Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ полиморфизма ДНК у потомков мышей, подвергшихся острому и хроническому γ-облучению

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ полиморфизма ДНК у потомков мышей, подвергшихся острому и хроническому γ-облучению"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи МЯЗИН Андрей Евгеньевич

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ДНК У ПОТОМКОВ МЫШЕЙ, ПОДВЕРГШИХСЯ ОСТРОМУ И ХРОНИЧЕСКОМУ у-ОБЛУЧЕНИЮ

Специальность 03.00.01 - радиобиология Специальность 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории радиационной генетики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Шевченко Владимир Андреевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор, Пелевина Ирина Ивановна,

Зав. лабораторией № 0416 Института химической физики РАН, Москва

Кандидат биологических наук, Снигирева Галина Петровна,

Зав цитогенетической лаборатории ФГУ Российского научного центра рентгенологии и радиологии ФА по здравоохранению и соц. развитию Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Защита диссертации состоится «18» мая 2006 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д.501.001.65 при МГУ им. М. В. Ломоносова по адресу 119899, Москва, Ленинские Горы, Биологический факультет, аудитория 557, факс (495) 939-43-09

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан сиф&мЛ. 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Развитие методов биохимии, молекулярной биологии и генетической инженерии позволяет подходить к оценке таких явлений как пострадиационный мутационный процесс и радиационно-индуцированная нестабильность генома с точки зрения оценки изменения молекулярно-генетических показателей. В последние годы постоянно увеличивается количество работ, посвященных анализу вариабельности маркеров полиморфизма ДНК у потомства облученных родителей. Маркеры полиморфизма ДНК имеют ряд характеристик, которые делают их удобными для изучения радиационно-генетических эффектов [Алтухов, Салменкова, Курбатова и др., 2004]. Наибольший интерес исследователей в области изучения генетических эффектов радиации представляют мини (МНС) - и микросателлитные (МКС) локусы. Использование МКС и МНС для изучения генетических последствий облучения дает целый ряд преимуществ перед традиционными методами. Например, за счет повышенной частоты спонтанных мутаций, для исследований не требуется значительного числа животных в экспериментальных группах. Большая часть исследований в этой области посвящена изучению генетических последствий облучения в малых дозах, то есть до 0,2 Гр [UNSCEAR, 1999]. В то же время диапазон доз от 0,5 до 1 Гр и выше охвачен молекулярно-генетическими исследованиями в значительно меньшей степени. Вопрос о закономерностях радиационной индукции полиморфизма ДНК при воздействиях средних и больших доз ионизирующих излучений и связи такой индукции с нестабильностью генома остается открытым. Boyd и соавторы, изучая зависимость «доза-эффект» для частоты мутаций в мини- и микросателлитных локусах в клетках линии UVW, показали, что при воздействии у - излучения в дозах 1 - 3 Гр наблюдается достоверное увеличение частоты мутаций с увеличением дозы облучения [Boyd, Livingstone, Wilson et al., 2000].

Помимо анализа изменчивости сателлитных локусов, довольно широкое распространение получил метод оценки генетической вариабельности с помощью полиморфной ДНК, амплифицированной с серией случайных праймеров (random amplified polymorphic DNA, RAPD, или arbi-

POC. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА i С.-Петербург ОЭ 200^акт5^3

trary primed DNA, AP-PCR). Данный метод дает возможность быстрого сканирования генома за счет получения фингерпринтов («отпечатков пальцев») ДНК и может быть использован для оценки изменений, произошедших в нем под воздействием каких-либо факторов. Набор фрагментов ДНК, получаемых при амплификации со случайными праймерами, обладает генотип-специфичностью и может служить критерием при изучении генетических различий между близкородственными видами, линиями, сортами, породами и штаммами. В основе метода RAPD лежит модификация полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой вместо пары праймеров (прямой и обратный), фланкирующих определенную последовательность, используется серия одиночных случайных праймеров, не имеющих специфичности к данному геному. Также иногда используется смесь из 2 - 4 таких праймеров, (semi-RAPD) [Матвеева и др., 2005].

Анализ вариабельности полиморфной ДНК применяется в радиа-ционно-генетических исследованиях как на модельных объектах, так и для мониторинга популяций человека. Безлепкин с соавторами [Безлеп-кин и др., 2000] с помощью метода AP-PCR показали увеличение генетической вариабельности у потомков мышей линии BALB/c, хронически облученных гамма-излучением в дозах 0,1 - 0,5 Гр. Примером использования данной технологии в радиционно-генетическом мониторинге может служить работа Weinberg с соавторами, которые показали увеличение частоты мутаций с помощью RAPD у детей ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС [Weinberg et al., 2001]. Существует множество других примеров использования полиморфной ДНК для оценки генетической вариабельности, возникающей у потомков облученных родителей. Но значительная часть таких исследований посвящена эффектам малых доз, тогда как информации о генетической вариабельности, возникающей при воздействии доз ионизирующего излучения от 0,5 Гр и выше, явно недостаточно. Изучение молекулярно-генетических эффектов средних и больших доз радиации позволит получить более полное представление о механизмах воздействия ионизирующего излучения на геном. Таким образом, актуальность настоящей работы состоит в изучении вариабельности ДНК, возникающей в потомстве мышей, облученых в диапазоне до от 1 до 3 Гр.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении молекулярно-генетических эффектов радиационного воздействия у мышей линий ВАЬВ/с и СВА/1ас и их потомков в условиях однократного и хронического облучения в различных дозах. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить индукцию генетической вариабельности на пре - и по-стмейотической стадиях сперматогенеза при облучении в дозах от 1 до 3 Гр с помощью полиморфной ДНК, амплифицированной со случайными праймерами.

2. Дать сравнительную оценку чувствительности стадий сперматогенеза на основании анализа уровней вариабельности продуктов ЯАРО потомков мышей, облученных в диапазоне доз 1-3 Гр.

3. Изучить с помощью метода ДНК -комет изменение устойчивости клеток селезенки мышей линий ВАЬВ/с и СВАЛас к воздействию однократного облучения в диапазоне доз 1-6 Гр и пролонгированного облучения в суммарной дозе 0,36 Гр.

4. Изучить молекулярно-генетические эффекты хронического низкоинтенсивного у-излучения у мышей и их потомков с помощью методов ЯАРР и электрофореза индивидуальных клеток (комет- тест).

Научная новизна полученных результатов. Впервые проведен сравнительный анализ чувствительности пре - и постмейотических стадий сперматогенеза в области доз от 1 до 3 Гр с помощью анализа полиморфизма ДНК, амплифицированной с серией случайных праймеров. Для анализа полиморфизма ДНК была использована серия случайных праймеров, в которую входили как одиночные, так и смеси праймеров. Получены достоверные различия между опытной и контрольной группами для всех использованных доз облучения. Впервые исследованы генетические эффекты пролонгированного облучения в суммарной дозе 0,36 Гр, лишь в несколько раз превышающей годовую дозу от естественного радиационного фона (0,086 - 0,173 Гр/год). Новизна работы заключается и в использованных модификациях метода КАРП), позволяющих получать более воспроизводимые результаты.

Практическая значимость работы Результаты работы могут быть использованы для экстраполяции данных на человека с целью оценки

рисков как острого, так и хронического облучения. Кроме того, полученные результаты позволяют рассматривать возможность использования метода амплификации ДНК со случайными праймерами при проведения радиоционно-генетического мониторинга. При этом, воспроизводимость метода увеличивается при использовании модификации, описанной в настоящей работе, а так же при использовании серии праймеров.

Апробация работы. Результаты настоящей работы были представлены на 6-ой Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», г. Пущино 20-24 мая 2002 г; Международной конференции «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций», Москва, 10-13 июня 2002 года.; 6-ой Международной научной конференции «Экология человека и природа», г. Плёс, 5-11 июля 2004 г.; Международной научно-практической конференции «Парадигмы современной радиобиологии. Радиационная защита персонала объектов атомной энергетики», Киев - Чернобыль, 27 сентября - 2 октября 2004 г.; 2-ой Международной конференции «Современные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции», посвященной 105-летию со дня рождения Н.В. Тимофеева-Рессовского, Ереван, 8 -11 сентября 2005 г.; 3-ей Международной конференции «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций», Дубна, 4 -7 октября, 2005 г; 3-ем Международном симпозиуме «Хроническое радиационное воздействие: медико-биологические эффекты», Челябинск, 25 - 28 октября 2005 г.; межлабораторном семинаре «Проблемы генетической безопасности», ИОГен РАН, 20 декабря 2005 г.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок и 14 таблиц. Диссертация имеет традиционную структуру и состоит из введения, литературного обзора, описания методов и материалов, результатов исследований, их обсуждения, выводов и списка литературы. В списке литературы 193 источника, в том числе 148 на английском языке. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика животных и методы облучения. В экспериментах использовали мышей линий BALB/c, CBA/lac, а также гибридных самок СВАЛас X С57/Ы из питомника «Столбовая» РАМН. Для однократно-

го облучения использовали мышей линии ВАЬВ/с, так как мыши этой линии отличаются высокой радиочувствительностью и стабильно высокой плодовитостью. В экспериментах с острым облучением, самцов мышей линий ВАЬВ/с облучали в дозах 1 - 3 Гр на гамма-установке ГУПОС (источник - 137Сб, ИОГен РАН) при мощности дозы 450 рад/мин. Для сравнения радиационной чувствительности стадий сперматогенеза, самцов скрещивали с самками той же линии через две недели и через три месяца после облучения. Интервал между облучением и началом спаривания был выбран таким образом, чтобы в оплодотворении участвовали сперматозоиды, которые во время облучения находились на премейотических (стволовые сперматогонии) и постмейотической (сперматиды) стадиях созревания. Группы потомков от скрещивания на второй - третьей неделе после облучения называли «сперматидными» группами, а от скрещивания через три месяца - «сперматогониевой» группами

Для оценки соматических отдаленных последствий облучения был поставлен эксперимент с облучением мышей-самцов линии ВАЬВ/с в дозах 1,3 и 6 Гр. Для облучения использовали установку ГУПОС (мощность дозы - 450 рад/мин, источник - '"Се, ИОГен РАН) В данном эксперименте изучали изменение чувствительности после облучения лимфоцитов селезенки к пероксиду водорода с помощью электрофореза индивидуальных клеток (метод ДНК-комет).

Совместно с ГУЛ МосНПО «Радон», был проведен эксперимент с целью изучить индукцию полиморфизма ДНК в геноме потомков хронически облученных мышей. Самцов линии СВАЛас облучали на установке УОГ-1 (источник - |37Сз, ГУЛ МосНПО «Радон») при мощности дозы 0,17 сГр/сутки, в течение 210 суток. Суммарная доза составила 0,36 Гр. Через неделю после облучения, самцы опытной и контрольной групп были скрещены с гибридными самками СВАЛас X С57/Ы. Потомство контрольных и облученных самцов содержали в стандартных условиях и забивали в возрасте 3-4 недель. Для отбора проб родительского поколения, после окончания эксперимента, самцы и самки всех групп бьши также забиты. Помимо генетической вариабельности, у хронически облученных мышей линии СВАЛас изучалась так же устойчивость клеток селезенки к воздействию перекиси водорода. Для этого, часть самцов контрольной и

опытной групп была забита через 40 и 270 суток после начала облучения. Во всех экспериментах соблюдалась строгая паспортизация всех потомков с помощью маркировки животных и контроля при пересадках животных, что гарантировало соблюдение конкретных родительских пар для каждого из потомков, родившегося как от облученных самцов, так и от контрольных необлученных.

Характеристика реактивов и оборудования. В работе были использованы реактивы и оборудование как зарубежных, так и отечественных производителей, предоставленные ООО «Хеликон». Так же был использован программируемый термостат отечественного производства (ООО «ТДЛ»). Реактивы для выделения ДНК и готовые наборы для постановки ПЦР были предоставлены фирмой ООО «Лаборатория ИЗО-ГЕН». Для амплификации были использованы 18-ти и 20-ти членные олигонуклеотиды производства ЗАО «Синтол».

Методы исследований. ДНК выделяли из печени с помощью набора Diatom DNA Ргер200 (ООО «Лаборатория Изоген»), руководствуясь прилагаемой инструкцией. После выделения, качество и количество ДНК контролировали с помощью стандартного электрофоретического разделения в 1%- ном агарозном геле. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась с помощью готовых наборов Genepak PCR Core (ООО «Лаборатория Изоген»), Программа амплификации состояла из 35-ти циклов и включала в себя первые 4-е цикла с «холодной» температурой отжига (Тпл =42 °С). Постановка реакций проводилась на одном и том же ампли-фикаторе в максимально стандартизованных условиях.

Аналитический электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК проводили в 1,5%-ном агарозном геле в отдельном помещении, с целью предотвращения контаминации. Документирование гелей проводили в проходящем УФ-свете с помощью видеосистемы Gel Imager (Россия), состоящей из аналоговой видеокамеры, подключенной к персональному компьютеру, и программного обеспечения.

В настоящем исследовании критерием появления изменений в RAPD-паттернах потомства служило: появление новых, «неродительских» полос, исчезновение родительских полос. Подсчитывали частоту новых полос на одного потомка в семье и частоту исчезновения родительских

полос на одно животное в группе, по причине относительной редкости случаев исчезновения полос в данных экспериментах.

С целью изучения соматических эффектов радиации при однократном и хроническом облучении, было проведено исследование антиокислительного статуса клеток селезенки облученных мышей. В данных экспериментах был использован метод электрофореза индивидуальных клеток (комет тест). Метод позволяет эффективно изучать степень повреж-денности ДНК в результате самых различных воздействий и широко используется в радиационной биологии. Спленоциты подвергали обработке раствором перекиси водорода в концентрации 50 и 500 мкМ. Для этого, слайды с иммобилизированными в агарозу спленоцитами помещали в емкости с охлажденным ФСБ, содержащим 0, 50 и 500 мкМ пероксида водорода на 10 мин при 0°С. Затем проводили электрофорез индивидуальных клеток (метод ДНК-комет) в щелочной модификации [Singh et al 1988]. Для окраски использовали флуоресцентный краситель Hoechst 33258. Анализ ДНК-комет проводили при помощи люминесцентного микроскопа «Axiophot» (Carl Zeiss, Германия). Подсчитывали 100 «комет» на каждом слайде, оценивая степень миграции ДНК из ядра по методу визуальной оценки Collins et al. [1995] Средний индекс ДНК-комет (СИК) рассчитывали по формуле:

СИК g(".+2i.a +3i,3+4i,4)t

4

г где - nl - п4 - число «комет» в категориях 1-4, - сумма всех

/=1

подсчитанных «комет» [Осипов, Елаков, Пучков и др., 2002].

Экспериментальные данные обрабатывали общепринятыми статистическими методами с использованием параметрического критерия Стьюдента (t), непараметрического критерия Манна-Уитни, точного критерия Фишера, регрессионного анализа и критерия хи-квадрат (метод таблиц сопряжения) [Урбах В.Ю., 1964; Медик В.А., 2000] с использованием программных пакетов Microsoft Excel 2000 и Statistica v.6.0. Для каждого исследуемого параметра при каждой дозе облучения определяли среднее значение параметра и ошибку среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Вариабельность продуктов амплификации ДНК со случайными праймерами у потомков облученных мышей. Метод анализа полиморфизма ДНК, амплифицированной с серией случайных праймеров (НАРБ) дает возможность быстрого сканирования генома без необходимости сек-венирования изучаемых последовательностей. Среди методов изучения полиморфизма ИАРБ или АР-РСЯ является наиболее простым и доступным, не требует дополнительного оборудования и реактивов.

Но помимо перечисленных достоинств, этот метод анализа вариабельности ДНК имеет такие значимые недостатки, как чувствительность к изменениям условий амплификации и склонность к образованию различных артефактов. Поэтому требовалась тщательная отработка условий и подбор праймеров.

Предварительно из 20 схожих по составу праймеров были отобраны девять, которые давали наиболее четкие и воспроизводимые паттерны при амплификации с геномной мышиной ДНК. Отобранные олигонуклеотиды применялись в дальнейшей работе, как одиночные, так и в смесях праймеров. Выбор данных олигонуклеотидов обусловлен тем, что амплификация геномной ДНК с этим набором праймеров давала наиболее воспроизводимые паттерны КАРП-маркеров. Применение смесей из двух и более праймеров для случайной амплификации описано в ряде работ, посвященных генотипированию микроорганизмов и филогенетическим исследованиям [Матвеева и др., 2005]. Использование жидких наборов для ПНР не приводило к желаемым результатам, прежде всего из-за невозможности воспроизведения паттернов. В силу специфики метода, реакция полимеризации должна всегда проходить в стандартных условиях. Поэтому была использована ингибированная полимераза в составе лиофилизиро-ванных смесей. Такая полимераза обладает стабильной активностью, так как ее свойства не зависят от условий хранения, и, прежде всего - от перепада температур при замораживании и размораживании.

Помимо этого, была оптимизирована программа амплификации с учетом состава праймеров и особенностей используемого программируемого термостата. Стандартная схема амплификации с постоянной темпе-

ратурой отжига не позволяла получать читаемые картины электрофореза. Наиболее четкие паттерны получались при введении в программу амплификации двухступенчатого отжига с повышением температуры с 42°С до 58°С.

Так же необходимо было учесть артефакты, возникающие при амплификации со случайными праймерами. Для этого при появлении изменений в паттерне, каждую амплификацию делали в трех повторностях. Известно так же, что наиболее четко ИАРО-маркеры воспроизводимы в пределах от 1000 до 200 пар нуклеотидов. Этим был обусловлен выбор 1,5%-ного агарозного геля для электрофоретического разделения продуктов амплификации. Окончательные результаты подбора состава смесей, условий амплификации и праймеров представлены на рис.1, на примере мышей линии ВАЬВ/с и их потомков.

Анализ КАРБ-профилей потомков контрольной и опытной групп проводили по таким параметрам, как процент новых, «неродительских полос», и средняя частота появления новых полос в расчете на одно животное.

М 1 2345 12345 1 2345М

А В С

Рис.1. Электрофореграмма ЯАРВ-маркеров облученного самца (А), потомка (В) и самки (С). 1- 759, 2- 760, 3- 765, 4 - М1, 5- М2, М- ладцер 1000-100 п.о. Стрелочкой отмечена неродительская полоса.

Увеличение частот новых полос у потомков мышей-самцов линии ВАЬВ/с, однократно облученных в дозе 1 Гр. На рис. 2 представлено сравнение уровней вариабельности ЯАРО-маркеров у потомков от скрещивания через две недели («сперматидная» группа) и потомков от скре-

щивания («сперматогониевая» группа) через три месяца после облучения в дозе 1 Гр. Из данных гистограммы на рис.2 видно, что как потомки «сперматидной» группы, так и «сперматогониевой» группы имеют заметно более высокий уровень полиморфизма по сравнению с контролем. При этом различия между экспериментальными группами недостоверны, о чем свидетельствуют результаты статистической обработки с использованием ^критерия. Повышение вариабельности в группе потомков «сперматидного» скрещивания можно объяснить меньшей выборкой, т.к. было отмечено резкое снижение количества потомков по сравнению с контрольной и «сперматогониевой» группами. Достоверное увеличение частоты (Р<0,05) появления новых полос в обоих экспериментальных группах по сравнению с контрольной, подтверждает индукцию полиморфизма в геноме потомков облученных мышей при облучении в дозе 1 Гр.

Увеличение частот новых полос у потомков мышей-самцов линии ВАЬВ/с, однократно облученных в дозе 2 Гр. На рис. 3 представлены результаты сравнения уровней вариабельности сперматидной и сперматогониевой групп потомков мышей, облученных в дозе 2 Гр. Различия по уровню полиморфизма между потомством «сперматидного» и «спер-матогониевого» скрещивания заметно возрастают.

Таким образом, статистическая значимость различий частот появления неродительских полос в потомстве контрольной и опытных групп при облучении в дозе 2 Гр свидетельствует об индукции генетической вариабельности.

Увеличение частот новых полос у потомков мышей-самцов линии ВАЬВ/с, однократно облученных в дозе 3 Гр. На рис. 4 представлено сравнение уровней полиморфизма сперматидной и сперматогониевой групп потомков мышей, облученных в дозе 3 Гр. В некоторых случаях уровень полиморфизма потомков «сперматидного» скрещивания выше, чем у потомков «сперматогониевого» скрещивания (праймеры 756 и М). Отмечены статистически значимые отличия между опытными и контрольными группами. Это, в свою очередь позволяет делать вывод об индукции полиморфизма ДНК в потомстве мышей, облученных в дозе 3 Гр.

ю

1,5

□контроль □ сперматиды

759 760 765 М1 М2 Праймеры

Рис 2. Средняя частота появления «неродительских» полос на одного потомка опытной и контрольной группы при облучении в дозе 1 Гр

759 760 765 М1 М2

Праймер

Рис 3. Средняя частота появления «неродительских» полос на одного потомка опытной и контрольной группы при облучении в дозе 2 Гр.

Средний уровень вариабельности ДНК потомков мышей, облученных в дозах 1 -3 Гр. Для каждого из использованных праймеров картина изменения частот неродительских полос в зависимости от дозы об-

лучения отличалась. Но общей чертой является увеличение уровня вариабельности уже при дозе 1 Гр по сравнению с контролем и сохранение повышенного уровня при дозах облучения 2 и 3 Гр. Это дало нам основания использовать средние частоты появления новых полос для всей серии праймеров (рис. 5). Статистический анализ с применением параметрических и непараметрических критериев данных показал, что на фоне достоверного отличия частоты новых полос во всех экспериментальных группах от контроля (приблизительно в 3 раза), статистической значимости различий в частотах между группами, облученных в доза 1, 2 и 3 Гр, нет. Подобная тенденция характерна как для сперматидной, так и для сперма-тогониевой стадий. Это указывает на нелинейность кривой зависимости частоты появления новых полос от дозы облучения.

1,5

□ контроль

□ сперматиды

■ сперматогонии

-г 0,5

759

760

765 Праймер

М1

М2

Рис 4. Средняя частота появления «неродительских» полос на одного потомка опытной и контрольной группы при облучении в дозе 3 Гр.

Частота исчезновения родительских полос в паттернах потомков мышей линии ВАЬВ/с, однократно облученных в дозах 1-3 Гр.

Помимо появления новых полос, учитывалось также исчезновение полос, характерных для родительских паттернов. Не было зарегистрировано значительного увеличения изменений данного параметра в пересчете на

семью, поэтому данные по частоте нуль-мутаций приведены в обобщенным виде по всем праймерам. Частота нуль-мутаций подсчитывалась в расчете на одного потомка в группе. На рис 6 приведены результаты анализа исчезновения родительских полос в ЯАРБ-профилях потомков. Следует отметить, что наблюдалось увеличение на порядок частоты исчезновения полос у потомков облученных групп по сравнению с контрольной группой. Достоверное увеличение частоты нуль-мутаций в сравнении с контролем позволяет так же сделать вывод об увеличении степени вариабельности ДНК у потомков мышей, облученных в дозах 1- 3 Гр. Значимого увеличения частоты нуль-мутаций в зависимости от дозы облучения зарегистрировано не было.

□ слерматиды

1 . ■ сперматогонии

0 12 3

Доза, Гр

Рис 5. Изменение уровня полиморфизма ДНК потомков «сперматидной» и «сперматогониевой» групп в зависимости от дозы облучения.

Влияние низкоинтенсивного хронического облучения на уровень вариабельности ДНК потомков мышей линии СВАЛас. Была проанализирована изменчивость ДНК у 48 потомков (8 семей) опытной и 47 (7 семей) - контрольной группы. Было обнаружено увеличение средней частоты новых полос лишь для трех из пяти использованных праймеров -759, М1 и М2 (рис. 7), отличие от контроля составило, соответственно,

33,29%, 55,05% и 23,66%. Отметим, что и при анализе результатов ЯАРО у потомков однократно облученных мышей, частоты возникновения новых полос при использовании данных праймеров достоверно отличались от контрольного уровня. Статистический анализ с использованием двухстороннего ^теста выявил достоверное отличие (Р<0,05) опытных данных от контрольных только при использовании смеси праймеров М1. Частота нуль-мутаций в контрольной и опытной группах различалась незначительно. Таким образом, можно сделать вывод, что воздействие хронического низкоинтенсивного у -облучения на генетический аппарат мышей-самцов линии СВАЛас приводит к изменениям в паттернах потомства облученных мышей, однако статистическая значимость данных изменений незначительна.

Рис 6. Изменение частоты нуль-мутаций у потомков облученных мышей линии ВАЬВ/с в зависимости от дозы облучения.

Чувствительность спленоцитов мышей линий ВАЬВ/с и СВАЛас к пероксиду водорода после облучения в различных дозах. Для наиболее полной оценки отдаленных молекулярно-генетических последствий острого и хронического облучения гамма-излучением, был поставлен ряд

0,7

□ контроль

□ сперматиды ■ сперматогонии

2 Доза, Гр

экспериментов с целью изучить изменение чувствительности спленоци-тов к пероксиду водорода в зависимости от дозы облучения.

□ Контроль В Облучение хр

759 760 765 М1 М2

Праймеры

Рис 7. Средняя частота появления «неродительских» полос на одного потомка опытной и контрольной группы в эксперименте с хроническим облучением мышей линии СВАЛас. * - Р<0,05

Пероксид водорода (Н2СЬ) способен распадаться на свободные радикалы *ОН, которые обладают наибольшей активностью и вносят основной вклад в повреждение ДНК. Таким образом, с помощью пероксида водорода можно тестировать антиоксидантные системы клетки, которые защищают генетический аппарат от свободных радикалов. Опубликован ряд работ, в которых пероксид водорода используется как дополнительный повреждающий фактор для изучения антиоксидантного и репарационного статуса |^о]еиго<17ка е1 а1., 2002; РхрегаМв, Рейакоу, ТвПятвак! е1 а1., 2003; Во™с1еп, Висклгакег, МсВпс1е ег а!., 2003].

Предварительно была изучена динамика изменения уровня среднего индекса комет (СИК) в спленоцитах мышей линии ВАЬВ/с при увеличении концентрации пероксида водорода в диапазоне от 0 до 500 мкМ. На основании кривой «доза-эффект» были выбраны две концентрации пероксида водорода - 50 и 500 мкМ, которые были использованы в работе.

Чувствительность спленоцитов мышей линии ВАЬВ/с к пероксиду водорода после облучения в дозах 1-6 Гр. На рис. 8 и рис. 9 представлена динамика изменения среднего индекса комет в зависимости от

дозы облучения и концентрации пероксида водорода. Данные графика на рис. 8 свидетельствуют о сохранении зависимости «доза-эффект» через 11 месяцев после облучения в дозах 1-6 Гр, что свидетельствует о наличии отдаленных последствий при облучении в этом диапазоне доз.

На рис. 9 представлена динамика изменения чувствительности спле-ноцитов мышей линии ВАЬВ/с к перекиси водорода в концентрации 50 и 500 мкМ в зависимости от дозы облучения. Из данных гистограммы на рис 9, видно, что облучение в дозе 3 и 6Гр вызывает значительное увеличение чувствительности спленоцитов к действию пероксида водорода в концентрации 50 мкМ. Эффект действия Н2О2 в концентрации 500 мкМ значителен во всех группах и отличия между ними не являются статистически значимыми. Эти данные позволяют говорить о значительном повреждающем эффекте гамма излучения в дозах 1 - 6 Гр и сохранении эффектов в отдаленные сроки после облучения.

Доза, Гр

Рис. 8. Зависимость среднего индекса комет (СИК) лимфоцитов селезенки мышей линии ВАЬВ/с от дозы у-излучения полученная через 11 месяцев после облучения мышей в различных дозах (без дополнительного воздействия пе-роксидом водрода).

3

1 ; О !

О 50 500

Рис. 9. Изменения среднего индекса комет лимфоцитов селезенки обученных мышей линии ВАЬВ/с после инкубации суспензии клеток с перекисью водорода. По оси абсцисс - концентрация перекиси водорода, мкМ; по оси ординат - средний индекс комет, усл. ед.

Динамика изменения чувствительности спленоцитов мышей линии СВАДас к пероксиду водорода при хроническом облучении. На рис. 10 представлена гистограмма, отражающая изменения среднего индекса комет в зависимости от дозы облучения и концентрации перекиси водорода через 40 и 270 суток с момента начала облучения.

Данные по изменению среднего индекса комет в зависимости от дозы

-I

^ облучения и концентрации перекиси водорода свидетельствуют о прояв-

лении эффектов хронического воздействия низкоинтенсивного гамма* излучения уже на сороковые сутки с начала облучения.

Для проверки достоверности различий между средними индексами комет в различных точках эксперимента был проведен статистический анализ с использованием критерия хи-квадрат. С помощью данного метода было получено, что средние индексы комет облученной группы существенно отличаются от контроля при концентрации пероксида водорода 0 мкМ и 50 мкМ (х201> 13,3; <11=4) как на 40, так и на 270 сутки с начала облучения.

Доза, Гр

□ 0 01

□ 3 16

Контроль, 40 Контроль, Облучение, Облучение, сут 270 сут 40 сут 270 сут

Рис. 10. Динамика изменения чувствительности спленоцитов мышей линии СВАЛас в течение эксперимента с хроническим облучением.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Повышение частоты изменений в паттернах потомков облученных мышей наблюдается как после однократного воздействия у-излучения в интервале доз 1- 3 Гр, так и после хронического облучения. Изменения в профилях потомков от «сперматидного» и «сперматогониевого» скрещивания имеют сходную тенденцию - резкое увеличение относительно контрольного уровня вариабельности после облучения в дозе 1 Гр и незначительное увеличение/снижение уровня вариабельности при дозах облучения 2 и 3 Гр. Статистически значимой зависимости изменения вариабельности ДНК, амплифицированной с серией случайных праймеров, от дозы облучения не наблюдается, что соответствует данным других авторов.

Таким образом, результаты настоящей работы дают основания полагать, что индукция генетической вариабельности происходит в диапазоне доз менее 1 Гр.

выводы

1. При изучении генетической вариабельности, индуцированной у-облучением мышей линии ВАЬВ/с, показано, что в потомстве облученных родителей частота появления новых полос в КАРБ-паттернах достоверно превышает контрольный уровень примерно в 3 раза (в зависимости от используемого праймера и стадии сперматогенеза). Обнаруженный эффект достоверно не зависит от дозы облучения в интервале доз 1-3 Гр.

2. Степень вариабельности ЛАРП-паттернов у потомков не зависела от стадии сперматогенеза, на которой находились половые клетки родителей в момент облучения.

3. Частоты исчезновения родительских полос в НАРО-паттернах потомства (нуль-мутации) при всех использованных дозах облучения и стадиях сперматогенеза в момент облучения достоверно превышают контрольный уровень.

4. При изучении поврежденности ДНК в спленоцитах мышей линии ВАЬВ/с методом электрофореза индивидуальных клеток (метод ДНК- комет) спустя 11 месяцев после облучения в интервале доз 1-6 Гр показано, что средний индекс комет (СИК) достоверно превышал контрольный уровень. При дополнительном воздействии пероксида водорода на клетки облученных мышей было показано, что устойчивость спле-ноцитов к пероксиду водорода снижается по сравнению с контролем, начиная с дозы облучения 3 Гр.

5. Обнаружено значительное снижение устойчивости сплено-цитов хронически облученных мышей-самцов линии СВАЛас к пероксиду водорода в концентрациях 50 и 500 мкМ уже на 40 сутки с начала облучения.

6. При изучении воздействия хронического облучения (суммарная доза 0,36 Гр) на мышей-самцов линии СВАЛас показано достоверное увеличение частоты появления новых полос в 11АРО-паттернах потомства для смеси праймеров М1.

7. Метод амплификации ДНК со случайными праймерами (ЯАРО) может быть использован для изучения генетической вариабельности, возникающей в потомстве гамма-облученных мышей. Для наиболее полной оценки генетических последствий облучения, представляется

полезным применение анализа RAPD (как и других молекулярно-генетических методов) в комплексе с традиционными цитогенетиче-скими методами.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мязин А.Е., Осипов А.Н, Сыпин В.Д., Шевченко В.А./ Изучение чувствительности спленоцитов мышей к перекиси водорода с помощью комет-теста в отдаленные сроки после воздействия у-излучения./ Сб. тезисов 6-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», т. 1, стр. 288, г. Пущино 20-24 мая 2002 г.

2. Мязин А.Е., Елаков A.JL, Осипов А.Н, Сыпин В.Д., Шевченко В.А/ Однонитевые разрывы ДНК лимфоцитов селезенки мышей индуцированные дополнительным воздействием перекиси водорода в отдаленный срок после радиационного воздействия./ Сб. тезисов Международной конференции «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций», стр. 89, Москва, 10-13 июня 2002 года.

3. Мязин А.Е., Елаков А.Л., Осипов А.Н, Сыпин В.Д., Шевченко В.А/ Оценка методом ДНК-комет однонитевых разрывов ДНК лимфоцитов селезенки в отдаленные сроки после острого облучения мышей в сублетальных и среднелетальных дозах/ Радиационная биология. Радиоэкология; 2002, т. 42, №6, с. 731 -734.

4. Myazin А.Е., Osipov A.N., Shevchenko V.A. /Study of the sensitivity of spleen lymphocytes to hydrogen peroxide by the comet assay in mice continuously exposed to g-radiation and stable isotopes of cezium and strontium at low doses./ The 3rd Congress on radiation research. Abstracts, p. 102, Kyiv, 21 -25 May 2003.

5. Myazin A.E., Osipov A.N., Shevchenko V.A. /Change of sensivity of DNA of mice's spleenocytes to H202, continuously exposed to g-radiation and stable isotopes of cezium and strontium at low doses./ Conferences for young scientist, Phd-students and students on molecular biology and genetics. Abstracts, p. 107., Kiev, Ukraine, September 25 - 27,2003.

5. Мязин A.E., Сафонов A.B., Шайхаев Г.О., Померанцева М.Д., Шевченко В.А. / Анализ радиационно-индуцированной нестабильности генома у

потомства мышей линии BALB/C с помощью RAPD./ Сб. тезисов 8-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, 17 -21 мая 2004 года, стр. 22.

6. Мязин А.Е., Сафонов А.В., Рамайя Л.К., Померанцева М.Д., Шайхаев Г.О., Шевченко В.А. / Полиморфизм RAPD -маркеров у потомков у-облученных мышей-самцов линии BALB/c./ Сб. трудов 6-ой Международной научной конференции «Экология человека и природа», г. Плёс, 5 -11 июля 2004 г., стр 52- 55.

7. Мязин А.Е., Сафонов А.В., Осипов А.Н., Рамайя Л.К., Померанцева М.Д., Шайхаев Г.О., Шевченко В.А./ Анализ полиморфизма RAPD -маркеров потомства хронически и остро облученных мышей/ Сборник «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии», Томск, 2004, т. 4 ,№ 1, стр. 15-19.

8. Мязин А.Е., Осипов А.Н., Померанцева М.Д., Шайхаев Г.О., Шевченко В.А./ Полиморфизм RAPD-маркеров потомства хронически и остро облученных мышей как проявление радиационно-индуцированной нестабильности генома. Тезисы докладов научно-практической конференции «Парадигмы современной радиобиологии. Радиационная защита персонала объектов атомной энергетики», стр. 50, Киев - Чернобыль, 27 сентября -1 октября 2004 г.

9. V.D. Sypin, A.N. Osipov, A.L. Elakov, O.G. Polsky, S.A. Dmitriev, V.G. Egorov, P.V. Puchkov, A.E. Myazin, G.Ya. Kolomijtseva, V.Yu. Afonin, B.I. Synzynys, E.V. Prudnikova. /Biological approach to evaluating the ecological safety of radioactive waste disposal system: study of small rodents. // Equido-simetry. Ecological Standardization and Equidosimetry for Radioecology and Environmental Ecology. Brechignac, F.; Desmet, G. (Eds.). Springer Book Series: NATO Security Through Science Series. Subseries: Sub-Series C: Environmental Security, Vol. 2. - 2005. - P. 419-425.

06 14 2 15

дооСА

MUS

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 11.04.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 250. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мязин, Андрей Евгеньевич

Список сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы.

1.1. Геномная нестабильность как эффект облучения.

1.2. Полиморфизм - понятие, причины, значение.

1.2.1. Маркеры полиморфизма ДНК.

1.2.1.1. Мини- и микросателлиты.

1.2.1.2. ИАРБ и АРЬР-маркеры.

1.2.2. Некоторые методы изучения маркеров полиморфизма ДНК.

1.2.2.1. Рестрикционные ферменты.

1.2.2.2. Полимеразная цепная реакция.

1.2.4. Увеличение степени вариабельности ДНК как генетический эффект облучения.

1.3. Половые клетки - мишень для действия ионизирующего излучения.

1.3.1. Некоторые методы изучения генетических эффектов радиации в половых клетках.

1.3.1.1 Доминантные летальные мутации.

1.3.1.2. Реципрокные транслокации.

1.3.1.3 Аномальные головки спермиев.

1.3.2. Стадии сперматогенеза.

1.3.3. Различие стадий сперматогенеза по чувствительности к радиационному воздействию.

1.3.4. Летальное действие радиации.

1.3.5. Различия чувствительности половых клеток к генетическому действию

II. Материалы и методы.

II. 1. Однократное облучение животных.

П.2. Хроническое облучение животных.

11.3. Реактивы и оборудование.

11.4. Выделение ДНК.

11.5. Постановка полимеразной цепной реакции.

11.6. Электрофоретический анализ в агарозном геле.

11.7. Документирование результатов электрофореза.

11.8. Анализ паттернов амплифицированной со случайными праймерами ДНК (RAPD-профилей).

11.9. Выделение и обработка пероксидом водорода лимфоцитов селезенки.

НЛО. Метод электрофореза единичных клеток.

II.il. Статистическая обработка результатов.

III. Результаты и обсуждение.

III. 1. Плодовитость, соотношение полов в потомстве однократно- и хронически облученных мышей.

III.2. Вариабельность продуктов амплификации со случайными праймерами у потомков облученных мышей.

111.2.1. Спонтанная вариабельность продуктов RAPD потомства контрольных групп мышей двух различных линий.

111.2.2. Повышение частоты новых полос у потомков мышей-самцов линии BALB/c, однократно облученных в дозах 1-3 Гр.

111.2.2.1. Повышение частоты новых полос у потомков мышей-самцов линии BALB/c , однократно облученных в дозе 1 Гр.

111.2.2.2. Повышение частоты новых полос у потомков мышей-самцов линии BALB/c, однократно облученных в дозе 2 Гр.

111.2.2.3. Повышение частоты новых полос у потомков мышей-самцов линии BALB/c, однократно облученных в дозе 3 Гр.

111.2.3. Зависимость эффекта от дозы для различных стадий сперматогенеза при облучении в диапазоне доз 1 -3 Гр.

III.2.3.1. Средний уровень полиморфизма при облучении 1-3 Гр.

III.2.3.2. Статистический анализ результатов изучения вариабельности RAPDмаркеров по частотам появления новых полос.

III.2.4. Частота исчезновения родительских полос в паттернах потомков.

111.3. Выход мутаций в расчете на 0,01 Гр при остром облучении на стадиях сперматид и сперматогониев.

111.4. Влияние низкоинтенсивного хронического облучения на уровень полиморфизма ДНК потомков мышей линии CBA/lac.

111.5. Определение частоты реципрокных транслокаций в сперматоцитах мышей.

111.6. Чувствительность спленоцитов мышей линий BALB/c и CBA/lac к пероксиду водорода после облучения в различных дозах.

III.6.1 Изменение количества спленоцитов мышей линии BALB/c в отдаленные сроки после облучения в дозах 1-6 Гр.

II 1.6.2. Зависимость среднего индекса комет спленоцитов мышей линии BALB/c от концентрации пероксида водорода.

111.6.3. Чувствительность спленоцитов мышей линии BALB/c к пероксиду водорода после облучения в дозах 1-6 Гр.

111.6.4. Динамика изменения чувствительности спленоцитов мышей линии CBA/lac к пероксиду водорода при хроническом облучении.

111.7. Обсуждение.

IV. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ полиморфизма ДНК у потомков мышей, подвергшихся острому и хроническому γ-облучению"

Актуальность темы.

Развитие методов биохимии, молекулярной биологии и генетической инженерии позволяет подходить к оценке таких явлений как пострадиационный мутационный процесс и радиационно-индуцированная нестабильность генома с точки зрения оценки изменения молекулярно-генетических показателей. В последние годы постоянно увеличивается количество работ, посвященных оценке изменения вариабельности маркеров полиморфизма ДНК у потомства облученных родителей. Маркеры полиморфизма ДНК, такие как микро- (МКС) и минисателлитные локусы (МНС), ДНК Y-хромосомы, митохондриальная ДНК имеют ряд характеристик, которые делают их более удобными для изучения радиационно-генетических эффектов [Алтухов, Салменкова, Курбатова и др., 2004]. Наибольший интерес исследователей в области изучения генетических эффектов радиации привлекают мини- и микросателлитные локусы. Помимо радиационного фактора, была показана индукция мутационного процесса в МКС и МНС при воздействии химических мутагенов, а так же вследствие оксидативного стресса, вызываемого действием перекиси водорода [Yauk, Quinn, 1996; Jackson, Loeb, 2000]. Появление относительно простых и быстрых методов работы с ДНК позволило выявить в начале 90-х годов взаимосвязь повышенной вариабельности микросателлитных локусов и онкологических заболеваний. Следствием изучения корреляции онкологических заболеваний и индуцированной изменчивости микросателлитных локусов стало введение в научную практику нового термина - микросателлитная нестабильность [Peltomaki, Lothe et al., 1993; Loeb, 1994; Безлепкин, Газиев, 2001].

Использование МКС и МНС для изучения генетических последствий облучения дает целый ряд преимуществ перед традиционными методами. К примеру, за счет повышенной частоты спонтанных мутаций, для исследований не требуется значительного числа животных в экспериментальных группах. Большая часть исследований в этой области посвящена изучению генетических последствий малых доз облучения, то есть до 0,2 Гр [UNSCEAR, 1999]. Целый ряд работ Dubrova и соавторов показывает передающееся по наследству увеличение вариабельности минисателлитных локусов в результате воздействия ионизирующих излучений в различных дозах, как на модельные объекты, так и на человека [Dubrova et al., 1996, 1998, 2000, 2002].

Диапазон доз от 0,5 до 1 Гр и выше охвачен молекулярно-генетическими исследованиями в значительно меньшей степени. Вопрос о закономерностях радиационной индукции полиморфизма ДНК при воздействиях средних и больших доз ИИ и связи такой индукции с нестабильностью генома остается открытым. Boyd и соавторы, изучая зависимость «доза-эффект» для частоты мутаций в мини- и микросателлитных локусах в клетках линии UVW, показали, что при воздействии у - радиации в дозах 1 - 3 Гр наблюдается достоверное увеличение частоты мутаций с увеличением дозы облучения [Boyd, Livingstone, Wilson et al., 2000].

Помимо анализа вариабельности сателлитных локусов, довольно широкое распространение получил метод оценки генетической вариабельности с помощью полиморфной ДНК, амплифицированной с серией случайных праймеров (random amplified polymorphic DNA, RAPD, или arbitrary primed DNA, AP-PCR). Данный метод дает возможность быстрого сканирования генома за счет получения фингерпринтов («отпечатков пальцев») ДНК и может быть использован для оценки изменений, произошедших в нем под воздействием каких-либо факторов. Набор фрагментов ДНК, получаемых при амплификации со случайными праймерами, обладает генотип-специфичностью и может служить критерием при изучении генетических различий между близкородственными видами, линиями, сортами, породами и штаммами.

Анализ RAPD или AP-PCR является модификацией полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой вместо пары праймеров (прямой и обратный), фланкирующих определенную последовательность, используется серия одиночных случайных праймеров, не имеющих специфичности к данному геному. Также, иногда, используется смесь из 2 - 4 таких праймеров, такая модификация носит название semi-RAPD [Матвеева и др., 2005].

Анализ вариабельности полиморфной ДНК применяется в радиационно-генетических исследованиях, как на модельных объектах, так и для мониторинга популяций человека. Безлепкин с соавторами [Безлепкин и др., 2000] показали увеличение генетической вариабельности у потомков мышей линии BALB/c, хронически облученных гамма-излучением в дозах 0,1 - 0,5 Гр с помощью AP-PCR. Примером использования данной технологии в радиционно-генетическом мониторинге может служить работа Weinberg с соавторами, которые показали увеличение частоты мутаций с помощью RAPD у детей ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС [Weinberg et al., 2001]. Существует множество других примеров удачного использования полиморфной ДНК для оценки генетической вариабельности, возникающей у потомков облученных родителей. Но значительная часть таких исследований посвящена эффектам малых доз, тогда как информации о генетической вариабельности, возникающей при воздействии доз ИИ от 0,5 Гр и выше, явно недостаточно. Изучение молекулярно-генетических эффектов средних и больших доз радиации дало бы более полное представление о механизмах воздействия ионизирующего излучения на геном.

Цель и задачи исследования.

Цель данной работы заключалась в изучении молекулярно-генетических эффектов радиационного воздействия у мышей линий BALB/c и CBA/lac и их потомков в условиях однократного и хронического облучения в различных дозах.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить индукцию генетической вариабельности на пре - и постмейотической стадиях сперматогенеза при облучении в дозах от 1 до 3 Гр с помощью полиморфной ДНК, амплифицированной со случайными праймерами.

2. Дать сравнительную оценку чувствительности стадий сперматогенеза на основании анализа уровней вариабельности продуктов ИАРЭ потомков мышей, облученных в диапазоне доз 1-3 Гр.

3. Изучить с помощью метода ДНК -комет изменение устойчивости клеток селезенки мышей линий ВАЬВ/с и СВАЛас к воздействию однократного облучения в диапазоне доз 1-6 Гр и пролонгированного облучения в суммарной дозе 0,36 Гр.

4. Изучить молекулярно-генетические эффекты хронического низкоинтенсивного □-излучения у мышей и их потомков с помощью методов ИАРЭ и электрофореза индивидуальных клеток (комет- тест).

Научная новизна полученных результатов. Впервые проведен сравнительный анализ радиационно-генетической чувствительности пре - и постмейотических стадий сперматогенеза в области доз от 1 до 3 Гр с помощью анализа полиморфизма ДНК, амплифицированной с серией случайных праймеров. Для анализа полиморфизма ДНК была использована серия случайных праймеров, в которую входили как одиночные, так и смеси праймеров. Получены достоверные различия между опытной и контрольной группами для всех использованных доз облучения. Исследованы генетические эффекты пролонгированного облучения в суммарной дозе 0,36 Гр, лишь в несколько раз превышающей годовую дозу от естественного радиационного фона (0,086 - 0,173 Гр/год).

Практическая значимость работы. Результаты работы могут быть использованы для экстраполяции данных на человека с целью оценки рисков как острого, так и хронического облучения. Кроме того, полученные результаты позволяют рассматривать использование метода амплификации ДНК со случайными праймерами при проведения радиоционно-генетического мониторинга. При этом, воспроизводимость метода увеличивается при использовании модификации, описанной в настоящей работе, а так же при использовании серии праймеров.

I. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Мязин, Андрей Евгеньевич

1. При изучении генетической вариабельности, индуцированной у облучением мышей линии BALB/c, показано, что в потомстве облученных

родителей частота появления новых полос в RAPD-паттернах достоверно

превышает контрольный уровень примерно в 3 раза (в зависимости от

используемого праймера и стадии сперматогенеза). Обнаруженный эффект

достоверно не зависел от дозы облучения в интервале К З Гр. 2. Степень вариабельности RAPD-паттернов у потомков не зависела

от стадии сперматогенеза, на которой находились половые клетки родителей в

момент облучения. 3. Частоты исчезновения родительских полос в RAPD-паттернах

потомства (нуль-мутации) при всех использованных дозах облучения и

стадиях сперматогенеза в момент облучения достоверно превышали

контрольный уровень. 4. При изучении однонитевых разрывов ДЬЖ спленоцитов мышей

линии BALB/c методом электрофореза индивидуальных клеток (метод ДЬЖ комет) спустя И месяцев после облучения в интервале доз К б Гр показано,

что индекс ACI (средний индекс комет) достоверно превышал контрольный

уровень. При дополнительном воздействии пероксида водорода на клетки

облученных мышей было показано, что устойчивость спленоцитов к

пероксиду водорода снижается по сравнению с контролем, начиная с дозы

облучения 3 Гр. 5. Обнаружено значительное снижение устойчивости спленоцитов

хронически облученных мышей-самцов линии СВА/1ас к пероксиду водорода

в концентрациях 50 и 500 мкМ уже на 40 сутки с начала облучения. 6. При изучении воздействия хронического облучения (суммарная

доза 0,36 Гр) на мышей-самцов линии СВА/1ас показано достоверное

увеличение частоты появления новых полос в RAPD-папернах потомства для

смеси праймеров Ml. 7. Метод амплификации ДНК со случайными праймерами (RAPD)

пригоден для изучения генетической вариабельности, возникающей в

потомстве гамма-облученных мышей. При этом, для наиболее полной оценки

генетических последствий облучения, представляется полезным применение

анализа RAPD (как и других молекулярно-генетических методов) в

комплексе с традиционными цитогенетическими методами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мязин, Андрей Евгеньевич, Москва

1. Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. М.: Мир, 1978. 452 с.

2. Безлепкин В.Г., Газиев А.И. Индуцированная геномная нестабильность генома половых клеток животных по мини и микросателлитным последовательностям. Радиобиология 2001. том 41.№5.с. 475-488

3. Бочков Н.П., Шрам Р.Я., Кулешов Н.П., Журков B.C. Система оценки химических веществ на мутагенность для человека; общие принципы, практические рекомендации и дальнейшие разработки. Генетика, 1975, т. 11, №10, с. 156-159

4. Воробцова И.Е. Влияние облучения родителей на физиологическую полноценность и риск канцерогенеза у потомства первого поколения организмов разных видов. Автореф. дис . докт. биол. JL: ЦНИРРИ МЗ РФ. 1988.

5. Воробцова И.Е. Генетические и соматические эффекты ионизирующей радиации у человека и животных (сравнительный аспект). Радиац. биология. Радиоэкология. 2002. Т. 42. № 6. С. 639-643.

6. Генетика человека.// Учебник для ВУЗов под редакцией В.А.Шевченко, Н.А Топорниной, Н.С. Стволинской. М.: Владос 2002г.

7. Гришанкина Т. И., Шаповалова A.M. Изучение стабильности хромосом у потомков облученных животных. Тез. докл. Междунар. конф. Проблемы радиационной генетики на рубеже веков. М. РУДН. 2000. С. 94.

8. Дубинин Н.П. Потенциальные изменения в ДНК и мутации. М.: Наука. 1978.246 с.

9. Засухина Г.Д., Васильева И.М., Семячкина А.Н. Радиоадаптивный ответ: факты, механизмы, загадки. Тез. докл. Междунар. конф. Проблемы радиационной генетики на рубеже веков. М. РУДН. 2000. С. 110.

10. Ильинских H.H., Юркин А.Ю., Ильинских И.Н., Ильинских E.H. Поломки хромосом в местах расположения онкогенов у лиц, подвергнутых радиационному воздействию. Тез. докл. Междунар. конф. Проблемы радиационной генетики на рубеже веков. М. РУДН. 2000. С. 279.

11. Комар В.Е. Хансон К.П. Информационные макромолекулы при лучевом поражении клеток. М. Атомиздат,1972, 160 с.

12. Кузьмина Н.С., Сусков И.И., Шевченко В.А. Дисгеномные эффекты в организме детей, подвергающихся низкоинтенсивному воздействию радиации в малых дозах.// Сборник «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии», Томск, 2004, т. 4 , № 1, стр. 9-15.

13. Ли Д.Е. Действие радиации на живые клетки. М.:Атомиздат, 1963. 287 с.

14. Мазурик В.К., Михайлов В.Ф. Радиационно-индуцируемая нестабильность генома: феномен, молекулярные механизмы, патогенетическое значение. Радиац. биология. Радиоэкология. 2001. Т.41.№3. С.272-289.

15. Малашенко A.M., Суркова Н.И., Семенов Х.Х. Определение мутагенности химических соединений (генетический принцип) на лабораторных мышах (методические указания). М.: АМН СССР, 1977. 16 с.

16. Маурер Г. Диск- электрофорез. М.: Мир, 1971. 247 с.

17. Медик В.А., Токмачев М.С., Фишман Б.Б. Статистика в медицине и биологии. М. Медицина. 2000.

18. Моссэ И.Б. Радиация и наследственность: генетические аспекты противорадиационной защиты. Минск, 1990. 208 с.

19. Никитина Т.В., Назаренко С.А. Микросателлитные последовательности ДНК человека: мутационный процесс и эволюция.// Генетика, 2004, Т.40, №10, с. 1301-1318.

20. Омельченко В.Т. Электрофоретическое исследование гемоглобинов рыб Дальнего Востока // Генетика. 1974. Т. 10 № 9 С. 35 43.

21. Пелевина И.И., Алещенко A.B., Антощина М.М., Готлиб В.Я., Кудряшова О.В., Семенова Л.П., Серебряный A.M. Реакция популяции клеток на облучение в малых дозах. Радиац. биология. Радиоэкология. 2003. Т. 43. №2. С. 161-166.

22. Померанцева М. Д, Вилкина Г. А. Влияние цистамина на выход доминантных летальных мутаций и реципрокных транслокаций в половыхклетках мышей, подвергшихся гамма-облучению в разных дозах.- Генетика, 1974, т. 10, №7, с. 128-134.

23. Померанцева М. Д, Рамайя JI. К. Мутагенный эффект излучений разных видов на половые клетки самцов мыши. Со общ. I. Сравнительная генетическая радиочувствительность сперматогониев и других стадий сперматогенеза. Генетика, 1969, т. 5, .№ 5, с. 103-112.

24. Померанцева М. Д. Оценка генетического риска радиации для человека. -В кн.: Мутагенез при действии физических факторов. М.: Наука, 1980, с. 45-64.

25. Померанцева М. Д. Сравнительное изучение частоты реципрокных транслокаций в сперматоцитах при облучении новорожденных и взрослых мышей. Генетика, 1978, т. 4, № 3, с. 548-550.

26. Померанцева М. Д., Рамайя JI. К. Об изменении радиочувствительности семенников мышей, подвергшихся рентгеновскому облучению. Радиобиология, 1964, 4, вып. 1, с. 129-135.

27. Померанцева М. Д., Рамайя JI. К. Предварительное облучение как фактор, изменяющий эффективность лучевого воздействия на организм. В кн.: Действие ионизирующих излучений на организм. М.: Изд-во АН СССР, 1962, с. 91-106.

28. Радиобиология.// Учебник для с.х. вузов. Под редакцией А.Д. Белова. М.: Колос 1999г.

29. Рябченко Н.И. Радиация и ДНК. // М.: Атомиздат- 1979, 192 с.

30. Севанькаев А.В. Радиочувствительность хромосом лимфоцитов человека в митотическом цикле. М.: Энергоатомиздат, 1987. С. 79-86.

31. Справочник по радиационной обстановке и дозам облучения в 1991 г. вследствие аварии на Чернобыльской АЭС. Под ред. Балонова М.И. Институт радиационной гигиены ГКСЭН РФ. СПб. Ариадна-Аркадия. 1993. С. 4-7.

32. Сусков И.И, Кузьмина Н.С. Проблема индуцированной геномной нестабильности в детском организме в условиях длительного действия малых доз радиации.//Радиобиология. 2001, т 41. N5. С. 606-613

33. Шевченко В. А. Радиационная генетика одноклеточных водорослей. М.: Наука, 1979.236 с.

34. Шевченко В.А. Последствия Чернобыльской катастрофы: Здоровье человека// под ред. Е.Б.Бурлаковой. М.: ЦЭПР, 1996 С. 50-60.

35. Шевченко В.А. Радиационная генетика природных популяций // Генетические механизмы селекции и эволюции. М.: Наука, 1986. С. 131-141.

36. Шевченко В.А., Померанцева М.Д. Генетические последствия действия ионизирующих излучений. М.: Наука, 1985. 279 с.

37. Aaltonen L.A., Peltomaki P., Leach F.S. et al. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer// Science. 1993. V. 260. P. 812- 816.

38. Armour J.A.L., Alegre S.A., Miles S. et al. Minisatellites and mutation processes in tandemly repetive DNA // Microsatellites: Evolution and applications / Ed. D.R. Goldstein, C. Schlotter. N.Y.: Oxford Univ. press, 1999. P. 24-33.

39. Atak C., Alikamanoglu S., Acik L., Canbolat Y. Induced of plastid mutations in soybean plant (Glycine max L. Merrill) with gamma radiation and determination with RAPD. // Mutat Res. 2004 Nov 22;556(1-2):35-44.(найти, добавить в обсуждение.)

40. Atienzar F.A., Venier P., Jha A.N., Depledge M.N. Evaluation of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay for the detection of DNA damage and mutations // Mut. Res. Vol. 521, 2002, P. 151 -163.

41. Bapat B.V., Madlensky L., Temple L.K.F. et. al. Family history characteristics, tumor microsatellite instability and germline MSH2 and MLH1 mutations in hereditary colorectal cancer. // Hum. Genet. 1999. V. 104. P. 167 176.

42. Betnzen P., Wright J.M., Bryden L.T. et al. Tandem repeat polymorphism in mitochondrial control region of redfishes (Sebastes): Scorpaenidae // J. Heredity. 1998. Vol. 89. P. 1-7.

43. Billen D. Spontaneous DNA damage and its significance for the "negligible dose" controversy in radiation protection. Radiat. Res. 1990. V. 124. P. 242-245. .(найти, добавить в обсуждение.)

44. Biological dosimetry: chromosomal aberration analysis for dose assessment/ Technical reports series № 260. Vienna: Int. Atomic Energy Agency. 1986. 69 c. .(найти, добавить в обсуждение.)

45. Bowden R.D., Buckwalter M.R., McBride J.F., Johnson D.A., Murray B.K., O'Neill K.L. Tail profile: a more accurate system for analyzing DNA damage using the Comet assay.// Mutation Research, 2003, vol. 537, P. 1 9.

46. Brewen J.G., Preston R.J., Gengozian N. Analisys of X-ray induced chromosomal translocation in human and marmoset spermatogenial stem cells. -Nature, 1975. Vol. 253, N 5491. P. 468 470.

47. Brinkmann B., Klintschar M., Neuhunder F. Et al. Mutation rate in human microsatellites: influences of the tandem repeat // Am. J. Hum. Genet. 1998. V. 62. P. 1408- 1415.

48. Brinkmann B., Meyer E., Jungle A. Complex mutational events at the HumD21Sl 1 locus // Hum. Genet. 1996. V. 98. P. 60 64.

49. Brown W.M., George M., Wilson A.C. Rapid evolution of animal mitochondrial DMA //Proc. Nat. Sci. US. 1979. Vol. 76. P. 1967-1971.

50. Bruce W.R., Furrer R., Wyrobec A.J. Abnormalites in the shape of murine sperm after acute testicular X-irradiation. Mutat. Res., 1973. Vol. 23, N 3. P. 381 -386.

51. Cattanach B.M. Spermatogonial stem-cell killing in the mouse following single fractionated X-ray doses as assessed by length of sterile period. Mutat. Res., 1974. Vol.25. P. 53-62.

52. Cavali-Sforza L.L., Bordmer W.F. The genetics of human populations. San Francisco: Freeman, 1971. 962 p.

53. Chanq W.P., Little J.B. Delayed reproductive death in X-irradiated Chinese hamster ovary cells. Int. J. Radiat. Biol. 1991. V. 60. P. 483-496.

54. Churikov D., Matsuoka M., Luan X. et al. Assessment of concordance among genealogical reconstructions from various mtDNA segments in three species of Pacific salmon (genus Oncorhynchus) II Ibid. 2001. Vol. 10. P. 2329 2339.

55. Collins A.R, Ma A.G, Duthie S.J. The kinetics of repair of oxidative DNA damage (strand breaks and oxidised pyrimidines) in human cells. // Mutat Res. 1995 Jan; №336, vol. 1, p. 69-77.

56. Crompton N.E. Telomeres, senescens and cellular radiation response // Cell. Mol. Life Sci. 1997. V. 53. N7. P. 568-575.

57. Das С.С., Kaufmann В.Р. Histono-protein transition in Drosophila melanogaster. I. Changes during spermatogenesis. Exp. Cell Res., 1964. Vol. 35, N 3,P. 507-514.

58. Datta U., Datta P., Mandai R.K. Cloning and characterization of highly repetitive fish nucleotide sequence//Gene. 1998. Vol. 62. P. 331 -336.

59. Dietmaier W., Wallinger S., Bocker T. Diagnostic microsatellite instability: definition and correlation with mistmatch repair expression.// Cancer Res. 1997. V. 57. P. 4749-4756.

60. Djian P. Evolution of simple repeats in DNA and their relation to human disease. Cell. 1998. Jul 24 Vol. 94(2) P. 155-60.

61. Dubrova Y. E. Radiation-induced mutation at tandem repeat DNA Loci in the mouse germline: spectra and doubling doses //Radiat. Res. 2005 Feb; Vol. 163(2) P. 200-207. Найти и посмотреть!

62. Dubrova Y. Plumb M. Ionizing radiation and mutation induction at mouse minisatellite loci. The story of the two generations. // Mutation research 2002 № 499, P. 134-150

63. Dubrova Y.E., Plumb M., Brown J., Boulton E., Goodhead D., Jeffreys A. J. Induction of minisatellite mutations in the mouse germ line by low-dose chronic exposure to y-radiation and fission neutrons. Mutat. Res. 2000. V.453. P.17-24.

64. Dubrova Y.E., Plumb M., Brown J., Jeffreys A.J. Radiation-induced germline instability at minisatellite loci. Int. J. Radiat. Biol. 1998. V. 74. C. 689-696.

65. Dubrova Yu., Nesterov V., Krouchinsky N., Ostapenko V.A., Neumann R., Neil D.L., Jeffreys A.J. Human minisatellite mutation rate after the Chernobyl accident//Nature, vol. 380, April 1996.78. Dubrova 1997 НАЙТИ

66. Evans E.P., Brecon G., Ford C.C. An air drying method for meiotic preparations from mammalian tests. Cytogenetics, 1964, Vol. 2. P. 289 - 294.

67. Eyre-Walker A. Do mitochondria recombine in humans? // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2000. Nov. Vol 29; 355(1403) P. 1573-80.

68. Ferreis S.D., Sage R.D., Prager E.M. et al. Mitochondrial DNA evolution in mice // Genetics (US). 1983. Vol. 105. P. 681 721.

69. Ferris S.D., Berg W.I. The utility of mitochondrial DNA in fish genetics and management // Population genetics and fishery management / Ed. N. Ryman, F. Utter. Seattle; L.; Wash. Press. 1987. P. 277 301.

70. Ford MJ, Thornton PJ, Park LK. Natural selection promotes divergence of transferrin among salmonid species//Mol Ecol. 1999 Jun;8(6): 1055-61.

71. Genetic Instability and Tumorogenesis / Ed. M.B. Kastan. B.: 1997. 210 p.

72. Harms-Ringdahl M. Some aspects on radiation induced transmissible genomic instability//Mut. Res. 1998. V. 404. P.27-33.

73. Hedrick P.W. Perspective: Highly variable loci and their interpretation in evolution and conservation // Evolution. 1999. Vol. 53, N 2. P. 313 318

74. Heyer E., Puymirat J., Dieltiers P.et al. Estimating Y-chromosome specific microsatellite mutation frequencies using deep rooting pedigrees // Hum. Mol. Genet. 1997. V. 6. P.

75. Hill C.K., William-Hill D. Neutron carcinogenesis: past, present, and future // J. Radiat. Res., v. 40, 1999, p. 117-127.

76. Hodgins H. Serological and biochemical studies in racial identification of fishes // Stock concept in pacific salmon / Ed. R. Simon, P. Larkin. Vancouver: UBC press, 1972. P. 199-208.

77. Huang Q.Y., Xu F.H., Shen H., Deng H.Y., Liu Y.J., Liu Y.Z., Li J.L., Recker R.R., Deng H.W. Mutation patterns at dinucleotide microsatellite loci in humans.// Am. J. Hum. Genet 2002 Mar; № 70 vol. 3, p. 625-34. Epub. 2002 Jan.

78. Ingram V.M. Gene evolution and the haemoglobins // Nature. 1961. Vol. 189. P. 704-708

79. Ingram V.M. Haemoglobin and its abnormalities. Oxford: Pergamon press, 1960. 240 p.

80. Ingram V.M. The haemoglobins in genetics and evolution. N.Y.: Columbia Univ. press, 1963. 166 p.

81. Ionov Y., Peinado M.A., Malkhosyan S., Shibata D., Perucho M. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis //Nature. 1993 Jun 10; Vol. 363(6429) P. 558-61.

82. Jeffreys A.I., Wilson V., Thein S.L. Hypervariable "minisatellite" regions in human DNA //Ibid. 1985a. Vol. 316. P. 67-73.

83. Jeffreys A.I., Wilson V., Thein S.L. Individual "fingerprints" of human DNA //Ibid. 1985a. Vol. 316.P. 76-79.

84. Jeffreys A.J., Tamaki K., MacLeod A., Monckton D.G., Neill D.L. and Armour J. A. L. Complex gene conversion events in germline mutation at human minisatellites. // Nature Genetics, 1994 Feb, vol. 6, p. 136 145.

85. Kadhim M.A, Marsden S.J., Wright E.G. Radiation-induced chromosomal instability in human fibroblasts: temporal effects and the influence of radiation quality.//Int. J. Radiat. Biol. 1998. V. 73. P. 143-148.

86. Kaiser M., Roewer L., Hedman M. et al. Characteristic and frequency of germline mutations at microsatellite loci from the human Y-chromosome, as revealed by direct observation in father/son pairs. // Am. J. Hum Genet. 2000. V. 66. P. 1580 -1588.

87. Kan Y.W., Dozy K. Polymorphism of DNA sequence adjacent to the P-globin structural gene: Its relation to the sickle mutation // Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1078. Vol. 75. P. 5631 5635

88. Kaplan M.I., Morgan W.F. The nucleus is the target for radiation-induced chromosomal instability. Radiat. Res. 1998. V. 150. P. 382-390.

89. Karp A., Edwards K. DNA markers: global overview / DNA markers: Protoclos, application and overview / Ed. G. Caentano-Anolles, P.M. Gressnoff. N.Y.: Wiley, 1997. P. 1- 13.

90. Keshava N, Zhou G, Spruill M, Ensell M, Ong TM. Carcinogenic potential and genomic instability of beryllium sulphate in BALB/c-3T3 cells // Mol. And Cel. Biochem, vol. 222, 2001, p. 69-76.

91. Kriehuber R., Simko M., Schiffmann D., Trott K.R. Delayed cytotoxic and genotoxic effects in a human cell line following X-irradiation. Int. J. Radiat. Biol. 1999. V. 75. P. 1021-1027.

92. Krutovskii K.V., Vollmer S.S., Sorensen F.C. et al. RAPD genome map of Douglasfir // J. Hered. 1998. Vol. 89. N. 3 P. 197 205.

93. Lambert B., Holmberg K, Hackman P, Yennborg A. Radiation induced chromosomal instability in human T-lymphocytes. Mutat. Res. 1998. V. 405. P. 161-170.

94. Landi S., Frenzilli G., Milillo P.C., Cocchi L., Sbrana I., Scapoli C., Barale R. Spontaneous sister chromatid exchange and chromosome aberration frequency in humans: the familial effect. Mutat. Res. 1999. V.444. P.337-345.

95. Leonard A., Decat R. Relation between cell-cycle and yield of aberrations observed in irradiated human-lymphocytes. Can. J. Genet. 1979. V. 21(4). P.473-478.

96. Levinson G., Gutman G.A. Slipped-strand mispairing: A major mechanism for DNA sequence evolution // Mol. Biol. Evol. 1987. Vol. 4. P. 203 221.

97. Levinson G., Gutman G.A. Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution.// Mol. Biol. Evol., 1987, May; № 4 vol. 3, p. 203-21.

98. Limoli C.L., Kaplan M.I., Corcoran J., Meyers M., Boothman D.A., Morgan W.F. Chromosomal instability and its relationship to other end points of genomic instability// Cancer Res. 1997. V.57. N24. P.5557-5563.

99. Limoli C.L., Kaplan M.I., Phillips J.W., Adair G.M., Morgan W.F. Differential induction of chromosomal instability by DNA strand-breaking agents // Cancer Res. 1997. V.57. N18. P.4048-4056.

100. Little J.B. Radiation-induced genomic instability. Int. J. Radiat. Biol. 1998. V. 74. P. 663-671.

101. Loeb L.A. Microsatellite instability: marker of a mutator phenotype in cancer // Cancer Res. 1994 Oct 1; Vol. 54(19) P. 5059-63.

102. Lyon M.F., Phillips R.J., Glenister P.H. Mutagenic effects of repetated small radiated doses to mouse spermatogonia. II. Translocation yield at various dose intervals. Mutat. Res., 1973. Vol 15, N 1. P. 191 - 195.

103. Marder B.A., Morgan W.F. Delayed chromosomal instability induced by DNA damage. Mol. and Cell. Biol. 1993. V. 13. P. 6667-6677.

104. Martins M. B., Sabatier L., Ricoul M., Pinton A., Dutrillaux B. Specific chromosome instability induced by heavy ions: a step towards transformation of human fibroblasts // Mutat. Res. 1993. V 285. P. 229- 237.

105. Mei M., Qiu Y., Sun Y., Huang R., Yao J., Zhang Q., Hong M, Ye. J. Morphological and molecular changes of maize plants after seeds been flown on recoverable satellite. //Adv Space Res. 1998;22 (12):1691-7.

106. Mondello C., Riboni R., Casati A. et al. Chromosomal instability and telomere length variations during the life span of human fibroblast clones // Exp. Cell. Res. 1997. V. 236. N2. P. 385-396.

107. Monesi V. Synthetic activities during spermatogenesis in the mouse RNA and protein. -Exp. Cell Res., 1965. Vol. 39, N1. P. 197 224.

108. Moran P, Dightman DA, Park LK. Nonelectrophoretic genotyping using allele-specific PCR and a dsDNA-specific dye. // Biotechniques. 1998 Feb;24(2):206-208, 210,212.

109. Morgan W.F., Day J.P., Kaplan M.I., McGee E.M., Limoli C.L. Genomic instability induced by ionizing radiation. Radiat. Res. 1996. V. 146. P. 247-258.

110. Muller U.G., Wolfenbarger L.L. AFLP genotyping and fingerprinting // Trends Ecol. Evol. 1999. Volume 14. P. 380- 394

111. Mullis K., Faloona F., Scharf S. et al. specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1986. Vol. 51. P. 263-273

112. Murnane JP. Role of induced genetic instability in the mutagenic effects of chemicals and radiation // Mutat Res. 1996 Jan; 367(1):11-23.

113. Naish KA, Park LK. Linkage relationships for 35 new microsatellite loci in chinook salmon Oncorhynchus tshawytscha.Anim Genet. 2002 Aug;33(4):316-8.

114. Neel J.V. The inheritance of sickle cell anemia // Science. 1949. Vol. 110. P. 64-66.

115. Nikitin A.G., Shmookler Reis R.J. Role of transposable elements in age-related genomic instability // Genet. Res. 1997. V. 69. №3. P. 183-195.

116. Oakberg E. F. A new concept of spermatogonial stem-cell renewal in the mouse and its relationship to genetic effects.- Mutat. Res., 1971a. Vol. 11. N 1. P. 1 -7.

117. Oakberg E. F. Spermatogonial stem-cell renewal in the mouse.- Anat. Fee., 1971b. Vol. 169. N 3. P. 515 532.

118. Ono T., Okada S. Radiation-induced DNA single-strand scission and its rejoining in spermatogonia and spermatozoa of mouse. Mutat. Res., 1977. Vol. 43. N1, P. 25-36.

119. Ota H., Settheetham-Ishida W., Tiwawech D. et al. Human mtDNA and Y-chromosome variation is correlated with matrilocal versus patrlilocal residence// Nature. Genet. 2001. Vol. 29. P.20-21.

120. Paglia G., Morgante M. PCR-based multiplex DNA fingerprinting techniques for the analisys of conifer genomes//Mol. Breed. 1998. Vol. 4. P. 173-177

121. Palcic B., Sharsgard L.D. Absence of ultrafast processes of repair of singlestrand breaks in mammalian DNA. Int. J. Radiat. Biol. 1975. V. 27. P. 121-133.

122. Pallavicini M.G., Grewal L. Genomic instability in mice with varying genetic susceptibility to radiation-induced leukemia. Blood. 1997. V. 90. P. 1425-1426.

123. Pampfer S., Streffer G. Increased chromosome aberration levels in cells from mouse fetuses after zygote X-irradiation. Int. J. Radiat. Biol. 1989. V. 55. P. 85-92.

124. Paquette B., Little J. In vivo enhancement of genomic Instability in minisatellite sequences of mouse C3H/10T1/2 cells transformed in vitro by X-Rays // Cancer Res. 1994. V.54. P. 3173-3178.

125. Park LK, Brainard MA, Dightman DA, Winans GA. Low levels of intraspecific variation in the mitochondrial DNA of chum salmon (Oncorhynchus keta) //Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1993 Dec; 2 (6): 362-70.

126. Park LK, Moran P, Dightman DA. A chinook salmon PCR-RFLP marker in the p53 locus //Anim Genet. 1996 Apr; 27(2): 127-8.

127. Park LK, Moran P, Dightman DA. A polymorphism in intron D of the chinook salmon growth hormone 2 gene //Anim. Genet. 1995 Aug;26(4):285.

128. Park LK., Nephrol Guidelines on disposing of medical waste in the dialysis clinic //News Issues. 2002 Feb; 16(3): 16-7.

129. Park LK.Nephrol New inspection procedures for bloodborne pathogens take effect //News Issues. 2002 May;16(6):73-5, 79-81.

130. Pauling L., Itano H.H., Singer S.J., et al., Sickle cell anemia molecular disease // Science. 1949. Vol. 110. P. 543-548.

131. Piperakis S.M., Petrakou E., Tsilimigaki S., Sagnou M., Monogiudis E., Haniotakis G., Karkaseli H. and Sarikaki E. Biomonitoring with the comet assay of Greek greenhouse workers exposed to pesticides.// Environ. Mol. Mutagen. 2003, vol. 41, p. 104-110

132. Raymond S. Acrilamid gel electrophorezis // Ann. N.Y. Acad Sci. 1964. Vol. 121. P. 350-365.

133. Rejoining of X-rays induced breaks in humans progeroid cells. Nature, 1967. V. 214. N 5090, P. 790 - 792. Auth.: J.T. Left, I. Calowell, C.J. dean, P. Alexander.

134. Sabatier L., Dutrillaux B. Chromosomal instability. Nature. 1992. V.357. P.548.

135. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S. et al. Premier -directed enzymatic amplification of DNA with termostable DNA polymerase // Science. 1988. Vol. 239. P. 487-491.

136. Salomaa S., Holmberg K., Lindholm C., Mustonen R., Tekkel M., Veidebaum T., Lambert. B. Chromosomal instability in in vivo radiation exposed subjects. Int. J. Radiat. Biol. 1998. V. 74. P.771-779.

137. Sandhu S.S., Bastos C.R., Azini L.E., Tulmann Neto A., RAPD analysis of herbicide-resistant Brasilian rice lines produced via mutagenesis. //Colombo C.Genet Mol Res. 2002 Dec 31; 1 (4):359-70.

138. Santos F., Tyler-Smith C. Reading the human Y-chromosome: Emerging DNA markers and human genetic history // Brazil. J. Genet/ 1996. Vol. 18. P. 669 -672.

139. Schierwater B., Ender A., Schroth W., et al. Arbitrarilly ampliefied DNA in ecology and evolution // DNA markers: Protoclos, application and overview / Ed. G. Caentano-Anolles, P.M. Gressnoff. N.Y.: Wiley, 1997. P. 313 -330.

140. Sega G.A., Sotomayor R.E., Owens J. G. A study of unscheduled DNA synthesis induced by X-ray in the germ cells of male mice. Mutat. Res., 1978. Vol. 49, N2. P. 239-257.

141. Shapiro M.J. Radionuclide scanning and lung lesions. JAMA. 1980. Jule Vol. 4; N 244(1) P. 28.

142. Singer M., Berg P. Genes and genomes. Mill Valley (Calif.): Univ. sci. books, 1991. 929 p.

143. Singh N.P., McCoy M.T., Tice R.R., Schneider E.L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 1988 Mar; №175 vol. l,p. 184-91.

144. Smithies O. Zone electrophoresis in starch gels: Group variations in the serum proteins of normal human adult // Biochem. J. 1955. Vol. 61. P. 629 641.

145. Soares E.R., Sheridan W., Haseman J.K., Segall M. Increased frequencies of aberrant sperm as indicator of mutagenic damage in mice. Mutat. Res., 1979. Vol. 64,N l.P. 27-35.

146. Sotomayor R.E., Sega G.A., Cumming R.B. An autoradiographic study of unscheduled DNA synthesis in the germ cells of male mice treated by X-rays and methyl methannesulfonate. -Mutat. Res., 1979. Vol. 62. P. 293-309.

147. Spandidos D.A, Koumantakis E., Sifakis S., Sourvinos G. Microsatellites mutations in spontaneously aborted embryos. // Fertill. Steril. 1998. V. 5 P. 829 -895.

148. Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers // Nucl. Acids Res. 1989. Vol. 17. P. 6463 6471.

149. Thibodeau S.N., Bren G., Schaid D. Microsatellite instability in cancer of the proximal colon// Science. 1993. May 7 Vol. 260(5109) P. 816 9.

150. Transposable elements are stable strurtural components of Drosophila melanogaster heterochromatin / S. Pimpinelli, L. Berloco, L. Fanti et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1995. Vol. 92, № 9. P. 3804-3808.

151. Trott K.R., Teibe A. Lack of specificity of chromosome breaks resulting from radiation-induced genomic instability in Chinese hamster cells // Radiat. Environ. Biophys. 1998. V. 37. P. 173-176.

152. Trott K.R., Jamali M., Manti L., Teibe A. Manifestations and mechanisms of radiation-induced genomic instability in V-79 Chinese hamster cells // Int. J. Radiat. Biol. 1998. V. 74. P. 787-791.

153. Ullrich R.L., Davis C.M. Radiation-induced Cytogenetic instability in vivo // Radiat. Res. 1999. V. 152. P. 170-173.

154. Ullrich R.L., Ponnaiya B. Radiation-induced instability and its relation to radiation carcinogenesis. Int. J. Radiat. Biol. 1998. V. 74. P. 747-754.

155. Urquhart A., Kimpton C.P., Downes T.J., Gill P. Variation in short tandem repeat sequences — a survey of twelve microsatellite in loci for use as forensic indefication markers. // Int. J. Med. 1994. V. 107. P. 13- 20.

156. Utter F.M. Biochemical genetics and fishery management: An historical perspective // J. Fish. Biol. 1991. Vol. 39, suppl. A. P. 1-20.

157. Van Hooft W.F., Groen A. F., Prints H.H.T. Phylogeography of the African buffalo based on mitochohdrial and Y-chromosomal loci: Pleistocene origin and population expansion of the Cape buffalo subspecies // Mol. Ecol. 2002. Vol. 11. P. 267-279.

158. Vilarino-Guell C., Smith A., Dubrova Yu. Germline mutation induction at mouse repeat DNA loci by chemical mutagens"// Mut. Res., vol. 526, 2003, p. 63-73.

159. Voiculetz N., Shenghe M., Sandulescu T., Unscheduled DNA synthesis in human lymphocytes g-irradiated in vitro.- Stud. Biophys, 1975. Bd. 50, N 2. S. 97 -105.

160. Wallis G.P. Do animal mitochondrial genomes recombine? // Trends Ecol. Evol. 1999. Vol. 14. P. 209- 210.

161. Watson G.E., Lorimore S.A., Clutton S.M., Kadhim M.A., Wright E.G. Genetic factors influencing alpha-particle-induced chromosomal instability. Int. J. Radiat. Biol. 1997. V.71. P. 497-503.

162. Watson G.E., Lorimore S.A.,Wright E.G. Long-term in vivo transmission of alpha-particle-induced chromosomal instability in murine hemopoietic cells. Int. J. of Radiat. Biol. 1996. V. 69. P.175-181.

163. Weber J.L., Wong C. Mutation of human short tandem repeats // Hum. Mol. Genet. 1993. Vol. 2. P. 1123 1128

164. Weinberg H.-Sh., Nevo E., Korol A., Fahima T., Renert G., Shapiro S. Molecular changes in offspring of liquidators who emigrated to Israel from the Chernobyl disaster area. Environmental Health Perspectives. 1997. V. 105. P. 1479.

165. Welsh J., Petersen Ch. and McClelland M. Polymorphism generated by arbitrary primed PCR in the mouse: application to strain identification and genetic mapping.// Nucleic Acids Research, 1991, Vol. 19, № 2, p. 303 306.

166. Welsh S.J., Phillips C.N., Farhi D.C. Detection of BCRabl in acute leukemia by molecular and cytogenetic methods // Mol. Diagn. 1996 Dec; Vol. 1(4): 305 313.

167. Welsh, J. and McClelland. M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers//Nucl. Acids Res. 1990, 18, p. 7213-7218.

168. Williams J.G.K., Hanafey M.K., Rafalsky J.A., Tingey S.V. Genetic analisys using random amplified polymorphic DNA markers // Recombinant DNA. San Diego: Acad. Press, Meth. Enzymol.; Vol. 218, 1993. P.704 740.

169. Williams, J. G. K., A. R. Kubelik, K. J. Livak, J. A. Rafalski, and S. V. Tingey. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. // Nucl. Acids Res. 1990 18:6531.

170. Wojewodzka M., Buraczewska I., Kruszewski M. A modified neutral comet assay: elimination of lysis at high temperature and validation of the assay with anti-single-stranded DNA antibody.//Mutation Research, 2002, vol. 358, P. 9-20.

171. Wright E.G. Inherited and inducible chromosomal instability-a fragile bridge between genome integrity mechanisms and tumorigenesis. J. of Pathol. 1999. V. 187. P. 19-27.

172. Wright E.G. Radiation-induced genomic instability in hemopoietic cells. Int. J. Radiat. Biol. 1998. V. 74. P.681-687.

173. Wright J. M. Mutation at VNTRs: Are minisatellites the evolutionary progeny of microsatellites? // Genome. 1994. Vol. 37. P. 345 347.