Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ нового гена млекопитающих tagL, имеющего структурную гомологию с геном tag7 и фаговыми лизоцимами

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кибардин, Алексей Владимирович

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Врожденный иммунитет.

Проблемы распознавания внедрившихся микроорганизмов.

Группы патгерн-распознающих клеточных рецепторов.

Примеры паттерн-распознающих рецепторов и их функции.

Семейство Са2+-зависимых лектинов.

Маннозо-связывающий белок (МБР).

Рецептор маннозы макрофагов (MMR).

Рецептор CD69.

Семейство рецепторов натуральных киллеров Ly-49.

Инте грины.

Рецептор комплемента 3 (CR3).

Лейцин-богатые белки.

Семейство Toll/IL-IR.

Распознавание бактерий врожденной иммунной системой.

Грамм-отрицательные бактерии.

Роль LBP и CD 14.

Роль TLR4.

Грамм-положительные бактерии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ нового гена млекопитающих tagL, имеющего структурную гомологию с геном tag7 и фаговыми лизоцимами"

Иммунитет — это способ защиты организма от всех антигенно чужеродных веществ как экзогенной, так и эндогенной природы. Подобная защита обеспечивает генетическую стабильность особей в течении их жизни. Иммунитет любого позвоночного организма складывается из взаимодействия двух различных систем: врожденного и приобретенного иммунитета. Врожденный иммунитет включает в себя систему предсуществующих, наследственно обусловленных защитных факторов организма, которые обеспечивают предотвращение и ограничение распространения патогенного микроорганизма. Долгое время врожденный иммунитет считался вторичным по важности в иерархии иммунного ответа и рассматривался как часть приобретенного. Но в последние несколько лет интерес к врожденному иммунитету возрос, так как было показано, что его механизмы способны инициировать и модулировать специфический иммунный ответ.

Обзор литературы.

Врожденный иммунитет.

Врожденный иммунитет является родоначальником приобретенного так как, во-первых, врожденная защита найдена у всех многоклеточных организмов, а приобретенная только у позвоночных. Во-вторых, система врожденного иммунитета, в отличие от приобретенного, всегда безошибочно отличает своё от чужого. В-третьих, клетки врожденного иммунитета используют эволюционно древние рецепторы, тогда как система приобретенного иммунитета использует специфические антитела и Т-клеточные рецепторы (ТСЫб), получаемые путем перестановки генов семейства иммуноглобулинов. У позвоночных врожденный иммунитет включает в себя комплекс отдельных, но взаимодействующих систем: кининовая система свертывания крови, комплемент, фагоцитирующие клетки (макрофаги, нейтрофилы) и натуральные киллеры (НК) [1-5].

Проблемы распознавания внедрившихся микроорганизмов.

Все многоклеточные организмы способны узнавать и уничтожать внедрившийся патогенный микроорганизм, при этом не нанося вреда собственному организму. Проблемы с распознаванием микроорганизмов возникают в связи с их огромной вариабельностью, молекулярной гетерогенностью и высокой скоростью мутаций. Возможная мишень для системы врожденного иммунитета должна отвечать нескольким требованиям:

1. Молекулярная структура узнаваемая врожденной иммунной системой должна принадлежать определенной группе патогенных микроорганизмов и служить молекулой-маркером для данной группы.

2. Узнаваемая молекула должна быть необходимой для выживания и патогенности микроорганизма, являться консервативным продуктом метаболизма.

3. Данная структура должна совершенно отличаться от хозяйских антигенов, распознаваться как чужая.

Инвариантная молекулярная структура, служащая мишенью для системы врожденного иммунитета обозначается как ПАМП (патогенассоциированный молекулярный паттерн). Все ПАМП необходимы для жизни патогенного микроорганизма и отсутствуют у хозяина. Примерами ПАМП являются липополисахариды (ЛПС) и тейхоевые кислоты бактерий, неметелированный мотив CpG у прокариот, вирусная dsRNA, маннаны клеточной стенки дрожжей, мембраны микобактерий, порин Neisseria, гликаны и т.п. [1-5]. Микроорганизмы используют различные механизмы, позволяющие избежать уничтожения иммунной системой: блокирование путей активации фактора транскрипции NF-kB, предотвращение синтеза оксида азота, а также изменение в структурах бактериальной поверхности [6]. Поэтому эффективность элиминации микроорганизма напрямую зависит от эффективности его распознавания специфическими рецепторами.

Группы паттерн-распознающих клеточных рецепторов.

У хозяйского организма существует набор рецепторов широкой специфичности, узнающие ПАМП. Они связывают набор различных лигандов с общими молекулярными мотивами [1-3]. Данные рецепторы (ПРР - паттерн-распознающие клеточные рецепторы) не подвергаются клональной селекции,' обычно постоянно экспрессированны на поверхности клетки (то есть не индуцибельны), первыми встречают внедрившийся патогенный микроорганизм. ПРР расположены на мембранах клеток эпителия, антиген-презентирующих клеток, макрофагах, НК и на других клетках иммунной системы. В отличие от клональных рецепторов, кодируемых исключительно иммуноглобулинами, ПРР принадлежат к различным семействам белков, причем не для всех известных в настоящий момент рецепторов установлены функции и соответствующие лиганды. Среди них можно выделить несколько групп [3], в том числе :

1. Лектины С-типа, включая коллектины и рецепторы экспрессируемые НК (Ly49A-G, NKR-P1), макрофагами и дендритными клетками (макрофагальный С-лектин, макрофагальный маннозный рецептор DEC 205). Колектины - внеклеточные белки из 9-18 полипептидных цепей, имеют в своем составе домен коллагена на N-конце и лектиновый домен на С-конце. К членам этого семейства относятся конглютинин, манноза-связывающий белок (MBP), CL-43 и сурфактанты легких - белки SP-A и SP-D. Рецепторы данной группы связывают широкий спектр бактериальных и вирусных полисахаридов и опосредуют фагоцитоз, опсонизпацию, активацию комплемента (лектиновый путь), цитолитические функции, в том числе противоопухолевую активность макрофагов, а также секрецию IFN-y. Каждый из этих белков содержит один или более углевод-связывающих доменов (CDRs). Несмотря на различную зависимость от ионов Са2+, все CDR-домены лектинов С-типа имеют одинаковое строение: 120 аминокислот, 14 из них инвариантны, другие 18 консервативны.

2. Пентраксины. Являясь компонентами острой фазы иммунного ответа, они продуцируются в печени и высвобождаются в плазму крови. Лигандами пентраксинов являются фосфатидилхолин и компоненты бактериальной клеточной стенки, взаимодействие которых с рецептором индуцирует опсонизацию и активацию комплемента.

3. Интегрины. Эти рецепторы экспрессируются макрофагами, дендритными клетками, НК и Т клетками, их лигандом является ЛПС. Показано участие интегринов в фагоцитозе и межклеточных взаимодействиях, в частности адгезии.

4. Липидные трансферазы. Как и пентраксины, они синтезируются в печени, попадая в плазму крови во время острой фазы иммунного ответа. Взаимодействуя с ЛПС, они опосредуют антибактериальный ответ

5. Лейцин-богатые белки. К этой группе относятся множество ПРР, среди которых можно выделить семейство рецепторов То11/1 Ь-1.

Примеры паттерн-распознающих рецепторов и их функции. Семейство Са2+-зависимых лектинов.

Маннозо-связывающий белок (МБР).

Маннозо-связывающий белок (МВР) - лектин С-типа, компонент сыворотки крови. Человеческий МВР синтезируется в печени в острофазной реакции, транспортируется в место инфекции, где участвует в неспецифической защите организма. МВР узнает углеводные участки на поверхности микроорганизмов (бактерий, дрожжей, микобактерий, некоторых вирусов), вызывает их опсонизацию или лизис с помощью системы комплемента [7-9]. В активации каскада комплемента участвует коллагеновый домен МВР. МВР связывает О-маннозу, Ы-ацетил-Б-глюкозоамин (С1сЫАс), Э-глюкозу, Ь-фукозу, то есть сахара, распостраненные в мире микроорганизмов, МВР не связывает свои гликопротеины - терминальную сиаловую кислоту, D-галактозу и ее производные. Молекулярные структуры узнаются тримерными и олигомерными формами МВР, когда вместе обьединяются два тримера. Расстояние между CRDs одного тримера составляет 45А [10]. Таким образом МВР связывается с макропаттерном, осуществляется многоточечное взаимодействие с высокоповторяющимися последовательностями ПАМП. Структура гликопротеинов высших животных не содержит повторов, следовательно, невозможно высокоафинное связывание с МВР.

Рецептор маннозы макрофагов (MMR)

Рецепторы маннозы формируют целое семейство белков, активизация которых приводит к продукции цитокинов и, таким образом, к усилению ответа со стороны врожденного и приобретенного иммунитета. Рецептор маннозы макрофагов (MMR) это интегральный мембранный гликопротеин типа I, 175 kD, основная роль MMR состоит в узнавании и связывании углеводных мотивов клеточных стенок инфекционных агентов, то есть MMR функционирует как ПРР [11]. MMR синтезируется в виде неактивного предшественника, который превращается в активный белок в процессе транспортировки через комплекс Гольджи. MMR представлен на поверхности многих оседлых, не мигрирующих, тканевых макрофагов, а также на незрелых дендритных клетках. Рецептор узнает маннозу и фруктозу, в меньшей степени глюкозу и N-ацетилглюкозоамин [11]. MMR — один из членов семейства лектинов С-типа. Предполагается, что различные молекулярные паттерны узнаются разными доменами: сульфатированные гликопротеины, такие как гормоны лютропин и тиреостимулирующий гормон, неогликопротеин способен связывать цистеин-богатый, а не CRD домен, таким образом регулируется биодоступность гормонов [12]. N-концевой цистеин-богатый домен также связывается с клетками маргинальных зон вторичных лимфоидных органов. Экспериментально показано, что растворимая, секретируемая форма MMR вовлечена в транспорт гликопротеиновых антигенов в районы скопления В-клеток, транспортировать антиген могут и сами MMR+ клетки [13]. Таким образом, рецепторы макрофагов осуществляют связь между врожденным и приобретенным иммунитетом. MMR связывает широкий спектр патогенных микроорганизмов: грамм-положительные и грамм-отрицательные бактерии, дрожжи, микобактерии [14]. Мультивалентное связывание MMR с субстратом обеспечивается одной полипептидной цепью с несколькими лектиновыми доменами, но только CRD4 и CRD5 содержат аминокислотные остатки, необходимые для связывания Сахаров. Активированный MMR также стимулирует кислородный взрыв, приводящий к умерщвлению клетки, но возможно этот путь связан с другими рецепторами макрофагов (CR3, рецептор ß-глюкана), которые способны узнавать лиганды MMR. MMR экспрессируется не только на поверхностях макрофагов и незрелых дендритных клетках, а также на субпопуляциях эндотелиальных клеток, в плаценте, печени, на клетках выстилки трахеи, пигментных клетках эпителия сетчатки, на клетках саркомы Капоши [15]. Экспрессия MMR модулируется рецепторами иммуноглобулинов, патогенными микроорганизмами и продуктами их жизнедеятельности, усиливается при воздействии простагландина Е, IL-13, IL-4 (продуцируется Th2-клетками). Экспрессия MMR коррелирует с функциональным состоянием макрофагов [16]. MMR является передатчиком сигналов — связавшись с лигандом, MMR передает сигнал в клетку, запускает продукцию различных секреторных медиаторов, в том числе TNF-a, стимулирует синтез лизосомальных ферментов, цитокинов (IL-lß, IL-6, IL-12, GM-CSF) [17,18], модулирует продукцию остальных рецепторов макрофагов (рецептора Fcy) и стимулирует фагоцитоз опсонизированных структур через рецептор Fcy [19]. Таким образом, MMRs, как паттерн-узнающий рецептор, вовлечен в передачу сигнала между врожденным и приобретенным иммунитетом и его роль не ограничивается пассивным фагоцитозом. MMR является ключевой молекулой в узнавании антигенов и принимает участие в их процессинге [20].

1. Эндоцитоз. Поверхностный MMR связавшийся с лигандом попадает в везикулы, выстланные клатрином, которые сливаются с эндосомами. Для фагоцитоза и эндоцитоза необходимы как трансмембранный, так и цитоплазматический участки MMR. После закисления содержимого эндосомы, лиганд освобождается от рецептора и MMR возвращается к клеточной мембране. Таким образом, только 10-20% всех молекул MMR макрофага в данный момент находятся на поверхности клетки. В заключении, эндосома с пойманным микробом сливается с лизосомой, где микроорганизм деградирует с помощью комбинации низкого pH и гидролитических ферментов. В незрелых дендритных клетках MMR необходим для последующего презентирования антигена в комплексе с МНС II. На поверхности зрелых дендритных клеток MMR экспрессирован, но его фагоцитирующая способность сильно редуцирована.

2. Антиген, связанный с CRD может непосредственно презентироваться эффекторным клеткам, если на эффекторных клетках существуют рецепторы для цистеин-богатого домена MMR.

3. MMR участвует в процессинге гликолипидов (липоарабиноманнанов) микобактерий в комплексе с CDlb. MMR поглощает и доставляет липоарабиноманнан микобактерий к CDlb для презентации Т-клеткам.

Рецептор CD69.

CD69 - регуляторная молекула, экспрессия которой индуцируется на ранних стадиях иммунного ответа. CD69 принадлежит к комплексу генов НК клеток и является рецептором, передатчиком внутриклеточных сигналов. CD69 — трансмембранный гликопротеин типа II, содержит лектиновый домен С-типа во внеклеточной части. CD69 экспрессируется как связанный дисульфидными мостиками гомо-или гетеродимер. 40 аминокислотных остатков CD69 являются внутриклеточными, 21 остаток формируют трансмембранный домен, 138 - внеклеточный домен. Идентичность последовательности аминокислот в лектиновом домене между МБР и CD69 не высока, около 20 %, у

СБ69 отсутствуют некоторые консервативные остатки. Экспрессия С069 показана на поверхностях многих клеток гематопоэтического происхождения, в том числе на Т- и В-лимфоцитах, НК клетках, макрофагах, нейтрофилах, эозинофилах. СОб9 постоянно экспрессирован на моноцитах, тромбоцитах, эпидермальных клетках Лангерганса [21]. Экспрессия СЭ69 индуцируется различными стимулами: обработкой фитогемагглютинином, 1Ь-2, 1Ь-12, ^N00. Известно, что СЭ69 является костимулирующим активирующим рецептором для пролиферации лимфоидных клеток и секреции лимфокинов, усиливает цитотоксическую активность НК; активирует синтез адгезионных молекул (1САМ-1), продукцию ТЫБ-а [22], лизоцима и мобилизацию внутриклеточного Са2+ в нейтрофилах; стимулирует синтез тромбоксана В2, простагландина Е2 в тромбоцитах, активизирует их агрегацию. Специфические лиганды СБ69 и его точная физиологическая роль до сих пор не выяснены. Активация СБ69 вызывает увеличение уровня транскрипции 1Ь-2. На поверхности

СБ69 найдены возможные участки связывания Са2+ и несколько гидрофобных полостей, окруженных заряженными аминокислотами. Некоторые гидрофобные зоны соответствуют аналогичным у МВР, некоторые уникальны для СБ69 и, возможно, служат для связывания специфических лигандов [23]. По видимому, С069 вовлечен в патогенез таких заболеваний, как ревматоидный артрит, хроническое воспаление печени, астма, иммунодефицитные состояния, системная красная волчанка. У больных системной красной волчанкой показано увеличение экспрессии CD-69 на клетках периферической лимфоидной ткани, что может приводить к нарушению их активации или регуляции [24,25].

Семейство рецепторов натуральных киллеров Ly-49.

Мультигенное семейство Ly-49 насчитывает 8 генов (Ly-49 А-Н), идентичность их аминокислотных последовательностей 49-91%. Они относятся с семейству белков, содержащих лектиновый домен С-типа, такие же домены участвуют в связывании углеводов у МВР, лектинов печени, селектинов [26]. Все эти гены кодируют трансмембранные белки типа II, дистальный внеклеточный регион которых гомологичен углевод-узнающему домену (CRD) лектинов С-типа. Между членами мультигенных семейств идентичность аминокислотных остатков 25%, гомология ограничена лектиновым доменом. По крайней мере два белка семейства Ly-49: Ly-49A и Ly-49C, экспрессируются на различных субпопуляциях NK и связывают комплекс МНС I с антигеном на различных клетках-мишенях. Ly-49A связывает иммобилизованный Н-2Dd и H-2Dk, узнавание антигенов, связанных с этими сигналами приводит к лизису клетки-мишини. В отличие от Ly-49A, Ly-49C связывается с клетками-мишенями разных гаплотипов (H-2b/d/R/e). Ly-49С также связывает и углеводные участки [27,28]. Ly-49C избирательно связывает отрицательно заряженные сульфо-гликан фукоидан (терминальный сахар - фруктоза), л-каррагинан (терминальная галактоза), декстран-сульфат (заканчивается глюкозой), другие полисахариды сходного размера и заряда с Ly-49C не взаимодействуют. Связывание Ly-49C с углеводами не зависит от наличия в их составе терминальной сиаловой кислоты, обычного компонента полисахаридов млекопитающих [27]. Терминальные фруктоза, галактоза, глюкоза не встречаются среди углеводов млекопитающих. Предположительно, лектиновые рецепторы НК узнают углеводные структуры на поверхности клеток-мишеней и вызывают их лизис. Ly-49 также может связываться с остатками Сахаров, расположенных в консервативном участке N-гликозилирования молекулы МНС I (Asn-86), между а! и а2 доменами. Углевод-узнающие домены описаны также у NKR-P1 и Ly-49A, но их поведение отличается от других лектинов С-типа: у всех прочих лектинов связывание CRD с полисахаридами зависит от экзогенного Са2+, для Ly-49A, Ly-49C такой зависимости не наблюдается. Лектиновые рецепторы НК - это лишь одна подгруппа суперсемейства лектинов С-типа, возможно существуют варианты этих лектинов с высокой и низкой аффинностью к Са2+.

Интегрины.

Рецептор комплемента 3 (CR3).

CR3 относится к интегринам, семейству поверхностных клеточных белков. Как и другие члены этого семейства, CR3 состоит из нековалентно связанных аир субъединиц: а-субъединица, CDllb, 126 kD, гликопротеин типа I; ß-субъединица, CD 18, 95 kD, гликопротеин типа I [28]. CR3 экспрессируется на поверхности макрофагов, но, в отличие от MMR, также присутствует на мембранах нейтрофилов и натуральных киллеров. CR3 опосредует распространение лейкоцитов, хемотаксис, адгезию с эндотелием, миграцию через эндотелий и производство свободных радикалов кислорода [29]. Необычно то, что CR3 играет важную роль как во врожденном, так и в приобретенном иммунитете: он связывает и фагоцитирует микроорганизмы опсонизированные белком комплемента iC3b. Поглощение микроорганизма- это регулируемый процесс, зависящий от стимуляции клетки. iCD3b может образовываться через систему приобретенного иммунитета (классический путь комплемента), как результат связывания Clq с микроорганизмом, декорированным антителами, или через альтернативный (врожденный) путь, как результат взаимодействия бактериальной клетки с белками комплемента. CR3 также связывает некоторые продукты патогенных микроорганизмов (ЛПС, ß-глюкан) не используя iC3b; CR3 взаимодействует и с разнообразными собственными белками клеточной поверхности, например с адгезиоными молекулами ICAM-1. Эти взаимодействия с собственными лигандами могут регулировать миграцию моноцитов и нейтрофилов. Как MMR, CR3 способен инициировать фагоцитоз связанных микроорганизмов. Присутствие липоарабиноманнана посттрансляционно супрессирует способность CR3 связывать и опсонизированные структуры. Связывание лиганда с CR3 вызывает также внутриклеточный сигнальный каскад, приводящий к перестройке цитоскелета и активации NADFH-оксидазы [30]. В результате образуются реакционно-способные формы кислорода. Данный каскад не зависит от формирования фагосом и ингибируется цитохолазином В.

Лейцин-богатые белки.

Семейство Toll/IL-IR.

Интенсивное изучение механизмов природного иммунитета первоначально было связано с использованием в качестве удобной для анализа модели организмов, характеризующихся отсутствием приобретенного иммунитета. Такой моделью стали насекомые, в частности, дрозофила. Было установлено, что индукция иммунного ответа против инфекций у дрозофилы осуществляется с помощью белка Spazle при его взаимодействии с идентифицированным трансмембранным рецепторным белком, обозначенным как Toll (dToll). Взаимодействие Toll с лигандом Spazle активирует два внутриклеточных белка-ТиЬе и Pelle [2,31]. Точная функция Tube не установлена, однако он рассматривается как адаптер, опосредующий активацию серин-треониновой киназы Pelle посредством транс локации Pelle к внутренней поверхности мембраны. С помощью промежуточной киназы активный Pelle индуцирует фосфорилирование гомолога IkB - Cactus, являющегося ингибитором цитоплазматического комплекса Cactus-Dorsal. Индуцированная фосфорилированием деградация Cactus вызывает высвобождение Dorsal и его транслокацию в ядро, где он активирует транскрипцию генов противомикробных пептидов [2,31].

Сравнительный анализ путей передачи сигналов, инициируемых патогенными микроорганизмами у дрозофилы, млекопитающих и растений показал, что То11-опосредуемый сигнал обладает эволюционной консервативностью. В частности, была установлена аналогия Toll/

Dorsal- передачи сигнала с сигналом, опосредуемым IL-1R в клетках млекопитающих [32].

1L-1 является цитокином, продуцируемым различными типами клеток при повреждении тканей и инфекции и опосредующим воспалительный процесс. Три лиганда- IL-la, IL-1 р и антагонист рецептора IL-l(IL-lra) -связываются с тремя формами рецептора IL-1: IL-IR типа I (IL-1RI, 80 кДа), IL-1R типа II (IL-IRII, 68 кДа) и секретируемой формой IL-1R типа II (sIL-lRII). Цитоплазматическая область IL-1RI состоит из 213 аминокислот и именно она ответственна за проведение сигнала, в то время как цитоплазматическая область IL-1RII содержит лишь 29 аминокислот и не способна трансдуцировать сигнал. Было обнаружено, что цитоплазматическая область IL-1 RI человека и аналогичная область рецептора Toll дрозофилы обладают значительной степенью гомологии [31]. Сайт-направленный мутагенез и делеционный анализ позволили обозначить внутри цитоплазматической области район, опосредующий передачу сигнала и являющийся общим для Toll и IL-1R. В действительности, было установлено, что стимуляция клеток, экспрессирующих IL-1R интерлейкином a или р индуцирует активацию Pelle- подобной киназы IRAK с последующей деградацией комплекса NFkB- IkB, гомологичного Dorsal- Cactus и активацией NFkB [33].

В то же время необходимо отметить, что в отличие от лейцин-богатой (LRR) внешней, N- концевой, последовательности Toll рецептора внешняя область IL-1R представляет собой три иммуноглобулиновых домена [32,33].

Было идентифицировано несколько генов дрозофилы, имеющих гомологию с цитоплазматической областью Toll и IL-1R: wheeler, tir (Toll-like receptor) и MstProx [30-34]. Помимо известной роли wheeler и tir в эмбриогенезе предполагают, что эти гены вовлечены в межклеточные взаимодействия, в частности, они могут быть молекулами адгезии . Однако эти функции находятся в стадии изучения.

Подобно dToll человеческий Toll (hToll) является трансмембранным белком типа I с лейцин-богатой (LRR) N-концевой областью, гомологичной dToll и цитоплазматической областью, гомологичной Toll/ IL-IR [35].

Анализ профиля экспрессии hToll в различных органах и тканях установил преимущественную экспрессию мРНК hToll в лейкоцитах периферической крови- моноцитах, макрофагах, дендритных клетках, Т-ютетках и клетках селезенки. Обнаруженная незначительная экспрессия в других тканях, как предполагается, связана с присутствием в них макрофагов и дендритных клеток [35]. За последнее время путем компьютерного поиска был найден ряд генов млекопитающих, гомологичных Toll и IL-1R и составляющих растущее семейство Toll/ IR-lR-подобных генов: человеческие TIL, TLR (Toll-like receptor)l-5, человеческий и мышиный MyD88, мышиный T1/ST2 [36-41].

TIL и TLR характеризуются дифференциальной экспрессией. Транскрипт TLR1 был найден в яичниках и селезенке, а также в лимфоме Буркитта. мРНК TLR2 и TLR3 была детектирована в легких, сердце, мозге и мышцах, TLR3 также присутствует в плаценте и поджелудочной железе. Транскрипты TLR4 и TLR5 исключительно тканеспецифичны: TLR4 обнаруживается только в плаценте, а слабый сигнал TLR5 - в яичниках и лейкоцитах периферической крови [37,39].

T1/ST2 охарактеризован как ген первичного иммунного ответа, экспрессирующийся в мышиной клеточной линии BALB/c-ЗТЗ и проявляющий наибольшую структурную и функциональную гомологию с IL-1R [36].

Маркер миелоидной дифференцировки MyD88 был впервые охарактеризован как ген первичного ответа, активируемый в мышиной миелоидной линии Ml под действием IL-6, индуцирующего остановку роста и дифференцировку Ml в зрелые макрофаги [40]. Позднее был охарактеризован человеческий гомолог MyD88 [41]. Транскрипт MyD88 широко представлен в различных тканях и органах взрослого организма мыши и человека- селезенке, легких, печени, периферических лейкоцитах, в немного меньшем количестве- в сердце, мозге, скелетных мышцах, почках. Полипептидная цепь MyD88 состоит из 2 частей. С-концевой домен гомологичен цитоплазматической области представителей семейства Toll/ IL-1R. N-концевой домен проявляет структурную гомологию с областями рецептора TNF-a (TNFR1) и FAS антигена, известными как "death domain" (DD), опосредующими передачу сигнала при программированной гибели клеток. В отличие от Toll и IL-1R, MyD88, очевидно, не является интегральным белком, так как было установлено отсутствие у него внеклеточного домена и последовательности, характерной для трансмембранного сегмента.

Показано, что все идентифицированные представители семейства Toll/ IL-1R млекопитающих способны активировать NF-kB [1-3,31-41].

Таким образом, в настоящее время установлено существование ПРР, среди которых выделяется интенсивно исследуемое семейство Toll/ 1L-1R. Механизм передачи сигнала обладает эволюционной консервативностью и состоит в активации NF-kB и индукции экспрессии генов иммунного ответа.

Распознавание бактерий врожденной иммунной системой.

Грамм-отрицательные бактерии.

Грамм-отрицательные бактерии представляют собой большую группу патогенов, вызывающих различные заболевания у людей. В случае грамм-отрицательных бактерий основным компонентом, узнаваемым врожденной иммунной системой является гликолипид известный как эндотоксин или липополисахарид (ЛПС). Хотя химическая структура ЛПС была полностью описана довольно давно [42], молекулярная основа распознавания ЛПС была освещена совсем недавно. Открытие ЛПС-связывающего белка (LBP) [43] и описание его структуры и функций [44,45], с последующей идентификацией CD14 в качестве рецептора ЛПС [46] обеспечило основу для современного детального понимания этого пути врожденного иммунитета. Около 10 лет назад было установлено, что ЛПС активирует клеточные линии миелоидного происхождения посредством механизма, включающего в себя сывороточный белок LBP и белок клеточной поверхности CD 14 [45,46]. ЛПС связывается с этими белками с константой диссоциации порядка

Ю-9. LBP является членом группы гомологичных липид-связывающих белков, которые в некоторых известных случаях служат переносчиками липоидов [47-49]. В клеточных линиях миелоидного происхождения CD 14 заякорен на внешней мембране клетки через гликозилфосфатидил-инозитол. Так как CD 14 непосредственно не сообщается с внутриклеточным пространством клетки, то предполагается, что ЛПС рецептор клеточных линий миелоидного происхождения состоит из нескольких субъедениц, в котором CD14 служит лиганд-связывающим белком. Была выдвинута гипотеза, что это рецептор содержит по меньшей мере один дополнительный компонент, являющийся трансмембранным и связывающий ЛПС или комплекс С014-ЛПС, и уже после связывания инициирующий передачу сигнала [50]. Эта гипотеза поддерживается данными, что члены семейства TLR вовлечены в CD 14 зависимый ответ на ЛПС [35,39,51]. Существует дополнительный путь активации клеток не миелоидного происхождения, который зависит от LBP и растворимого CD14 [52,53]. Предполагается, что в нем также участвует трансмембранный белок, распознающий ЛПС, однако неизвестно, относится ли он к TLR семейству.

Роль LBP и CD14.

Взаимодействие с ЛПС показано для большого количества белков плазмы, но только один известный белок- LBP связывается с ЛПС через липид-А и влияет на последующие взаимодействие ЛПС с CD14. Видимо, LBP обладает незаменимыми функциями, включающими в себя инициацию быстрой воспалительной реакции в ответ на незначительное количество ЛПС. Это подтверждается данными, полученными в результате направленной делеции ЬВР [54,55]. Во-первых, никакой другой белок сыворотки не способен заменить ЬВР в качестве опсонина для ЛПС, транспортирующего ЛПС к СБ 14. Во-вторых, эта транспортировка необходима для индукции клеточного ответа, так как экспрессия ТИБ, вызванная внутреперитониальной инъекцией ЛПС значительно меньше у мышей с фенотипом ЬВР-/- чем у мышей с фенотипом ЬВР+/~ В-третьих, мыши ЬВР-/- практически полностью устойчивы к ЛПС-индуцируемой смерти. Направленная делеция СБ 14 привела к возникновению похожего фенотипа, выраженного в устойчивости к летальному действию ЛПС [56]. Мыши ЬВР-/- проявили значительное уменьшение в способности очищаться от бактерий. После инъекции БаШопеИ ттпезо!а , в селезенке и печени ЬВР-дефицитных мышей наблюдалось значительно большее количество микроорганизмов, чем у нормальных мышей [55]. Существенность роли ЬВР и СБ14 для фагоцитоза бактерий была также показана в экспериментах с различными клеточными линиями [57,58].

Роль ТЫ4.

Около 30 лет назад произошло понимание того, что чувствительность к ЛПС у позвоночных зависит от продукции единственного гена [59,60]. Мутантная аллель этого гена, названная приводит к полной нечувствительности к ЛПС, но не оказывает побочного действия на развитие иммунной системы и иммунного ответа [61]. Мутанты Ьр.ч нормально отвечают на другие микробные продукты и на цитокины, индуцируемые ЛПС. В тоже время, мутанты проявляют повышенную чувствительность к определенным видам грамм-отрицательных бактерий [62,63] и нормальную чувствительность к грамм-положительным организмам. В результате позиционного клонирования было показано, что Ьря кодируется геном ТЬК4, который является трансмембранным компонентом ЛПС рецепторного комплекса [51,64-66]. Было также обнаружено, что мышиная линия, не реагирующая на ЛПС С57В1/105сСг не экспрессирует ТЬЯ4 мРНК [51,65,66]. Из полученных данных следует, что ТЬЫ4 опосредует ответ на ЛПС макрофагов [51,64-67].

Грамм-положительные бактерии.

Количество инфекционных заболеваний и септических шоков, вызываемых грамм-положительными бактериями значительно увеличилось в последние годы, так что в настоящий момент грамм-положительные микроорганизмы ответственны за 40-50% всех наблюдаемых случаев септического шока [68-70]. Стафилококковый и стрептококковый токсический шоковый синдром (ТШС) является примером скоротечного, и часто смертельного септического шока, вызываемого грамм-положительными бактериями. В отличие от септического шока, вызываемого грамм-отрицательными бактериями, очень мало известно о патофизиологии грамм-положительных инфекций, приводящих к септическому шоку. В случае токсического шокового синдрома эндотоксины стафилококков и стрептококков вызывают массовую активацию макрофагов и Т лимфоцитов, что в свою очередь, приводит к экспрессии большого количества различных цитокинов [7176]. Эти эндотоксины способны приводить к токсическому шоковому синдрому в отсутствие самих микроорганизмов [77]. Однако, септический шок также вызывается грамм-положительным и микроорганизмами, которые не продуцируют эндотоксины [78-80]. Клеточные стенки грамм-положительных бактерий содержат различные компоненты, такие как пептидогликан (ПГ) и липотейхоевые кислоты (ЛТК)[81], которые могут вызвать воспалительную реакцию [68, 82-84]. ПГ может индуцировать все основные признаки и симптомы, связанные с бактериальными инфекциями, включая жар, воспаление, пониженную периферическую перфузию, понижение давления, уменьшение аппетита, бессонницу, артриты [85,86]. При совместном воздействии ПГ и ЛТК также индуцируют нарушение кровотока и множественное поражение органов [70]. Так как антитела к СО 14 ингибируют активацию моноцитов ПГ, было предположено, что СО 14 является рецептором как для ПГ, так и для Л ПС [87]. Впоследствии, было показано связывание ПГ [88,89] и ЛТК [90,91] с С014, приводящее к СОН зависимой клеточной активации. Было показано, что ПГ активирует транскрипционные факторы №-кВ [87], СЯЕВ/АТР и АР-1 [92], и что данная активация С014 - зависимая. Так, как С 014 не содержит внутриклеточного сигнального домена, было постулировано существование трансмембранного корецептора. Кандидатами на эту роль являются обнаруженные недавно рецепторы Т1Л2 и ТЬИ4 [51,65,93-95]. Было показано, что ТЬЯ2 и ТЫ14 узнают различные компоненты клеточных стенок бактерий. TLR2 дефицитные макрофаги гипочувствительны к клеточным стенкам грамм-положительных бактерий, TLR4 дефицитные макрофаги неспособны отвечать на липотейхоевые кислоты грамм-положительных бактерий [96]. Потенциальным участником механизма распознавания ПГ клеточных стенок грамм положительных бактерий является ген tag7, экспрессируемый в лимфоидных органах мыши [97,98]. Показано, что tag7 эволюционно консервативен, аналоги tag7 существуют как у млекопитающих, так и у насекомых (PGRP)[97-101], У насекомых PGRP¡tag7 узнает пептидогликан и запускает профенолоксидазный каскад, часть антимикробной защитной системы насекомых, у млекопитающих нет профенолоксидазного каскада, поэтому функции tag7 остаются недостаточно ясны. Для мышиного tag!/PGRP показано связывание с пептидогликаном [102], однако, в отличие от CD 14 зависимого пути, обусловленного макрофагами, tag7 участвует в другом, в настоящий момент неизвестном пути распознавания петидогликана, так как tag7/PGRP ингибирует фагоцитоз грамм положительных бактерий макрофагами [102].

Заключение.

Система иммунитета создает мощный заслон для инвазии бактерий, вирусов, грибков, простейших или многоклеточных паразитов и содержит эффективные механизмы для их распознавания, обезвреживания и удаления из организма. Нарушения в механизмах распознавания, презентации антигена или дисбаланс регуляторных

Материалы и методы.

Ферменты и реактивы.

В работе использовались ферменты, производимые фирмами

Fermentas (Litvenia), Promega (USA), Gibco (USA) и реактивы производства фирм Sigma (USA) и Merck (Germany). Для радиоавтографии применялась пленка BioMax MS (Kodak) с соответствующими усиливающими экранами. Радиоавтография при определении первичной последовательности ДНК проводилась с использованием односторонней пленки BioMax MR (Kodak). Стандартные праймера (Т7, ТЗ и Sp6 праймер-промоторы) были получены от Promega (USA). Остальные олигонуклеотиды были заказаны в фирме Syntol (Москва). Агарозный гель-электофорез ДНК.

Гель-электрофорез ДНК проводили в 0.4 - 1.5 % агарозном геле, содержащем буфер ТАЕ (Tris-Acetate-EDTA) с 0.5% бромистым этидием [103]. ДНК детектировали с помощью трансиллюминатора в ультрафиолете (302 нм). Реакция обратной транскрипции.

Реакцию обратной транскрипции проводили на матрице полиА-РНК, выделенной из тимуса мыши или суммарной РНК, выделенной из печени мыши. Условия реакции: 40°С в течение 40 мин. с последующим разрушением РНК при 95°С в течение 5 мин. Состав реакционной смеси (20 мкл): lxRT-буфер (Fermentas), 10 мМ DTT, 0.5 мМ dNTP, 1мМ рассеянная затравка, 20 ед. RNAsin (Promega), 5 мкг тотальной РНК или 1 мкг полиА РНК, 10 ед. обратной транскриптазы ( Fermentas).

Амплификация фрагмента кДНК tagL.

Амплификация фрагмента кДНК tagL на матрице синтезированной кДНК проводилась с помощью GeneAmp DNA PCR Kit (Perkin-Elmer/Roche). В реакции ПЦР использовались праймера к фрагменту кДНК гена tagL мыши, полученному в результате компьютерного анализа. Реакция (50 мкл) содержала 1нг кДНК, IX буфер PCR, 2.5 мМ хлорид магния, 0.1 мМ dNTP каждого, 100 нг каждого праймера и 5 ед. Pful -полимеразы. Амплификация проводилась в течении 30 циклов (94°С, 40 с; 65 °С, 1 мин.; 72°С, 1 мин.). Продукты реакции разделяли в 1% агарозном геле и элюировали из геля с помощью набора реагентов QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).

Амплификация 5' конца к ДНК гена tagL.

После построения первой цепи со специфического праймера на матрице полиА РНК, полученной из тимуса мыши, был достроен олиго dA 5' конец при помощи терминальной нуклеотидилтрансферазы (в 50 мкл 1мМ dATP 40 минут при 37 °С). Далее была проведена амплификация фрагмента кДНК с праймером 5'-CCTGTCGAC (T)i6-3' и специфическим праймером как описано выше. Амплифицированный фрагмент клонирован в вектор pBlueSript II SK(-) по Sall/Smal.

Амплификация 3' конца кДНК гена tagL.

Первая цепь была построена с праймера 5'-CCTGTCGAC (T)j6-3' на матрице мРНК, полученной из тимуса мыши, как описано выше.

Далее была проведена амплификация фрагмента кДНК с праймером 5'-CTGTCGAC (Т)]6-3' и специфическим праймером как описано выше. Амплифицированные фрагменты клонированы в вектор pBlueSript II SK(-) по Sall/Smal.

Плазмидные и фаговые векторы

В работе были использованы плазмидные вектора семейства pBluescript II SK (-) (Stratagene) и pQE31(Qiagen). Геномная мышиная библиотека из линии 129/Svj в векторе X FIX II (Stratagene) была любезно продоставлена Бухманом В.Л., University of St Andrews, (Англия).

Штаммы бактерий.

Для амплификации рекомбинантных плазмид был использован штамм Е. coli XL1 Blue MRF'. При всех манипуляциях с геномной мышиной библиотекой (высев, амплификация, скрининг, выделения фагов) был использован штамм Е. coli XL-I MRA( Р2).

Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК проводилась в соответствии с двумя протоколами: 1) с использованием СаС12; 2) электропорация.

Трансформация клеток Е. coli с использованием Са&2.

Для трансформации с использованием СаС12 компетентные клетки приготовляли как описано в [103]. Одной бактериальной колонией инокулировали 1-5 мл среды LB и растили в течение ночи. Затем выросшей культурой инокулировали среду LB (при соотношении 1:100) и растили до СЮбоо 0.3-0.5 (~5х107 клеток/мл) при 37°С с постоянным качанием. По достижении культурой нужной плотности клеточную массу охлаждали во льду в течение 10 мин., клетки осаждали центрифугированием при 4000£, 4°С в течение 5 мин. Клеточный Осадок ресуспендировали в 1/2 исходного объема охлажденного на льду раствора 50 мМ М§С12, 10 мМ Тт-НСЛ, рН 8.0. После центрифугирования (4000§, 4°С, 5 мин.) клетки ресуспендировали в 1/2 исходного объема охлажденном во льду раствора 50 мМ СаС12, ЮмМ Тш-НО, рН8.0, и осаждали центифугированием при 4000g, 4°С, 5 мин. Клетки ресуспендировали в 1/15 исходного объема 50 мМ СаС12, 10 мМ Тш-НО, рН 8.0 и инкубировали на льду в течение 30 мин. Для трансформации к 100 мкл компетентных клеток добавляли 10 мкл лигированной смеси ДНК (1 мкг). Смесь клеток с ДНК инкубировали на льду 60 мин. Пробирку быстро помещали в водяную баню при 42°С на 90 сек. для теплового шока и обратно в лед. Затем добавляли 1 мл среды ЬВ и инкубировали на 37°С в течение часа для экспрессии генов устойчивости к антибиотикам. Затем различные разведения клеток высевали на чашки с агаром и соответствующим антибиотиком и растили на 37°С в течение ночи. Полученные колонии использовали для наращивания ночных культур и выделения плазмид.

Трансформация клеток Е. соН электропорацией.

Для приготовления компетентных клеток для электропорации одной колонией инокулировали 2.5 мл ЬВ и растили в течение ночи. Затем ночной культурой инокулировали среду ЬВ (1:100) и растили клетки до (Юбоо=0.5-0.8. Клетки охлаждали во льду в течение 15-30 мин. и центрифугировали 5 мин. на 4000g, 4°С. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 исходном объеме охлажденной стерильной воды (Mili-Q). После центрифугирования в том же режиме клетки ресуспендировали в 1/2 исходного объема воды, центрифугировали, ресуспендировали в охлажденном 10% глицерине и быстро замораживали в жидком азоте в виде аликвот по 40 мкл. Компетентные клетки хранили на -70 °С. Перед трансформацией клетки оттаивали на льду и добавляли к ним 1 мкл ДНК (10-100 нг). Смесь переносили в охлажденные кюветы (0.1 см) и помещали в электропоратор. Использовали следующие параметры: 2.4кВ, 25mkF, 400 Ом. После электропорации добавляли 1 мл среды SOC и качали клетки в среде при 37°С в течение 1 часа без антибиотиков. После этого клетки высевали в различных разведениях на покрытые LB-агаром чашки Петри с соответствующим антибиотиком. Клетки растили в течение ночи на 37°С, отбирали колонии и выделяли из них плазмиды.

Выделение плазмидной ДНК.

Плазмидную ДНК выделяли по стандартной методике щелочным лизисом [103]. Полученный из 3-5 мл ночной культуры культуры клеточный осадок ресуспендировали в 200 мкл раствора 1 (25 мМ трис-НС1 рН 8,0; 50 мМ глюкоза; 10 мМ ЭДТА), затем добавляли 400 мкл раствора 2 (0,2 M NaOH; 1% SDS), осторожно перемешивали и инкубировали 5 мин во льду. Добавляли 300 мкл 3 M ацетата калия рН 4,8, интенсивно перемешивали и инкубировали 30 мин. на льду.

Плотную белую массу (высоко молекулярная ДНК и клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 5 мин. К супернатанту добавляли 400 мкл 40% (вес/вес) раствора ПЭГа, перемешивали и инкубировали во льду в течение 1 часа. После центрифугирования при 14.000 об/мин в течение 5 мин. осадок плазмидной ДНК растворяли в 100 мкл Н2О. Примеси полисахаридов осаждали 200 мкл 7,5 М ацетата аммония, рН 7.5 в течение 5 мин при -70°С. После центрифугирования к супернатанту, содержащему плазмидную ДНК добавляли 0,6 объема изопропанола и инкубировали 1 минуту при комнатной температуре. После центрифугирования при 14.000 об/мин в течение 10 минут осадок плазмидной ДНК промывали 70% этанолом, сушили и растворяли в 50 мкл Н2О.

Определение первичной последовательности ДНК.

Первичная последовательность ДНК определялась по методу

Сэнгера с использованием Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit (Amersham-USB) в соответствии с рекомендациями производителей. В качестве матрицы использовалась денатурированная двухцепочечная плазмидная ДНК, полученная с помощью аналитического выделения и очистки плазмидной ДНК методом щелочного лизиса как описано выше. Для одной реакции брали по 4-5 мкг плазмиды. Для реакции отжига использовали внутренние праймера к кДНК tagL или плазмидные праймера в количестве 1пмоль праймера на реакцию. Реакцию отжига праймера на матрице проводили при 65°С в течение 5 минут, после чего реакционную смесь охлаждали до 30 °С. Реакцию мечения проводили с помощью модифицированной Т7 ДНК полимеразы (Sequenase ™ Version 2.0 Т7 DNA polymerase, Amersham) Реакционную смесь (Sequencing Kit, Amersham) инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. В качестве меченого нуклеотида использовали аР32 -dATP. Терминацию реакции проводили с помощью набора терминаторов-дидезоксинуклеотидов (Sequencing Kit, Amersham) в течение 10 минут при 42°С. Разделение продуктов реакций секвенирования проводилось в 6% ПААГ/ТВЕ (Tris-Borate-EDTA), содержащем 50% мочевину (136).

Выделение тотальной РНК.

Для выделения тотальной РНК печень или тимус мыши замораживали в жидком азоте, растирали в ступке и лизировали в буфере "D", содержащем 4М гуанидинизотиоцианат, 25мМ цитрат натрия ( рН7.0), 0.5% саркозил, 0.1М p-меркаптоэтанол. РНК экстрагировали смесью, состоящей из 1 объема водонасыщенного фенола, 0.2 объемов хлороформа в присутствии 0.2М ацетата натрия (рН 4.0) и преципитировали равным объемом изопропанола. После переочистки РНК с помощью перерастворения в буфере "D" с последующим переосаждением изопропанолом РНК растворяли в воде. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически по поглощению водного раствора РНК при длине волны 260 нм. РНК хранили при -70 °С в виде суспензии в водном растворе, содержащем 0.1 объем ЗМ ацетата натрия (рН 5.0), 3 объема этанола.

Выделение хромосомной ДНК и приготовление образцов хромосомной ДНК для Саузерн-блот-гибридизационного анализа.

Хромосомную ДНК выделяли как описано в [104]. Материал (около 1 г ткани), замороженный в жидком азоте, растирали до состояния порошка и суспендировали в 2.4 мл буфера, содержащего 100 мМ ЫаС1, 10 мМ Тш-НС1 рН 8.0, 25 мМ БЭТА рН 8.0, 0.5% ББЗ и 0.1 мг/мл протеиназы К. Обработку протеиназой К осуществляли в течение ночи при 50°С. ДНК экстрагировали равным объемом фенола/ хлороформа и преципитировали 1/2 объема 7.5 М ацетата аммония, 2 объемами этанола. После промывки в 70% этаноле ДНК ресуспендировали в буфере ТЕ в концентрации 1 мг/мл. Для Саузерн-блот-гибридизационного анализа образцы хромосомной ДНК обрабатывались несколькими рестрикционными эндонуклеазами СЕсоШ, £соМ+НМШ) в течение ночи при 37°С. На каждую реакцию брали по 20 мкг образца ДНК при соотношении 5-10 ед. каждого фермента на 1 мкг ДНК. Для избавления от примеси РНК образцы обрабатывали панкреатической рибонуклеазой А (0.25 мг/мл) в течение 15-30 минут при 37°С. Образцы ДНК экстрагировали фенолом, преципитировали этанолом и ресуспендировали в 40 мкл воды для нанесения на электрофорез.

Выделение фаговой ДНК

Бляшки, соответствующие индивидуальным фаговым клонам, дающим положительный гибридизационный сигнал при повторном скрининге библиотеки вырезали из агара, помещали в буфер БМ (0.1

M NaCl, 10 мМ MgS04, 20 мМ Tris-HCl, рН 7.5), добавляя каплю хлороформа, и хранили в таком виде на 4 °С. Фаговую ДНК выделяли как описано в [104]. 300 мкл ночной культуры клеток штамма XL1 MRA(P2) преинкубировали с индивидуальной бляшкой в течение 30 минут на 37 °С для адсорбции фаговых частиц на клетках и инокулировали этим количеством 50 мл среды NZY, добавив еще 1-1.5 мл ночной культуры. Клетки растили при интенсивной аэрации на качалке 6-8 часов до наступления лизиса. После этого добавляли 60 г/л NaCl и 1-1.5 мл хлороформа. Лизат откручивали при 15.000 rpm в течение 15 минут, супернатант собирали. Фаг из супернатанта преципитировали с помощью ПЭГа (конечная концентрация 10%) в течение 30-60 минут при 0 °С. Частицы фага ресуспендировали в 2 мл SM, добавляли равный объем хлороформа, встряхивали на Vortex и центрифугировали. Супернатант, содержащий суспензию фагов, собирали.

Для очистки от бактериальной геномной ДНК и РНК суспензию фагов в 2 мл буфера SM обрабатывали дезоксирибонуклеазой I (грубая фракция, 100 мкг/мл) и панкреатической рибонуклеазой А (грубая фракция, 100 мкг/мл) в течение 30 минут при 37 °С. Затем белки оболочки фаговых частиц гидролизовали с помощью протеиназы К (100 мкг/мл) в буфере SM, 0.5% SDS, 20 мМ EDTA в течение 60 минут при 56 °С. Фаговую ДНК экстрагировали последовательно равным объемом фенола, равным объемом смеси фенол: хлороформ (1:1) и преципитировали 1/20 объема 5М NaCl, 2.5 объема этанола в течение нескольких часов при -20 °С. Фаговую ДНК растворяли в воде, концентрацию определяли электрофоретически с помощью стандартных концентраций фага X.

При построении рестрикционных карт фаговых клонов из геномной мышиной библиотеки 1 мкг ДНК из анализируемых положительных независимых фаговых клонов подвергали обработке различными общеупотребимыми рестрикционными эндонуклеазами (ЕсоШ, BamHl, Xho\, Hindlll, Pvull, Xbal) и их сочетаниями (.ЕсоШ+ВатШ, £coRI+ Xhol, £coRI+ Hindlll, £coRI+ Xhol, EcóRl+ ВатШ+ Mol и т.д.) из расчета 5-10 ед. каждого фермента на 1 мкг ДНК в соответствующих буферах рестрикции (Promega). ДНК экстрагировали фенолом, осаждали этанолом и растворяли в воде для нанесения на электрофорез.

Нозерн- и Саузерн- блот гибридизационный анализ.

Электрофорез и перенос образцов РНК на мембрану

Тотальную РНК для Нозерн-блот гибридизации разделяли в 1% агарозном геле содержащем формальдегид как описано в [103] при нагрузке 20 мкг РНК на дорожку. Электрофорез осуществляли при постоянном напряжении 60 В до выхода бромфенолового синего из геля. После завершения электрофореза гель отмывали от формальдегида в буфере SSC в течение 40 минут с двумя сменами буфера и переносились на нейлоновую мембрану Hybond-N (Amersham) в буфере lOxSSC в течение ночи с помощью капиллярного блоттинга.

Электрофорез и перенос образцов ДНК на мембрану

Для Саузерн-блот гибридизации фрагменты ДНК, полученные с помощью обработки хромосомной ДНК различными рестрикционными эндонуклеазами, разделяли в 0.9% агарозном геле при нагрузке 20 мкг ДНК на дорожку. ДНК фаговых клонов, обработанных различными рестрикционными эндонуклеазами разделяли в 1% агарозном геле при нагрузке 1 мкг ДНК на дорожку. В качестве стандартов молекулярных масс использовали набор фрагментов, отличающихся на 1 т.п.н. (1 kb ladder, Promega).

После завершения электрофореза ДНК обрабатывали следующим образом:

1 денатурация крупных фрагментов ДНК с помощью погружения верхней части геля в раствор 0.25М НС1 в течение 5 минут.

2 денатурация всей ДНК с помощью вымачивания геля в растворе

0.5 М NaOH/ 1.5 М NaCl в течение 40 минут с двумя сменами раствора.

3 нейтрализация геля в растворе 1М Tris-HCl/ 1.5 М NaCl в течение 40 минут с двумя сменами раствора.

После обработки осуществляли перенос ДНК на нейлоновую мембрану Hybond-N (Amersham) в буфере lOxSSC в течение ночи с помощью капиллярного блоттинга.

Фиксация РНК и ДНК на фильтре достигалась облучением фильтра ультрафиолетом (302 нм) в течении 10 мин. на трансиллюминаторе.

Приготовление меченых ДНК-зондов

Зонды для Саузерн-, Нозерн-блот гибридизации и гибридизации фаговых клонов на фильтре получали с помощью метода рассеянной ДНК-затравки (Prime-a-Gene Labeling System, Promega) как описано в [105]. В качестве матрицы использовали двухцепочечную ДНК. Для скрининга геномной мышиной библиотеки использовали два фрагмента кДНК tagL 1100 п.н. и 700 п.н., полученных в результательтате рестрикции кДНК tagL по сайту PvuW. Состав реакционной смеси для мечения :

5 о.е./мл рассеянной ДНК-затравки (гексадеоксинуклеотиды) в буфере 50 мМ Tris-HCl, рН8.0, 5 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, 0.2 мМ HEPES, pH 6.6., 25 нг ДНК-матрицы для Нозерн- и Саузерн- блот-гибридизации (100 нг ДНК-матрицы для анализа клонов библиотеки на фильтре), денатурированои кипячением в течение 10 минут, aP32-dATP (3.000 Ci/mmole; 50 jliCí для блот-гибридизаций, 100 |.iCi для клонов библиотеки на фильтре), 0.05 мМ dNTP (-dATP), 0.4 мг/мл BSA, 100 ед./мл фрагмента Кленова.

Компоненты смешивали при 0 °С и реакционную смесь инкубировали при 37 °С в течение 1 часа. Процент включения определяли с помощью связывания ДНК из реакционной смеси на GF/C фильтре, отмывая ДНК от невключившихся нуклеотидов 10 % ТХУ. Стандартный процент включения составлял 30-50%. Очистку от невключившихся нуклеотидов осуществляли с помощью PCR QIAquick Spin Column (Qiagen).

Гибридизация.

Предгибридизация мембран проводилась в буфере, содержащем 0.5 М Na-фосфат, рН 7.2; 7% SDS; 1 мМ ЭДТА, рН 8.0, денатурированной ДНК спермы лосося (Sigma) в концентрации 100 мкг/мл в течении 2-3 часов при 65°С (139).

Гибридизацию проводили в буфере того же состава, содержащем денатурированный кипячением меченный зонд (0.5-2.5 iaCi/мл, 1-6x106 срт) при 65°С в течении 18-24 часов. Мембраны отмывали в 0.1% SDS/ 2xSSC (0.3М NaCl, 30 мМ цитрат натрия) при 65°С в течение нескольких часов. Отмытые мембраны радиоавтографировались с усиливающими экранами Kodak при -70 °С.

Приготовление бактериальных штаммов, определение титра и амплификация библиотеки

Для анализа геномной мышиной библиотеки был использован штамм XL1MRA(P2), обеспечивающий селективный рост рекомбинантных клонов.

Единичной колонией клеток инокулировали 50 мл среды LB, содержащую 10 мМ MgS04, 0.2% мальтозу. Клетки инкубировали при 37°С на качалке 6-7 часов до достижения ODsoo 0.6, затем центрифугировали (500g, 10 мин.), ресуспендировали в 1/2 исходного объема стерильного раствора ЮмМ MgS04 , измеряли OD^oo и доводили до 0.5 раствором ЮмМ MgS04 (140).

Для определения титра библиотеки 1 мкл упаковочной реакции (в разведении 1:1 и 1:10) добавляли к 200 мкл клеток и инкубировали при

37°С в течение 15-30 минут, после чего инфецированные клетки смешивали с 2-3 мл расплавленного верхнего NZY агара (с температурой около 48°С) и равномерно покрывали им 100 мм чашки Петри с нижним NZY агаром. После застывания верхнего агара чашки переворачивали, инкубировали в течение ночи на 37°С и подсчитывали количество фаговых бляшек.

Титр библиотеки (число фаговых клонов/мл, pfu/ml) рассчитывали (140): Титр библиотеки (pfu/ml)= число бляшек на чашке х фактор разведения/ высеянный объем, мл Титр библиотеки составлял 5xl06pfu/ml.

Для амплификации библиотеки аликвоты по 20 мкл, содержащие 105 pfu (всего 50 аликвот) смешивали с 600 мкл клеток (СЮбоо=0-5 в 10 мМ MgS04) и инкубировали при 37°С в течение 30 минут. Затем инфецированные клетки смешивали с 7-8 мл верхнего NZY агара и равномерно покрывали им 150 мм чашки Петри с нижним NZY агаром. После застывания верхнего агара чашки переворачивали и инкубировали при 37°С в течение 8 часов. Затем слой верхнего агара заливали 10-12 мл буфера SM, инкубировали чашки в течение ночи на 4°С для диффузии фаговых частиц в SM. Суспензию бактериофагов вместе с верхним агаром собирали, центрифугировали 20 минут при 3000g, супернатант собирали, добавляли хлороформ до конечной концентрации 0.3% объема и хранили библиотеку на 4°С. Титр амплифицированной библиотеки составлял 109 pfu/ml. Для длительного хранения библиотеку замораживали на -70°С в виде аликвот по 5х106 pfu, добавляя DMSO до конечной концентрации 8%. При размораживании аликвот библиотеки повторно проверяли их титр.

Скрининг библиотеки

Высев клонов геномной библиотеки для скрининга производили как описано выше (см. амплификация библиотеки). Для скрининга геномной библиотеки было высеяно 106 клонов. После инкубации в течение 8 часов при 37°С с клонов снимали реплики на нейлоновую мембрану Hybond-N (Amersham), предварительно охладив чашки в течение 1-2 часов на 4°С, чтобы предотвратить прилипание верхнего агара к мембране. С каждой чашки было снято по 2 реплики, прикладывая мембрану к агару с колониями на 2 мин. (4 мин. для второй реплики) и отмечая с помощью нескольких проколов иглой ориентацию мембраны. После снятия реплик чашки хранили на 4°С, а перенесенный на мембраны материал денатурировали раствором 1.5 М NaCl, 0.5 М NaOH в течение 2 мин, затем нейтрализовали раствором 1.5 М NaCl, 1 М Tris-HCl, рН 8.0 в течение 15 минут, промывали мембраны буфером 2xSSC, сушили на воздухе и фиксировали ДНК , облучая мембраны ультрафиолетом в течение 20 мин. в ламинаре[109].

Зонды для гибридизационного анализа клонов были приготовлены, как описано выше (см. приготовление меченых ДНК-зондов).

Гибридизацию проводили в течение ночи при 42°С в формамид-содержащем буфере: 50% деионизованный формамид (Sigma), 5х SSC, 5х раствор Денхарта (50х раствор Денхардта содержит 1% (вес/вес) фиколла,

1%поливинилпиролидола, 1%В8А), 0.1мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, 0.1 мг/мл дрожжевой тРНК, 0.1% (136, 139).

Фильтры отмывали в растворе 2х88С, 01% 8Б8 в течение 2 часов и экспонировали в течение ночи с рентгеновской пленкой, используя усиливающие экраны. После проявления пленку совмещали с фильтрами, отмечали расположение гибридизационных сигналов на чашках, соответствующую область агара с фаговыми бляшками вырезали, помещали в 0.5 мл буфера БМ, содержащего 0.3% хлороформа, встряхивали для диффузии фаговых частиц в БМ и использовали для вторичного скрининга. Для этого аликвоты по 1 мкл суспензии фагов в 8М, выявленных при первичном скрининге (разведения 1:10, 1:100, 1:1000 в 8М), смешивали с 300 мкл клеток и после инкубации (15 мин., 37°С) смешивали с верхним агаром и высевали на 100 мм чашки Петри с нижним NZY агаром. Чашки инкубировали в течение ночи при 37°С. С чашек, содержащих порядка 100-200 клонов снимали по одной реплике и проводили повторную гибридизацию, как описано выше. После проявления положение гибридизационных сигналов отмечали на чашках, соответствующие индивидуальные бляшки вырезали и использовали для выделения фаговой ДНК.

Экспрессия и выделение рекомбинантного TagL

Для экспрессии рекомбинантного белка в клетках Е. соИ фргмент кДНК tagL Крп1/Руи11 был субклонирован в экспрессирующий вектор рС>Е31 (С^еп) по Крп1/8а11. Экспрессирующая конструкция с помощью электропорации введена в штамм M15[pREP]. Экспрессию рекомбинантного TagLPART индуцировали с помощью IPTG. В оптимизированных условиях максимум экспрессии рекомбинантного белка достигался индукцией культуры Е. coli при OD600=1.5 в присутствии 1 мМ IPTG в течении 3 часов. TagLPART был получен в виде гибрида с 6 гистидинами на N-конце белка, что позволило провести выделение рекомбинантого белка с помощью металло-хелатной хроматографии на смоле Ni-NTA агароза (Qiagen). Выделение TagLPART проводили в денатурирующих условиях. Клеточную массу лизировали в буфере А, содержащем 6М гуанидингидрохлорид, 0.1 М NaH2P04, 0.01 М Tris, при значении рН 8.0 с добавлением 10 мМ 2-меркаптоэтанола. Элюцию белка со смолы проводили в буфере содержащем 8М мочевину, 0.1 М NaH2P04, 0.01 М Tris путем ступенчатого градиента рН от 8.0 до 4.5, все буфера также содержали 10 мМ 2-меркаптоэтанол. Рекомбинантный белок сходил с колонки при значении рН 4.5.

Получение поликлональной антисыворотки к белку TagL.

Раствор очищенного рекомбинантного белка TagLPART мыши был использован для иммунизации кролика. Первую иммунизацию животного проводили подкожно и внутримышечно, с добавлением полного адъюванта Френда. Две следующие иммунизации проводились подкожно с интервалом в две недели, с добавлением неполного адъюванта Френда. Для каждой иммунизации использовалось 100 мкг рекомбинантного белка. Кровь для получения сыворотки брали из краевой вены уха спустя 1-2 недели после последней иммунизации.

Полученную антисыворотку хранили в виде аликвот по 100 мкл при температуре -70°С .

Культивирование трансформированных клеточных линий и первичных культур.

В работе были использованы трансформированные клетки линий ВНК (почки хомячка), ANA-1 (крысиные макрофаги), HL60 (миелобластома человека), ARH-77 (В-клеточная лимфобластома человека) и Jurkat (Т-клеточная лейкемия человека). Использованные клеточные линии были описаны American Tissue Culture Collection (USA). Клетки HL60, ARH-77 и Jurkat представляют собой суспензионную культуру, ВНК сорбируются на пластике. Клетки культивировали в инкубаторе с 5% С02 при 37°С в 25 см пластиковых матрасах (Costar). Клетки ARH-77 и Jurkat культивировали в среде RPMI 1640 (Gibco) с 10% FCS (Gibco) в присутствие 100 ед/мл канамицина. ВНК и HL-60 культивировали в среде DMEM (Gibco) с 10% FCS (Gibco) в присутствие 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина. При пересаживании ВНК на новый матрас клетки промывали раствором трипсина (Gibco) и десорбировали с пластика раствором Версена (Gibco). Первичные культуры спленоцитов получали как описано [108]. Селезенка растиралась в PBS, эритроциты лизировались инкубацией в 0,9% NaCl в течении 5 минут. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Gibco), содержащей 5% FBS (Gibco),

100 ед/мл пенициллина и стрептомицина, 5x10-5 М 2-меркаптоэтанола, 1% глютамина, 1% 1 М HEPES (Gibco). Индукцию клеток проводили в среде без сыворотки при конечных концентрациях ЛПС (Sigma) 5 мкг/мл, ФГА 10 мкг/мл, КонА 2,5 мкг/мл, ФМА 5 нг/мкл в течении 24 часов.

Получение кондиционной среды.

Для получения кондиционной среды клетки растили до 80% монослоя и инкубировали в течении 24 ч. в культуральной среде без сыворотки. После инкубации среда фильтровалась и сразу использовалась.

Выделение нейтрофилов и лимфоцитов человека.

Нейтрофилы выделены из фракции гранулоцитов с помощью фракционирования в градиенте Hystopaque (Sigma). Человеческие периферические Т лимфоциты выделялись из МНК периферической крови при помощи сортировки с магнитными частицами, коньюгированными с антителами к рецепторам CDllb, CD16, CD19, CD36 и CD56 (Miltenyi Biotec). Гомогенность проверялась при помощи ФАКС анализа. Суммарная фракция лимфоцитов человека получена после центрифугирования в изоосмотическом градиенте Перколла МНК периферической крови.

Получение содержимого гранул нейтрофилов.

Нейтрофилы, в количестве 5 млн/мл инкубировались в бессывороточной среде RPMI 1640 15-30 минут в присутствии ФМА (2 нг/мл) и иономицина (0.5-1 мМ). Супернатант высаживался тремя объемами метанола -20 °С , 18 часов.

Иммуногистохимический анализ

Иммуногистохимический анализ проводился как описано [106].

Образцы органов мыши фиксировали в 4% растворе параформальдегида

Sigma) в течении ночи при +4°С. После дегидратации образцы заключались в парафин. Срезы толщиной 10 мкм помещали на покрытые поли-Ь-лизином (Sigma) предметные стекла, депарафинировали и фиксировали в течении 20 мин. в 4% растворе параформальдегида (Sigma) при комнатной температуре. После отмывки препаратов в 1х TBS-T (138 мМ NaCl; 25 мМ трис-НС1; 2.7 мМ КС1; 0.1% Tween-20, рН 7.4) срезы блокировали в блокирующем растворе (10% FBS в lxTBS-T) в течении 30 мин. После блокирования срезы гибрид изовал и с поликлональными антителами к TagL в разведении 1:20 в блокирующем растворе в течении 2 часов во влажной камере. Контрольные срезы инкубировали в блокирующем растворе. После отмывки в блокирующем растворе (3 раза по 5 мин.) срезы гибридизовали со вторичными антикрысиными IgG антителами, конъюгированными с HR пероксидазой (Sigma), в разведении 1:200 в течении 1 часа и отмывали, как описано выше. Детекция специфического сигнала проводилась с использованием 3,3'-диаминобендизидина (DAB) с металлическим усилителем в качестве субстрата (SIGMA FAST DAB with metal enhancer, Sigma). После завершения реакции препараты заключались в 90% глицерин/0.1 М трис-НС1, рН 8.0.

Электрофорез в ДСН/ПААГ.

Разделение белков проводилось в денатурирующем 12 % ДСН

ПААГ (толщина 0.75 мм) по Лэммли [107] в камере для вертикального электрофореза (Stratagene). Состав электродного буфера: 20 мМ Tris, 0.2 М глицин, 0.1% SDS. Электрофорез осуществляли в режиме постоянного тока: 15 мА в концентрирующем геле, 20 мА - в режиме разделения. Длина разделяющего геля 10 см. Состав геля: 5% концентрирующий гель ( 5 мл): 3.4 мл Н20

0.83 мл 30 % акриламид-бисакриламид (19:1)

0.63 мл 1 М Tris-HCl, рН 6.8

0.05 мл 10% SDS

0.05 мл 10% персульфат аммония

0.005 мл TEMED

12% разделяющий гель (25 мл)

8.3 мл Н20

10.0 мл 30% акриламид-бисакриламид (19:1)

6.3 мл 1.5 М Tris-HCl, рН 8.8

0.25мл 10% SDS

0.25 мл персульфат аммония

0.01 мл TEMED

В качестве стандартов молекулярных весов использовались Prestained High-Range Protein Molecular Weight Markers (Gibco). После окончания гель-электрофореза белки в геле окрашивали либо переносились на мембрану.

Окрашивание осуществляли водным раствором 0.25% Кумасси R-250, содержащим 45% этанола, 10% уксусной кислоты в течение 1 часа, затем гель отмывали водным раствором 10% уксусной кислоты для выявления полос белков.

Электроперенос белков на мембрану.

Электроперенос осуществляли на мембрану PVDF (Amersham), предварительно смоченную в метаноле. Перенос проводили в аппарате для полусухого электроблоттинга Т70 Semi- Dry Transfer Unit (Hoefer Scientific) при постоянном токе 100 мА в течение 1.5 часов в Трис-глициновом буфере (20 мМ Tris, 0.2 M глицин, рН 8.5), содержащем 20 % метанола.

Вестерн- блот анализ

После электропереноса мембраны окрашивали либо помещали в блокирующий раствор для последующего иммуноблоттинга. Окрашивание осуществляли раствором 0.1% Coumassie G-250, содержащим 50% метанола в течение 3 минут с последующей отмывкой водным раствором, содержащим 50% метанол, 5 % уксусной кислоты и промывкой водой.

Вестерн-блот анализ проводили по стандартной методике. Мембраны, содержащие исследуемые образцы, блокировали в буфере TBS-T, содержащем 3% BSA в течение ночи и затем окрашивали поликлональными кроличьими антителами к рекомбинантному TagL мыши (разведение 1: 5.000 в буфере TBS-T, 3% BSA) в течение 1 часа. После отмывки от избытка несвязавшихся антител с помощью трехкратной промывки TBS-T мембраны инкубировали в течение 1 часа со вторичными козлиными анти-кроличьими антителами (разведение 1:

5000), конъюгированными с пероксидазой хрена. После отмывки от избытка вторичных антител с помощью трехкратной промывки ТВБ-Т детекцию иммунного окрашивания проводили с помощью люминесцентной ферментативной реакции, используя набор реагентов ЕСЬ, АтегеЬат.

Разрушение эукариотических клеток ультразвуком.

Клетки суспендируются в буфере:

Тш-НСЛ 50тМ рН 8.0, сахароза 0.153 г/мл, ЕОТА 2шМ, р-меркаптоэтанол 5 мМ, тритон 0.1%, РМ8Р 0.2 мМ. Далее клетки обрабатываются ультразвуком при непрерывном охлаждении во льду в течении нескольких интервалов по 15 секунд. Суммарое время обработки составляет 2 минуты.

Фракционирование клеточных мембран.

Митохондриальная фракция осаждается при центрифугировании клеточного лизата при 3000 § в течении 20 минут. Внутриклеточные мембраны выделяются при добавлении в надосадочную жидкость СаС12 до 10 мМ и проведении инкубации при +4° С 10 мин с последующим осаждением центрифугированием при 3000 % 10 минут. Цитоплазма-тические мембраны осаждают центрифугированием при 43 000 об/мин 45 минут. Цитоплазматические белки высаживаются 3 объемами метанола при инкубации -20° С 12 часов.

Результаты и обсуждения.

Клонирование полноразмерной кДНК гена tagL.

Мышиный EST клон, обладающий в одной из возможных рамок трансляции гомологией по аминокислотной последовательности с белком Tag7, был выявлен с помощью компьютерного анализа базы данных Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI). Далее были обнаружены фланкирующие EST клоны, что дало возможность составить фрагмент кДНК размером 1500 п.н. Данный фрагмент был клонирован путем обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на суммарной РНК полученной из печени мыши (Рис.1); при этом были использованы праймеры 5'-CAGAGTGTCCAGGCCAACCA-3' (GtagF) и 5'-CACCGTGTTCAGCGCAGCTT-3' (GtagR). После определения нуклеотидной последовательности фрагмента было проведено клонирование 5' и 3' областей кДНК путём наращивания цепи ДНК и полимеразной цепной реакции на поли-А РНК, полученной из тимуса мыши. При клонировании 3' района кДНК синтез первой цепи был проведен с праймера S'-CCTGTCGAC^^-S' (Sall(dT) 1б), затем было проведено 20 циклов ПЦР с праймерами SalI(dT)i6 и GtagF и 30 последующих циклов ПЦР с праймерами SalI(dT)i6 и 5'-GGAGGCCCTTGTCCTGTTAC-3' (GtagMF). При клонировании 5' района кДНК синтез первой цепи был проведен с праймера GtagR, затем произведено наращивание поли-А фрагмента на 5' конце кДНК при помощи терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы. После этого было проведено 20 циклов ПЦР с праймерами SalI(dT)16 и GtagR и 30 последующих циклов ПЦР с праймерами SalI(dT),6 и 5'-TGAGTCCTGGCCAGGTGGCT-3' (GtagM). г ^"пг

GtagF УGtagR р. I ОТ ПЦР +

GtagM GtagMF

2 С

GtagalphaF jj от щр Gtagmyc

Рис. 1. Стратегия клонирования кДНК гена tagL. Заштрихованный прямоугольник обозначает область гомологии с Tag7.

Было проанализировано 8 клонов. Оказалось, что все они относятся к варианту, отличающемуся от первоначально выбранного варианта последовательности фрагмента кДНК. Различия затрагивали только первые 60 нуклеотидов, что может быть результатом альтернативного сплайсинга 5' области мРНК. После этого стало возможным определить полную нуклеотидную последовательность кДНК гена, получившего название tagL. Клонирование кодирующей области кДНК осуществлялось методом ОТ-ПЦР на мРНК из тимуса мыши. Все амплифицированные фрагменты кДНК клонировались в плазмидный вектор pBlueScript II SK(-). Нуклеотидная последовательность определена по методу Сенгера (Рис. 2).

1 gtgaggtaag садсЪ^сЪс caacagaagt ЪссЬсЬсЬсс Ъсаааддссс 51 agagtgtcca ддссаассаа с^дассаада а1;ЪасаасЛд ctgaaact

1 61 121

181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141

1201 1261 1321 1381

1441 1501 1561 1621 1681

6 1741 1801 асасаассЪЪ асс-Ьсдс^дд ддЬдас^дсд асаддЪЪааЪ Ъс-ЬсаЪдс-Ьс с^а'Ьсс'ЬссЪ адддссЬ.ссд aggttctctg сйддд-ЬсЪдЪ дсссЪддаас ctggggtgcc ctctggatcg 1:дс1Ъдда^ gctgctgtgg ctccttgcct accagtgact cacccacaat gccagatcct сдаЪд!асад ЪдЪдаадссЪ дсс^садаЪ сассЬддсса tttaccaaac ддсЪддЪдас дддаас^дад ccaggcatcc даассасЬЬд ctatggagct acagaaactg ддЬадссасс cccccgctgc acttggattc дадсЪдсдсс 1;дасаЪсддс дсасЪдддЪа дддсаасЪас сссдадсдса gctagtgctc cttcacagag сЪс ctgctcatgg даддссадса tcccttcacc сасЪз'Ьс'Ьса aatgggcggg ctgctgtttg tgtctggcta ggactcatgg дасааадсса ЪЬадд^Ъда ggctgctggg aggctcacca адссаааЪсс ggggtgaatg асЪЪсадссс дадссадаас ЬЪддсЪасса cgttggggag ttatatgtgc дссдаЪа1^дс tacag

-ЬЬ-Ьсд ддЪдсдсаса ас^дддЬсас attcgcgcag асссасЪдсс gt

ЪдаааасЪ gatcctttga actccatcat Ьсас1:дсс1;с agcgcttgct gcccggagct aatatggagt ддс1ададдс tcccctgtga atgcttttcc адасЬсссас сс^ссЪсса ассадсЪЪас •Ьддс'Ь'Ь'ЬссЬ сЪаддсссса gagatccggt сЪасссЪддс acctacagtt aggagttcac ссаддсссЪ! tgcatggatt дсЪдааддса tcaagcaGtg ggtgctggca сддЪсЪасад tactggagac aaatgcctct сас^дЬддас саддЪсссад Ьдсссссадд caatggtgcc сссассссЪс дЪЬссдаадЪ ccagcaggta goagaacatt tgaggctttc сддсЬсссЪа ссдаддссас аЪсасасаЪа сд!дссадсд gctccatgca gcgtttccac tggtaggctc сасдсддс!а 1;дсссаасда gtctcttgcg ссдддаасдс сдасддсЪаЬ саасЪсссдс адсЬдсдсЪд gccagactac gctcttcaac tggagaccca ссададссад gctgaacttg сЪд!:садсса ссаадссаса а1^1;1:с1дадд сс1даЪддсЪ дсасасадсд асс^ддсса tctccagatg адасЪссЪдд асЪЪддадЬс д'ЬсЬ'Ьсасас ttagatggag адссасс^дс аас^ссдаа Ъдддаддссс адосаададс с'Ьддд atgcc ссаасассас ccaccctgca саддаЪдЪдс сЬдЬассадд ддсЪ-ЬсддЪд аасасддЪдс аадс!дсЪЪд ttgctgcgca ссЭ. "Ьфааддс дд дсадссЪс адсааааддЪ адаасЬссад асасЪасада tggctcaaca ссассдЪадс ttgctaactt atattagagc ^ддадссас caatcacGtt otccaggact tgttggaccc сЬсЪсс^дд ЬаадададЪа ддсадаасдд ttgtcctgtt. agctggctca садссаЬ'Ь.са ЬссддсЬдсс ссассЬ^сса gcaagtggga gccgtggctg tggccttcgt дсдасдсдсЪ дссассдсса ссЪддссЪса аадаасЪсс^ ^дададасс дсаассасад ассЬссааЪа cttgaagatc саддаддЪаЬ аадддассас tgaaagaaat

Рис. 2. Полная нуклеотидная последовательность мышиного гена tagL с учетом экзон-интронной организации. Подчеркнута часть второго экзона, отсутствующая в сплайс-вариантах а' и р\ В остальных сплайс-вариантах отсутствует первый экзон. Жирным шрифтом отмечен старт трансляции.

Анализ клонированных сплайс-вариантов гена tagL.

При клонировании полноразмерной кДНК были обнаружены пять различных сплайс-вариантов гена tagL (Рис. 3.). Сплайс-вариант tagL-a имеет длину 1803 п.н., вероятный старт трансляции, удовлетворяющий критерию Козак, находится на расстоянии 113 п.н. от 5' конца мРНК.

Рис 3. Сплайс-варианты гена tagL. Прямоугольниками обозначена транслируемая область мРНК. Закраска прямоугольника указывает на изменения в рамке трансляции.

Размер белка TagL-a составляет 529 аминокислот. Область гомологии с Tag7 находится на С-конце TagL-a. Сплайс-варианты tagL-a и tagL-a' отличаются только в некодирующей 5' области мРНК, и, вследствие этого, кодируемые белки идентичны. Сплайс-вариант tagL-(3' отличается от tagL-a' делецией длиной 87 п.н., не меняющей рамку трансляции. Сплайс-варианты tagL-y и tagL-6 отличаются от tagL-a делециями длиной 127 п.н. и 338 п.н. соответственно, сдвигающими рамку трансляции. Компьютерный анализ базы данных NCBI выявил EST клоны, относящиеся к дополнительным сплайс-вариантам tagL-s, a а т. отличающемуся от tagL-a делецией длиной 295 п.н., и tagL-\i отличающемуся от tagL-a делецией длиной 131 п.н. Таким образом, только TagL-a (TagL-a') и TagL-(3' обладали гомологией с белком Tag7. Идентичность аминокислотных последовательностей мышиного tagL-a и аналогов tag7 составляла 32% для мыши, 35% для человека и 38% для трех различных видов насекомых, в то же время гомология составляла около 55% (Рис. 4). Лизоцим фага Т7, обладающий также гомологией с Tag7, идентичен TagL-a на 28%. Как видно из рисунка 4, существуют участки, консервативные для всех представленных последовательностей. Кроме этого, последовательность TagL-a наиболее близка с аналогами Tag7 насекомых. Эти данные свидетельствуют о филогенетической древности tagL, и на их основании tagL-a и tag7 можно отнести к одному семейству генов, обладающих лизоцим-подобным доменом.

Компьютерный анализ TagL-a предсказал потенциальное наличие двух трансмембранных участков: с 1 по 22 и с 198 по 218 аминокислоту, направленных во внутрь и наружу клетки соответственно. Первый участок относился к потенциальному лидерному пептиду, который может подвергаться процессингу. При такой организации в цитоплазматической области TagL-a компьютерный анализ показал наличие одного вероятного участка фосфорилирования протеинкиназы С (серин в положении 58) и трех участков фосфорилирования казеиновой киназы II (треонин 82, 193 и серин 176). Участок гомологии с Tag7 в таком случае находится во внеклеточном пространстве.

Длина предполагаемого белка TagL-5 составляет 414 аминокислот, вследствие сдвига трансляционной рамки TagL-б не обладает гомологией с Tag7. Анализ белковой последовательности выявил участок в 16 аминокислот, гомологичный фрагментам рецепторов CD69 мыши и человека (Рис. 5). CD69 является трансмембранным рецептором II типа и играет важную роль в биологии клеток гематопоэтического происхождения, в частности, он принимает участие в регуляции эффекторных функций Т лимфоцитов [21,22]. Область гомологии CD69 с TagL-5 относится к структурно-консервативной а-спиральной области [23]. Несмотря на все попытки, специфический лиганд к CD69 все ещё не обнаружен. Таким образом, TagL-5 может оказаться одним из неизвестных участников сигнального пути связанного с CD69. Недавно были опубликованы нуклеотидные последовательности пяти новых генов дрозофилы, являющихся пептидокликан-распознающими белками. Гомология белковых продуктов этих генов составляет от 27 до 60 % с белком TagL-a, при полном отсутствии гомологии по нуклеотидной последовательности. Гомологов этих генов к настоящему времени у млекопитающих не обнаружено. Это лишний раз говорит о возможном функционировании TagL в качестве паттерн-распознающего рецептора, узнающего пептидогликаны. В отличие от дрозофилы, у млекопитающих кроме врожденного есть еще и приобретенный иммунитет, хотя между ними и не существует четких границ. Вероятно, в процессе эволюции иммунной системы необходимость в большом разнообразии пептидогликан-распознающих белков отпала в связи с возникновением других, более совершенных систем защиты. В результате сохранились только наиболее универсальные компоненты, вписавшиеся в более сложные системы иммунной защиты организма.

Была проведена оценка вероятных молекулярных масс белковых продуктов различных сплайс-вариантов гена tagL исходя из их химического состава. Результаты приведены в таблице 1.

TagL-a TagL-|3 TagL-5 TagL-y TagL-s TagL-(а

57,6 кДа, 54,5 кДа 44,6 кДа 41,1 кДа 49,1 кДа 40,6 кДа

Таблица 1. Вероятные молекулярные массы белковых продуктов различных сплайс-вариантов мышиного гена tagL.

Изучение экспрессии гена tagL в нормальных тканях мыши.

Была изучена экспрессия гена tagL в различных органах мыши посредством Нозен-блот гибридизации с образцами полиА-РНК (Рис. 6.). На каждую дорожку было нанесено по 5 мкг полиА-Р/Ж Транскрипт tagL детектировался в тимусе, селезенке и печени, и не обнаруживался в мозге, почках и сердце. Компьютерный поиск в базе данных NCBI выявил EST клоны, полученные также из легких, CD4+ лимфоцитов, молочной железы. В тимусе и селезенке присутствует транскрипт большей молекулярной массы, который, вероятно, является еще одним сплайс-вариантом. Надо отметить, что уровень экспрессии tagL довольно низкий и при использовании для гибридизации суммарной РНК находится за пределами чувствительности метода.

Рис. 6. Нозерн-блот гибридизационный анализ полиА-РНК, выделенной из различных органов мыши с a3!-[dATP] меченным фрагментом кДНК мышиного гена tagL.

Мышиный ген tagL имеет своего человеческого гомолога.

Чтобы выявить, присутствует ли в составе генома человека гомолог мышиного гена tagL был проведен Саузерн-блот гибридизационный анализ образцов геномной ДНК мыши и человека с пробой кДНК tagL мыши. Геномная ДНК подвергалась обработке рестрикционными эндонуклеазами (EcoR I и EcoR I + Hind III). После разделения образцов ДНК в 0.9 % агарозном геле (с нагрузкой по 20 мкг образца ДНК на каждую дорожку) и переноса на нейлоновую мембрану Hybond-N была проведена гибридизация с a32[dATP]- меченой пробой кДНК tagL мыши (Рис. 7) Полученные результаты показали, что существует человеческий аналог мышиного гена tagL, обладающий с ним высокой степенью гомологии. Как впоследствии показали результаты компьютерного анализа, идентичность нуклеотидных последовательностей составляет 83%. Подобная эволюционная консервативность гена tagL свидетельствует о его функциональной значимости.

Рис. 7. Саузерн-блот гибридизационный анализ образцов геномной ДНК мыши и человека с a"[dATP]- меченой пробой кДНК tagL мыши.

Изучение геномной организации гена tagL.

С целью идентификации геномной копии tagL была проанализирована геномная библиотека полученная из ДНК мыши линии 129/Svj. Гибридизационный анализ с а 32 d[ATP]-меченой пробой кДНК tagL мыши позволил идентифицировать несколько положительных клонов. Было обнаружено несколько фрагментов ДНК, характеризующиеся гибридизационным сигналом. Они были субклонированы в плазмидный вектор pBluescript II (SK-). Их нуклеотидная последовательность была определена по методу Сенгера с помощью набора внутренних праймеров к кДНК tagL мыши. Впоследствии, в базе данных NCBI были обнаружены нуклеотидные последовательности генома мыши (АС073765) и человека (АС01492), содержащих ген tagL. Это позволило уточнить данные о геномной структуре гена tagL мыши, а также построить геномную карту его человеческого аналога. Ген tagL мыши состоит из 6 экзонов (Рис. 8). Первый экзон относится к некодирующей области, и был обнаружен только в сплайс-вариантах tagL-a и tagL-fi. В этих сплайс-вариантах отсутствует часть второго экзона. В остальных полученных сплайс-вариантах первый экзон полностью отсутствует, зато присутствует полностью второй экзон. Таким образом, различия в 5' некодирующей области сплайс-вариантов возникают вследствие альтернативного сплайсинга. Это может быть результатом функциональной значимости первого интрона и двух первых экзонов для регуляции транскрипции и

Мышь

1 экзон 2 экзон 3 экзон 4 экзон 5 экзон 6 экзон

96 176 1017 211 299 100

ШП п И

1050 211 300 101

1 Т.П.Н.

Рис. 8. Геномная структура гена tagL мыши и человека трансляции гена tagL. Область гомологии с геном tagL находится в четвертом и пятом экзонах. На схеме также представлены сплайс-варианты гена tagL. Как видно из рисунка 8, участки альтернативного сплайсинга находятся внутри третьего, четвертого и пятого экзонов. Экзоны гена tagL человека точно соответствуют экзонам tagL мыши. Однако, так как 5' конец мРНК гена tagL человека еще не определен, пока нельзя ничего сказать о существовании 1 и 2 экзонов.

Полная нуклеотидная последовательность мышиного гена tagL.

Анализ нуклеотидной последовательности сплайс-вариантов и анализ геномной структуры гена tagL позволил определить его полную нуклеотидную последовательность (Рис. 2).

Гены tagL и tag 7 человека локализованы на 19 хромосоме.

Участок генома, содержащий человеческий ген tagL (АС01492) локализован на 19 хромосоме в локусе 19р 13.1 на расстоянии 15,5 млн. п.н. от р-теломеры. Была также обнаружена нуклеотидная последовательность фрагмента человеческого генома, содержащая ген tag! (АС007785), локализованная также та 19 хромосоме в локусе 19ql3.3 на расстоянии 51 млн.п.н. от р-теломеры. Таким образом, расстояние между человеческими генами tagL и tag7 составляет 35,5 млн.п.н. (Рис. 9). Ранее было установлено, что мышиный tag7 локализован в области синтении с 19 хромосомой человека на 7 хромосоме, в районе 7АЗ, генетически ассоциированным с таким аутоиммунным заболеванием, как системная красная волчанка. Было предположено, что tag7 и tagL колокализованы на 7 хромосоме. Был исследован фрагмент генома мыши, размером 80 т.п.н., прилегающий к гену tag7, однако ген tagL не был обнаружен. После определения хромосомной локализации гена tagL человека, обнаружено, что большинство мышиных аналогов человеческих генов, расположенных в локусе 19р13.1, локализованы на 8 хромосоме мыши. Таким образом, локализация мышиного гена tagL наиболее вероятна также на 8 хромосоме.

Получение рекомбинантного белка TagL и антител к нему.

Для получения рекомбинантного белка TagL (rTagL) кодирующая

часть кДНК tagL была амплифицирована путем ОТ-ПЦР с полимеразой Pfu I на мРНК, полученной из тимуса мыши. Продукт амплификации был клонирован в вектор pQE31 (Qiagen) и была проверена его первичная последовательность с использованием внутренних специфических праймеров. Экспресированный полипептид, кодируемый плазмидой pQE31-tagZ, должен был содержать аминокислотную последовательность белка TagL с 6 остатками гистидина на N-конце полипептидной цепи, которые могли быть использованы для очистки рекомбинантного белка из лизата клеток Е. coli с помощью металло-хелатной аффинной хроматографии на Ni-агарозе (Qiagen) в качестве носителя. Однако, несмотря на использование различных условий индукции, получить полноразмерный рекомбинантный белок TagL не удалось. Видимо, это связано с токсичностью белкового продукта гена TagL для бактерий. Тогда из экспрессионной конструкции была удалена область гомологии гена tagL с tag7 и лизоцимом фага Т7. После этого в стандартных условия была получена экспрессия рекомбинантного фрагмента белка Та§Ь (Та§ЬРАЯТ). Очистка Та§ЬРАЯТ проводилась в денатурирующих условиях. Очищенный рекомбинантный белок обладал молекулярным весом около 36 кДа, что соответствовало ожидаемому размеру продукта экспрессии (данные не приведены). Раствор очищенного ТавЬРАЯТ в использовался для иммунизации кролика. Полученная поликлональная антисыворотка к белку Та§ЬРАЯТ обладала способностью специфически узнавать как рекомбинантный, так и нативный белок TagL (Рис. 10). Нативный белок TagL был детектирован в лизатах клеток линии ВНК и А11Н-77 и не детектировался в клеточной линии ANA-l. Молекулярная масса нативного белка TagL, определенная по подвижности в ДСН-ПААГ составила 57 кДа, что совпало с предсказываемой, исходя из химического состава молекулярной массой. В человеческой В-лимфобластоидной клеточной линии АЯН-77 также детектировался белок размером 30 кДа. Среди предполагаемых белковых продуктов обнаруженных нами мышиных сплайс-вариантов нет белка с такой молекулярной массой, по видимому, человеческие сплайс-варианты гена tagL отличаются от мышиных.

Локализация белка Та^Ь в клетках линии ВНК.

Ранее было предсказано наличие трансмембранных участков в белке TagL, что говорит о его возможной мембранной локализации. Для определения локализации белка TagL в клеточной линии ВНК было проведено фракционирование клеточного лизата центрифугированием в градиенте сахарозы, с последующим Вестерн-блот анализом полученных фракций (Рис. 11). Локализация TagL была обнаружена только во фракции внутриклеточных мембран. В супернатанте клеточной линии ВНК TagL не был обнаружен, т.е в данной модельной системе TagL не является секретируемым. Внутриклеточная локализация не исключает возможного участия TagL в распознавании и презентации ПГ, так как подобная картина наблюдается для некоторых белков, вовлеченных в антимикробный иммунный ответ. Например, рецептор CD lb, относящийся к группе молекул CD1, презентирующих Т клеткам гликолипидные антигены [110,111], локализуется в поздних эндосомо-лизосомальных везикулах, в которых также происходит связьгвание с антигена с молекулами МНС класса II [112-115]. Таким образом, TagL может играть роль внутриклеточного рецептора ПГ.

Влияние различных агентов на секрецию белка TagL в клетках иммунной системы мыши и человека.

Экспрессия ряда белков, секретируемых различными клетками иммунной системы, например, фактора некроза опухоли (ФНО), лимфотоксина (ЛТ),а также гена tag7 может быть индуцирована различными агентами, такими как фетогемагглютенин (ФГА), липополисахарид (ЛПС), интерлейкин-2 (ИЛ-2) и другими. Так как экспрессия tagL наблюдается в органах иммунной системы, было проведено исследование характера изменения экспрессии белка TagL в клетках иммунной системы мыши и человека в ответ на обработку различными индукторами (Рис. 12). Первоначально было обнаружено, что в периферических человеческих лимфоцитах наблюдается индукция секреции иммунореактивных с антителами к TagL белков трех различных молекулярных масс: 57, 40 и 30 кДа при обработке ФГА, и не наблюдается при обработке ИЛ-2 и ЛПС (Рис 12А). ФГА - это поликлональный активатор антиген-специфического Т-клеточного ответа. Механизм его действия опосредован связыванием с антиген-распознающими Т -клеточными рецепторами. Взаимодействие ФГА с Т-клеточными рецепторами вызывает бластотрансформацию и последующую пролиферацию, что является моделью поликлонального антиген-индуцируемого Т-клеточного ответа. Таким образом, возможно предположить, что TagL вовлечен в антиген-специфический иммунный ответ и является компонентом приобретенного иммунитета. Также было обнаружено, что первичная культура спленоцитов мыши секретитует белок TagL (57 кДа) в кондиционную среду, причем обработка различными агентами не влияет на уровень секреции (Рис. 12Б). Секреции белков с другими молекулярными массами первичными культурами мышиных спленоцитов не было обнаружено. Так как было известно, что ген tag7, гомолог гена tagL, вовлечен во врожденный иммунитет и экспрессируется в нейтрофилах, мы также проверили наличие в нейтрофилах белка TagL. В содержимом гранул нейтрофилов, полученных при инкубации с ФМА и иономицином, были обнаружены белки размером 57 и 40 кДа (Рис. 12В). Нейтрофилы являются первым звеном антиген-независимой, неспецифической защиты организма. Таким образом, TagL может быть вовлечен как в антиген-специфичный, так и неспецифический иммунный ответ.

Сравнительный анализ экспрессии белка TagL под действием ФГА в лимфоцитах человека и линии человеческой Т-клеточной лимфомы 1игкаи

Было обнаружено, что периферические лимфоциты человека секретируют TagL под действием ФГА. Тогда был проведен сравнительный Вестерн-блот анализ экспрессии ТщЬ в лимфоцитах и линии человеческой Т-клеточной лимфомы 1игка1 (Рис. 13). Белки размером 57 и 40 кДа были детектированы в клеточных лизатах как стимулированных, так и не стимулированных лимфоцитов и клеток 1игка1;. В лизатах не стимулированных клеток линии 1игкаг детектируется гораздо более высокий уровень экспрессии ТаяЬ, чем в лизатах стимулированных клеток, в клеточных лизатах лимфоцитов не наблюдается различия при стимуляции ФГА. После обработки ФГА в супернатанте клеток Лика! детектируется белок размером 30 кДа, в то время как в супернатанте лимфоцитов детектируются белки размером 57, 40 и 30 кДа. Был проведен Вестерн-блот анализ супернатанта человеческих Т лимфоцитов, стимулированных ФГА (Рис. 14). В нем также детектировался только белок размером 30 кДа. Полученные результаты говорят о том, что секреция белка размером 30 кДа осуществляется Т лимфоцитами. Секреция белков 57 и 40 кДа может осуществляться В лимфоцитами и НК клетками, а может быть результатом комплексной стимуляции, так как содержание различных цитокинов в кондиционной среде отличается вследствие их секреции разными клетками. Нельзя исключать возможность, что секреция также кДа

Рис. 13. Вестерн-блот анализ экспрессии белка TagL в клеточных лизатах и супернатанте лимфоцитов и клеточных линий лимфоидного происхождения. А. Экспрессия белка TagL в клеточных лизатах и супернатанте человеческих лимфоцитов обработанных ФГА Б. Экспрессия белка TagL в клеточных лизатах и супернатанте клеток линии ,1игк^ обработанных ФГА.

Рис. 15. Иммуногистохимический анализ белка TagL на парафиновых срезах А) тимуса Б) легкого и В) печени мыши. Для анализа использовались поликлональные антитела к белку TagLPART и вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой. Детекция иммобилизованной пероксидазы (отмечена стрелками) проводилась с использованием SIGMA FAST DAB с металлическим усилителем. Контрольные гибридизации срезов без первичных антител(данные не приведены) были отрицательными. интенсивное окрашивание стенок альвеол (Рис. 15Б). В печени детектировалось диффузное окрашивание вокруг сосудов (Рис. 15В). В тимусе и легком наблюдается сходная картина экспрессии белка Tag7. В мышином тимусе также наблюдается окрашивание отдельных клеток. В легких человека было обнаружено интенсивное окрашивание альвеолярного эпителия и эндотелиальных клеток. Сходная локализация экспрессии белков TagL и Tag7 свидетельствует о возможном кооперативном действии этих двух белков, в котором Tag7 играет может роль секретируемого компонента, a TagL непосредственно принимать участие в распознавании ПАМП и передаче внутриклеточного сигнала. Учитывая высокую эволюционную консервативность семейства генов tagL и tag7, полученные результаты говорят о их важной роли в иммунном ответе млекопитающих

Выводы.

1. Впервые проведено клонирование нового гена tagL с помощью компьютерного анализа базы данных.

2. Впервые клонирована кДНК, кодирующая ген tagL и его возможные сплайс-варианты.

3. tagL и tag7 принадлежат к одному семейству генов млекопитающих. Показана гомология белка, кодируемого одним из сплайс-вариантов гена tagL и CD69, принимающим участие в иммунном ответе.

4. Показано, что экспрессия TagL связана с клетками и органами иммунной системы, обнаружена секреторная форма белка.

5. Характер экспрессии указывает на то, что TagL принимает участие как в антиген-специфическом, так и в неспецифическом иммунном ответе.

Список литературы.

1. Fearon Т. D. and Locksley R.M., " The Instructive Role of Innate

Immunity in the Acquired Immune Response", Science, 1996, v.272, April 5, 50-53.

2. Medzhitov R. and Janeway Ch.A., "An ancient system of host defense", Current Opinion in Immunology, 1998, v.10, 12-15.

3. Medzhitov R. and Janeway Ch.A., "Innate immunity: impact on the adaptive immune response", Current Opinion in Immunology, 1997, v.9, 49.

4. Абелев Г.И., "Взаимодействие врожденного и приобретенного иммунитета в защите организма от инфекции", Соросовский образовательный журнал, 1998, п. 2, 52-58.

5. Poccia F., Cipriani В., Vendetti S., Colizzi V., Poquet Y., Battistini L., Lopez-Botet M., Fournie J. J., Gougeon M.L., "CD94/NKG2 inhibitory receptor complex modulates both anti-viral and anti-tumoral responses of polyclonal phosphoantigen reactive V gamma 9V delta 2 T lymphocytes", J. Immunol. 1997, December 15, 159 (12), 6009-6017.

6. Rhen M, Eriksson S, Pettersson S "Bacterial adaptation to host innate immunity responses." Curr Opin Microbiol 2000 Feb;3(l):60-4.

7. Ikeda, K., Sannoh, Т., Kawasaki, N., Kawasaki, Т., and Yamashina, I. "Serum lectin with known structure activates complement through the classical pathway",(1987) J. Biol. Chem. 262, 7451-7454

8. Super, M., Levinsky, R. J., and Turner, M. W. "The level of mannan-binding protein regulates the binding of complement-derived opsonins to mannan and zymosan at low serum concentrations", (1990) Clin. Exp. Immunol. 79, 144-150

9. Kuhlman, M., Joiner, K., and Ezekowitz, R. A. B. "The human mannose-binding protein functions as an opsonin", (1989) J. Exp. Med. 169, 17331745

10.Weis W. I., Drickamer K., Hendrickson W. A., "Structure of a C-type mannose-binding protein complexed with an ligosaccharide", Nature (1992), 360, 127-134

11. Ezekowitz R. A., Sastry K., Bailly P., Warner A., "Molecular characterization of the human macrophage mannose receptor: demonstration of multiple carbohydrate recognition-like domian and phagocytosis of yeasts in Cos-1 cells" // J. Exp. Med. (1990), 172, 17851794

12. Kim S. J., Ruitz N., Bezouska K., Drickamer K., "Oranisation of the gene encoding the human macrophage mannose receptor (MRC1)" // Genomics (1992), 14, 721-727

13. Martinez-Pomares L., Mahoney J.A., Kaposzta R., Linehan S.A., Stahl P.D., Gordon S., "A functional soluble form of the murine mannose receptor is produced by macrophages in vitro and is present in mouse serum" // J. Biol. Chem. (1998), 273, 23376-23380

14. Stahl P. D., Ezekowitz R. A., "The mannose receptor is a pattern recognition receptor involved in host defense" // Curr. Opin. Immunol. (1998), 10, 50-55

15. Koziel H., Eichbaum Q., Kruskal B.A., Pinkston P., Rogers R.A., Armstrong M.Y.K., Richards F.F., Rose R.M, Ezekowitz R.A.B, "Reduced Binding and Phagocytosis of Pneumocystis carinii by Alveolar Macrophages from Persons Infected with HIV-1 Correlates with Mannose Receptor Down regulation" // J. Clin. Invest. (1998), 102, 1332-1344

16. Schreiber S., Blum J. S., Stenson W. F., McDermott R. P., Stahl P. D., Teitelbaum S. L.,Perkins S. L., "Monomeric IgG2 promotes maturation of bone-marrow macrophage and expression of the mannose receptor" // Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), 88, 1616-1620

17.Yamamoto Y., Klein T. W., Friedman H., "Involvment of mannose receptor in cytokine interleukin-lbeta (IL-lbeta), IL-6, and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor responses, but not in chemokine macrophage infammatory protein lbeta (MIP-lbeta), MIP-2, and KC responses, caused by attachment of Candida abligans to macrophage" // Infect. Immun. (1997), 65, 1077-1082

18. Shibata Y., Metzger W. J., Myrvik Q. N., "Chitin particle-induced cellmediated immunity is inhibited by soluble mannan: mannose receptor-mediated phagocytosis initiates IL-12 production" // J. Immunol. (1997), 159, 2462-2467

19. Murai M., Aramaki Y., Tsuchiya S., "Contribution of mannose receptor to signal transduction in Fc gamma receptor-mediated phagocytosis of mouse peritoneal macrophage induced by liposomes" // J. Leukoc. Biol. (1995), 57, 687-691

20. Linehan S.A., Martinez-Pomares L., Stahl P.D., Gordon S., "Mannose receptor and its putative ligands in normal murine lymphoid and nonlymphoid organs: In situ expression of mannose receptor by selected macrophages, endothelial cells, perivascular microglia, and mesangial cells, but not dendritic cells" // J. Exp. Med. (1999), 189, 1961-1972

21.Marzio R., Mauel J., Betz-Corradin S., "CD69 and regulation of the immune function" // Immunopharmacol Immunotoxicol (1999), 21, 565582

22. Borrego F., Robertson M. J., Ritz J., Pena J., Solana R., "CD69 is a stimulatory receptor for natural killer eel and its cytotoxic effect is blocked by CD94 inhibitory receptor" // Immunollogy (1999), 97, 159-165

23. Bajorath J., Aruffo A., "Molecular model of the exstracellular lectin-like domain in CD69" // J. Biol. Chem. (1994), 269, 32457-32463

24. Crispin J. C., Martinez A., de Pablo P., Velasquillo C., Alcocer-Varela J., "Participation of the role CD69 antigen in the T-cell activation process of patients with systemic lupus erytheromatosus" // Scand. J. Immunol. (1998), 48, 196-200

25. Ishikawa S., Akakura S., Abe M., Terashima K., Chijiiwa K., Nishimura H., Hirose S., Shirai T., "A subset of CD4+ T cells expressing early activation antigen CD69 in murine lupus: possibile abnormal regulatory role for cytokine imballance" //J. Immunol. (1998), 161, 1267-1273

26.Takei, F., Brennan, J., and Mager, D. L. (1998) Immunol. Rev. 155, 67-77

27. Brennan J., Takei F., Wong S., Meger D. L., "Carbogydrate recognition by a natural killer cell receptor Ly-49C" // J. Biol. Chem. (1995), 270, 96919694

28.Arnaout, M. A. "Structure and function of the leukocyte adhesion molecules CD11/CD18." (1990) Blood 75, 1037-1050

29. Rieu, P., Arnaout, M. A. (1996) Adhesion Molecules and the Lung (Ward, P. J., Fantone, C., eds) , Vol 89, p. 1, Marcel Dekker Inc., New York

30. Serrander L., Larsson J., Lundqvist H., Lindmark M., Fallman M., Dahlgren C., Stendahl O., "Particles binding beta(2)-integrins mediated intracellular production of oxidative metabolites in human neutrophils independently of phagocytosis" // Biochim, Biophys. Acta. (1999), 1452, 133-144

31.Bendelac A. and Fearon D.T., "innate Immunity. Innate pathway that control acquired immunity", Current Opinion in Immunology", 1997, v.9, 1-3.

32. Dinarello C.A., "A THl-inducing, proinflammatory cytokine and new member of the IL-1 family"., J. Allergy Clin. Immunol., 1999, January, n.103, 11-24.

33. Muzio M., Ni J., Fend P., Dixit V.M., "IRAK (Pelle) Family Member IRAK-2 and MyD88 as Proximal Mediators of IL-1 Signaling", Science, 1997, November 28, v.278, 1612-1615.

34. Yanagata M., Merkie, J.P., and Sanes J.R., "Interspecific comparisons reveal conserved features of the Drosophila Toll protein", Gene, 1994, n. 139, 223-228.

35. Medzhitov R., Preston-Hurlburt P. and Janeway Ch. A., "A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity", Nature, 1997, July 24, v.388, 394-397.

36. Mitcham J.M., Parnet P., Bonnert T.P., Garka K.E., Gerhart M.J., Slack J.L., Gayle M.A., Dower S.K. , and Sims J.E., "T1/ST2 Signaling Establishes It as a member of an Expanding Interleukin-1 Receptor Family", JBC, 1996, n.10, v.271, March 8, 5777-5783.

37.Taguchi T., Mitcham J.L., Dower S.K. , Sims J.E., and Testa J.R., "Chromosomal Localization of TIL, a Gene Encoding a Protein Related to the Drosophila Transmembrane Receptor Toll, to Human Chromosome 4pl4", Genomics, 1996, n.32, 486-488.

38. Chaudhary P.M., Ferguson C., Nguyen V., Nguyen O., Massa H.F., Eby M., Jasmin A., Trask B.J., Hood L., and Nelson P.S., "Cloning and Characterization of Two Toll/Interleukin-1 Receptor-Like Genes TIL3 and TIL4: Evidence for a Multi-Gene Receptor Family in Humans", Blood, 1998, n.ll, June 1, v.91, 4020-4027.

39. Rock F.L., Hardiman G., Timans J.C., Kastelein R.A., and Bazan J.F., "A family of human receptors structurally related to Drosophila Toll", PNAS, 1998, January, v.95, 588-593.

40. Hultmark D., "Macrophage differentiation marker MyD88 is a member of the Toll/IL-1 receptor family", 1994, February 28, v. 199, n. 1, 144-146.

41. Hardiman G., Jenkins N.A., Copeland N.G., Gilbert D.J., Garcia D.K., Naylor S.L., Kastelein R.A., and Bazan J.F., "Genetic Structure and Chromosomal Mapping of MyD88", Genomics , 1997, n.45, 332-339.

42. Rietschel ET, Brade H, Holst O, Brade L , Muller-Loennies S, Mamat U, Zahringer U, Beckmann F, Seydel U, Brandenburg K. "Bacterial endotoxin: chemical constitution, biological recognition, host response, and immunological detoxification." Current Topics in Microbiology and Immunology. 1996:39-81.

43. Tobias PS, Soldau K, Ulevitch RJ. "Isolation of a lipopolysaccharide -binding acute phase reactant from rabbit serum." J Exp Med. 1986 Sep l;164(3):777-93.

44. Wright SD, Tobias PS, Ulevitch RJ, Ramos RA. "Lipopolysaccharide (LPS) binding protein opsonizes LPS-bearing particles for recognition by a novel receptor on macrophages." J Exp Med. 1989 Oct 1; 170(4): 1231-41.

45. Schumann RR, Leong SR, Flaggs GW, Gray PW, Wright SD, Mathison JC, Tobias PS, Ulevitch RJ. "Structure and function of lipopolysaccharide binding protein." Science. 1990 Sep 21;249(4975): 1429-31.

46. Wright SD, Ramos RA, Tobias PS, Ulevitch RJ, Mathison JC. CD 14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein. Science. 1990 Sep 21;249(4975): 1431-3.

47. Gray PW, Flaggs G, Leong SR, Gumina RJ, Weiss J, Ooi CE, Elsbach P. Cloning of the cDNA of a human neutrophil bactericidal protein. Structural and functional correlations. J Biol Chem. 1989 Jun 5;264(16):9505-9.

48. Day JR, Albers JJ, Lofton-Day CE, Gilbert TL, Ching AF, Grant FJ, O'Hara PJ, Marcovina SM, Adolphson JL. Complete cDNA encoding human phospholipid transfer protein from human endothelial cells. J Biol Chem. 1994., 269(12):9388-91.

49. Jiang XC, Bruce C, Cocke T, Wang S, Boguski M, Tall AR. Point mutagenesis of positively charged amino acids of cholesteryl ester transfer protein: conserved residues within the lipid transfer/lipopolysaccharide binding protein gene family essential for function. Biochemistry. 1995 May 30;34(21):7258-63.

50. Ulevitch RJ. Recognition of bacterial endotoxins by receptor-dependent mechanisms. Adv Immunol. 1993;53:267-89. Review.

51. Poltorak A, He X, Smirnova I, Liu MY, Huffei CV, Du X, Birdwell D, Alejos E, Silva M, Galanos C, Freudenberg M, Ricciardi-Castagnoli P, Layton B, Beutler B. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 1998 Dec 11 ;282(5396):2085-8.

52. Frey EA, Miller DS, Jahr TG, Sundan A, Bazil V, Espevik T, Finlay BB, Wright SD. Soluble CD 14 participates in the response of cells to lipopolysaccharide. J Exp Med. 1992 Dec 1; 176(6): 1665-71.

53. Pugin J, Schurer-Maly CC, Leturcq D, Moriarty A, Ulevitch RJ, Tobias PS. Lipopolysaccharide activation of human endothelial and epithelial cells is mediated by lipopolysaccharide-binding protein and soluble CD 14. Proc Natl Acad Sei USA. 1993 Apr l;90(7):2744-8.

54. Jack RS, Fan X, Bernheiden M, Rune G, Ehlers M, Weber A, Kirsch G, Mentel R, Furll B, Freudenberg M, Schmitz G, Stelter F, Schutt C.

Lipopolysaccharide-binding protein is required to combat a murine gramnegative bacterial infection. Nature. 1997 Oct 16;389(6652):742-5.

55. Wurfel MM, Monks BG, Ingalls RR, Dedrick RL, Delude R, Zhou D, Lamping N, Schumann RR, Thieringer R, Fenton MJ, Wright SD, Golenbock D. Targeted deletion of the lipopolysaccharide (LPS)-binding protein gene leads to profound suppression of LPS responses ex vivo, whereas in vivo responses remain intact. J Exp Med. 1997 Dec 15;186(12):2051-6.

56. Haziot A, Ferrero E, Lin XY, Stewart CL, Goyert SM. CD14-deficient mice are exquisitely insensitive to the effects of LPS. Prog Clin Biol Res. 1995;392:349-51.

57. Grunwald U, Fan X, Jack RS, Workalemahu G, Kallies A, Stelter F, Schutt C. Monocytes can phagocytose Gram-negative bacteria by a CD14-dependent mechanism. J Immunol. 1996 Nov 1;157(9):4119-25.

58. Schiff DE, Kline L, Soldau K, Lee JD, Pugin J, Tobias PS, Ulevitch RJ. Phagocytosis of gram-negative bacteria by a unique CD14-dependent mechanism. J Leukoc Biol. 1997 Dec;62(6):786-94.

59. Sultzer BM. Genetic control of leucocyte responses to endotoxin. Nature. 1968 Sep 21;219(160): 1253-4.

60. Watson J, Riblet R, Taylor BA. The response of recombinant inbred strains of mice to bacterial lipopolysaccharides. J Immunol. 1977 Jun;118(6):2088-93.

61.Coutinho A, Meo T. Genetic basis for unresponsiveness to lipopolysaccharide in C57BL/10Cr mice. Immunogenetics. 1978, 7:17-24.

62. O'Brien AD, Rosenstreich DL, Scher I, Campbell GH, MacDermott RP, Formal SB. Genetic control of susceptibility to Salmonella typhimurium in mice: role of the LPS gene. J Immunol. 1980 Jan;124(l):20-4.

63. Rosenstreich DL, Weinblatt AC, O'Brien AD. Genetic control of resistance to infection in mice. Crit Rev Immunol. 1982 Jun;3(4):263-330. Review.

64. Poltorak A, Smirnova I, He X, Liu MY, Van Huffel C, McNally O, Birdwell D, Alejos E, Silva M, Du X, Thompson P, Chan EK, Ledesma J, Roe B, Clifton S, Vogel SN, Beutler B. Genetic and physical mapping of the Lps locus: identification of the toll-4 receptor as acandidate gene in the critical region. Blood Cells Mol Dis. 1998 Sep;24(3):340-55

65. Qureshi ST, Lariviere L, Leveque G, Clermont S, Moore KJ, Gros P, Malo D. Endotoxin-tolerant mice have mutations in Toll-like receptor 4. J Exp Med. 1999 Feb 15;189(4):615-25.

66. Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, Sanjo H, Ogawa T, Takeda Y, Takeda K, Akira S. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product. J Immunol. 1999 Apr l;162(7):3749-52.

67. Takeuchi O, Hoshino K, Kawai T, Sanjo H, Takada H, Ogawa T, Takeda K, Akira S. Differential roles of TLR2 and TLR4 in recognition of gramnegative and gram-positive bacterial cell wall components. Immunity. 1999 Oct;ll(4):443-51.

68. Bone RC. Gram-positive organisms and sepsis. Arch Intern Med. 1994 Jan 10;154(l):26-34. Review.

69. Dziarski R. Peptidoglycan and lipopolysaccharide bind to the same binding site on lymphocytes. J Biol Chem. 1991 Mar 15;266(8):4719-25.

70. De Kimpe SJ, Kengatharan M, Thiemermann C, Vane JR. The cell wall components peptidoglycan and lipoteichoic acid from Staphylococcus aureus act insynergy to cause shock and multiple organ failure. Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Oct 24;92(22): 10359-63.

71. Ikejima T, Dinarello CA, Gill DM, Wolff SM. Induction of human interleukin-1 by a product of Staphylococcus aureus associated with toxic shock syndrome. J Clin Invest. 1984 May;73(5):1312-20.

72. Ikejima T, Okusawa S, van der Meer JW, Dinarello CA. Induction by toxic-shock-syndrome toxin-1 of a circulating tumor necrosis factor-like substance in rabbits and of immunoreactive tumor necrosis factor and interleukin-1 from human mononuclear cells. J Infect Dis. 1988 Nov;158(5):1017-25.

73. Parsonnet J, Hickman RK, Eardley DD, Pier GB. Induction of human interleukin-1 by toxic-shock-syndrome toxin-1. J Infect Dis. 1985 Mar;151(3):514-22.

74. Jupin C, Anderson S, Damais C, Alouf JE, Parant M. Toxic shock syndrome toxin 1 as an inducer of human tumor necrosis factors and gamma interferon. J Exp Med. 1988 Mar l;167(3):752-6l.

75. Scherer MT, Ignatowicz L, Winslow GM, Kappler JW, Marrack P. Superantigens: bacterial and viral proteins that manipulate the immune system. Annu Rev Cell Biol. 1993;9:101-28. Review

76. Miethke T, Wahl C, Regele D, Gaus H, Heeg K, Wagner H. Superantigen mediated shock: a cytokine release syndrome. Immunobiology. 1993 Nov;189(3-4):270-84. Review.

77. Bohach GA, Fast DJ, Nelson RD, Schiievert PM. Staphylococcal and streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses. Crit Rev Microbiol. 1990; 17(4):251-72. Review.

78. Natanson C, Danner RL, Elin RJ, Hosseini JM, Peart KW, Banks SM, MacVittie TJ, Walker RI, Parrillo JE. Role of endotoxemia in cardiovascular dysfunction and mortality. Escherichia coli and Staphylococcus aureus challenges in a canine model of human septic shock. J Clin Invest. 1989 Jan;83(l):243-51.

79. Roder BL, Eriksen NH, Nielsen LP, Slotsbjerg T, Rosdahl VT, Espersen F. No difference in enterotoxin production among Staphylococcus aureus strains isolated from blood compared with strains isolated from healthy carriers. J Med Microbiol. 1995 Jan;42(l):43-7.

80. Freudenberg MA, Kumazawa Y, Meding S, Langhorne J, Galanos C. Gamma interferon production in endotoxin-responder and -nonresponder mice during infection. Infect Immun. 1991 0ct;59(10):3484-91.

81. Schleifer KH, Kandier O. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications. Bacteriol Rev. 1972 Dec;36(4):407-77. Review.

82. Wakabayashi G, Gelfand JA, Jung WK, Connolly RJ, Burke JF, Dinarello CA. Staphylococcus epidermidis induces complement activation, tumor necrosis factor and interleukin-1, a shock-like state and tissue injury in rabbits without endotoxemia. Comparison to Escherichia coli. J Clin Invest. 1991 Jun;87(6):1925-1935.

83. Card GL, Jasuja RR, Gustafson GL. Activation of arachidonic acid metabolism in mouse macrophages by bacterial amphiphiles. J Leukoc Biol. 1994 Dec;56(6):723-728.

84. Timmerman CP, Mattsson E, Martinez-Martinez L, De Graaf L, Van Strijp JA, Verbrugh HA, Verhoef J, Fleer A. Induction of release of tumor necrosis factor from human monocytes by staphylococci andstaphylococcal peptidoglycans. Infect Immun. 1993 Oct;61(10):4167-72.

85. Dziarski R, Ulmer AJ, Gupta D. Interactions of CD14 with components of gram-positive bacteria. Chem Immunol. 2000;74:83-107. Review.

86. Raetz CR. Biochemistry of endotoxins. Annu Rev Biochem. 1990;59:129-70. Review.

87. Gupta D, Kirkland TN, Viriyakosol S, Dziarski R. CD14 is a cell-activating receptor for bacterial peptidoglycan. J Biol Chem. 1996 Sep 20;271(38):23310-6.

88. Dziarski R, Tapping RI, Tobias PS. Binding of bacterial peptidoglycan to CD14. J Biol Chem. 1998 Apr 10;273(15):8680-90.

89. Weidemann B, Schletter J, Dziarski R, Kusumoto S, Stelter F, Rietschel ET, Flad HD, Ulmer AJ. Specific binding of soluble peptidoglycan and muramyldipeptide to CD14 on human monocytes. Infect Immun. 1997 Mar;65(3):858-64.

90. Cleveland MG, Gorham JD, Murphy TL, Tuomanen E, Murphy KM. Lipoteichoic acid preparations of gram-positive bacteria induce interleukin

12 through a CD14-dependent pathway. Infect Immun. 1996 Jun;64(6):1906-12.

91.Hattor Y, Kasai K, Akimoto K, Thiemermann C. Induction of NO synthesis by lipoteichoic acid from Staphylococcus aureus in J774 macrophages: involvement of a CD14-dependent pathway.

92. Gupta D, Wang Q, Vinson C, Dziarski R. Bacterial peptidoglycan induces CD14-dependent activation of transcription factors CREB/ATF and AP-1. J Biol Chem. 1999 May 14;274(20): 14012-20.

93.Vogel G. Fly development genes lead to immune find. Science. 1998 Sep 25;281(5385): 1942-4.

94. Kirschning CJ, Wesche H, Merrill Ayres T, Rothe M. Human toll-like receptor 2 confers responsiveness to bacterial lipopolysaccharide. J Exp Med. 1998 Dec 7;188(ll):2091-7.

95. Yang RB, Mark MR, Gray A, Huang A, Xie MH, Zhang M, Goddard A, Wood WI, Gurney AL, Godowski PJ. Toll-like receptor-2 mediates lipopolysaccharide-induced cellular signalling. Nature. 1998 Sep 17;395(6699):284-8.

96.Takeuchi O, Hoshino K, Kawai T, Sanjo H, Takada H, Ogawa T, Takeda K, Akira S. Differential roles of TLR2 and TLR4 in recognition of gramnegative and gram-positive bacterial cell wall components.

97. Кустикова, O.C., Киселев, С.Л., Бородулина, O.P., Сенин, В.М., Афанасьева, А. В., Кабишев, А. А. Клонирование гена tag7, экспрессирующегося в метастазирующих опухолях. Генетика, 1996, 32: 621 - 628.

98. Kiselev SL, Kustikova OS, Korobko EV, Prokhortchouk EB, Kabishev AA, Lukanidin EM, Georgiev GP. Molecular cloning and characterization of the mouse tag7 gene encoding a novel cytokine. J Biol Chem. 1998 Jul 17;273(29): 18633-9.

99. Kang D, Liu G, Lundstrom A, Gelius E, Steiner H. A peptidoglycan recognition protein in innate immunity conserved from insects to humans. Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Aug 18;95(17): 10078-82.

100.Mirkina II, Kiselev SL, Sashchenko LP, Sadchikova ER, Gnuchev NV. Cloning the human tag7 gene and study of its genomic organization. Dokl Akad Nauk. 1999 Aug;367(4):548-52. lOl.Ochiai M, Ashida M. A pattern recognition protein for peptidoglycan. Cloning the cDNA and the gene of the silkworm, Bombyx mori. J Biol Chem. 1999 Apr 23;274(17): 11854-8.

102.Liu C, Gelius E, Liu G, Steiner H, Dziarski R. Mammalian peptidoglycan recognition protein binds peptidoglycan with high affinity, is expressed inneutrophils, and inhibits bacterial growth. J Biol Chem. 2000 Aug 11;275(32):24490-9.

103.Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J., J. Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982.

104.Ausubel F. M., Brent R., Kingston R. E., Moore D.D., " Short protocols in molecular biology: a compendium of methods from Current protocols on molecular biology", 1989.

105.Titus D. E., "Promega Protocols and Applications Guide", second edition, March, 1991.

106.Mayer, R.J. and Walker, J.H. (1987) Immunochemical procedures. In: Immunochemical methods in cell and molecular biology. Academic Press: San Diego, CA. 259 - 281.

107.Laemmli, U.K., Nature, 1970, v.227, 680.

108.Hunt, S.V. (1987) Preparation of lymphocytes and accessory cells. In: Lymphocytes: a practical approach. Klaus, G.G.B, ed., 1987, IRL Press, Oxford, Washington, D.C., 1 - 32.

109.Amersham International pic: Membrane transfer and detection methods, Amersham UK, 1991.

110.Porcelli SA. The CD1 family: a third lineage of antigen-presenting molecules. Adv Immunol. 1995;59:1-98.

111.Moody DB, Ulrichs T, Muhlecker W, Young DC, Gurcha SS, Grant E, Rosat JP, Brenner MB, Costello CE, Besra GS, Porcelli SA. CDlc-mediated T-cell recognition of isoprenoid glycolipids in Mycobacterium tuberculosis infection. Nature. 2000 Apr 20;404(6780):884-8.

112.Schaible UE, Hagens K, Fischer K, Collins HL, Kaufmann SH. Intersection of group I CD1 molecules and mycobacteria in different intracellular compartments of dendritic cells. J Immunol. 2000 May l;164(9):4843-52.

113.Sugita M, Grant EP, van Donselaar E, Hsu VW, Rogers RA, Peters PJ, Brenner MB. Separate pathways for antigen presentation by CD1 molecules. Immunity. 1999 Dec;ll(6):743-52.