Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы адаптации коллагеновых структур к температуре

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы адаптации коллагеновых структур к температуре"

ХЛРЮВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УШВЕРСИТЕТ

кузнецов ШАН ВПСГОРОВИЧ

^ ^ УДК 612.07.2:577.1

1 ДМ 1993

МОЛЕКУЛЯРШ МЕХАН13МИАДАПТАЦНКОЛАГЕНОВИХ СТРУКТУР

ДО ЗМШ ТЕМПЕРАТУРИ

03.00.04 - бюхЬпя

Автореферат дисертацй на здобуття паукового ступени кандидата бюлопчних наук

Харкш -1998

Дисертшдею с рукоппс.

Робота выкопана у НДЧ Харкшського державного университету, Мпистерство освпи УкраЬш.

Наукавкй кершшк;

- доктор бюлоггших наук, старший каукошш ствробпник, Перський Озген Ефрщмович, професор кафедра фЫологи лмдгаш та тварип Харивського дерганного ушверситету.

Офщиаи опоненти:

- доктор Шолаггашх наук, професор, Петренко Олексапдр Юрьевич, проввдтй науковнй ствробгпшк ваддшу крюмедицини Ьктитуту проблем крЫнологи та кр^амедищши HAH Укргшщ;

- доктор Овлаггшш паук, старший науковий сшвробшшк, Тимошенко Ольга Павлыжа, зав. лаборатор!ао GioxiMU i експерименгалыюго моделювання Харсавського иаукова-досладного Ьктитуту ортопеда i травматологи im. M.I. Сгтенко МОЗ Украйш.

Правила оргашзацш - 1нститут 6ioxiMu im. O.B. Палладша HAH Украши, м. Kids.

Захист юдбудеться "J_" fy^i^^PU 1998 р. о годшп на заеданш спещалпованоТ вчеиоТ ради К 64.051.17 Харгавського державного ушверситету, за адресом: 310077, м. Харкш, пл. Свобода, А f ' 'ii ~ ^

3 дисертацкго можиа озпайодштися у Цеитральнш наукавш Шблютыо Харкзвського державного ушверситету: 310077, м. Харюв, пл. Свобода, 4

Автореферат розклашш " fj " tCC (£ gZ^t^y<31998 р.

В тении секретар

Падалко B.I.

Загальиа хараетеристшса робота

Акгуальмсть робота. Сполучна тканина вдаграе важливу роль у процесах адаптаци агатоклгганних тварин до температури навколшпнього середовшца. У значшй Mipi щ роцеси забезпечуються структурною стабшьгастю колагену - основного хонструкщшюго омпонента сполучно» тханини.

В багатьох роботах було показано, що структурна стабшьтсть колагену, яка цшюехъся за температурою його денатурацй, блгоька до верхнъоТ меяа температури ередовшца мешкання у пошешотермних тварин чп температури тша - у гомойотермних Зурджанадзе, 1989-1993, Есипова, 1991,1995, Chellan, 1993, Rigby, 1990].

В ocHosi ujc'i залежносп знаходиться корелягця 1лж температурою денатурацц молекул а вмйсггом у них шшокислот, зокрема вщносно» плькосп серед них залиппав оксипролшу Зурджанадзе, 1992, Berg, 1993, Nemethy, 1986, Ramachandran, 1973]. Сумарна юлыасть ишокнелот у колагеш твар1ш pisron видав, що живуть ниш, е наслщком тривало! юлекулярно! еволюцц i закршлена генетично. Bmict оксипролшу визначаеться итенсившспо пдрокешповання залиппав пролшу, яке здайснюеться ферментом фолзлпдрокенлазою в процс« постгранслащшго! модифжацц первпйно! струггури колагену Eichner, 1988]. Слад шдкреелнти, що структурна стабшьтсть надмолекулярних утворень получно! тканшш залежпть i вад загально! кенцентрацн колагену, а також i вад iimrax юсггранслящйних та постсингетичних його модификация ппкозилювання , що веде до творения холаген-полкахаридних комплексов [Kimura, 1992]; поперечне зв'яэування Kivirikko, 1990, Richard-Blum, 1994] та взаемодая з шшимн структурними компонентами яголучно! тканинн. Уй щ сгруктурт характеристики колагенових утворень, як i сгушнь ддроксилювання залшпкш пролшу, безпосередньо генетично не закршлет i визначаються нстивгоспо фермента, яю здшенюють процесшг колагену.

Таким чином, еволюцшно закршлена корелящя м1ж вшетом оксипролшу в колагет, äoro структурною сгабшьшстю i температурою навколишнього середовшца с лише одним з »спекттв температурноГ адаптаци тварин i вадноситься до видав, яи вже протягом довгого часу живуть у постшних температурил* умовах.

В той же час пойюлотермщ тварщш середнъо! смути вщчувають сезонт змшн температури, що досягають десятюв граду eis. Тому повинш юнувати i шпп - твидм мехашзми адаптаци колагену до значких змш температуря навколишнього середовшца. Мехашзми такого типу можуть використовувати i пбернантш ссавщ, температура тша як их при перехода В1Д стану бадьорос-ri до стану сплячки та навпаки суттево змшюсться протягом короткого часу.

Таким чином, здаеться псвним, що температура навколишнього середовшца шляхом до на актившеть вщповщних фермента синтезу, процесшгу та розпаду колагену мохе безпосередньо впливати на перебудову його надмолекулярнях утворень i, як наоццок, змшювати IX структурну стабшьшсггь.

Проте, по цей час питания про вшшв температури навколишнього ссредовища на штенсившсть цих спадай обмшу колагену практично не дослщжувалось. Mia: тим його вивчення дозволило б виевггити не лише нолскулярш мехашзми швидкоУ адаптаци колагенових утворень пойкшотермних та пбернангних тварин до температури зовншшього середовшца, а й внести певну ясшсгь у шггання про вшткнення та еволюцЬо цих мехатзм1в у хребетних, в тому 4iiaii гомойотермних тварин.

Одержат результата також можуть бути важливими i для розвигку уявлень про загальш мехашзми температурши адаптаци.

НДЧ Харкгвського державного ушверситету в межах теми "Структурно-метабол1чш мехашзми адаптаци сполучноТ тканиыя до до екстремальних фактор1в", № держреестрацй 0197Ú003060.

Мета та завдання .црстпжсття. Всгановиги, як вшшвае температура середовщцз на синтез, процесшг, розпад i структурну егабшьшеть колагену хребетних тварин рЬних систематичних груп in vivo та in vitro. З'ясувативати, яи молекулярш мехашзми лежать в ochobí швидко1 структурно! адаптаци колагену до температури. Поршнята ix особливосп у пойюлотермних (риб), пбернанпшх (кажашв) та гомойотермних (щур1в) тварин з метою виявлення основних закономерностей еволюцц цих мехашзьнв. Для досягнення мети були поставлеш Taxi задачк

1. Вивчнти температурш залежносп сшггезу, гвдроксилювання залипшв пролшу, гшкозшповання, поперечного зв'язування та розпаду колагену в органах риб in vivo (гамбузи звичайна) та in vitro (карп звичайний), бших щурш (шшя Bicrap) та кажашв (великий шдковошс) in vitro, коли температурна регуляцк, характерна для ссавщв, знята.

2. Досладити температурну залежшеть розчшшосп та термосгабшьносгп колагену i внявнтп ix кореляцда з pÍ3hhmk стадами обмшу колагену.

3. Виявити молекулярш мехашзми, що лежать в ociiobí температурних залежностей обмшу та структура колагену хребетних тварин pi3Hzx систематичних груп.

4. Провести иоршняльний аналлз мехашзм^в структурно-ыгтабол1чно1 адаптаци колагену до температури у пойкшотермних, пбернангних та гомойотермних тварин. 3найти загальш 3aKOHOMÍpHocri цих ироцесм та розглянути можливу схему ix еволюцп.

Наукова новизна робота. Впсршс показано, що температур на залежтсть тенсивносп синтезу колагену в достдях in vitro у scix досгпджених органах обох вивчених дав ссавщв мае двогорбий характер з максимумами в областях 10-15 °С та 25-35 °С. ггенсившсть лдроксилювання прожну мае аяалогинпй характер, зокрема стутиь дрокешповання в ycix випадках вшций в друпй обласп . Стутнь гшкозшшвання колагену ж ферментативного, так i неферментативного) також е максим альним в обласгп 35 °С. найдено зворотню залежтсть Mix температурою середовища i штенсивтспо утоколагешхтзу, максимум ягого припадае на 10-15 °С. Вперше показано, що ступть оперечного зв'язування в пздмолегуляргагх колагенових угвореннях шдвшцуеггься si ростанням температуря середовшца. Встановлено, що термостабшыисть колагену, яка щиюегься за температурою та ентальтею його денатурацц, вшца для молекул, ннтезованих in vitro при 35 °С, шж для молекул, сшггезованих при 10 °С, i корелюе з бшьш исоким ступенем гадрокешповання, глгкозшповання та поперечного зв'язування колагену, цо спостер1гаеться при температур! 35 °С.

Впсршс показано, що у пойилотермних хребетннх змша температуря навколшпнъого ¡ередовшца, а у пбернантних ссавщв змшз температуря тша безпосередньо регулюс будову га структур ну стабшьшсть колагенових утворень шляхом до на штенсившсть процеав гиптезу, процесшгу та розпаду колагену. Tari яг сам! структурно-метабол^чн! мехатзми гемпературшй адаптаци колагену знайдеш i у гомойотершшх ссавщв в умовах in vitro.

Вперше показано, що в умовах in vitro пронеси структурн0-мстаб0л!чн01 перебудови колагенових утворень подабш в сполучюй тканит тварин р1зних спстематнчних груп, що изють i рЬш тшш температурпо! регуляци.

Теоретичне та практитас значения робота. Проведет досладження дозволили виявити молекулярга механЬми птендго! адаптаци колагенових утворень до температуря зовтшнього середовшца. Виявлет етапи обмшу колагену, яп безпосередньо регулзоються температурою i ведуть до вдаоваднося мш структурною стаоЬчьшстю сподучно! тканини i температурою навколшпнъого середовшца. Щ результата дозволяють доповннти сучаст погляди на молекулярш механЬми адаптаци' тварнн до температуря i можугь бути корисгоши у розробщ уявлень про походження та сволющю цих мсханЬм!в.

Отрнмаш результата дозволяють доповнити деяи уявлення про молекулярнз механЬми адаптаци бшав до тештератури середовшца. Вони тагож можугь мати значения при аюдмацц тварин та у еколога.

Особистий впесок здобувача: nifl6ip, обробка та анали лггературних даних; постановка науково'1 задач»; внбгр i реал^защя аналпнчних методов ц вирйпення; участь у розробщ еяемн можлпвих мехашзмш структурно! адаптаци колагенового матриксу

сполучшм ткашши тварин з р1зшши типами терморегуляцц до зшни температуря навколишнього середовшца; аналюта штерпреггацк одержаних результата.

Апробашя результата дисертацц. Результата i ochobhí положения робота допов¡дались на: XIV з'Ъдо Украшського фвюлоггчного товариства (Кшв, 1994), симпозиум! "Биологические механизмы старения" (Харкю, 1994), II KOHTpcci патофшолопв Украши (Кшв, 1996), II Украшському бюх1М1чному зЪда (Кшв, 1997), XV з'Ьдо Украшського фшолопчного товариства (Цонецьк, 1998), III Мгкнародому cmmo3ÍyMÍ "Биологические механизмы старения" (Харк'ш, 1998), II зЪдо Украшського б^офЬичного товариства (Харюв, 1998).

Публшадц. За результатами дисертацц опублйсовано 11 po6ÍT.

Структура та обол* nwTTPfTii Дисертацшна робота складастъся з вегтупу, роздшв: лггературний оглад, матер^али та метода дослзджень, результата власних досшджень та 1х обговорення, щцеумкових bhchobkíb та перелаку використано! лиератури í3 220 найменувань. Роботу викладено на 137 сторшках друкованого тексту, вона mí стать 6 таблиць i 18 рисунив.

Роздал 1. Лпературний оглад

У першому шдроздш литературного огляду наведено теоретичш та екепериментальш дат про структуру колагенових угворень сполучно! ткашши. Розглянуто результата вивчення синтезу, посттранслящйшк та постсшггетичних моднфцеацш цих сполук на pÍ3iinx pÍBHSx ix оргашзаци. Показано, яку роль Binirpae колаген у створенш сполучно-тканинного матриксу. У другому шдроздт наведет даш про деяи мехатзми температурно! адаптацц тварин. Розглядаютъся мехатзм1 адаптацц бшкш до pisHiix температурных умов. Наведет даш про корелящю Mix структурою колагенових угворень та термодашашчшшн параметрами його денатурацп для тварин, що жив уть при поетШних температурних умовах.

Роздал 2. Матер1али i метода доелдакешш.

Експерименти були проведет на хребегнпх тваринах, що вцдаосятъся до трьох сисгематичних груп з р1зннм типом терморегуляци. Предсгтавниками пойюлотермних були риби двох видав: в досшдах in vivo - гамбузи звичайна (Gambusia affinis), in vitro - карп звнчайний (Cypriaus carpió). Представниками пбернантних ссавщв в досадах in vitro були кажани виду великий шдковошс (Rhinolophus ferrum-equinum), а гомойотермних -щурн-самки лит Bicrap (Rattus norvegicus).

В експериментах in vivo з пойилотермшши тваринами гамбуэш подшяли на дщ групи вмицували в aKBapiyMii з температурою води 14 та 24 °С. Шсля 35-добово1 аклшаци в sapiyMH вносили иС-пролш. На 45-у добу риб умертвпяли i в експеримеит брали ппару, гбет i хвостовий плавець. У досладах in vitro дослщжували nntipy та плавалыпш Mixyp рпа. Його гомогенат вмипували у роччигн Рпггеря-Кребг.я- mn шстиб 'Н-проля- s :убуваш1 прп температурах 15 та 25 °С [Лебедев, 1978, Martens, 1989].

Досшди з ссзецями проводили in vitro для знятгя характерно! для них температурное гуляцц. У щур iß внвчали nncipy епшш та серце, а у кажатв - шюряну перегонку крила.

Об'остом доелвдження у рЬних експериментах був колаген Timy I та сумарний колаген гашв. 1нкубування гомогенаттв проводили так саме. як i в експериментах з рибами in vitro, и температурах шкубахш 10, 15, 20, 25, 30, 35 та 40 °С у щур1в i 5, 10, 15, 20, 25, 30, °С у кажатв.

ГПсля щкубацц колаген вилучали з оргатв [Слуцкий, 1969, Никитина, 1992], ¡чищали центрифугуванням та доа.шзом i вшсористовуваяп у подальших досладженнях.

Вм1ст колагену оцшювали за оксипролшом [Stegemann, Stalder, 1967].

Про штенсивтстъ синтезу колагену судили на шдстав1 питомо! радюактивносп в ому 14С-оксипролшу (в досящах in vivo) та 3Н-оксипролшу (в досящах in vitro) [Замараева, 77, Лебедев, 1978, Martens, 1939].

Ступшь пдрокешповання пролшу в колагеш визначали за [Berg, 1982]. Розподш биоактивного пролшу та оксипролшу проводили за Замараевою [Замараева, 1977].

Ршень загального ппкозилювання колагену визначали за мрчано-фенольннм ггодом. Для визначення ферментагавного глгкозилювання внкористовували метод «курептного шпб1рування трансфераз [Dubous, 1986, Smith, 1989].

1нтенсившсть аутоколагешыйзу визначали на шдстав! вадношешы виьного :сипролшу, що вийшов 3i зразпв у шкубацшне середовшце в процеет шкубацц, до загалыкм пькосп оксипролшу, який знаходився у зразках до початку шкубацц [Перський, 1997].

Поперечне зв'язування колагену оцшювали в досладах in vitro за його розчинтстю в гстракщйному розчит [Утевская, Перс кий, 1982], В досладах з рнбами in vivo його внювалп також за вадношеншм денатурованого колагену до загалыю! юлькосп колагену зразках до ix narpisy [Hincimma, 1992].

Термостабмьшстъ колагену, сингезованого в досладах in vhro при р'тшх темпе-ггурах, оцшювали за термодинамгпшми параметрами його денатурацц [Перский, Гим-глевич, 1990, Кузнецов, Перский, Соловьева, 1998].

Робота виконана з використанням спещального програмного забезпечешш: Microsoft ford for Windows 6.0, Borland Quadro Pro 5.0, CorelDRAW 5.0, Global DeLorme Explorer.

Роздал 3. Результата доопда«ш, та 1х обговорешхя.

На рис. 1 А наведено залежшеть штенсшшосп синтезу колагену шыри, хвостового плавця та хребта вщ температури навколшпнього середовшца. Видно, що найбшыпа штенсившсть синтезу колагену спостертгасться при температур 24 °С. При цш же температур! вшций 1 стушнь пдрокешоовання затоптав пролшу в колагеш шири (рис. 1 Б). Характерно, що цей параметр лежить у межах 27-38 %, що вщповдае середшм значениям ступеня пдрокешдавання залипшв пролшу в колагеш риб середшх широт.

А Б

14 24 Т, «С з

Рис. 1. Температурна залежшеть штенсивноеп синтезу колагену пшры (1А), хребту (2А), хвостового плавця (ЗА) гамбузш; штенсившхгп пдроксилювання колагену шири(1Б), хребту (2Б) та хвостового плавця (ЗБ) гамбузШ.

Концентрагця окснпроли1у в шгар! риб також вшца при температур! води 24 °С (рис. 2 А). При цш температур! вщбуваеться \ штеисяфкащя процепв поперечного зв'язуван-

а Б в

14 24 Т;"°€

Рис. 2. Температурна залежшеть концентраци колагену в шыр1 гамбузш (А); розчинносп колагену ппари гамбузш в 1М ЫаС1 (Б); виходу колагену 31 шюри гамбузш при и натри»! у вод1 (В).

колагену в nncipi. Про це свадчить зниженвя виходу 31 шири риб денатурованого колагену л HarpiBaHiri геанннн у вода пря 60 °С, а тагож нейтральнорозчннного колагену при його пракцц 1М NaCI (рис. 2 Б та 2 В).

Наведет дат сввдчать про те, що пщвтцсння температуря навколишнього >сдовища викяикае у риб стругтурну перебудову голагенових утворень. Вона полягае у эстанш стабшьносп колагену як на молекулярному, так i на надмолекулярному piBiuix i (значаеться узгодженими змшами цггенсивносп посладовних стадай його обману.

У табл.1 наведет дат про ттененвтегь pbimx стадш обмиту колагену плавального хура риб у досл1дах in vitro. Найбшьша штенсивтстъ синтезу cnocTepirseibc« при 25 °С. гупшь пдроксилювання пролшу у колагет при цш температур! також випщй. Щ даш щчать про зростагшя crpyrrypHoi стабшьносп шдедадуальних молекул колагену, итезованих при втпш температур) яавколтлнього середовища. Пвень розпаду колагену ш щй температур! иаймешшш. У поеднатв з штенспфшащею синтезу при 25 °С це веде до двшцення концеитраци колагену в тканпш при щй температур! шкубацц. Стугонь эперечного зв'язування в колагет також налбшыпий при 25 °С, про що свадчить зннясення иоду розчшшого колагену в процеа екстракци 1М NaCI. Зростання концептрацц колагену тканиш, а також шдвшцення ступеня його поперечного звя'зувания при вшцш температур! гредовшца веде до збшыпення структурно! стабшьносп i падмолекулярннх колагепових гворень.

Таблица 1

¡плив температурн шкубавдйного середовшца на pism стадо обману колагену в длавальному dxypi карпа звичайного.

Темпера- Пптома Стушнь пдро- Ступшь Ревель Розчнн-

тура радюактившеть ксилювання глисозн- аутокола- шеть

пшубаци, 3Н-Опро, пролшу, лювання ко- rerroimy, % колагену

Т, °С iMn/ хв/мкг Оттро 3В-Ощк> лагену, % в 1М

3Н-Опро+3Н-Про NaCI, %

15 195 ±9,8 0,37 +0,026 3,2 + 0,25 2,9 + 0,12 2,3 ±0,08

25 810 + 37 0,46 + 0,037 5,7 + 0,38 1,3+0,09 1,4+0.04

Таким чином, ми бачимо, що в доелвдах in vitro шдвищення температури ивколишнього середовища виклигае швидку перебудову o6MiHy колагену, яка веде до ■»ростання структурно» стабшьносп на ycix ровнях його оргатзаци. Певно, що така

псрсбудова е одним з мсхашзмш швцдко! адаппщи пошалотершшх оргатзм1в до рЬгих змш температури навколипгаього середовшца.

. Експсрименти на Нбернаигних та гомойотсрмних тварших in vitro. На рисунках 3-7 та в табл. 2 i 3 наведет даш про вгошв температури на р1зш стада обмшу колагену деяин органш ссавщв у досщдах in vitro. Оскшыси крлаген типу I складае основну масу (бшьш 90%) колагену птри сгтатевозршизс тварин, його властивосп у значшй Mipi визначають термоетабшьтсть надмолекулярних колагснових утворень. 3 рис. 3 та

Т, °С

Рис. 3. Температурка залежшеть штепсивносп сшггезу колагсну в ппар1 щургв (1) та в ширянш перетинц1 крила кажашв (2).

даних табл. 2 видно, що залгжносп пнтомо! радшактивноеп оксипролшу в колатеш пшри тварин обох вщув 1 в колатеш серця щур1в год температури мають два максимум!!.

В век випадаах перший максимум спостеркастъся при 15 °С, друпш же - при 25 °С для шири кажашв та 35 °С - для шири та серця щур1в. Залежносп цггенсивностг гщроксшдавання залиппав пролшу для колагену птри щур1в та ппаряна'{ пере-гинки крила кажашв вщ температури наведен! на рис. 4. Вони теж мають два максимуми, при температурах 15 та 35 "С.

Температурка залежшеть гщроксилювашм заяштов пролшу у колагеш серця щурш мае лише один максимум при 35 °С (табл. 2).

Т, °С

Рис. 4. Температуриа залежшсть штенсивносп пдрокснлювання колагену в шир1 щур1в (1) та в ппарятй псретанщ крпла кажатв (2).

Таблица 2

Вшит температуря шкубащйного середовшца на рЬш стада обмшу колагену та розпаду загального бшка серця З-мкячшх щур1в-самок лшй Вкггар.

Температура шкубаци, Т, °С Питома радюактквтстъ 3Н-Опро, гмп/хв/мкг О про Стушнь пдроксилюванпя пролшу, 3Н-Опро Ргвень аутоко-лагено-.тпзу, % Квснь розпаду загального бшка, %

3Н-Опро+3Н-Про

10 310+14 0,28+0,012 0,6+0,04 4.5+0,22

15 845+37 0,31+0,015 4,8+0,37 8,6+0,36

20 182+16 0.33+0,014 0,7+0,06 5.7+0,28

25 183+10 0,30+0,025 0,6+0,05 3,5+0,17

30 304+23 0,35+0,018 0,8+0,03 3,3+0,19

35 507+41 0,46+0,011 0,98+0,04 2,8+0,15

40 160+6.5 0,27+0,013 0,7+0,02 3,1+0,17

На рис. 5 наведет даю про загалышй стушнь глЬсозилюванпя колаген-полюахарцдннх комплскси; в пиар! щур1в. Це глЬсознлювання включае до себе як ферментативне, так 1 неферментативне ириедиання гексоз до колагену. У шдпсвщносп з наведенный даними спостернаеться лише один шк як загального, так 1 ферментативного глкозшповання - при 35 °С.

т, °с

Рис. 5. Температурна залежшсть ступеня загального гсикозилюва! тя колагену (1) та ступе ферментативного глжозилювання колагену (2).

Температурю залежносп юлы осп розчинного колагену, що екстрагусться 31 пшри тварин обох видав, наведет на рис. 6. Як бачимо, м1ж розчиншстю колагену 1 температурою ипсубаци е звороиы лшейна залежшсть, при цьому максимум розчшшосп . спостерц-аеться при 5°С, а мшамум - при 40 °С. Це еввдчить про штенсифкацш поперечного

Т, °С

Рис. 6. Температурна залежшсть розчшшосп свЬгомштезовалого колагену птри щур^в, г вийшов у розчин у процсс1 екстракци 1М N301 (1), та св^жосшггсзованого колагену ширят перетинки крила кажашв, що вийшов у розчин в нроцем екстракци 0,5М СНзСООН (2).

ковалентного зв'язування молекул колагену при шдвшценш температури ссрсдокища, що веде, зростання стабтыюсп його надмолекулярних утворень.

На рис. 7 та в табл.2 наведеш дат про температурну залежшсть аутоколагеполЬу у шк твар!ш обох видав 1 в серц) щур^в. Ус1 щ дат якюно подгбш. Максимум штенсивносп розпа колагену у ппар1 та серц! щур^в вщзначасться при15°С, а у птр1 кажашв - при 10° Таким чином, ми бачимо, що температура , середовшца безпосередньо вплш на актившеть фермента синтезу та процесшгу колагену. Це веде до перебудови обми

сггрямованого на змшу структурно! стабшьносп колагенових утворснь 1 приведения !х у твдповедшсть з температурою середовшца. Для виявлення цього ефекту була вишряна термостабшьшсть колагену, синтезованого при рппих температурах, а?

Рис. 7. Температуриа залежшсть аутоколагепол1зу в ппар1 щур1в (1) та в пшрянш перептщ крила кажашв (2).

На рис.8 зображега крив1 теплопогллнання ф1брил, утворених з колагену, синтезова- ного при 15 та 35 °С, а в табл. 3 наведет разраховат за цими кривими термодинам1чт парамстри його денатурацц. Результата розрахунюв свадчать, що термосгабшьтсть колагену, синтезованого при 35 "С, значно вшца шж термостабшьшсть колагену, синтезованого при 15 °С. Це вказуе на зв'язок м1ж температурними залежностями вивчених еташв обмшу колагену 1 структурно! стабшьносп цього бшка, синтезованого при рЬних температурах.

305 307 309 311 313 315 317 319 321 323 325 327 329

Т. К

Рис. 8. Температурив залежшсть теплопогшшання фабрил, утворешге з колагену, що був сшггезовашш при 15 °С (1) та при 35 °С (2).

Таблпця 3

Стушнь пдроксилювання колагену, сшггезованого при pi3irox температурах, та термодннамлш парам стри плавления утворених з нього фабрил.

Температура шкубацц, Т,°С Ступшь лдроЕсишован-ня колагену, % Температура ттг.дятупптпУ к Ентальшя (кДж/моль) х 102 Ешрошя дснатуриЦи, Дж/моль

15 41,5 320,5 0,89 ±0,12 0,28 + 0,02

35 52,3 321,5 1,45 ±0,23 0,45 + 0,02

Анал13 теш1ератур!шх залежносгей дослщженкх стадай обмшу дозволяе виявнтн мехашзш: що ведуть до шдвшцсння термостабшьносп колагену, синтезованого при 35 °С. 1нтенсившсгг синтезу колагену при щй температур! у 4 рази вища, шж у Ьггсрваш температур 20-30 °С, штенсывшсть розпаду найменша. Вшцнй при цш температур» i ступшь пдроксилювання залипла, пролшу у колагеаа, а як насдадок найбшып висока структурна стабшьшсть шдивадуальнн молекул. При 35 °С бшып высокий i р1вень постсинтетнчних модифшацШ колагену. Таким чином при температура що близька до температури тша гомойотермних ссавщв, виявляеться узгодженн штенсифкацц i уповшьненыя стадш обману колагену, спрямованих на утворення адекватно! щ температур! структурно! стабшьносп колагену.

При зпнженш температури виявляеться, що при 15 °С одночасно i рико зростають синтез розпад та розчиншсть колагену, у той час, як ступшь його пдроксилювання знихусгься. Д® пояснения виявленого ефекту слад розглянути особливосгп експерименту. У вилучених зразках, щ< знаходяться у шкубацУшому розчиш, фиюлопчна температур на регуляция вщеутня. При нгоьки температур! шкубацн структурна стабшьшсть колагенових утворень у них вшца, шж необхвдна Тому у зразках повинна вщбутися перебудова цих утворень, спрямована на приведения ; вщповщшсть !х структурно! стабшьносп зовншшш температур!. Як бачимо з отр1шаних даних майже це i вхдбувасться у зразках тканшш. РЬка штенсифцсащя розпаду веде до вилученк молекул колагену, структурна стабшьшсть яких не вщповщас температурь На ix мкце приходят] hobi, св!жосингезоват та менш стабшьш молекули, яю мають нихчий ршень пдроксилювання гткозштовашы та поперечного зв'зування. Таким чином, у зразках шшрн вадбуваеться змии обмшу колагену, що веде до адаптаци тканини до бшыл низько! температури середовшца, яга не < характерна для вивчаемого виду ссавщв.

Цей процес в!дбуваеться лише тому, що у колаген-синтезуючих клтшах ссавщв i ферменптвт системи, оптимум дц яких знаходиться при низыай температур!. Характерно, щс при зниженш температури шкубацц вже до 10 °С, в досадах in vitro 3i щурами иггенсившсть як синтезу, так i розпаду р1зко знижусться. При язасно подобному характер!

гемпературних залсжносгей вивчених стадш обмшу колагену mypie та кажашв шж ними вщм1чаеться i деяка ршшця. Перш за все привертае до себе увагу те, що як абсолютш в сличили, так i максимуми кривих, яп вщображують штснсившсть синтезу та розпаду колагену кажашв, не збигаються з такими у щур1В. Так, в области високдо температур максимум штенсивносп синтезу колагену у кажашв вадмйчаеться не при 35, а при 25 "С (рис. 3). Максимум розпаду колагену у кажашв та кож зсунуто у область бшып низысих температур (рис. 7).

Ця рЬшщя пов'язана, можливо, з р1зними умовами ¡снуваыня цих видав та з рвшши типами механЬм!в ix терморегуляции Таким чином, виявлеш залежт вад температури перебудови колагенових утворень у кажашв можуть бути присгосуванням до двох рЬних сташв - активного та пасивного.

Одержат дат надають можлишсть зробити висповок, що у npoqeci еволюци хребетнкх тварга виробився едшшй ушверсальний мехашзм твидко! сгруктурно-метабол1чно1 адаптацц колагенового матриксу до змш температури навколипшього середовшца. В npoqeci подальшо! еволюци ссаввдв цей мехашзм продовжуе використовуватися тшыси пбернантними тваринами. У гомойотермних вш залишився, можливо, тип>кн у впгляда религга.

ВИСНОВКИ

1. У пойюлотермних хребегних - гамбузп та карпа - пггенсивтсть синтезу загального колагену в nndpi, плавальному Mixypi, хвостовому плавщ i xpeoii в облаеп 24-25 °С вища, Hi* в облаеп 14-15 °С. У лберншггаих хребегних - кажашв - температурил залежшеть штенсивносп синтезу колагену у пшрянш перетинщ крила мае два максимума - в облаеп 15 0 та 25 °С. В експериментах in vitro В nndpi та серцевому и'яз'\ гомойотермних ссавщв -щур is - ця залежшеть також мае два максимуми - в областях 150 та 35 °С.

2. Ступигь идрокешповання залиппав пролшу в молекулах колагену також корелюе з температурою середовшца. Максимум спостеркаегься в облаеп 24-25 °С у риб та при 35 °С у ссавщв,

3. Ревень гакозгоповання колаген-полкахаридних комплекав е максималышм в плавальному Mixypi та msripi карпа при 25 °С, а у nndpi mypiB при 35 °С.

4. 3i зростанням температури середовшца у пойюлотершшх та пбернантних хребегних та температури шкубацп в експериментах in vitro у гомойотермних ступшь поперечного зв'язування колагену в ycix вивчегшх органах зростае.

5. У вивчсних органах ycix доавджених видав хребстннх pißciib аутоколагенолЬу пов'язани з температурою оборотньопропорщйною залсжшстю i е максимальным при темлсрату] 10-15 »С.

6. Колаген, сшггезований in vilro при 35 °С, бшьш темостабшышй - мае вшцу температур та ентальтю денатурацц - шж сшгтсзовашш при 15 °С.

7. Встановлено, що змша температурп середовища може безпосередньо рег7люват шгенсившсгь об мшу колагену, впливаючи на ключов! стада його синтезу, процссшгу т розпаду, Гснують два тшш такоГ регуляцц. При першому штенсившслъ конкретно! стад обмшу визначаеться температуриою залсжшстю активносп того ж самого фермента (ях випадку глкозилювання). При другому - температура активЬус одну з ¿зоформ ферментг найбшьш актив ну в визначеному температурному нггервал!, як це можливо мае М1сце пр: гвдроксилюванш пролЬгу.

8. Bmíct оксипролшу в молекулах колагену не е видовою ознакою органЪму. Лшп максимальний стушнь гтдрокешповання пролшу, який залежить вщ первинно! структур) молекули, може використовуватися як систематичний показник, але на бшьш вищом; таксоном1чному pÍBHi, шж вид.

9. Перебудова колагенових утворень, яка внклпкана звонами температур« середовшца, одним з MexaHÍ3MÍB швидко! адаптацц сполучно» тканини до цих змш. Щ мехашзм) використовуються пошешотермшаш та пбершштшшн хребетшши, яю ¡снують в умова: pÍ3KHX сезонных змш температуря довкшля. У гомойотермних ссавщв щ механЬш зашшшлись лише у вигляда релшту.

Список опублхковатегх праць за темою дкеерталв:

1. Перский Е.Э., Кузнецов И.В., Гарбузенко О.Б. Температурная зависимость некоторый стадий обмена коллагена в коже крыс in vitra II ДАН Украины. - 1997. - № 1. - С. 170-173.

2. Garbuzenko О.В., Kuznetsov I.V., Naglov A.V., Nikitina N.A., Persky E.E., Utevskaya L.A Structural and metabolic mechanisms of Collagen adaptation to endogenous and exogcuou: factors effects II School of fundamental medicine journal. - 1997. - V.3, № 1 - C. 27-30.

3. Кузнецов И.В., Гарбузенко О.Б., Кузьмис А.Э., Никитина H.A., Перский Е.Э. Утевская JI.A. Особенности обмена коллагена кожи позвоночных животных npi: температурной адаптации II Проблемы криобиологии. - 1997. - № 3. - С. 27-31.

4. Кузнецов И.В., Соловьева A.C., Перский Е.Э., Зинчеико A.B. Быстрая структурно-метаболическая адаптация коллагена к температуре // Проблемы криобиологии. - 1998. • I4« 1. - С. 67-68.

5. Перский Е.Э., Кузнецов И.В., Наглов A.B., Никитина H.A., Пипа П.А., Утсвская JI.A. Особенности механизмов, обеспечивающих надежность коллагеновых структур в онтогенезе // Симпозиум "Биологические механизмы старения". - Тез. докл., Харьков. -1994.-С. 62.

6. Перський €.Е., Гарбузенко О.Б., Кузнецов I.B., Наглов О.В., Нгктна H.A., Утевська JI.A. Роль окремих етагав синтезу в "швидкш" адаптаци колагенових структур хребетних до р1зних температур // XIV зЪд Украшського фЫол. тов. - Тез. доп., Ктв. -1994. - С.59.

7. Гарбузенко О.Б., Кузнецов I.B., Наглов О.В., НЬптша H.A. Бюх1м1чт мехашзми резистентносп колагенових структур сполучно! тканини до до пошкоджуючих фактор1в /7 II конгрес патоф1зюлопв Украши. - Тез. доп., Khïb. - 1996. - С.46.

8. Кузнецов I.B., Васильева Л.В., Кузьмк А.Е., Нжшна H.A., Перський С.Е. Структурпо-метабол1чш мехашзми адаптаци сполучно! ткашпш ссавщв до температуря // VII Украшський 6ioxiMÎ4inffl зЪд. - Тез. доп., Ктв. - 1997. -Т.Н. - С. 148.

9. Кузнецов I.B., Наглов О.В., Утевська Л.А. Мехашзми швидко! структурно-метабол1чно1 адагггацй колагену птри до температури // Мат. XV з'Ьду Украшського ф1эюл. тов. -«Изюлопчннй журпал. - 1998. - Т.44, № 3. - С.295.

10. Никитина H.A., Кузнецов И.В., Наглов A.B., Утевская Л.А. Возрастные особенности быстрой адаптации коллагена рыб к температуре // III Международный симпозиум "Биологические механизмы старения". - Тез. докл., Харьков - 1998. - С.26.

П.Кузнецов I.B., Васильева Л.В., Кузьм1с А.Е., Утевська Л.А., Перський G.E. Молекулярний мехашзм швидко! змши термостабмъпосп колагену щд доею зовшшвьоТ температури // II зЪд Украшського бюфп. тов. - Тез. доп, Харюв. - 1998. - С.48.

Кузнецов I.B. Молекулврт механтт адаптацц колагенових утворень до

температури. - Руксппс.

Дисертахпя на здобутгя паукового ступеня кандидата бюлолчних наук з спещальносп 03.00.04 - 6ioxiMW - Харивський державный ушверситет, Харюв, 1998.

Проведено пор1вняльпе доелвдження основ них еташв обмшу колагену, що забезпечуютъ його сгабшьшсть на молекулярному та надмолекулярному pieroix у процес! температурю?» адаптаци у пошешотермних, пбернантних та гомойотермютх тварин. Показано, що в yeix випадках осиовт етагш обмшу колагену змшюються одпаково, що забезпечуе позитивну корелящю мЬг термостабшьшстю колагену та температурою навколипшього середовшца. Так а перебудова обмшу пов'язапа 3Î змшою синтезу, процесшгу та рознаду колагену. В екеяеркмептах /г. vitro продемонстровано також, що при знпженш температури

шкубацшного середовшца штенсифгкуеться розпад бшьш термостабшьного та синтез мен термостабшьлогс «очагену.

Показано, що таи мехашзмп швидко! адаптацц колагенових утворень до температу{ середовшца можуть безпосередньо використовуватися поикшотермними хребетними, п кнуютъ в умовах рюких сезонннх змш температури. Схожд мехатзми викооистовуються Нберпантними ссавцями, температура тша яких також може швидко змшюватися протягс короткого часу при перехода вад стану бадьороеп до стану сплячки.

Зроблено висновок, що у гомойотермних ссавцш у хода еволюцц також залипшв! религговий мехашзм температурно! адаптацц колагенового каркасу сполучно! тканшш.

Ключощ слова.', адаптащя, колаген, температура, обмш, аутоколагешмпз, термодинашч параметри, денатуращя, структурна стабшьшсть.

Кузнецов И.В. Молекулярные механизмы адаптации коллагеноцых структур

температуре. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук г специальности 03.00.04. - биохимия. -Харьковский государственный университет, Харько 1998.

Проведено сравнительное исследование основных этапов обмена коллаген обеспечивающих его стабильность на молекулярном и на надмолекулярном уровнях процессе температурной адаптации пойкилотермных, гибернантных и гомойотермнь животных. Показано, что во всех случаях основные этапы обмена изменяются сходны образом, обеспечивая положительную корреляцию между термостабильностью коллагена температурой окружающей среды. Такая перестройка обмена связана, в основном, изменением синтеза, процессинга и распада коллагена. В экспериментах т ми продемонстрировано также, что при снижении температуры инкубации шггенсифицируеп распад более термосгабильного и синтез менее термостабильного коллагена.

Показано, что такие механизмы быстрой адаптации коллагеновых структур к резки изменениям температуры среды могут непосредственно использоваться пойкилотермпьпи позвоночными, обитающими в условиях резких сезонных колебаний температур окружающей среды. Сходные механизмы используются, по-видимому, и гибернаншым млекопитающими, температура тела которых также может резко изменяться при переходе с состояния бодрствования к состоянию спячки.

Сделан вывод, что у гомойотермных млекопитающих в ходе эволюции так я сохранился реликтовый механизм температурной адаптации коллагенового каркаса.

Ключевые слова: адаптация, коллаген, температура, обмен, аутоколлагеноли термодинамические параметры, денатурация, структурная стабильность.

KnznetsoT I.V. Molecular mechanisms of collagen structures adaptation to the

temperature influence. - Manuscript

Thesis for degree of candidate of biological sciences on the speciality 03.00.04 -biochemistry. Kharkov State University, Kharkov, 1998.

The comparative investigation of the collagen metabolism main stages were done. These stages provide the stability on collagen molecular and supramolecular levels at temperature adaptation of cold-blooded, hibernating and warm-blooded animals.

It was shown that in these three cases all metabolism stages change in the same way which provides positive correlation between collagen thermostability and the environment temperature. Such rebuildings of metabolism connect mainly with synthesis, processing and degradation changes.

In experiments in vitro there is the intensification of more thermostable collagen degradation and synthesis of less thermostable collagen with the decreasing of incubation temperature.

These mechanisms of collagen structures quick adaptation to the sharp environment temperature changes can be used by cold-blooded animals, which live in such conditions. The same mechanisms have hibernating animals, because their body temperature changes at the transition awaking to sleeping state.

We have made the conclusion that warm-blooded animals also have these mechanisms of collagen quick adaptation to the temperature influence and they exist in relict form.

Key words: adaptation, collagen, temperature, metabolism, autocollagenolysis, thermodynamic parameters, denaturation, structure stability.