Молекулярные механизмы регуляции транскрипции и копирования ДНК эукариот при участии стероидных гормонов и аполипопротеинов А-I и Е

Гимаутдинова, Ольга Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы регуляции транскрипции и копирования ДНК эукариот при участии стероидных гормонов и аполипопротеинов А-I и Е
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы регуляции транскрипции и копирования ДНК эукариот при участии стероидных гормонов и аполипопротеинов А-I и Е"

На правах рукописи

Гимаутдинова Ольга Ивановна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ И КОПИРОВАНИЯ ДНК ЭУКАРИОТ ПРИ УЧАСТИИ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ И АПОЛИПОПРОТЕИНОВ А-1 и Е

03 00 04 - биохимия 03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск - 2007

003061373

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН, г Новосибирск

Научный консультант:

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Панин Лев Евгеньевич

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Беклемишев Анатолий Борисович

доктор биологических наук, профессор

Гуляева Людмила Федоровна

доктор медицинских наук, профессор

Некрасова Марина Федоровна

Ведущая организация:

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г Новосибирск

Защита диссертации состоится « » С^ЛиГф-Р 2007 г в /О часов на заседании диссертационного совета Д 001 034 01 в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу 630117, г Новосибирск, ул Академика Тимакова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН

Автореферат разослан «_»_2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Г.С. Русских

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Гормональная регуляция экспрессии генов привлекает внимание ученых уже многие десятилетия Это связано с той огромной ролью гормонов, которую они играют в регуляции метаболизма в органах-мишенях, изменяя их функцию в необходимом для организма направлении Адаптивные свойства гормонов, как правило, реализуются через взаимодействие с геномом клетки, приводя к усилению экспрессии или, напротив, к супрессии отдельных генов Однако молекулярные механизмы этого взаимодействия во многих случаях остаются неясными Достаточно полно изучены молекулярные механизмы индукции ключевых ферментов глюконеогенеза под влиянием глюкокортикоидов Они связаны с проникновением гормона в клетку, образованием комплекса с цитозольным рецептором, транслокацией последнего в ядро, где он взаимодействует с определенным акцепторным участком ДНК как транскрипционный фактор, приводя к экспрессии соответствующих генов (Munck А , and Foley R , 1979, Мертвецов Н П , 1990, Mangelsford D J et al, 1995) О сайтах связывания подобных транскрипционных факторов с ДНК имеется довольно обширная информация (Yamamoto К К et al, 1988, Foulkes NS et al, 1992, Quandt К et al, 1995) Аналогичные механизмы действия на геном клеток органов-мишеней рассматриваются в отношении андрогенов (Davies Р and Rushmere NK, 1990, Foulkes NS et al, 1992), эстрогенов (Cavailles V et al, 1995) и других стероидных гормонов Участие стероидных и других гормонов в образовании сложных комплексов гормон-рецептор-ДНК давно является предметом пристального внимания биохимиков (Dalman F С , 1990, Меркулова Т И и др , 1997, Libri V et al, 2004) Но молекулярные механизмы взаимодействия гормон-рецепторных комплексов с ДНК недостаточно изучены

В Институте биохимии СО РАМН было открыто явление стимуляции резидентными макрофагами биосинтеза белка в паренхимных клетках органов и тканей в процессе регенерации (Панин Л Е , Усынин И Ф , Харьковский А В , 1987, 1994, 1997) Показано, что роль переносчиков стероидных гормонов в организме могут играть липопротеины различных классов ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП (Панин Л Е и др, 1992) В липопротеинах гормоны связаны с белком Таким белком в ЛПВП является аполипопротеин A-I (апоА-I) Поглощая продукты деградации клеток, макрофаги кооперативно захватывают ЛПВП и стероидные гормоны (Панин ЛЕ и др, 1994) В макрофаге происходит дезинтеграция ЛПВП, освобождение аполипопротеина A-I и восстановление стероидных гормонов редуктазами

Тетрагидропроизводные гормонов образуют комплекс с апоА-1, который сначала попадает в интерстициальное пространство, а затем в ядра соматических клеток, где взаимодействует с ДНК (Панин JI Е и др, 1996, Panin LE et al, 1998, 2000) Показано присутствие аполипопротеинов A-I, В и Е в ядрах гепатоцитов и других клеток in vivo (Панин JI Е, Русских Г С, Поляков JI М, 2000), а также образование и стехиометрия комплексов стероидный гормон-аполипопротеин A-I in vitro (Биушкина Н Г и др , 1992)

Молекулярные механизмы взаимодействия стероидных гормонов, аполипопротеинов A-I и Е, их комплексов с ДНК, изменение вторичной структуры ДНК, ее копирование и активация транскрипции впервые подробно изучены в данной работе Актуальность нашего исследования связана не только с расширением представлений об участии стероидных гормонов в комплексе с апоА-I в регуляции экспрессии генов, но и с более глубоким пониманием таких фундаментальных явлений, как процессы внутриклеточной регенерации и пролиферации клеток Цель и задачи исследования.

Целью работы являлось изучение воздействия стероидных гормонов, их метаболитов и аполипопротеинов A-I и Е на структуру эукариотической ДНК, копирование ДНК и транскрипцию генов

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи

1) Исследовать молекулярные механизмы взаимодействия стероидных гормонов, аполипопротеинов A-I и Е а также комплексов стероид-аполипопротеин с ДНК

2) Изучить воздействие кортизола, тетрагидрокортизола, андростерона, дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростерон-сульфата и холестерина на структуру ДНК в отсутствии и в присутствии апоА-I и апоЕ

3) Определить количественные характеристики связывания апоА-1, комплекса апоА-1-стероид с ДНК и изменения ее вторичной структуры Изучить функциональную роль апоА-I во взаимодействии с ДНК

4) Определить нуклеотидные последовательности, моделирующие сайты связывания комплексов апоА-1-стероид с ДНК, оценить характер и специфичность их взаимодействия Найти минимальный сайт связывания комплекса апоА-1-тетрагидрокортизол с ДНК

5) Изучить влияние комплексов апоА-1-стероид на копирование ДНК крысы и человека in vitro

6) Изучить in vitro транскрипцию ДНК с измененной под влиянием комплекса стероидный гормон-апоА-I вторичной структурой

Научная новизна работы. Разработан методический подход для обнаружения структурных изменений высокомолекулярных ДНК с использованием флуоресцентного зондирования и ферментативного анализа Этот подход применен для изучения молекулярных механизмов взаимодействия ДНК со стероидными гормонами в комплексе с аполипопротеинами (апоА-I, апоЕ) Впервые обнаружено образование однонитевых (чувствительных к нуклеазе S1) участков в результате связывания стероидных гормонов и их метаболитов (тетрагидрокортизол, андростерон, дегидроэпиандростерон, дегидроэпиандростерон-сульфат) с ДНК Число таких участков значительно увеличивается в присутствии аполипопротеина A-I, но не аполипопротеина Е Показано, что связывание холестерина -предшественника стероидных гормонов, с нативной ДНК не приводит к образованию в ней дополнительных одноцепочечных участков Показано и количественно оценено воздействие комплекса апоА-1-стероидный гормон (тетрагидрокортизол, дегидроэпиандростерон) на вторичную структуру нативной ДНК

Определена нуклеотидная специфичность и характер распределения по геному крысы одноцепочечных участков, образующихся под влиянием комплекса апоА-1-тетрагидрокортизол Впервые обнаружены нуклеотидные последовательности, регулярно распределенные по геному крысы, специфично взаимодействующие с восстановленной формой кортизола — тетрагидрокортизолом в присутствии аполипопротеина A-I На основании полученных результатов и их сопоставления с литературными данными сделан вывод, что такие последовательности играют важную роль в регуляции экспрессии генов, создавая особые «узнаваемые» матричными ферментами структуры

регуляции, ее роли в механизмах адаптации с участием макрофагов, метаболитов стероидных гормонов и аполипопротеина A-I В работе предложен и подробно изучен in vitro молекулярный механизм регуляции репликации ДНК и транскрипции генов, ключевая роль в котором принадлежит метаболитам стероидных гормонов (тетрагидрокортизол, андростерон) в комплексе с аполипопротеином A-I Найденные в геноме крысы неизвестные ранее структурные элементы и особенности их взаимодействия с ферментами в присутствии аполипопротеина A-I и стероидных гормонов дополняют современные знания о структурно-функциональной организации генома эукариот Полученные в работе результаты важны для анализа молекулярных механизмов взаимодействия в системе макрофаг — опухолевая клетка, макрофаг - лимфоцит и в некоторых других процессах иммунного ответа Выводы, вытекающие из данных работы, вносят существенный вклад в представления о сигнальных трансдукторных системах, участвующих в механизмах регенерации Полученные данные позволят найти новые решения в коррекции дегенеративно-деструктивных процессов в органах и тканях, а также при лечении онкологических и иммунных заболеваний Основные положения, выносимые на защиту.

1) Взаимодействие стероидных гормонов и метаболитов кортизола, тетрагидрокортизола, дегидроэпиандростерона, андростерона, дегидроэпиандростерон-сульфата, с нативной ДНК in vitro приводит к образованию в ней одноцепочечных участков В присутствии аполипопротеина A-I их количество существенно возрастает для стероидов тетрагидрокортизол, андростерон, дегидроэпиандростерон и дегидроэпиандростерон-сульфат Аполипопротеин Е не влияет на количество однонитевых участков в ДНК

2) Аполипопротеин A-I имеет высокое сродство как к природной ДНК, так и к синтетическим олигодезоксирибонуклеотидам разного состава

3) Связывание комплексов апоА-1-стероид (тетрагидрокортизол, дегидроэпиандростерон-сульфат) с нуклеотидными последовательностями вида (GCC/CGG)n приводит к образованию одноцепочечных (Sl-нуклеазочувствительных) участков вблизи них

4) Нуклеотидные последовательности ДНК, способные взаимодействовать с комплексом апоА-1-тетрагидрокортизол с образованием однонитевых Sl-нуклеазочувствительных участков, представлены в геноме в количестве, не меньшем, чем 2 на 100 т п н

5) Найден повторяющийся элемент генома крысы размером 5,5 т п н , способный дозозависимо связывать комплекс апоА-1-

тетрагидрокортизол с образованием одноцепочечных участков, чувствительных к нуклеазе S1

6) Синтетические олигонуклеотиды различного состава и длины связываются с апоА-I и его комплексом с тетрагидрокортизолом В образующихся аддуктах преобладают гидрофобные, а не электростатические взаимодействия

7) Минимальная нуклеотидная последовательность, связывающая комплекс апоА-1-тетрагидрокортизол в синтетических олигонуклеотидах и недоступная действию нуклеаз, представлена 13-15-мером вида 5'-ggCggCggCggT3±lN

8) Тетрагидрокортизол, но не кортизол, в небольшой степени активирует копирование ДНК, 50-кратный избыток тетрагидрокортизола подавляет копирование Комплексы апоА-1-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон) дозозависимо активируют копирование ДНК крысы и человека in vitro Значительный мольный избыток (выше 100-кратного) комплексов апоА-1-стероид полностью подавляет реакцию копирования

9) Комплекс апоА-1-тетрагидрокортизол активирует транскрипцию т vitro ДНК крысы, катализируемую РНК-полимеразами белкового экстракта ядер из клеток печени, при 20-кратном мольном избытке комплекса транскрипция ингибируется

Апробация работы н публикации. Материалы диссертации изложены в 25 работах, опубликованных в центральных российских и международных реферируемых изданиях Результаты работы были представлены на международном конгрессе "Progressive Scientific Technologies for Human Health" (Украина, Феодосия) в 2003 г, на международном симпозиуме "Molecular mechanisms of cell function regulation (Россия, Тюмень) в 2005 г, международной конференции "Neuroscience for Medicine and Psychology" (Украина, Судак) в 2006 г , на международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Россия, Москва-Дубна) в 2007 г, на ученом совете и семинарах НИИ биохимии СО РАМН

Структура и объем работы диссертация изложена на 264 страницах, включая 19 таблиц и 56 рисунков Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы Список литературных источников содержит 336 ссылок, включая 67 отечественных

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы. Тетрагидрокортизол любезно предоставлен проф Ю А Панковым НИИ ЭНЦ РАМН, Москва Дезоксирибоолигонуклеотиды CC(GCC)3 (Г1), CC(GCC)5 (ONI), комплементарные им GG(CGG)3 (Г2), GG(CGG)5 а также AnCC(GCC)3 (A3, п=3, Г1А, п=6) и комплементарные им GG(CGG)3Tn (ТЗ, п=3, Г2Т, п=6) синтезированы Е М Ивановой и Д В Пышным (ИХБиФМ СО РАН, Новосибирск) Олигонуклеотиды Tjg и АТ-богатый (ON2)

pATCTTTAACTGATGAACTTCT а также GC-богатый (ON3) pTGCCTGGAGCTGCTTGATGC синтезированы в ФГУ ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирск d[a-32P]ATP, r[a-32P]CTP, г[у-32Р]АТР с удельной радиоактивностью 1000 Ки/ммоль и шестизвенные праймеры со статистически случайной последовательностью синтезированы в ИХБиФМ СО РАН, Новосибирск ДНК фага М13 штамм mplO любезно предоставлена С Ф Орешковой (НИИ биоинженерии, ФГУ ГНЦ «Вектор») Основные методы

1) Выделение ДНК из молок лосося, из печени крысы Вистар, из лимфоцитов крови человека (здоровые добровольцы) Blin N , Stafford D W , 1976, Маниатис T , 1984, Karlmsey J et al, 1989

2) Выделение липопротеинов из крови крыс Вистар методом изоплотностного ультрацентрифугирования (Hatch F Т, Less R S, 1968)

3) Выделение аполипопротеинов A-I и Е из липопротеинов высокой плотности электрофорезом в ПААГ по Лэммли (Laemmli U К, 1970), с собственными модификациями и последующей электроэлюцией белка из геля

4) Выделение хроматина и белкового экстракта из ядер клеток печени крысы Вистар с активными ДНК- и РНК-полимеразами (Dignam J D et al, 1983)

5) Электрофорез белков, РНК и ДНК

6) Иммуноферментный анализ (Нго Т Т , Ленхофф Г М , 1988, Поляков ЛМ идр, 1991)

8) Аффинная хроматография белков и ДНК

9) Аффинная модификация белков и нуклеиновых кислот (Grineva NI and Karpova G G, 1973, Budker V G et al, 1973, Gimautdinova et al, 1981, Knorre D.G , Vlassov V V, 1989)

10) Флуоресцентное зондирование ДНК (Владимиров Ю А , Добрецов Г Е , 1980, Gambelunghe G et al, 1999, Long Yi-T et al, 2003)

11) Дот- и блот-гибридизация ДНК по Саузерну (Southern Е М , 1975)

12) Ферментативный анализ ДНК и ее продуктов с применением нуклеазы Б1, ДНКазы I, РНК-полимеразы фага Т7, РНК- и ДНК-полимераз белкового экстракта ядер клеток печени крысы, фрагмента Кленова, полинуклеотидкиназы фага Т4

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

До настоящего времени в литературе не встречалось данных о связывании апоА-1 с ДНК Поскольку предполагалось прямое воздействие этого белка на геном, было изучено взаимодействие апоА-I с ДНК, в т ч количественные характеристики их связывания Сродство апоА-1 к ДНК и олигонуклеотидам; влнянне стероидных гормонов Для определения сродства апоА-1 к ДНК использовали метод аффинной хроматографии Известно, что некоторые белки плазмы крови, например, альбумины и иммуноглобулины, имеют довольно высокое сродство к нуклеиновым кислотам (Клопе О О , ХПазэоу V V , 1989, Е Уи Яукоуа Е V, 1994)

Таблица 1 Связывание белков плазмы с ДНК, иммобилизованными на АЭ-целлюлозе_

Иммобилизованная ДНК Количество связавшегося белка, %

апоА-1 БСА IgG

ДНК крысы 40±10* 20+5 9±4

ДНК из молок лосося 25+5 18±5 10±4

*Р<0,05, п=5

ДНК крысы или ДНК из молок лосося была ковалентно связана с АЭ-целлюлозой Пропуская растворы белков через колонку с аффинным сорбентом, определяли, какая часть нанесенного белка связывается с частично ренатурированной ДНК Результаты аффинной хроматографии, приведенные в таблице 1, показывают, что апоА-1 имеет еще более высокое сродство к ДНК, чем бычий сывороточный альбумин или иммуноглобулины С ДНК связывается в 1,4-4 раза больше апоА-1, чем БСА или IgG в одинаковых условиях

Возможности метода аффинной модификации биополимеров (Grineva N1 and Karpova GG, 1973, Budker VG et al, 1973, Gimautdmova et al, 1981, Knorre DG, Vlassov VV, 1989) были применены для исследования топографии матричного центра рибосом Е coli и закономерностей взаимодействия ДНК(РНК)-олигонуклеотид или олигонуклеотид-белок С этой целью синтезировали алкилирующие 5'-производные рибоолигонуклеотидов - аналогов мРНК и комплементарно адресованные 5'-производные

дезоксирибоолигонуклеотидов по методу Мишениной Г Ф идр (1979) с собственными модификациями, используя [С14]4-(Ы-2-хлорэтил-Ы-метиламино)бензиламин, RC1 (Гимаутдинова ОИ, 1987) Алкилирующие З'-производные олигонуклеотидов были синтезированы Карповой Г Г (Будкер В Г и др, 1973) Варьируя длины 5'- и 3'-аналогов мРНК в составе специфических тройных комплексов рибосома-матрица-тРНК, изучали закономерности модификации рибосом Е coli в районе мРНК-связывающего центра (табл 2)

Таблица 2 Относительная степень алкилирования рибосомных субъединиц, рРНК и белков 3'- и 5'-[14С]-СЖ-производными моно- и олигонуклеотидов___

Относительная Относительная

Реагент Количество степень степень

реагента в модификации, модификации,

комплексе, 30S/50S рРНК/белки

моль/моль 70S субъединиц 30S

рибосом

3'- MepARCl - 0,56 0,37

3' - (Ap)7ARCl 1,1 2,3 8,0

3'- (pU)8pURCl 0,7 2,9 3,5

5'-ClR(pU)4 0,4 4,4 2,3

5'-ClR(pU)5 0,5 1,7 9,0

5'-ClR(pU)6 0,7 1,1 1,4

По специфичности и эффективности алкилирования белков в мРНК-связывающем центре рибосом, а также наиболее удобными по методу синтеза и идентификации модифицированных продуктов оказались 5'-производные олигонуклеотидов [4-(Ы-2-хлорэтил-К-метил)аминобензил]-5'-фосфамиды Из изученных методов синтеза алкшшрующих 5'-производных олигонуклеотидов выбрали метод с применением конденсирующих реагентов 2,2'-дипиридилдисульфида и трифенилфосфина, т к выход и чистота продуктов этой реакции наиболее высокие (не менее 90-95%) Вместе с результатами по другим 5'-реагентам, модифицирующим белки, это позволило впоследствии сконструировать белковое окружение мРНК-связывающего центра рибосом Е coli (Гимаутдинова О И , 1987)

Для определения характеристик связывания белка апоА-I с ДНК также применяли метод аффинной модификации С этой целью синтезировали алкилирующие 5'-производные

дезоксирибоолигонуклеотидов разного состава и длины, содержащие радиоактивную метку Р32 Зависимость модификации апоА-1 от концентрации алкилирующего реагента 2Ш-11С1, полученная из результатов одномерного электрофореза в ПААГ по Лэммли, представлена на рис 1а

Рис 1 Зависимость (а) аффинной модификации апоА-1 от концентрации алкилирующего 4-(М-2-хлорэтил-Н-метиламино)бензил-5,-фосфамида-<3(АТСТТТААСТОАТСААСТТСТ), 21 N-1101, (б) зависимость ингибирования модификации апоА-1 алкилирующим производным 2Ш-ЯС1 от избытка олигонуклеотида 2Ш

Видно, что уже при небольшом избытке алкилирующего 5'-производного олигонуклеотида достигается плато, максимальная степень модификации белка невысокая Это объясняется по нашему мнению малым количеством нуклеофильных центров, способных алкилироваться вблизи сайтов связывания субстрата и/или их конформационной недоступностью в условиях реакции модификации Характер концентрационных зависимостей для двух других аффинных реагентов 2014-110 и 28Ы-ЯС1 аналогичен представленному на рис 1а Отсюда сделан вывод, что АТ- (2Ш) или вС-богатые (20Ы) олигонуклеотиды не имеют преимущественного сродства к апоА-1 по крайней мере в пределах использованных длин от 20 до 28 с выбранными первичными структурами На рис 16 представлена концентрационная зависимость модификации белка апоА-1 реагентом 21 N-110 в присутствии свободного олигонуклеотида 2Ш Максимальное подавление модификации белка происходит при 50-кратном молярном избытке ингибитора (олигонуклеотида) по отношению к алкилирующему реагенту Около трети от первоначальной модификации при этом сохраняется, что указывает на конкурентный характер ингибирования и, следовательно, на специфичность модификации апоА-1 Константа ассоциации белка с олигонуклеотидом составляет 106М"'

Таким образом, впервые была показана аффинность апоА-1 к эукариотическим ДНК Определена константа подобного взаимодействия аполипопротеина с гетероолигонуклеотидами Порядок величины этой константы сопоставим с таковым для иммуноглобулинов, ассоциированных с гомогенным олигонуклеотидом р(с!Т)16 (Лукоуа Е й а1, 1994) Возможно, это указывает на общий характер взаимодействия белков плазмы крови с продуктами частичной деградации нуклеиновых кислот

В совместной работе с Тузиковым Ф В методом МУРР (Тиг1коу Р V й а1, 1996) были определены константы связывания апоА-1 с олигодезоксирибонуклеотидами и определен вклад стероидных гормонов в это взаимодействие

Таблица 3 Константы связывания апоА-1 с олигонуклеотидами в присутствии и в отсутствии стероидных гормонов

Белок/ON CC(GCC)5 AT-rich GC-nch Т,9

AnoAI 5,37x105 M"1 ~ю6м-'* -

AnoAI-кортизол 3,65x105 М-1 - -

anoAI-ТГК l,66xl06M_1 3,11x10s M"1 2,32x105 M'1

* данные аффинной модификации

Из табл 3 видно, что константа ассоциации GC-содержащего олигонуклеотида в 4,5 раза увеличивается при замене кортизола в комплексе апоА-1-стероидный гормон на его восстановленную форму -тетрагидрокортизол В присутствии ТГК константа ассоциации белок-олигонуклеотид в 3 раза увеличивается, тогда как в присутствии кортизола даже несколько снижается Следует отметить, что константы ассоциации белок-олигонуклеотид, определенные в опытах по аффинной модификации, в пределах ошибки опыта совпадают с данными экспериментов МУРР

С целью изучения характера связывания апоА-1 с участками ДНК определенной нуклеотидной последовательности были проведены эксперименты с использованием метода гель-ретардации Для этого белок апоА-1 и его комплексы с гормонами (кортизол, ТГК) инкубировали с GC-содержащим олигонуклеотидом ON1 и АТ-богатым олигонуклеотидом ON2 при температуре не выше 20°С Реакционные смеси затем разделяли в 15% или 20% ПААГ в неденатурирующих условиях, чтобы сохранялись аддукты ON-гормон-белок На рис 2 видно, что после добавления ON1 или ON2 окрашиванием Кумасси выявляется белковая полоса с большей

Рис. 2.

Электрофореграмма разделения ONJ и ON2 в 15 % ПААГ после связывания с апоА-I в присутствии или

отсутствии ТГК: а -апоА-1; б - аддукт апоА-1-TFK-ON.

Гель окрашен Кумассп R-250. Количество апоА-I: дор. I, 3, 9-3 мкг; дор.4, 10—6 мкг;дор. 5-7, 11-12-9 мкг. 1 - апоА-I, контроль; 2 - ON1; 3 -5 - апоА-I + ON1; 6 - апоА-1-ТГК + ON1; 7 - алоА-1-ТГК + ON1 в 6 М мочевине; 8 - ON2; 9 - 11 - апоА-I + ON2; 12 - аиоА-1-ТГК + ON2,

электрофоретической подвижностью, чем у исходного агюЛ-1 (дор. 4-7, 9-12). При окрашивании всех компонентов в геле красителем Stain's all было видно, что подобные полосы отсутствовали в исходных олигонуклеотидах, а эл ектр о ф ор ети ч ее к ая подвижность ONI или ON2 существенно возрастала. Исходя из этого сделали вывод о том, что ON1 и ON2 образуют комплексы с апоА-1, причем эти комплексы обладают несколько большей электрофоретической подвижностью, чем исходный белок апоА-I. Очевидно, это происходит за счет отрицательных зарядов связанного олигону клеотида, т.к. его масса по сравнению с массой белка вносит небольшой вклад в электрофоретическую подвижность комплексов белок-ON.

Чтобы оценить характер связывания апоА-1-ТГК с ояигонуклеотидом ON1, к реакционной смеси добавляли диссоциирующий агент - мочевину. Видно (рис. 2, дор. 7), что после ее добавления не происходит полной диссоциации комплекса. Это указывает на участие и гидрофобных, и электростатических взаимодействий в процессе комплексообразования НК - белок, т.к. известно, что гидрофобные взаимодействия и водородные связи разрушаются денатурирующими агентами. Но гидрофобные и водородные связи преобладают в аддуктах ON-гормон-белок.

Для отбора (селекции) нуклеотщшых последовательностей, имеющих преимущественное сродство к апоА-1 в присутствии ТГК использованы возможности метода аффинной хроматографии, Поликлональные антитела к апоА-I, полученные Потеряевой О.Н. (Поляков Л.М. и др., 1991), были ковалентно «пришиты» к Сефарозе 4В. На колонке с таким сорбентом Проводили аффинную

хроматографию со смесями, содержащими АпоА-1, ТГК и олигонуклеотиды разного состава и длины: Г1, Г2, A3, ТЗ, Г1А, Г2Т, ON2 и Т,9. Результаты электрофореза в ПААГ свидетельствуют, что сродством к комплексу антиапоА1-апоА1-ТГК обладают все вышеперечисленные олигонуклеотиды, кроме Т^, но наиболее заметное присутствие на радиоавтографах обнаруживается для Г2, ТЗ и Г2Т {рис. 3).

Г2 ТЗ Г2Т

1 2 3 4 5

_ BP —

Рис. 3. Радиоавтографы 15% Г1ААГ после электрофореза Р32-олигонуклеотидов, элюированных с сорбента Сефароза-антиапоА1:апоА1-ТГК; ( # ) - метка введена до хроматографии« 1 - , 2 -'ON1,3 - ON3,4 - ON2, 5 - ON1.

Влияние стероидных гормонов па структуру ДНК в присутствии и отсутствии апоА-1 и аиоЕ

Известно, что в нативной ДНК имеется некоторое количество одно цепочечных (Sl-нуклеазочуветвительных) участков (Sheridan R., and Huang P., 1977). Количество однонигевых участков зависит от стадии клеточного цикла, типа клеток (Collins J. et а)., 1982), возраста животного (Потапенко А., Обухова Л., 1992; Романенко Е. и др., 1998).

Для исследования структурных изменений нативную ДНК выделяли из печени взрослых крыс Вистар и из лимфоцитов крови взрослого человека (здоровые добровольцы). Действительно, в соответствии с приведенными выше литературными данными было обнаружено, что инкубация исходной ДНК с нуклеазой S1 выявляет

некоторое количество Sl-нуклеазочувствительных участков (табл 4, рис 6-7, дорожки 1 и 2)

Флуоресцентное зондирование ДНК в присутствии стероидов.

апоА-I и их комплексов Флуоресцентное зондирование широко используется для оценки изменений во вторичной структуре ДНК (Свергун, Владимиров и др , 1973, Gambelunghe G et al, 1999, Long Yi-T et al, 2003) Интеркаляция акридинового оранжевого (AO) в двуцепочечные участки нуклеиновых кислот вызывает эмиссию в «зеленой» области спектра флуоресценции, а связывание АО в виде эксимеров с одноцепочечными участками вызывает эмиссию в «красной» области (Владимиров Ю А , Добрецов Г Е , 1980) Рабочие концентрации ДНК и АО были подобраны по результатам из кривых титрования так, чтобы фоновая эмиссия в составе дуплекса ДНК была минимальной на длине волны 615 нм и в то же время концентрация зонда была достаточной для образования эксимеров, но не влияла на нативную структуру ДНК Известно, что высокие концентрации АО способны разворачивать двойную цепь ДНК (Свергун, Владимиров и др , 1973) Связывание АО с двунитевой нативной высокомолекулярной ДНК крысы и однонитевым синтетическим 13-мерным олигонуклеотидом приводило к разным результатам В первом случае наблюдали флуоресценцию в «зеленой» области (495-530 нм), при интеркаляции АО в дуплекс ДНК Напротив, в «красной» области (615 нм) в растворе нативной ДНК наблюдали только незначительную эмиссию, тогда как эмиссия АО в растворе синтетического олигонуклеотида существенно превышала фон На рис 4 и 5 приведены кривые титрования ДНК крысы тетрагидрокортизолом и комплексом ТГК-апоА-I, соответственно Видно, что кривая зависимости «красной» эмиссии аддукта ДНК-АО-ТГК от концентрации стероида выходит на плато (рис 4) Подобная зависимость получена и для аддукта ДНК-АО-кортизол Концентрации стероидов, при которых достигалась наибольшая эмиссия при 615 нм, и максимальные значения величин эмиссии в пределах ошибки опыта, которая не превышала 0,5%, были одинаковы для ТГК и кортизола На рис 5 можно видеть, что в области использованных концентраций комплекса ТГК-апоА-I кривая имеет предел насыщения, как и в опытах со стероидами (рис 4), но

СхЮ-5, М

->■

0,5

1,6

Рис 4 Зависимость прироста «красной» эмиссии ДНК с АО от концентрации ТГК Концентрация ДНК 2,7 ОЕ2бо/мл

г" а

40 ■

20 •

н о о а.

о. В

СхЮ"6. М

Рис 5 Зависимость прироста «красной» эмиссии ДНК с АО от концентрации комплекса апоА-1-ТГК (белок стероид = 3 1)

плато выше на 25% и достигается при концентрации стероида в составе комплекса, на порядок меньшей (срав 10"5 М на рис 4 и 10"6 М на рис 5) Наличие плато на кривой титрования указывает на ограниченность числа мест связывания комплекса ТГК-апоА-1 на ДНК В аналогичных экспериментах с комплексом кортизол-апоА-1 не наблюдали прироста «красной» эмиссии по отношению к фону Связывание ДНК с аполипопротеином также не приводило к изменению эмиссии на 615 нм Если комплекс ТГК-апоА-1 получали в присутствии 2 М мочевины, прирост «красной» эмиссии совпадал с величиной, регистрируемой в присутствии одного стероида По нашему мнению это свидетельствует о разрушении комплекса ТГК-апоА-1 в данных условиях и является доказательством заметного воздействия на вторичную структуру ДНК восстановленной формы гормона только в виде его комплекса с апоА-1

Ферментативный анализ взаимодействия ДНК со стероидами Роль аполипопротеинов Предварительная инкубация ДНК со стероидами - кортизолом, ТГК, АС, ДЭА и его сульфатом приводит к появлению дополнительных Б 1-нуклеазочувствительных участков (рис 6, табл 4) На рис 6 видно, что и кортизол (дор 4, 8), и ТГК (дор 5, 9) в реакционных смесях с разными рН приводят к увеличению количества расщепленных нуклеазой Б1 фрагментов по сравнению с ДНК, инкубированной только с нуклеазой (дор 2)

Из сравнения сканированных электрофореграмм (программа Вапс1Всап) видно, что ТГК в большей степени (на 24%) влияет на последующий ферментативный гидролиз ДНК по сравнению с кортизолом в той же концентрации (табл 4, рис 6 срав дор 4, 8 с дор 5, 9) Полученные результаты свидетельствуют о влиянии кортизола и тетрагидрокортизола на вторичную структуру ДНК, что подтверждает данные, полученные при использовании нами метода флуоресцентных зондов Как описано в предыдущем разделе, в этих экспериментах не было замечено различия в характере и степени воздействия кортизола и ТГК на ДНК, т к в обоих случаях наблюдалось дозозависимое накопление однонитевых участков с одинаковым плато концентрационых кривых Это связано по нашему мнению с меньшей чувствительностью метода флуоресцентного зондирования по сравнению с ферментативным анализом Надо отметить, что непосредственное взаимодействие ДНК со стероидами мало представлено в литературе Известна работа японских эндокринологов (Бегау М е1 а1, 1996), в которой обнаружено связывание различных гормонов, в том числе, кортикостероидов, их предшественника -

Рис. 6. Электрофореграмма 1% агарозного геля после разделения ДЫК, инкубированной со стероидами (2 молекулы на 1 т.п.н) или комплексом anoA-I-ТГК и нуклеазой S1, при рН 5 (3-6) и рН 7,5 (7-10). Гель окрашен бромистым этидием. 1 - ДНК, контроль

2-Ю - ДНК, инкубирована с S1 нуклеазой (Qv35 е.а./мд)

3.7 - ДНК+ холестерин

4.8 - ДНК + кортизол

5.9 - ДНК + ТГК

6,10- ДНК + апоА-1-ТГК (1 молекула белка на 1 т.п.н.). 11-ДНК A/HindlII.

холестерина и гормональных метаболитов с ДНК in vitro, но вывод авторов о ковалентном связывании гормонов с ДНК вызывает сомнение. Скорее можно говорить об образовании нековалентных аддуктов за счет гидрофобных, полярных и др. слабых взаимодействий. Образование аддуктов ДНК-холестерин подтверждено и в работе (Gómez-Pinto I. el al,, 2003), где обнаружили образование комплекса холестерина с дуплексом ДНК.

Преинкубация ДНК с другими стероидными гормонами (АС, ДЭА, ДЭАС) также приводит к появлению дополнительных однонитевых участков, чувствительных к SI нуклеазе (табл. 4).

Таблица 4. Влияние стероидов на гидролиз ДНК нуклеазой S1.

ДНК/стероид + SI нуклеаза контроль, без стероида ХС К ТГК АС ДЭА ДЭАС

Количество фрагментов, нг 11,8±3,9 10,4+3,4 34,2+3,7 44,5+5,6 41,0+5,2 37,3+5,0 39,2±4,4

п=4, Р< 0,05. Масса ДНК в каждой дорожке геля - 1 мкг.

Количество однонитевых участков невелико, однако видно, что три указанных гормона и ТГК в большей степени, чем кортизол влияют иа вторичную структуру ДНК (табл. 4). В работе (Панин и др., 2002) было показано стимулирующее действие комплексов гормонов

1 23456789 10 11

АС, ДЭА и ДЭАС с апоА-I на биосинтез белка в гепатоцитах, что не наблюдалось для комплекса кортизол-апоА-I Это отличие может быть связано с необходимостью наличия гидрокси-группы в положении 3 кольца А для связывания комплекса ТГК-апоА-I с ДНК в регуляторных районах Следует отметить, что предшественник всех стероидных гормонов в организме эукариот - холестерин почти не оказывает влияния на вторичную структуру ДНК, что видно из табл 4 По-видимому, наличие полярных оксиацетоновой группировки (ТГК, кортизол) или оксо-группы (АС, ДЭА, ДЭАС) при атоме С-17 в стероидах имеет решающее значение для воздействия на вторичную структуру ДНК т vitro в отсутствии апоА-I, хотя все стероиды связываются с ДНК, как показано в работе (Seray М et al, 1996), и все, кроме кортизола имеют одинаковое строение кольца А Достаточно длинный гидрофобный «хвост» при атоме С-17 препятствует образованию дополнительных однонитевых участков и даже несколько снижает их исходное количество (на 12%, табл 4) при связывании холестерина с ДНК

Таким образом, мы впервые обнаружили воздействие стероидных гормонов и их метаболитов (кортизол, ТГК, АС, ДЭА, ДЭАС) на вторичную структуру нативной ДНК, которое приводит к образованию дополнительных однонитевых участков, чувствительных к S1 нуклеазе Показано отсутствие такого воздействия на вторичную структуру ДНК предшественника стероидных гормонов — холестерина Взаимодействие ДНК с комплексами апоА-1-стероиды Комплекс апоА-1-кортизол сохраняется в интервале рН 5-8, и может содержать от 1 до 3 молекул лиганда на 1 молекулу белка (Панин JI и др, 1992) Были исследованы комплексы с различными молярными соотношениями белок-гормон (ТГК, ДЭАС) 1 молекула гормона на 3 молекулы белка (рис 5), 11, 12 (рис 6 и 7), 13 Обнаружено, что комплексы всех указанных составов вызывают появление дополнительных Sl-нуклеазочувствительных участков на ДНК, однако максимальным эффектом обладает комплекс апоА-1-ТГК состава 1 2, моль/моль (рис 7) Комплексы, в состав которых входил кортизол, не вызывали увеличения количества Sl-нуклеазочувствительных участков в ДНК (рис 7, дор 7) Для комплексов апоА-1-стероид (стероид - АС, ДЭА, ДЭАС) состава 1 2 количество образовавшихся под их воздействием Sl-нуклеазочувствительных участков оказалось сравнимым с таковым для комплекса апоА-1-ТГК аналогичного состава В работе (Панин и др, 2002) было показано, что комплексы апоА-1-стероид (ТГК, АС, ДЭА, ДЭАС) состава 1 2 активируют биосинтез белка в культивируемых

гепатоцитах от 1,4 (для АС) до 1,8 (для ДЭАС) раза. По-видимому, комплексы состава 1 молекула белка - 2 молекулы стероидного гормона обладают оптимальной конформацией для максимального воздействия нь структуру ДНК. Можно думать, что такая эффективность взаимодействия неодинакова для комплексов апоА-1 с разными стероидными гормонами. Для изучения этого аспекта необходимы эксперименты на модельных ДНК. В данном

Рис. 7.

Электрофореграмма ДНК, инкубированной с комплексом алоА-1-ТГК и нуклеазой (8 Е.А./мл). 1% агарозный гель окрашен

бромистым этидием. 1 - ДНК, 2-ДНКЬБ!, 3-6 - ДНК+[адоА-1-ТГК]+$1: 1 молекула белка на 5 т.п.н., 1 м-ла белка на 1 т.п.н., б м-л белка на 1 т.п.н., 10 м-л белка на 1 т.п.н.; 7 - ДНК+[апоА1-К]+51, 10 м-л белка на 1 т.п.н.; 8-9 - ДНК+апоА-Х+Э 1:

23,! 9,4 6,7 4,3

2,3 2,0

1 м-ла белка на 5 тльн., 5 м-л белка на 1 т.п.н.; 10-11 - ДНК+апоА-Г. 1 м-ла белка на 5 т.п.н., 5 м-л белка на 1 т.п.н., соответственно; 12 - ДНК ХЛНпсШ1, 13 - ДНК X

исследовании впервые обнаружено такое взаимодействие и оценены его общие характеристики.

Для исследования влияния рН на воздействие комплекса гормон-апоА-1 на ДНК использовали буферы с рН 7,5 и рН 5. Известно, что для действия нуклеазы оптимальным является рН 5 (Уо§1, 1973; Маниатис и др., 1984), При замене буфера с рН 7,5 на буфер с рН 5 картина расщепления нуклеазой 81 после обработки ДНК комплексами гормон-апоА-1 или его отдельными компонентами принципиально не менялась (рис. 6). Как уже отмечалось, комплекс гормон-апоА-1 сохраняется в интервале рН 5-8 (Панин Л. и др., 1992).

Вместе с нашими данными это может указывать на малый вклад электростатических и предпочтительность гидрофобных взаимодействий как в комплексе гормон-белок, так и при связывании комплекса (и его компонентов) с ДНК При этом взаимодействии важную роль играют также водородные связи, что подтверждается экспериментами по связыванию компонентов в аддукты ОМ-апоА-1-ТГК и влиянию на него мочевины (рис 2) В свою очередь такой вывод позволяет предполагать, что связывание комплекса апоА-1-ТГК с ДНК происходит преимущественно по малой «бороздке», где основную роль играют гидрофобные взаимодействия и водородные связи

Эксперименты по воздействию на вторичную структуру ДНК белка в комплексе с тетрагидрокортизолом были проведены и для другого аполипопротеина ЛПВП - апоЕ Было показано, что апоЕ в присутствии ТГК или кортизола не способствует образованию дополнительных 81-нуклеазочувствительных участков в нативной ДНК крысы по сравнению с влиянием одного ТГК

Таким образом, свойство влиять на вторичную структуру ДНК является специфичным для апоА-1 в комплексе с метаболитом стероидного гормона, и не характерно для другого аполипопротеина, входящего в состав ЛПВП, в данном случае апоЕ

Значительное увеличение количества

нуклеазочувствительных участков в нативной ДНК под воздействием комплекса апоА-1-ТГК по сравнению с одним ТГК видно из результатов электрофореза препаратов ДНК в 1% агарозном геле (рис 7, дорожки 3-6) При повышении концентрации комплекса апоА-1-ТГК в образцах заметно накапливаются фрагменты размером от 0,5 до 15 т пн

При дальнейшем увеличении концентрации этого комплекса выше 2,6х10"6 М существенно ингибируется действие нуклеазы Б1 Был сделан вывод, что однонитевые участки защищаются избытком комплекса апоА-1-ТГК от действия фермента, что согласуется с нашими результатами по связыванию ДНК и синтетических олигонуклеотидов с апоА-1 (табл 1, табл 3, рис 2, 3, 12-14) В эксперименте с использованием денатурированной ДНК показано практически полное ингибирование действия нуклеазы 81 при концентрациях комплекса от 3x10~6 М и выше (здесь данные не приведены)

Комплекс апоА-1 с невосстановленной формой гормона -кортизолом в том же мольном соотношении, что и с ТГК, не увеличивал сколько-нибудь заметно количества 81-нуклеазочувствительных участков (рис 7, дорожка 7) Оно оставалось

сравнимым с исходной ДНК. Обработка ДНК одним апоА-1 также не приводила к изменению распределения и количества однонитевых фрагментов, что видно на дор. 8 и 9 рис. 7.

Таким образом, исследуемые нами стероидные гормоны в составе комплексов с агюА-1 резко отличаются по действию на ДНК, а именно: только восстановленная форма гормона - тетрагидрокортизол в комплексе с апоА-1 приводит к существенному (в 10-15 раз) увеличению количества однонитевых участков. Похожие результаты были получены нами методом флуоресцентных зондов (рис. 4, 5). и в совместной работе с Тузиковым Ф.В. методом МУРР, где в присутствии ТГК обнаруживали в 2 раза больше однонитевых участков, чем в присутствии одного апоА-1. Количество ЗЬнуклеазочуествитеяьных участков в ДНК

180

160

140

120

^ 100 х

80 Щ 60

40 20 П

2 3 4567 8 № дорожки

Рис. 8. Количество фрагментов ДНК < 4,3 т.п.н., содержащихся в дорожкак гег.я (рис. 7).

Стандартное отклонение определено из 3 опытов (по 2 электрофореграммы в каждом), Р<0,05.

Широкий спектр размеров расщепленных нуклеазой фрагментов от 0,5 до 15 т.п.н, свидетельствует о нерегулярном характере распределения эффективных сайтов взаимодействия с комплексом йпоАЬТГК в геноме крысы. Сканирование прозрачности

дорожек в фотонегативах электрофореграмм позволило определить относительное количество разрушаемых нуклеазой S1 участков ДНК до и после воздействия комплекса апоА-1-гормон Результаты представлены на диаграмме рис 8 Было определено относительное содержание фрагментов ДНК С этой целью выделяли участки сканированных электрофореграмм (фотопленок) с фрагментами расщепленной ДНК размером меньше 4,3 т п н На этом участке фотопленки при сканировании соблюдается прямо пропорциональная зависимость между количеством маркерных рестриктных фрагментов ДНК и их интегральной светимостью Затем с помощью программы BandScan оценивали интегральную светимость расщепленного нуклеотидного материала по отношению ко всей ДНК в % Фон вычитали таким образом, чтобы соотношения площадей пиков маркерной ДНК Ä./Hind III размером 4,3, 2,3 и 2 т п н были максимально близки к соотношениям их масс Чтобы оценить количество нуклеотидного материала, содержащегося в том или ином участке геля в зависимости от размеров фрагмента, проводили калибровку масса фрагмента ДНК ?VIIind III в нг/площадь засвеченного участка Вычисляли массу всех рестриктных фрагментов ДНК XVHind III, зная массу нанесенного материала (210 нг) и размеры фрагментов Из этого количества для дорожки 6, рис 7 (максимальное воздействие комплекса на ДНК), вычитали контроли дорожка 2 (ДНК+нуклеаза S1), дорожка 9 (ДНК+апоА-I) Полученные величины выражали в % по отношению ко всей ДНК A./Hmd III, нанесенной на дорожку Эти величины сравнивали с величинами, полученными по программе BandScan, и находили коэффициент соответствия засвеченности фотонегатива по площади к истинной массе нуклеотидного материала в геле Например, масса фрагмента 4,3 т п н ДНК A/Hind III равна 9 нг, значит, масса расщепленного нуклеотидного материала в 6-ой дорожке (рис 7) равна 9x9,4=84 нг, т к соответствующая площадь в 9,4 раза больше, чем площадь пика, соответствующего фрагменту размером 4,3 т п н

Таким образом, в случае специфического воздействия, т е эффективного дозозависимого влияния ТГК-апоА-I, расщеплению нуклеазой подвергается -5,4% исходной ДНК за вычетом контролей Из этого следует, что 2-3 расщепляемых S1 нуклеазой сайта связывания комплекса ТГК-апоА-I приходится на 100 т п н ДНК

Следует отметить, что сайты связывания комплекса апоА-1-ТГК с нативной двухцепочечной ДНК, не образующие дополнительных одноцепочечных участков, предложенным нами методом, конечно, не распознаются

На наш взгляд для оценки количества однопитевых участков в нативной ДНК предложенный подход является оптимальным, так как интенсивность флуоресценции бромистого этидия зависит только от количества ДНК, тогда как на интенсивность радиоактивного, например, сигнала влияют, в том числе, особенности ферментативной реакции при включении метки. Оценка изменений в структуре ДНК но флуоресценции бромистого этидия позволила нам регистрировать их во всем пуле исследуемого препарата.

Влияние структурных особенностей ДНК на гидролиз нуклеазой 51

На рис. 9 представлена электрофореграммз ДНК после взаимодействия с комплексом апоА-1-ТГК (белок/гормон=1:2) и нуклеазой 51. Количественный расчет содержания фрагментов 5,5 и 6

7 8 9 10 И 12

т.п.н.

Рис, 9. Электрофореграмма ДНК, инкубированной с комплексом апоА-1-ТГК И 51 нуклеазой (8 Е.А./мл). 0,5% агарозный гель, окрашенный бромистым этидием.

1 - ДНК, контроль, 2-9 - ДНК, инкубированная с 51 нуклеазой; 3-7 -ДНК+[апоА-1-ТГК], 1 молекула белка на 5 т.п.н., 1 м-ла белка на I т.п.п., 5 м-л белка на 1 т.п.н., 10 м-л белка на 1 т.п.н. и 50 м-л белка на 1 т.п.н., соответственно; 8 - ДНК+ [апоА-1-кортизол], 5 м-л белка на 1 т.п.н., 9 - ДНК + апоА-1, 5 м-л белка на 1 т.п.н.; 10 - ДНК + апоА-1 (без нуклеазы), 1 м-ла белка на 1 т.п.н.; 11 - ДНК^, 12-ДНК МНш<Ш1.

т.п.н. был произведен аналогично расчету количества одноиитевых участков, описанному выше. Показано, что при повышении концентрации комплекса аиоА-1-ТГК накапливаются фрагменты

расщепления размером около 5,5 т п н , достигая максимума до 0,8% от общего количества ДНК, затем количество этого фрагмента уменьшается из-за ингибирования действия нуклеазы Б1 увеличивающейся концентрацией комплекса Комплекс кортизол-апоА-1 также вызывает образование фрагмента размером 5,5 тпн (рис 9, дор 8) Содержание этого фрагмента вдвое ниже (0,4%), чем для комплекса ТГК-апоА-1 (0,8%) в той же концентрации Вероятно, образование Б1-нуклеазочувствительного сайта в данном случае определяется конформацией комплекса кортизол-апоА-1 и/или протонированием кетогруппы в положении 3 кольца А кортизола при кислом рН Фрагмент размером 6 тпн присутствует во всех реакционных смесях, подвергшихся гидролизу нуклеазой 81, его количество составляет в среднем 1% от количества всей ДНК Накопление фрагмента размером 5,5 тпн в присутствии комплекса ТГК-апоА-1 не вызывает уменьшения количества фрагмента 6 т п н , т е они представляют собой два независимых высококопийных повтора, составляющих в целом около 1,5% ДНК Фрагмент размером 6 тпн от всей ДНК размером 3><109 пн составляет 0,0002%, или около (5000+1250) повторов размером 6 тпн содержится в ДНК крысы Фрагментов размером 5,5 тпн найдено в среднем около (3,0±0,8) нг, что составляет (0,5±0,13)% от 500 нг ДНК Это соответствует содержанию около (2500+625) повторов размером 5,5 т п н в ДНК крысы

Специфичность комплексов апоА-1-стероид к нуклеотндным последовательностям ДНК Для оценки нуклеотидной специфичности расщепляемых нуклеазой Б1 участков взаимодействия комплекса апоА-1-гормон (ТГК, ДЭАС) с ДНК были проведены эксперименты с использованием методов гибридизации (1) и метода конкурентного ингибирования взаимодействия комплексов апоА-1-гормон с ДНК олигонуклеотидами разного состава (2)

1) Специфичность комплекса апоА-1-стероид к нуклеотидным последовательностям ДНК по результатам гибридизации

На рис 10 представлены данные денситометрии радиоавтографов, полученных в результате гибридизации ДНК, инкубированной с комплексами апоА-1-ТГК или апоА-1-ДЭАС, нуклеазой 81 и с зондом Р32-СС(ССС)5 Уменьшение сигнала от зонда СС(ОСС)5 на ДНК, обработанной комплексами апоА-1-ТГК, апоА-1-ДЭАСС и затем нуклеазой 81 по сравнению с контролем, где ДНК обработана только нуклеазой 81, составило ~1,5 раза, что свидетельствует о связывании этих комплексов с

последовательностями вида ССС/СОО в составе ДНК. Очевидно, однонитевые участку;, образовавшиеся под воздействием комплексов апоА-1-стероид, гидролизукхгся нуклеазой 51 и число мест, способных гибридизоваться с зондом СС(ССС)5, уменьшается. Следует отметить, что в этом эксперименте использовали концентрации комплексов апоА-Ьстероид, при которых уже образуются оддонитевые участки ДНК, но еще нет избытков комплексов, при которых эти участки полностью связываются с комплексами а по А-¡-стероид. Кроме того, константы связывания комплексов с ДНК (106 М"1) существенно ниже констант связывания комплементарных олигонуклеогидов с ДНК (более 109 М"), в результате чего 17-мерные олигонуклеотиды вытесняют апоА-1-стероид из аддуктов с ДНК.

ос

s ft

-В-

I - средней

Рис. 10. Диаграмма гибридизации инкубированной с нуклеазой S1 комплексов стероид-апоА-1. I - ДНК; 2 - ДНК-ТГК-апоА-1; 3 - ДНК-ДЭАС-апоА-1. Р< 0,05; п = 10.

номер

зонда 32P-CC{GCC)5 с ДНК, в присутствии и отсутствии

2) Конкурентное ингибирование олигонуклеотидам и воздействия

Комплекса ТГК-аиоА-1 на структуру ДНК.

Эксперимент по конкурентному ингибированию

взаимодействия комплекса апоА-1-ТГК с ДНК проводили с

олигонуклеотидамй разного состава; GC-содержащим ON1 й А'Г-

богатым ON2,

Определялась способность указанных олигонуклеотидов влиять на расщепление SI нуклеазой ДНК, прединкубированной с

комплексом аиоА-1-ТГК. Были использованы различные мольные соотношения 0лигонуклеотид-комплекс anoA-î-ТГК, равные 1:5, 2:1, 20:1. В случае ON1 применяли различный порядок добавления компонентов смеси: в одном случае олигонуклеотид добавляли к смеси

ДНК и комплекса апоА-1-ТГК, в другом - ДНК добавляли к прединкубированной смеси комплекса arioA-1-ТГК и олигонуклеогида. Затем проводили гидролиз нуклеазой S1, электрофорез в 1% агарозном геле и окрашивание ДНК бромистым этидием. На рис. 11 (дор. 4-6, 7-9) видно, что увеличение концентрации олигонуклеотида CC(GCC)5 приводит к уменьшению количества фрагментов ДНК, расщепляемых S1 нуклеазой, в обоих способах проведения реакции конкурентного ингибирования. В первом случае (рис. 11, дор 4-6) при преинкубации комплекса aitoAI-ТГК с ДНК уменьшение количества расщепленных участков ДНК происходит заметнее, чем во втором (рис. 11, дор. 7-9), когда комплекс anoAI-ТГК иреинкубировали с олигонуклеотидом в возрастающей концентрации и затем эту смесь инкубировали с ДНК. Это может указызать и на структурные особенности ДНК при

Рис. 11. Конкурентное и нгибирование взаимодействия комплекса ТГК-апоА-I с ДНК в присутствии CC(GCC)3 (ONI) и AT-богатого (ON2). Электрофоретическое разделение ДНК,

инкубированной с нуклеазой S1, в 1 %-ном агарозном геле. 1 - ДНК, контроль без S1; 2 -ДНК; 3 - (ДНК + [ТГК-апоА-I]); 4-6 - (ДНК + [ТГК-апоА-I]) + 0,12, 1.2, 12.0 нг ON 1; 7-9 - ДНК + ([ТГК-аноА-1] 0.12, 1.2, 12.0 нг ON 1;

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 т.п.н.

23,1

•-WWffwwwirK»

-'МШМИ»

10-12 - ДНК + ([ТГК-апоА-1] + 0.12; 1.2; 12.0 нг СЖ2); 13 -фрагменты ДНК Х/НнкШ1. Гель окрашен бромистым этидием.

взаимодействии с указанным комплексом. Результаты, представленные на рис. 11, подтверждают наше предположение о способности комплекса апоА-1-ТГК специфично связываться с последовательностями СС(ССС)П в составе ДНК. Следует отметить, что замена в эксперименте белка апоА-1 на апоЕ в присутствии всех остальных компонентов реакции не приводила ни к появлению

дополнительных расщепляемых S1 нуклеазой сайтов, ни к защите от действии нуклеазы S1 уже существующих однонитевых участков в исходной ДНК.

В экспериментах {1 и 2) концентрация комплексов апоА-1-стероид (0,5-0,Hxl0"f' М) была в 3,2-5,2 раза меньше той, при которой (2,6x10 М) начинается подавление гидролиза одноцепочечных участков ДНК нуклеазой S1 вследствие связывания с ними избытков этих комплексов.

Взаимодействие комплекса апоА-1-ТГК с олигонукдсотидами и их комплементарными дуплексами

Для более детального изучения механизма воздействия комплексов аноА-1-стероид на ДНК были выбраны синтетические дезоксирибоелигонуклеотидвд, моделирующие сайты связывания. П: 5' -CC(GCC)i, Г2: 5'-GG(CGG)3l A3: 5'-AjCC(GCC)3, ТЗ: 5'-GG(CGG)3T.i ПА: 5 -A6CC(GCC)j, Г2Т: 5'-GG(CGG)jT(v

Как видно из структуры, П комплементарен Г2, A3 комплементарен ТЗ, а Г1А - Г2Т. Была исследована способность о л и гону к л ео г идов и их

Рис. 12. Радиоавтограф 20% ПААГ после разделения Г1, Г2 и их дуплекса в нативных условиях. 1-4 -Дуплекс Г1-Г2; 5-8 - Г1; 9-12 -Г2. Дорожки 2-4, 6-8, 10-12 с нуклеазой S1; дорожки 3, 4, 7, 8, 11, 12 - в присутствии комплекса ТГК-АпоА1.

Стрелками указаны продукты гидролиза (дор. 2-4, 6-8,10-12).

дуплексов гидролизоваться нуклеазой S1 и панкреатической ДНКазой I. Как известно, в стандартных условиях при pil 5 нуклеаза S1 расщепляет однонитевые участки нуклеиновых кислот независимо от кукпедтидкок последовательности (Vogt, 1973), На рис. 12 видно, что одноцепочечные олигонуклеотиды Г1 и Г2 полностью расщепляются

(дор. 6, 10), тогда как дуплекс Г1Т2 остается не г и др олизованны м (дор.1). Аналогичный результат получен и для АЗ, ТЗ, Г1А и Г2Т.

Были подобраны условия ферментативного гидролиза после воздействия комплекса апоА-ЬТГК на олигонуклеотиды и их комплементарные дуплексы при разных рН. Видно, что при рН 5 появляются продукты гидролиза олиго н уклеотидов нуклеазой 81 в присутствии апоА-1-ТГК из дуплекса П-Г2 (рис, 12, дор. 2-4).

Следует отметить, что при кислом рН по сравнению с нейтральным несколько меняется характер связывания белка и с гормоном, и с олигонуклеотидами, т.к. их функциональные группы подвергаются ионизации, а степень и характер ионизации зависят от

1 2 34 5678 9 10

Рис. !3. Радиоавтограф 15% ПААГ после электрофореза олигонуклеотидов Г1А, Г2Т и их дуплекса, инкубированных с комплексом апоА-1-ТГК и нуклеазами S1 и ДНКазой 1.

рН. Таким образом, комплекс аиоА-1-ТГК оказывает «расплетающее» действие на дуплекс, т.к. образуются продукты гидролиза одно цен очечных олигонуклеотидов (рис. 12). В то же время видно, что даже небольшой избыток комплекса апоА-1-ТГК защищает любой из

одноцегючечных о л игонуклеотвдов от гидролиза нуклеазой S1, но в разной степени. Так, Г1 и Г2 не гидролизу юте я полностью в присутствии anoA-I-ТГК уже при соотношении о л и гон у к л е очи д - бел ок, равном 1и защищены количественно от действия нуклеазы SI при соотношении 1:4 (рис. 12, дор. 7-9, 11, 12). ПА защищен от действия нуклеазы S1 при мольных соотношениях 1:2 и 1:4, но гидролизуется при соотношении 1:0,5 (рис, 13, дор. 3, 4). Защита олигонуклеотида Г2Т комплексом апоА-1-ТГК от действия нуклеазы S1 носит необычный характер, т.к. при увеличении концентрации комплекса олигонуклеотид гидролизуется в большей степени, как видно из рис. 13, дор. 5, 6 и рис. 14, дор. 1-3. Похожий результат получен и для ТЗ. По-видимому, это связано с разрушением структурированных (G-квадруплекСЫ, Símonsson Т., 2001) участков ТЗ и Г2Т в присутствии комплекса апоА-1-ТГК, Очевидно, самокомплементарные GC-участки «расплетаются» под влиянием этого комплекса и в Г1, Г2, АЗ, Г1А. Следует сделать вывод, что Tn-иоследовательность на З'-конце оказывает стабилизирующее влияние т G-структуры и/или на самокомплементарные взаимодействия и ТЗ и Г2Т и затрудняет ферментативный гидролиз в стандартных условиях.

Рис. 14. Радиоавтограф 15% ПААГ после разделения электрофорезом в 6 М ХС мочевине продуктов

гидролиза олигонуклеотидов Вр нуклеазой Sis присутствии комплекса ТГК-апоА-f. *- Метка, Гу-32Р]АТР

I Г2Т+ТГК-апоА-1 (1:4, моль Г2Т/моль белка)+51;

2. Г2Т+ТГК-агюА-1 (J:2)+S!;

3. Г 2 Т+ТГ К-а rio А-1 (1:0,5)+S1;

4. Г2+ТГК-апоА-1 (1:0,5) ¡S1;

5. Г2+ТГК-апоА-1 (1:2)+Sl;

6. Г2+ТГК-апоА-1 (1:4)+S 1;

7. Г2Т+ТГК-апоА-1 (] :2); 8. Г2+ТГК-апоА-1 (1:2); 9. Г2Т+51; 10, T2+S1; 11.Г2Т, 12, Г2.

Минимальный сайт связывания комплекса atioA-1-ТГК

с олигонуклеогидами Чтобы определить минимальную нуклеатидную последовательность, способную удерживать комплекс аиоА-1-ТГК,

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12

аддукты олигонуклеотид-ТГК-апоА-I подвергали гидролизу панкреатической ДНКазой I (Sambrook J et al, 1989) От действия ДНКазы I олигонуклеотид Г1А защищен комплексом апоА-1-ТГК частично, тк. сохраняется GC-содержащая последовательность, но отщепляется Аб с 5'-конца так же, как и Аз в олигонуклеотиде A3 В то же время З'-Тв-последовательность в Г2Т или 3'-Т3 в олигонуклеотиде ТЗ не отщепляются от соседнего пуринового нуклеотида G, что соответствовало бы литературным данным (Edwards J, 2006) Инкубация дуплекса Г1А-Г2Т с комплексом апоА-1-ТГК и ДНКазой I приводит к появлению олигонуклеотида, защищенного от действия фермента, с большей электрофоретической подвижностью, чем у исходных олигонуклеотидов Г1А или Г2Т (рис 13, дор 1 и 2) Подвижность в геле этого олигонуклеотида близка к подвижности 11-меров Г1 и Г2, но т к ДНКаза I не «отрезает» Тп от Г2Т (но гидролизует Г1А полностью), его нельзя идентифицировать как Г2, но можно идентифицировать как 13-15-мер с Тп на 3'-конце и прилегающими Cgg Похожий результат получен на олигонуклеотидах A3, ТЗ и их комплементарном дуплексе A3 ТЗ При анализе продуктов гидролиза олигонуклеотидов Г2 и Г2Т нуклеазой S1 в присутствии разных молярных избытков комплекса апоА-1-ТГК также обнаружен подобный олигонуклеотид (рис 14, дор 3) Таким образом, 5'-ggCggCggCggTßilN представляет собой минимальный сайт связывания комплекса апоА-1-ТГК с выбранными модельными олигонуклеотидами

Влияние комплекса апоА-1-стероид на копирование ДНК

Анализ наших данных вместе с литературными данными, касающимисяся влияния комплекса апоА-1-ТГК на синтез белка в гепатоцитах печени крысы (Панин и др , 2002), позволил сделать предположение об участии апоА-1-ТГК в инициации транскрипции многих генов и в индукции пролиферации клеток Мы провели копирование нативной ДНК in vitro с использованием фрагмента Кленова В этом эксперименте ДНК обрабатывали комплексом апоА-1-стероид (ТГК, АС), затем инкубировали с фрагментом Кленова в условиях реакции копирования Для контроля использовали нативную ДНК, ДНК, инкубированную с апоА-I, ТГК, АС и комплексом апоА-1-кортизол

Во всех случаях наблюдали синтез [32Р]-фрагментов ДНК На радиоавтографах появлялись достаточно длинные (50N-60N и больше) фрагменты ДНК и более короткие фрагменты длиной до 20 нуклеотидов Мы полагаем, что в данных условиях происходит как мечение «выступающих» концов длинных молекул ДНК, так и синтез

новых цепей ДНК на внутренних однонитевых участках Индукция копирования осуществляется в присутствии ТГК и АС в небольшом интервале концентраций комплекса (табл 5) Было показано, что при мольном соотношении ДНК - комплекс апоА-1-стероид (ТГК, АС), равном 1 50, синтезируется на 22-27 % больше копий ДНК, чем в отсутствии комплекса (табл 5) К подобному результату приводят как фрагмент Кленова, так и ДНК-полимеразы из белкового экстракта ядер клеток крысы (табл 5) При дальнейшем повышении концентрации комплекса апоА-1-стероид наблюдали ингибирование реакции копирования до полного ее отсутствия (табл 5) Это можно объяснить связыванием избытка комплекса апоА-1-стероид с теми последовательностями ДНК, на которых осуществлялось копирование, и неспособностью ДНК-полимеразы конкурировать за эти участки

Поскольку показано, что комплексы апоА-1-стероид (ТГК, АС, ДЭА и ДЭАС) способны влиять на вторичную структуру ДНК, вызывая появление однонитевых участков в сайтах связывания, можно утверждать, что в этих сайтах инициируется копирование ДНК

Таблица 5. Синтез ДНК в присутствии комплексов стероид-апоА-1, катализируемый фрагментом Кленова и ДНК-полимеразами БЭЯ_

ДНК/комплекс стероид-АпоА-1 Р32-копии ДНК, относительное кол-во (средний коэффициент поглощения)

фрагмент Кленова полимеразы БЭЯ

ТГК-апоА-1 АС-апоА-1 ТГК-апоА-1

Без комплекса 0,34+0 02 0,27±0 01 0,30+0 02

1 20, моль/моль - - 0,38+0 02

1 50 0,42+0 02 0,33±0 02 -

1 100 0,25+0 01 0,21+0 01 -

1 200 0 0 0

п—8, Р<0,05

Транскрипция ДНК с измененной вторичной структурой

Синтез РНК проводили на матрице ДНК в присутствии белкового экстракта ядер (БЭЯ) из клеток печени крысы Вистар, 6-звенных праймеров со статистически случайной нуклеотидной последовательностью и смеси 4-х рибонуклеозидтрифосфатов, из которых один был мечен фосфором-32 (О^пат е1 а1, 1983) Было исследовано влияние комплекса апоА-1-ТГК (12, моль белка/моль

стероида) па синтез РНК в присутствии РНК-полимераз БЭЯ, При небольшом молярном избытке (5-10 - кратный) комплекса апоА-1-ТГК наблюдали активацию транскрипции ДНК (рис. 15, дор. 1). При дальнейшем повышении концентрации комплекса при соотношении ДНК/белок, равном 1:20 моль/моль, наступало ингибирование синтеза РНК. При мольных соотношениях ДНК/белок, выше 1:50, синтез РНК tie novo подавлялся полностью. По-видимому, степень изменения вторичной структуры ДНК под влиянием комплекса апоА-1-ТГК достигала критической величины, начиная с которой РПК-полимеразы переставали катализировать транскрипцию.

В совместной работе с Туликовым Ф.В. методом МУРР обнаружено высококооперативное связывание до 6 молекул РНК-полимеразы фага Т7 в присутствии комплекса апоА-1-ТГК на I макромолекулу ДНК (М=26000кДа). Можно сделать вывод, что, по крайней мере, часть новообразованных однонитевых участков мод влиянием комплекса апоА-ШГК становятся мишенями для РНК-полимеразы, т.е. обнаруженное нами специфическое изменение вторичной структуры ДНК под влиянием комплекса ТГК-апоА-1 инициирует кооперативное, дозозависимое связывание РНК-полимеразы.

Рис. 15. Радиоавтограф 15% ПААГ после з л е ктр о ф ор ети ч ее кого разделения Р32-

транскриптов,

1. Транскрипция ДНК в присутствии апоА1-ТГК (1:10 моль ДНК/моль апоА1)

2, Транскрипция ДНК, контроль.

1 2

Изучение влияния комплекса апоА-1-сгероидный гормон на синтез ДНК и РНК при использовании хроматина в качестве матрицы показало, что при значительном увеличении концентрации комплекса апоА-1-ТГК (1:100, моль ДНК/моль белка) наступает полное ингибирование и копирования, и транскрипции ДНК, Мольные

_ - _ ___._

соотношения ДНК/апоА-I от 1 2 до 1 10 приводили к активации (1015%) реакций и транскрипции, и копирования

Таким образом, найден молекулярный механизм влияния стероидных гормонов и их метаболитов (ТГК, АС, ДЭА, ДЭАС) в комплексе с апоА-I на ДНК Он заключается в локальном изменении вторичной структуры ДНК, т е образовании одноцепочечных участков в нативной ДНК в сайтах взаимодействия с комплексами апоА-1-стероид Анализ изученных свойств апоА-I и его комплекса со стероидными гормонами позволяет установить наличие у него полифункциональных свойств, а именно 1) способность служить транспортным белком не только для липидов и не только в составе ЛПВП, но и способность в свободном состоянии связывать стероиды и ДНК, 2) способность выполнять регуляторные функции в комплексе с метаболитами стероидных гормонов (ТГК, АС), активируя и копирование, и транскрипцию ДНК in vitro Несомненно, для эффективной индукции этих процессов с участием комплекса апоА-1-стероидный гормон требуются дополнительные белковые факторы, которые присутствуют in vivo в клетках

ВЫВОДЫ

1 Взаимодействие стероидных гормонов и их метаболитов кортизола, тетрагидрокортизола, андростерона, дегидроэпиандростерона,

дегидроэпиандростерон-сульфата, с нативной ДНК приводит к образованию одноцепочечных участков, чувствительных к действию S1 нуклеазы Предшественник стероидных гормонов - холестерин не влияет на вторичную структуру ДНК

2. Аполипопротеин A-I связывается с высокомолекулярной ДНК и дезоксирибоолигонуклеотидами (11N-28N) как в свободном состоянии, так и в составе комплекса с тетрагидрокортизолом, с константой ассоциации 106М~'

3 В присутствии аполипопротеина A-I в 10-15 раз возрастает количество одноцепочечных участков, возникающих под влиянием тетрагидрокортизола, андростерона, дегидроэпиандростерона и его сульфата, но не кортизола Аполипопротеин Е не влияет на количество однонитевых участков в ДНК

4 Связывание комплекса аполипопротеин A-1-стероид (тетрагидрокортизол, дегидроэпиандростерон-сульфат) с последовательностями ДНК вида (gCC/Cgg)n приводит к образованию одноцепочечных участков вблизи них В геноме крысы такие участки представлены в количестве, не меньшем, чем 2 на 100 т п н ДНК

5. Обнаружен повторяющийся элемент генома крысы размером 5,5 т п н, способный связывать комплекс аполипопротеин A-I-тетрагидрокортизол с образованием одноцепочечных участков

6 Дуплексы CCgCCgCCgCC ggCggCggCgg и AnCCgCCgCCgCC ggCggCggCggTn (n=3, 6) при взаимодействии с комплексом аполипопротеин A-I-тетрагидрокортизол становятся чувствительными к нуклеазе S1 Олигонуклеотиды AnCCgCCgCCgCC в присутствии комплекса апоА-1-тетрагидрокортизол более подвержены гидролизу нуклеазой S1, чем ggCggCggCggTn (п=3, 6)

7 Олигонуклеотиды ggCggCggCggTn (п=3, 6) избирательно связываются с комплексом аполипопротеин A-1-тетрагидрокортизол как в свободном состоянии, так и в составе комплементарного дуплекса, становясь практически недоступными действию нуклеазы S1 и ДНКазы I Минимальная нуклеотидная последовательность, связывающая комплекс апоА-1-тетрагидрокортизол и недоступная действию нуклеаз, представляет собой 5'-ggCggCggCggT3±lN

8 Копирование ДНК in vitro с измененной под влиянием комплекса апоА-1-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон) вторичной структурой катализируется как фрагментом Кленова, так и ДНК-полимеразами из белкового экстракта ядер клеток крысы При мольном соотношении ДНК/комплекс аполипопротеин A-1-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон), равном 1 50, синтезируется на 2227 % больше копий ДНК, чем в отсутствии комплекса 100-кратный мольный избыток комплекса апоА-1-стероид полностью подавляет копирование ДНК Тетрагидрокортизол, но не кортизол, активирует копирование ДНК, 50-кратный избыток тетрагидрокортизола подавляет копирование

9 Комплекс аполипопротеин A-I-тетрагидрокортизол активирует транскрипцию ДНК крысы in vitro, катализируемую РНК-полимеразами белкового экстракта из ядер клеток печени крысы, при 20-кратном мольном избытке комплекса транскрипция ингибируется

10 Показана способность in vitro комплексов апоА-1-стероид (тетрагидрокортизол, дегидроэпиандростерон, андростерон) выполнять роль, подобную роли кофакторов/факторов, изменяющих структуру ДНК в процессах транскрипции и репликации

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Будкер В Г , Гимаутдинова О И , Карпова Г Г , Кобец Н Д , Теплова Н М Специфическая химическая модификация рибосом вблизи мРНК-связывающего центра//Молек биол-1976-Т 10-С 340-346

2 Гимаутдинова О И , Гринева Н И , Денисова JIЯ , Ломакина Т С , Пустошилова Н М Расщепление и изомеризация фосфодиэфирных связей при водной обработке рибоолигонуклеотидов, ацилированных мезитиленкарбонилхлоридом // Биоорган химия -1977 -Т 3 -С 16331640

3 Гимаутдинова О И , Карпова Г Г , Ломакина Т С, Мызина С Д , Гринева Н И Синтез алкилирующих производных фосфамидов нуклеозидов и олигонуклеотидов и их взаимодействие с ДНК и РНК Е coli // Тезисы докл 1-ой Всесоюз конференции по химии нуклеозидов и нуклеотидов —Рига, 1978-С 45

4 Гимаутдинова О И , Гринева Н И , Карпова Г Г , Ломакина Т С , Шелпакова Е Л Получение 4-(Ы-2-хлорэтил-Ы-метиламино)бензил-5'-фосфамидов рибоолигоаденилатов и их взаимодействие с рРНК и ДНК Ecoh //Биорган химия- 1978 -Т 4-С 917-927

5 Гимаутдинова О И , Карпова Г Г , Ломакина Т С , Шелпакова Е Л , Чемасова А Н , Гринева Н И Алкилирование ДНК в комплементарных комплексах с 4(Ы-2-хлорэтил-К-метиламино)бензил-5'-фосфамидами олигонуклеотидов//Биоорган химия-1980-Т 6-С 70-80

6 Гимаутдинова О И, Номоконова Н Ю, Макарова Е Н Взаимодействие аполипопротеина A-I с эукариотическими и синтетическими ДНК // Бюлл СО РАМН - 1998 - №3 - С 30-32

7 Гимаутдинова О И, Панин Л Е Влияние аполипопротеина A-I в комплексе с тетрагидрокортизолом на вторичную структуру нативной ДНК // Бюлл СО РАМН -1998 - №3 - С 32-35

8 Панин Л Е, Гимаутдинова О И, Поляков Л М, Наякшина Т Н Особенности взаимодействия кортизола, тетрагидрокортизола и их комплексов с аполипопротеином A-I с эукариотической ДНК // Молек биол- 1998-Т 32-С 447-451

9 Рашп L Е , Lukashev V А , Gimautdinova О I Disturbances of genome regulation as the consequence of the structural likeness of HIV-1 env proteins and human apolipoprotein A-I // The first intern conf on biomformatics - Russia, Novosibirsk, 1998 - V 2-P 411

10 Lukashev V A , Frolov A S , Panin L E , Gimautdinova О I Antigenic mimicry of human immunodeficiency virus type 1 as a result of structural similarity of protein gpl20 and human apolipoprotein A-I // The first intern conf on biomformatics -Russia, Novosibirsk, 1998-V 2-P 417

11 Панин Л E , Лукашев В A , Гимаутдинова О И Антигенная мимикрия вируса иммунодефицита HIV-I как следствие структурного сходства белков gpl20 и аполипопротеина A-I человека // Иммунология - 1999 - Т 2-С 13-15

12 Акимжанова M В, Гимаутдинова О И, Кузнецов П А Специфические сайты связывания комплекса аполипопротеин A-I-тетрагидрокортизол на эукариотической ДНК // Бюлл СО РАМН -2000 - №2 - С 29-32

13 Кузнецов П А , Гимаутдинова О И , Акимжанова M В Изменения вторичной структуры ДНК эукариот вблизи сайтов связывания комплекса тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I // Бюлл СО РАМН - 2000 - №2 - С 71-73

14 Панин JI Е , Тузиков Ф В , Тузикова H А , Гимаутдинова О И , Поляков JI M Взаимодействие эукариотической ДНК с аполипопротеином A-I и его комплексами с глюкокортикоидами // Биофизика - 2000 - Т 45-С 611-619

15 Панин JIE, Тузиков ФВ, Тузикова НА, Усынин ИФ, Гимаутдинова О И Влияние комплекса тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I на взаимодействие РНК полимеразы с эукариотической ДНК и скорость биосинтеза белка в гепатоцитах // Биоорган химия-2001 -Т 27-С 114-119

16 Гимаутдинова О И , Панин JI Е , Кузнецов П А , Еттянова-Акимжанова M В Специфические изменения вторичной структуры ДНК эукариот под влиянием комплекса тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I//Молек биол - 2002 - Т 36 - С 103-105

17 Панин JI Е , Тузиков Ф В , Тузикова H А , Гимаутдинова О И , Поляков JI M Взаимодействие комплекса тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I с эукариотической ДНК и одноцепочечными олигонуклеотидами // Молек биол - 2002 - Т 36 - С 96-102

18 Панин JI Е , Гимаутдинова О И , Кузнецов П А , Акимжанова M В , Тузиков Ф В Влияние комплекса тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I на вторичную структуру эукариотической ДНК и ее взаимодействие с РНК-полимеразой // Биохимия - 2002 - Т 67 - С 953958

19 Рашп L Е , Tuzikov F V , Gimautdinova О I Tetrahydrocortisol-apolipoprotein A-I complex specifically interacts with eukaryotic DNA and GCC elements of genes // J Steroid Biochem and Mol Biol-2003 -V 87-P 309-318

20 Gimautdinova О I, Kuznetsov P A , Panin L E A transcription initiation with the participation of the tetrahydrocortisol-apolipoprotein A-I complex // Proceedings Progressive Scientific Technologies for Human Health -Ukraina, Feodosia, 2003 - P 48-49

21 Базалук В В , Величко Е Ю , Гимаутдинова О И , Кузнецов П А , Панин JI Е Инициация копирования ДНК при участии стероидных

гормонов и аполипопротеина A-I // VI Конгресс «Наука о человеке» -Томск, 2005-С 21

22 Gimautdinova О I, Panin L Е , Bazaluk V V , Velichko Е Ju , Kuznetsov Р A The initiation mechanism of DNA copy with the participation of steroid hormons and apolipoprotein A-I // Intern Symp "Molecular mechanisms of cell function regulation" - Russia, Tjumen, 2005 - P 77-78

23 Gimautdinova О I, Velichko E Ju , Panin L E The role of DNA GCC elements binding the steroid-apoAI complex in stress conditions // Second Intern Interdisciplinary Congress "Neuroscience for Medicine and Psychology" -Ukraina, Sudak, 2006 - P 78-80

24 Панин JI E , Гимаутдинова О И , Кузнецов П А , Величко Е Ю , Базалук В В Структура сайтов взаимодействия ДНК эукариот с комплексами стероидный гормон-аполипопротеин A-I // Молек биол -2007-Т 41, № 4 - С 1-7

25 Панин Л Е, Гимаутдинова О И Роль метаболитов стероидных гормонов в комплексах с аполипопротеином A-I в процессах регенерации // III Междунар Симпозиум «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» - Россия, Москва-Дубна, 2007

Список обозначений и сокращений

апоА-I, апоЕ - аполипопротеины A-I и Е,

ЛПВП - липопротеины высокой плотности,

ЛПНП - липопротеины низкой плотности,

ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности,

БЭЯ - белковый экстракт из ядер клеток печени крысы,

ПААГ - полиакриламидный гель,

т п н - тысяча пар нуклеотидов,

ХС - ксиленцианол,

BP - бромфеноловый синий,

К - кортизол,

ТГК - тетрагидрокортизол,

АС - андростерон,

ДЭА - дегидроэпиандростерон,

ДЭАС - дегидроэпиандростерон-сульфат,

МУРР - малоугловое рентгеновское рассеяние,

АО - акридиновый оранжевый,

ON - олигонуклеотид,

Г1, Г2, A3, ТЗ, Г1А, Г2Т, ON1 - GC-содержащие олигонуклеотиды, структуры приведены в разделе «Материалы и методы», ON2 - АТ-богатый олигонуклеотид, ON3 - GC-богатый олигонуклеотид

Автор выражает благодарность за интересные научные идеи и поддержку этих исследований научному консультанту академику РАМН, д м н , проф Л Е Панину, сотрудникам Института биохимии СО РАМН д м н , проф Л М Полякову, д м н , проф А Р Колпакову, д б н И Ф Усынину, д б н Ф В Тузикову, к б н ПА Кузнецову, сотруднику Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН д б н, проф Г Г Карповой за плодотворную совместную работу и творческое обсуждение результатов, сотруднику Гематологического научного центра (г Москва) д х н, проф Н И Гриневой за профессиональное обучение и возможность участия в оригинальных исследованиях по комплементарно адресованной модификации нуклеиновых кислот ,

Соискатель О И Гимаутдинова

Подписано к печати 16 июля 2007 г Тираж 150 экз Заказ № 596 Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел 335-66-00

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гимаутдинова, Ольга Ивановна

Список сокращений, обозначений и пояснений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Механизмы активации транскрипции генов эукариот

1.1.1. Структура хроматина

1.1.2. Архитектура транскрипционных белково-нуклеиновых комплексов - ассамблей

1.1.2.1. Регуляторные области генов. Описание TRRD

1.1.2.2. Резюме по базе данных TRRD

1.1.2.3. Виды транскрипционных ансамблей

1.1.3. Транскрипционные факторы

1.1.3.1. Определение и строение транскрипционных факторов

1.1.3.2. Классификация ТФ

1.1.3.3. Описание ДСД в суперклассах, описание некоторых классов, семейств и индивидуальных факторов транскрипции

1.1.3.4. Резюме по классификации ТФ

1.1.4. Участие медиаторов и коактиваторов в экспрессии генов

1.1.5. Примеры молекулярных механизмов инициации транскрипции генов

1.1.5.1. Общие представления о функционировании РНК-полимераз

1.1.5.2. Элементы организации гена апоА-Iи транскрипционные факторы, обеспечивающие его экспрессию

1.1.5.3. Некоторые элементы механизма функционирования гена апоА-I и связанных с ним генов anoCIII и anoAIV

1.1.5.4. Регуляция транскрипции с помощью FoxA/HNF-З и HNF

1.1.5.5. Возможные механизмы синергизма FoxA7HNF-3 и HNFпод контролем печень-специфичного энхансера гена апоА

1.1.5.6. Влияние экспрессии гена апоА-I на метаболизм

1.1.6. Резюме по регуляции транскрипции генов

1.2. Аполипопротеин A-I - регуляторный белок?

1.3. Стероидные гормоны. Строение. Метаболизм

1.3.1. Кортизол

1.3.2. Строение стероидов

1.3.3. Действие стероидных гормонов на организм

1.3.4. Применение стероидных гормонов в фармакологии

1.3.5. Глюкокортикоиды

1.3.6. Половые стероидные гормоны

1.3.7. Метаболизм стероидных гормонов

1.3.8. Биохимические пути действия стероидных гормонов в клетке

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы регуляции транскрипции и копирования ДНК эукариот при участии стероидных гормонов и аполипопротеинов А-I и Е"

Актуальность проблемы. Гормональная регуляция экспрессии генов привлекает внимание ученых уже многие десятилетия. Это связано с той огромной ролью гормонов, которую они играют в регуляции метаболизма в органах-мишенях, изменяя их функцию в необходимом для организма направлении. Адаптивные свойства гормонов, как правило, реализуются через взаимодействие с геномом клетки, приводя к усилению экспрессии или, напротив, к супрессии отдельных генов. Однако молекулярные механизмы этого взаимодействия во многих случаях остаются неясными. Достаточно полно изучены молекулярные механизмы индукции ключевых ферментов глюконеогенеза под влиянием глюкокортикоидов. Они связаны с проникновением гормона в клетку, образованием комплекса с цитозольным рецептором, транслокацией последнего в ядро, где он взаимодействует с определенным акцепторным участком ДНК как транскрипционный фактор, приводя к экспрессии соответствующих генов (Munck A., and Foley R., 1979; Мертвецов Н.П., 1990; Mangelsford D.J. et al., 1995). О сайтах связывания подобных транскрипционных факторов с ДНК имеется довольно обширная информация (Yamamoto К.К. et al., 1988; Foulkes N.S. et al., 1992; Quandt K. et al., 1995). Аналогичные механизмы действия на геном клеток органов-мишеней рассматриваются в отношении андрогенов (Davies P. and Rushmere N.K., 1990; Foulkes N.S. et al., 1992), эстрогенов (Cavailles V. et al., 1995) и других стероидных гормонов. Участие стероидных и других гормонов в образовании сложных комплексов гормон-рецептор-ДНК давно является предметом пристального внимания биохимиков (Dalman F.C., 1990; Меркулова Т.Н. и др., 1997; Libri V. et al., 2004). Но молекулярные механизмы взаимодействия гормон-рецепторных комплексов с ДНК недостаточно изучены.

В Институте биохимии СО РАМН было открыто явление стимуляции резидентными макрофагами биосинтеза белка в паренхимных клетках органов и тканей в процессе регенерации (Панин JI.E., Усынин И.Ф., Харьковский А.В., 1987; 1994; 1997). Показано, что роль переносчиков стероидных гормонов в организме могут играть липопротеины различных классов: ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП (Панин Л.Е. и др., 1992). В липопротеинах гормоны связаны с белком. Таким белком в ЛПВП является аполипопротеин A-I (апоА-I). Поглощая продукты деградации клеток, макрофаги кооперативно захватывают ЛПВП и стероидные гормоны (Панин Л.Е. и др., 1994). В макрофаге происходит дезинтеграция ЛПВП, освобождение аполипопротеина A-I и восстановление стероидных гормонов редуктазами. Тетрагидропроизводные гормонов образуют комплекс с апоА-I, который сначала попадает в интерстициальное пространство, а затем в ядра соматических клеток, где взаимодействует с ДНК (Панин Л.Е. и др., 1996; Panin L.E. et al., 1998; 2000). Показано присутствие аполипопротеинов A-I, В и Е в ядрах гепатоцитов и других клеток in vivo (Панин Л.Е., Русских Г.С., Поляков Л.М., 2000), а также образование и стехиометрия комплексов стероидный гормон-аполипопротеин A-I in vitro (Биушкина Н.Г. и др., 1992).

Молекулярные механизмы взаимодействия стероидных гормонов, аполипопротеинов A-I и Е, их комплексов с ДНК, изменение вторичной структуры ДНК, ее копирование и активация транскрипции впервые подробно изучены в данной работе. Актуальность нашего исследования связана не только с расширением представлений об участии стероидных гормонов в комплексе с апоА-I в регуляции экспрессии генов, но и с более глубоким пониманием таких фундаментальных явлений, как процессы внутриклеточной регенерации и пролиферации клеток.

Цель и задачи исследования.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи.

1) Исследовать молекулярные механизмы взаимодействия стероидных гормонов, аполипопротеинов A-I и Е а также комплексов стероид-аполипопротеин с ДНК.

3) Определить количественные характеристики связывания апоА-1, комплекса апоА-1-стероид с ДНК и изменения ее вторичной структуры. Изучить функциональную роль апоА-1 во взаимодействии с ДНК.

4) Определить нуклеотидные последовательности, моделирующие сайты связывания комплексов апоА-1-стероид с ДНК, оценить характер и специфичность их взаимодействия. Найти минимальный сайт связывания комплекса апоА-1-тетрагидрокортизол с ДНК.

5) Изучить влияние комплексов апоА-1-стероид на копирование ДНК крысы и человека in vitro.

6) Изучить in vitro транскрипцию ДНК с измененной под влиянием комплекса стероидный гормон-апоА-I вторичной структурой.

Научная новизна работы. Разработан методический подход для обнаружения структурных изменений высокомолекулярных ДНК с использованием флуоресцентного зондирования и ферментативного анализа. Этот подход применен для изучения молекулярных механизмов взаимодействия ДНК со стероидными гормонами в комплексе с аполипопротеинами (апоА-1, апоЕ). Впервые обнаружено образование однонитевых (чувствительных к нуклеазе S1) участков в результате связывания стероидных гормонов и их метаболитов (тетрагидрокортизол, андростерон, дегидроэпиандростерон, дегидроэпиандростерон-сульфат) с ДНК. Число таких участков значительно увеличивается в присутствии аполипопротеина A-I, но не аполипопротеина Е. Показано, что связывание холестерина - предшественника стероидных гормонов, с нативной ДНК не приводит к образованию в ней дополнительных одноцепочечных участков. Показано и количественно оценено воздействие комплекса апоА-1-стероидный гормон (тетрагидрокортизол, дегидроэпиандростерон) на вторичную структуру нативной ДНК.

Определена нуклеотидная специфичность и характер распределения по геному крысы одноцепочечных участков, образующихся под влиянием комплекса апоА-1-тетрагидрокортизол. Впервые обнаружены нуклеотидные последовательности, регулярно распределенные по геному крысы, специфично взаимодействующие с восстановленной формой кортизола - тетрагидрокортизолом в присутствии аполипопротеина A-I. На основании полученных результатов и их сопоставления с литературными данными сделан вывод, что такие последовательности играют важную роль в регуляции экспрессии генов, создавая особые «узнаваемые» матричными ферментами структуры.

Показана функциональная роль комплексов апоА-1-стероидный гормон (тетрагидрокортизол, андростерон, дегидроэпиандростерон, дегидроэпиандростерон-сульфат) при взаимодействии с ДНК эукариот, заключающаяся в изменении ее вторичной структуры и, как следствие, активность этих комплексов в процессах транскрипции и репликации ДНК. Высказано экспериментально обоснованное положение о функциональной роли комплексов стероидный гормон-аполипопротеина A-I, подобной роли факторов или кофакторов транскрипции и репликации, связанных с регуляцией синтеза белка и внутриклеточной регенерацией. Теоретическая и практическая значимость работы. Данные, полученные в процессе решения поставленных в работе задач, имеют фундаментальное значение для развития представлений о паракринной регуляции, ее роли в механизмах адаптации с участием макрофагов, метаболитов стероидных гормонов и аполипопротеина A-I. В работе предложен и подробно изучен in vitro молекулярный механизм регуляции репликации ДНК и транскрипции генов, ключевая роль в котором принадлежит метаболитам стероидных гормонов (тетрагидрокортизол, андростерон) в комплексе с аполипопротеином A-I. Найденные в геноме крысы неизвестные ранее структурные элементы и особенности их взаимодействия с ферментами в присутствии аполипопротеина A-I и стероидных гормонов дополняют современные знания о структурно-функциональной организации генома эукариот. Полученные в работе результаты важны для анализа молекулярных механизмов взаимодействия в системе макрофаг - опухолевая клетка, макрофаг - лимфоцит и в некоторых других процессах иммунного ответа. Выводы, вытекающие из данных работы, вносят существенный вклад в представления о сигнальных трансдукторных системах, участвующих в механизмах регенерации. Полученные данные позволят найти новые решения в коррекции дегенеративно-деструктивных процессов в органах и тканях, а также при лечении онкологических и иммунных заболеваний. Основные положения, выносимые на защиту.

1) Взаимодействие стероидных гормонов и метаболитов: кортизола, тетрагидрокортизола, дегидроэпиандростерона, андростерона, дегидроэпиандростерон-сульфата, с нативной ДНК in vitro приводит к образованию в ней одноцепочечных участков. В присутствии аполипопротеина A-I их количество существенно возрастает для стероидов: тетрагидрокортизол, андростерон, дегидроэпиандростерон и дегидроэпиандростерон-сульфат. Аполипопротеин Е не влияет на количество однонитевых участков в ДНК.

2) Аполипопротеин A-I имеет высокое сродство как к природной ДНК, так и к синтетическим олигодезоксирибонуклеотидам разного состава.

3) Связывание комплексов апоА-1-стероид (тетрагидрокортизол, дегидроэпиандростерон-сульфат) с нуклеотидными последовательностями вида (GCC/CGG)n приводит к образованию одноцепочечных (S1-нуклеазочувствительных) участков вблизи них.

4) Нуклеотидные последовательности ДНК, способные взаимодействовать с комплексом апоА-1-тетрагидрокортизол с образованием однонитевых S1 -нуклеазочувствительных участков, представлены в геноме в количестве, не меньшем, чем 2 на 100 т.п.н.

5) Найден повторяющийся элемент генома крысы размером 5,5 т.п.н., способный дозозависимо связывать комплекс апоА-1-тетрагидрокортизол с образованием одноцепочечных участков, чувствительных к нуклеазе S1.

6) Синтетические олигонуклеотиды различного состава и длины связываются с апоА-I и его комплексом с тетрагидрокортизолом. В образующихся аддуктах преобладают гидрофобные, а не электростатические взаимодействия.

8) Тетрагидрокортизол, но не кортизол, в небольшой степени активирует копирование ДНК; 50-кратный избыток тетрагидрокортизола подавляет копирование. Комплексы апоА-1-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон) дозозависимо активируют копирование ДНК крысы и человека in vitro. Значительный мольный избыток (выше 100-кратного) комплексов апоА-1-стероид полностью подавляет реакцию копирования.

9) Комплекс апоА-1-тетрагидрокортизол активирует транскрипцию in vitro ДНК крысы, катализируемую РНК-полимеразами белкового экстракта ядер из клеток печени; при 20-кратном мольном избытке комплекса транскрипция ингибируется.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации изложены в 25 работах, опубликованных в центральных российских и международных реферируемых изданиях. Результаты работы были представлены на международном конгрессе "Progressive Scientific Technologies for Human Health" (Украина, Феодосия) в 2003 г., на международном симпозиуме "Molecular mechanisms of cell function regulation (Россия, Тюмень) в 2005 г., международной конференции "Neuroscience for Medicine and Psychology" (Украина, Судак) в 2006 г., на международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Россия, Москва-Дубна) в 2007 г., на ученом совете и семинарах НИИ биохимии СО РАМН.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гимаутдинова, Ольга Ивановна

ВЫВОДЫ

1. Взаимодействие стероидных гормонов и их метаболитов: кортизола, тетрагидрокортизола, андростерона, дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростерон-сульфата, с нативной ДНК приводит к образованию одноцепочечных участков, чувствительных к действию S1 нуклеазы. Предшественник стероидных гормонов - холестерин не влияет на вторичную структуру ДНК.

3. В присутствии аполипопротеина A-I в 10-15 раз возрастает количество одноцепочечных участков, возникающих под влиянием тетрагидрокортизола, андростерона, дегидроэпиандростерона и его сульфата, но не кортизола. Аполипопротеин Е не влияет на количество однонитевых участков в ДНК.

4. Связывание комплекса аполипопротеин A-I-стероид (тетрагидрокортизол, дегидроэпиандростерон-сульфат) с последовательностями ДНК вида (gCC/Cgg)n приводит к образованию одноцепочечных участков вблизи них. В геноме крысы такие участки представлены в количестве, не меньшем, чем 2 на 100 т.п.н. ДНК.

5. Обнаружен повторяющийся элемент генома крысы размером 5,5 т.п.н., способный связывать комплекс аполипопротеин A-1-тетрагидрокортизол с образованием одноцепочечных участков.

6. Дуплексы CCgCCgCCgCC-ggCggCggCgg и AnCCgCCgCCgCC-ggCggCggCggTn (п=3, 6) при взаимодействии с комплексом аполипопротеин A-1-теграгидрокортизол становятся чувствительными к нуклеазе S1. Олигонуклеотиды AnCCgCCgCCgCC в присутствии комплекса апоА-1-тетрагидрокортизол более подвержены гидролизу нуклеазой S1, чем ggCggCggCggTn (п=3, 6).

7. Олигонуклеотиды ggCggCggCggTn (n=3, 6) избирательно связываются с комплексом аполипопротеин A-I-тетрагидрокортизол как в свободном состоянии, так и в составе комплементарного дуплекса, становясь практически недоступными действию нуклеазы S1 и ДНКазы I. Минимальная нуклеотидная последовательность, связывающая комплекс апоА-1-тетрагидрокортизол и недоступная действию нуклеаз, представляет собой 5^-ggCggCggCggT3±lN.

8. Копирование ДНК in vitro с измененной под влиянием комплекса апоА-1-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон) вторичной структурой катализируется как фрагментом Кленова, так и ДНК-полимеразами из белкового экстракта ядер клеток крысы. При мольном соотношении ДНК/комплекс аполипопротеин A-I-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон), равном 1:50, синтезируется на 22-27 % больше копий ДНК, чем в отсутствии комплекса. 100-кратный мольный избыток комплекса апоА-1-стероид полностью подавляет копирование ДНК. Тетрагидрокортизол, но не кортизол, активирует копирование ДНК; 50-кратный избыток тетрагидрокортизола подавляет копирование.

9. Комплекс аполипопротеин A-I-тетрагидрокортизол активирует транскрипцию ДНК крысы in vitro, катализируемую РНК-полимеразами белкового экстракта из ядер клеток печени крысы; при 20-кратном мольном избытке комплекса транскрипция ингибируется.

10. Показана способность in vitro комплексов апоА-1-стероид (тетрагидрокортизол, дегидроэпиандростерон, андростерон) выполнять роль, подобную роли кофакторов/факторов, изменяющих структуру ДНК в процессах транскрипции и репликации.

Заключение

Таким образом, найден молекулярный механизм влияния стероидных гормонов и их метаболитов (ТГК, АС, ДЭА, ДЭАС) в комплексе с аполипопротеином A-I на ДНК. Он заключается в образовании одноцепочечных участков в нативной ДНК в сайтах их взаимодействия, т.е. локальном специфическом изменении вторичной структуры ДНК.

Обнаружены нуклеотидные последовательности, регулярно распределенные по геному крысы, специфично взаимодействующие с восстановленной формой кортизола — тетрагидрокортизолом в присутствии аполипопротеина A-I. На основании полученных результатов и их сопоставления с литературными данными сделан вывод, что такие последовательности играют важную роль в регуляции экспрессии генов, создавая особые «узнаваемые» матричными ферментами структуры.

Анализ изученных свойств апоА-I и его комплекса со стероидными гормонами позволяет установить наличие полифункциональных свойств у этого белка, а именно: 1) способность служить транспортным белком не только для липидов и не только в составе ЛПВП, но и способность в свободном состоянии транспортировать стероиды; 2) способность выполнять регуляторные функции в комплексе с метаболитами стероидных гормонов, активируя и копирование, и транскрипцию ДНК, по крайней мере, при некоторых состояниях организма в процессах адаптации к стрессу. Несомненно, для индукции этих процессов с участием комплекса апоА-1-стероидный гормон требуются дополнительные белковые факторы, которые присутствуют в клетках in vivo.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гимаутдинова, Ольга Ивановна, Новосибирск

1. Борисенков М.Ф., Карманов А.П., Канева A.M., Кочева Л.С., Вайкшнорайте М.А. Гепато-энтеральная циркуляция половых стероидных гормонов и гормон-зависимые опухоли // treskunov.narod.ru/conference2004/

2. Будкер В.Г., Гиршович А.С., Гринева Н.И., Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г., Кобец Н.Д. Специфическая химическая модификация рибосом вблизи мРНК-связывающего центра // Докл. АН СССР,- 1973.- Т. 211.- С. 725-728.

3. Вингендер Э. Классификация транскрипционных факторов эукариот // Молек. биол,- 1997.- Т. 31.- С. 584-600.

4. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. // Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука.- 1980.-С. 300-320.

5. Гимаутдинова О.И. Аффинная модификация рибосом E.coli производными олигоуридилатов с реакционноспособными группами на 5"-конце // Диссертация на соиск. уч. ст. канд. хим. наук. Новосибирск.- 1987.159 с.

6. Гринева Н.И., Ломакина Т.С., Тигеева Н.Г., Чимитова Т.А. Кинетика ионизации С-С1 связи в 4-(N-2-xлopэтил-N-мeтилaминo)бeнзил-5,-фосфамидах нуклеозидов и олигонуклеотидов // Биоорган. химия.-1977.-Т. 3.-С. 210-214.

7. Енукашвили Н.И., Лобов И.Б., Подгорная О.И. Ядерный матрикс человека содержит белковый комплекс, специфически связывающий альфа-сателлитную ДНК in vitro // Биохимия. 1999. - Т. 64- С. 564-573.

8. Иванова Н.Г., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Взаимодействие липопротеинов сыворотки со стероидными гормонами // Укр. Биохим. Журн,- 1991.- Т. 63,- С. 103-105.

9. Иммунно-ферментный анализ. Под ред. Нго Т.Т., Ленхоффа Г. М.: Мир,-1988.-446 с.

10. Кауфман С.А. Антихаос и приспособление // В мире науки. Scientific American.- 1991,- Т. 10,- С. 58-65.

11. Кветной И.М., Ярилин А.А., Полякова В .О., Князькин И.В. Нейроиммуноэндокринология тимуса. Научная серия «Молекулярная нейроиммуноэндокринология». С.-Пб.- 2005.- С. 11-23.

12. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия: Пер. с нем. М.: Мир.-2000,- 469 с.

13. Кузнецов П.А. Влияние стероидных гормонов и их комплексов с аполипопротеином A-I на структуру ДНК // Диссертация на соиск. уч. ст. канд. биол. наук. Новосибирск.- 2004.-119 с.

14. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Общая гормонология. Определение, значение, свойства и механизмы действия гормонов. Иркутск.-2005.-142 с.

15. Куницын В.Г. Структурные фазовые переходы в мембранах эритроцитов, липопротеинах и макромолекулах // Диссертация на соиск. уч. ст. докт. биол. наук. Новосибирск.- 2002.- С. 205-215.

16. Лобов И.Б., Подгорная О.И. Роль белков ядерного матрикса в формировании гетерохроматина// Цитология. 1999. - Т. 41. - С. 562 - 573.

17. Лукашев В. А. Разработка теоретических методов анализа функциональных элементов в белках по инвариантным структурным характеристикам // Диссертация на соиск. уч. ст. канд. биол. наук.-Новосибирск.-1992.-191 с.

18. Максимов В. Ф., Коростышевская И. М. Изменение ультраструктуры ядер гепатоцитов при перфузии печени разными классами липопротеинов в присутствии глюкокортикоидов // Бюллетень СО РАМН.- 1998,- Т. 89.- С. 4751.

19. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир.- 1984.- С. 272.

20. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В.М. Биохимия человека. М.: Мир.- 2004.- 391 с.

21. Маянский Д.Н. Хроническое воспаление. М.: Медицина.- 1991.- 272 с.

22. Мейнуоринг У. Механизмы действия андрогенов. М.:Мир.-1979.- 224 с.

23. Меркулова Т.И., Меркулов В.М., Митина Р. Л. Механизмы глюкокортикоидной регуляции и регулягорные зоны генов, контролируемых глюкокортикоидами: описание в базе данных TRRD // Молек. биол,- 1997.- Т. 31,- С. 714-725.

24. Мертвецов Н.П. Регуляция экспрессии генов стероидными гормонами. Новосибирск: Наука.- 1990. 264 с.

25. Мишенина Г.Ф., Самуков В.В., Шубина Т.Н. Селективная модификация монозамещенных фосфатных групп в 5'-моно- и полифосфатах нуклеозидов и олигонуклеотидов //Биоорган. химия.-1979.-Т. 5.-С. 886-893.

26. Озолинь О.Н., Деев А.А. Неканонические структурные элементы промоторной ДНК и их роль в комплексообразовании с РНК-полимеразой // Молек. биол.- 1998.- Т. 32,- С. 441-446.

27. Панин Л.Е. Биохимические механизмы стресса. Новосибирск: Наука. -1983.-233 с.

28. Панин JI. Е. Роль кооперативного эффекта липопротеинов и гормонов в регуляции лизосомального аппарата клеток // Вопр. Мед. Хим. 1987. - Т. 33. -С. 96-102.

29. Панин Л.Е. Система мононуклеарных фагоцитов и регенераторно-восстановительные процессы // Бюлл. СО РАМН.- 1996.- №2.- С.62-69.

30. Панин Л.Е. Функциональная роль тетрагидропроизводных стероидных гормонов. Эндокринные механизмы регуляции функции в норме и патологии. Новосибирск.- 1997. С. 117-118.

31. Панин Л.Е., Биушкина Н.Г., Поляков Л.М. Количественная характеристика взаимодействия липопротеинов сыворотки крови со стероидными гормонами // Бюлл. Эксп. Биол. и Медицины. 1992. - Т. 112. -С. 34-36.

32. Панин Л.Е., Максимов В.Ф., Коростышевская И.М. Активация ядрышковой ДНК и биосинтеза рибосом в гепатоцитах под влиянием глюкокортикоидов и липопротеинов высокой плотности // Цитология.- 2000.Т. 42,- С. 461-467.

33. Панин Л. Е., Поляков Л. М., Усынин И. Ф., Кузьменко А. П., Потеряева О. Н. Иммунохимическая идентификация апопротеина A-I в хроматине ядер гепатоцитов крыс // Биополимеры и клетка.- 1992,- Т. 8.- С. 44-49.

34. Панин Л.Е., Русских Г.С., Поляков Л.М. Обнаружение иммунореактивности к аполипопротеинам A-I, В и Е в ядрах клеток тканей крыс // Биохимия,- 2000.-Т. 65.-С. 1684-1689.

35. Панин Л.Е., Свечникова И.Г., Маянская Н.Н. Роль плазменных липопротеидов как модуляторов специфического гормонального эффекта гидрокортизона //Вопр. мед. химии. 1990а. - Т. 36. - С. 60-62.

36. Панин Л.Е., Соколова М.В., Усынин И.Ф. Изменение скорости биосинтеза белка в паренхимных клетках печени при стимуляции системы мононуклеарных фагоцитов // Цитология. 19906. - №5. - С. 528-532.

37. Панин JI.E., Усынин И.Ф., Харьковский А.В. Явление стимуляции резидентными макрофагами биосинтеза белка в паренхимных клетках органов и тканей в процессе регенерации. Диплом № 99 Международной Ассоциации авторов научных открытий. Москва.- 1999.

38. Панин JI.E., Усынин И.Ф., Харьковский А.В., Трубицина О.М. Роль клеток Купфера в регуляции биосинтеза белка в гепатоцитах // Вопр. мед. химии,- 1994,- Т. 40.- С. 6-8.

39. Панин JI.E. Хощенко О.М. Роль резидентных макрофагов в регуляции биосинтеза ДНК и белка в клетках асцитной гепатомы мышей линии А // Вопросы онкологии. 2003. - Т. 49.- С. 472-475.

40. Панин JI.E., Хощенко О.М. Усынин И.Ф. Роль аполипопротеина A-I в реализации анаболического действия стероидных гормонов // Проблемы эндокринологии. 2002,- №6. - С. 45-48.

41. Панков Ю.А. Новые гормоны и проблемы молекулярной эндокринологии// Проблемы эндокринологии. -1998.- Т. 44.- С. 3-7.

42. Панков Ю. А. Первые достижения в молекулярной эндокринологии, полученные с использованием систем Cre/LoxP // Молек. биология. 2001.Т. 35. - С. 372-375.

43. Паташинский А.З., Шумило Б.И. // Тезисы докл. на симпозиуме "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках". Пущино,- 1985.-С. 3-4.

44. Перевозчиков А. П. Экспрессия гена аполипопротеина A-I человека в клетках млекопитающих // Автореферат докт. диссерт. С.-П,- 1997.

45. Перевозчиков А.П., Орлов С.В., Кутейкин К.В. Связывание GCC-элементов с ядерными белками // Докл. Акад. Наук. 1994. - Т. 38. - С. 411415.

46. Поляков JI.M., Потеряева О.Н., Панин JI.E. Определение аполипопротеина A-I методом иммуноферментного анализа // Вопросы мед. химии. 1991. - Т. 37. - С. 89-92.

47. Потапенко А.И., Обухова JI.K. Дефекты вторичной структуры ДНК, опознаваемые нуклеазой S1, и их возможная роль в старении соматических клеток млекопитающих // Изв. акад. наук, биол. серия. №6. - С. 940-943.

48. РНКазин. CSH Protocols, Jan 2006: pdb.rec9138.

49. Родионов М.А., Галактионов С.Г., Ахрем А.А. Профили координационных чисел белков // Докл. Акад. Наук.- 1981.-Т. 261.- С. 756759.

50. Розен В. Б. Основы эндокринологии. М.: Высшая школа.- 1984.- С. 336.

51. Розен В. Б., Смирнов А. Н. Рецепторы и стероидные гормоны. М.: МГУ.- 1981.-312 с.

52. Романенко Е. Б., Демиденко 3. Н., Ванюшин Б. Ф. РНК-полимеразная, ДНК-полимеразная, ДНК-метилтрансферазная и сфингомиелазная активность в ядрах печени крыс различного возраста // Биохимия. 1998. - Т. 63.-С. 194-199.

53. Свергун Д.И., Фейгин J1.A. // Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. М.: Наука.- 1986.- 279 с.

54. Светловаа Е.Ю., Разин С.В., Филипский Я. Картирование участков гиперчувствительности к нуклеазе S1 в III хромосоме дрожжей saccharomyces cerevisiae // Докл. Акад. Наук. 1997. -Т. 353.- С. 831-833.

55. Светлова6 Е.Ю., Разин С.В., Филипский Я. Определение участков гиперчувствительности к нуклеазе S1 в дрожжевой искуственной хромосоме, включающей домен (3-глобиновых генов человека // Докл. Акад. Наук. -1997.-том 353,-С. 562-564.

56. Селье Г. Стресс без дистресса. М.: Прогресс.- 1979.- 124 с.

57. Сергеев П. В. Стероидные гормоны. М.: Наука,- 1984. С. 240.

58. Студитский В.М. Транскрипция хроматина // Молек. биол.- 2001.- Т. 35,- С. 235-247.

59. Ткачук В.А. Введение в молекулярную эндокринологию. М.: МГУ.-1983,- 256 с.

60. Уотсон Д. Молекулярная биология гена. М.: Мир,- 1978. С. 285-288.

61. Усынин И.Ф. Роль макрофагов в регуляции метаболических процессов в печени при функциональном напряжении организма // Диссертация на соиск. уч. ст. докт. биол. наук. Новосибирск.- 1999.- с.

62. Хефтман Э. Биохимия стероидов. М.: Мир.- 1972.

63. Холодова Ю.Д., Чаяло П.П. Липопротеины крови. Киев: Наук. Думка. 1990.- С. 208.

64. Худолий Г. А., Обухова Л.К., Акифьев А.П. Изменение чувствительности ДНК к нуклеазе S1 в процессе старения и после воздействия геропротектором в эксперименте // Докл. АН СССР. 1980. - Т. 254.-С. 507-509.

65. Allfrey V.C., Faulkner R., and Mirsky A.E. Acetylation and methylation of histones and their possible role in the regulation of RNA synthesis // Proc. Natl. Acad. Sci.- 1964,-V. 51.-P. 786-794.

66. Angel P., Imagawa M., Chiu R., Stein В., Imbra R.J., Rahmsdorf H.J., Jonat C., Herrlich P., Karin M. Phorbol ester-inducible genes contain a common cis element recognized by a TPA-modulated trans-acting factor // Cell.- 1987.- V. 49.-P. 729-739.

67. Anthony-Cahill S.J., Benfield P.A., Fairman R., Wasserman Z.R., Brenner S.L., Stafford III W.F., Altenbach C., Hubbell W.L., DeGrado W.F. Molecular characterization of helix-loop-helix peptides // Science.- 1992.- V. 255.- P. 979983.

68. Aposian H.V., Kornberg A. Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleic Acid. IX. The polymerase formed after T2 bacteriophage infection of Escherichia coli: a new enzyme // J. Biol. Chem.-1962.- V. 237.- P. 519-525.

69. Arthanari,H. and Bolton,P.H. (2001) Functional and dysfunctional roles of quadruplex DNA in cells // Chem. Biol.- V. 8.- P. 221-230.

70. Attisano L. and Wrana J.L. Signal transduction by the TGF-beta superfamily // Science.- 2002,- V. 296.- P. 1646-1647.

71. Babu M.M., and Teichmann S. Functional determinants of transcription factors in Escherihia coli: protein families and binding sites // Trends in Genetics.-2003.-V. 19,-P. 75-79.

72. Bartsch C., Bartsch H., Karasek M. Melatonin in clinical oncology // Neuroendocrinol. Lett.- 2002,- V. 236.- P. 30-38.

73. Bartholeyns J. Monocytes and macrophages in cancer immunotherapy // Res. Immunol.- 1993,- V. 144.- P. 288-291.

74. Baxter J.D., Rousseau G.G. Glucocorticoid hormone action. N.Y.: Springer Verlag.- 1979.

75. Beato M., Chalepakis G., Schauer M., Slater E.P. DNA regulatory elements for steroid hormones // J. Steroid. Biochem.- 1989.- V. 32,- P. 737-747.

76. Bjorklund S., Kim Y.-J. Mediator of transcriptional regulation // Trends Biochem. Sci.- 1996.- V. 21.- P. 335-337.

77. Blin N., Stafford D.W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes // Nucleic Acids Res. 1976. - V. 3. - P. 23032308.

78. Bondarenko V.A., Liu Y.V., Jiang Y.I., and Studitsky V.M. Communication over a large distance: enhancers and insulators // Biochem. Cell. Biol.- 2003.- V. 81,-P. 241-251.

79. Bonne C. From stimulus to message in biological systems, an illustrated survey // Plenary lecture presented at the 8th GIRI Meeting. Jerusalem, Israel.-1994. (Universite Montpellier I, Faculte de Pharmacie).

80. Boulias К. and Talianidis I. Functional role of G9a-induced histone methylation in small heterodimer partner-mediated transcriptional repression // Nucleic Acids Res.- 2004,- V. 32,- P. 6096 6103.

81. Boumpas, D.T., G.P. Chrousos, R.L. Wilder, T.R. Cupps, and J.E. Balow. Glucocorticoid therapy for immune-mediated diseases: basic and clinical correlates //Ann. Intern. Med.- 1993.-V. 119,-P. 1198-1208.

82. Bresnik E.H., Dalman F.C., Sanchez E.R., Pratt W.B. Evidence that the 90-kDa heat shock protein is necessary for the steroid binding conformation of the L cell glucocorticoid receptor// J. Biol. Chem.- 1989.- V. 264.- P. 4992-4997.

83. Brewer H.B., Fairwell Т., LaRue A., Ronan R., Houser A., and Bronzert T.J. The amino acid sequence of human APOA-I, an apolipoprotein isolated from high density lipoproteins // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1978.- V. 80.- P. 623630.

84. Brivanlou A.H., and Darnell J.E. Signal transduction and the control of gene expression // Science.- 2002.- V. 295,- P. 813-818.

85. Brown C.E., Lechner Т., Howe L., and Workman J.L. The many HATs of transcription coactivators.- Trends Biochem. Sci.- 2000.- V. 25.- P. 15-19.

86. Brown S.A. and Kingston R.E. Disruption of downstream chromatin directed by a transcriptional activator // Genes & Dev.- 1997.- V. 11.- P. 3116 -3121.

87. Brown W.V. and Baginsky M.L. Inhibition of lipoprotein lipase by an apoprotein of human very low density lipoprotein // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1972,- V. 46,- P. 375-382.

88. Brunvand M.W., Schmidt A., Siebenlist U. Nuclear factors interacting with the mitogen-responsive regulatory region of the interleukin-2 gene // J. Biol. Chem.- 1988,-V. 263,- P. 18904-18910.

89. Budarf M. Blackburn E. SI nuclease sensitivity of a double-stranded telomeric DNA sequence //Nucleic Acids Res.- 1987.- V. 15,- P. 6273-6292.

90. Budker V.G., Girshovich A.S., Grineva N.I., Karpova G.G., and Knorre D.G. Specific chemical modification of ribosomes near the mRNA-binding center // Dokl. Akad. Nauk SSSR.- 1973,- V. 211,- P. 725-728.

91. Carey M. The enhanceosome and transcriptional synergy // Cell.- 1998.- V. 92.-P. 5-8.

92. Castelli W.P., Doyle J.T., Gordon Т., Hames C.H., Hjortland M.C., Hulley S.B., Kagan A., Zukel W.J. HDL cholesterol and other lipids in coronary heart disease. The cooperative lipoprotein phenotyping study // Circulation.- 1977.- V. 55,-P. 767-772.

93. Cavailles V., Dauvois S., L'Horset F., Lopez G., Hoare S., Kushner P.J., and Parker M.G. Nuclear factor RIP 140 modulates transcriptional activation by the estrogen receptor // EMBO J.- 1995.- V. 14,- P. 3741-3751.

94. Chetsanga C.J., Rushlow K., Boyd V.T. Caffeine enhancement of digestion of DNA by nuclease SI // Mutation Research.- 1976,-V. 34.-P. 11-20.

95. Chiu R., Angel P., Karin M. Jun-B differs in its biological properties from, and is a negative regulator of, c-Jun // Cell.- 1989.- V. 59.- P. 979-986.

96. Cho Y., Gorina S., Jeffrey P.D., Pavletich N.P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations // Science.-1994,- V. 265,-P. 346-355.

97. Choy В., Green M.R. Eukaryotic activators function during multiple steps of preinitiation complex assembly//Nature.- 1993,- V. 366.- P. 531-536.

98. Chrousos, G.P., The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation//N. Engl. J. Med.- 1995.- V. 332.-P. 1351-1362.

99. Chung H., Randolph A., Reardon I., Heinrikson R.L. The covalent structure of apolipoprotein A-I from canine high density lipoproteins // J. Biol. Chem. 1982.-V.257.-P. 2961-2967.

100. Cirillo L.A., Lin F.R., Cuesta I., Friedman D., Jarnik M., and Zaret K.S. Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4 // Mol. Cell.- 2002.- V. 9,- P. 279-289.

101. Clark K.L., Halay E.D., Lai E., and Burley S.K. Co-crystal structure of the HNF-3/forkhead DNA-recognition motif resembles histone H5 // Nature.- 1993 -V. 364,-P. 412-420.

102. Clark A.F., Lane D., Wilson K., Miggans S.T., and McCartney M.D. Inhibition of dexamethasone-induced cytoskeletal changes in cultured human trabecular meshwork cells by tetrahydroCortisol // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.-1996,- V. 37,- P. 805-811.

103. Cohen E.A., Subbramanian R.A., and Gottlinger H.G. Role of auxiliary proteins in retroviral morphogenesis // Curr. Top. Microbiol. Immunol.- 1996.- V. 214.- P. 219-235.

104. Collins J.M., Glock M.S., Chu A.K. Nuclease SI sensitive sites in parental deoxyribonucleic acid of cold- and temperature-sensitive mammalian cells // Biochemistry.- 1982.- V. 21,- P. 3414-3419.

105. Conti A., Maestrony J.M. The clinical neuroimmunotherapeutic role of melatonin in oncology // J. Pineal. Res.- 1995,- V. 19.- P. 103-110.

106. Darimont B.D., Wagner R.L., Apriletti J.W., Stallcup M.R., Kushner P.J., Baxter J.D., Fletterick R.J., and Yamamoto K.R. Structure and specificity of nuclear receptor-coactivator interactions U Genes&Development.- 1998.- V. 12,-P. 3343-3356.

107. Davidson W. S., Hazlett Т., Mantulin W. W., and Jonas A. The role of apolipoprotein Al domains in lipid binding // Proc. Natl. Acad. Sci. USA (Biochemistry).- 1996.-V. 93.-P. 13605-13610.

108. Denis M., Wikstrom A.G., Gustafsson J.-A. The molybdate-stabilized nonactivated glucocorticoid receptor contains a dimer of Mr 90,000 non-hormone-binding protein//J. Biol. Chem.- 1987.-V. 262.-P. 11803-11806.

109. Dieci G., Sentenac A. Detours and shortcuts to transcription reinitiation.

110. Dignam J.D., Lebovitz R.M., and Roeder R.G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei // Nucleic Acids Res.- 1983,- V. 11,- P. 1475-1489.

111. DiPietro L.A. Wound healing: the role of the macrophage and other immune cells // Shock.- 1995,- V. 4,- P. 233-240.

112. Dynan W.S. Modularity in promoters and enhancers // Cell.- 1989.- V. 58.-P. 1-4.

113. Edwards J. // www.mblab.gla.ac.uky~julian7dict2.cgi? 1768.- 2006.

114. Encio I.J., Deterawadleigh S.D. The genomic structure of the human glucocorticoid receptor// J. Biol. Chem.- 1991,- V. 266.- P. 7182-7188.

115. Falkenstein E., Norman A.W., and Wehling M. Mannheim classification of nongenomically initiated (rapid) steroid action(s) // J. Clin. Endocrinol. Metab.-2000,- V. 85.-P. 2072-2075.

116. Favre G., Tazi K.A., Le Gaillard F., Bennis F., Hachem H., and Soula G. High density lipoprotein 3 binding sites are related to DNA biosynthesis in the adenocarcinoma cell line A549 // J. Lipid Res.- 1993,- V. 34,- P. 1093-1100.

117. Felsenfeld G., Boyes J., Chung J., Clark D., and Studitsky V. Chromatin structure and gene expression // Proc. Natl. Acad. Sci.- 1996.- V. 93.- P. 93849388.

118. Ferrari S., Harley V.R., Pontiggia A., Goodfellow P.N., Lovell-Badge R., Bianchi M.E. SRY, like HMG1, recognizes sharp angles in DNA // EMBO J.-1992.-V. 11.-P. 4497-4506.

119. Fong Y.W. and Zhou Q. Stimulatory effect of splicing factors on transcriptional elongation//Nature.- 2001.- V. 414.- P. 929-933.

120. Foulkes N.S., Mellstrom В., Benusiglio E., Sassone-Corsi P. Developmental switch of CREM function during spermatogenesis: from antagonist to activator // Nature.- 1992,- V. 355.- P. 80-84.

121. Garrett R.H., and Grisham Ch.M. Molecular Aspects of Cell Biology. Saunders College Publ., Fort Worth, Philadelphia.- 1995,- P. 1180-1254.

122. Ge R., Rhee M., Malik S. and Karathanasis S.K. Transcriptional repression of apolipoprotein AI expression by orphan receptor ARP-1 // J. Biol. Chem.-1994.- V. 269,-P. 13185-13192.

123. Ghosh G., van Duyne G., Ghosh S., Sigler P.B. Structure of NF-Kappa-B P50 homodimer bound to a Kappa-B site //Nature.- 1995.- V. 373,- P. 303-310.

124. Gimautdinova O.I., Karpova G.G., Kobetch N.D., Knorre D.G. The proteins of the messenger RNA binding site of E. coli ribosomes // Nucleic Acids Res-1981.- V. 9,- P. 3465-3481.

125. Glass C.K., and Rosenfeld M.G. The coregulator exchange in transcriptional function of nuclear receptors // Genes Dev.- 2000.- V. 14,- P. 121-141.

126. Glattard E., Muller A., Aunis D., Metz-Boutigue M.H., Stefano G.B., and Goumon Y. Rethinking the opiate system? Morphine and morphine-6-glucuronide as new endocrine and neuroendocrine mediators // Med. Sci. Monit.- 2006.- V. 12-P. 25-27.

127. Gordon J. I., Smith O. P., Andy R., Alpers D. H. The primary translation product of rat intestinal apolipoprotein A-I mRNA is an unusual preproprotein // J. Biol. Chem.- 1982.- V. 257,- P. 971-978.

128. Green V.J., Kokkotou E., and Ladias J.A. Critical structural elements and multitarge protein interactions of the transcriptional activator AF-1 of hepatocyte nuclear factor 4 // J. Biol. Chem.- 1998.- V. 273,- P. 29950-29957.

129. Grineva N.I. and Karpova G.G. Complementarity addressed modification of rRNA with p-(chloroethylmethylamino) benzylidene hexanucleotides // FEBS Lett.- 1973.-V. 32.- P. 351-355.

130. Grunstein M. Histon acetylation in chromatin structure and transcription // Nature.- 1997.- V. 389.- P. 349-352.

131. Hadzopoulou-Cladaras M., Kistanova E., Evagelopoulou C., Zeng S., Cladaras C. and Ladias J.A. Functional domains of the nuclear receptor hepatocyte nuclear factor 4 // J. Biol. Chem.- 1997.- V. 272.- P. 539-550.

132. Hai Т., Curran T. Cross-family dimerization of transcription factors Fos Jun and ATF CREB alters DNA-binding specificity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1991,- V. 88,- P. 3720-3724.

133. Hanas J.S., Hazuda D.J., Bogenhagen D.F., Wu F.Y.H., Wu C.W. Xenopus transcription factor A requires zinc for binding to the 5 S RNA gene // J. Biol. Chem.- 1983,- V. 258,- P. 14120-14125.

134. Handwerger S., Myers S., Richards R., Richardson В., Turzai L., Moeykins C., Meyer Т., Anantharamahiah G. M. Apolipoprotein A-I stimulates placental lactogen expression by human trophoblast cells // Endocrinology.- 1995 V. 136.-P. 5555-5560.

135. Harnish D.C., Malik S., and Karathanasis S.K. Activation of apolipoprotein Al gene transcription by the liver-enriched factor HNF-3 // J. Biol. Chem.- 1994.-V. 269,- P. 28220-28226.

136. Harnish D.C., Malik S., Kilbourne E., Costa R., and Karathanasis S.K. Control of the apolipoprotein Al gene expression through synergistic interactions between hepatocyte nuclear factors 3 and 4 // J. Biol. Chem.- 1996.- V. 271.- P. 13621-13628.

137. Hatch F.T., Lees R.S. Practical methods for plasma lipoprotein analysis // Adv. Lipid Res.- 1968.- V. 6.- P. 2-68.

138. Hayhurst G.P., Lee Y.H., Lambert G., Ward J.M., and Gonzalez F.G. Hepatocyte nuclear factor 4alpha (nuclear receptor 2A1) is essential for maintenance of hepatic gene expression and lipid homeostasis // Mol. Cell. Biol.-2001,-V. 21,-P. 1393-1403.

139. Haynes R.C. The pharmacological basis of therapeutics. N.Y.: Pergamon Press.- 1990.- P.1431-1462.

140. Hernandez N. TBP, a universal eukaryotic transcription factor? // Genes Dev.- 1993- V. 7,- P. 1291-1308.

141. Hertz R., Magenheim J., Berman I., and Bar-Tana J. Fatty acyl-CoA thioesters are ligands of hepatic nuclear factor-4alpha// Nature.- 1998.- V. 392,- P. 512-516.

142. Holmquist G. DNA sequences in G-bands and R-bands // Chromosomes and Chromatin. Boca Raton: C. R. C. Rress.- 1988.- V. 2.- P. 75-121.

143. Holstege F.C., Jennings E.G., Wyrick J.J., Lee T.i., Hengartner C.J., Green M.R., Golub T.R., Lander E.S., and Young R.A. Dissecting the regulatory circuitry of a eukaryotic genom // Cell.- 1998,- V. 95.- P. 717-728.

144. Hromas R. and Costa R. The hepatocyte nuclear factor-3/forkhead transcription regulatory family in development, inflammation and neoplasia // Crit. Rev. Oncol. Hematol.- 1995.- V. 20,- P. 129-140.

145. Ingle D.J., Nilson H.W., and Kendall E.C. The effect of cortin on the concentrations of some constituents of the blood of adrenalectomized rats // Am. J. Physiol. (Legacy Content).- 1937,- V. 118.- P. 302-308.

146. Jain J., McCaffrey P.G., Miner Z., Kerppola Т.К., Lambert J.N., Verdine G.L., Curran Т., Rao A. The T-cell transcription factor NFATp is a substrate for calcineurin and interacts with Fos and Jun // Nature.- 1993.- V. 365.- P. 352-355.

147. Jane S.M., Nienhuis A.W., Cunningham J.M. Hemoglobin switching in man and chicken is mediated by a heteromeric complex between the ubiquitous transcription factor Cp2 and a developmentally specific protein // EMBO J.- 1995.-V. 14.-P. 97-105.

148. Kaiser K., Meisterrernst M. The human general cofactors // Trends Biochem. Sci.- 1996,-V. 21,-P. 342-345.

149. Kanda Y., Richards R. G., Handwerger S. Apolipoprotein A-I stimulates human placental lactogen release by activation of MAP kinase // Mol. Cell. Endocrinol.- 1998,-V. 1431.-P. 125-131.

150. Karathanasis S.K. Lipoprotein metabolism: high density lipoprotein // Monogr. Hum. Genet.- 1992.- V. 14.- P. 140-171.

151. Karathanasis S.K., McPerson J., Zannis V.I., and Breslow J.L. Isolation and characterization of the human apolipoprotein A-I gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1983а,- V. 80.- P. 6147-6151.

152. Karathanasis S.K., McPerson J., Zannis Y.I. and Breslow J.L. Linkage of human apoipoprotein A-I and C-III genes //Nature.- 1983b V. 304.- P. 371-373.

153. Kardassis D., Pardali K., and Zannis V.I. SMAD proteins transactivate the human ApoCIII promoter by interacting physically and functionally with hepatocyte nuclear factor 4 // J. Biol. Chem.- 2000.- V. 275.- P. 41405-41414.

154. Karlinsey J., Stamatoyannopoulos G., Enver T. Simultaneous purification of DNA and RNA from small numbers of eukaryotic cells // Anal. Biochem.- 1989.-V.180.-P. 303-306.

155. Karlseder J., Rotheneder H., Wintersberger E. Interaction of Spl with the growth- and cell cycle-regulated transcription factor E2F // Mol. and Cellul. Biology.- 1996,- V. 16,- P. 1659-1667.

156. Kee B.L., Arias J., and Montminy M.R. Adaptor-mediated recruitment of RNA polymerase II to a signal-dependent activator // J. Biol. Chem.- 1996.- V. 271.-P. 2373 -2375.

157. Keegan L., Gill G., and Ptashne M. Separation of the DNA binding from the transcription-activating function of a eukaryotic regulatory protein // Science.-1986.-V. 231,-P. 699-704.

158. Kel O.V., Romaschenko A.G., Kel A.E., Wingender E., Kolchanov N.A. A compilation of composite regulatory elements affecting gene-transcription in vertebrates //Nucleic Acids Res.- 1995,- V. 23.- P. 4097-4103.

159. Kilbourne E.J., Widom R., Harnish D.C., Malik S., and Karathanasis S.K. Involvment of early growth response factor Egr-1 in apolipoprotein AI gene transcription // J. Biol. Chem.- 1995,- V. 270.- P. 7004-7010.

160. Kim J.L., Nikolov D.B., Burley S.K. Co-crystal structure of TBP recognizing the minor groove of a TATA element // Nature.- 1993 V. 365.- P. 520-527.

161. Kim Y., Geiger J.H., Hahn S. Sigler P.B. Crystal structure of a yeast TBP/TATA-box complex//Nature.- 1993.- V. 365,- P. 512-520.

162. Kingston R.E., and Narlikar G.J. ATP-dependent remodeling and acetylation as regulators of chromatin fluidity// Genes&Dev.- 1999.- V. 13.- P. 2339-2352.

163. Kingston R.E., Bunker C.A., and Imbalzano A.N. Repression and activation by multiprotein complexes that alter chromatin structure // Genes&Dev.- 1996.- V. 10.- P. 905-920.

164. Kingston R.E., Green M.R. Modeling eukaryotic transcriptional activation // Current Biology.- 1994.- V. 4,- P. 325-331.

165. Kino Т., Gragerov A., Kopp J.B., Stauber R.H., Pavlakis G.N., Chrousos G.P. The HIV-1 virion-associated protein Vpr is a coactivator of the human glucocorticoid receptor // J. Exp. Med.- 1999,- V. 189.- P. 51-62.

166. Knezetic J.A., Felsenfeld G. Mechanism of developmental regulation of alpha pi, the chicken embryonic alpha-globin gene // Mol. Cell. Biol.- 1993.- V. 13,- P. 4632-4639.

167. Knorre D.G., Vlassov V.V. Affinity modification of biopolymers. CRC Press, Boca Raton, FL.- 1989.

168. Rroeker W.D., Kowalski D. Gene-sized pieces produced by digestion of linear duplex DNA with mung bean nuclease // Biochemistry.- 1978,- V. 17.- P. 3236-3243.

169. Krust A., Green S., Argos P., Kumar V., Walter P., Bornert J.M., Chambon P. The chicken oestrogen receptor sequence: homology with v-erbA and the human oestrogen and glucocorticoid receptors // EMBO J.- 1986.- V. 5.- P. 891-897.

170. Kugel J.F., Goodrich J.A. Translocation after synthesis of a four-nucleotide RNA commits RNA polymerase II to promoter escape // Mol. and Cellul. Biology.- 2002,- V. 22.- P. 762-773.

171. Kunitsyn Y.G., Panin L.E., Polyakov L.M. Anomalous change of viscosity and conductivity in blood plasma lipoproteins in the physiological temperature range // Intern. J. of Quantum Chemistry.- 2001.- V. 81.- P. 348-369.

172. Kurokawa R., Soderstrom M., Horlein A., Halashmi S., Brown M., Rosenfeld M.G., and Glass C.K. Polarity-specific activities of retinoic acid receptors determined by a co-repressor // Nature.- 1995.- V. 377 P. 451-454.

173. Kyte J., Xu K.Y., and Bayer R. Demonstration that lysine-501 of the alpha polypeptide of native sodium and potassium ion activated adenosinetriphosphatase is located on its cytoplasmic surface // Biochemistry.- 1987.- Y. 26.- P. 8350-8360.

174. Ladias J.A., Karathanasis S.K. Regulation of the apolipoprotein Al gene by ARP-1: a novel member of the steroid receptor superfamily // Science.- 1991,- V. 251.- P. 561-565.

175. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature.- 1970.- V. 227.- P. 680-685.

176. Lai E., Darnell J.E. Transcriptional control in hepatocytes: a window of a development// Trends Biochem. Sci.- 1991.- V. 16,- P. 427-430.

177. Laughon A., Scott M.P. Sequence of a Drosophila segmentation gene: protein structure homology with DNA-binding proteins // Nature.- 1984,- V. 310.-P. 25-31.

178. Le Douarin В., Nielsen A.L., Gamier J.M., Ichinose H., Jeanmougin F., Losson R., and Chambon P. A possible involvement of TIF 16 and TIFIb in theepigenetic control of transcription by nuclear receptors // EMBO J.- 1996.- V. 15.-P. 6701-6715.

179. Le Hir H., Nott A., and Moore M. How introns influence and enhance eukaryotic gene expression // TRENDS in Bioch. Sci.- 2003,- V. 28,- P. 215-220.

180. Lee J.W., Ryan F., Swafflied J.C., Johnston S.A., Moore D.D. Interaction of thyroid-hormone receptor with a conserved transcriptional mediator.- Nature.-1995.- V. 374.-P. 91-94.

181. Lee T.I. and Young R.A. Transcription of eukaryotic protein-coding genes // Annu. Rev. Genet.- 2000.- V. 34,- P. 77-137.

182. Li J., Ning G., and Duncan S. A. Mammalian hepatocyte differentiation requires the transcription factor HNF-4 // Genes & Dev.- 2000.- V. 14.- P. 464474.

183. Libri V., Onori A., Fanciulli M., Passananti C. and Corbi N. The artificial zinc finger protein "Blues" binds the enchancer of the fibroblast growth 4 and represses transcription // FEBS Lett.- 2004.- V. 560,- P. 75-80.

184. Lim L.C., Swendeman S.L., Sheffery M. Molecular-cloning of the alpha-globin transcription factor Cp2 // Mol. Cell. Biol.- 1992,- V. 12,- P. 828-835.

185. Lin-Su K., Zhou P., Arora N., Betensky B. P., New M. I., and Wilson R. C. In Vitro Expression Studies of a Novel Mutation д299 in a Patient Affected with

186. Apparent Mineralocorticoid Excess // J. Clin. Endocrinol. Metab.- 2004,- V. 89.- P. 2024-2027.

187. Long Yi-T., Li C.-Z., Kraatz H.-B., and Lee J.S. AC Impedance Spectroscopy of Native DNA and M-DNA // Biophys. J.- 2003,- V. 84.- P. 3218-3224.

188. Lorch Y., Cairns B.R., Zhang M., and Kornberg R.D. Activated RSC-nucleosome complex and persistently altered form of nucleosome // Cell.- 1998.-V. 94,- P. 29-34.

189. Lorch Y., Zhang M., and Kornberg. Histone octamer transfer by a chromatin-remodeling complex // Cell.- 1999,- V. 96.- P. 389-392.

190. Losel R. M., Falkenstein E., Feuring M., Schultz A., Tillmann H.-CH., Rossol-Haseroth K. and Wehling M. Nongenomic Steroid Action: Controversies, Questions, and Answers // Physiol. Rev.- 2003.- V. 83.- P. 965-1016.

191. Lu H. and Levine A J. Human TAFn31 protein is a transcriptional coactivator of the p53 protein // Proc. Natl. Acad. Sci.- 1995,- V. 92.- P. 51545158.

192. Luger K., Rechsteiner T.J., and Richmond T.J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones // Methods Enzymol.- 1999.- V. 304,- P. 3-19.

193. Luisi B.F., Xu W.X., Otwinowski Z., Freedman L.P., Yamamoto K.R., Sigler P.B. Crystallographic analysis of the interaction of the glucocorticoid receptor with DNA // Nature.-1991,- V. 352.- P. 497-505.

194. Lukashev V.A., Blinov V.M., Bogachev S.S., Vlaskin N.V. Profilies of coordinate numbers of proteins // Issue of Abstracts of All-Union working conference. Novosibirsk.- 1988.- P. 55.

195. Malik S. and Karathanasis S.K. TFIIB-directed transcriptional activation by the orphan nuclear receptor hepatocyte nuclear factor 4 // Mol. Cell. Biol.- 1996.-V. 16,-P. 1824-1831.

196. Malik S. Transcriptional regulation of the apolipoprotein Al gene // Fronties in Bioscience.- 2003.- V. 8.- P. 360-368.

197. Malik S., and Roeder R.G. Transcriptional regulation through Mediator-like coactivators in yeast and metazoan cells // Trends Biochem. Sci.- 2000.- V. 25.- P. 277-283.

198. Mangelsford D.J., Thummel C., Beato M., Herrlich P., Schutz G., Umesono K., Blumberg В., Kastner P., Mark M., Chambon P., Evans R.M. The nuclear receptor superfamily the 2nd decade // Cell.- 1995.- V. 83.- P. 835-839.

199. Manley J.L. Nuclear coupling: RNA processing reaches back to transcription // Nat. Struct. Biol.- 2002.- V. 9.- P. 790-791.

200. Mason H.L., Hoehn W.M., and Kendall E.C. Chemical studies of the suprarenal cortex. IV. Structures of compounds C, D, E, F, and G // J. Biol. Chem.-1938.-V. 124.-P. 459-474.

201. McMahon S.B., Monroe J.G. A ternary complex factor-dependent mechanism mediates induction of Egr-1 through selective serum response elements following antigen receptor cross-linking in B-lymphocytes /7 Mol. Cell. Biol.-1995,-V. 15,-P. 1086-1093.

202. Mellon P.L., Clegg C.H., Correl L.A., McKnight G.S. Regulation of transcription by cyclic AMP-dependent protein kinase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1989,-V. 86.-P. 4887-4891.

203. Mermod N., CTNeill E.A., Kelly T.J., Tjian R. The proline-rich transcriptional activator of CTF/NF-I is distinct from the replication and DNA binding domain // Cell.- 1989,- V. 58,- P. 741-753.

204. Miller J., McLachlan A.D., Klug A. Repetitive zinc-binding domains in the protein transcription factor IIIA from Xenopus oocytes // EMBO J.- 1985.- V. 4.-P. 1609-1614.

205. Miltenberger R.J., Sukow K.A., Farnham P.J. An E-Box-Mediated Increase in CAD Transcription at the G(l)/S-Phase Boundary Is Suppressed by Inhibitory C-myc Mutants // Mol. Cell. Biol.- 1995.- V. 15.- P. 2527-2535.

206. Mitchell P.J., and Tjian R. Transcriptional regulation in mammalian cells by sequence-specific DNA binding proteins // Science.- 1989.- V. 245,- P. 371-378.

207. Moreira J.M., Holmberg S. Transcriptional repression of the yeast CHA1 gene requires the chromatin-remodeling complex RSC // EMBO J.- 1999,- V. 18.-P. 2836-2844.

208. Muller C.W., Rey F.A., Sodeoka M., Verdine G.L., Harrison S.C. Structure of the NF-Kappa-B P50 homodimer bound to DNA // Nature.- 1995,- V. 373.- P. 311-317.

209. Muller C.W., Harrison S.C. The structure of the NF-Kappa-B P50-DNA-complex a starting point for analyzing the Rel family // FEBS Lett.- 1995.- V. 369,-P. 113-117.

210. Munck A., Foley R. Activation of steroid hormone-receptor complexes in intact target cells in physiological conditions // Nature.- 1979.- V. 278,- P. 752754.

211. Murphy D.J., Hardy S., and Engel D.A. Human SWI-SNF component BRG1 represses transcription of the c-fos gene // Mol. Cell. Biol.- 1999.- V. 19.- P. 27242733.

212. Myers L.C. and Kornberg R.D. Mediator of transcriptional regulation // Annu Rev. Biochem.- 2000.- V. 69.- P. 729-749.

213. Naar A.M., Lemon B.D., and Tjian R. Transcriptional coactivator complexes // Ann. Rev. Biochem.- 2001,- V. 70.- P. 475-501.

214. Nechustan H., Benvenisty N., Brandies R., Reshelf L. Glucocorticoids control phosphoenolpyruvate carboxykinase gene expression in a tissue specific manner //Nucleic Acids Res.- 1987,- V. 15,- P. 6405-6417.

215. Nightingale K.P., Wellinger R.E., Sogo J.M., and Becker P.B. Histone acetylation facilitates RNA polymerase II transcription of the Drosophila hsp26 gene in chromatin // EMBO J.- 1998.- V. 17.- P. 2865-2876.

216. Nikolov D.B., Hu S.-H., Lin J., Gasch A., Hoffmann A., Horikoshi M., Chua N.-H., Roeder R.G., Burley S.K. Crystal structure of TFIID TATA-box binding protein // Nature.- 1992.- V. 360,- P. 40-46.

217. Novak E.M., Budlowski S.P. NFY transcription factor binds to regulatory element AIC and transactivates the human apolipoprotein A-I promoter in HEPG2 cells //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1997.- V. 231.- P. 140-143.

218. Orphanides G., LeRoy G., Chang C.H., Luse D.S., and Reinberg D. FACT, a factor that facilitates transcript elongation through nucleosomes // Cell.- 1998.- V. 92.-P. 105-116.

219. Ocate S.A., Tsai S.Y., Tsai M.J., and CTMalley B.W. Sequence and characterization of a coactivator for the steroid hormone receptor superfamily II Science.- 1995.- V. 270,- P. 1354-1357.

220. Panin L.E., Maksimov V. F., Usynin I.F., Korostyshevskaya I.M. Activation of nucleolar DNA expression in hepatocytes by glucocorticoids and high density lipoproteins // J. Steroid Biochem. and Mol. Biol.- 2002.- Y. 81.- P. 69-76.

221. Papoulas О., Beek S.J., Moseley S.L., McCallum C.M., Sarte M., Shearn A., and Tamkun J.W. The Drosophila trithorax group proteins BRM, ASH1 and ASH2are subunits of distinct protein complexes // Development.- 1998.- V. 125.- P. 3955-3966.

222. Patel L., Abate C., Curan T. Altered protein conformation on DNA binding by Fos and Jun // Nature.- 1990.- V. 347,- P. 572-575.

223. Ptashne M. How eukaryotic transcriptional activators work // Nature.- 1988.-V.335.- P. 683-689.

224. Ptashne M., and Gann A. Transcriptional activation by recruitment // Nature.- 1997,-V. 386,- P. 569-577.

225. Pugh B.F. and Tjian R. Diverse transcriptional functions of the multisubunit TFIID complex // J. Biol. Chem.- 1992.- V. 267,- P. 679-682.

226. Pugh B.F. and Tjian R. Mechanism of transcriptional activation by Spl: evidence for coactivators // Cell.- 1990.- V. 61.- P. 1187-1197.

227. Quandt K., Freeh K., Karas H., Wingender E., and Werner T. Matind and Matinspector new fast and versatile tools for detection of consensus matches in nucleotide sequence data // Nucleic Acids Res.- 1995,- V. 23.- P. 4878-4884.

228. Rachez C., Lemon B.D., Suldan Z., Bromleigh V., Gamble M., Naar A.M., Erdjument-Bromage H., Tempst P., and Freedman L.P. Ligand-dependent transcription activation by nuclear receptors requires the DRIP complex // Nature.-1999,- V. 398,-P. 824-828.

229. Reddy M.V. Nuclease SI-mediated enhancement of the 32P-postlabeling assay for aromatic carcinogen-DNA adducts // Carcinogenesis 1991.- V. 12,- P. 1745-1748.

230. Redner R.L., Wang J., and Liu J.M. Chromatin remodeling and leukemia: new therapeutic paradigms // Blood.- 1999,- V. 94,- P. 417-428.

231. Reese J.C. Basal transcription factors: shedding new light on a complex process // Current Opin. in Genetics&Dev.- 2003,- V. 13.- P. 114-118.

232. Rhodes S.J., DiMattia G.E., Rosenfeld M.G. Transcriptional mechanisms in anterior pituitary cell differentiation // Current Opin. in Genetics&Dev.- 1994,- V. 4,-P. 709-717.

233. Roeder R.G. Role of general and gene-specific cofactors in the regulation of eukaryotic transcription // Cold Spring Harb. Symp. Quont. Biol.- 1998.- V. 63.- P. 201-218.

234. Roeder R.G. The role of general initiation-factors in transcription by RNA-polymerase-II // Trends Biochem. Sci.- 1996.- V. 249.- P. 327-335.

235. Romanov V.V., Starostina V.K. DNA covalently bind to AE-cellulose // Biotechnologiya.- 1987,- V. 3,- P. 618-623.

236. Rubin E.M., Krauss R.M., Spangler E.A., Verstuyft J.G., and Clift S.M. Inhibition of early atherogenesis in transgenic mice by human apolipoprotein A-I // Nature.- 1991,- V. 353,- P. 265-268.

237. Rykova E.Yu., Pautova L.V., Yakubov L.A., Karamyshev V.N., Vlassov V.V. Serum immunoglobulins interact with oligonucleotides // FEBS Lett.- 1994.-V. 344.- P. 96-98.

238. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York.- 1989,-P. 583.

239. Sastry K.N., Seedorf U., and Karathanasis S.K. Different cis-acting DNA element control expression of the human apolipoprotein Al gene in different cell types // Mol Cell. Biol.- 1988.- V. 8.- P. 605-614.

240. Scheffer L., Solomonov I., Weygand M. J., Kjaer K., Leiserowitz L., and Addadi L. Structure of Cholesterol/Ceramide Monolayer Mixtures: Implications to the Molecular Organization of Lipid Rafts // Biophys. J.- 2005,- V. 88.- P. 3381 -3391.

241. Schnitzler G., Sif S., and Kingston R.E. Human SWI/SNF interconverts a nucleosome between its base state and a stable remodeled state // Cell.- 1998.- V. 94,-P. 17-27.

242. Segrest J.P., Harvey S.C., and Zannis V. Detailed molecular model of apolipoprotein A-I on the surface of high-density lipoproteins and its functional implications // Trend Cardiovasc. Med.- 2000.- V. 10,- P. 246-252.

243. Segrest J.P., Li L., Anantharamaiah G.M., Harvey S.C., Liadaki K.N., and Zannis V. Structure and function of apolipoprotein A-I and high density lipoprotein // Curr. Opin. Lipid.- 2000.- V. 11,- P. 105-115.

244. Seraj M.J., Umemoto A., Tanaka M., Kajikawa A., Hamada K., Monden Y. DNA adduct formation by hormonal steroids in vitro // Mutat. Res.- 1996.- V. 370,- P. 49-59.

245. Sharp P.A. TATA-binding factor is a classless factor // Cell.- 1992.- V. 68.-P. 819-821.

246. Shaw J.-P., Utz P.J., Durand D.B., Toole J.J., Emmel E.A., Crabtree G.R. Identification of a putative regulator of early T cell activation genes // Science.-1988,-V. 241.-P. 202-205.

247. Shepherd J.C.W., McGinnis W., Carrasco A.E., de Roberts E.M., Gehring W.J. Fly and frog homeo domains show homologies with yeast mating type regulatory proteins //Nature.- 1984.- V. 310,- P. 70-71.

248. Sheppard K.E. Corticosteroid receptors, 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase, and the heart // Vitam. Horm.- 2003.- V. 66.- P. 77-112.

249. Sheridan R.B., Huang P.C. Single strand breakage and repair in eukaryotic DNA as assayed by SI nuclease // Nucleic Acids Res.- 1977.- V. 4.- P. 299-318.

250. Simonsson T. G-quadruplex DNA structures—variations on a theme // Biol. Chem.- 2001,- V. 382.- P. 621-628.

251. Singleton, C.K. Kilpatrick, M.W. Wells, R.D. SI nuclease recognizes DNA conformational junctions between left-handed helical (dT-dG n. dC-dA)n and contiguous right-handed sequences // The J. of Biol. Chem- 1984.- V. 259 P. 1963-1967.

252. Sladek F.M. Orphan recptor HNF-4 and liver-specific gene expression // Receptor.- 1994,- V,- 4,- P. 64-68.

253. Sluder A.E., and Maina C.V. Nuclear receptors in nematodes: themes and variations // Trends Genet.- 2001.- V. 17,- P. 206-213.

254. Smith C.A., Bates P., Rivera-Gonzalez R, Gu В., Deluca N.A. ICP4, the major transcriptional regulatory protein of herpes simplex virus type I, forms a tripartite complex with TATA-binding protein and TFIIB // J. Virol.- 1993,- V. 67.- P. 4676-4687.

255. Smith C.L., Ocate S.A., Tsai M.-J, and O^Malley B.W. CREB binding protein acts synergistically with steroid receptor coactivator-1 to enhance steroid receptor-dependent transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996.- V. 93,- P. 8884-8888.

256. Solbach W., Moll H., and Rollinghoff M. Lymphocytes play the music but the macrophage calls the tune // Immunol. Today.- 1991.- V. 12,- P. 4-6.

257. Southern, E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. of Mol. Biol.- 1975.-V. 98.- P. 503-517.

258. Steger D.J., Hecht J.H., Mellon P.L. Gata-binding proteins regulate the human gonadotropin alpha-subunit gene in the placenta and pituitary gland // Mol. Cell. Biol.- 1994.- V. 14,- P. 5592-5602.

259. Studitsky V.M., Clark D.J., and Felsenfeld G. Overcoming a nucleosomal barrier to transcription // Cell.- 1995.- V. 83,- P. 19-27.

260. Studitsky V.M., Kassavetis G.A., Geiduschek E.P., and Felsenfeld G. Mechanism of transcription through the nucleosome by eukariotic RNA polymerase // Science.- 1997.- V. 278.- P. 1960-1963.

261. Suelter C.H. A practical guide to enzymology // Biochemistry: A series of monographs.- 1985,- P. 441-447.

262. Sundseth R., Hansen U. Activation of RNA polymerase II transcription by the specific DNA-binding protein LSF // J. Biol. Chem.- 1992,- V. 267.- P. 78457855.

263. SWISS-PROT Protein Sequence Data Bank. Release 34.0.-0ctober 1996.

264. Takeshita A.G., Cardona G.R., Koibuchi N., Suen C.S., and Chin W.W. TRAM-1, a novel 160-kDa thyroid hormone receptor activator molecule, exhibits distinct properties from steroid coactivator-1 // J. Biol. Chem.- 1997.- V. 272,- P. 27629-27634.

265. Tasken K., Aandahl E.M. Localized Effects of cAMP Mediated by Distinct Routes of Protein Kinase A // Physiol. Rev.- 2004.- V. 84,- P. 137-167.

266. Teng S. and Piquette-Miller M. The involvement of the Pregnane X Receptor in hepatic gene regulation during inflammation in mice // J. Pharmacol. Exp. Ther.- 2005,- V. 312,- P. 841-848.

267. Tenysson C.N., Klamut H.J., and Worton R.G. The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is ^transcriptionally spliced // Nature Genet.- 1995,- V. 9,- P. 184-190.

268. Tian Y., Adya N., Wagner S., Giam C.Z., Green M.R., and Ellington A.D. Dissecting protein: protein interactions between transcriptional factors with an RNA aptamer// RNA.- 1995,- V. 1,- P. 317-326.

269. Tjian R. and Maniatis T. Transcriptional activation: a complex puzzle with few easy pieces // Cell.- 1994.- V. 77,- P. 5-8.

270. Torchia J., Rose D.W., Inostroza J., Kamei Y., Westin S., Glass C.K., and Rosenfeld M.G. The transcriptional co-activator p/CIP binds СВР and mediates nuclear-receptor function // Nature.- 1997.- V. 387.- P. 677-684.

271. Dieci G. and Sentenac A. Detours and shortcuts to transcription reinitiation. // Trends Biochem Sci.- 2003,- V. 28,- P. 202-209.

272. Tse C., Sera Т., Wolffe A.P., and Hansen J.C. Disruption of higher-order folding by core histone acetylation dramatically enhances transcription of nucleosomal arrays by RNA polymerase III // Mol. Cell. Biol.- 1998.- V. 18,- P. 4629 4638.

273. Tuzikov F. V., Panin L. E., Tuzikova N. A., Polyakov L. M. Application of the small-angle X-ray scattering technique for estimating structural changes in high density lipoproteins // Membr. And Cell. Biol.- 1996.- V. 10.- P. 75-82.

274. Tuzikov F.V., Zinoviev V.V., Vavilin V.I., Malygin E.G. Small-angle X-ray scattering study of enzyme-substrate interaction in solution // Studia Biophisica.-1988.-V. 125.-P. 169-172.

275. Tzameli I. and Zannis V.I. Binding specifity and modulation of the ApoA-I promote activity by homo- and heterodimers of nuclear receptors // J. Biol. Chem.-1996,- V. 271,-P. 8402-8415.

276. Verrijzer C.P., Tjian R. Tafs mediate transcriptional activation and promoter selectivity // Trends Biochem. Sci.- 1996,- V. 21,- P. 338-342.

277. Vogt P.K., Bos T.J., and Doolittle R.F. Homology between the DNA-Binding Domain of the GCN4 Regulatory Protein of Yeast and the Carboxyl

278. Terminal Region of a Protein Coded for by the Oncogene jun // PNAS.- 1987.- V. 84,- P. 3316 3319.

279. Vogt V.M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae // Europ. J. of Biochemistry- 1973 V. 33,- P. 192-200.

280. Wallace A.M., Banfield E., Ingram M., Fraser R., Swan L., Hillis W.S., and Connell J.M. Glucocorticoids contribute to the heritability of leptin in Scottish adult female twins // Clin. Endocrinol. (Oxf).- 2004.- V. 61.- P. 149-154.

281. Walsh A., Ito Y., and Breslow J.L. High levels of human apolipoprotein A-I in transgenic mice result in increased plasma levels of small high density lipoprotein (HDL) particle comparable to human HDL3 // J. Biol. Chem.- 1989.-V. 264.- P. 6488-6494.

282. Wang W., Gralla J.D., Carey M. The acidic activator GAL4-AH can stimulate polymerase II transcription by promoting assembly of a closed complex requiring TFIID and TFIIA // Genes Dev.- 1992,- V. 6,- P. 1716-1727.

283. Wang W., Xue Y., Zhou S., Kuo A., Cairns B.R., and Crabtree G. R. Diversity and specialization of mammalian SWI/SNF complexes // Genes&Dev.-1996,-V. 10,-P. 2117-2130.

284. Weber K.T. Aldosteronism revisited: perspectives on less well-recognized actions of aldosterone // J. Lab. Clin. Med.- 2003,- V. 142,- P. 71-82.

285. Werner M.H., Ruth J.R., Gronenborn A.M., Clore G.M. Molecular-basis of human 46X,Y sex reversal revealed from the 3-dimensional solution structure of the human Sry-DNA complex // Cell.- 1995,- V. 81,- P. 705-714.

286. Widom R.L., Ladias J.A., Kouidou S., and Karathanasis S.K. Synergistic interaction between transcription factors control expression of the apolipoprotein Al gene in liver cells // Mol. Cell. Biol.-1991,- V. 11,- P. 677-687.

287. Widom R.L., Rhee M. and Karathanasis S.K. Repression by ARP-1 sensitizes apolipoprotein AI gene responsiveness to RXR alpha and retinoic acid // Mol. Cell. Biol.- 1992.- V. 12,- P. 3380-3389.

288. Windier E., Chao Y., and Havel R.J. Determinants of hepatic uptake of triglyceride-rich lipoproteins and their remnants in the rat // J. Biol. Chem.- 1980.-V. 255,- P. 5475-5480.

289. Wingender E. Gene regulation in eukaryotes. Germany: VCH.- 1993.- 430 PP.

290. Wingender E., Dietze P., Karas H., Knuppel R. TRANSFAC: a database on transcription factors and their DNA binding sites // Nucleic Acids Res.- 1996.- V. 24,- P. 238-241.

291. Workman J.L. and Kingston R.E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation // Annu. Rev. Biochem.- 1998.- V. 67.- P. 545-579.

292. Workman J.L., Taylor I.C.A., Kingston R.E. Activation domains of stably bound GAL4 derivatives alleviates repression of promoters by nucleosomes // Cell.- 1991.- V. 64.- P. 533-544.

293. Xanthopoulos K.G. and Mirkovitch J. Gene regulation in rodent hepatocytes during development, differentiation and disease // Eur. J. Biochem.- 1993.- V. 216.-P. 353-360.

294. Yakubov L., Khaled Z., Zhang L.M., Truneh A., Vlassov V. and Stein C.A. Oligodeoxynucleotides interact with recombinant CD4 at multiple sites // J. Biol. Chem.- 1993,-V. 268,-P.18818-18823.

295. Yamamoto K.K., Gonzalez G.A., Biggs W.H. 3d, Montminy M.R. Phosphorylation-induced binding and transcriptional efficacy of nuclear factor CREB // Nature.- 1988.- V. 334,- P. 494-498.

296. Zannisa V.I., Kan H.Y., Kritis A., Zanni E.E., and Kardassis D. Transcriptional regulator mechanisms of the human apolipoprotein genes in vitro and in vivo // Curr. Opin. Lipidol.- 2001,- V. 12,- P. 181-207.

297. Zannisb V.I., Kan H.Y., Kritis A., Zanni E.E., and Kardassis D. Transcriptional regulation of the human apolipoprotein genes // Front. Biosci.-2001,-V. 6,-P. 456-504.

Информация о работе

Гимаутдинова, Ольга Ивановна
доктора биологических наук
Новосибирск, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Молекулярные механизмы регуляции транскрипции и копирования ДНК эукариот при участии стероидных гормонов и аполипопротеинов А-I и Е - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Молекулярные механизмы регуляции транскрипции и копирования ДНК эукариот при участии стероидных гормонов и аполипопротеинов А-I и Е - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы