Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Молекулярно-генетические методы дифференциации пород пчелы медоносной Apis mellifera L.

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Чудинов, Олег Светославович

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Породы медоносных пчел (Apis mellifera).

1.1.1. Темная лесная пчела, среднерусская (Apis mellifera mellifera L.).

1.1.2. Бурзянские (Башкирские) бортевые пчелы - популяция

Apis mellifera mellifera L.

1.1.3. Серая горная кавказская порода (Apis mellifera caucasica).

1.1.4. Желтая (долинная) кавказская порода (Apis mellifera remipes Gerst.).

1.1.5. Итальянская порода (Apis mellifera ligustica).

1.1.6. Краинская порода (Apis mellifera carnica).

1.1.7. Карпатская порода (Apis mellifera carpatica).

1.1.8. Украинская степная порода (Apis mellifera acervorum).

1.1.9. Дальневосточные пчелы.

1.1.10. Внутрипородный тип среднерусской породы пчел «Приокский».

1.1.11. Пчела Юго-Восточной Азии и Индии - Apis cerana.

1.2. Генетика и современное состояние исследований Apis mellifera и Apis cerana.

1.2.1. Основные генетические особенности пчел рода Apis.

1.2.2. Построение генетической карты пчелы медоносной.

1.2.3. Исследования митохондриальной ДНК пчел.

1.2.4. Изоферментный анализ.

1.2.5. Малоиспользуемые в настоящее время методы дифференциации пчел.

1.2.6. Микросателитный анализ.

1.2.7. Локальная амплификация ДНК с использованием случайно-выбранного праймера (ИАРО).

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Молекулярно-генетические методы дифференциации пород пчелы медоносной Apis mellifera L."

Россия обладает богатым генетическим потенциалом пород и популяций пчел. Однако, за последнее время во многих регионах страны из-за отсутствия четкой программы породного районирования пчел сокращается численность чистопородных семей, а также создается угроза полной утраты генофондов ряда пород в результате неконтролируемой метизации (В.Н.Поздняков и др., 2000; А.Г.Николенко, В.Г.Поскряков, 2000). Потребность в высококачественных племенных матках в пчеловодческих хозяйствах нашей страны за последние годы резко возросла. Часть племенного материала поступает из республик бывшего Советского Союза (Украина, Белорусия, Грузия, Молдавия и др.) и из дальнего зарубежья (Италия и др.). В настоящее время отсутствует систематизированный учет и контроль ввозимого в различные регионы страны племенного пчелиного материала (А.Г.Николенко, В.Г.Поскряков, 2000). Внутри России в различных пчеловодческих хозяйствах разводящих и реализующих племенной материал пчел также нет соответствующего учета и контроля. При проведении селекционной работы по улучшению пчел на племенных пасеках отсутствует жесткий контроль за используемым для этого генетическим материалом. При таких условиях содержания и разведения пчел поддержание чистоты пород возможно только с помощью искусственного осеменения, создания криобанков спермы трутней, использования удаленных друг от друга случных пунктов репродукции пчел.

Изменение климатических условий в России за последнее десятилетие создает потребность использовать новые породные линии и породы пчел с улучшенными хозяйственными признаками. Поэтому помимо проблем связанных с использованием неконтролируемого племенного материала пчел природно-сложившихся пород (рас), существует необходимость максимально эффективно и достоверно подтверждать результаты селекционной работы по созданию новых линий и пород пчел (Г.Д.Билаш и др., 1991).

В настоящее время в пчеловодческих хозяйствах России принадлежность пчелы к той или иной породе определяется в основном по фенотипическим признакам: экстерьерным, морфологическим, хозяйственно-значимым, поведенчиским. Указанные признаки довольно вариабельны и сильно зависят от географической широты распространения, условий питания, возраста пчел и квалификации зоотехника (В.Н.Поздняков и др., 1999). Поэтому необходимо использовать подходы, которые позволят однозначно маркировать различные породы и породные линии пчел. За последние годы были разработаны и применены на практике в сельском хозяйстве различные методы ДНК-маркирования (В.И.Глазко, 1998; 1.АХоЬо, 1995). Данные методы маркирования хорошо зарекомендовали себя и используются во всех странах мира не только для генетической паспортизации и селекционной работы, но и для решения сложных юридических вопросов связанных с использованием генетического материала.

Однако, надежные ДНК маркеры, позволяющие определить принадлежность пчелосемьи к той или иной породе практически отсутствуют. Необходимо отметить, что за последние годы разработаны митохондриальные ДНК-маркеры, позволяющие дифференцировать некоторые породы и популяции пчел (А.Г.Николенко, Г.Д.Поскряков, 2000; М.11.Ра1тег е1 а1., 2000), но из-за материнского характера наследования они не дают возможности анализировать гибриды различных пород. Поэтому митохондриальные ДНК-маркеры нельзя в полной мере использовать ни для подтверждения результатов селекционной работы, ни для сертификации и паспортизации племенной продукции пасек.

Следовательно, существует необходимость разработать молекулярно генетические подходы к дифференциации и идентификации популяций пчел на основе геномных ДНК-маркеров. Однако геном пчел весьма плохо изучен, и к настоящему времени построена лишь его приблизительная генетическая карта (G.J.Hunt, R.E.Page, 1995). Поэтому для создания геномных ДНК-маркеров дифференцирующих различные породы пчелы необходимо использовать метод, для которого не требуются расширенные предварительные знания о геноме пчел. Поиск межпородных различий обычно требует больших временных и материальных затрат, поскольку сравниваются относительно близкие популяционные группы, геномы которых слабо отличаются друг от друга. Поэтому метод поиска геномных ДНК-маркеров пчелы должен не только максимально не зависть от предварительных знаний о геноме пчелы, но и быть по -возможности быстрым, эффективным и дешевым. Таким требованиям отвечает метод RAPD- анализа (Д.Б.Дорохов, Э.Клоке, 1997), который и был выбран как основной метод исследований ДНК пчелы в этой работе. Данный метод широко используется для популяционной генетики и таксономических исследований (J.C.Williams et al., 1990; J.Welch, M.McClelland, 1990).

RAPD - это локальная амплификация набора (фингерпринта) фрагментов ДНК размером от 50 до 2500 п.н. фланкированных короткими инвертированными повторами, которые выступают как участки отжига для подобранного случайным образом 10-нуклеотидного праймера (О.С.Чудинов и др., 2000; Д.Б.Дорохов, Э.Клоке, 1997). Распределение в геноме инвертированных повторов является уникальным (J.G.Williams et al., 1993; В.И.Глазко, 1998; G.J.Hunt, 1995), что позволяет выявлять различия в RAPD-фингерпринтах разных видов и пород. Для RAPD-анализа практически не требуются предварительные знания о геноме. В результате RAPD амплификации получается набор фрагментов ДНК различного веса, который при разделении на гель-электрофорезе дает уникальный фингерпринт. Поэтому одним из основных преимуществ RAPD маркеров состоит в том, что на один праймер может приходиться несколько полиморфных фрагментов ДНК (несколько локусов на один праймер) (G.J.Hunt, R.E.Page, 1995), что существенно экономит время и материальные затраты по сравнению с амлификацией где используются специфические праймерные пары. Воспроизводимость результатов сильно зависит от правильного подбора условий КАРБ-анализа (А.Биаго сЧ а1., 1998). При неправильно подобранных условиях амплификация множества фрагментов ДНК может привести в результате к множественным артефактам (Т.Аг^1апу е1 а1., 1990; C.M.Nagamine е1 а1., 1989). Кроме необходимости подбора условий КАРБ-анализа, возникает необходимость подбора праймеров, которые выявят полиморфные фрагменты ДНК - кандидатные на роль маркеров. Однако необходимо отметить, что метод ИАРО для генетической дифференциации успешно использовался для других организмов при других условиях амплификации - как для дифференциации видов (Б-КатЫгатрай е1 а1., 1992), так и для популяционных генетических исследований низшего уровня -исследований различных генетически близких штаммов микроорганизмов. Простота тестирования огромного количества образцов с геномами неизвестной структуры при помощи ЛАРБ маркеров делает данный метод предпочтительным перед другими методами исследования в особенности с учетом того факта, что каждый КАРБ-фингерпринт дает репрезентативно более значимый результат по сравнению со специфической амплификацией. Поэтому ЛАРО-технология успешно используется при конструировании генетических карт организмов (0.1.Нип1 е1 а1., 1994; О.ВтеШ, Ст.Висс1, 1994), создании генетических маркеров (А.Биаго е1 а1., 1998; К.М.КНп-ЬапкЪогз! е1 а1., 1991), анализе интрогрессий (М.Реггоп, е! аЦ 1995), паспортизации сортов, пород и видов организмов и установлении между ними генетических отношений (т.е. геномная дактилоскопия), а также для филогенетических исследований (А.8иаго et а1., 1998; Т.МНПап а1., 1996).

Цель настоящей работы состояла в поиске подходов к молекулярно-генетической дифференциации пород пчелы медоносной Apis mellifera L. и двух видов пчел (Apis mellifera L. и Apis cerana) на основе выявления ДНК - маркеров.

С учетом приведенных особенностей исследований ДНК пчел методически работа была разделена на 4-ре основных этапа:

1. Подбор условий сбора и хранения образцов, а также метода выделения и очистки тотальной ДНК из этих образцов ( Для молекулярно -генетических исследований необходимо использовать хорошо очищенную высокомолекулярную ДНК пчел. Степень очистки и количество высокомолекулярной фракции в препарате ДНК сильно зависит от способов хранения образцов и метода выделения ДНК. Для уменьшения затрат в работе в основном использовались препараты тотальной ДНК пчел.);

2. Оптимизация условий RAPD - анализа для пчел, необходимо для достижения воспроизводимости результатов;

3. Поиск породоспецифических (и видоспецифических) ДНК-маркеров методом RAPD-анализа образцов тотальной ДНК пчел, т.е. перебор 10-нуклеотидных праймеров;

4. Определение принадлежности ДНК-маркеров к геномной или митохондриальной ДНК пчел (посколькув работе используются препараты тотальной ДНК пчел, необходимо определить принадлежность найденных ДНК - маркеров к геномной или митохондриальной ДНК).

Научная новизна

Впервые найдены геномные ДНК - маркеры дифференцирующие породы пчел: Apis mellifera mellifera, Apis mellifera caucasica и приокский внутрипородный тип. Впервые была подтверждено, что по результатам анализа ДНК приокский внутрипородный тип отвечает критерию повторяемости - одному из основных породных критериев. Впервые были найдены геномные ДНК - маркеры дифференцирующие виды Apis mellifera L. и Apis cerana. Найденные геномные ДНК -маркеры позволяют проводить научно - обоснованную выработку стандартов различных пород пчел для геномной дактилоскопии. Кроме того, эти маркеры могут использоваться в популяционных исследованиях пчел.

В процессе работы были отработанны простые и эффективные методы фиксации и длительного хранения пчел перед выделением и очисткой ДНК, обеспечивающих минимальную деградацию исследуемых образцов. Из различных опробованных методов выделения и очистки тотальной ДНК пчел был выбран наиболее эффективный, который в отличие от предлагаемых в других работах методов является наиболее дешевым. В работе подобраны оптимальные условия проведения RAPD-анализа для пчел так, что в отличие от целого ряда предшествующих исследований результаты всегда воспроизводились. На основе отработанных и оптимизированных методик выработан эффективный механизм анализа ДНК пчелы.

Практическая значимость работы

Полученные в процессе работы ДНК-маркеры пригодны для использования в практической идентификации и паспортизации маток и их семей в пчеловодческих хозяйствах внутри России, а также для генетического контроля ввозимых из-за рубежа пчел. В процессе работы отработанны эффективные и дешевые методики ДНК

11 исследований различных пород и видов пчел пригодные для практической стандартизации, идентификации и паспортизации пчел. В процессе работы подтверждена практическая ценность метода НАРБ-анализа, как мощного и эффективного инструмента получения ДНК-маркеров для различных пород и видов пчел.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 139 страницах машинописного текста. Диссертация содержит 23 иллюстрации и 11 таблиц. Структурно диссертация состоит из введения, трех разделов, выводов и списка литературы. В списке литературы представлено 122 печатных работы, из них иностранных - 82.

Заключение Диссертация по теме "Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных", Чудинов, Олег Светославович

Практические рекомендации

Базируясь на результатах исследований целесообразно привести ряд практических рекомендаций:

1. При паспортизации маток и их семей совместно с морфометрическими методами рекомендуется использовать молекулярно-генетический метод геномных ДНК-маркеров разработанных в данной работе.

2. При исследовании различных пород пчел в различных местах обитания на предмет выявления неконтролируемой метизации рекомендуется использовать геномные ДНК-маркеры, найденные в данной работе, т.к. их использование имеет значительные преимущества перед классическими морфометрическими методами. В связи с этим также рекомендуется проведении расширенного мониторинга пчел различных пород с использованием исследований геномной ДНК (разрабатываемых в данной работе) в критических местах возможных метизаций и в целом по племенным пасекам.

Крайне целесообразно использовать в селекционной работе по созданию новых пород и линий с заданными свойствами метод молекулярно-генетического контроля

ДНК разрабатываемого в данной работе, а также использование ДНК-маркирования получаемых пород и линий.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на международном конгрессе пчеловодов "Apimondia" (Канада, Ванкувер, 1999), на научной конференции «Памяти Грегора Менделя» (Москва, 2001), на 3-ей Юбилейной международной конференции по молекулярно-генетическим маркерам животных (Киев, 1999), на Ш-ей Международной научно-практической конференции «Экология и охрана пчелиных» (Москва, 1999), на конференции «Интермед 2002» (Москва, 2002), на научно - практической конференции «Проблемы экологии и развития пчеловодства в России» (Рыбное, 1999).

Публикации результатов исследований

Материалы диссертации изложены в статьях научных журналов и печатных материалах научных конференций. Всего по теме диссертации опубликованы 9 печатных работ:

1. Чудинов О.С., Поздняков В.Н., Абрамова А.Б., Какпаков В.Т., Козин Р.Б. Оптимизация RAPD-технологии для изучения генетического полиморфизма ДНК генома различных пород пчел.// Сельскохозяйственная биология,- 1999,- №6,- С.47-56;

2. Поздняков В.Н., Чудинов О.С., Абрамова А.Б., Какпаков В.Т., Козин Р.Б. Оптимизация методов выделения ДНК из медоносной пчелы.// Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук,- 2000.- №2.- С.49-51;

3. Поздняков В.Н., Абрамова А.Б., Чудинов О.С.,Какпаков В.Т., Козин Р.Б., Кривцов H.H., Бородачев A.B. Молекулярно - генетические подходы в изучении генетического полиморфизма различных пород пчел.// Сельскохозяйственная биология,-2000,- №4.-С.56-60;

4. Поздняков В.Н., Чудинов О.С., Абрамова А.Б., Кривцов Н.И., Бородачев A.B. Молекулярно - генетические подходы к дифференциации пчел различных пород.// Материалы и тезисы 3- ей международной научно-практической конференции «Интермед 2002».- Москва, 2002.-С.211-212;

5. Поздняков В.Н., Чудинов О.С., Абрамова А.Б. Геномная дактилоскопия различных пород пчел на основе RAPD-технологии.//Печатные материалы научной конференции «Памяти Грегора Менделя»,- Москва: Издательство МСХА, 2001.-С. 106107;

6. Поздняков В.Н., Какпаков В.Т., Абрамова А.Б., Чудинов О.С., Бородачев A.B., Кривцов Н.И. Геномная дактилоскопия пчелиных и решение проблемы генофонда медоносной пчелы.// Материалы научно-практической конференции «Проблемы экологии и развития пчеловодства в России» Россельхозакадемии-70 лет.- Рыбное, 1999.- С.46-49;

7. Поздняков В.Н., Чудинов О.С., Какпаков В.Т. Геномная дактилоскопия пород пчел как основа для выявления молекулярно-генетических породоспецифических маркеров.// Печатные материалы 3-ей Юбилейной международной конференции по молекулярно-генетическим маркерам животных,- Киев, 1999;

8. Поздняков В.Н., Чудинов О.С., Какпаков В.Т. Генетический полиморфизм пчел и проблема сохранения чистоты генофонда.// Сборник научных докладов III Международной научно- практической конференции «Экология и охрана пчелиных»,-Москва, 1999.-С. 178-182;

9. Pozdniakov V.N., Chudinov O.S., Abramova A.B., Kakpakov V.T. Genome fingerprinting of different honey bees breeds.// Printing materials of International honey bees congress "Apimondia".- Vancouver, 1999.

129

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Чудинов, Олег Светославович, Рыбное

1. Аветисян Г.А. Некоторые вопросы эволюции, распростронения, охраны и использования видов и пород пчел.// XVI Международный конгресс по пчеловодству, Москва, 1958, с.65-67.

2. Алпатов В.В. Породы медоносной пчелы и их использование в сельском хозяйстве.// МОИП, Москва, 1948, с. 183.

3. Алпатов В.В. Биометрические исследования по изменчивости и породам медоносной пчелы.// Qart. Rev. of biology, 1929, v.4, No 1, p. 1-58.

4. Билаш Г.Д., Бородачев A.B. Приокские пчелы.// Пчеловодство, 1991, № 5, с.9-12.

5. Билаш Г.Д., Бурмистров А.Н., Гребцов В.Г. и др. Малая энциклопедия пчеловодства. М.: Сов.энциклопедия, 1991, 511 с.

6. Билаш Г.Д., Кривцов Н.И. Селекция пчел. Москва, ВО «Агропромиздат»,1991, 304 с.

7. Булат С.А.,Захаров И.А.Выявление ДНК методом полимеразной цепной реакции в материале энтомологических коллекций.// Журнал общей биологии, 1995.

8. Брайен М. Общественные насекомые.// Мир, Москва, 1986.

9. Бутлеров A.M. О кавказской пчеле и пчеловодстве на Кавказе.// СПБ, 1891, с. 7587.

10. Великанов В. Желтые кавказские пчелы.// Пчеловодное дело,1928, № 7, с.351-354.

11. Виноградов М.Н. Специализация в пчеловодстве.// Москва, Россельхозиздат, 1970, 176 с.

12. Витвицкий Н.М. // Практическое пчеловодство, СПБ, 1835.

13. Глазко В.И. Проблемы использования ДНК-технологий у животных.// Сельскохозяйственная биология, 1998, № 4, р.33-42.

14. Горбачев К.А. О желтых пчелах Закавказья и Северного Кавказа.// Пчеловодное дело, 1929, №4, с. 132-134.

15. Горбачев К.А. Кавказская серая горная пчела (Apis mellifera var.caucasica) и место ее среди других пород.// Тифлис, 1916, 40 с.

16. Гранкин Н.Н. Селекция и воспроизводство среднерусских пчел для центральных и северных областей России.// Автореферат диссертации, Москва, 1999, 38 с.

17. Губа П.О., Согрин Б.В. Материалы по аналитической селекции.// Украшских степовах бджил. Бджильнитство,1978, вып. 13, с. 35-39.

18. Губин В.А. Особенности поведения карпатских пчел.// Пчеловодство, 1983, № 2, с.7-9.

19. Дорохов Д.Б., Клоке Э. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов.// Генетика, 1997, том 33, № 4, с.443-450.

20. Кривцов Н.И., Сокольский С.С. Серые горные кавказские пчелы.//Сочи 2002 г., 132 с.

21. Кривцов Н.И., Сокольский С.С. Породы пчел.//Сочи 2001 г., 24 с.

22. Кюрегян С.М. Изучение и разработка мероприятий по репродукции чистых желтых пчел в Мегринском районе.// Авт. Кандидатской диссертации, Ереван, 1969.

23. Левченко И.А. Передача информации о координатах источника корма у пчелы медоносной.//Киев, 1976.

24. Луво Ж. Значение понятия «экотип» у пчелы.// Международный конгресс по пчеловодству «Апимондия», Бухарест, 1969, с. 201-205.

25. Макаров Ю.И. Биологические и хозяйствено-полезные особенности дальневосточных пчел и их селекция.// Автореферат кандидатской диссертации, Москва-1969.

26. Малков В.В., Мартынов А.Г., Назин С.Н. Селекция приокских пчел.// Пчеловодство, 1991, №5, с.12-13.

27. Маркосян Ж.К. Некоторые признаки армянских пчел.// Пчеловодство, 1960, № 8, с. 27-28.

28. Николенко А.Г., Поскряков В.Г. Полиморфизм локуса COI СОИ митохондриальной ДНК медоносной пчелы Apis mellifera L. на Южном Урале.// Генетика, 2002, Том 38, № 4, с.458-462.

29. Петров Е.М.Башкирская бортевая пчела.//Башкирское книжное издательство,Уфа-1983,200с.

30. Поздняков В.Н., Абрамова А.Б., Чудинов О.С.,Какпаков В.Т., Козин Р.Б., Кривцов Н.И., Бородачев А.В. Молекулярно генетические подходы в изучении генетического полиморфизма различных пород пчел.// Сельскохозяйственная биология, 2000, №4, с. 56-60.

31. Скориков А.С. Породы кавказских пчел.// Кавказская пчела, 1929, № 5-6, с.7-8.

32. Фатхиев Ф.Ф. Сохраним башкирскую бортевую пчелу.// Пчеловодство, 1987, №7, с.10-11.

33. ЧеревкоЮ.А. Гетерозис при чистопородном разведении пчел.// Пчеловодство,1995,.№2, с.17-19

34. Чудинов О.С., Поздняков В.Н., Абрамова А.Б., Какпаков В.Т., Козин Р.Б. Оптимизация RAPD-технологии для изучения генетического полиморфизма ДНК генома различных пород пчел.// Сельскохозяйственная биология, 1999, №6, с.47-56.

35. Шавров Н. Краткий отчет современного положения пчеловодства на Кавказе.// Тифлис, 1893, 88 с.

36. Шакиров Д.Т. Нужны не слова, а дела.// Пчеловодство, 1987, №12, с.9.

37. Шафиков И.В. Изучение и селекция бурзянских бортевых пчел Башкирского государственного заповедника.// Автореферат диссертации, Канд. С-х. Наук М.ТСХАб 1987.16с.

38. Amersham: Hybridisation Applications Manual, 1989, Amersham, UK.

39. Anglany F., Picci L., Camporese C. Zacchello F. Heteroduplex formation in polimerase chain reaction.//Am.J.Hum. Genet.,. 1995, No 47, p. 169-170.

40. Beye M., Moritz R.F.A. In situ hibridization of rDNA on chromosome of the honeybee, Apis mellifera L.// Experientia, 1993, v.49, p.337-338.

41. Binelli G.,Bucci G. A genetic linkage map of Picea abies Karst., based on RAPD markers, as a tool in population genetics.// Theor. Appl. Genet., 1994, 88, p.283-288.

42. Blanchetot A., Genetic relatedness in honeybees as astablished by DNA fingerprinting.// J.Hered., 1991, No 82, p. 391-396.

43. Boehringer Mannheim: PCR Applications Manual, 1995, by Boehringer Mannheim GmbH, Biochemica.

44. Buttel-Reepen. Apistica Beitrage zur Sustematik sovie zur geschichtlichen und geographissen Verbreitung der Honigbiene (A.m.L.) ihrere Verietaten und der übrigen Apis-Arten.// Veroft. Zool., Berlin, 1906, p. 112-201.

45. Callen D.F., A.D. Thompson, H.A.Y. Shen, H.A. Phillips, R.A. Richards et al., Incidence and origin of "null" alleles in the (AC)n microsatellite markers.// Am. J. Hum. Genet., 1993, No 52, p. 922-927.

46. Carlson D.A., Bolten A.B. Identification of Africanized and European honeybees using extracted hydrocarbons.// Bull.Entomol. Soc.Am., 1983, No 30, p.32-35.

47. Collins A.M., Rinderee T.E., Harbo J., Bolten A.B. Colony defense by Africanized and European honeybees.// Science, 1982, No 218, p.72-74.

48. Cornuet J.M.L., Garnery L., Solignac M. Putative origin and function of the intergenic region between COI and COII of Apis mellifera L. mitochondrial DNA.// Genetics, 1991,v. 128, p.393-403.

49. Crain W.R., Davidson E.H., Britten J. Contrasting patterns of DNA sequence arrangement in Apis mellifera (honeybee) and Musca Domestica (housefly).// Chromosoma, 1976, v.59, p.1-12.

50. Crozier R.H., CrozierY.C. The mitochondrial genome of the honeybee Apis mellifera: complete sequence and genome organization.// Genetics, 1993, v.133, p.97-117.

51. Crozier R.H., CrozierY.C., MackinlayA.G. the COI and COII region of the haneybee mitochondrial DNA: evidence for variation in insect mitochondrial evolutionary rates.// Mol. Biol. Evol., 1989, v.6 (4), p.399-411.

52. Cuthrie P.A.I., Magill C.W., Fredericsen R.A., Oduody G.N. Random amplified polimorphic DNA marcers: a system for identifying and differentiating isolates of Colletotrichum graminicola.//Phitopathology, 1992, No 82, p. 832-835.

53. Daly H.V., Ballings S.S. Identification of Africanized honeybees in the western hemisphere by discriminant analysis.// J. Kans. Entomol. Soc., 1978, No 51, p. 857-869.

54. Dietz A. Evolution.// Bee Genetics and Breeding. Academic Press, Inc., 1986, Harcourt Brace Jovanovich, Publishers., p.3-22.

55. Estoup A., Garnery L., Solignac M., Cornuet J.M. Microsatellite Variation in honey bee (Apis mellifera L.) populations: hierarchical structure and test of the Infinite Allele and stepwise mutation models.// Genetics, 1995, No 140, p.679-695.

56. Estoup A., M. Solignac, J.M. Cornuet, Precise assessement of the number of matings and of relatedness in honey bee colonies.// Proc. R. Soc. Lond., B. Biol. Sei., 1994, No 258, p. 1-7.

57. Estoup A., M. Solignac, M. Harry, J.M. Cornuet, Characterization of (GT)n and (CT)n microsatellites in two insect species: Apis mellifera and Bombus Terrestris.il Nucleic Acids Res., 1993, No 21, p. 1427-1431.

58. Fondrk M.K., Page R.F., Hunt Paternity analysis of worcer honey bees using Random Amplified Polimorphic DNA.// Naturwissenschaften, 1993, No 80, p.226-231.

59. Garnery L., Cornuet J.M.,Inter and intra lineage mitochondrial DNA variation in the honeybee Apis mellifera.il Xllth IUSSI congress, 1994, Paris, p.428.

60. Garnery L., Cornuet J.M., Solignac M. Evolutionary history of the honeybee Apis mellifera inferred from mitochondrial DNA analysis.// Mol.Ecol.,1992, No 1, p. 145-154.

61. Gromisz M. Genetyczne podstawy selekcje.// Pszcselarstwo,1972, No3-8.

62. Hall H. G. Further characterization of nuclear DNA RFLPs markers that distinguish African and European honeybees.// Arch Insect Biochem Physiol, 1992, No 19, p.163-175.

63. Hall H. G., Smith D.R. Distinguishing African and European honeybee matrilines using amplified mitochondrial DNA.// Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1991, No 88, p.4548-4552.

64. Hall H. G. Parental analysis of introgressive hybridization between African and European honeybees using nuclear DNA RFLPs.// Genetics, 1990, No 125. p.611-621.

65. Hall H. G. DNA differences found between Africanized and European honeybees. // Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1986, No 83, p.4874-4877.

66. Hunt G.J., Page R.E. A lineage map of the honey bee, Apis mellifera, based on RAPD markers. //Genetics, 1995, v.139, p.1371-1382.

67. Hunt G.J., Page R.E.Lineage analysis of sex determination in the honey bee (Apis mellifera L.).//Mol.Gen. Genet., 1994, v.244, p.512-518.

68. Hunt G.J., Page R.E. Patterns of inheritens with RAPD molecular markers reveal novel types of polymorphism in the honeybee.//Theor Appl. Genet., 1992, v.85, p. 15-20.

69. Jermstad K.D., & others. Development of random amplified polymorfic DNA markers for genetic mapping in Pacific yew (Taxus brevifolia).// Can.J.For.Res., 1996, 26, p.497-503.

70. Jordan R.A., Brosemer R.W. Characterization of DNA from three bee species.// J.Insect. Phisiol.,1974, v.20, p.2513-2520.

71. Kambhampati S., Black C.W., Rai K.S. Random amplified polimorphic DNA of mosquito species and populations (Diptera, Culicidae): techniques, statistical analysis and applications.// J. Med.Entomol., 1992, No 29, p.936-945.

72. Kaya Z., Neale D.B. Linkage mapping in red pine (Pinus brutia Ten.) using random amplified polimorphic DNA (RAPD) genetic markers.// Silvae Genet. 1995,44, p. 110-116.

73. Kerr W.E., Laidlaw H.L. General Genetics of Bees.// Adwancer in Genetics, New York, 1961, No 8.

74. Klin-Lankhorst R.M., Vermut A., Weid R. Isolation of molecular markers for tomato(L.esculentum) using random amplified polimorphic DNA (RAPD).// Theor. Appl. Genet., 1991, 83, p. 108-114.

75. Laydlaw H.H., El-Banby M.A., Tucker K.W. Further linkage studies in the honey bee.// J.Hered., 1965, No 56, p.39-41.

76. Lindauer M. Ein Beitrag zur Arbeitsteilung im Bienistaat.// Z. Vergl. Physiol., 1952, v.34, p. 299-345.

77. Lobo J.A. Morphometric, isozym and mitohondrial variability of African honeybees in Costa Rica.// Heredity, 1995, v.75, p.133-141.

78. Mackensen O. Linkage studies in the honey bee.// J.Hered., 1958, No.49, p.99-102.

79. Merriam J., Ashburner M., Hartl D.L., Kafatos F.C. Toward cloning and mapping the genome of drosophila.// Science, 1991, No 254, p.221-225.

80. Millian T., Osuna F., Cobos S., Torres A.M. Using RAPDs to study phylogenetic relationships in rosa.// Theor. Appl. Genet., 1996, 92, p.273-277.

81. Milne, Jr. Charles P. Cytology and Cytogenetics.// Bee Genetics and Breeding. Academic Press, Inc., 1986, Harcourt Brace Jovanovich, Publishers., p.205-234.

82. Moritz R.F., Meusel M.S., Haberl M.Oligonucleotide DNA fingerprinting discriminates seper- and half-systers in honeybee colonies (Apis mellifera L.).// Naturwissenschaften, 1991, No 78, p.422-424.

83. Moritz Robin F.A. Genetics of bees other than Apis mellifera.// Bee Genetics and Breeding. Academic Press, Inc., 1986, Harcourt Brace Jovanovich, Publishers., p. 121-154.

84. Nagamine C.M., Chan K., Chris Lau Y.F. A PCR artifact: generation of heteroduplex.// Am.J.Hum.Genet., 1989, No 45, p.337-339.

85. Packer L., Owen R.E. Variable enzyme systems in the Himenoptera.// Biochem.Syst.Ecol., 1992, No 20, p. 1-7.

86. Palmer M.R., Smiyh D.R., Kaftanoglu O. Turkish honeybees: Genetic variation and evidence for a fourth lineage of Apis mellifera mtDNA.//The Journal of Heredity, 2000, v.91(l), p.42-46.

87. Pamilo P.S.L., Crozier R.H. Genetic variation in male haploids under deterministic selection.// Genetics, 1981, No 98, p. 190-214.

88. Pamilo P.S.L.,Varvio-Aho, Pekkarinen Low enzyme genevariability in Himenoptera as a consequence of haplodiploidy.// Hereditas, 1978, No 88, p.93-99.

89. Perron M., Gordon A.G., Bousquet J. Species-specific RAPD fingerprints for closely related Picea marianna and P.rubbens.// Theor. Appl. Genet., 1995, 91, p.142-149.

90. Petrunkewitsch A. Die richtungskorper und ihr schicksal im befruchteten und unbefruchteten bienenei.// Zool.Jahrb.Abt. Allg.Zool.Physiol.Tiere, 1901, v.14, p. 573-608.

91. RoweDJ., Rinderer T.E., Stelzer J.A., Oldroyd B.P., Crozier R.H. Seven polymorphic microsatellite loci in honeybees (Apis mellifera).// Insectes sociaux, 1997, v.44, p.85-93.

92. Ruttner F. Biogeography and taxonomy of honey bees.// Berlin: Springer-Verlag, 1998, 288 p.

93. Ruttner F. Naturegeschichte der Honigbienen.// Munchen, Ehrenwirth, 1992, p.358.

94. Ruttner F. Geographical Variability and Classification.// Bee Genetics and Breeding. Academic Press, Inc., 1986, Harcourt Brace Jovanovich, Publishers., p.23-56.

95. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoeffel S„ Scharf S„ Higuchi G.T., Mullís K.B., Erlich H.A. Primer directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polimerase.// Science, 1988, No 239, p.487-491.

96. Sambrook J. & others, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.// Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

97. Shahjahan R.M., Keith J., Hughes, Leopold R.A., DeVant D. Lower incubation temperature increases yield of insect genomic DNA isolated by the CTAB methods.// BioTechigues, 1995, v.3, p.333-334.

98. Shepard W.S. Comparative study of enzymepolimorphism in US and Europian honey bee populations.// Ann. Eutom. Soc. Am., 1988, p. 808-889.

99. Sheppard W.S. and Berlocher SH New allozyme variability in italian honeybees.// J. Hered., 1985, 76, p.45-48.

100. Smith D.R. African bees in the Americas: insights from biogeography and genetics.// Trends Ecol.Evol., 1991, No 6, p. 17-21.

101. Smith R.K. Chemotaxonomy of honeybees (Apis mellifera). Part I European and African workers.// Bee Sci., 1990, 1, p.23-32.

102. Smith D.R., Brown W.M. Polymorphism in mitohondrial DNA of European and Africanized honeybees (Apis mellifera).// Experientia, 1988, v.44, p.257-260.

103. Suazo A., McTiernan R., Hall H.G. Differences between african and european honey bees (Apis mellifera) in Random Amplified Polimorphic DNA (RAPD).// Journal of Heredity, 1998, No 89, p.32-36.

104. Sylvester H.A. Biochemical Genetics.// Bee Genetics and Breeding. Academic Press, Inc., 1986, Harcourt Brace Jovanovich, Publishers., p. 177-203.

105. Sylvester H.A. Electrophoretic identification of Africanized honeybees.// J. Apic. Res., 1982, No 21, p.93-97.

106. Sylvester H.A. Allozime variation in honeybees (Apis mellifera).// Ph.D.dissertation.University of California, 1976, Davis, Calif.

107. Tares S., Cornuet J.M., Abad P.Characterization of an unusually conserved Alul highly reiterated DNA sequence famili from the honeybee, Apis mellifera.// Genetics, 1993, No 134. p.l 195-1204.

108. Taylor A.R. African bees: potentialimpact in the United States.// Bull Entomol Soc. Am., 1985,31, 14.

109. Tucker K.W. Visible mutants.// Bee Genetics and Breeding, edited by Rinderer T.E., Academic Press, New York, 1986, p.57-79.

110. Valdes A.M., Slatkin M., Freiner N.B. Allele frequencies at microsatellite loci: the stepwise mutation model revised.// Genetics, 1993, No 133, p.737-749.