаны для природных почв [Ермаков, Шумейко, 1979; Орлов, 1985]. Через 7 лет непрерывного культивирования растений при регулируемом поступлении тепла, света, влаги и минеральных элементов первоначально абиогенная порода - гранитный щебень трансформируется в биокосное вещество сходное с почвой. В породе формируется сообщество живых организмов (агробиоценоз), включающее, кроме культивируемого высшего растения, сложное сообщество микроорганизмов: прокариотических (бактерии) и эукариотических (грибы, водоросли, а также простейшие и нематоды). В результате жизнедеятельности этого сообщества в КС образуется сложное по составу органическое вещество, включающее смесь корневых выделений и опада растений, метаболиты и продукты распада микроорганизмов, а также гумусоподобные образования, в том числе слабо сформированные гуминовые кислоты, сходные с природными. Формирование агробиоценоза и органического вещества КС является взаимосвязанным и взаимообусловленным процессом. Сообщество живых организмов посредством метаболитов и продуктов их деструкции воздействует на

минералы КС с целью извлечения недостающих минеральных элементов. Результатом этого воздействия является дезинтеграция гранитного щебня и изменение составляющих его минералов. Как и в почвах, атаке живых организмов подвергаются минералы, содержащие наиболее легко усваиваемые микроорганизмами элементы.

Таким образом, биодеградация гранитного щебня при длительном выращивании на нем растений в РАЭС сходна с почвообразованием, так как включает два наиболее важных процесса, формирующих природное, но индуцированное антропогенным способом преобразование почвы: гумусонакопление и внутрипочвенное выветривание минералов. Биодеструкция мрамора

Электронно-микроскопическое исследование биодеструктивных изменений мрамора скульптурных памятников (ангелы из костела Св. Екатерины, барельефы Висячего сада Эрмитажа, античные скульптуры из коллекции Эрмитажа, античный мрамор из Херсонеса) показало, что начальным и решающим этапом биоповреждения является адгезия (адсорбция) микроорганизмов на повреждаемой поверхности. После прикрепления микроорганизмы воздействуют на поверхность минералов с помощью метаболитов (органических кислот и ферментов), поскольку биоповреждения в большей степени обнаруживаются непосредственно под прикрепившимися над ними клетками. В результате проведенных методами СЭМ исследований показана первоочередная необходимость тщательного изучения адгезии микроорганизмов на повреждаемых ими поверхностях. Установлено, что при работе с биоповреждениями основное внимание следует уделять изучению количества и природы адгезированных микроорганизмов. Полученные методом СЭМ данные об ультраструктуре мрамора позволяют глубже понять механизмы микробных биоповреждений. Сведения о доминирующих на разрушающихся поверхностях мрамора микроорганизмах приобретают особое значение при исследовании структуры ассоциаций микроорганизмов, формирующих биопленки, метаболические связи в которых играют определяющую роль в процессе биоповреждения.

На основании данных, полученных методом СЭМ, о влиянии биоцидов на способность микроорганизмов к адгезии, разработаны практические рекомендации по борьбе с биоповреждениями.

Структура микробных сообществ микроорганизмов-нефтедеструкторов

Необходимым условием успешного проведения биотехнологического этапа очистки (биоремедиации) воды и почвы от нефтезагрязнений является изучение состава их микрофлоры с целью выделения естественных ассоциаций микроорганизмов-алканотрофов, способных к эффективному разрушению нефтепродуктов. Наибольший интерес представляют полученные данные по исследованию структуры смешанного микробного сообщества, проявляющего максимальную нефтередуцирующую активность,

разрушая сырую нефть на 67-80%. Выявление методами электронной микроскопии характера взаимоотношений между клетками, степени их воздействия друг на друга, а также влияние факторов окружающей среды, в том числе самих нефтепродуктов, во многом определяет эффективность препаратов, используемых для биоремедиации. Биодеструкция кожи и пергамена

Микроорганизмы, участвующие в повреждении пергамена, повреждают также и кожу, при этом полной аналогии не наблюдается, так как существует определенные различия в составе этих субстратов. Однако при известной осторожности можно сделать некоторые обобщения. Биоповреждения пергамена и кожи имеют общий механизм -ферментативный гидролиз белковых компонентов субстрата. Химическая деструкция пергамена и кожи возможна под действием как специфических ферментов-коллагеназ, так и протеаз более широкого спектра действия. Последние гидролизуют не только глобулярные белки кожи и пергамена, но и денатурированный коллаген, содержание которого увеличивается в процессе старения при хранении рукописных книг. Бактериальные и грибковые ассоциации осуществляют деструкцию кожи и пергамена значительно быстрее, чем гомологичные монокультуры. Сканирование поверхности различных деструктурированных материалов показало, что в большинстве случаев причиной разрушения были микроорганизмы — бактерии и грибы (микромицета), причем последние преобладали в образцах из памятников культуры. Доминирование грибов среди биодеструкгоров памятников закономерно, так как грибы обладают морфо-физиологическими и генетическими особенностями, которые позволяют им выживать в экстремальных климатических условиях и развиваться на предметах внутри помещений — в музеях, библиотеках, архивах. Используя материалы памятника в качестве субстратов, грибы разрушают не только органические соединения (источник питания), но и камни, довольствуясь малым количеством органических веществ и влаги, которые накапливаются преимущественно на рельефных частях поверхностей в трещинах. В процессе жизнедеятельности микромицеты выделяют различные метаболиты, вызывающие разрушение памятников, проникают в толщу материала, увлажняют его и создают дополнительные условия для развития более влаголюбивых микроорганизмов бактерий и водорослей. Выделяемые грибами щавелевая, молочная и глюконовая кислоты, действуя как хелатирующие агенты, участвуют в деминерализации различных каменных субстратов, при этом в минералах происходит выщелачивание кальция, кремния, железа, магния и марганца [Griffin, Indictor, Koestler, 1991]. Особенно активно грибы повреждают памятники из пористых пород — мрамора, известняка, доломита. Они способны также разрушить плотные породы камня, например, гранит.

Рост различных видов микроорганизмов на памятниках из камня приводит к эрозии породы, а также нарушает эстетическую ценность памятника. Архитектурные сооружения и скульптуры покрываются разноцветными бактериальными пленками, зеленой порослью водорослей, черными корками грибов. После очистки на памятниках остаются пятна, включающие выделенный микроорганизмами пигмент, при этом поверхность очищенного участка выглядит деформированной: шелушение, осыпание, источенность, отслоение чешуек. Метод СЭМ дает возможность определить степень деструкции материала памятника на ультраструктурном уровне и на любой стадии повреждения, включая самые ранние. Мы полагаем, что именно СЭМ является наиболее точным и информативным методом определения деструктивных изменений. Этот метод также может быть использован для определения эффективности реставрационных работ с целью оптимизации процесса консервации памятников культуры.

ВЫВОДЫ

1.Разработан электронно-микроскопический метод позитивного окрашивания, позволяющий выявлять морфо-физиологическую гетерогенность микробных сообществ по интенсивности электронной плотности цитоплазмы бактерий. Во всех исследованных в работе бактериальных популяциях, независимо от их таксономического положения, обнаружены электронно-прозрачные - физиологически активные клетки и электронно-плотные клетки, с меньшими размерами и пониженной метаболической активностью-покоящиеся формы. Образование электронно-плотных клеток является динамичным универсальным явлением для про- и эукариотических микро- и макроорганизмов.

2. Комплексные исследования микробных сообществ в жидких средах (электронная микроскопия, ИК-, УФ-спектроскопия, ориентационная кондуктометрия) выявили генерализованные конформационные изменения биополимеров внеклеточной среды. При оптимальных для жизнедеятельности условиях (температура, фаза развития и др.) на клеточном уровне зарегистрировано уменьшение электронной плотности цитоплазмы бактерий, увеличение их размеров и дезагрегация клеточных ассоциатов, отражающая качественные изменения характера межклеточных взаимодействий. Согласованность молекулярных и надмолекулярных процессов свидетельствует об изменении состояния бактериальной популяции как целостной системы на разных уровнях ее организации.

3. Разные типы микробных сообществ (классические колонии, колониеподобные сообщества, биопленки) всех исследованных в работе видов микроорганизмов на плотных питательных средах, имеют общую схему строения и представлены сложными кооперативными системами, что проявляется в наличии между клетками в микробных сообществах двух типов контактов: первый — плотное слипание клеточных стенок у

грамотрицательных и у грамположительных бактерий; второй -цитоплазматические выросты, отмеченные только у грамотрицательных микроорганизмов.

4. Все исследованные в работе типы микробных сообществ на плотных питательных средах со стороны воздуха окружены поверхностной пленкой, выполняющей защитную функцию. Основным элементом поверхностной пленки является трехслойная мембрана, ультратонкое строение которой соответствует всем биологическим мембранам. Размеры трехслойной мембраны соответствуют величине поверхностной пленки. С внутренней, внешней или с обеих сторон трехслойной мембраны выявлены аморфные полисахаридные слои.

5. Пленка на поверхности микробных сообществ образуется в результате слияния мембранных везикул, экскретируемых бактериальными клетками во внеклеточное пространство. Везикулы, отделяясь от клеточной стенки бактерий, диффундируют через межклеточный матрикс, всплывают на поверхности микробного сообщества и, сливаясь друг с другом, формируют поверхностную пленку. Фрагменты трехслойной мембраны, окружающие везикулы, соединяясь между собой, образуют основу поверхностной пленки - трехслойную мембрану; внутреннее содержимое везикул откладывается в виде аморфных полисахаридных слоев.

6. Участие мембранных везикул в формировании пленки на поверхности разных типов микробных сообществ (колонии, биопленки, колониеподобные сообщества, смешанные сообщества), оказалось общим свойством для всех грамотрицательных и грамположительных бактерий.

7. На поздних стадиях развития на плотных питательных средах внутри однородных микробных сообществ обнаружены внеклеточные мембранные структуры, отграничивающие зоны, включающие различные морфологические типы клеток (физиологически активные, покоящиеся, деструкгурированные и автолизированные). В смешанных микробных сообществах на плотных питательных средах внеклеточные мембранные структуры, отделяющие бактерии разных видов, появляются на более ранних стадиях развития.

8. Смешанные микробные сообщества, выращенные на плотных питательных средах, отделены от окружающей среды со стороны воздуха единой для разных видов и штаммов бактерий поверхностной пленкой, внутри которой выявлена общая для всех микроорганизмов трехслойная мембрана.

9. Смешанные микробные сообщества, развивающиеся в жидких питательных средах, окружены многослойными внеклеточными мембраноподобными структурами. Существование контактов по типу «плотное слипание» в смешанных сообществах указывает на наличие неизвестных ранее способов взаимодействия между не родственными бактериями.

10. Оценка и регуляция морфо-физиологической структуры микробных сообществ с помощью созданной оригинальной методики позволи перейти на качественно новый уровень проведения биотехнологических процессов в промышленных и природных экосистемах.

11. Созданный оригинальный комплекс электронно-микроскопических методов апробирован и эффективно применяется для:

— дифференцирования степени антагонистической активности между прокариотическими, а также прокариотическими и эукариотическими микроорганизмами при подборе штаммов в процессе биотехнологического производства препаратов-пробиотиков;

— оценки биодеградации гранитного щебня в условиях регулируемой агроэкосистемы при длительном выращивании растений, приводящем к почвообразованию, включающему гумусообразование и внутрипочвенное выветривание минералов;

— анализа в составе почвенной микрофлоры ассоциаций бактерий-нефтедеструкторов и определения их структуры с целью оптимизации биотехнологического этапа очистки воды и почвы от нефтезагрязнений;

— тестирования биодеструктивных процессов различных субстратов (минералы, бумага, кость, кожа, пергамен) и оценки степени эффективности защитных мероприятий (покрытие защитными пленками, обработка биоцидами).

Список основных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Мамкаева К.А., Рыбальченко О.В. Особенности ультраструктуры Bdellovibrio chlorellavorus // Микробиология. 1979. Т. XIVIII. № 1. С. 159161.

2. Шалаева О.Н., Андреев O.A., Рыбальченко О.В., Томилин Н.В. Свойства плазмид термофильных бактерий // Тез. докл. Всесоюзн. конф. «Метаболические плазмиды бактерий». Таллин, 1982. С. 21-22.

3. Климов H.A., Батарин В.И., Рыбальченко О.В., Андреев O.A. Особенности регуляции биосинтеза экстраклеточной термостабильной протеазы // Тез. докл. Всесоюзн. конф «Термостабильные организмы в природе и практике народного хозяйства». Москва, 1983. С. 92.

4. Андреев O.A., Рыбальченко О.В., Шадаева О.Н., Исакова Н.П., Кабоев O.K., Томилин Н.В. Характеристика термофильных бактерий, выделенных из горячих источников Камчатки // Микробиология. 1983. Т. 52. Вып. 3. С. 496-504.

5. Тец В.В., Рыбальченко О.В., Кафтырева JI.A. Роль RecA-белка в изменении морфологии, антигенной структуры и вирулентности патогенных эшерихий // Сб. Острые кишечные инфекции. J1., 1986. № 10. С. 85-90.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

С.Петербург

09 300 акт [

6. Рыбальченко О.В., Чайка Н.А. Электронно-микроскопическое изучение возбудителей кампилобактериоза // Сб. Острые кишечные инфекции. Л.,

1986. №10. С. 178-184.

7. Рыбальченко О.В., Тец В.В. Значение активности Rec-A гена в изменении ультраструктуры Escherichia coli // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1987. №2. С. 11-14.

8. Чайка Н.А., Рыбальченко О.В., Сафонова Н.В. Кокковидная форма возбудителей кампилобактериоза // Сб. Острые кишечные инфекции. Л.,

1987. №11. С. 57-63.

9. Сафонова Н В., Чайка Н.А., Рыбальченко О.В. Лабораторная диагностика кампилобактериоза // проспект на ВДНХ: Л., 1987. брошюра 28 с.

Ю.Чайка Н.А., Блэйзер М.Дж., Бутцлер Ж.П., Бейер Т.В., Масловская Г.Я., Рыбальченко О.В., Сафонова Н.В., Стрелкова М.Р., Хазенсон Л.Б., Гуссенс Г., Ванг В. Кампилобактериоз. М.: Медицина, 1988. 351 с.

П.Амосов Ф.Г., Андреев О.А., Рыбальченко О.В. Влияние полиаминов на термоустойчивость клеток Escherichia coli М-17 при тепловом шоке // Микробиология. 1988. Т. 57. Вып. 3. С. 499-502.

12.Тец В.В., Норман Л.Л., Рыбальченко О.В., Шафхид М.Г. Условия существования патогенных энтеробактерий и изменения их биологической активности // Сб. Острые кишечные инфекции. Л., 1988. № 12. С. 59-66.

13.Климов Н.А., Батарин В.И., Рыбальченко О.В., Андреев О.А. Образование внеклеточной протеазы клетками термофильных бактерий // Микробиология. 1988. Т. 57. Вып. 4. С. 579-585.

14.Амосов Ф.Г., Рыбальченко О.В. Влияние полиаминов на морфологию и жизнеспособность клеток микроорганизмов // Сб. Передовой и производственный опыт в медицинской промышленности, рекомендуемый для внедрения. М.: ВНИИСЭНТИ, 1989. Вып. 4. С. 32.

15.Рыбальченко О.В., Савкова Г.А. Электронно-микроскопическое изучение микробных популяций грамотрицательных бактерий, развивающихся на плотных и жидких питательных средах // Сб. Передовой и производственный опыт в медицинской промышленности, рекомендуемый для внедрения. М.: ВНИИСЭНТИ, 1989. Вып. 4. С. 32-34.

16.Ровнов Н.В., Петров Л.Н., Рыбальченко О.В., Сорвин С.В. Активная роль межклеточной среды в регуляции метаболизма бактериальных популяций // Тез. докл. Всесоюзн. Научн. Конф. «Регуляция микробного метаболизма». Пущино на Оке, 1989. С. 152.

17.Ровнов Н.В., Сорвин С.В., Петров Л.Н., Рыбальченко О.В., Добролеж О.В. Экстраклеточная белковая система и регуляция состояния бактериальных популяций // Тез. докл. Всесоюзн. Научн. Конф. «Лимитирование и ингибирование микроорганизмов», Пущино на Оке, 1989. С. 141.

18.Шамов С.А., Рыбальченко О.В., Андреев О.А., Пасечник В.А. Каталазная активность и морфология клеток Escherichia coli Ml 7, устойчивых к

бензилвиологену // Сб. Ферменты микроорганизмов от журн. Биотехнология, (под ред. Дебабова В.Г.). М.: ВНИИСЭНТИ (Генетика),

1989. С. 11-21.

19.Тец В.В., Рыбальченко О.В., Савкова Г.А. Кооперация и специализация клеток в микробных колониях // Сб. Острые кишечные инфекции. Л.,

1990. №13. С. 54-62.

20.Tetz V.V., Rybalchenko O.V., Savkova G.A. infrastructure features of microbial colony organisation // J. Basic Microbiol. 1990. V. 8. № 8. P. 597Ровнов H.B„ Сорвин C.B., Рыбальченко O.B., Петров JI.H., Добролеж О.В., Лисицкая Т.Б. Регуляция функционального состояния бактериальных популяций и внеклеточная среда // Сб. Передовой и производственный опыт в медицинской и микробиологической промышленности, рекомендуемый для внедрения. М.: ВНИИСЭНТИ, 1990. Вып. 2. С. 23.

22. Лисицкая Т.Б., Сухаревич В.И., Медведева Н.Г., Петров Л.Н., Рыбальченко О.В., Ровнов Н.В., Сорвин С.В. Действие синтетических углеводов на клетки Brevibacterium flavum Е-531 — продуцент лизина // Сб. Передовой и производственный опыт в медицинской и микробиологической промышленности, рекомендуемый для внедрения. М.: ВНИИСЭНТИ, 1990. Вып. 2. С. 17.

23.Рыбальченко О.В., Савкова Г.А,, Лисицкая В.И. Электронно-микроскопическое изучение взаимодействия клеток в микробных колониях // Сб. Передовой и производственный опыт в медицинской и микробиологической промышленноста, рекомендуемый для внедрения. М.: ВНИИСЭНТИ, 1990. Вып. 2. С. 15.

24.Сорвин С.В., Ровнов Н.В., Рыбальченко О.В., Петров Л.Н., Маслова М.Н. Теоретические, экспериментальные и практические аспекты регуляции популяций прокариотических организмов // Тез. Всесоюзн. Конф. «Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии». Махачкала, 1990. Ч. 1. С. 161-162.

25.Трусов А.А., Какорин С.А., Рыбальченко О.В., Сорвин С.В., Ровнов Н.В. Структура и организация бактериальных популяций по данным кондуктометрических, электронно-микроскопических и спектральных методов // Тез. докл. 1-й Всесоюзн. Научн. Конф. «Теория и практика электронно-оптического исследования коллоидных систем». Оболенск, 1990. С. 22.

26.Алексин Л.М., Рыбальченко О.В. Контроль вирусного загрязнения сточных вод методом фагомониторинга // Тез. докл. Всесоюзн. Научно-Технич. Конф. «Охрана окружающей среды на предприятиях Минмедпрома СССР». Ташкент, 1990. С. 174-175.

27.Алексин Л.М., Дятлов Ф.Г., Рыбальченко О.В. Экологические аспекты фагомониторинга сточных вод // Тез. докл. Всесоюзн. Научно-Технич.

Конф. «Охрана окружающей среды на предприятиях Минмедпрома СССР». Ташкент, 1990. С. 141.

28.Tetz V.V., Rybalchenko O.V., Savkova G.A. infrastructure of Bacterial Colonies // Abstr. ASM Intern. Conf. «Multicellular behavior of bacteria in nature, industry and the laboratory». Woods Hole, Massachusetts, 1990. P. 22.

29.Alexin L.M., Rybalchenko O.V., Sorvin S.V. Veterinary preparation of polyvalent Salmonella bacteriophage // Abstr. Intern. Conf. «Medical Biotechnol. Immunization and AIDS». -1991. - P.7-11.

30.Тец B.B., Рыбальченко O.B., Савкова Г.А. Контакты между клетками в микробных колониях // Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1991. № 2. С. 7-13.

31.Петров Л.Н., Ровнов Н.В., Сорвин С.В., Рыбальченко О.В., Черняков Г.М., Какорин С.А. Исследование молокулярных процессов, лежащих в основе формирования бактериальных популяций // Тез. докл. Всесоюзн. Конф. «Биотехнология и биофизика микробных популяций». Алма-Ата, 1991. С. 69.

32.Жуковский А.П., Ровнов Н.В., Сорвин С.В., Рыбальченко О.В., Петров JI.H., Вукс Е.М. Температурное изменение состояния внеклеточной среды бактериальной суспензии // Биофизика. 1991. Т. 36. Вып. 1. С. 303-307.

33.Какорин С.А., Ровнов Н.В., Рыбальченко О.В., Сорвин С.В., Трусов А А. Структуры бактериальной суспензии Escherichia coli // Биофизика. 1991. Т. 36. Вып. 6. С. 1043-1047.

34.Рыбальченко О.В., Данилова О.П. Электронно-микроскопическое изучение дрожжевых и мицелиальных клеток Candida albicaus и С. tropicalis, полученных in vivo и in vitro // Тез. докл. II Междунар. Микологич. Симп. «Микозы и иммунодефициты». Ленинград, 1991. С. 41.

35.Kakorm S.A., Rovnov N.V., Rybalchenko O.V., Sorvin S.V., Trusov A.A. Temperature influence on structure of Escherichia coli, quartz and palygorskite suspensions studied by means of conductometric, electron microscope's and spectral methods // Abstr. 10th Intern. Confer. «Surface forces». Moscow, 1992. P. 94.

36.Сорвин C.B., Ровнов H.B., Рыбальченко O.B., Петров JI.H., Черняков Г.М. Сенсорная рецепция и регуляция бактериальных популяций // Тез. докл. Всесоюзн. Конф. «Сенсорные системы». Москва, 1992. С. 141.

37.Tetz V.V., Rybalchenko O.V., Savkova G.A. Morphophysiologic characteristics of Escherichia coli and Shigella flexneri 2 a carryng the htpR 15 gene // J. Basic Microbiol. 1993. V. 33. № 2. P. 131-139.

38.Tetz V.V., Rybalchenko O.V., Savkova G.A. Ultrustucture of the surface film of bacterial colonies//J. General Microbiol. 1993. V. 139. P. 855-858.

39.Tetz V.V., Rybalchenko O.V., Savkova G.A. Surface film of Escherichia coli colony // FEMS Microbiology Letters. 1993. V. 107. P. 231-240.

40.Данилова О.П., Кубась В.Г., Рыбальченко O.B. Сравнительное изучение поверхностных АГ 2-х фаз роста Candida tropicalis // Сб. Актуальные

проблемы инфекционных паталогий. СПб.: НИИЭМ им. Пастера, 1993. С. 78.

41.Сорвин С.В., Ровнов Н.В., Рыбальченко О.В., Черняков Г.М. Исследование организации, поведения и регуляции бактериальных популяций в водных средах // Тез. докл. Междунар. Конф. «Загрязнение окружающей среды, проблемы токсикологии и эпидемиологии». Пермь, 1993. С. 21-22.

42.Tetz V.V., Rybalchenko O.V. Electron microscopic study of the ultrastructure of bacterial colony-like communities // Proc. Intern. 6th Beijing Confer, and Exhib. «Instrum. Analysis». Beijing, 1995. P. 9-10.

43.Кубась В.Г., Данилова О.П., Рыбальченко O.B., Никифоров Н.А. Сравнительная характеристика двух фаз Candida albicans // Сб. Междунар. Симпоз., посвящ. году Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». СПб.: НИИ им. Пастера, 1995. С. 110.

44.Кубась В.Г., Данилова О.П., Рыбальченко О.В. Морфологические и антигенные изменения грибов p. Candida в процессе трансформации // Матер. III Междунар. Симп. «Патогенез, диагностика и терапия микозов и микогенной аллергии». СПб, 1995. С. 73.

45.Яковлева Е.П., Медведева Н.Г., Сухаревич М.Э., Рыбальченко О.В., Гоголушко Н.Б. Действие имбрицина на целлюлозо-разрушающие грибы // Микология и фитопатология. 1995. Т. 29. № 6. С. 17-21.

46.Krumbein W., Bogomolova Е., Gorbushina A., Panina L., Rybalchenko О., Ryshov S., Sagulenko E., Vlasov D. Biodeterioration and conservation status of marbl monuments on Crimea // Proc. Fourth Intern. Confer, on structural studies of historical buildings STREMA'95. «Structural Studies of Historical Buildings». V. 1. P. 195-203.

47.Сорвин C.B., Ровнов H.B., Рыбальченко О.В. Регуляция микробных популяций в водных системах // Матер. 4-ой Междунар. Конф. «СПИД, рак и родственные проблемы». СПб., 1996. С. 106.

48.Сухаревич М.Э., Медведева Н.Г., Борисова О.Г., Рыбальченко О.В. Влияние аэрации и редокс-потенциала среды на биосинтез антибиотика имбрицина // Матер. 4-ой Междунар. Конф. «СПИД, рак и родственные проблемы». СПб., 1996. С.104.

49.Медведева Н.Г., Гоголушко Н.Б., Сухаревич М.Э., Рыбальченко О.В., Яковлева Е.П. Влияние имбрицина на рост и ультраструктуру клеточной поверхности микромицетов // Микология и фитопатология. 1996. Т. 30. № 1. С. 17-21.

50.Dobrussina S.A., Velikova T.D., Rybalchenko O.V. A study of biostability of parylene-coated paper//Restaurator. 1996. № 17. P. 75-85.

51.Добрусина С А., Рыбальченко O.B., Беликова Т.Д., Кочкин В.Ф. Исследование биостойкости бумаги с поликсилиленовым покрытием // Микология и фитопатология. 1996. Т. 30. Вып. 4. С. 87-95.

52.Tetz V.V., Rybalchenko O.V. Ultrastructure of colony-like communities of bacteria// APMIS. 1997. V. 105. P. 99-107.

53.Черепанова Н.П., Панина JI.K., Богомолова E.B., Рыбальченко О.В., Спицына Н.Г. Исследование характера взаимодействия грибов с новой аллотропной модификацией углерода — фуллеренами // Микология и фитопатология. 1997. Т. 34. № 4. С. 27-32.

54.Slavoshevskaya L., Smolyanitskaya О., Mozgovoy V., Petrova S., Rybalchenko О. Mycological investigation of deteriorated ancient Greece and Rome marble monuments from the collection of the Hermitage museum // Proc. Intern. 4th Symp. «Conservation of Monuments in the Mediterranean Basin». Rhodes, 1997. V. 4. P. 437-451.

55.Rybalchenko O.V. Electron microscopic method of the biofilms visualization // Proc. Intern. 7th Beijing Confer, and Exhib. «Instrum. Analysis». Beijing, 1997. P. 41.

56.Tetz V.V., Rybalchenko O.V. Electron microscopic study of the ultrastructure of mixed bacterial colony // Proc. Intern. 7th Beijing Confer, and Exhib. «Instrum. Analysis». Beijing, 1997. P. 114.

57.Рыбальченко O.B., Смоляницкая O.JL, Словашевская Л.В., Беликова Т.Д. Применение сканирующей электронной микроскопии для выявления биодеструктивных изменений памятников культуры // Матер. Междунар. Конф. «Консервация памятников культуры». СПб., 1997. С. 41.

58.Медведева Н.Г., Сухаревич В.И., Рыбальченко О.В. Влияние конденсата формальдегида на продуцент лимонной кислоты Aspergillus niger // Биотехнология. 1997. № 5. С. 28-32.

59.Нижарадзе Т.Н., Рыбальченко О.В., Руднева Е.Б., Томилин А.М. Универсальный метод геоэкологической экспертизы промышленных зон // Матер. Междунар. Симпоз. «Стратегия экологической безопасности Санкт-Петербурга с использованием опыта Нидерландов». СПб., 1997. С. 44.

60.Трещанина Н.В., Рыбальченко О.В., Сорвин С.В., Вербицкая Н.Б. Влияние нитратов и нитритов на морфологию энтеробактерий // Матер. 2-ой Междунар. Конф. «Охрана окружающей среды для населения и будущих поколений». Самара, 1997. С. 41-43.

61.Жуковский А.П., Рыбальченко О.В., Ровнов Н.В., Вахитов Т.Я. Влияние переменного магнитного поля на состояние и развитие б&ктериальной популяции // Тез. 1-го Междунар. Конгрес. «Слабые и сверхсильные поля и излучения в биологии и медицине». СПб., 1997. С. 106.

62.Рыбальченко О.В., Вербицкая Н.Б., Данилова О.П. Электронно-микроскопическое исследование симбиотических взаимоотношений дрожжей p. Candida и лактобацилл // Тез. 6-й Междунар. Конф. «СПИД, рак и родственные проблемы». СПб., 1998. С. 18.

63.Рыбальченко О.В., Ждан-Пугакина С.М. Гетерогенность микробных популяций при разных температурах и условиях выращивания // Матер.

Научн. Конф. «Современная микробиология, состояние, достижения, перспективы». СПб., 1998. С. 88.

64.Рыбальченко О.В., Вербицкая Н.Б. Электронно-микроскопическое исследование антагонизма энтеробактерий по отношению к лактобациллам // Матер. Научн. конф. «Современная микробиология, состояние, достижения, перспективы». СПб., 1998. С. 87.

65.Kliassanova Z.M., Khassanova L.A., Rybalchenko O.V., Zdan-Pushkina S.M., Verbitskaya N.B., Collery Ph., Choisy C., Etienne J.C. Cu2+ effect on morphological and ultrastructural changes of Escherichia coli cells // Proc. 5th Intern. Sympos. «Metal Ions in Biology and Medicine». Neucherberg/Munich, 1998. V. 5. P. 184-189.

66.Кхариф M., Зольникова H.B., Рыбальченко О.В., Яковлев В.И. Способ хранения микроорганизмов-биодеструктуров // Матер. Всерос. Конф. «Экологические проблемы биодеградации промышленн. строительных материалов и отходов производства». Пенза, 1998. С. 144.

67.Зольникова Н.В., Кхариф М., Рыбальченко О.В., Рощина Е.К., Яковлев

B.И. Интенсификация активности почвенных микроорганизм ов-нефтедеструкторов биоорганическим удобрением «Бамил» // Докл. Рос. Акад. Сельскохоз-х. наук. 1998. № 6. С. 22-25.

68.Смоляницкая O.JL, Мельникова Е., Словашевская JI.B., Петрова С., Мозговой В., Рыбальченко О.В., Геллер Н. Микромицеты поврежденных скульптур двух архитектурных памятников Санкт-Петербурга и новые защитные композиции для реставрации // Матер. Всерос. Конф. «Экологические проблемы биодеградации промышлен. строительных материалов и отходов производства». Пенза, 1998. С. 44.

69.Smolyanitskaya O.L., Mel'nikova Е., Slovashevskaya L.V., Petrova S., Mosgovoy V., Rybalchenko O.V., Geller N. Mycromycetes from the deteriorated marble monuments and the new protective compositions for the sculpture conservations // Proc. 6th Intern. Mycol. Congr. Israel, 1998. P. 41.

70.Ермаков Е.И., Зверева T.C., Рыбальченко O.B., Непримерова C.B. Изменение гранитного щебня при длительном выращивании растений в регулируемых условиях // Докл. Рос. Акад. Сельскохоз-х наук. 1998. № 4.

C. 20-22.

71.Рыбальченко О.В., Вербицкая Н.Б., Петров JI.H. Применение электронно-микроскопических методов исследования структуры микробных сообществ для конструирования препаратов-эубиотиков нового поколения // Матер. 7-ой Междунар. Конф. «СПИД, рак и родственные проблемы». СПб., 1999. С. 119. (Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. 1999. Т. 3. № 1. С. 119.)

72.Ермаков Е.И., Зверева Т.С., Рыбальченко О.В. Влияние биоты на процесс первичного почвообразования в регулируемой агроэкосистеме // Тез докл. III съезда «Докучаевского общества почвоведов». Суздаль, 2000. С. 238239.

»11 205%^

73.Рыбальченко О.В., Вербицкая Н.Б., Добролеж О.В., Петров JI.H. Электронно-микроскопическое исследование механизмов антагонистической активности различных препаратов-пробиотиков по отношению к Shigella flexneri 2а // Матер. 8-ой Междунар. Конф. «СПИД, рак и родственные проблемы». СПб., 2000. С. 34-35. (Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. 2000. Т. 4. № 1. С. 34-35.)

74.Ермаков Е.И., Зверева Т.С., Рыбальченко О.В., Непримерова С.В. Изменение гранитного щебня при многолетнем культивировании пшеницы и томата//Ж. Почвоведение. 2000. № 12. С. 1463-1471.

75.Никонов Б.А., Вербицкая Н.Б., Синева С.А., Антонов С.Ф., Кобатов А.И., Потокин И.Л., Рыбальченко О.В., Добролеж О.В., Андреева И.А., Воеводина И.Н. Совместимость хитозана с микрофлорой кишечника и культурами клеток // Матер. 6-й Междунар. Конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». Москва-Щелково, 2001. ВНИРО. С. 373-374.

76.Петров Л. Н., Молдавер Б. Л., Кобатов А. И., Добролеж О. В., Вербицкая Н. Б., Заручевская Н. В., Потокин И.Л., Ровнов Н.В., Рыбальченко О.В. Технология получения нового бактериального препарата «Витафлор в свечах» // Матер. Междунар. Научно-пракшч. Конф. «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования». Москва, 2002. С. 65.

12.05.03 г. Зак.бЗ-100 РТП ИК «Синтез» Московский пр., 26

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Рыбальченко, Оксана Владимировна

ВВЕДЕНИЕ стр. —

Глава 1. ОСНОВНЫЕ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ —

1.1. Роль электронной микроскопии в проведении морфо-физиологических исследований —

1.2. Объекты исследования —

1.3. Методы исследования —

1.3.1. Основные микробиологические методы —

1.3.2. Методы определения антагонистической активности —

1.3.3. Физические методы: —36 -УФ - и ИК- спектроскопия —36 -метод ориентационной кондуктометрии —

1.3.4. Электронно-микроскопические методы: —

- метод позитивного окрашивания —

- модифицированный метод позитивного окрашивания —

- метод ультратонких срезов —

- электронно-цитохимический метод выявления полисахаридов —

- сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) —

1.3.5. Методы исследования ультраструктурной организации микробных сообществ, выращенных на плотных питательных средах: —

- модифицированный метод СЭМ колоний —

- метод позитивного окрашивания отпечатков с колоний —

- модифицированный метод ультратонких срезов колоний —

1.3.6. Электронно-микроскопические методы исследования антагонистических взаимоотношений микроорганизмов, выращенных на плотных питательных средах —

1.3.7. Методы исследования биодеструктивных изменений различных материалов и памятников культуры: —

- оценка изменения структуры гранитного щебня —

- оценка биодеструктивных изменений мрамора —

-оценка действия биоцида —

-оценка биодеструкции нефтепродуктов —

-применение метода позитивного окрашивания для геоэкологической экспертизы —

- оценка биодеструктивных изменений памятников культуры (бумага, пергамен, кожа) —

1.3.8. Морфометрический метод —

1.3.9. Статистическая обработка результатов —

Глава 2. ГЕТЕРОГЕННОСТЬ МИКРОБНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ —

2.1. Обзор литературы —

- понятие «микробная популяция» —

- структура микробных популяций —

- микробная экология и гетерогенность микробных популяций —

- морфологическая гетерогенность микробных популяций —

- регуляторные системы бактериальных популяций — система глобальной регуляции —

2.2. Результаты исследований —

2.2.1. Основные морфологические типы клеток —

2.2.2. Морфологическая гетерогенность микробных популяций при различных воздействиях (повышенная температура, обезвоживание, кислотный и щелочной шоки) —

2.2.3. Морфологическая гетерогенность микробных популяций Escherichia coli В при разных условиях выращивания —

2.2.4. Морфологическая гетерогенность микробных популяций Brevibacterium flavum Е531 в процессе роста и биосинтеза лизина —

2.2.5. Морфологическая гетерогенность микробных популяций Campylobacter jejuni, Campylobacter coli и Helicobacter pylori —

Глава 3. УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ —121 3.1. Обзор литературы —

3.2. Результаты исследований —

3.2.1. Ультраструктура бактериальных колоний —

3.2.2. Ультраструктура бактериальных биопленок —

3.2.3. Ультраструктура колониеподобных сообществ —

3.2.4. Ультраструктура смешанных микробных сообществ —

Глава 4. ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКИХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ МЕЖДУ МИКРООРГАНИЗМАМИ —

4.1. Обзор литературы —

4.2. Результаты исследований —

4.2.1. Электронно-микроскопическое исследование антагонистических взаимоотношений прокариотических микроорганизмов (лактобацилл, патогенных и условно-патогенных бактерий) —

- антагонистическое воздействие лактобацилл на патогенные энтеробактерии Shigella flexneri 2а —

- антагонистическое воздействие лактобацилл на условно-патогенные грамположительные бактерии Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis —

- антагонистическое воздействие энтеробактерий на лактобациллы —

4.2.2. Электронно-микроскопическое исследование антагонистических взаимоотношений прокариотических (лактобацилл) и эукариотических (дрожжеподобные грибы Candida albicans) микроорганизмов —

- антагонистическое воздействие лактобацилл на клетки С. albicans —

- антагонистическое воздействие клеток С. albicans на клетки Lactobacillus acidophilus —

Глава 5. ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ НА РАЗЛИЧНЫХ СУБСТРАТАХ: ПОЧВА, МИНЕРАЛЫ, НЕФТЬ, БУМАГА, ПЕРГАМЕН, КОЖА —215 5.1. Обзор литературы —

5.1.1. Биодеструкция минералов и трансформация почвы —

5.1.2. Биодеструкция нефти и нефтепродуктов —

5.1.3. Биодеструкция бумаги —

5.1.4. Биодеструкция кожи и пергамена —230 5.2. Результаты исследований —

5.2.1. Биогенная трансформация почвы и минералов —

5.2.2. Биодеструкция мрамора —

5.2.3. Биодеструкция нефти —

5.2.4. Биодеструкция органических материалов in vivo (бумага, кожа, пергамен, кость) —265 ЗАКЛЮЧЕНИЕ —276 ВЫВОДЫ —295 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ —

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АВ — аморфное вещество

ВКТ — высушивание при критической точке

ВЦМ — внутрицитоплазматическая мембрана

ГНП — гладкая наружная поверхность

ДК — деструктурированные клетки

ДКС — деструктивные изменения клеточной стенки

ДЦ — деструктивные изменения цитоплазмы

Ж — жгутики

ЗБ — зоны Байера

KB — капсулоподобное вещество

КП — клеточная перегородка

КПП — колониальная поверхностная пленка

КПС - колоииеподобные сообщества

КС — клеточная стенка

КТ — «клеточные тени» — пустая клеточная стенка

М — мезосомальное образование

MB — мембранные везикулы

ММ — межклеточный матрикс

ММВ — мелкие мембранные везикулы

Н — нуклеоид

НБС — наружный белковый слой НГ — некристаллическая гранула НМ — наружная мембрана П — пили

ПГ — пептидогликановый слой ПМК — перемычка между клетками ПП — периплазматическое пространство ПС — плотное слипание Р — рибосомы

РЦ — разреженная цитоплазма

CMC - смешанные микробные сообщества

СЭМ — сканирующая электронная микроскопия

ТПП — тонкая поверхностная пленка

ТЭМ —трансмиссионная электронная микроскопия

УА — уранилацетат

УПП — утолщенная поверхностная пленка Ф — филаменты

ФВК — фосфорновольфрамовая кислота

Ц — цитоплазма

ЦМС — центральная мезосома

ЦМ — цитоплазматические мостики

ЦПМ — цитоплазматическая мембрана

ШВП — шероховатая внутренняя поверхность

ШНП — шероховатая наружная поверхность

ЭМ — элементарная мембрана

ЭПВ — электронно-плотное вещество

ЭПК — электронно-плотные клетки

1 — первый тип контактов - плотное слипание

2 — второй тип контактов - цитоплазматические мостики

Таксономические, физиологические, биохимические исследования некоторое время уводили микробиологов в сторону от основной цели их науки - от изучения поведения микроорганизмов в их естественных местах обитания»

Ганс III лег ель

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфо-физиологические аспекты взаимодействий микроорганизмов в микробных сообществах"

Актуальность исследования. Работа относится к новому научному направлению в области микробиологии - микробной экологии, предметом которого является выявление закономерностей взаимодействия микроорганизмов между собой и окружающей средой.

В настоящее время становится все более очевидным, что процессы, в которых участвуют микроорганизмы, как в природных, так и в лабораторных условиях, необходимо наблюдать на уровне популяций, представленных однородными и смешанными микробными сообществами [88,379].

В связи с необходимостью оценки состояния всех структурных компонентов микробиоценоза, подвергающихся изменению в процессе жизнедеятельности микроорганизмов, исследование структуры микробных сообществ, развивающихся на различных субстратах, является одной из основных и трудно решаемых проблем современной микробной экологии. Решение таких многоуровневых задач возможно только при применении комплексного, системного подхода, что, в свою очередь, требует создания новых методов исследования микроэкологических систем.

Вместе с тем, в настоящее время появились данные, свидетельствующие о существенных различиях в поведении и свойствах бактерий in vivo и in vitro, проявляющихся, например, в их повышенной устойчивости in vivo к антимикробным препаратам, химиопрепаратам, факторам иммунной защиты, а также экстремальным воздействиям окружающей среды [54, 354].

В связи с этим, внимание микробиологов в последнее время было обращено на создание новых методов, позволяющих осуществлять комплексные исследования бактерий in situ, т. е. непосредственно в естественных условиях обитания: природных экосистемах или микробных сообществах в тканях организма-хозяина, развивающихся в качестве нормальной микрофлоры, а также в ходе инфекционного процесса [199].

В основу предложенной автором концепции комплексного анализа структуры микробных сообществ различными электронно-микроскопическими методами положен принципиально новый аспект исследования функционирования микробных популяций, как целостных многоуровневых систем, предполагающих осуществление взаимодействий как между самими микроорганизмами, так и с окружающей средой на молекулярном, клеточном и популяционном уровнях [73].

Анализ собственных результатов и данных литературы позволил предположить, что только при совместном исследовании морфо-физиологических особенностей микроорганизмов, структуры их микробных сообществ, а также состояния субстратов^ на которых они развиваются, можно получить полную и углубленную информацию о функциональных характеристиках и механизмах взаимодействия объектов в микроэкосистемах.

Объективный характер электронно-микроскопических исследований таких систем подтверждается, с одной стороны, выявлением влияния микроорганизмов, вызывающих в процессе своей жизнедеятельности деструктивные изменения как в окружающей среде, так и в организме человека. С другой стороны, разработанные нами методы и приемы позволяют достаточно быстро оценить, дифференцировать и прогнозировать реакцию микробиологической составляющей исследуемого микробиоценоза, возникающую в результате воздействия на микроорганизмы физико-химических факторов окружающей среды, таких как температура, обезвоживание, кислотный, щелочной шок и т. д.

Таким образом, получение характеристики структуры микробных сообществ представляется весьма важным и необходимым этапом исследования в связи с высокой информативностью, позволяющей оценить не только общее состояние микробиоценоза, но и прогнозировать в данных конкретных условиях поведение отдельных групп микроорганизмов на основании определения их морфо-физиологических свойств.

Электронно-микроскопический анализ микроэкосистем in situ, в основе которого лежит комплексное системное исследование микробных сообществ, включает изучение проблемы на нескольких уровнях, таких как структура самих субстратов и структура развивающихся на них микробных сообществ.

В соответствии с поставленной целью возникла необходимость разработки нескольких аспектов: методического, морфо-физиологического и экологического. В связи с этим были поставлены следующие основные задачи:

Методический аспект

1. Разработать новые электронно-микроскопические методы, модификации методов и приемы для исследования структуры однородных и смешанных микробных сообществ in situ.

Морфо-физиологический аспект

1. Исследовать морфологические особенности бактериальных клеток различных видов микроорганизмов (представители родов Escherichia, Shigella, Salmonella, Bacillus, Lactobacillus, Brevibacterium, Staphylococcus, Campylobacter, Helicobacter и т. д.), в оптимальных условиях и выявить закономерности их изменений под влиянием экстремальных факторов • (повышенная температура, обезвоживание, низкие и высокие значения рН).

2. Выявить закономерности проявления морфо-физиологической гетерогенности при оптимальных условиях развития микробных популяций и на основе проведенного анализа установить динамику изменений грамотрицательных и грамположительных бактерий на разных этапах развития популяций при различных стандартизированных условиях и изменяющихся параметрах экстремальных воздействии,

4. Провести отработку эффективной методологии для оценки функционально-структурных изменений на основе комплексного исследования структуры микробных популяций различными физическими (ориентациониая кондуктометрия, УФ-, ИК-спектроскопия) и электронно-микроскопическими методами.

5. Исследовать морфологические особенности однородных микробных сообществ различного типа (колонии, биопленки, колониеподобные сообщества) и смешанных микробных сообществ, состоящих из нескольких различных видов микроорганизмов.

6. Разработать систему комплексной оценки значимости элементов кооперации и специализации бактериальных клеток в микробных ассоциациях, обеспечивающих функционирование микробных популяций как целостных многоуровневых систем, взаимодействие бактерий в которых осуществляется на молекулярном, клеточном и популяционном уровнях.

7. Определить морфологические признаки, объективно свидетельствующие о начальном и завершающем этапах проявлений антагонистических взаимоотношений между прокариотическими микроорганизмами (на примере лактобацилл, патогенных и условно-патогенных бактерий), а также между прокариотическими и эукариотическими микроорганизмами (на примере лактобацилл и дрожжеподобиых грибов) для осуществления оперативного отбора стандартных систем с заданным алгоритмом функционирования. Экологический аспект

2. Разработать электронно-микроскопические методы оценки защиты материалов при их биодеградации.

3. Создать на основе электронно-микроскопического анализа систему тестирования изменений при биодеструктивных процессах, используя морфологический мониторинг с целью осуществления объективного и стандартизированного контроля за нарушениями структуры микробиоценозов в природных экосистемах, а также в искусственно моделируемых биоценозах.

Научная новизна результатов. Впервые на основе комплексного сравнительного электронно-микроскопического анализа (просвечивающая, сканирующая электронная микроскопия) на клеточном и популяционпом уровнях разработана методология количественной и качественной характеристики разных видов микроорганизмов при оптимальных и экстремальных условиях развития и действии физико-химических факторов (повышенная температура, обезвоживание, низкие и высокие значения рН) на примере бактериальных монокультур и микробных ассоциаций.

Впервые на ультратонком уровне различными электронно-микроскопическими методами у широкого круга микроорганизмов выявлено особое морфо-физиологическое состояние бактериальных клеток — покоящиеся формы (электронно-плотные клетки). Показана универсальность данного явления для всех видов исследованных в работе микроорганизмов.

Впервые установлены закономерности в изменении структуры микробных популяций различных видов бактерий на разных этапах развития в жидких и на плотных питательных средах, проявляющиеся в изменении соотношения различных типов клеток: физиологически активных, покоящихся, автолизироваиных и инволюционных.

Произведен анализ ультратонкой организации колоний широкого круга микроорганизмов. Впервые показано, что колонии покрыты поверхностной пленкой, в основе которой находится трехслойная мембрана; колонии разделены на зоны, содержащие определенные морфологические типы клеток; между клетками в колониях выявлено два типа контактов: плотное слипание и цитоплазматические мостики, благодаря которым клетки образуют сложную трехмерную систему.

Впервые установлена специфичность ультраструктурных преобразований в бактериальных клетках при действии экстремальных факторов (тепловых воздействиях, обезвоживании, кислотном и щелочном шоках): характерные морфологические изменения на клеточном (некристаллические гранулы в цитоплазме при тепловых воздействиях) и популяционном (характерное соотношение морфологических типов клеток) уровнях.

Отмечена взаимосвязь между появлением специфических ультраструктурных изменений в клетках и свойствами их внеклеточной среды при тепловых воздействиях.

Впервые выявлено влияние htpR-гена системы теплового шока на проявление морфологических свойств клетками при тепловых воздействиях: морфологические изменения в клетках и колониях энтеробактерий, дефектных по htpR-гену системы теплового шока (некристаллические гранулы в цитоплазме бактерий, толстая поверхностная пленка на ранних стадиях развития колоний, филаментация клеток в результате нарушения процесса септообразования). Установлено, что грануляция цитоплазмы при сублетальном тепловом воздействии обусловлена изменением регуляции метаболизма htpR-геном.

Впервые определены индивидуальные особенности ультраструктурной организации различных типов однородных и смешанных микробных сообществ, развивающихся на плотных питательных средах (колонии, колониеподобпые сообщества, бактериальный газон): защитная поверхностная пленка, межклеточный матрикс, межклеточные контакты, зоны скопления клеток, принадлежащих к определенному морфологическому типу. Выявлены специфические изменения морфологической гетерогенности (соотношения различных морфологических типов клеток), отражающие сложные взаимоотношения микроорганизмов в микробных сообществах различного типа.

Впервые выявлены ультраструктурпые особенности строения смешанных микробных сообществ, свидетельствующие о проявлении антагонистических взаимоотношений между микроорганизмами. Показано, что межклеточные взаимодействия в микробных сообществах такого типа проявляются на молекулярном (действие бактериоцинов), клеточном (ультраструктурные изменения в клетках и клеточных органеллах) и популяционном (изменение структуры популяции) уровнях.

Впервые показаны биодеструктивные изменения минералов в процессе физического моделирования регулируемой агроэкосистемы корнеобитаемые среды - растения, свидетельствующие о непосредственном участии микробиоты в трансформации гранитного щебня в биокосное вещество сходное с почвой.

Впервые на основе электронно-микроскопического анализа структуры микробных сообществ и биодеструктивных изменений субстратов (почва, минералы, нефть, бумага, кожа, пергамен) разработаны методы экспресс-анализа для оценки и рекомендаций по охране состояния природных экосистем и культурных памятников.

Научно-практическое значение работы. Научно-практическая ценность полученных результатов заключается в раскрытии закономерностей изменения гетерогенной структуры микробных сообществ различного типа (однородные колонии, колониеподобные сообщества, смешанные бактериальные сообщества), а также сложных механизмов взаимодействия между микроорганизмами внутри этих сообществах и их воздействия на окружающую среду.

Полученные данные по морфологической гетерогенности микробных популяций различных типов, а также разработанные методы и приемы оценки морфо-физиологического состояния микроорганизмов, особенно выявление покоящихся форм клеток, перспективны для прогноза развития микробных сообществ на различных субстратах in vivo.

Данные по ультратонкому строению смешанных микробных сообществ, морфологические признаки, свидетельствующие о симбиотичсском или антагонистическом воздействии микроорганизмов друг на друга, могут быть полезны при создании лекарственных препаратов-пробиотиков и рекомендаций к использованию для биокоррекции при дисбактериозах.

На основе анализа структуры микробных сообществ и биодеструктивных изменений субстратов, осуществляемых микроорганизмами, проведена разработка теоретического и экспериментального обоснования целесообразности применения электронно-микроскопического исследования для прогнозирования интенсивности протекающих в различных микробиоценозах процессов.

Близкие характеристики основных параметров микробных сообществ различного типа, выявленные нами в процессе комплексного электронно-микроскопического исследования, позволяют рассматривать микробные сообщества как удобную модель для изучения различных аспектов взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой, в том числе и с организмом человека.

Результаты исследований включены в курс лекций и практических занятий «Микробиология, вирусология и иммунология» на медицинском факультете, в курс лекций «Медицинская микробиология» на биолого-почвенном факультете Санкт-Петербургского государственного университета, отдельные разработки используют в курсах по микробиологии Санкт-Петербургского технологического института, Санкт-Петербургского медицинского университета им. И. П. Павлова, а также Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования (МАПО).

Апробация работы. Основные результаты и положения работы обсуждались на 42 всесоюзных, всероссийских и международных конференциях и симпозиумах.

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 1 монографии и 41 печатной работе, опубликованных в отечественных изданиях и за рубежом.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены во введении, 5 главах, заключении и выводах. В первой главе представлены основные объекты и методы. В каждой следующей главе первый подраздел посвящен обзору литературы по проблемам, анализируемым в данной главе. В следующих подразделах изложены результаты исследований и заключительные замечания. Работа документирована 200 электронограммами и рисунками, 24 таблицами. Список литературы включает 427 ссылок. Общий объем диссертации - 337 с.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Рыбальченко, Оксана Владимировна

выводы

1. Разработан электронно-микроскопический метод позитивного окрашивания, позволивший по интенсивности электронной плотности цитоплазмы разделить бактериальные клетки всех исследованпных в работе видов микроорганизмов на: электронно-прозрачные - активно метаболизирующие физиологически активные и электронно-плотные, с меньшими линейными и объемными размерами и пониженной метаболической активностью — покоящиеся формы. Образование покоящихся клеток является универсальным явлением для про- и эукариотических организмов. Покоящиеся формы клеток обнаружены во всех исследованных нами бактериальных популяциях, независимо от их принадлежности к грамотрицательным, грамположительным, мезофильным или термофильным микроорганизмам.

2. Микробные сообщества всех исследованных в работе видов микроорганизмов, выращенные на плотных питательных средах (классические колонии, колониеподобные сообщества, биопленки и смешанные микробные сообщества), имеют единую схему строения и представлены сложными кооперативными системами, что проявляется в наличии между клетками в микробных сообществах двух типов контактов: плотное слипание клеточных стенок у грамотрицательных и у грамположительных бактерий и цитоплазматические выросты, встречающиеся только у грамотрицательных микроорганизмов. К структурам, подтверждающим существование специальных приспособлений, способствующих тесному взаимодействию клеток, относятся капсулоподобные оболочки у клеток, расположенных в строго определенных частях микробных сообществ.

3. Все микробные сообщества со стороны воздуха окружены поверхностной пленкой, выполняющей защитную функцию. Основным элементом поверхностной пленки является трехслойная мембрана, которая имеет ультратонкое строение, свойственное всем биологическим мембранам.

Длина трехслойной мембраны соответствует величине поверхностной пленки. Наряду с трехслойной мембраной, поверхностная пленка включает дополнительные структуры в виде аморфных полисахаридных слоев, образующиеся с внутренней, внешней или с обеих ее сторон.

4. Пленка на поверхности микробных сообществ образуется в результате слияния мембранных везикул, экскретируемых бактериальными клетками. Везикулы, отделяясь от бактериальной клеточной стенки, диффундируют через межклеточный матрикс, всплывают на поверхности микробного сообщества и, сливаясь друг с другом, формируют поверхностную пленку. Фрагменты трехслойной мембраны, окружающие везикулы, соединяясь между собой, формируют основу поверхностной пленки — трехслойную мембрану; внутреннее содержимое везикул образует прилегающие к ней аморфные полисахаридные слои.

5. Различными электронно-микроскопическими методами выявлены многочисленные полиморфные мембранные везикулы в микробных сообществах всех исследованных нами видов грамотрицательных и грамположительных бактерий. Участие мембранных везикул в формировании поверхностной пленки оказалось общим свойством для всех грамотрицательных и грамположительных бактерий.

6. Внутри однородных микробных сообществ на поздних сроках развития (стадия отмирания) обнаружены внеклеточные мембранные структуры, отграничивающие зоны, включающие различные морфологические типы клеток (физиологически активные, покоящиеся, деструктурированные и лизированные).

7. Смешанные микробные сообщества, выращенные на плотных питательных средах, отделены от окружающей среды со стороны воздуха единой для различных видов и штаммов бактерий поверхностной пленкой, внутри которой выявлена общая для всех микроорганизмов трехслойная мембрана. Смешанные микробные сообщества, развивающиеся в жидкой питательной среде, окружены многослойными внеклеточными мембраноподобными структурами. Существование контактов по типу «плотное слипание» в смешанных сообществах указывает на наличие неизвестных ранее способов взаимодействия между не родственными бактериями.

8. На основе разработанного комплексного электронно-микроскопического исследования проведен анализ морфо-физиологических параметров смешанных микробных сообществ с антагонистическим типом взаимоотношений, что позволило дифференцировать степень антагонистической активности ряда прокариотических и эукариотических микроорганизмов. Полученные данные необходимо учитывать при подборе штаммов в процессе биотехнологического производства препаратов-пробиотиков.

9. Впервые разработанный электронно-микроскопический метод оценки биодеградации гранитного щебня в условиях регулируемой агроэкосистемы (РАЭС) показал, что длительное выращивание на нем растений приводит к почвообразованию, т.к. сопровождается гумусообразованием и внутрипочвенным выветриванием минералов.

10. Разработанный электронно-микроскопический метод определения в составе почвенной микрофлоры ассоциаций бактерий-нефтедеструкторов впервые использовался для оптимизации биотехнологического этапа очистки воды и почвы от нефтезагрязнений.

11. Впервые на основе разработанных электронно-микроскопических методов создана система тестирования биодеструктивных процессов различных материалов (минералы, бумага, кость, кожа, пергамен), позволяющая оценить степень эффективности защитных мероприятий (покрытие защитными пленками, обработка биоцидами).

Благодарности

Особую признательность хотелось бы выразить своему учителю член-корреспонденту РАН, доктору биологических наук, профессору Б.В. Громову, идеи которого еще со студенческих лет определили мой интерес к электронной микроскопии и разрабатываемой в настоящей работе проблеме.

Выражаю благодарность всем соавторам и сотрудникам ГНЦ Гос. НИИОЧБ за участие в совместной работе, понимание и поддержку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данное исследование включает электронно-микроскопический анализ микроэкосистем с целью выявления морфологических особенностей и механизмов взаимодействия различных микроорганизмов в микробных сообществах между собой и окружающей средой на молекулярном, клеточном и популяционном уровнях. По современным понятиям микробная популяция представляет собой сложную, гетерогенную систему, ответ которой на внешние воздействия зависит от реакции и поведения всех ее компонентов. Комплексное электронно-микроскопическое исследование включает анализ микробных сообществ на нескольких уровнях, в том числе и структуры субстрата, на котором развиваются микробные сообщества, с обязательным учетом воздействия на всю систему самых различных факторов окружающей среды. Именно поэтому, в первую очередь, необходимо было провести детальное исследование ультраструктурной организации интактных клеток различных видов микроорганизмов, отличающихся, с одной стороны, по принципу строения клеточной стенки;^ (грамотрицательные и грамположительные бактерии), с другой, по температурному оптимуму роста (мезофильные и термофильные бактерии). -В дальнейшем,^" возникла необходимость сравнительного изучения'^ морфологических особенностей представителей различных групп микроорганизмов до и после воздействия повышенной температуры, обезвоживания, низких и высоких значений рН с целью выявления специфических ультраструктурных изменений при действии указанных экстремальных факторов.

Результаты, полученные в ходе первого этапа электронно-микроскопического анализа, привели к необходимости исследования структуры популяции и выявлению морфологической гетерогенности микробных сообществ. В любой популяции наряду с бактериями, имеющими характерную для данного вида ультраструктурную организацию, можно обнаружить различные морфологические варианты, отличающиеся не только по строению, но и по физиологическим и генетическим свойствам [87]. Именно электронно-микроскопический анализ, проводимый с высокой степенью достоверности одновременно несколькими методами, дает возможность выявить в составе микробной популяции различные морфологические типы клеток, которые по-разному реагируют на изменение параметров выращивания и действие экстремальных факторов, что проявляется в различной степени выраженности ультраструктурных изменений. В связи с этим, при исследовании влияния различных факторов на бактериальные клетки, возникла необходимость анализа реакции на эти воздействия не только отдельных клеток, но и всей популяции в целом. Морфологическая гетерогенность микробных популяций

Электронно-микроскопический анализ всех исследованных в работе видов микроорганизмов, наряду с признаками, характерными для данного вида и рода, выявил большое разнообразие ультраструктурных особенностей у бактерий, свидетельствующее о гетерогенности микробных популяций. Подобные наблюдения поставили нас перед необходимостью исследования взаимосвязи между морфометрическими характеристиками бактерий и их физиологическими параметрами в процессе их развития.

Морфологические типы клеток '

Несколькими электронно-микроскопическими методами с использованием просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии проведен морфометрический анализ микробных популяций Е. coli Ml7, развивающихся при различных условиях. Для оценки степени гетерогенности микробной популяции Е. coli Ml7 применен модифицированный нами метод позитивного окрашивания 0,1%-ным водным раствором уранилацетата, что позволило использовать в качестве одного из критериев такой параметр, как интенсивность электронной плотности цитоплазмы бактериальных клеток. Применение подобного критерия дало возможность выделить в структуре микробных популяций два типа бактериальных клеток: электронно-прозрачные и электронно-плотные.

Данные по изменению размеров клеток, полученные методом позитивного окрашивания, подтвердили разделение популяции на две, резко различающиеся по размерам группы (подсчет размеров клеток проводили на анализаторе изображения IBAS - I (Германия) (табл. 2). Полученные результаты также были подтверждены методом ориентационной кондуктометрии (табл. 4). При использовании в качестве второго критерия ультраструктурного состояния клеточных органелл, выявленных методом ультратонких срезов, была получена комплексная характеристика микроорганизмов по морфо-физиологическим признакам. Подобный подход к оценке структурно-функционального состояния микробных популяций позволил выделить 5 основных морфологических типов клеток: морфологически интактные делящиеся и неделящиеся (электронно-прозрачные), покоящиеся (электронно-плотные), клетки с начальными деструктивными изменениями в цитоплазме и клеточной стенке (электронно-прозрачные), инволюционные (электронно-прозрачные), частично или полностью автолизированные. Покоящиеся клетки

Аналогичные морфологические формы клеток у Е. coli М17 на уровне световой микроскопии наблюдала группа авторов [1]. В работах Эль-Регистап с соавторами [60, 205, 206, 207, 208] методами световой микроскопии при изучении В. subtilis, В. cereus, Pseudomonas carboxydoflava и др. отмечено появление клеток, характеризующихся повышенной рефрактильностью. Подобные клетки были по объему на 20-40% меньше обычных бактерий и по данным авторов обладали пониженной метаболической активностью, т.е. находились в анабиотическом состоянии (покоящиеся формы). Поскольку функциональные особенности некоторых из перечисленных морфологических типов клеток (интактные, делящиеся, автолизированные) общеизвестны, то в обсуждении мы будем акцептировать внимание на значительно менее изученных вегетативных покоящихся (электронно-плотных) формах клеток.

Структурно-функциональные кластеры, объединяющие клетки с общими функциями, но разобщенные пространственно, наблюдали в своей работе Воскун С. Е. с соавторами [37]. Методами цейтраферной микрокиносъемки и электронной микроскопии (ультратонкие срезы) авторам удалось выделить в популяции два основных морфологических варианта. Первый представлен клетками очень крупными или средних размеров с гладкоконтурным профилем среза. Ко второму варианту отнесены бактерии, имеющие волнистые контуры и значительную толщину клеточной стенки. Методом электронно-микроскопической авторадиографии было показано, что отмеченные морфологические варианты отличаются функционально и репродуктивно. Клетки больших размеров со сглаженной поверхностью клеточной стенки характеризовались более активным метаболизмом Н3-треонина по сравнению с более мелкими клетками, у которых поверхность клеточной стенки была извилистой, при этом именно более крупные клетки давали основную часть потомства. Особый интерес вызвали у авторов клетки меньших размеров, имеющие волнистые контуры и утолщенную клеточную оболочку, которые условно были отнесены к покоящимся клеткам, поскольку скорость включения радиоактивной метки у них была заметно снижена, но не прекращена, что свидетельствовало об осуществлении ими метаболизма и сохранении жизнеспособности. Для интерпретирования своих данных автор привлек гипотезу клонально-функциональной дифференцировки, предложенную Бакулиной Н.А. [18].

Дополнительные основания для отнесения электронно-плотных клеток к покоящимся формам дают наши наблюдения за ними в процессе выращивания и действия экстремальных факторов. Так например, наличие электронно-плотных клеток в посевном материале, снижение или полное их исчезновение в логарифмической фазе роста, появление и возрастание их числа в стационарной фазе роста, присутствие в регидратировапных препаратах и хранящихся культурах, а также их появление при медленном понижении или повышении температуры инкубационной среды свидетельствуют в пользу высказанного выше предположения.

Морфологические признаки, свойственные покоящимся клеткам, обнаружены и у эукариотических организмов. В монографии О. И. Епифановой [66] приводится сравнительный анализ структурно-функциональных особенностей пролиферирующих и покоящихся клеток. На различных перевиваемых клеточных линиях показано, что клетки и их ядра уменьшаются в размерах при переходе культуры в стационарную фазу роста [178, 179, 425], при этом увеличивается плотность клеток [279]. В детальном электронно-микроскопическом исследовании Шеридана с соавторами [381], выполненом на культуре клеток меланомы человека, установлено, что уменьшение размеров ядер по достижении стационарной фазы роста происходит параллельно с уменьшением размеров клеток. Этот процесс сопровождается конденсацией митохондрий, вакуолизацией цитоплазмы и другими морфологическими изменениями. При действии стимуляторов клеточной пролиферации размеры покоящихся клеток вновь увеличиваются. Структура наружной мембраны покоящихся клеток претерпевает характерные изменения, приводящие к тому, что в целом она становится более стабильной по сравнению с мембраной пролиферирующих клеток. На поверхности покоящихся клеток увеличивается количество серосодержащих глюкозаминогликанов, способных аккумулировать ионы кальция, благодаря чему происходит фиксация белков плазматической мембраны [412]. Существенным образом изменяется при переходе клеток в состояние покоя метаболизм фосфолипидов. Установлено, что в состоянии покоя в клетках фибробластов кожи человека общее количество холестерина снижается.

В электронно-микроскопическом исследовании опухолевых клеток крови от лейкозных больных, нами также были выявлены два морфологических варианта клеток, характеризующихся указанными выше ультраструктурными особенностями [74].

Таким образом, сопоставление перечисленных выше данных литературы с полученными в настоящей работе наблюдениями позволяют считать, что образование покоящихся электронно-плотных клеток является универсальным явлением для про- и эукариотических организмов. Покоящиеся формы клеток обнаружены во всех исследованных нами бактериальных популяциях, независимо от их принадлежности к грамотрицательным, грамположительным, мезофильным или термофильным микроорганизмам.

Морфологический анализ микробных популяций в жидкой питательной среде

Исследованию морфологических свойств бактерий при изменениии фазы развития микробных популяций посвящено крайне незначительное число научных работ [20]. Морфологический анализ микробных популяций Е. coli М17 и В. flavum Е531, развивающихся в жидкой питательной среде, выявил большое разнообразие морфологических форм клеток, отличающихся по размерам, форме и ультраструктурной организации. Соотношение различных морфологических форм клеток менялось в зависимости от возраста микробной популяции и отражало физиологическое состояние клеток. Наиболее высокий уровень морфологической гетерогенность' отмечен в популяциях, используемых в качестве посевного материала, где, как правило, обнаруживались все пять морфологических типов клеток. Например, 70% посевного материала Е. coli Ml7 составляли инволюционные и частично автолизированные клетки, 24% - электронно-плотные клетки и только 6% клеток сохраняли интактную ультраструктуру. Соотношение морфологических типов клеток изменялось по мере развития микробной популяции: в начале логарифмической фазы роста доля морфологически интактных клеток увеличивалась до 93%, при этом доля всех остальных клеток уменьшалась до минимального уровня. Начало стационарной фазы роста характеризовалось уменьшеньшением доли морфологически интактных клеток до 85% с одновременным увеличением доли электронноплотных покоящихся форм, доля которых с 2% в начале логарифмической фазы роста возрастала до 10%. Частично деструктурированные и почти полностью автолизированные клетки составляли 4 и 1% соответственно. По мере старения популяции доля электронно-плотных клеток продолжала возрастать и в более позднем стационаре к концу 7-го ч выращивания составляла около 40%.

Морфологический анализ различных микробных сообществ на плотных питательных средах

В составе всех исследованных в настоящей работе микробных сообществ, развивающихся на плотных питательных средах, обнаружены неописанные ранее внеклеточные мембраны, фрагменты которых входят в состав мембранных везикул, выявленных не только у грамотрицательных, но и у грамположительных бактерий. Показано также, что мембрана является основным элементом поверхностной пленки, отграничивающей микробные сообщества от окружающей среды. Наряду с этим, фрагменты мембран достаточно большой величины обнаружены в глубине самих микробных сообществ, где они разъединяют участки, состоящие из интактных и деструктурированных клеток. Мембранные везикулы грамотрицательных бактерий давно привлекали внимание исследователей, данные о них суммированы в обзорах D. Mayrand, D. Grenier [336] и T.J. Beveridge [230]. Образование везикул отмечено у представителей различных родов: Escherichia, Vibrio, Bacteroides, Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas, Serratia, Veillonella [250, 253, 281, 296, 353, 421]. Подобные структуры наблюдали при выращивании бактерий в жидких питательных средах. Установлено, что их число изменялось в зависимости от условий выращивания, например, возрастало при неблагоприятных воздействиях [296]. Наличие везикул в различных сообществах грамотрицательных бактерий, выращенных на плотных питательных средах, впервые было показано в наших работах [398, 399, 400, 402]. Способность грамположительных бактерий образовывать мембранные везикулы оставалась до последнего времени неизвестной. Используя различные электронно-микроскопические методы, мы наблюдали многочисленные полиморфные мембранные везикулы в микробных сообществах всех исследованных нами видов грамположительных бактерий: Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus, Brevibacterium, Streptoccocus, Lactobacillus и т.д. [398, 399, 400, 401, 402]. Формирование мембранных везикул являлось общим свойством для грамотрицательных и для грамположительных бактерий. Происхождение мембранных везикул у грамотрицательных бактерий связывают с внешней мембраной их клеточной стенки [242, 271, 336, 418]. Была разработана схема процесса формирования подобных структур [427]. Предложенный авторами механизм их образования позволяет объяснить наличие в составе мембранных везикул фрагментов пептидогликана [296]. Отсутствие внешней мембраны в клеточной стенке грамположительных бактерий позволяет предположить, что единственным источником образования мембранных везикул у грамположительных бактерий может служить цитоплазматическая мембрана. Возможно, что и у грамотрицательных бактерий цитоплазматическая мембрана также принимает участие в формировании мембранных везикул. Образование везикул, по-видимому, происходит по принципу постепенной сборки компонентов, синтезируемых, и в дальнейшем экскретируемых из клетки в окружающую среду. Установлено, что в состав мембранных везикул включены белки (токсины и ферменты) полисахариды, а также липиды [59, 217, 233,249, 262, 276,322].

До сих пор до конца не выяснен вопрос о биологических функциях мембранных везикул. В работе Z. Li, A.J.Clarke и T.J. Beveridge [323] показана способность мембранных везикул, выделенных из клеток 15 штаммов грамотрицательных бактерий (Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Salmonella, Shigella), лизировать клетки различных грамотрицательных и грамположительных бактерий, включая представителей рода Mycobacterium. Электронно-микроскопическими методами показано разрушение клеточных стенок бактерий под действием пептидогликановых гидролаз, выделенных из мембранных везикул [295].

Согласно полученным нами данным, одной из функций мембранных везикул является транспорт веществ, необходимых для образования поверхностной пленки, при этом везикулы диффундируют через межклеточный матрикс, всплывают на поверхности микробного сообщества, и сливаясь друг с другом, формируют поверхностную пленку. Фрагменты трехслойной мембраны, входящие в состав везикул, соединяясь между собой, формируют основу поверхностной пленки, а внутреннее содержимое везикул образует прилегающие к ней слои аморфного вещества. Подобная транспортная функция хорошо известна для мембранных везикул внутри различных эукариотических клеток, некоторое сходство просматривается также и с процессом экзоцитоза в животных эукариотических клетках. Необходимо отметить, что существование внеклеточных мембранных везикул отмечено у эукариотических организмов только в костной ткани [214, 260]. Допустимо полагать, что появление мембранных везикул на поверхности пептидогликанового слоя клеточных стенок грамположительных бактерий привело в ходе эволюционного развития к образованию внешней мембраны клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Слияние на поверхности грамположительных бактерий фрагментов мембран, входящих в состав везикул, при определенных условиях могло привести к образованию дополнительного компонента клеточной стенки -внешней мембраны.

379]. Авторы предполагали, что полисахаридная пленка образуется в результате жизнедеятельности бактерий, а также при их частичном разрушении. Однако мембрана в составе этой пленки обнаружена не была. Очевидно, объектом наблюдения этих авторов были только аморфные слои поверхностной пленки. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что все исследованные микробные сообщества, выращенные на плотных питательных средах, окружены мембраной, которая имеет ультратонкое строение, свойственное всем бактериальным мембранам. Протяженность такой мембраны может соответствовать длине поверхности микробного сообщества. Особенно отчетливо это прослеживается в препаратах, полученных методом позитивного окрашивания пленок, предварительно снятых с поверхности микробных сообществ.

Наиболее важным следует признать факт наличия трехслойной мембраны в составе пленки, образованной на поверхности CMC. Возможно, пленки на них формируются также, как и в однородных микробных сообществах за счет слияния мембранных везикул, продуцируемых всеми, а может быть, только отдельными представителями CMC. Мембранные везикулы, диффундируя через матрикс, поднимаются к поверхности микробных сообществ и, сливаясь, образуют единую мембрану. В пользу указанного выше способа образования мембраны поверхностной пленки свидетельствует последовательность ее формирования, а также слияние мембранных везикул [398, 399, 400, 402].

Мембраны поверхностных пленок микробных сообществ образуются в результате слияния мембранных везикул, что позволяет высказать предположение о механизме доставки веществ, формирующих ее аморфные слои. Различными электронно-микроскопическими методами нами было показано, что наружный аморфный слой появляется после образования мембраны, при этом его толщина значительно увеличивается в процессе дальнейшего роста микробных сообществ. Однако нельзя исключать возможность образования мембраны поверхностной пленки из веществ секретируемых клетками, но не входящих в состав мембранных везикул. Использование для построения поверхностной пленки клеточного детрита не столь существенно, поскольку пленка на поверхности микробных сообществ формируется одновременно с увеличением числа жизнеспособных клеток, когда еще не отмечена гибель и деструкция бактерий.

Наибольший интерес представляет исследование биохимического состава и функциональных особенностей мембран, входящих в состав поверхностных пленок. Очевидно, как любая биологическая мембрана, она формирует границу между внешней и внутренней средой микробного сообщества. Возможно, бактерии, образовавшие сообщество, оказываются наиболее защищенными от воздействия различных факторов внешней среды, а также от влияния других микроорганизмов. В этой связи выявление механизмов транспорта веществ через мембрану в разных направлениях и защитного действия поверхностной пленки представляет особый интерес. Факт наличия мембран в составе микробных сообществ свидетельствует о их важной роли в организации и регуляции жизнедеятельности микроорганизмов.

Внеклеточные мембраны, отграничивающие зоны из физиологически активных и автолизированных" клеток внутри CMC, свидетельствуют о проявлении антагонистического воздействия микроорганизмов друг на друга . Возможно, при образовании подобных мембранных структур используются элементы погибших клеток. В этом процессе могут принимать участие физиологически активные клетки, одной из функций которых, возможно, является регуляция взаимоотношений с деструктурированными клетками, воспринимаемыми ими как компонент внешней среды или питательный субстрат.

Идентичные мембранные структуры в отдельных случаях можно обнаружить и в однородных микробных сообществах на более поздних сроках выращивания, когда ускоряется процесс отмирания и увеличивается число автолизированных клеток. В этих случаях зоны, включающие значительное число деструктурированных клеток, отделены от остальной части микробного сообщества многослойными мембранами и мощным слоем электронно-плотного аморфного вещества.

В целом, полученные данные свидетельствуют о существовании различных вариантов внеклеточных мембран, часть из которых не имеет известных аналогов. Исследование механизмов образования, состава и функций мембран, входящих в состав микробных сообществ, позволит в дальнейшем выявить новые закономерности жизнедеятельности микроорганизмов.

Микробные сообщества, развивающиеся в виде биопленок на поверхности самых различных предметов и напоминающие по своей организации бактериальный газон, являются наиболее распространенной формой существования микроорганизмов в естественных условиях обитания in situ. При этом с внешней средой контактируют не отдельные клетки, а целые сообщества микроорганизмов, защищенные комплексом дополнительных структур. В этой связи стала очевидной необходимость применения новых подходов и методов при исследовании взаимодействия бактерий с факторами внешней среды. Первые сведения об особенностях взаимодействия целых микробных сообществ с различными факторами окружающей среды были получены на биопленках [247, 273, 306]. Авторы показали, что бактерии, находящиеся внутри биопленок, более устойчивы при действии различных веществ и антимикробных препаратов. Повышение резистентности, в основном, связывали с защитными свойствами полисахаридного матрикса, в толще которого находились микроколонии, при этом необходимо отметить, что поверхностных пленок и каких-либо мембран в составе биопленок авторы не обнаруживали. Указанные данные свидетельствуют о важной роли поверхностных структур микробных сообществ в обеспечении защиты от действия негативных факторов окружающей среды. По всей вероятности, повышение выживаемости бактерий в данных случаях связано с наличием дополнительных барьеров, отграничивающих их от внешней среды.

По-видимому, исследование влияния антимикробных препаратов на микробные сообщества, защищенные от внешней среды поверхностной пленкой, может иметь большое практическое значение для оценки не только чувствительности бактерий, но и способности различных веществ проникать через эти барьеры.

Результаты проведенного электронно-микроскопического анализа подтверждают высказанные ранее предположения о проявлении бактериальными клетками свойств, присущих многоклеточным организмам [88, 89, 196, 379]. Актуальность применения системного подхода для понимания механизмов, обеспечивающих существование микробных сообществ в виде целостных структур, подтверждена также данными по исследованию выживаемости микроорганизмов, входящих в состав биопленок при действии антимикробных препаратов [247, 273, 306]. Повышение устойчивости бактерий, входящих в состав микробных сообществ, развивающихся в виде биологических пленок в макроорганизме или на поверхности каких-либо субстратов, можно объяснить особой организацией микробных сообществ, дополнительные структуры которых в виде поверхностной пленки препятствуют проникновению антимикробных препаратов.

Антагонистические взаимоотношения микроорганизмов

Недостаток сведений о свойствах и поведении различных морфологических типов клеток в популяции, особенно покоящихся некультивируемых клеток, отсутствие необходимых данных о морфо-физиологических особенностях взаимодействия различных видов микроорганизмов в смешанных ассоциациях in situ значительно затрудняет понимание основных микроэкологических процессов, протекающих как в организме человека, так и в природных условиях. Исследование антагонистических взаимоотношений в сложных ассоциациях микроорганизмов, определение их роли в осуществлении некоторых функций организма-хозяина позволило бы контролировать состав и активность его микрофлоры.

Особый интерес в этой связи представляет анализ морфо-физиологических параметров, позволяющих дифференцировать степень антагонистической активности исследуемых микроорганизмов. В настоящее время доказана определяющая роль нормальной микрофлоры кишечника для здоровья человека. В связи с этим особого внимания заслуживают препараты-пробиотики, включающие представителей нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта здорового человека -бифидобактерии и лактобациллы. Комплекс лечебных свойств препаратов-пробиотиков, содержащих представителей нормальной микрофлоры человека, определяется не только видами бактерий, но в большей степени конкретными штаммами [19]. При подборе штаммов для получения препаратов-пробиотиков необходимо учитывать такие свойства, как безвредность, способность к адгезии и антагонистическую активность. Особое внимание уделяют проявлению антагонистической активности представителей нормальной микрофлоры по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям, поскольку это свойство способствует не только восстановлению нормальной микрофлоры, но и подавлению развития нежелательных для человека микроорганизмов. Биодеструкция различных материалов

Биодеструкция минералов и трансформация почвы Исследование гранитного щебня при длительном выращивании на нем растений выявило интенсивное воздействие биоты на КС, что выразилось в образовании глубоких трещин и привело к биодеструкции минералов. При этом в первую очередь выкрашивались минералы, включающие элементы сравнительно легко доступные для живых организмов - триоктаэдрические слюды. В зависимости от особенностей химического состава и кристаллического строения характер изменения минералов был различен. Кварц и полевые шпаты измельчались сильнее слюд, но слюды подвергались более глубоким химическим изменениям. Это выразилось у слюд в осветлении окраски (потеря железа), расщеплении и закручивании краев (потеря калия из межслоев), появлении следов травления и коррозии на поверхности зерен. Главным местом атаки живых организмов и их метаболитов в щебне являлись участки контакта зерен и дефекты строения (трещины, царапины). Аналогичные наблюдения были сделаны для природных почв [70, 146].

Через 7 лет непрерывного культивирования растений при регулируемом поступлении тепла, света, влаги и минеральных элементов первоначально абиогенная порода - гранитный щебень трансформируется в биокосное вещество, сходное с почвой. В породе формируется сообщество живых организмов (агробиоценоз), включающее, кроме культивируемого высшего растения, сложное сообщество микроорганизмов: прокариотических (бактерии) и эукариотических (грибы, водоросли, а также простейшие и нематоды). В результате жизнедеятельности этого сообщества в КС образуется сложное по составу органическое вещество, включающее смесь корневых выделений и опада растений, метаболиты и продукты распада микроорганизмов, а также гумуеоподобные образования, в том числе слабо сформированные гуминовые кислоты, сходные с природными. Формирование агробиоценоза и органического вещества КС является взаимосвязанным и взаимообусловленным процессом.

Сообщество живых организмов посредством метаболитов и продуктов их деструкции воздействует на минералы КС с целью извлечения недостающих минеральных элементов. Результатом этого воздействия является дезинтеграция гранитного щебня и изменение составляющих его минералов. Как и в почвах, атаке живых организмов подвергаются минералы, содержащие наиболее легко усваиваемые микроорганизмами элементы. Интенсивность и характер их изменения зависят от химического состава и кристаллической структуры.

Таким образом, биодеградация гранитного щебня при длительном выращивании на нем растений в РАЭС сходна с почвообразованием, так как включает два наиболее важных процесса, формирующих природное, но индуцированное антропогенным способом преобразование почвы: гумусонакопление и виутрипочвенное выветривание минералов.

Биодеструкция мрамора

Электронно-микроскопическое исследование биодеструктивных изменений мрамора скульптурных памятников (ангелы из костела Св. Екатерины, барельефы Висячего сада Эрмитажа, античные скульптуры из коллекции Эрмитажа, античный мрамор из Херсонеса) показало, что начальным и решающим этапом биоповреждения является адгезия микроорганизмов на повреждаемой поверхности. После прикрепления микроорганизмы начинают воздействовать на поверхность с помощью метаболитов (органических кислот и ферментов), поскольку биоповреждения в большей степени обнаруживаются непосредственно под прикрепившимися над ними клетками. Если бы удалось избежать адгезии микроорганизмов и образования ими на твердых поверхностях биопленок, то в большинстве случаев исчезла бы и сама угроза биоповреждений. В результате проведенных методами СЭМ исследований показана первоочередная необходимость тщательного изучения адгезии микроорганизмов на повреждаемых ими поверхностях. Установлено, что при работе с биоповреждениями основное внимание следует уделять изучению количества и качества адгезированных микроорганизмов. Полученные методом СЭМ данные по структуре мрамора позволяют глубже понять механизмы микробных биоповреждений. Сведения о доминирующих на разрушающихся поверхностях мрамора микроорганизмах приобретают особое значение при исследовании структуры ассоциаций микроорганизмов, формирующих биопленки, метаболические связи в которых играют определяющую роль в процессе биоповреждения.

На основании данных, полученных методом СЭМ, о влиянии биоцидов на адгезию микроорганизмов, разработаны практические рекомендации по борьбе с биоповреждениями.

Повышение активности микроорганизмов-нефтедеструкторов

Для проведения биотехнологического этапа очистки воды и почвы от нефтезагрязнений необходимо знать состав микрофлоры с целью выделения естественных ассоциаций микроорганизмов-алканотрофов.

При исследовании влияния загрязненной почвы дизельным топливом на ее микрофлору при различной длительности воздействия выделены эффективные ассоциации микроорганизмов-алканотрофов, разрушающие сырую нефть на 67-80%. Методом СЭМ показано, что бамил обладает необходимыми для иммобилизации нефтередуцирующих микроорганизмов свойствами и может быть использован для получения эффективных биопрепаратов.

Биодеструкция пергамена

Биоповреждения пергамена и кожи имеют общий механизм -ферментативный гидролиз белковых компонентов субстрата. Химическая деструкция пергамена и кожи возможна под действием как специфических ферментов — коллагеназ, так и протеаз более широкого спектра действия. Последние гидролизуют не только глобулярные белки кожи и пергамена, но и денатурированный коллаген, содержание которого увеличивается в процессе старения при хранении рукописных книг.

Бактериальные и грибковые ассоциации осуществляют деструкцию кожи и пергамена значительно быстрее, чем гомологичные монокультуры. Вместе с тем, существуют некоторые различия в развитии грибов на коже и пергамене. Так, Penicillium diversum, Basipetospora rubra, Scopulariopsis brevicaulis,Cladosporium herbarum растут гораздо активнее на пергамене, чем на коже. Многие грибы выделяют пигменты исключительно при росте на пергамене [170].

Сканирование поверхности различных деструктурированных материалов показало, что в большинстве случаев причиной разрушения были микроорганизмы — бактерии и грибы (микромицеты), причем последние преобладали в образцах из памятников культуры. Доминирование грибов среди биодеструкторов памятников закономерно, так как грибы обладают морфо-физиологическими и генетическими особенностями, которые позволяют им выживать в экстремальных климатических условиях и развиваться на предметах внутри помещений — в музеях, библиотеках, архивах. Используя материалы памятника в качестве субстратов, грибы разрушают не только органические соединения (источник питания), но и камни, довольствуясь малым количеством органических веществ и влаги, которые накапливаются преимущественно на рельефных частях поверхностей в трещинах. В процессе жизнедеятельности микромицеты выделяют различные метаболиты, вызывающие разрушение памятников, проникают в толщу материала, увлажняют его и создают дополнительные условия для развития более влаголюбивых микроорганизмов бактерий и водорослей. Выделяемые грибами щавелевая, молочная и глюконовая кислоты, действуя как хелатирующие агенты, участвуют в деминерализации различных каменных субстратов, при этом в минералах происходит выщелачивание кальция, кремния, железа, магния и марганца [282]. Особенно активно грибы повреждают памятники из пористых пород — мрамора, известняка, доломита. Они способны также разрушить плотные породы камня, например, гранит.

Метод СЭМ дает возможность определить степень деструкции материала памятника на ультраструктурном уровне и на любой стадии повреждения, включая самые ранние. Мы полагаем, что именно СЭМ является наиболее точным и информативным методом определения деструктивных изменений. Этот метод также может быть использован для определения эффективности реставрационных работ с целью оптимизации процесса реставрации и консервации.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Рыбальченко, Оксана Владимировна, Санкт-Петербург

1. А.С. 1328377 А1 СССР, МКИ 4С12 12 1/02. Способ определения физиологического состояния бактериальных клеток Escherichia coli в препаратах / Е.Н. Свентицкий (CCCP).-N 3939984/28-13; заявл. 02. 08. 85; опубл. 1987, БИ N 29.

2. Акайзин Э.О., Воскун С.Э., Панова Л.А., Смирнов С.Г. Гетерогенность популяции Escherichia coli в процессе индуцированного автолиза // Микробиология. 1990. Т. 59. Вып. 2. С. 283 288.

3. Аким Э.Л., Чернина Е.С. Метод ламинирования и его развитие в Государственной Публичной библиотеке им. М.Е. Салтыкова-Щедрина // Теория и практика сохранения книг в библиотеке. Сб. науч. тр. / ГПБ. Л., 1983. Вып. 11. С. 77-98.

4. Аксенов С.И. Вода и ее роль в регуляции биологических процессов. М.: Наука, 1990. 117 с.

5. Александрова Л.Н. Органическое вещество почвы и процессы его трансформации. Л.: Наука, 1980. 286 с.

6. Алекси-Месхешвили Г.П. К изучению микрофлоры пергамена // Экспресс-информация Министерства культуры СССР Библиотеки им. Ленина. Серия: «Реставрация памятников истории и культуры». Вып. 1. М., 1987. 65 с.

7. Альберте Б., Брей Д., Льюис Д. и др. Молекулярная биология клетки. Т. 3. М.: Мир, 1986.296 с.

8. Андреев О. А.,. Рыбальченко О.В.,. Шалаева О.Н. и др. Характеристика термофильных бактерий, выделенных из горячих источников Камчатки // Микробиология. 1983. Т. 52. Вып. 3. С. 496-504.

9. Антипов Каратаев И.Н., Алферова И.Т. Закономерности биохимического разложения альбита и мусковита // Миграция химических элементов при процессах выветривания / Под ред. И. И. Гинзбурга. М.: Наука, 1966. 130 с.

10. Аристовская Т.В. Микробиология процессов почвообразования. Л.: Наука, 1980. 187 с.

11. Аристовская Т.В. О микробиологических факторах мобилизации кремния из труднорастворимых природных соединений // Почвоведение. 1968. № 12. С. 59-65.

12. Аристовская Т.В., Владимирская М.Е., Голлербах М.М. и др. Большой практикум по микробиологии. М.: Высшая школа, 1962. 491 с.

13. Аристовская Т.В., Дараган А.Ю., Зверева Т. С. Роль микроорганизмов в превращении минералов // География, генезис и плодородие почв / Под ред. В.К. Петрякова. Л.: Колос, 1972. 271 с.

14. Аркадьева З.А. Факторы, влияющие на жизнеспособность и свойства микроорганизмов при различных методах хранения // Биологические науки. 1983. № 4. С. 93-105.

15. Ауэзова О.Н., Бакирова Л.Ш. Углеводородокисляющие микроорганизмы озера Балхаш // Изв. А.Н. Казахск. ССР. Сер.биол.1991. № 5. С. 48-53.

16. Ашмарин И.П., Васильев Н.Н., Амбросов В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирования экспериментов. Л.: Наука, 1975. 78 с.

17. Бабанин В.Ф. Железо в почвах: Автореф. докт. дис. М., 1987. 54 с.

18. Бакулина Н.А. Физико-химические исследования патогенных энтеробактерий в процессе культивирования. Иваново, 1985. Т. 11 С. 9.

19. Банникова Л.А. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности. М.: Пищевая промышленность, 1975. 255 с.

20. Баснакъян И.А., Дубинина Г.П. Морфологические особенности в сопоставлении с физиолого-биохимическими закономерностями жизнедеятельности микроорганизмов при периодическом и непрерывном культивировании // Микробиология. 1974. Т. 43. Вып. 7. С. 3-7.

21. Беляева Н.В., Матвеева З.Н. Клииические особенности кампилобактериоза у взрослых // Острые кишечные инфекции. Вып. 10. Л., 1986. С. 130-132.

22. Бердичевская М.В. Численность, видовой состав и оксигеназная активность углеводородокисляющего сообщества нефтезагрязненных речных акваторий Урала и Западной Сибири // Микробиология. 1991. Т. 60. №6. С. 122-128.

23. Богдан JI.B., Лазарева Е.В., Моисеева В.Н. Экологические проблемы современной нефтепереработки и нефтехимии. М.: ЦНИИ информации и технико-эконом. исслед. нефтеперераб. и нефтехим. промышл., 1980. С. 14-16.

24. Будрене Е.О. Влияние хемотаксиса на геометрию структур в колониях бактерий // Биофизика. 1988. Т. 33. Вып. 2. С. 373-374.

25. Будрене Е.О. Образование пространственно упорядоченных структур в колониях подвижных бактерий на агаре // Докл. АН СССР. 1985. Т. 283. № 2. С. 470-473.

26. Будрене Е.О., Полежаев А.А., Птицын М.О. Модель образования пространственно упорядоченных структур в колониях подвижных бактерий // Биофизика. 1986. Т. 31. Вып. 5. С. 866-870.

27. Бурштейн Б.А. Люминесценция белковых хромофоров: Модельные исследования // Итоги науки и техники. Биофизика. 1976. Т. 6. С. 213-216.

28. Бутцлер Ж.П., Хазенсон Л.Б., Чайка Н.А. Кампилобактериоз. М.: Медицина, 1988.351 С.

29. Быков В.А., Крылов И.А., Манаков М.Н. и др.// Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов. Биотехнология. Т.6. М.: Высшая школа, 1987. 143 с.

30. Вайсман И.Ш. Предпосылки комплексной оценки физиологического состояния бактериальных популяций // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1984. № 4. С. 3-9.

31. Ваксман З.А. Антагонизм микробов и антибиотические вещества. М.: Иностран. литерат., 1947. 391 с.

32. Вайнштейн М.Б., Кудряшова Е.Б. О наннобактериях // Микробиология. 2000. Т. 69. №2. С. 163-174.

33. Виноградский С.Н. Микробиология почвы. М.; Л.: Изд-во Акад. наук СССР, 1952. 792 с.

34. Войтылов В.В., Какорин С.А., Трусов А.А. Исследование анизотропии электропроводности коллоидов и суспензий, наведенной внешним электрическим полем //Коллоидн. журн. 1986. Т. 48. № 1. С. 139-141.

35. Войтылов В.В., Какорин С.А., Трусов А.А. Определение распределения коллоидных частиц по размерам из измерений анизотропии электропроводности дисперсных систем // Коллоидн. журн. 1990. Т. 52. № 1.С. 8-14.

36. Вольф И.В., Ткаченко Н.И. Химия и микробиология природных и сточных вод. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1973. 238 с.

37. Воскун С.Е., Смирнов С.Г., Панов Л.А. Гетерогенность популяции Escherichia coli THR по усвоению 3Н-треонина // Микробиология. 1989. Т. 58. Вып. 4. С. 602-606.

38. Высоцкий В.В. Ультраструктура бруцелл. Сообщение IV. Некоторые особенности строения поверхностных структур S-клеток, выявленные при фиксации осмиевой кислотой и мертиолатом // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1968. Т. 6. С. 50-53.

39. Высоцкий В.В., Вайсман И.Ш., Ефимова О.Г., Чемурзиева Н.В. Криофрактографическое изучение межклеточных связей в популяции агаровых культур Bordetella pertussis // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1985. № 9. С. 54-60.

40. Высоцкий В.В., Заславская П. Л., Машковская А.В., Баулина О.И. Полиморфизм как закономерность развития популяции прокариотических организмов//Биол. науки. 1991. № 12. С. 5-18.

41. Галиев М. А. Экологическая оценка загрязнителей окружающей среды при добыче нефти // Борьба с коррозией и защита окружающей среды: Обзорная информация. Вып. 2. М.: ВНИИОЭНГ, 1988. С. 12-14.

42. Галстян А.Ш. Ферментативная активность почв Армении. Ереван: Айстан, 1974. 275 с.

43. Головлев E.JI. Механизм формирования биопленки -структурированной популяции Pseudomonas aeruginosa II Микробиология. 2002. Т. 71. № 3. С. 293-300.

44. Головлев E.JI. Другое состояние неспорулирующих бактерий // Микробиология. 1998. Т 67. № 6. С. 725 735.

45. Головлев E.JI. Может ли быть то, чего быть не может? // Биофизика. 1998. Т. 43. вып.4. С 751 752.

46. Горбушина А.А. Биологические особенности микромицетов, повреждающих мрамор: Автореф. канд. дис. СПб., 1997. 17 с.

47. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий. JL: Изд-во Ленингр. унта, 1989. 248 с.

48. Горленко В.М., Дубинина Г.А., Кузнецов С.И. Экология водных микроорганизмов. М.: Наука, 1977. 288 с.

49. Груздкова Р.А. Загрязнение почв района г. Новокуйбышевска нефтепродуктами // Труды Ин-та эксперим. метеорол. комитета по гидрометеорологии и мониторингу окруж. среды Министерства экол. и природ, ресурсов РФ. 1993. № 22. С. 123-128.

50. Губанова Г. А. Биодеградация нефти психрофильными микроорганизмами // V Конф. РФ "Новые направления биотехнологии": Тез. докл. Пущино, 1992. С. 146.

51. Данилова О.П., Пономаренко В.А. Микробиоценоз женских гениталий. Учебн. Пособие. СПб. 2000. 81 с.

52. Дараган А.Ю. Разложение железосодержащих минералов почвенными микроорганизмами // Почвоведение. 1971. № 9. С. 35-40.

53. Дебабов В. Г. Жизнь бактерий за стенами лабораторий // Молекулярная биология. 1999. Т. 33. № 6. С. 1074-1084.

54. Дебабов В. Г. Метаболическая инженерия микробной клетки // Микробиология. 1999. Т. 68. № 6. С. 823-833.

55. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И., Звягинцев Д.Г. Репродуктивные покоящиеся формы Arthrobacter globiformis // Микробиология. 2000. Т. 69. № 3. С. 377-382.

56. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автол изирующихся суспензиях // Микробиология. 2000. Т. 69. № 3. С. 383-388.

57. Добрусина С.А., Рыбальченко О.В., Беликова Т.Б., Кочкин В.Ф. Исследование биостойкости бумаги с поли-n- ксилиленовым покрытием // Микология и фитопатология. 1996. Т. 30. Вып. 4. С. 87-95.

58. Дуда В.И., Дмитриев В.В., Сузина Н.Е. и др. Ультраструктурная организация газовых баллонов и поверхностных пленок в колониях у грамотрицательных бактерий Alcaligenes sp. // Микробиология. 1996. Т. 65. № 2. С. 222-227.

59. Дуда В.И., Пронин С.В., Эль-Регистан Г. И. Образование покоящихся клеток у Bacillus cereus под влиянием ауторегуляторного фактора // Микробиология. 1982. Т.51. № 1. С. 77-81.

60. Дьюсбери Д. Поведение животных: Сравнительные аспекты. М.: Мир, 1981.480 с.

61. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.: Высшая школа, 1986. 447 с.

62. Егоров Н.С., Ландау Н.С. Биосинтез биологически активных соединений смешанными культурами микроорганизмов // Прикл. биохим. и микробиол. 1982. Т. 18. Вып. 6. С. 835-849.

63. Блинов Н.П. Химическая микробиология. М.: Высшая школа, 1989. 447 с.

64. Блинов Н.П. Химия микробных полисахаридов. // М.: Высшая школа, 1984. 267 с.

65. Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А. Покоящиеся клетки. М.: Наука, 1983. 180 с.

66. Ермаков Е. И. Регулируемая агроэкосистема в биологических и сельскохозяйственных исследованиях: Продукционный процесс растений в регулируемых условиях. Л.: Гидрометеоиздат, 1993. С. 3-15.

67. Ермаков Е.И., Аникина Л.М., Орлова Н.Е. Накопление и трансформация органического вещества в корнеобитаемых системах // Вестн. Россельхозакадемии.1996. № 1. С. 45-48.

68. Ермаков Е.И., Зверева Т.С., Рыбальченко О.В. Изменение гранитного щебня под многолетней культурой пшеницы и томата // Почвоведение. 2000. № 12. С. 1463-1471.

69. Ермаков Е.И., Шумейко С.И. О возможной роли диатомовых водорослей в биогенном выветривании корнеобитаемых сред // Докл. АН СССР. 1979. Т. 248. С. 1233-1237.

70. Ждан-Пушкина С.М. Основы роста культур микроорганизмов. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1983. 187 с.

71. Жуковский А.П. Обоснование континуальной модели структуры воды методом ИК-спектроскопии // Журнал структурной химии. 1981. Т.22. № З.С. 56-61.

72. Жуковский А.П., Ровнов Н.В., Сорвин С.В. и др. Температурное изменение состояния внеклеточной среды бактериальной суспензии // Биофизика. 1991. Т. 36. Вып. 2. С. 303-307.

73. Жуковский А.П., Ровнов Н.В., Тяготии Ю.В. и др. Влияние слабых постоянных магнитных полей на клетки крови, полученные от лейкоз! 1ых больных // 4-я Межд. конф. "СПИД, рак и родственные проблемы" СПб., 1996. С. 83.

74. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. "Quorum sensing", или как бактерии "разговаривают" друг с другом // Молекулярная биология. 2001. Т. 35. № 2. С. 268-277.

75. Захаров А.А. Организация сообществ у муравьев. М.: Наука, 1991. 277 с.

76. Звягинцев Д. Г. К вопросу об адсорбции микроорганизмов почвенными частицами // Почвоведение. 1962. № 2. С. 19-25.

77. Звягинцев Д.Г. Адсорбция микроорганизмов почвами и ее влияние на их активность // Микроорганизмы в сельском хозяйстве / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1963. С. 277-296.

78. Звягинцев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1973. 176 с.

79. Звягинцев Д.Г. Изучение микроорганизмов как компоненты биогеоценоза // Программа и методика биогеоценологических исследований. М.: Наука, 1966. С. 195-228.

80. Звягинцев Д.Г., Хлебникова Г.М., Горин В. А. Рентгенография основных типов породообразующих минералов. JI.: Недра, 1983. 359 с.

81. Звягинцев Д.Г., Хлебникова Г.М., Горин С.Е. Сравнительная характеристика численности микроорганизмов почв и подстилающих их осадочных пород//Микробиология. 1979. Т. 48. Вып.1. С. 118-124.

82. Злочевская И.В., Мартиросова Е.В. Биохимическая активность смешанных культур грибов, повреждающих пергамен // Тез. докл. III всес. конф. по биоповреждениям. Донецк, 1987. С. 70.

83. Злочевская И.В., Мартиросова Е.В. Влияние влажности на рост грибов, повреждающих пергамен и кожу // Микология и фитопатология. 1986. Т. 20. Вып. 1.С. 43-46.

84. Злочевская И.В., Мартиросова Е.В., Горленко М.В. Экспериментальные ассоциации грибов, повреждающих пергамен // Микробиология и фитопатология. 1988. Т. 22. Вып.6. С. 108.

85. Иваницкий Г.Р., Кринский В.И., Цыганов М.А., Агладзе К.И. Изменение модальности автоволн в растущей популяции бактерий // Биофизика. 1988. Т. 33. Вып. 2. С. 372-373.

86. Иванов В.Н. Экзо- и эндотрофия клетки. Киев: Наукова думка, 1990. 104 с.

87. Иванов В.Н., Угодчиков Г.А. Клеточный цикл микроорганизмов и гетерогенность их популяций. Киев: Наукова Думка, 1984. 279 с.

88. Иерусалимский Н.Д. Основы физиологии микробов. М.: Изд-во АН СССР, 1963.244 с.

89. Ильичев В.Д., Бочаров Б.В., Горленко М.В. Экологические основы защиты от биоповреждений. М.: Наука, 1985. 261 с.

90. Казначеев В.П., Михайлова Л.П. Биоинформационная функция естественных электромагнитных полей. Новосибирск: Наука, 1985. 180 с.

91. Казначеев В.П., Михайлова Л.П. Сверхслабое излучение в межклеточных взаимодействиях. Новосибирск: Наука, 1981. 141 с.

92. Кантор Ч., Шиммел П. Биоорганическая химия. Т. 3. М.: Мир, 1985. 536 с.

93. Каравайко Г.И., Кузнецов С.И., Голомзик А.И. Роль микроорганизмов в выщелачивании минералов из руд. М.: Наука, 1972. 24 с.

94. Кардаш И.Е., Пебалк А.В., Праведников А.Н. Химия и применение полипараксилиленов // Итоги науки и техники. Химия и технология высокомолекулярных соединений. 1984. Т. 19. С. 66-150.

95. Карпинская Н.С. К вопросу о поглощении бактерий в почве // Научно-агрономич. журнал. 1926. № 9. С. 587-610.

96. Климов Н.А., Батарин В.И., Рыбальченко О.В. и др. Образование внеклеточной протеазы клетками термофильных бактерий // Микробиология. 1988. Т. 57. Вып. 4. С. 579-585.

97. Клюйвер А., Ван-Ниль К. Вклад микробов в микробиологию. М.: Наука, 1959. 195 с.

98. Кобатов А.И. Определение реперных точек при разработке регламента сублимационного высушивания биопрепаратов. СПб., Изд-во НИИХ СПбГу,. 2001.223 с.

99. Конев С.В., Калер Г.В. Трансмембранный электрический потенциал как регулятор функциональной активности биомембран // Биофизика. 1988. Т. 33. Вып. 6. С. 1018-1022.

100. Константинова Н.Д., Лаврова Л.Н., Гулевская С.А., Кац Л.Н. Использование сканирующей электронной микроскопии для изучения микроорганизмов на уровне популяции. № 2. Таллин: ВКЭМ, 1979. С. 61.

101. Корн Г., Корн Т. Справочник по математике. М.: Наука, 1974.- 832 с.

102. Кох А. Измерение роста // Методы общей бактериологии. Т. 1. М.: Мир, 1983. С. 442-534.

103. Кудлай Д. Г. Эписомы и инфекционная наследственность бактерий. М.: Медицина, 1969. 138 с.

104. Кузнецов В.Д. Streptomyces albiaxialis sp. nov. — новый вид термо- и галотолерантного стрептомицета, разлагающего углеводороды нефти // Микробиология. 1992. Т. 61. № 1. С. 84-91.

105. Курепина Е., Хмель И. А., Липасова В. А. и др. О способности кишечных бактерий синтезировать низкомолекулярные вещества микроцины. // Тез. докл. конф. "Плазмида-11". Пущино на Оке, 1986. С. 41-42

106. Кутузова Р.С. Возможные пути выветривания минералов в щелочных почвах//Почвоведение. 1973. № 2. С. 135-140.

107. Ленцнер А. А., Ленцнер X. П., Микельсаар М. Э. и др. Лактофлора и колонизационная резистентность // Антибиотики и химиотерапия. 1987. № З.С. 173-179.

108. Лившиц М.А., Бапабеков Б.Ч., Волькенштейн М.В. Диссипативные структуры в растущей колонии подвижных бактерий // Биофизика. 1988. Т. 33. Вып. 4. С. 647-652.

109. Лимарь Т.Е., Кожевин П.А., Звягинцев Д.Г. Введение в геологическую микробиологию. М.: Изд-во Акад. наук СССР, 1962. 239 с.

110. Лимарь Т.Е., Кожевин П.А., Звягинцев Д.Г. Сравнение количества микроорганизмов в почвах разных типов, выявленного с помощью чашечного метода и люминесцентной микроскопии // Научн. докл. высшей школы. Биол. науки. 1975. № 9. С. 134-138.

111. Лисицкая Т.Б., Беликова Т.Д., Склярова О.А. Ассоциации бактерий, выделенные с бумаги и пергамена // Сб. материалов Всерос. конф. "Экологические проблемы биодеградации промышленных строительных материалов и отходов производств". Пенза, 1998. С. 40-44.

112. Литвинов М.А. Методы изучения почвенных микроскопических грибов. Л.: Наука, 1969. 118 с.

113. Лугаускас А.Ю., Микульскене А.И., Шляужене Д.Ю. Каталог микромицетов-биодеструкторов полимерных материалов. М.: Наука, 1987. 341 с.

114. Лукашёв К.И., Лукашёв * В.К., Мазо В.И. Микробиологическая' характеристика лёссовых пород Оршано-Могилёвского плато // Докл. АН СССР. 1978. Т. 22. № 7. С. 655-675.

115. Мазур И.И. Экология нефтегазового комплекса: Наука. Техника. Экономика. М.: Недра, 1993. 130 с.

116. Максимов В. И., Миловзорова Т. А., Молодова Г. А. О специфичности микробных лизоцимов // Успехи биологической химии. Т. 29. М.: Наука, 1988. С. 218-230.

117. Мамкаева К.А., Рыбальченко О.В. Особенности ультраструктуры-Bdellovibrio chlorellavorus // Микробиология. 1979. Т. XIVIII. № 1. С. 159161.

118. Медведева Н.Г., Гоголушко Н.Б., Сухаревич М.Э. и др. Влияние имбрицина на рост и ультраструктуру клеточной поверхности микромицетов// Микология и фитопатология. 1996. Т. 30. Вып. 1. С. 1721.

119. Медведева Н.Г., Сухаревич В.И., Рыбальченко О.В. Влияние конденсата формальдегида на продуцент лимонной кислоты Aspergillus niger // Биотехнология. 1997. № 5. С. 28-32.

120. Медведева С.Е., Пузырь А.П., Могильная О.А. Цитоархитектоника бактериальных колоний. Препринт. 149Б. Красноярск: Изд-во Ин-та биофизики, 1991. 35 с.

121. Медвинский А.Б., Шахбазян В.Ю., Цыганов М.А. и др. Как и почему возникают демаркационные зоны при сближении популяционных волн, формируемых бактериями Escherichia coli // Докл. АН СССР. 1991. Т. 317. №4. С. 1001-1004.

122. Мельникова Е.П., Славошевская JI.B., Соловский М.В. Катапол в реставрации и защите художественных ценностей // IV Европ. конф. по материалам и методам. СПб., 1993. С. 135.

123. Мечников И.И. Этюды оптимизма. М.: Наука, 1964. 226 с.

124. Милехина Е.И. Углеводородокисляющая микрофлора заводняемых нефтяных месторождений Татарии с различной минерализацией пластовых вод // Микробиология. 1991. Т. 60. № 4. С. 747-756.

125. Миненков А.Р. Адсорбция бактерий различными типами почв: Дневник Всес. съезда ботаников. JI.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1928. С. 206-207.

126. Минкевич И.Г. Базовая модель микробной культуры как распределенной системы // Биофизика. 1992. Т. 37. Вып. 2. С. 310-317.

127. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. СПб.: Наука, 1994. 399 с.

128. Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология. М.: Колос, 1980. 344 с.

129. Муромцев Г. С. О роли продуктов жизнедеятельности почвенных микроорганизмов в мобилизации Р2О5 фосфоритов // Агробиология. 1957. № 1.С. 96-103.

130. Набирухин Ю.И. Проблемы построения количественной модели строения воды // Журнал структурной химии. 1984. Т. 25. № 2. С. 60-67.

131. Нижарадзе Т.Н., Томилин A.M., Тукалло A.M. Контроль загрязнения водных объектов по интегральной микробиологической активности // Вестн. Ленингр. ун-та. Сер. 7. 1989. Вып. 3. № 21. С. 93-97.

132. Николаев Ю.А. Дистантные информационные взаимодействия у бактерий // Микробиология. 2000. Т. 69. № 5. С. 597-605.

133. Нобл У. К. Микробиология кожи человека. М.: Медицина, 1986. 138 с.

134. Новик Г.И., Высоцкий В.В. Архитектоника популяций бифидобактерий: Субмикроскопический аспект когезии клеток Bifidobacterium adolescentis и Bifidobacterium bifidum // Микробиология. 1995. Т. 64. №2. С. 222-227.

135. Новиков Ю.В., Комзолова Н.Б. Исследования бактериального препарата Путидойл, предназначенного для очистки водоемов от нефти // Водные ресурсы. 1992. № 2. С. 121-123.

136. Новогрудский Д.М. Нижний предел почвенной влаги для жизнедеятельности бактерий // Микробиология. 1946а. Т. 15. Вып.6. С. 479-483.

137. Новогрудский Д.М. Новый метод исследования почвенной микрофлоры // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1948. № 6. С. 710-731.

138. Новогрудский Д.М. Почвенная микробиология. Алма-Ата: Изд-во Акад. наук Казахск. ССР, 1956. 402 с.

139. Новогрудский Д.М. Почвенные микроорганизмы и гигроскопическая почвенная влага//Микробиология. 19466. Т. 15. Вып .3. С. 177-186.

140. Нюкша Ю. П. Грибы, обитающие на бумаге // Микология и фитопатология. 1974. Т. 8. Вып. 4. С. 306-311.

141. Нюкша Ю.П. Микрофлора книг и бумаги // Ботанич. журнал. 1961. Т. 46. № 1.С. 70-79.

142. Олескин А.В. Надорганизменный уровень взаимодействия в микробных популяциях//Микробиология. 1993 .Т. 62. Вып. 3. С. 389-405.

143. Олескин А.В., Ботвинко И. В., Цавкелова Е. А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. 2000. Т. 69. № 3. С. 309-327.

144. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Д. Хоулта и др. 9 изд. в 2-х т. М.: Мир, 1997. 800 с.

145. Орлов Д.С. Химия почв. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1985. 376 с.

146. Остроумов C.JI. Введение в биохимическую экологию. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1986. 176 с.

147. Павлова И. Б., Куликовский А. В., Ботвинко И. В. и др. Электронно-микроскопическое исследование развития бактерий в колониях // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1990. №. 9. С. 15-20.

148. Панов Е.Н. Поведение животных и этологическая структура популяции. М.: Наука, 1983. 424 с.

149. Пат. 1702613. (Россия). Мельникова Е.П., Мамонова И.В., Успенская З.Р., Соловский М.В., Панарин Е.Ф.,. Кочеткова И.С., Громов Б.В. Состав для реставрации мраморной скульптуры.

150. Пат. 2039369. (Россия). Нижарадзе Т.Н., Рязанова М.С. Способ поисков залежей углеводородов.

151. Пат. 95110614. (Россия). Нижарадзе Т.Н., Рязанова М.С. Способ поисков залежей углеводородов.

152. Перт С. Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978.326 с.

153. Печуркин Н.С. Популяционная микробиология. Новосибирск: Наука, 1978. 277 с.

154. Поглазова М.Н., Петушкова Ю.П. Изучение биоповреждения пергамена греческой рукописи XIII века различными методами микроскопии // Тез. докл. III всес. конф. по биоповреждениям. Донецк, 1987. С. 71-72.

155. Похиленко В.Д. Разработка состава стабилизаторов при создании сухих препаратов на основе нефтеокисляющих микроорганизмов // VII Конф. РФ "Новые направления биотехнологии": Тез. докл. Пущино, 1994. С. 38.

156. Прозоров А.А. Феромоны компетентности у бактерий // Микробиология. 2001. Т. 70. № 1. С. 5-14.

157. Пузырь А.П., Могильная О.А., Тирранен Л.С. Деление клеток в объеме колоний Flavobacterium SP 22 // Микробиология. 2000. Т. 69. № 2. С. 248256.

158. Ратникова И.А., Гаврилова Н.Р., Колоколова Н.Н., Идентификация антибиотических веществ молочнокислых бактерий // Микробиология. 1995. Т. 65. № 1.С. 56.

159. Рекомендации по использованию биоудобрения бамил и биокомпостов для повышения урожая сельскохозяйственных культур. СПб.: ВНИИСХМ. 1995. 25 с.

160. Роот П.Э., Хлебникова Г.М., Болотина Т.П. и др. Численность и роль микроорганизмов в грунтах // Инж. геология. 1982. № 6. С. 72- 78.

161. Руклиша М.П., Дунцэ М.Э., Леване В.А., Калниня Р.В. Особенности функционирования цикла трикарбоновых кислот у Brevibacterium и Corynebacterium // Микробиология. 1987. Т. 56. Вып. 5. С. 759-763.

162. Рунов Е.В. Восстановление окисных соединений железа биологическим путём // Вестн. бактериол.-агр. станции. 1926. № 24. С. 15-19.

163. Сеги И. Методы почвенной микробиологии. М.: Колос, 1983. 235 с.

164. Селезнев И.А. Загрязнение подземных горизонтов и возможность их ликвидации // Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Сев. Прикаспия: Тез.докл. Всес. симп. Оренбург, 1991. С. 97-98.

165. Сизова Т.П., Мантуровская Н.В. Применение триады Коха в исследовании биоповреждений // Методы выделения и идентификации почвенных микромицетов-деструкторов: Вильнюс, 1982. С. 109-111.

166. Скулачев В.П. Мембранная биоэнергетика. М.: Наука, 1989. 564 с.

167. Скурлатов И.Ю. Основы управления качеством природных вод: Матер. 1 Всес. школы "Экологическая химия водной среды". Кишинёв, 1985. М.: Госкомиздат, 1988. С. 230-255.

168. Смирнов В. В., Резник С. Р., Василевская И. А. Спорообразующие аэробные бактерии — продуценты биологически активных веществ. Киев: Наукова Думка, 1982. 280 с.

169. Смирнова Б.И. К вопросу о микрофлоре пергамена // Вопросы консервации и реставрации бумаги и пергамена. М.; Л., 1962.С. 49-59.

170. Сухаревич В.И., Яковлев В.И., Медведева Н.Г. Получение и использование синтетических углеводов в микробиологических процессах: Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии // Сб. научн. трудов. JI.: Наука, 1986. С. 241-252.

171. Сухаревич В.И., Кислухина О.В., Тутурина В.А., Медведева Н.Г. Влияние синтетических углеводов на биосинтез лизина // Биотехнология. 1992. №2. С. 30-32.

172. Тарасова Т.Н., Зимин А.Б. Химический состав и численность бактерий в грунтах р. Волги в районе Чебоксарского водохранилища // Гидробиол. журнал. 1978. Т. 14. № 6. С. 109-110.

173. Терских В.В., Зорин Е.В. Кинетика пролиферации и популяционный состав культуры диплоидных клеток человека при длительном выращивании без смены среды // Цитология. 1971. Т. 13. № 11. С. 13961401.

174. Терских В.В., Засимовская А.И. Синтез ДНК и пролиферация при длительном культивировании клеток китайского хомячка // Цитология. 1971. Т. 13. № 11. С. 1379-1387.

175. Тец В.В., Рыбальченко О.В., Савкова Г.А. Контакты между клетками в микробных колониях // Журнал микробиологии, эпидемиологии и* иммунобиологии. 1991. № 2. С. 7-13.

176. Тинберген Н. Социальное поведение животных. М.: Мир, 1993. 152 с.

177. Тома М.К., Швинка Ю.Э., Виестур У.Э. Потребление кислорода клетками Brevibacterium flavum 22ЛД: Продуценты аминокислот и ферментов: //. Сб. Научн. трудов Рига: Зинатне, 1987. С. 23-29.

178. Трошанов Э.П. Условия, влияющие на редуцирующую способность и активность бактерий, восстанавливающих железо и марганец в рудоносных озёрах Карельского перешейка // Микробиология. 1969. Т. 38. Вып.4. С. 634-643.

179. Тюрин М. В. Антибиотикорезистентность и антагонистическая активность лактобацилл: Автореф. канд. дис. М., 1990. 21 с.

180. Тюрин М. В., Шендеров Б. А., Рахимова Н. Г. и др. К механизму антагонистической активности лактобацилл // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1989. № 2. С. 3-8.

181. Фармакопейная статья ФС 42-252ВС-89. (Лактобактерин сухой.)

182. Феофилова Е.П. Трегалоза, стресс и анабиоз // Микробиология. 1992. Т. 61. №5. С. 739-753.

183. Хазенсон Л.Б., Сафонова Н.В., Матвеева З.Н. и др. Опыт выделения Campylobacter jeuni от больных с острыми кишечными заболеваниями // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1986. № 7. С. 1721.

184. Химия и технология кожи / Под ред. Н.Н. Кожевникова. М.: Легкая индустрия, 1968. 452 с.

185. Хмель И. А., Метлицкая А. 3., Фоменко Д. Э. , Липасова В. А. Макроцины пептидные антибиотики энтеробактерий и генетический контроль их синтеза // Тез. докл. конф. "Дисбактериозы и эубиотики". М., 1996. С. 57-58.

186. Цокур Н.И., Рожанская A.M., Козлова И.А., Андреюк Е.И. Некоторые физиологические свойства тионовых бактерий, выделенных из отложений палеогена//Микробиология. 1979. Т. 41. С. 12-18.

187. Цыганов В.А., Конев Ю.Е., Барашкова Н.П., Петрова Л.Я. Образование антибиотиков типа азаломицина F культурой Actinomyces imbricatus sp. // Антибиотики. 1970. Т. 15. № 3. С. 208-212.

188. Чайка Н.А., Рыбальченко О.В., Сафонова Н.В. Кокковидная форма возбудителей кампилобактериоза// Острые кишечные инфекции. Вып. 11. Л., 1987. С. 57-63.

189. Чайка Н.А., Хазенсон Л.Б., Бутцлер Ж. и др. Кампилобактериоз. М.: Медицина, 1988.351 с.

190. Чугунов В.А. Разработка и испытания жидких препаратов «Экойл» на основе нефтеокисляющих бактерий // VI Конференция РФ «Новые направления биотехнологии»: Тез. докл. Пущино, 1994. С. 56.

191. Шапиро Д.А. Бактерии как многоклеточные организмы // В мире науки. 1988. №8. С. 46-54.

192. Шахобова Б. Б. Восстановление трехвалентного железа культурами грибов и актиномицетов // Почвоведение. 1976. № 8. С. 145-149.

193. Швинка Ю.Э. Физиологические и биотехнологические аспекты регуляции выхода продуктов, синтезируемых микроорганизмами // Изв. АН ЛатвССР. 1984. № ю. С. 56-71.

194. Шендеров Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т.1. Микрофлора человека и животных и ее фунуции. М.: Грантъ, 1998. 288 с.

195. Шендеров Б. А. Нормальная микрофлора и некоторые вопросы микроэкологической токсикологии // Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987. Т. 32. № з. с. 164-170.

196. Шеховцев В. П., Жарикова Г. Г. Электронно-микроскопическое изучение структуры поверхностной пленки в колониях бактерий // Биол. науки. 1984. № 10. С. 101-104.

197. Шилов И.А. Физиологическая экология животных. М.: Высшая школа, 1985.328 с.

198. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987. 566 с.

199. Эйзенберг Д., Кауцман В. Структура и свойства воды. Л.: Гидрометеоиздат, 1975. 280 с.

200. Эль-Регистан Г. И., Дуда В.И., Козлова А.Н. Изменение клеток Bacillus cereus под влиянием специфического ауторегуляторного фактора // Микробиология. 1979. Т. 38. № 2. С. 240-244.

201. Эль-Регистан Г. И., Дуда В.И., Светличный В.А. и др. Динамика ауторегуляторных факторов D в периодических культурах Pseudomonas carboxydoflora и Bacillus cereus // Микробиология. 1983. Т. 52. № 2. С. 238243.

202. Эль-Регистан Г. И., Хохлова Ю.М., Дуда В.И. и др. Выявление и характеристика специфических аутогенных факторов, синтезируемыхпрокариотическими и эукариотическими микроорганизмами // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1979. № 6. С. 869-877.

203. Эль-Регистан Г.И., Дуда В.И., Козлова А.Н. Изменение конструктивного метаболизма и ультраструктурной организации клеток Bacillus cereus под влиянием специфического ауторегуляторного фактора // Микробиология. 1979. Т. 48. № 2. С. 240-244.

204. Ютте Х.Г. Пассивная консервация: климат и освещение. СПб., Санкт-Петербургская гильдия реставраторов. Европейский дом, 1997. С. 127-154.

205. Юхневич Г.В. Инфракрасная спектроскопия воды. М.: Наука, 1973. 176 с.

206. Amy P. S., Pauling С., Morita R. Y. Starvation survival processes of a marine vibrio //Appl. Environ. Microbiol. 1983. V. 45. P. 1041-1048.

207. Anand S. K., Srivivasan R. A., Rao L. K. Antibacterial activity associated with Bifidobacterium bifidum-11 // Cultured Dairy Prod. J. 1985. V. 20. № 1. P. 13-19.

208. Anderson H. C. Matrix vesicles calcification // Fed. Proc. 1976. V. 35. P. 105-108.

209. Arrietta L., Grez R. Solubilisation of iron-contaning minerals by soil microorganisms // Appl. Microbiol. 1971. V. 22. № 4. P. 487-490.

210. Atsuco I. Anti-MRSA activity of Bifidobacterium breve and its purification // J. Nara Medical Associat. 1994. V. 45. № 2. P. 421-427.

211. Austin-Pratner S. L., Booth S. J. Evidence for a membrane- bound form of a bacteriocin of Bacteroides uniformis T101 // Can. J. Microbiol. 1984. V. 30. P. 272-286.

212. Axelsson Z.T., Chung T.C., Dobrogos W.J., Lindgrens S.E. Production of a broad spectricum antimicrobial substans by Lactobacillus reuteri // Microb. Ecol. Health Disease 1989. V. 2. № 2. P. 131-136.

213. Banik G. Naturwissenschafnliche Untersuchungen zum Pergament: Methoden und Probleme/ Pergament. Sigmaringen, 1991. 480 S.

214. Baquero F., Fernandez-Jorge A., Visente M. F. e. a. Diversity analysis of the human intestinal flora: A simple method based on bacterial morphotypes // Microb. Ecol. Health Disease. 1988. V. 1. P. 16-19.

215. Baquero F., Moreno F. The microcins // Microbiol. Lett. 1984. V. 23. P. 813-820.

216. Barefoot S.F., Klaenhammer T.R. Detection and activity of Lactocin В, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus // Appl. Environ. Microbiol. 1983. V. 45. № 6. P. 1808-1815.

217. Bassler B.L., Greenberg E.P., Stevens A.M. Cross-Species Indication of Luminescense in the Quorum-Sensing Bacterium Vibrio harveyi // J. Bacteriology. 1997. V. 179. № 12. P. 4043-4045.

218. Bassler B.L., Wright M. Multiple signalling systems controlling expression of luminescense in Vibrio harveyi: sequence and function of genes encoding a second sensory pathway // Mol. Microbiol. 1994.V.13. P. 273-286.

219. Bayer M. E., Easterbrook K. Tubular spinae are long distance connectors between bacteria//J. Gen. Microbiol. 1991. V. 137. P. 1081-1086.

220. Berg R.D. Bacterial translocation from the gastrointestinalis tract // Medical Aspects of Microbial Ecology. V.7/8. / Ed. by B.A. Shenderov. M., 1994. 238 P

221. Bertrand J.C. Anaerobic biodegradation of hydrocarbons // Sci. Progr. (Gr. Brit.) 1989. V. 73. № 3. P. 333-350.

222. Beuth J., Ко. Y. L., Roszkowski W. e. a. Lectins: Meditors of Adhesion for Bacteria in Infectious Diseases and for Tumor Cells in Metastasis // Zbl. Bakt. 1990. V. 274. S. 715-721.

223. Beveridge T.J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles//J. Bacteriol. 1999. V. 181. № 16. P. 4725-4733.

224. Black I.T. Principles and techniques of scanning microscopy: Biological applications/Ed. M.A. Hayat. 1974.V.1.№ l.P. 159-198.

225. Bladen H. A., Megenhagen S. E. Ultrastructure of Veillonella and morphological correlation of an membrane with particles associated with endotoxic activity//J. Bacteriol. 1964. V. 88. P. 1484-1492.

226. Booth S. J., Johnson J. I., Wilkins T. D. Bacteriocin production by strains of Bacteroides isolated from human feces and the role of these strains in the bacterial ecology of the colon // Antimicrob. Agents Chemother. 1977. V. 11. P. 718-724.

227. Brenner S., Home R.W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses // Biochim. Biophys. Acta. 1959.V. 34. № 1. P. 103-110.

228. Brine В., Minekus M., Vossen J. e. a. Antimicrobial activity of lactobacilli: preliminary characterization of production of acidocin B, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus // J. Appl. Bacteriol. 1994. V. 77. № 2. P. 621-629.

229. Brock Th .D. Effekt of water potential on growth and iron oxidation by Thiobacillus ferrooxidance // Appl. Microbiol. 1975. V. 29. №4. P. 495-501.

230. Bromfild S.M. Reduction of ferric compounds by soil bacteria // J. Gen. Bacteriol. 1954. V. 11. № 1. P. 1-6.

231. Bull A.T. II Comprehensive biotechnology. V. 1 / Ed. M. Moo-Young. Oxford: Pergamon Press, 1985. 281 p.

232. Burge R. E., Adamst R., Balyuzi H. H. M., Reaveley D.A. Structure of the Peptydoglycan of Bacterial Cell Walls//J. Mol. Biol., 1977, V.l 17, P. 927-953.

233. Characklis W. G., Marshall К. C. Biofilms: a basis for an interdisciplinary approach // Biofilms / Ed. by W. Characklis, K. Marshall New York.: J. Wiley & Sones,1990. P. 3-15.

234. Chaloupka J., Vinter V. Programmed cell death in bacteria // Folia Microbiol. 1996. V. 41. № 6. P. 451 -464.

235. Chattergee S.W., Das J. Electron microscopic observation the excretion, of cell-wall material by Vibrio cholerae//J. Gen. Microbiol. 1967. V. 49. P. 1-1 1.

236. Chen L., Rhoads D., Tai P. C. Alkaline phosphotase and ompA protein can be translocated posttranslationally into membrane vesicles of Escherichia coli // J. Bacteriol. 1985. V. 16. P. 973-980.

237. Chuang S., Daniels D., Blattner F. Global regulation of gene expression in Escherichia coli //J. Bacteriology. 1993. V. 175. № 7. P. 2026-2036.

238. Clegg C.D., van Elsas J.D., Anderson J.M., Lappin Scott H.M. Survival of parental and genetically modified derivatives of a soil isolated Pseudomonas fluorescens under nutrient-limiting conditions // J. Appl. Bacteriol. 1996. V .81. P. 19-26.

239. Costerton J. W. The bacterial glycocalyx in nature and diseases // Ann. Rev. Microbiol. 1981. V. 35. P. 299-324.

240. Costerton J. W., Cheng K.-J., Geese G. G. e. a. Bacterial biofilms in nature and disease //Ann. Rev. Microbiol. 1987. V. 41. P. 435-464.

241. Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., Lapin-Scott H.M. Microbial biofilms // Annu. Rev. Microbiol. 1995. V. 49. P. 711-745.

242. De Voe I. W., Gilchrist J. E. Release of endotoxin in the form of cell wall blends during in vitro growth of Neisseria meningitidis // J. Exp. Med. 1973. V. 138. P. 1156-1167.

243. Deslaures M., Ni Eidhin D., Lamonde E., Maiton C. SDS- PAGE analysis of protein and lipopolysaccharide of extracellular vesicles and sarcosyle insiluble membrane from Bacteroides gingivalis // Oral Microbiol. Immunol. 1990. V. 5. P. 1-7.

244. Dobroussina S.A., Velicova T.D., Rybalchenko O.V. A study on the Biostability ofParylene-Coated Paper//Restaurator. 1996. V. 17. P. 75-85.

245. Dorward D. W., Garon C. F. DNA-binding proteins in cells and membrane blends of Neisseria gonorrhoeae//J. Bacteriol. 1989.V. 171. P. 4196-4201.

246. Druker D.B., Wittaker D. K. Microstructure of colonies of red-shaped bacteria//J. Bacteriol. 1971. V. 108. P. 515-526.

247. Dubnau D., Hahn J., Roggiani M. e. a. Two-component regulators and genetic competence in Bacillus subtilis II Res. Microbiol. 1994. V. 145. P. 403411.

248. Dupont R. Ryan Fundamentals of bioventing applied to fuel contaminated sites // Environ. Progr. 1993. V. 12. № 1. P. 45-53.

249. De Castro Aurora F., Ehrlich H.L. Reduction of iron oxide minerals by a marine Bacillus //J. Microbiol. Serol. 1970. V. 36. № 3. P. 317-327.

250. Eberhard A., Burelingame A.L., Eberhard C. e. a. Structural Identification of autoinductor of Photobacterium fischeri // Biochemistry. 1981. V. 20. P. 24442449.

251. Eisenberg P. Uber spezifische Adsorption von Bakterien // Zblt. Bact., Parazsitens, Infektionskr. und Hyg. 1918. Bd 1. S. 81.

252. Felix R., Fleisch H. The role of matrix vesicles in nucleation // Fed. Proc. 1976. V. 35. P. 169-171.

253. Flieder F. La consrevation des documents graphiques. Paris: Ed. Eyrolles, 1969. 288 p.

254. Forsberg C. W., Beveridge Y. J., Hellstorm A. Cellulase and xynalase release from Bacteroides succinogenes and its importanse in the rumen environment//Appl. Microbiol. 1981. V. 42. P. 886-896.

255. Fox Jeffry L. Confronting doubtful oil clean-ap data // Biotechnology. 1991.V.9. № l.C. 14-18.

256. Franc J. F. Mechanism of Pathogen Inhibition by Lactic Acid Bacteria // 7 Intern. Sem. Lactic Acid Bacteria and Human Health. Seoul, Republic of Korea, 1991. P. 23.

257. Fredrickson A. G. Behavior of mixed cultures of microorganisms // Ann. Rev. Microbiol. 1977. V. 31. P. 63-87.

258. Frei W., Erismann H. Beitrag zur Theorie der Bacterien Filtration // Zblt. Bact., Parazsitens, Infektionskr. und Hyg. 1922. Bd 1. S. 88.

259. Freter R. Interdependence of mechanisms that control bacteria colonization of the large intestinale // Microecol. and Therapy. 1984. V. 14. P. 378-382.

260. Fuller R. The Importance of Epithelial Attachment in colonization of the Gut by Bacteria // Eur. J. Chemotherapy and Antibiotics. 1982. V. 2. P. 929-938.

261. Gabezalf C.B. Biodegradation of petroleum refinery sludge // 6 Int. Symp. Microb. Ecol. (ISME-6). Barselona, 1992. P. 220.

262. Gallo F. II biodeterioramento di libri e documenti.-Iccrom: Centro di studi per la conservazione della carta, 1992. 128 p.

263. Gankema H., Wensink J., Guinee P. A. e.a. Some characteristics of the membrane material released by growing enterotoxigenic Escherichia coli // Infect. Immun. 1980. V. 29. P. 704-713.

264. Gibson G. R., Wang X. Regulatory effects of bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria // J. Appl. Bacteriol. 1994. V. 77. № 4. P. 1128-1131.

265. Gilbert P., Collier P. J., Brown M. R. Influence of growth rate on susceptibility to antimicrobial agents: biofims, cell cycle, dormancy and stringent response // Antimicrobial Agents and Chemother. 1990. V. 34. P. 1865-1868.

266. Givskov M., Eberl L., Molle S. e.a. Responses to nutrient starvation in Pseudomonas putida KT2442: analysis of general cross-protection, cell shape and macromolecular content //J. bacterial. 1994. V. 176. P. 7-14.

267. Glauert A.M. Factors influencing the appearance of biologic specimens in negatively stained preparations//Lab. Investig. 1965.V. 14. P. 1060-1079.

268. Goodell E.W., Schavvrs U. Release of cell wall peptides into culture medium by exponentially growing Escherichia coli // J. Bacterid. 1985. V. 162. P. 391397.

269. Gorbushina A.A., Krumbein W.E., Hamman C.H. e. a. Role of black fungi in colour change and biodeterioration of antique marbles // Geomicrobiol. Jom. 1993. V. 11. P. 205-222.

270. Gorbushina A.A., Krumbein W.E., Vlasov D. Yu. The fungal microcosm of Mediterranean monuments and sites past, present and future // IV Int. Symp. on the Conservation of monuments in the Mediterranean Basin. Rhodes, 1997. P. 261-270.

271. Grdina D.J., Meistrich M.L., Withers H.R. Separation of clonogenic cells from stationary phase cultures by density gradient centrifugation // Exp. Cell. Res. 1974. V. 85. P. 15-22.

272. Greenberg E. P., Winans S. C., Fuqua W. C. Quorum sensing by bacteria // Ann. Rev. Microbiol. 1996. V. 50. P. 727-751.

273. Grenier D., Mayrand D. Functional characteriztion of extracellular vesicles produced by Bacteroidesgingivalis//Infect. Immun.1987. V. 55. P. Ill- 117.

274. Griffin P.S., Indictor N., Koestler R.J. The biodeterioration of stone: a review of deterioration mechanisms, conservation case histories, and treatment // Int. Biodeterioration, 1991. V. 28. P. 187-208.

275. Grossman A.D., Ericson J. W., Gross C.A. The htpR gene product of E. coli is a sigma-factor for heat shock promoters // Cell.1984. V. 38. P. 383-390.

276. Hammon D. F., Lillard S. E., Stevens R. H. A bactericin of Actinobacillus actinomycetemcomitans // Infect. Immun. 1987. V. 55. № 3. P. 533-539.

277. Havarstein L. S., Holo H., Nes I. F. The leader peptide of colicin V shares consensus sequences with leader peptides that are common among peptide bacteriocins produced by gram- positive bacteria // Microbiology. 1994. V. 140. 2383-2389.

278. Hayat M.A. Principles and techniques of electron microscopy: Biological applications. V.l. № 1. New York: Van Nostrand Reinhold. Co., 1974. P. 3-51.

279. Hayes J., Cundy K. R., Fernan des P. В., Hoober K. J. Purification and characterization of a bacterocin from Bacteroides fragilis // J. Bacteriol. 1983. V. 155. №3. P. 1799-1805.

280. Hentges D. The protective function of the indignous intestinal flora // Pediatr. Infect. Dis. 1986. V. 5. Suppl. 1. P. 47-56.

281. Hill M. J., Hudson M. J., Borriello S. P. Factors controlling the intestinal flora // Eur. J. Chemother. Antibiot. 1982. V. 2. P. 51-59.

282. Hill R. R. Digestion of mucin polysaccharides in vitro by bacteria isolated from the rabbit cecum // Current Microbiol. 1986. V. 14. P. 1114-1122.

283. Hodge H.M., Metcalfe S.N. Floculation on bacteria by hydrofillic colloids // J. Bacteriol. 1958. V. 75. № 3. P. 258-264.

284. Hoskins L. C. The Basic symbiotic unit: a concept of community organisation in enteric microbial ecosystems // Abstr. Ann. Meeting of SOMED. Boston, USA, 1993. P. 31-32.

285. Jack R.W., Wood B. J., Berry D. R. Evidence for the involvement of thiocyanate in inhibition of Candida albicans by Lactobacillus acidophillus // Microbios. 1990. V. 62. P. 1347-1356.

286. Jack R.W., Tagg J.R., Ray B. Bacteriocins of gram-positive bacteria // Microbiol. Rev. 1995. № 59. P. 171-200.

287. Kadurugamuwa J. L., Beveridge T. J. Bacteriolytic effect of membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa on the other Bacteria including pathogens: Conceptually new antibiotics // J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 27672774.

288. Kaiser D., Losiek R. How and why bacteria talk to each other// Cell. 1993. V. 79. P. 873-885.

289. Kampfer P. Microbiological characterization of a fuel-oil contaminated site including numerical identification of heterotrophic water and soil bacteria // Microbiol. Ecol. 1991. V. 21. № 3. P. 227-251.

290. Kanatani K., Oshimura M., Sano K. Isolation and characterization of acidocin A and of the bacteriocin gene from Lactobacillus acidophilus // Appl. Environm. Microbiol. 1995. V. 61. № 3. 1061-1067.

291. Kaplan H. В., Plamann L. A. Myxococcus xanthus cell density-sensing system required for multicellular development // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 139. P. 89-95.

292. Kaprelyants A. S., Kell D. B. Do bacteria need to communicate with each other for growth? // Trends Microbiol. 1996. V. 4. P. 237-241.

293. Karjalainen Т., Ramaldes M., Leblong F., Bourlioux P. Isolation of sialidase genes from C. indolis and C. Cocleatum // Abstr. XXI Intern. Congress Microb. Ecol. Disease. Paris, 1996. P. 91.

294. Kaun В., Rohloff J. Microbiologische In-situ-Bodensanierung // Chem.-Techn. (BRD). 1989. V. 18. № 3. P. 86, 88-89.

295. Kerry E. Microorganisms colonizing plants and soil subjected to different degrees of human activity, including petroleum contamination in the vestfold Hills and MacRobertson Land Antarctica // Polar Biol. 1990. V. 10. № 6. P. 423-430.

296. Ketyi I. Resistance of Escherichia coli to some antibiotics and biocides in the intestinal biofilm//Acta Microbiol. Hung. 1991. V. 38. P. 33-41.

297. Kevin B. Biotechnology and the United States Depar. of Agrical. // Ecol. Law Quart. 1990. V. 17. №2. P. 413-446.

298. Kimura В., Murakami M., Fujisawa H. Utilization of hydrocarbonsubstrates by heavy oil-degrading bacteria isolated from the sea water of oil-polluted Bisan Seto // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1990. V. 56. № 5. P. 771-776.

299. Klaenhammer T. R. Bactericins of lactic acid bacteria // Biochimie. 1988. V. 70. P. 928-937.

300. Klebanoff S. J., Coombs R. W. Viricidal effect of Lactobacillus acidophilus on human immunodeficiency virus type I: possible role in heterosexual transmission//J. Exp. Med. 1991. V. 174. № 1. P. 69-77.

301. Kleerebezem M., Quadri L.E., Kuipers O.P. e. a. Quorum sensing by peptide pheromones and two-component signal-transduction systems in Gram-positive bacteria // Molecular Microbiology. 1997. V. 24. № 5. P. 895-904.

302. Kobayasi Т., Saboe-Hansen G. Ruthenium red staining of ultra-thin sections of human mast-cell granules //J. Microsc. 1971. V. 93. P. 55-60.

303. Koopman J. P., Kennis H. M., Lankhorst A. e. a. A Comparison of two media for culturing the anaerobic cecal microflora of mice // Z .Versuchstierkd 1987.Bd 29. S. 768-775.

304. Krishnamurti K., Soman S.V. Studies in the adsorption of bacteria. Part 1. Adsorption of B. subtilis and B. coli by caolin and charcoal // Proc. Indian Academy Sci. 1951. V. 34. Section B. № 2. P. 81-91.

305. Kroos L., Kuspa A., Kaiser D. Defects in Fruiting Body Development Caused by Tn5 lac Insertions in Myxococcus xanthus // J. Bacteriol. 1990. V. 172. № i.p. 484-487.

306. Krumbein W.E., Ursi C. Microbiological impacts on the cultural heritage with special reference to rock materials // La Pietra Dei Monumenti Nel Suo Ambiente Fisico. 1996. P. 151-178.

307. Kruth H.S., Avigan J., Gamble W. Vangham M. Effect of cell density on binding and uptake of low density lipoprotein by human fibroblasts // J. Cell Biol. 1979. V. 83. № 3. P. 588-594.

308. Kuhn I., Katouli M., Mollby R. Biomedical Fingerprinting as a tool study the diversity, stability and metabolic capacity of intestinal microflora // Abatr. Ann. meeting SOMED. Boston, USA, 1993. P. 57.

309. Lacey R. W. Sensitivity of staphylococci to fatty acids: novel inactivation of linolenic acid by serum //J. Med. Microbiol. 1981. V. 14. № 1. P. 99-112.

310. Levingston R.G., Koening C.C., Lincer J.L. e. a. Synergism and modifying effects interacting factors in bioassay and fild experiments // Proc. Workshop on marine Bioassay, Marine Technol. Soc. Washington, 1974. P. 137-139.

311. Lewus С. В., Montville T. J. Detection of bacteriocins produced by lactic acid bacteria//J. Microbiol. Methods. 1991. V. 13. P. 2203-2213.

312. Li Z., Clarke A. J., Beveridge T. J. A major autolysin of Pseudomonas aeruginosa: subcellular distribution role in cell growth and division, and secretion in surfacen membrane vesicles // J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 24792488.

313. Li Z., Clarke A. J., Beveridge T. J. Gram-negative bacteria produce membrane vesicles which are capable of killing other bacteria // J. Bacteriol. 1998. V. 180. № 20. P. 5478-5483.

314. Link-Amster H., Rochat F., Saudan K. Y. e. a. Modulation of a specific humoral immune response and changes in intestinal flora mediated through fermented milk intake // FEMS Immunol. Med. microbiol. 1994. V. 10. № 1. P. 321-330.

315. Looms W. F. Dictyostellium disscoideum: a development system. New York, 1975.

316. Losick R., Kaiser D. Why and how bacteria communicate // Sci. Amer. 1997. February. P. 68-73.

317. Luckey T. D. Overview of gastrointestinal microecology // Die Nahrung. 1987. Bd 31. № 5-6. S. 1114-1123.

318. Lunsdorf H., Brummer I., Timmis K. N., Wagner-Dobler I. Metal selectivity of in situ microcolonies on biofilms of the Elbe river // J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 31-40.

319. Mallot R.J., Lo R.Y.C. Studies on the production of quorum-sensing signal molecules in Mannheimia haemolytica A1 and other Pasteurellaceae // FEMS Microbiol. Let. 2002. V. 206. P. 25-30.

320. Mandal L.N. Transformation of iron and manganese in water-logged rice soil //Soil Sci. 1961. V. 91. №2. P. 121-126.

321. Manual of Clinical Microbiology. Fifth Edition / Ed. by A. Balows. Washington: American Society for Microbiology, 1991. 1364 p.

322. Marshall K.C. Interaction between colloidal montmorillonite and cells of Rhizobium species with different iongenic surfaces // Biochem. Biophys. Acta. 1968. V. 156. № l.P. 179-186.

323. Marshall K.C. The nature of bacterium-cley interaction and its significance in survival of (Rhizobium) under arid conditions // 9-th. Inter. Congr. Soil Sci. Australia: Trans. Adelaide. 1968. V. 3. P. 275-280.

324. Masayuki T. Production of bifidobacterial Culture by Fermentation with filtration and Effect of Eddition of the Fermented Metter on Quality of Meat Proceccing Products // Shokuniku ni Kansuru Josei Kenkyu Chosa Seika Hokokusho. 1994. V.12. P. 429-438.

325. Matin A. Molecular analysis of the starvation stress in Escherichia coli // FEMS Microbiol. Ecol. 1990. V. 72. P. 185-196.

326. Mayrand D., Grenier D. Biological activities of outer membrane vesicles // Can. J. Microbiol. 1989. V. 35. P. 607-613.

327. McLennan N., Masters M. GroE is vital for cell-wall synthesis // Nature. 1998. V. 392. P. 139.

328. McGroarty J. A., Reid G. Detection of lactobacillus substance that inhibits Escherichia coli // Can. J. Microbiol. 1988. V. 34. № 3. P. 344-361.

329. Mehta A.M., Peter K.A., Dave P.J. Purification and properties of the inhibitory protein isolated from Lactobacillus acidophilus // Microbios. 1983. V. 38. №. 152. P. 73-81.

330. Midtvedt Т., Carlstedt-Duke В., Hoverstadt Т. e. a. Establishment of biochemically active intestinal ecosystem in exgermfree rats // Appl. Environm. Microbiol. 1987. V. 53. № 12. P. 2866-2871.

331. Miller M. В., Bassler B. L. Quorum sensing in bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 2001. № 55. P. 165-199.

332. Milles Gunter M. Microbiologische Methoden der Detoxifizierung von Abwassern und kontaminierten Boden // Seifen-Ole-Fette-Wachse. 1991. V. 117. № 19. P. 760-763.

333. Moog G. Haute und Felle zur Pergamentherschtellung // Pergament. Sigmaringen, 1991. 480 S.

334. Moran A., Upton M. A comparative study of the rod and coccoid forms of Campylobacter jejuni ATCC 29428 // J. Appl. Bacteriol. 1986. V. 60. P. 103110.

335. More G. Oil pollution at sea- the EEC plan // Fire Int. 1993. V. 17. № 138. C. 38-39.

336. Morris G., Sherbeeny M., Patton C., e. a. Comparison of four hippurate hydrolysis methods for identification of thermophilic Campylobacter sp. // J. Clin. Microbiol. 1985. V, 22. № 5. P. 714-718.

337. Motomura S. Relationship between ferrous iron formation and nitrogen metabolism in soil // Soil Sci. Plant Natur. 1962. V. 8. № 5. P. 177-185.

338. Muller G., Forster I. Einige methodische versuche zum problem der Nahrstoff-freisetzung aus mineralien durch bodenpilze // Zblt. Bact., Parazsitens, Infektionskr. und Hyg. 1961. Bd. 114. S. 2.

339. Namba Y., Hidaka Y., Taki K., Movimoto T. Effect of oral administration of Lysozyme or digested bacterial cell wall on immunostimulation in guinea pigs // Infect. Immun. 1981. V. 31. № 2. P. 527-536.

340. NATO ASI Series, Series H: Cell Biology. Lactic Acid Bacteria. Current Advances in Metabolism, Genetics and Applications V. 98. / Ed. F. Bozoglu, B. Ray. Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag, 1996. 303 p.

341. Neidhardt F. С., Van Bogelen R., Lau E. T. Molecular cloning and expression of a gene that controls the hight-temperature regulon of Escherichia coli//J. Bacteriol. 1983. V. 153. P. 597-603.

342. Nicoli J. R., Rainband P. In vivo and in vitro antagonistic effect against Clostridium perfringes of a Peptostreptococcus sp. from human intestinal flora in mice // Abstracts 10 Symp. Gnotobiol. Leiden, 1990. P. 51.

343. Nowotny A., Behling U. H., Hammond B. e. a. Release of toxic microvesicles by Actinobacillus actinomycetemcomintans // Infect. Immun. 1982. V. 37. P. 151-154.

344. Oleskin A.V., Samuilov V.D. Technical bioenergetics and ecosystem biotechnology//J. Basic Microbiol. 1992. V. 32. P. 129 -149.

345. Oppenheimer C., Muster M. Solution of quartz and precipitation of dolomite in seawater during photosynthesis and respiration // Zblt. Allg. Microbiol. 1965. Bd.5. S. 48-51.

346. O'Toole G., Kaplan H., Kalter R. Biofilm formation as microbial development//Annu. Rev. Microbiol. 2000. № 54. P. 49-79.

347. Ottow J.C.G. Distribution and differentiation of iron-reducing bacteria in gley soil // Zblt. Bact., Parazsitens, Infektionskr. und Hyg. 1969. Bd 123. S. 600-615.

348. Ottow J.C.G. Evaluation of iron-reducing bacteria in soil and the physiological mechanism of iron redution Aerobacter aerogenes // Zblt. Allg. Microbiol. 1968. Bd 8. S. 441-443.

349. Peele T.C. Adsorption of bacteria by soil // Cornell. Univ. Agricult. Exp. Sta. 1936. Mem. 197.

350. Piggot P., Coote J.G. Genetic aspects of bacterial endospore formation // Bacteriol. Rev. 1976. V. 40. P. 908-962.

351. Pirt S.J. Principles of Microbe and sell cultivations. London: Blackwell Sci Publ Oxford, 1975.271 p.

352. Que J., Casey S. W., Henges D. Factors responsible for increased susceptibility of mice to intestinal colonization after treatment with streptomycin // Infect. Immun. 1986. V. 53. P. 2237-2244.

353. Ramare F., Dabard J., M. Ladire e. a. Colonisation resistance against Clostridium perfringes: involvement of an antimicrobial subatances produced in vivo // Abstr. XXI Intern. Congress Microb. Ecol. Disease. Paris, 1996. P. 72.

354. Reichenbach H. Myxobacteria: development and cell interaction // Ed. E. Rosenberg. New York; Berlin; Heidelberg; Tokyo: Springer-Verlag, 1984. 2751. P

355. Renondo-Lopez V., Cook R. L, Sobel J. D. Emerging Role of Lactobacilli in the Control and Maintaince of the vaginal Bacterial Microflora // Rev. Infect. Dis. 1990. V. 12. № 5. p. 901-907.

356. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy//J. Cell Biol. 1963.V. 17. № 1. P. 208-217.

357. Ribeiro M.M., Moureaux C., Mussi S.A. Action des microorganismes sur Alteration d'une roche basique // Cah. ORSTOM Pedol. 1973. V. 11. № 1. P. 27-31.

358. Roberts J.L. Reduction of ferric hydroxide by strains of Bacillus polymyxa // Soil. Sci. 1947. V. 63. № 2. P. 135-140.

359. Robertson A.D.J., Grutsch J.F. Aggregation in Dictiostelium discoideum. // Cell. 1981. V. 24. № 3. P. 603-611.

360. Rothfield L., Pearlman-Kothens M. Synthesis and assembly of bacterial membrane components //J. Mol. Biol. 1969. V. 44. P. 477-492.

361. Rusch V. С. Das Konzept Symbiose: Eine Ubersicht uber die Terminologie zur Beschreibung von Lebensgemeinschaften ungleichnamiger Organismen // Microecol. Therapy. 1989. Bd 19. S. 107-112.

362. Sasaki S. Normal bacterial flora and host // J. Germfree. 1979. V. 9. № 1. P. 69-75.

363. Savage D. C. Overview of the association of microbes with epithelial surfaces // Microecol. and Therapy. 1984. V. 14. P. 1327-1336.

364. Savage D. C. The normal human microflora composition: The regulatory and protective role of thenormal flora / Eds. R. Grubb e. a. New York: M-Stocton Press, 1989. 459 P.

365. Scott D. Antimicrobial enzymes // Food Biotechnology. 1988/89. V. 2. № 2. P. 305-312.

366. Shahni К. M., Vakil J. R., Kilara A. Natural antibiotic activity of Lactobacillus acidophilus and L. bulgaricus. 1. Cultural condition for the production of antibiotics // Cultured Dairy Prod. 1976. V. 11. P. 628-637.

367. Shapiro J. A. Scaning electron microscope study of Pseudomonas putida colonies//J. Bacteriol. 1985. V. 164. P. II7I-II8I.

368. Shenderov B. A., Manvelova M. A., Lyannaya A. M. e. a. Microecological aspects of functional food and some prospects in Russia // Microecol. and Therapy. 1995. V. 25. P. 929-935.

369. Sheridan J. W., Bishop C. J., Simmons R. J. Biophysical and morphological correlates of kinetic change and death in a starved human melanoma cell line // J. Cell Sci. 1981. V. 49. P. 119-137.

370. Shimkets L. J. Intercellular signaling during fruiting-body development of Myxococcus xanthus // Annu. Rev. Microbiol. 1999. V. 53. P. 525-549.

371. Shingler V. Signal sensing by cr54-dependent regulators: derepression as a control mechanism//Molecular Microbiology. 1996. V. 19. N 3. P. 409-416.

372. Simon G. L., Gorbach S. L. Intestinal Flora in Health and Disease // Gastroenterology. 1984. V. 86. № 4. P. 483-490.

373. Snel J., Heidt P.J. Indigenous segmented filamentous bacteria increase colonization resistance to enteropathogenic bacteria by promoting intestinal transit// Abstr. XII Intern. Sympos. Gnotobiology. Honolulu, 1996. P. 71.

374. Soczo E.R. Forschungsresultate auf dem Gebiet der biologischen Bodenreinigung in den Niderlanden // Mull und Abfall. 1988. Bd. 20. № 4. S. 163-170.

375. Spurr A.R. A low-viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy//J. Ultrastructure Res. 1969. V. 26. № 1. P. 31-43.

376. Story S.P. e. a. Hydrocarbon-degrading bacteris isolated from hydrocarbon contaminated sites at Johnston Atoll // J. Ariz-Nev. Acad. Sci. 1993. 28 Proc.Suppl. P. 19.

377. Su W. J., Waechter M. J., Dolegeal M. e. a. Research of the mechanisms of colonisation resistance to Clostridium difficile by using an experimental animal model // Ann. 1st. Super. Sanita. 1986. V. 22. № 2. P. 430-435.

378. Shuangjiang L. Environmental bioremediation and biodegradation // China Environ. Sci. 1992. V.12. № 6. P. 405-409.

379. Sutter V. L. Anaerobic as normal oral flora // Rev. Infect. Dis. 1984. V. 6. Suppl. 1. P. 41-50.

380. Szewzyk R., Henziksoon H. Characteristics of Lactobacillus sp. Anthagonistic effect against patogenic Escherichia coli // Microbiol. 1989. V. 12.№ l.P. 68.

381. Tagg J.R., Daijani A.S., Wannahar L.M. Bacteriocins of Gram-positiv bacteria // Bacteriol. 1976. V. 40. P. 722-756.

382. Tannock G. W. The Normal Microflora: new concepts in Health Promotion //Microbiological Sciences. 1988. V. 5. P. 141-145.

383. Tasume S., Yamaoka Т., Hashimoto K., Sasaki S. Intestinal flora and bile acid metabo: Quantative analysis of bile acid metabolites in each step of rejection of shigella organisms // J. Germfree. 1978. V.8. № 2. P. 828-836.

384. Tayler W.E., Straus D.B., Grossman A.D. e. a. Transcription from a heat-inducible promotor caused heat-shock regulation of the sigma-subunit of Escherichia coli RNA polymerase//Cell. 1984. V. 38. P. 371-381.

385. Tetz V. V., Rybalchenko О. V. , Savkova G. A. Morphophysiologic characteristics of Escherichia coli and Shigella flexneri 2a carrying the htpR15 gene//J. Basic. Microbiol. 1993. V. 33. P. 131-139.

386. Tetz V. V., Rybalchenko О. V. , Savkova G. A. Ultrastructural features of microbial colony organization //J. Basic. Microbiol. 1990. V. 30. P. 597-607.

387. Tetz V. V., Rybalchenko О. V., Savkova G. A. Ultrastructure of the surface film of bacterial colonies//J. Gen. Microbiol. 1993. V. 139. P. 855-858.

388. Tetz V. V., Rybalchenko О. V. Ultrastructure of colony-like communities of bacteria//APMIS. 1997. V. 105. P.99-107.

389. Tetz V. V., Rybalchenko О. V., Savkova G. A. Surface films of Escherichia coli colonies //FEMS Microbiol. Letters. 1993. V. 107. P. 231-240.

390. Tetz V. V. Colony-like communities of bacteria // Microbios. 1994. V. 80. P. 63-65.

391. Todd W. J., Wray G. P., Hitchcock P. J. Arrangement of pili in colonues of Neisseria gonorrhoeae// J. Bacterid. 1984. V. 159. P. 312-320.

392. Torella F., Morita R.Y. Microcultural study of bacterial size changes and microcolony and ultramicrocolony formation by heterotrophic bacteria in seawater//Appl. Environ. Microbiol. 1981. V. 41. P. 518-527.

393. Toshio M., Toshihiro Y., Akihiro M. e. a. Antimicrobial Activities of Organic Acids Determined by Minimum inhibitory concentrations at different ph ranged from 4.0 to 7.0 // J. Jap. Soc. Food Sci. Technol. 1994. V. 41. № 10. P. 2031-2040.

394. Tylly К., Erickson J., Sharma S., Georgopoulos C. Heat shock regulatory gene rpoH mRNA level increase after heat shock in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1986. V. 168. P.l 155-1158.

395. Ushijima Т., Seto A. Selected faecal bacteria and nutrients essential for antagonism of Salmonella typhimurium in anaerobic continuous flow cultures // J. Med. Microbiol. 1991. V. 35. P. 1705-1711.

396. Van der Waaij D. The Immunoregulation of the Intestinal Flora: experimental investigation on the development and the composition of the microflora in normal and thymusless mice // Microecol. and Therapy. 1984. V. 14. P. 803-814.

397. Van Saene H. K., Stoutenbeek P., Geitz J. e. a. Effect of Amoxicillin on colonization resistance in human volunteers // Microbiol. Ecol. Health Diseases. 1988. V. l.P. 99-110.

398. Van Winkelhoff A. J., Kippuw N., de Graaff J. Cross-inhibition between black-pigmented Bacteroides species //J. Dent. Res. 1987. V. 66. P. 1169-1175.

399. Vannucchi S., Chiarugi V. P. Surface exposure of glycosaminoglycans in restyng, growing and virus transformed 3T3 cells // J. Cell Physiol. 1977. V. 90. P. 503-510.

400. Vo-Dinn T. Multicomponent analyses by synchronase-luminescense spectrometry // Anal. Chem. 1978. V.50. № 3. P. 396-401.

401. Voellmy R. The heat shock genes: a family of highly conserved genes with a superbly complex expression pattern//В ioEssays. 1987. V. l.P. 213-217.

402. Wai S.N., Mizunoe Y., Yoshida S. How Vibrio cholerae survive during starvation//FEMS Microbiology Letters. 1999. V. 180. P. 123-131.

403. Watson S.P., Clement M.O., Foster S.J. Characterization of the starvation-survival response of Staphylococcus aureus // J. Bacteriol. 1998. V.180. P. 1750-1758.

404. Wilheim M., Lee D., Rosenblatt J. Bacterial interference by anaerobes isolated from human faecal flora // Microecol. and Therapy. 1985. V. 15. P. 1100-1111.

405. Williams G. D., Holt S. C. Characteristics of the outer membranes of selected oral Bacteroides species // Can. J. Microbiol. 1985. V. 31. P. 238-250.

406. Wilson К. H., Perini F. Role of competition for nutrients in supression of to Clostridium difficile by the colonic microflora // Infect. Immun. 1988. V. 56. № 10. P. 623-629.

407. Wilson M. J., Wade W. G., Weightman A. J. The analysis of previously uncharacterised oral bacteria by 16S ribosomal RNA sequencing // Microecol. and Therapy. 1995. V. 25. P. 2403-2415.

408. Wispelwey В., Hansen E. J., Sheld W. M. Haemophilus influenzae outer membrane vesicle-introduced blood-brain barrier permeability during experimental meningitis // Infect. Immun. 1989. V. 57. P. 2559-2562.

409. Wollenzien U. Role of black fungi in colour change and biodeterioration of antique marbles // Geomicrobiol. Jom. 1993. V. 11. P. 205-222.

410. Wosten M. M. S. M. Eubacterial sigma-factors//FEMS Microbiology Reviews. 1998. V .22. P. 127-150.

411. Wurdemann S. e. a. Hydrocarbon biodegradation in sediments and soils. A systematic examination of physical and chemical conditions. Part 1. Grain size, surface area and soil type // Kohll-Erdyas-Petrochem. 1990. V. 43. № 6.";P. 217224.

412. Yen A., Fried J., Kitahara T. The kinetic significanse of sell size. I. Variation of cell cycle parameters with size measured at mitosis // Exp. Ceel. Res. 1975. V. 95. P. 295-302.

413. Zheng H.Y., Alcorn Т. M., Cohen M.S. Effects of H202 production lactobacilli on Neisseria gonorrhoeae growth and catalase activity // J. Infect. Dis. 1994. V. 170. № 5. P. 2013-2021.

414. Zhou L., Srisatjaluk R., Justus D. E., Doyle R. J. On the origin of membrane vesicles in Gram-negative bacteria // FEMS Microbiol. Let. 1998. V. 163. P. 223-227.

Информация о работе

Рыбальченко, Оксана Владимировна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2003
ВАК 03.00.23

Диссертация

Морфо-физиологические аспекты взаимодействий микроорганизмов в микробных сообществах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы